專利名稱：用于治療的可移植的丙烯酰胺共聚物水凝膠的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及聚合物水凝膠。更具體地說，本發(fā)明涉及用于治療的多孔的可移植的聚合物水凝膠，例如，其可以用于軟器官任何部分的內部組織置換，用于創(chuàng)傷治愈，用于組織再生，和用于全身(尤其是發(fā)育的和成熟的神經系統(tǒng)中)的器官修復等類似的治療中。本發(fā)明尤其針對一種聚合物水凝膠，移植后，該水凝膠變成一種多孔基質(其中填充有生物體液和分子，形成所謂的器官樣水凝膠)，并且通過爾后的組織和血管向內生長，逐漸整合進宿主。本發(fā)明也涉及將活組織細胞，前體細胞或遺傳修飾的細胞引入這樣的聚合物水凝膠內，產生生物雜種材料的方法，所說的雜種材料對三維細胞培養(yǎng)或對組織重構有用。本發(fā)明也涉及產生按照本發(fā)明的聚合物水凝膠的方法，并涉及由以上提及的方法產生的生物雜種材料。最后，本發(fā)明涉及通過移植進按照本發(fā)明的聚合物水凝膠或生物雜種材料，治療中樞神經系統(tǒng)，尤其是脊髓和視神經，或外周神經，或其它組織的損壞部分的方法。
背景技術：
器官移植目前是緩和器官衰竭、恢復或改善器官功能和功效的唯一的選擇。然而，器官移植療法的一些弊端是潛在的供體對受體的疾病傳播、供體器官的短缺和有限的可獲得性以及可能的免疫交叉反應。
這樣，例如，脊髓移植既不是臨床上也不是生物學上可行的，因此對SCI患者沒有可供使用的治療方法，而僅在美國就有250,000個慢性癱瘓的患者，并且每年增加10,000個新的SCI患者。
另一方面，細胞移植、轉移或注射到體內替換或恢復損失的細胞或組織器官的一部分不能適當地形成新的組織，這是由于缺乏支持性胞外基質(對擴展和組織進入與宿主器官接觸的整體結構所必需的組織框架)。此外，細胞需要置于生理學上等同的環(huán)境(其有利于營養(yǎng)物，氧，體液以及細胞組分的擴散)中，以便在移植后保持高的細胞存活性和生長潛力。
本發(fā)明的多孔水凝膠是以間質液體或水飽和的可變性的多孔聚合物基質，因此提供了必需的組織構架和水化空間，由此細胞可以以一種正確的組織學結構增殖和裝配成超細胞組織體系結構中，獲得一種功能性新組織(neotissue)。
在文獻中已經公開了采用各種移植材料嘗試在脊髓(動物模型)中恢復損傷時，脊柱內移植的不同的實驗策略，所說的移植材料可以分成兩個大類(1)生物組織和(2)修復材料。
在第(1)類中包括使用向脊髓的橋損傷(如胎兒神經組織)的供體組織移植物，同質的自體移植物或同種移植物，異源移植物或異種移植物，如(a)固體移植物(例如.Bregman，腦研究進展，34,265,1987；Houle和Reier，化合物神經學雜志(J.Comp.Neurol.),269,535,1988)或如(b)包括混合的神經組織細胞的懸液移植物(例如Goldberg和Bernstein，神經科學研究雜志，19,34,1988；Hoovler和Wrathall，神經病理學學報，81,303,1991)；以培養(yǎng)的敏感神經元重組的Schwann細胞(Kuhlengel等，化合物神經學雜志(J.Comp.Neurol.),293,74,1990)未成熟的星形細胞(例如，Bernstein和Goldberg，神經學神經科學研究，2,261,1991)；神經組織細胞前體(Monteros等，神經科學進展，14,98,1982)和永久移植生長的細胞系(Zompa等，國際神經科學進展雜志(Int.J.Dev.Neurosci.),11,535,1993)；包括培養(yǎng)的非神經細胞的外周神經區(qū)段(Wrathall等，神經病理學學報，57,59.1982)或者用胚神經組織(Horvat等，神經學神經科學研究，2,289,1991)。對第(2)類修復材料，已經公開的包括純的膠原基質(de la Torre和Goldsmith，腦研究通訊，35,418,1994；Marchand和Woerly，神經科學。36,45,1990；Gelderg，腦研究，511,80,1990)，包含神經活性劑的(Goldsmith和de la Torre，腦研究，589,217,1992)或包括培養(yǎng)的神經移植物的(Bernstein和Goldberg，腦研究377,403,1986)；處理過的硝基纖維素移植物(treated nitrocellulose implants)(Schreyer和Jones，腦研究進展，35,291,1987；Houle和Johnson，神經科學通訊。103,17,1989)；膠原移植物(Paino等，J.Nemocytol.,23,433,1991)和包含Schwann細胞的聚(丙烯腈-氯乙烯)的聚合物引導管)(Xu等，化合物神經學雜志(J.Comp.Neurol.),351,145,1995)。
這些方法十分專注于促進軸索再生，其采用各種組織基質作為新軸突的來源，或者采用復合修復基質支持和指導生長的軸突，而不涉及由大批宿主組織的再生和創(chuàng)傷愈合的改型修復的臨床相關脊髓組織或人腦組織，例如在損傷后移去壞死的或傷疤組織后。
已公開了聚合物水凝膠作為神經系統(tǒng)的移植物(Woerly等，生物材料，11,97,1990；Woerly等，生物材料，12,197,1991；Woerly等，神經移植塑料雜志3,21,1992；Woerly等，細胞移植，2,229,1993；Woerly等，神經移植塑料雜志5,245,1995)。這些水凝膠由在水中的自由基聚合制備，采用過硫酸銨和偏亞硫酸氫鈉(metabisulfite)或過硫酸鈉和抗壞血酸作為氧化還原引發(fā)劑，用羥乙基甲基丙烯酸酯(pHEMA)，甲基丙烯酸縮水甘油酯(pGMA)或N-羥丙基甲基丙烯酰胺(pHPMA)或者包含上述單體的組合物以及交聯劑進行，所述交聯劑是乙二醇和四亞乙基二醇二甲基丙烯酸酯或亞甲基雙丙烯酰胺。這些凝膠典型地是均相的和不透光的，具有雙重孔隙率，包括開的(可進入的孔體積)和閉的孔，如汞孔隙計數據和掃描電子顯微術所顯示的；這些凝膠的典型的多孔結構是由如

圖1所示的環(huán)狀交叉片段的平行圓柱形毛細管形成的，具有7-13μm的平均孔徑。分孔隙率(fractionalporosity)對pHEMA水凝膠而言在50％-85％的范圍內，對pGMA水凝膠而言在60％-65％的范圍內，對pHPMA水凝膠而言在70％-94％的范圍內。水凝膠的至少50％的孔體積被1.2-4μm的孔(pHPMA水凝膠)，pGMA的6-13μm的孔(pGMA)和10-14μm的孔(pHPMA)占據。人們發(fā)現它們的生物活性取決于膠原向交聯網絡中的引入和共聚合。申請人的在腦中的實驗性移植(顯示某種程度的組織修復)可以按照組織向內生長至均相凝膠基質的程度而達到。按照單體的組成和添加的官能團，這一反應是可變的。然而，均相水凝膠常引起纖維狀囊的形成，所述的囊易于使宿主與移植物分離。這是由于這些凝膠的不足以與活的神經組織的性質相匹配的機械性質，和由于較少比例體積的大孔。在脊髓中，這些均相水凝膠不整合進宿主，并迅速被結綈組織與神經膠質傷疤軸突包裹，而不穿入軸突或組織組分，如圖2所示。此外，有一種限制可以產生的表面區(qū)域的物理因素，由在這些均相凝膠中的圓柱形孔產生的成功的組織相互作用的一個重要參數。對凝膠的固定體積而言，所說的表面區(qū)域達到占據凝膠總體積的單一孔的最大半徑的限度。另一方面，通過減小孔尺寸增加的表面區(qū)域會導致與組織向內生長和生物量積累不相容的總空隙體積。
Harvey等，在腦研究，671,119,1995中公開了聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)的聚合物海綿體，其用作組織再生和軸突生長的腦移植物。這一產物最好在添加膠原到聚合物網絡中作為組織生物粘著劑和包含Schwann細胞后使用。
美國專利4,902,295描述了一種從胰腺組織細胞制備人工組織的方法。該方法涉及將基質前體，凝膠前體和促進劑與在水相中的存活的細胞聚合。所有聚合物前體以及促進劑生物化合物，易于快速生物降解到體內，并且在移植后不具有長期穩(wěn)定性。
Bellamkonda,R.；Ranieri,J,P.；Bouche,N.；Aebischer,P.(“神經細胞的水凝膠三維基質”，生物醫(yī)學材料研究雜志(J.Biomed.Mat.Res.)1995,29,663-671)描述了一種將神經組織細胞固定到瓊脂糖和胞外等同物(Matrigel)凝膠中的方法。這些材料是生物學的和可被生物降解的。
Krewson,C.E.；Chung,S.W.；Dai,W.；Saltzman,W.M.(“在胞外基質分子凝膠中的細胞聚集作用和軸突成長”，生物技術生物工程，1994,43,555-562)描述了一種技術，其中，將PC12細胞懸浮在單獨的或與纖連蛋白或層粘連蛋白組合的膠原凝膠中，和懸浮在瓊脂糖和膠原凝膠中。這些凝膠是可被生物降解的。
Cascone,M.G.；Laus,M.；Ricci,D.；Sbarbati del Guerra,R.(“聚(乙烯醇)水凝膠作為雜種人工組織組分的評價”，材料科學材料醫(yī)學雜志(J.Mat.Sci.Mat.Med.)1995,6,71-75)描述了一種利用聚(乙烯醇)水凝膠(物理交聯的)的技術，成纖維細胞通過一個冷干循環(huán)引入到所說的水凝膠中。
Wald H.L.；Sarakinos,G.；Lyman,M.D.；Mikos,A.G.；Vacanti J.P.；Langer,R.(“在多孔移植中的細胞接種”，生物材料(Biomat.)1993,14,270-278)描述了一種用微注射技術將肝細胞包封進聚(L-乳酸)的可降解聚合物泡沫中的方法。這一技術不能提供不可降解的基質和不能使均勻的細胞分布到整個聚合物基質中。
Mikos,A.G.；Bao,Y.；Cima,L.G,；Ingber,D.E.；Vacanti,J.P.；Langer,R.(“用于細胞附著和移植的聚(乙醇酸)結合的纖維結構的制備”，生物醫(yī)學材料(Biomed.Mat.)1993,27 183-189)描述了一種制造具有結合到肝細胞上的纖維的聚(乙醇酸)網絡的方法。這一聚合物是可被生物降解的，并且將細胞引入基質的方法不同于包埋。
Puerlacher,W,C.；Mooney,D.；Langer,R.；Upton,J.；Vacanti,J.P.,Vacanti,CA(“從可被生物降解的聚合物和軟骨細胞合成的鼻隔軟骨替代物的設計”，生物材料(Biomat.)1994,15,774-778)，并且Freed,L.E.,Marquis,J.C.；Nohria,A.Emmanual；Mikos,A.G.；Langer,R.(“利用在合成可被生物降解的聚合物上的培養(yǎng)的細胞體外和體內的Neocartilage形成”，生物醫(yī)學材料研究雜志(J,Biomed.Mat.Res.)1993 27,11-23)。這些參考文獻描述了通過毛細管作用將軟骨細胞引入聚乙醇酸(PGA)或聚乳酸(PLLA)或PGA-PLLA基質的方法。這一方法產生可被生物降解的聚合物材料，而細胞不均一地分布到聚合物中，并且使得不能控制細胞密度。
Cao,Y.；Vacanti,J.P.；Ma,X.；Paige；K.T.；Upton,J.；Chowanski Z.；Schloo,B.；Langer,R.；Vacanti,C.A.(“采用由Tenocytes接種的合成聚合物產生Neo-Tendon”，移植進展1994,26,3390-3391)描述了一種將tenocyte細胞接種到聚乙醇酸的修飾的非編織物中的方法。
Mooney,D.J.；Park,S.；Kaufman P.M.；Sano,K.；McNamara.K；Vacanti J.P.；Langer,R(“用于肝細胞移植的可被生物降解的海綿”，生物醫(yī)學材料研究雜志(J.Biomed.Mat.Res.)1995,29,959-965)和Takeda,T.,Kim,T.H.；Lee,S.K.；Langer,R.；Vacanti,J.O.(“利用Hyperuricosuria的Baltimatian狗模型以可被生物降解的聚合物骨架進行的肝細胞移植”，移植進展。1995,27,635-636)描述了一種通過吸附和毛細管作用將肝細胞吸附進聚乙醇酸聚合物氈片中或吸附到由聚乳酸和聚乙烯醇和從聚乳酸乙醇酸制造的聚合物海綿內的方法。這一方法產生可被生物降解的聚合物材料，而細胞不均一地分布到聚合物中，并且使得不能控制細胞密度。
Woerly,S.；Plant,G,W.；Harvey,A.R.(“培養(yǎng)包含在水凝膠聚合物基質內的大鼠神經和神經膠質細胞一種神經組織置換的潛在的手段”，神經科學通訊(Neurosci.Lett.)1996,205,197-201)公開了一種將神經組織細胞包含進聚[N-(2-羥丙基)-異丁烯酰胺]的均勻透明聚合物凝膠(可以含有膠原作為粘著基質)中的方法。這一方法包括把細胞懸浮加入到聚合物混合物中，制備在室溫下或在保持在37℃的溫箱中使細胞-聚合物混合物聚合。所形成的凝膠是不透光的，細胞隨機分散在交聯的凝膠內。免疫細胞化學研究表明，體外6天后，細胞的存活率在0和6％之間。
發(fā)明的公開本發(fā)明的目的是通過利用非生物修復裝置(如不可降解的聚合物水凝膠)克服現有技術的弊端，所說的修復裝置充當空間填充材料和作為刺激組織再生，形態(tài)發(fā)生以及改造成完整的結構至器官的骨架組分。
本發(fā)明的另一個目的是改善向組織形成的組織愈合，其可以通過控制穩(wěn)定的聚合物基質內的細胞增殖、細胞滲透和細胞組構達到。
本發(fā)明的另一個目的是借助聚合物基質提供組織再生方法，其對患有脊髓(SCI)和腦損傷或發(fā)育性脊髓缺損(脊柱bifida)的患者具有很大的益處和重要的臨床和經濟影響。
本發(fā)明的另一個目的是為視神經與外周神經的再生提供聚合物基質。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種不可降解的合成聚合物水凝膠基質，其具有各向異性的多孔結構，有效的表面區(qū)域和良好的組織粘著性和相容性，其設計來用于軟組織結構(特別是神經系統(tǒng))中的移植，并且逐漸成為器官的一部分。
本發(fā)明的另一個目的是提供具有控制的孔結構和攜帶表面活性劑的合成聚合物基質的治療用途。
本發(fā)明的一個基本目的是提供一種聚合物基質，其是由一種新的水不溶性聚合物水凝膠制造的，作為柔器官修復的組織再生修復裝置以膨脹態(tài)使用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用具有最后的修復裝置形狀的模型產生水凝膠產物的方法。
本發(fā)明的還一個目的是克服現有技術的一種或多種缺陷，并提供一種可以用標準的外科方法植入腦或脊髓中的聚合物神經修復物。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種可以將細胞或遺傳修飾的細胞引入到聚合物網絡中的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供提供一種聚合物基質，該基質能夠與活細胞混合，從而將具有水凝膠-型行為的聚合物基質的物理特征(多孔性、穩(wěn)定性、指導表面、通透性)與細胞生物因子(例如，生長因子)相組合。
本發(fā)明的另一個目的是提供可以用于替換部分組織軟器官的生物雜種裝置。
本發(fā)明的另一個目的是提供可以用于在體外延長時間期限的培養(yǎng)各種細胞的三維培養(yǎng)系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一個目的是將生物活性分子附著到組織或器官上的支持基質。
本發(fā)明的另一個目的是提供多孔水凝膠，其是用間質液體或水飽和的可變形的多孔聚合物基質，從而提供必需的組織構架和水化空間，由此細胞可以以一種正確的組織學結構增殖和裝配成超細胞組織體系結構中，獲得一種功能性組織。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種控制藥物和大分子釋放的系統(tǒng)組分，所說的藥物和大分子特別是抗炎癥物質，如indomethacin；細胞因子刺激物，如，細菌脂多糖；類固醇，如甲基prenisolone以及神經活性因子，如成纖維細胞生長因子。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種具有強的生物附著和止血性質的材料，所說的性質適用于內部軟組織置換，迅速附著并同時止血。
本發(fā)明的一個基本目的是提供一種聚合物基質，其具有對持續(xù)長期植入體內的機械的和化學的穩(wěn)定性，而不進行能夠損壞已生長進基質替代部分器官的新的組織網絡的降解。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種基質，其具有機械柔順性，使得操作者可以切割、確定尺寸和操作聚合物基質，而不改變基質的內部結構和機械性質。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種可膨脹的材料，其在含水介質中的具有高膨脹的容量，為了本發(fā)明的目的，其可以吸收大量的生物興趣物，例如粘著分子，如CAM和L1分子；或指導分子，如在合適的溶液中溶解的semaphorins或netrins，以便所說的分子其后被吸附在聚合物基質網絡的表面上。
按照本發(fā)明，本發(fā)明提供了一種新的親水聚合物水凝膠，其能夠形成多孔的，柔軟的，高吸收的聚合物基質，該基質有彈性并可變形，并且至少具有含量為約80％，優(yōu)選地至少96％的平衡水。
按照本發(fā)明，本發(fā)明也提供了可以與活細胞混合的聚合物混合物。
本發(fā)明涉及一種用于治療的聚合物水凝膠，所說的水凝膠是以下物質的共聚物(a)N-取代的異丁烯酰胺或者丙烯酰胺，(b)交聯劑，和(c)選自下組的可共聚的材料糖，糖衍生物，組織粘著肽，組織分化分子蛋白質(如骨形態(tài)形成蛋白質)以及具有脂質衍生物之抗體的聚合物共軛體，所說的聚合物水凝膠是有彈性和可變形的，并且具有含量為至少約80％，優(yōu)選地至少96％的平衡水。
優(yōu)選地，所說的N-取代異丁烯酰胺或丙烯酰胺(a)選自N-單烷基和N,N-二烷基異丁烯酰胺和丙烯酰胺，所說的交聯劑(b)包括丙烯酰胺或其前體，所說的可聚合的材料(c)是糖，該糖選自葡糖胺、N-乙酰葡糖胺和神經氨酸的N-乙酰衍生物和它們的聚合形式，例如聚唾液酸。
本發(fā)明也涉及一種制備用于治療的聚合物水凝膠的方法，該方法包括(a)將交聯劑溶解在具有自由基聚合引發(fā)劑的孔-形成溶劑中，以形成溶液，(b)將N-取代的異丁烯酰胺或丙烯酰胺加入到(a)中獲得的溶液中，以形成混合物，(c)將糖，糖衍生物，組織粘著肽，組織分化分子蛋白質或衍生的生物活性肽，或具有脂質衍生物之抗體的聚合物共軛體溶液加入到(b)中獲得的混合物中。
按照一個優(yōu)選的實施方案，該方法包括將偶氮二異丁腈和亞甲基雙丙烯酰胺溶解到所說的溶劑中形成溶液，將所說的溶液與N-2-(羥丙基)異丁烯酰胺混合，向其中加入葡糖胺或N-乙酰葡糖胺或N-乙酰神經氨酸，并且從中除去低分子量的殘余產物和引發(fā)劑微量物。
按照另一個實施方案，該方法包括將活組織細胞或遺傳修飾的細胞加入到(c)中獲得的產物中，并且使所說的細胞在所說的產物中聚合。
按照另一個實施方案，按照本發(fā)明的聚合物水凝膠包含聚合于其中的細胞或遺傳修飾的細胞。
按照另一個實施方案，本發(fā)明涉及用于治療損壞的腦部組織或脊髓的方法，該方法包括取走人類和動物中的所說的損壞的腦部組織或脊髓，用按照本發(fā)明的聚合物水凝膠替代所說的損壞的腦部組織或脊髓。
按照本發(fā)明的水凝膠是共價交聯的，不透明的，多相的材料。其優(yōu)選地顯示出明顯的相分離結構，該結構是由約1-10μm，優(yōu)選地約3-5μm的聚合物微粒形成的，由此，使得在所說的水凝膠用于與宿主組織接觸時給出相對粗大的孔(大孔)區(qū)域，在與向內生長的組織接觸時給出相對細小的孔(中孔)區(qū)域。
這導致優(yōu)選的具有大孔結構的海綿狀結構；例如至少80-90％的分孔隙率(汞侵入的體積對凝膠的總體積比)；優(yōu)選地幾百平方米/克凝膠范圍內的比表面區(qū)域；例如約15-35μm的中值孔徑(體積)；等于或大于10μm(等于100％的水凝膠分孔隙率)的孔的多孔體積；20-30μm的超孔特征(凝膠的分孔隙率至少為凝膠體積的50％)。
水凝膠的大結構和多孔結構可以提供控制顆粒大小和多孔結構來操作，后者取決于所使用的孔形成溶劑的組成和性質，聚合物的體積份數，聚合物-溶劑相互作用，聚合溫度和所使用的交聯單體的性質。成功的生物量積累和細胞相互作用導致產生這種最佳表面/體積相互作用(如汞孔隙學數據所顯示的)，其導致形成聚合物顆粒的小和中孔隙率。
材料的一個重要的最后方面是它的開放性質和適合于生物量細胞積累和細胞/分子與活組織相互作用的互相連接性(interconnectedness)。如圖3所示，在掃描電子顯微鏡下，這些多相凝膠通常顯示出膠狀的三維結構，具有非環(huán)狀的孔和由聚合物聚集體的表面的接觸代表的孔系統(tǒng)壁，如圖中所顯示的。有效的表面區(qū)是粒子表面孔隙率的函數。與均相凝膠相反，這樣的多相凝膠的一個主要優(yōu)點是由微粒所產生的表面區(qū)域實際上是無限的，因為聚集體(1)的大小降低，以便表面區(qū)域倒轉為1的比例。另外，與均相水凝膠比較，本發(fā)明的多相水凝膠顯示出大得多的多孔體積，因此對細胞滲透和生物量積累來說更有效。此外，與均相水凝膠比較，按照本發(fā)明的水凝膠具有與成熟的和發(fā)育的神經組織匹配的機械柔順性質。
這些水凝膠基質具有真正的組織特異性結構，因為細胞相互作用通過凝膠結構導致產生有組織的組織網絡，所謂的器官樣水凝膠。
所說的聚合物基質可以由同時沉淀或沉淀聚合和交聯有效量的以下各種組分的共聚合來形成(ⅰ)N-取代的異丁烯酰胺(如N-單烷基異丁烯酰胺)或N-取代的丙烯酰胺(如N-單烷基丙烯酰胺，或者N,N-二取代的丙烯酰胺，如N,N-二烷基丙烯酰胺；(ⅱ)交聯劑，如丙烯酰胺或其前體或二乙烯基化合物等；(ⅲ)自由基聚合引發(fā)劑，如偶氮二異丁腈，各種過氧化物，抗壞血酸，過氧硫酸鹽以及取代的氮雜化合物等，它們是本領域技術人員已知的，其用量在共聚物或三元共聚物重量的0.01和2％之間變化。(ⅳ)復合糖，如葡糖胺或N-乙酰葡糖胺或N-乙酰葡糖胺或N-乙酰神經氨酸或聚唾液酸或其它糖衍生物或組織粘著寡肽(包含序列，如Arg-Gly-Asp,Ile-Lys-Val-Ala-Val,Ala-His-Ala-Val-Ser-Glu Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)，組織分化分子來源的寡肽(例如，骨形態(tài)發(fā)生蛋白)或具有抗髓鞘質和軸突-相關脂質的抗體的聚合物共軛體，以及它們的衍生物，這些物質在溶劑中，優(yōu)選地在丙酮/二甲基亞砜，丙酮或丙酮/乙醇中。
烷基基團優(yōu)選地具有一至兩個碳原子，例如，C1到C2羥烷基和氨烷基基團。本文使用的術語N-取代的包括C1-8取代基，其可以含有羥基，氨基或它們的組合。
反應通常在由密封的安瓿組成的聚合容器中于40-60℃下進行約12小時。
附圖簡要描述圖1是均相凝膠的顯微鏡視圖；圖2是在脊柱的cirdl中移植的均相凝膠的顯微鏡視圖；圖3是HPMA多相凝膠的顯微鏡視圖；圖4是在神經組織中移植的圖3的凝膠的顯微鏡視圖。
實施發(fā)明的最好方式借助下列實施例說明本發(fā)明。實施例1將AIBN(偶氮二異丁腈)(1.2％W/W)和亞甲基雙丙烯酰胺(1mol％)溶解在干燥的丙酮中。將溶液與N-2-(羥丙基)異丁烯酰胺混合，達到30％的HPMA與丙酮/二甲亞砜(93∶7v/v)混合物的體積比，將N-異丁烯酰葡糖胺(5％wt)，或1-甲基-2-異丁烯酰氨基乙基-2-乙酰氨基-2-deoxdy-D-葡糖苷(6.5％wt)，或2-[l-甲基-2-異丁烯酰氨基乙基)5-乙酰胺基-3,5-二脫氧-D-甘油-α-半乳糖-2-nonulopyranosidonic酸(5.2％wt)，或異丁烯酰甘氨?；拾滨；滨；拾滨；於彼?1.4％wt)溶解到二甲亞砜中，并添加至聚合混合物中。使混合物充分勻化，裝入注射器中和注射到安瓿中。然后用氮凈化反應混合物，經加溫密封安瓿。為了避免溶劑蒸發(fā)，可以在加溫安瓿前首先用干冰和乙醇混合物凍結混合物，接著于50℃將密封的安瓿浸沒在水浴中24小時。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明，在水凝膠產物使用之前，從其中除去沒有包括在網絡中的低分子量剩余產物(例如未反應的單體和、寡聚物)和引發(fā)劑微量物。這一過程可以通過以下方法達到將干凝膠浸沒在乙醇中20小時，然后在乙醇/水混合物(1∶1V/V)中20小時，在蒸餾水中一周(進行頻繁的水交換，直到達到膨脹平衡，并且交換率低，優(yōu)選地為0時)。另一個本發(fā)明的重要的方面是避免污染。聚合物凝膠的制備優(yōu)選地是在具有過濾的空氣流的防生物危害室中進行。洗滌步驟優(yōu)選地利用無菌物質完成，并且凝膠在4℃下在無菌的蒸餾水中貯存。
為了形成雜合細胞裝置(它包括聚合物裝置和供體組織細胞兩者)，采用含有所說細胞懸液的Hamilton seringue通過聚合物網絡的微刺法可以將細胞接種到聚合物水凝膠多孔結構中。在水凝膠移植到靶器官區(qū)域后，接著足夠的二聚(dime)，可以在體外或體內進行細胞向所說的聚合物水凝膠中的引入?？梢詮娜四X或肌肉組織或尸體解剖材料分離細胞。實施例2體外將細胞引入到PHPMA水凝膠中用DMEM從大鼠胚的腦部半球分離無腦膜和blod脈管的神經元，并切成組織小碎片。在包含DMEM的離心機管中以巴斯德移液管機械分離組織。保存上清液，用已經用火磨光成窄小的尖端的巴斯德移液管進一步破碎沉淀的組織碎片。在幾個循環(huán)的細胞懸浮/分離后離心收集的上清液，將細胞濃縮至每100μl介質106個細胞。將組分保持在冰上，直到用于細胞包埋。為了有效的和可靠的將細胞穿入聚合物水凝膠中，將細胞引入到連接有微調裝置的Hamilton seringue中，并用所需濃度以最低的壓力損害在雙目顯微鏡下和無菌條件下接種到膨脹的PHPMA水凝膠中。將包含細胞的水凝膠保持在小體積的培養(yǎng)基中，并在37℃下在潮濕氛圍的5％的CO2中培養(yǎng)。一旦細胞達到生長的適當程度，就可以將雜合裝置移植進人腦中，以促進組織重構和修復。
聚合物混合物可以與活細胞混合，由此使聚合物基質的物理的特征與水凝膠型行為(孔隙率，穩(wěn)定性，指導表面，通透性)和細胞生物因子(例如，生長因子)相結合。
通過在0℃以下的溫度下達到細胞向聚合物基質的引入，即冷聚合，其產生多孔基質，在該基質內，細胞被固定化并且能夠達到重構、生長和/或分化，供后續(xù)移植。溶劑應當是具有合適的冷保護劑(甘油/二甲亞砜或甘油或DMSO或聚乙烯基吡咯烷酮或羥乙基淀粉，羧甲基纖維素)等滲溶液或者是通常用于細胞和組織培養(yǎng)類型的組織培養(yǎng)基。該方法使得可以控制最后的從幾個細胞的細胞密度到接近組織細胞密度的細胞密度，約109-1010個細胞/cm3。該方法也使得可以通過變化冷卻的速率包含細胞的聚合混合物的溫度(液氮或冷的異戊烷)來改變和控制基質孔隙率。該方法產生一種典型的冷凝膠大孔海綿狀結構，其具有允許營養(yǎng)物和大分子(例如生長因子)擴散到包埋在聚合物凝膠基質內的細胞內和從這些細胞擴散的孔大小，孔體積適合于在組織發(fā)育和成熟期間有效的生物量積累，擴展(細胞分裂)和組構(細胞與細胞接觸)。實施例3通過HPMA的冷聚合凝膠包埋星形細胞通過于37℃在含有0.1％胰島素-EEDTA,0.001％DNA(在Hepes緩沖的DMEM中)的溶液中培養(yǎng)2日齡大鼠的腦部皮質30分鐘獲得星形細胞，并機械分離。將細胞以106個細胞/10ml平板接種到塑料燒瓶上，并于37℃保持在具有10％胎牛血清的DMEM中。體外7天之后，收獲星形細胞，并重懸于含有20％甘油的Hank’平衡鹽溶液(HBSS,pH7.4)中，濃縮至每100μl106，并保持在6℃下。在層流柜櫥中并利用無菌材料進行包埋過程。預聚合溶液由下列物質組成0.69gN-(2-羥丙基)異丁烯酰胺和0.010g溶解在含有20％甘油2.3ml的HBSS中的亞甲基雙丙烯酰胺和作為引發(fā)劑的過硫酸銨(100mg/mL HBSS；4.3×10-3M)以及用HBSS(1∶1v/vHBSS；3.3×10-5M)稀釋的N,N,N′,N′-四亞甲基二胺。用0.1N HCl將pH調節(jié)至7.0，用氮氣使預聚合溶液脫氣，在使用前預冷至4℃。以106個細胞/ml的密度將細胞懸浮在高密度的預聚合物混合物中，充分混合混合物，在兩個預冷的玻璃平板之間(聚硅氧烷橡密封劑分開0.75mm，以使最終體積為3ml)用Hamilton seringue注射。通過浸沒在液氮中將模子在大約在1min內冷卻至-170℃，在轉移到水浴中于-15℃冷卻之前使其留在液氮中3分鐘。在冷水浴中進行聚合反應5小時，然后將模子在37℃的冰浴中解凍。在冰破碎之后，從模子移走凝膠，以HBSS洗滌以便除去冷保護劑與未反應的產物，并修整成具有0.8mm直徑的環(huán)狀盤。將凝膠盤在37℃和5％CO2(在補充有10％FBS和1％抗生素(鏈霉素-青霉素)的DMEM中)潮濕氛圍中溫育。
用于聚合物水凝膠雜合組織制造的這一方法與Woerly等公開的方法(1996)比較具有兩個主要優(yōu)點在低溫時阻止膜細胞被聚合損害和在細胞周圍形成導致增加的孔隙率和固定的孔結構的冰晶(多相水凝膠)。結果，細胞被包埋在聚合物基質內，該基質具有用于組構的支架結構，大的內部表面區(qū)域，供細胞擴展和增加通透性的足夠空間。此外，細胞聚合物混合物可以按照以上的描述為爾后的聚合冷凍保持一次。
在細胞發(fā)育的任何階段，所形成的雜合基質由固相(其包含多孔基質，細胞和細胞胞外基質)和液相(相應于細胞培養(yǎng)介質和胞外液體)組成。
本領域技術人員會認識到，這一方法不同于所謂的“細胞膠囊化”方法，后者利用微或大膠囊化技術，其中的細胞只是簡單地包封在具有球形和可變直徑的聚合物膜內。
如本文所使用的，術語“細胞”用來包括組織片段、細胞塊，胚胎、新生兒或成年人來源的單細胞，遺傳修飾的細胞，原初細胞或無限增殖化細胞，腫瘤細胞系或無限增殖化前體細胞系來源的無限增殖化細胞系，莖干或祖細胞系，任何組織和器官的成長因子-選擇前體細胞系。本發(fā)明的方法與產物適于制備用于移植的或三維培養(yǎng)系統(tǒng)的各種人工組織或器官。
為此，例如，將在包含10％-20％甘油(作為冷保護劑)的Hank’平衡鹽溶液(無菌HBSS,pH7.4)中的細胞懸液在4℃下溫育10分鐘。將如實施例1所描述的由可聚合的組分組成的預聚合溶液溶解在包含10％-20％甘油的HBSS中。通過多孔玻璃濾器過濾溶液，真空脫氣，并且在冰中預冷。用溶解在HBSS中的過硫酸鹽抗壞血酸或過硫酸鹽四亞甲基二胺引發(fā)自由基聚合反應。用1N鹽酸將溶液pH值調節(jié)至中性。以可變的密度(優(yōu)選地是106細胞/ml聚合混合物)將細胞懸浮在聚合溶液中。充分攪拌混合物，裝入注射器中，注射到安瓿中或注射到由兩個玻璃平板(由尺寸可變的聚硅氧烷橡膠密封劑分開的)或用安瓿制成的模子中。通過浸沒在液氮中將模子或安瓿迅速冷卻，并轉移到水浴中在-10℃至-30℃下冷卻。將冷聚合反應進行至少5個小時，優(yōu)選地是12個小時。在聚合后，將模子或安瓿在37℃水浴中解凍，同時除去凝膠，以HBSS洗滌，改變其大小使其成為合適的形狀。將凝膠轉移到5％CO2培養(yǎng)器中，所述培養(yǎng)器中具有優(yōu)選的培養(yǎng)介質，其含有抗生素和抗真菌藥物。在流櫥中并利用無菌儀器完成該過程。試驗1通過移植進大鼠橫切(transected)脊髓和腦損傷部位來研究本發(fā)明的聚合物水凝膠的生物學耐受性。移植后1周到10月采取試驗樣品。生物學耐受性良好。目視可見，凝膠整合進宿主組織，說明良好的穩(wěn)定性，并且在某些情況下，宿主器官表現得完整。顯微學研究表明，轉移聚合物水凝膠配方在半和橫切(transected)大鼠脊髓的移植位點促進組織再構和軸索再生，由此達到100％的組織連續(xù)性恢復(圖4)。數據總結如下(ⅰ)水凝膠的整合和器官的連續(xù)性恢復；水凝膠保持損傷的體積大小，以便新的組織可以發(fā)育和由其多孔表面粘著到傷口上替代損傷。(ⅱ)具有總的可用聚合物表面的平滑表面；(ⅲ)在鄰近的宿主組織中最小限度的留下傷痕和沒有囊腔化作用；(ⅳ)在加強移植物對宿主的連接的聚合物網絡之內基于神經膠質的組織網絡的向內生長；(ⅴ)多相來源的細胞的向內生長；(ⅵ)毛細管向內生長；(ⅶ)如免疫組織化學所見，在聚合物網絡的表面的胞外基質分子(膠原，fibronectine和層粘連蛋白)的沉積；和(ⅷ)軸索成長遍及生物移植物。移植的水凝膠的紅外線光譜學研究顯示，天然水凝膠(非移植的)的紅外光譜被脂質和蛋白質化合物的典型的紅外特征所替代，類似于鄰近的脊柱組織，證實脊髓組織元件整合進水凝膠的多孔網絡。試驗2冷聚合方法使得可以產生多相凝膠，其具有細胞固定化在其中的固定的大孔結構。使用細胞標記技術(例如細胞標記)或免疫細胞化學的研究表明，細胞在整個聚合物網絡中均勻分布，在凝膠中有不同的水平，以單個分離的細胞存在或以幾個細胞的小簇排列。通過用發(fā)育神經組織細胞的抗原輪廓3周的體外培養(yǎng)后，存活的細胞是免疫染色陽性的。因此，從大鼠新生腦分離的星形細胞可以由冷聚合反應以保留的高水平包藏到親水水凝膠中，所包藏的細胞可以存活，并且通常與它們在單層培養(yǎng)條件下一樣分化，在體外10天后，包藏的細胞的存活率是90％(采用細胞標記技術)。此外，當它們在聚合物基質內合成層粘連蛋白和fibronectine時，與它們在單層培養(yǎng)物中一樣是功能性的。
所說的聚合物水凝膠旨在主要用作組織膨脹物和組織形成模板，通過促進新的功能性整合的組織-到-器官，恢復組織缺陷或身體的軟器官的組織缺陷(其引起損傷或外科操作或先天性畸形)。其也旨在用于經工程化使創(chuàng)傷愈合，組織再構，組織再生，軟器官(如肝臟，胰腺，皮膚，肌肉)的組織發(fā)育。其也可以與用于骨再生和修復的其它材料結合起來。
另一種聚合物水凝膠的應用在于開發(fā)為特定的人神經學上的紊亂提供治療法的方法，按照疾病的類型和功能性缺陷的程度，所說的聚合物水凝膠可以以兩種不同的方式使用。首先，它可以用作組織再生模板或用作摻入細胞移植物后的細胞載體。按照本發(fā)明的聚合物水凝膠例如旨在用于治療發(fā)育階段或成熟階段中的腦和脊髓特定區(qū)域的損壞的或先天的缺陷(例如脊髓損傷)。典型地，所說的方法包括除去損壞的組織或傷疤組織或神經組織的任何功能失常部分，并且用以上所描述的聚合物水凝膠替代的腦部組織或脊髓組織。按照本發(fā)明的聚合物水凝膠在重構神經回路(其與發(fā)育階段或成熟階段的中樞神經系統(tǒng)中的軸索途徑有關)。例如，記憶功能(例如在阿耳茨海默氏疾病中其被削弱)中所牽涉的septo-hippocampala回路，或在帕金森病或杭廷頓氏舞蹈病中的部分紋狀體中所牽涉的黑紋狀體回路，或牽涉hypophyso-hypothalamus組織體系的垂體-下丘腦激素/再生不良作用。這通過外科除去腦組織的缺陷部分并移植按照本發(fā)明的凝膠(優(yōu)選地是用神經細胞移植物，以誘導新的功能性軸索回路的形成)完成。以相同的方式，導致脊髓回路功能失常的畸形(例如脊柱bifida)也可以通過除去異常形成形成的部分器官和用按照本發(fā)明的神經凝膠(優(yōu)選地是用神經元細胞移植物)替代缺陷部分。按照本發(fā)明的水凝膠的另一個應用是通過以相同的方式經按照本發(fā)明的聚合物水凝膠誘導軸索再生長治療視神經與外周神經。
可以理解，本發(fā)明不限于以上所描述的優(yōu)選的實施方案，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進行修改是可能的。
權利要求
1．一種用于治療的聚合物水凝膠，所說的水凝膠是以下物質的共聚物，(a)N-取代的異丁烯酰胺或者丙烯酰胺，(b)交聯劑，和(c)選自下組的可共聚的材料復合糖，糖衍生物，組織粘著肽以及具有脂質衍生物抗體的聚合物共軛體，所說的聚合物水凝膠是多相的，有彈性和可變形的，并且具有含量為至少約80％的平衡水。
2．按照權利要求1的聚合物水凝膠，其中(a)所說的N-取代的異丁烯酰胺或者丙烯酰胺選自N-單烷基和N,N-二烷基異丁烯酰胺和丙烯酰胺，(b)所說的交聯劑包括丙烯酰胺或其前體，(c)所說的可聚合的材料是糖，該糖選自葡糖胺、N-乙酰葡糖胺和神經氨酸的N-乙酰衍生物。
3．按照權利要求2的聚合物水凝膠，其中所說的烷基含有1-2個碳原子。
4．按照權利要求3的聚合物水凝膠，其中所說的烷基是羥烷基或氨烷基。
5．按照權利要求1的聚合物水凝膠，其中所說的平衡水的含量為至少96％。
6．按照權利要求1的聚合物水凝膠，其中所說的水凝膠是共價交聯的，實質上不透明的，并且構成一種多相的材料。
7．按照權利要求6的聚合物水凝膠，其中所說的水凝膠顯示出明顯的相分離結構，該結構是由約1-10μm的聚合物微粒形成的，由此，使得在所說的水凝膠用于與宿主組織接觸時給出相對粗大的孔區(qū)域，在與向內生長的組織接觸時給出相對細小的孔區(qū)域。
8．按照權利要求1的聚合物水凝膠，其具有大孔結構，該結構具有至少80-90％的分孔隙率，至少100平方米/克的比表面區(qū)域，約15-35μm的中值孔徑，測定值至少10μm(等于100％的水凝膠分孔隙率)的孔的多孔體積；20-30μm范圍內的超孔特征。
9．一種制備用于治療的聚合物水凝膠的方法，該方法包括(a)將交聯劑溶解在具有自由基聚合引發(fā)劑的溶劑中，以形成溶液，(b)將N-取代的異丁烯酰胺或丙烯酰胺加入到(a)中獲得的溶液中，以形成混合物，(c)在有效給出所說的聚合物凝膠的條件下，將可聚合的材料的溶液加入到(b)中獲得的混合物中，所說的可聚合的材料包括復合糖，復合糖衍生物，組織粘著肽或具有脂質衍生物抗體的聚合物共軛體。
10．按照權利要求9的方法，該方法包括將偶氮二異丁腈和亞甲基雙丙烯酰胺溶解到所說的溶劑中形成溶液，將所說的溶液與N-2-(羥丙基)異丁烯酰胺混合，向其中加入葡糖胺或N-乙酰葡糖胺或N-乙酰神經氨酸，并且從中除去低分子量的殘余產物和引發(fā)劑微量物。
11．按照權利要求9的方法，其中所說的交聯劑選自丙烯酰胺、其前體和二乙烯基交聯劑。
12．按照權利要求9的方法，其中所說的聚合引發(fā)劑選自是由偶氮二異丁腈，過氧化物，抗壞血酸，過氧硫酸鹽以及取代的氮雜化合物，并且以所形成的聚合物水凝膠重量的0.01和2％之間的范圍的量使用。
13．按照權利要求l2的方法，其中所說的可聚合的材料的溶液包含復合糖。
14．按照權利要求13的方法，其中所說的復合糖選自葡糖胺，N-乙酰葡糖胺，神經氨酸的N-乙酰衍生物，聚唾液酸和galactosene。
15．按照權利要求12的方法，其中所說的可聚合的材料的溶液包含組織粘著肽。
16．按照權利要求12的方法，其中所說的可聚合的材料的溶液包含具有脂質衍生物抗體的聚合物共軛體。
17．按照權利要求12的方法，其在40至60℃之間的溫度下進行約12小時。
18．按照權利要求9的方法，該方法包括將活組織細胞或遺傳修飾的細胞加入到(c)中獲得的產物中，并且使所說的細胞與所說的產物聚合。
19．一種共聚的按照權利要求1的聚合物水凝膠，其中活的組織細胞或遺傳修飾的細胞在其中是聚合的。
20．用于治療損壞的腦部組織或脊髓的方法，該方法包括取走人類或動物中的所說的損壞的腦部組織或脊髓，用按照權利要求1的聚合物水凝膠替代所說的損壞的腦部組織或脊髓。
21．一種用于治療的共聚物水凝膠，所說的水凝膠是下列物質的共聚物(a)N-取代的異丁烯酰胺或者丙烯酰胺，(b)交聯劑，和(c)可聚合的組織-粘著材料。
22．用于治療哺乳動物疤痕、損壞的或功能缺陷的組織的方法，該方法包括取走所說的疤痕、損壞的或功能缺陷的組織，用按照權利要求1的聚合物水凝膠替代它們。
23．根據權利要求22的方法，用于重建與中樞神經系統(tǒng)中軸索路徑相聯系的神經元回路。
24．按照權利要求22的方法，用于治療視神經和外周神經的創(chuàng)傷性損傷。
全文摘要
本發(fā)明的水凝膠是N－取代的異丁烯酰胺或者丙烯酰胺,交聯劑與復合糖或其衍生物,組織粘著肽或者具有抗體的聚合物共軛體的共聚物。該聚合物是多相的,有彈性和可變形的,并且具有含量為至少約80%的平衡水。其可以用于在例如發(fā)育的和成熟的神經系統(tǒng)中的組織再生和器官修復。
文檔編號A61L31/14GK1211194SQ97191715
公開日1999年3月17日 申請日期1997年10月15日 優(yōu)先權日1996年10月16日
發(fā)明者S·沃爾利 申請人:有機凝膠加拿大有限公司