專利名稱：蛋抗炎成分、分離方法和用途的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及天然食料中產(chǎn)生的抗炎成分。本發(fā)明具體涉及蛋抗炎成分、以大致高度純化形式生產(chǎn)它的方法和它在治療炎癥中的用法。
《多蘭氏醫(yī)學(xué)詞典)》中定義的炎癥為“組織損傷或破壞引起局部保護(hù)反應(yīng)，該反應(yīng)用來破壞、稀釋或隔開所述損傷劑和所述損傷組織。其特征在于微脈管系統(tǒng)穿孔、血液成分滲漏到間質(zhì)空間以及白細(xì)胞遷移到發(fā)炎組織中。在宏觀水平上，這一般伴隨著紅斑、腫脹、痛覺過敏(觸痛)和疼痛的熟悉的臨床癥狀。
在所述復(fù)雜反應(yīng)期間，局部釋放化學(xué)介質(zhì)，諸如組胺、5-羥基色胺、各種趨化組合物、緩激肽、白三烯和前列腺素。吞噬細(xì)胞遷移到該區(qū)域中，細(xì)胞溶酶體膜可能破裂，釋放裂解酶。所有這些事件都可能引起所述炎癥反應(yīng)。
患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的炎癥涉及抗原與抗體補(bǔ)體的結(jié)合引起局部釋放吸引白細(xì)胞的趨化和化學(xué)激活組合物。白細(xì)胞吞噬抗原-抗體與補(bǔ)體的復(fù)合體，也釋放它們的溶酶體中含有許多酶。這些溶酶體酶然后引起軟骨和其它組織的損傷，這加劇了炎癥的程度。也可能涉及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在該過程中，也釋放前列腺素，它是細(xì)胞功能的關(guān)鍵胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑。
局部過敏壞死反應(yīng)為抗原與該抗原的抗體復(fù)合的皮下部位形成免疫復(fù)合物引起的炎癥反應(yīng)。嗜中性白細(xì)胞特征性地粘附到皮下注射部位處形成的免疫球蛋白復(fù)合物的Fc部分，在此部位它們釋放消化酶，引起可見的急性炎癥。因此，該反應(yīng)主要是嗜中性白細(xì)胞介導(dǎo)的，影響該反應(yīng)發(fā)展的藥劑通過對(duì)這些細(xì)胞的作用介導(dǎo)該反應(yīng)。
藥劑有幾種可能的途徑干擾嗜中性白細(xì)胞從所述血管遷移到炎癥部位。一個(gè)可能的途徑是抑制貼壁，即炎性細(xì)胞的可逆地附著或“粘附”到所述血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞襯里上。這種附著受粘附和整聯(lián)蛋白分子的質(zhì)量和數(shù)量的精確調(diào)節(jié)，這些分子用作白細(xì)胞的“velcro”和血管的襯里。在正常狀態(tài)下，大約50％的嗜中性白細(xì)胞可逆地附著，但在急性炎癥反應(yīng)期間，附著變得強(qiáng)得多，為嗜中性白細(xì)胞遷移過程中的關(guān)鍵步驟。盡管前列腺素不可能參與趨化反應(yīng)，但花生四烯酸的另一種代謝產(chǎn)物白三烯是非常有效的趨化物質(zhì)。
所述炎癥反應(yīng)為特征為上述炎癥的任何反應(yīng)。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知所述炎癥反應(yīng)引起多種身體不適(即疼痛和功能喪失)，最終涉及不同疾病和損傷。因此，通常的醫(yī)學(xué)實(shí)踐是給與減輕所述炎癥反應(yīng)的身體不適的藥劑。具有這些性質(zhì)的藥劑分類為抗炎的?？寡姿幬镉脕碇委煻喾N疾病，同樣的藥物通常用來治療不同疾病。用抗炎藥物的治療不是治療所述疾病，大多數(shù)通常用于治療癥狀(即炎癥)。
抗炎、鎮(zhèn)痛和退熱藥是不同類的化合物，通常是化學(xué)上無關(guān)的，然后它們共有某些治療作用和副作用。皮質(zhì)類固醇代表最廣泛使用的一類治療炎癥的化合物。蛋白水解酶代表另一類被認(rèn)為具有抗炎作用的化合物。直接或間接引起腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生和分泌類固醇的激素代表另一類抗炎化合物。
不幸的是，所述天然和合成皮質(zhì)類固醇制劑引起多種嚴(yán)重的副作用，包括升高血壓、鹽和水潴留、腎損害和提高鉀和鈣的排泄。此外，皮質(zhì)類固醇可以掩蓋感染的癥狀并增加傳染性微生物的播散。這些激素被認(rèn)為在孕婦中使用是不安全的，長期的皮質(zhì)類固醇治療已經(jīng)與胃機(jī)能亢進(jìn)和/或消化性潰瘍相關(guān)聯(lián)。用皮質(zhì)類固醇治療亦會(huì)加重糖尿病，需要更高劑量的胰島素，并且可能產(chǎn)生精神障礙。間接增加內(nèi)源皮質(zhì)類固醇產(chǎn)生的激素抗炎藥具有引起不利副作用的同樣潛力。
已經(jīng)描述了多種非類固醇抗炎藥(NSAID’s)。其中，最廣泛使用的是水楊酸鹽。乙酰水楊酸或阿斯匹林是開處方最多的鎮(zhèn)痛-退熱和抗炎藥。在Physician’s Desk Reference中列出了類固醇和非類固醇抗炎藥的實(shí)例。
所述NSAID’s是合成生化化合物，它在高劑量下由于多種不良副作用而有毒。例如，水楊酸鹽引起嚴(yán)重酸堿平衡失調(diào)，特征為該類化合物中毒。水楊酸鹽直接和間接刺激呼吸。毒性劑量的水楊酸鹽引起中樞呼吸麻痹以及在血管舒縮抑制后的循環(huán)性虛脫。食入水楊酸鹽可能導(dǎo)致上腹部痛苦、惡心和嘔吐。水楊酸鹽誘導(dǎo)的胃出血是眾所周知的。水楊酸鹽可以產(chǎn)生肝損傷并延長凝血時(shí)間。因此，在患有嚴(yán)重肝損害、血凝血酶原過少、維生素K缺乏或血友病的病人中應(yīng)該避免阿斯匹林，因?yàn)樗畻钏猁}抑制血小板止血可能導(dǎo)致出血。水楊酸鹽中毒是常見的，每年在美國有超過10,000個(gè)嚴(yán)重水楊酸鹽中毒的病例，其中一些是致命的，許多發(fā)生在兒童中。參見Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics，第7版，1985。
因此，盡管目前可利用大量的抗炎藥，但仍需要安全有效的、無副作用和不利反應(yīng)的抗炎產(chǎn)品。
如果可以獲得具有抗炎作用的天然食品，那么可能提供容易給藥的、易于利用的安全的治療組合物。相關(guān)領(lǐng)域已經(jīng)報(bào)道了具有多種治療作用的牛乳。美國專利4,423,782公開了含有突變鏈球菌抗體、具有抑制齲齒作用的牛乳。通過用突變鏈球茵以兩個(gè)階段免疫奶牛獲得所述牛乳。美國專利4,284,623公開了具有抗炎性質(zhì)的牛乳。美國專利4,879,110公開了具有抗高血壓性質(zhì)的牛乳。美國專利3,128,230公開了通過給奶牛接種抗原混合物獲得的含有α、β和γ組分的球蛋白的牛乳。美國專利3,376,198、加拿大專利587,849和英國專利1,211,876也已經(jīng)描述了含有抗體的牛乳。美國專利4,897,265號(hào)和美國專利4,636,384(Reissue No.33,403)公開了通過喂動(dòng)物含有抗體牛乳降低血脂濃度的方法，所述牛乳得自通過注射多價(jià)細(xì)菌抗原保持在超免疫狀態(tài)的奶牛。
鳥綱的各個(gè)屬(諸如雞(Gallus domesticus)、火雞和鴨)在血液和蛋中產(chǎn)生抗引起鳥類疾病的抗原的抗體以及抗其它抗原的抗體。例如，LeBacq-Verheyden等(Immunology:27:683(1974))和Leslie,G.A.等(J.Med.130:1337(1969))已經(jīng)定量分析了所述雞的免疫球蛋白。Polson,A.等(Immunological Communications 9:495-514(1980))對(duì)幾種蛋白和蛋清的天然混合物免疫母雞，并在所述蛋黃中檢測到IgY抗體。Fertel,R.等(Biochemical and Biophysical Research Communications 102:1028-1033(1981))對(duì)前列腺素免疫母雞，并在蛋黃中檢測到抗體。Jensenius等(Joumal of Immunological Methods 46:63-68(1981))提供了用于免疫診斷的蛋黃IgG的分離方法。Polson等(Immunological Communications9:475-493(1980))描述了從用多種植物病毒免疫的母雞蛋黃中分離的抗體。
美國專利4,357,272公開了從得自超免疫母雞的蛋黃分離抗體。通過重復(fù)注射得自植物病毒、人類IgG、破傷風(fēng)抗毒素、蛇抗蛇毒和Semeba的抗原引起超免疫，美國專利4,550,019公開了從蛋黃中分離抗體，所述抗體是通過用分子量或顆粒重量至少為30,000的免疫原超免疫的母雞產(chǎn)生的。用來超免疫所述雞的抗原選自植物病毒、人類免疫球蛋白、破傷風(fēng)毒素和蛇毒。
另外，養(yǎng)雞場研究和對(duì)照感染實(shí)驗(yàn)顯示抗體蛋黃凍干粉和免疫全蛋凍干粉對(duì)腸毒性大腸桿菌的保護(hù)作用(Wiedermann等，J.Vet.Med.B.38:283-291(1991))?？诜捎脽釟⑺赖腒-99帶茵毛腸毒性大腸桿菌抗原接種疫苗的母雞制備的蛋黃粉，保護(hù)新生小牛免于大腸桿菌誘導(dǎo)的腹瀉(Ikemori等，Am.J.Vet.Res.53:2005-2008(1992))。
也已經(jīng)表明，給予感染輪狀病毒的小鼠抗輪狀病毒IgY提供完全的保護(hù)(Ebina等，Microbiol.Immunol.34:617-629(1990))。此外，發(fā)現(xiàn)含有抗緩慢愛得華氏菌抗體的蛋黃有效地預(yù)防日本鰻的edwardsiellosis(Gutierrez等，J.Fish Diseases 16:113-122(1993))。
美國專利4,784,018公開了被動(dòng)免疫哺乳動(dòng)物的方法，包括胃腸外給與純化抗體，所述抗體由已經(jīng)對(duì)相應(yīng)抗原免疫的鳥蛋獲得的，其中所述哺乳動(dòng)物有食用所述蛋的歷史。美國專利4,748,018中公開的專利延伸了美國專利4,748,018中公開的概念，因?yàn)榭梢酝ㄟ^適當(dāng)?shù)耐緩?，而不僅僅胃腸外給與所述蛋抗體。
頒發(fā)給DCV-Biologics的美國申請序號(hào)08/688,576公開了通過向受治療者給與超免疫蛋和/或牛乳或其部分，預(yù)防、抵抗或減輕受治療者慢性胃腸疾病或非類固醇抗炎藥誘導(dǎo)胃腸損害。
在美國專利5,215,746中公開了對(duì)特定細(xì)菌抗原免疫雞的蛋提供哺乳動(dòng)物中抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。
從用突變鏈球茵免疫的雞獲得含突變鏈球茵抗體的蛋(Otake等，J.Dental Research 70:162-166(1991))，它抑制齲齒的發(fā)展。
然而，這些參考文獻(xiàn)沒有一個(gè)公開或提示蛋可以產(chǎn)生可以給與動(dòng)物以預(yù)防或減輕炎癥的成分和/或因子。沒有一個(gè)公開或提示提供合理預(yù)計(jì)任何鳥類的處理可以在蛋中產(chǎn)生這一組合物和/或因子的方法。這些參考文獻(xiàn)沒有一個(gè)提示或公開產(chǎn)生所需治療效果的蛋抗炎組分的特性。
發(fā)明概述本發(fā)明基于本發(fā)明人的以下發(fā)現(xiàn)在蛋和蛋產(chǎn)品中，特別是從超免疫鳥類獲得的蛋產(chǎn)品中有抗炎活性，所述蛋和蛋產(chǎn)品給予受治療者，特別是哺乳動(dòng)物時(shí)，預(yù)防或減輕所述受治療者的炎癥。
特別是，本發(fā)明涉及從鳥蛋中獲得的高度純化的抗炎成分。在從蛋黃和蛋清分離的部分中都發(fā)現(xiàn)抗炎活性。
本發(fā)明也涉及用以下方法生產(chǎn)的高度純化的抗炎成分，該方法包括通過給予鳥類一種或多種抗原、特別是細(xì)菌抗原超免疫所述鳥類，從該超免疫鳥類收集蛋，然后從中分離所述高度純化的抗炎成分。
超免疫方法產(chǎn)生來自鳥蛋的超常水平的高度純化的抗炎成分。令人驚訝地是，通過所述超免疫方法可以提高蛋黃和蛋清中的該抗炎成分的水平。
本發(fā)明也包括治療受治療者、特別是哺乳動(dòng)物炎癥的方法，該方法包括給予所述受治療者大致純的抗炎成分或包含所述大致純的抗炎成分的組合物。該方面包括給予抗炎全蛋和/或其部分。
本發(fā)明還涉及使用含有所述抗炎成分的蛋和/或所述高度純化的抗炎因子本身，以防止淋巴細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞附著在小靜脈的內(nèi)皮上或(分離已經(jīng)附著在小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞襯里上的淋巴細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞)和減少淋巴細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞的遷移，并由此減少過度的腫脹和流體的積累。這樣，所述組合物用來減少與所述炎癥反應(yīng)相關(guān)的組織損害。
本發(fā)明最后包括在哺乳動(dòng)物中表現(xiàn)出抗炎活性的大致純的抗炎成分。
附圖簡述

圖1為顯示通過DEAE Sepharose離子交換色譜分離分子量低于30,000的蛋抗炎成分的色譜圖。
圖2圖示用分子量低于30,000的蛋抗炎成分抑制胸膜白細(xì)胞遷移。
圖3圖示用來自用己烷-乙醇脫脂蛋黃的無內(nèi)毒素抗炎成分抑制大鼠胸膜白細(xì)胞的遷移。
圖4為從蛋黃制備分子量低于30,000的抗炎成分的流程圖。
圖5為從液體蛋清中制備分子量低于30,000的抗炎成分的流程圖。
圖6圖示用來自用超臨界CO2萃取脫脂S-100蛋黃的分子量低于30,000的無內(nèi)毒素抗炎成分抑制大鼠胸膜白細(xì)胞。
圖7為從蛋黃干粉中制備分子量低于30,000的抗炎成分的流程圖。
圖8為從粉狀蛋黃中純化分子量低于3,000的抗炎成分的流程圖。
圖9為從粉狀蛋清中純化分子量低于3,000的抗炎成分的流程圖。
圖10為通過DEAE Poros離子交換色譜分離分子量低于3,000的蛋抗炎成分的色譜圖。
圖11圖示用來自蛋黃和蛋清的分子量低于3,000的高度純化部分抑制白細(xì)胞的遷移。
圖12圖示用小于3,000MW的DEAE峰2和來自超免疫蛋黃小于10,000MW的超濾液抑制白細(xì)胞的遷移。
圖13圖示來自蛋的分子量低于3,000的高度純化抗炎成分與抗炎藥(NSAIDS)(消炎痛和阿斯匹林)的比較。
圖14為HPLC分離來自超免疫蛋黃的分子量低于3,000的抗炎成分的色譜圖。
圖15為HPLC分離來自超免疫蛋黃DEAE部分的色譜圖。
發(fā)明詳述定義術(shù)語“蛋產(chǎn)品”是指本文所述含有抗炎蛋或蛋部分的任何產(chǎn)品。
術(shù)語“抗炎蛋或蛋部分”是指含有本文公開的抗炎成分、特別是用本文公開的方法生產(chǎn)的抗炎成分的蛋或蛋部分。
術(shù)語“抗炎成分”是指對(duì)抗或抑制炎癥過程的成分。
術(shù)語“大致純的蛋抗炎成分”是指純度至少為實(shí)施例3和典型材料和圖所述純度的抗炎成分。
術(shù)語“高度純化的蛋抗炎成分”是指純度至少為實(shí)施例4和典型材料和圖所述純度的抗炎成分。
術(shù)語“抗炎因子”是指對(duì)抗或抑制所述炎癥過程的大致純的因子，所述因子存在于純度至少為實(shí)施例7所述純度所述抗炎成分中。
術(shù)語“聯(lián)合衍生抗原”是指通過聯(lián)合合成在抗原中產(chǎn)生分子多樣性的新方法。
術(shù)語“生物工程抗原”是指通過允許插入和翻譯具有抗原性質(zhì)的蛋白的基因克隆技術(shù)和基因重排獲得的抗原。
術(shù)語“基因疫苗”是指一般通過重組技術(shù)生產(chǎn)的、可以引起免疫應(yīng)答的核酸疫苗。
術(shù)語“超免疫蛋”是指從保持在超免疫狀態(tài)的產(chǎn)蛋動(dòng)物中獲得的全蛋或得自它的產(chǎn)品。
術(shù)語“超常水平”是指超過未保持在超免疫狀態(tài)的產(chǎn)蛋動(dòng)物的蛋中發(fā)現(xiàn)水平的水平。
術(shù)語“餐桌上的蛋”是指非超免疫蛋。
術(shù)語“炎癥”以其領(lǐng)域認(rèn)同的意義，用作由組織損傷或破壞引起的局部保護(hù)性反應(yīng)，該反應(yīng)用來破壞、稀釋或隔開損傷劑和受傷組織，特征為不適當(dāng)?shù)姆强刂菩问降牡湫秃蠊奶弁?、發(fā)熱、發(fā)紅、腫脹和功能喪失，組織學(xué)上涉及一系列復(fù)雜事件，包括小動(dòng)脈、毛細(xì)管和小靜脈擴(kuò)張并伴隨通透性和血液流動(dòng)增強(qiáng)，包括血漿蛋白的流體的滲出和白細(xì)胞遷移到所述炎癥病灶。
術(shù)語“治療”是指預(yù)防、減輕或完全消除病癥的癥狀和/或該疾病病原起源。例如，所述抗炎成分不僅通過抑制人類和哺乳動(dòng)物炎癥癥狀，而且通過用作預(yù)防劑對(duì)抗所述受體中預(yù)期出現(xiàn)的炎性因子治療炎癥。
術(shù)語“給予”是指給受治療者提供物質(zhì)的任何方法，包括口服、鼻內(nèi)、胃腸外(靜脈注射、肌內(nèi)注射或皮下注射)或直腸給藥。
術(shù)語“受治療者”是指可以炎癥反應(yīng)并會(huì)患有炎性疾病和損害的任何活動(dòng)物，包括人類和其它動(dòng)物。本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括得自鳥蛋的高度純的抗炎成分、其分離和純化以及將所述成分給予受治療者用于治療炎癥。本發(fā)明還包括得自已經(jīng)用一種或多種抗原、特別是細(xì)菌抗原或其合成等價(jià)物超免疫的鳥蛋的高度純化的抗炎成分。所述高度純化的抗炎成分以超常水平存在于超免疫蛋中，在受治療者中提供抗炎活性。
盡管所述高度純化的抗炎成分在任何餐桌上的蛋的蛋黃和蛋清的水溶性部分中發(fā)現(xiàn)，但從超免疫蛋中分離時(shí)，發(fā)現(xiàn)超常水平的所述抗炎成分有效地治療受治療者的炎癥。
本發(fā)明也包括得自鳥蛋的大致純的抗炎成分、其分離和純化以及將所述成分給予受治療者用于治療炎癥。本發(fā)明還包括得自已經(jīng)用一種或多種抗原(特別是細(xì)菌抗原)或其合成等價(jià)物超免疫的鳥的蛋獲得的大致純化的抗炎成分。所述大致純化的抗炎成分以超常水平存在于超免疫蛋中，在受治療者中提供抗炎活性。
本發(fā)明的抗炎成分可以通過提供抗炎活性的任何方式給予。例如，可以通過胃腸外、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或經(jīng)口給藥。用于口服的固體劑量形式包括膠囊劑、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。
本發(fā)明還包括在所述抗炎成分中發(fā)現(xiàn)的大致純的抗炎因子。所述因子可以通過上述用于所述抗炎成分的相同方法給予。
下面給出本發(fā)明的細(xì)節(jié)。所述高度純化的抗炎成分的特征所述高度純的抗炎成分具有以下特征1)在受治療者、特另是哺乳動(dòng)物中具有抗炎活性；2)在鳥蛋的蛋清和蛋黃中都存在；3)從蛋黃中分離時(shí)，其抗炎活性高于從蛋清中分離的活性；4)其分子量低于大約3000道爾頓；
5)不被降解蛋白的酶降解；6)非蛋白的和非類固醇；7)普通條件下帶負(fù)電；8)于100℃熱穩(wěn)定至少30分鐘；9)具有口服活性，并且不被消化酶降解；10)抗酸和抗堿，甚至在用pH4-9.0的條件處理后，也轉(zhuǎn)化為活性形式。
由所述成分的分離和純化得出3,000道爾頓的分子量，其中所述分離和純化過程使用不允許大于3,000道爾頓的分子種類通過的超濾膜。所述成分測定為非蛋白性的和非類固醇的，因?yàn)樗某叽缧?，并且不被降解蛋白的酶降解。此外，該成分具有口服活性，并且不被消化酶降解。該成分的小穩(wěn)定形式(有別于大得多的蛋白質(zhì))有助于從其消化道吸收。
該成分抗酸和抗堿，甚至在用pH9.0的條件處理后轉(zhuǎn)化為活性形式。此外，該成分于100℃熱穩(wěn)定至少30分鐘，在中性pH下帶負(fù)電。
所述高度純化的蛋抗炎成分可以從全蛋、蛋黃和蛋清中分離。從蛋黃中分離的抗炎成分表現(xiàn)出的抗炎活性高于從蛋清中純化的抗炎成分。
超常水平的所述高度純化的抗炎成分可以從鳥的超免疫全蛋、蛋黃和蛋清中分離。所述大致純化的抗炎成分的特征所述大致純的抗炎成分在哺乳動(dòng)物中表現(xiàn)出抗炎活性。在蛋黃和蛋清的水溶性部分的含有分子量低于30,000道爾頓的部分中發(fā)現(xiàn)所述大致純化的抗炎成分。該成分帶負(fù)電，90℃熱穩(wěn)定至少1小時(shí)，它從蛋中的洗脫圖示于圖1。此外，從蛋黃中分離的該成分在哺乳動(dòng)物中的抗炎活性高于從蛋清中分離的因子。
用上述方法從雞蛋制備的蛋抗炎成分的分子量低于30,000道爾頓。這由以下事實(shí)得出從蛋黃和蛋清中分離該因子的第一步是采用不允許分子量大于30,000道爾頓的物質(zhì)通過的膜進(jìn)行超濾。通過將蛋30K超濾液上DEAE Sepharose離子交換柱測定，該成分在普通條件下帶負(fù)電。用水不能從該柱洗脫該抗炎成分。將該洗脫介質(zhì)變?yōu)镹H4OAc溶液使得該蛋抗炎成分洗脫。當(dāng)將該超濾液上DEAE Sepharose柱時(shí)，各種蛋白和鹽構(gòu)成未結(jié)合部分。產(chǎn)蛋動(dòng)物的超免疫本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)當(dāng)產(chǎn)蛋動(dòng)物(諸如鳥)達(dá)到超免疫的特定狀態(tài)時(shí)，該動(dòng)物產(chǎn)的蛋將具有超常水平的高度有益的抗炎成分，因此提供較高的抗炎作用。
任何產(chǎn)蛋動(dòng)物都可以產(chǎn)生超免疫蛋產(chǎn)品。最好是，該動(dòng)物為鳥綱成員。在鳥綱中，最好是家禽，但該綱的其它成員諸如火雞、鴨子和鵝是合適的超免疫蛋產(chǎn)品源。
當(dāng)通過例如周期性加強(qiáng)給與抗原的方法使這類產(chǎn)蛋動(dòng)物達(dá)到超免疫的特定狀態(tài)時(shí)，所述動(dòng)物將產(chǎn)含有超常水平抗炎成分的蛋，將所述成分給與受治療者時(shí)，在治療炎癥方面將具有有益的性質(zhì)。
單獨(dú)的免疫敏感性誘導(dǎo)不足以引起蛋中超常水平的所述蛋抗炎成分，正如即使在對(duì)鳥類疾病免疫的正常免疫期間和正常暴露于環(huán)境因子期間所述鳥類已被各種抗原致敏，被稱為“餐桌上的蛋”的正常鳥蛋也不含有這些超常水平。僅在特定的超免疫狀態(tài)下，所述蛋才具有所需的超常水平。
通過給與初次免疫，然后周期性地用足夠高劑量的特定抗原或抗原混合物加強(qiáng)，達(dá)到所述蛋將含有較高水平的該抗炎成分的這種特定超免疫狀態(tài)。加強(qiáng)的優(yōu)選劑量應(yīng)該等于或大于產(chǎn)生該鳥初次免疫必需劑量的50％。因此，加強(qiáng)劑量閾值以下，在鳥蛋中不產(chǎn)生所述性質(zhì)，即使該鳥處于正常稱為免疫狀態(tài)的狀態(tài)。由于已經(jīng)了解發(fā)展和保持超免疫狀態(tài)的要求，為了保持該動(dòng)物處于所述超免疫狀態(tài)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所用產(chǎn)蛋動(dòng)物的屬和品系改變抗原的用量。
應(yīng)該理解，如果所述抗炎成分的水平如上述增加，那么所述抗炎因子自然也會(huì)相應(yīng)地增加。
用任何抗原或抗原組合物都可以產(chǎn)生超免疫組合物。通過多次暴露于多種抗原、多次暴露于單一抗原或單次暴露于免疫原文庫，都可以達(dá)到超免疫。幾乎可以使用任何抗原誘導(dǎo)所述超免疫狀態(tài)，所述抗原包括(但不限于)細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、變應(yīng)原、真菌或細(xì)胞物質(zhì)。
除用天然產(chǎn)生的抗原免疫外，也可以用聯(lián)合化學(xué)合成衍生的抗原完成免疫?；静呗允茄b配用于產(chǎn)生具有多樣性分子群體的化學(xué)構(gòu)件塊的多種組合。最近已經(jīng)開發(fā)出幾種方法用于寡聚物文庫(Fodor,S.等，Science 251:767(1991)；Houghton,R.等，Nature 354:82(1991))以及小的有機(jī)分子(Bunin,B.和Ellman,J.,J.Am.Chem.Soc.114:10997(1992))的固相和溶液相聯(lián)合合成。多個(gè)肽和寡聚物的快速合成可以用作聯(lián)合衍生抗原源。此外，另一種策略允許以聯(lián)合方式將有機(jī)構(gòu)件塊加入主鏈分子中，以改進(jìn)抗原性。
超免疫產(chǎn)蛋動(dòng)物的另一種模式包括使用基因疫苗或生物工程抗原。特別是，任何DNA構(gòu)建物(一般由啟動(dòng)子區(qū)和抗原編碼序列組成)將觸發(fā)抗體釋放?；蛞呙缬煽乖幋a載體、裸露DNA片段、質(zhì)粒DNA、DNA-RNA抗原、DNA-蛋白質(zhì)綴合物、DNA-脂質(zhì)體綴合物、DNA表達(dá)文庫和傳遞的病毒和細(xì)菌DNA組成，以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
特別是，現(xiàn)在有證據(jù)表明，DNA具有免疫調(diào)節(jié)性和免疫原性。傳遞抗原編碼載體、裸露NDA片段、質(zhì)粒DNA、DNA-RNA抗原和DNA表達(dá)文庫可以有效地模擬活的和熱殺死的細(xì)菌和病毒疫苗。DNA疫苗的一個(gè)益處是從產(chǎn)生游離抗原的各個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生和釋放抗原，以誘導(dǎo)體液以及細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答。細(xì)胞毒性應(yīng)答導(dǎo)致效力增強(qiáng)(Ada.G.L.,Lancet 335:523-526(1990))。另一優(yōu)點(diǎn)是基因疫苗能夠產(chǎn)生具有合適三維構(gòu)象的外源蛋白。
遺傳免疫是疫苗生產(chǎn)的新途徑，具有活/減毒病原體的許多優(yōu)點(diǎn)，但沒有感染的風(fēng)險(xiǎn)?？梢杂糜蓭追N來源的DNA組成的表達(dá)文庫作為產(chǎn)生超免疫狀態(tài)的疫苗。
DNA傳遞的方法包括(但不限于)粒子轟擊、直接注射、脂質(zhì)體、氣流注射(Fynan,E.F.等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 90:11478-11482(1993))。編碼已知或未知免疫原、啟動(dòng)子區(qū)(值得注意的是CMV花椰菜花葉病毒)和SV40細(xì)茵起點(diǎn)的核酸可以在細(xì)菌中復(fù)制，產(chǎn)生用于DNA注射的質(zhì)粒DNA。盡管在雞中幾種胃腸外DNA給藥途徑是有效的，但優(yōu)選的方法是肌內(nèi)注射到胸肌。在產(chǎn)蛋鳥中，最好在雞中進(jìn)行疫苗試驗(yàn)。以1-2周間隔重復(fù)免疫，直至6個(gè)月。
最好是，DNA的用量一般大約為含50-300μg DNA的鹽水，以用于直接注射。對(duì)于粒子轟擊，最好是通過加入2.5M CaCl2共沉淀到金珠粒上的4-100μg DNA。可以用促進(jìn)DNA包被粒子進(jìn)入活動(dòng)物中的方法重復(fù)進(jìn)行皮內(nèi)免疫。
以下是用來使產(chǎn)蛋動(dòng)物達(dá)到較高免疫狀態(tài)的優(yōu)選步驟的詳細(xì)描述，所述動(dòng)物產(chǎn)下的超免疫蛋或蛋產(chǎn)品可以給與受治療者1．選擇一種或多種抗原。
2．通過初次免疫在所述產(chǎn)蛋動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答。
3．給與合適劑量的抗原加強(qiáng)疫苗，以誘導(dǎo)和保持所述超免疫狀態(tài)。
4．測試所述超免疫蛋的抗炎活性水平。
5．收集并加工所述蛋。
以下是該方法更詳細(xì)的描述。
步驟1可以使用任何抗原或抗原組合。所述抗原可以是細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真菌、細(xì)胞、變應(yīng)原或產(chǎn)蛋動(dòng)物的免疫系統(tǒng)會(huì)應(yīng)答的任何其它物質(zhì)。該步驟中關(guān)鍵的一點(diǎn)是抗原必須能夠不僅誘導(dǎo)所述產(chǎn)蛋鳥的免疫和超免疫狀態(tài)，而且誘導(dǎo)在所述蛋中產(chǎn)生所述抗炎成分。一種優(yōu)選的疫苗是稱為系列100(S-100)疫苗的多價(jià)細(xì)菌抗原。所述S-100疫苗中含有的細(xì)茵在實(shí)施例1的表1中列出。該疫苗先前已經(jīng)在美國專利5,106,618和5,215,746中進(jìn)行了描述，這兩個(gè)專利都頒發(fā)給Stolle Reseasrch and Development Corporation。
步驟2該疫苗可以用引起免疫應(yīng)答的任何方法給與。最好是，通過肌內(nèi)注射給與所述抗原完成免疫。鳥中優(yōu)選注射的肌肉是胸肌。劑量最好為0.5-5毫克所述抗原疫苗。其它可以使用的給藥方法包括靜脈注射、腹膜內(nèi)注射、直腸栓劑和口服。使用DNA技術(shù)進(jìn)行超免疫過程時(shí)，需要的量小得多，一般為1-300微克。
可以通過多種免疫學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，確定該疫苗是否引起產(chǎn)蛋動(dòng)物的免疫應(yīng)答。這些方法的實(shí)例包括酶聯(lián)免疫吸附檢定(ELISA)、用于抗所述刺激抗原的抗體存在的試驗(yàn)和設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)所述宿主的免疫細(xì)胞對(duì)該抗原應(yīng)答的能力的試驗(yàn)。一般而言，用該疫苗免疫后蛋抗體的出現(xiàn)是免疫應(yīng)答的指標(biāo)。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答所需的抗原最小劑量取決于所用的疫苗接種方法，包括所用的抗原類型以及用作所述宿主的產(chǎn)蛋動(dòng)物的類型。
步驟3．最好通過以固定時(shí)間間隔重復(fù)加強(qiáng)給與合適劑量，誘導(dǎo)和保持所述超免疫狀態(tài)。所述時(shí)間間隔最好為6個(gè)月中的2周間隔。所述加強(qiáng)給藥不導(dǎo)致免疫耐受是必要的。
也可以使用其它超免疫維持方法或方法的組合，諸如初次免疫為肌內(nèi)注射，加強(qiáng)注射為靜脈注射。其它方法包括同時(shí)給與微膠囊抗原和液體抗原，或初次免疫為肌內(nèi)注射，而加強(qiáng)劑量通過微膠囊方式口服或胃腸外給與。初次免疫和超免疫的幾種組合是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
步驟4．測試所述蛋的抗原活性水平是必要的。這可以用測試或者所述超免疫蛋或其來源的產(chǎn)品對(duì)炎癥的作用的任何臨床或臨床前評(píng)價(jià)進(jìn)行。化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠炎癥為抗炎藥的標(biāo)準(zhǔn)檢定。(參見實(shí)施例6a、b和c)。
步驟5．該步驟包括收集和加工含有所述抗炎成分的蛋?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法收集所述蛋。下面描述加工所述蛋以分離和純化該抗炎成分。分離和純化可以用全蛋、蛋黃或蛋清完成所述蛋抗炎成分的分離和純化。優(yōu)選方法的實(shí)例如下1．從蛋中制備水溶性部分；2．將該水溶性部分超濾；3．通過反相高效液相色譜分離部分；以及4．生物檢定分離部分的抗炎活性。
以下是該方法更詳細(xì)的說明步驟1可以從全蛋、蛋黃或蛋清中分離所述抗炎成分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用該方法從蛋清中分離該成分。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，從蛋黃中分離該成分。用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法從所述全蛋或蛋黃中除去所述脂質(zhì)部分。例如，在噴霧干燥的蛋黃粉的情況下，可以用溶劑(丙烷、丁烷或己烷或用雙溶劑)、超臨界CO2、酶等等完成脫脂，而在液體蛋黃的情況下，可以通過Lee(美國專利5,367,054號(hào))所述的辛酸分離方法(CAPS)完成脫脂。對(duì)于蛋清不必去脂，因此液體或粉狀形式的蛋清都可以用常規(guī)方法和下面實(shí)施例列出的方法或者加熱或直接溶解。然后，所述全蛋、蛋黃或蛋清最好加工為或者液體或粉狀形式，并且進(jìn)一步加工獲得水溶性部分。(參見實(shí)施例)。
步驟2從全蛋、蛋黃或蛋清產(chǎn)生的水溶性部分用配有截留分子量為3,000的膜的超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾。所述超濾方法將分子量大于3,000道爾頓的分子與分子量小于3000道爾頓的分子分離。一旦進(jìn)行超濾，則將產(chǎn)生的含有分子量小于3,000道爾頓分子的超濾液凍干，稱量和制備用于生物檢定測試。在特定公開的實(shí)施方案中，優(yōu)選的超濾為AmiconRA1000(3K MWCO)和DEAE離子交換色譜。然而應(yīng)該理解，已知本文的資料和本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的知識(shí)，可以用同等的技術(shù)和材料來分離該成分。
步驟3可以通過例如反相高效液相色譜分離小于3,000道爾頓的超濾液的部分，以分離所述高度純化的抗炎成分。作為可選擇的或另一策略，所述超濾液中的該蛋抗炎成分可以用陰離子交換DEAE-Sepharose色譜進(jìn)行進(jìn)一步的表征。這類分離方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
步驟4可以通過測定抗炎活性的任何生物檢定測試該成分的抗炎活性。一些實(shí)例包括抑制白細(xì)胞的遷移、大鼠足趾腫脹試驗(yàn)、佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎和活體顯微鏡檢查。也可以進(jìn)行蛋抗炎成分與已知抗炎藥(諸如阿斯匹林和消炎痛)的比較。最后，也可以用用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、退化性關(guān)節(jié)疾病和損傷誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的臨床試驗(yàn)測定抗炎活性。
通過生物檢定測定該高度純化的蛋抗炎成分的抗炎活性。優(yōu)選的生物檢定為Vinegar等(“角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠胸膜炎的一些定量特性”Proc.Soc.Exp.Bio.Med.143:711-714(1973))、Ammendola,G.等(“大鼠角叉菜膠胸膜炎中的白細(xì)胞遷移和溶酶體酶釋放”Agents andActions 5:250-255(1979))、Vinegar,R.等(“急性角叉菜膠炎癥的定量研究”，F(xiàn)ed.Proc.35:2447-2456(1976))中描述的胸膜白細(xì)胞遷移抑制檢定(參見實(shí)施例7、7a、7b、7c和9、圖3、5和6)。
一般如下進(jìn)行所述白細(xì)胞遷移抑制檢定將含有該抗炎成分的樣品給與用1％角叉菜膠溶液人工發(fā)炎的成年雌性大鼠，然后通過與對(duì)照大鼠相比處理大鼠胸膜滲出液中白細(xì)胞數(shù)的降低，測定(用自動(dòng)圖象分析技術(shù))每種劑量的所述樣品的抗炎作用。
另一方面，可以通過將角叉菜膠注射到大鼠后爪引起的腫脹測試所述大致純的抗炎成分的抗炎作用(Winter,C.A.,Risley,G.A.,Nuss,A.W.,“角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠后爪腫脹作為抗炎藥的檢定”Proc.Soc.Biol MEd.3:544(1967))。
可以使用多種其它試驗(yàn)(參見Wetnick,A.S.和Sabin,C.,“氯胺煙酸和Bethaurethasone在大鼠中對(duì)佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎的作用”Jap.J.Pharm.22:741(1972))。給與受治療者用于治療本發(fā)明也涉及治療受治療者炎癥的方法，包括給與所述受治療者所述蛋、蛋產(chǎn)品和/或本發(fā)明的抗炎成分。
本發(fā)明的抗炎成分可以用提供抗炎活性的任何方法給與。例如，可以胃腸外、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或經(jīng)口給藥。
口服最好通過固體劑量形式完成，所述固體劑量形式包括膠囊劑、粉劑、丸劑和顆粒劑。在固體劑量形式中，所述抗炎成分與至少一種諸如蔗糖、乳糖或淀粉之類的惰性稀釋劑混合。與正常做法一樣，這類劑量形式也可以包含非惰性稀釋劑的其它物質(zhì)。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，所述劑量形式也可以包含緩沖劑、pH敏感聚合物或食品和制藥工業(yè)中通常用作膠囊成分的任何其它緩慢釋放的膠囊劑。片劑和丸劑還可以用腸溶包衣制備。
用于口服的液體劑量形式的所述抗炎成分包括含有通常用于制藥領(lǐng)域的惰性稀釋劑的藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸液、糖漿和酏劑。除惰性稀釋劑外，組合物也可以包括潤濕劑、乳化劑和懸浮劑和甜味劑。
用于胃腸外給藥的抗炎組合物制劑包括無菌水溶性和非水溶液、懸液或乳液。非水溶劑或溶媒的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油的植物油和諸如油酸乙酯的可注射有機(jī)酯。
活性成分的劑量可以改變?nèi)欢匾氖撬龌钚猿煞值牧繎?yīng)該使得獲得合適劑量形式。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，選定的劑量形式取決于所需的治療作用、給藥途徑和治療時(shí)間。
最好是將含有所述抗炎成分的所述蛋本身加入食品中，形成所述蛋產(chǎn)品。一個(gè)制備待加入食品中的所述蛋的優(yōu)選方法包括將所述蛋干燥為蛋粉。盡管已知用于干燥蛋的各種方法，但噴霧干燥是優(yōu)選方法。最好使用不超過140°F(60℃)的溫度。在所述干燥過程中監(jiān)測樣品的含水量，以獲得具有任何所需稠度的成品。干燥的蛋粉可以用于飲料、蛋白添加劑和任何其它運(yùn)動(dòng)員相關(guān)營養(yǎng)產(chǎn)品。此外，所述蛋粉可以用于烘烤混合物、粉狀長面包、糖果、餅干等。其它蛋加工的實(shí)例包括制作煎蛋卷、嫩煮或強(qiáng)煮所述蛋、烘烤所述蛋或如果需要，可以生吃所述蛋。
考慮到副作用的可能性，給藥劑量和頻率取決于所述病人的年齡和一般健康狀況。給藥也取決于用其它藥物同時(shí)治療和病人對(duì)給與藥物的耐受性。
離子交換色譜后的制劑貯存的優(yōu)選模式為凍干粉。在第一純化步驟收集的濾液可以冷藏直至使用。用上述大鼠胸膜白細(xì)胞遷移試驗(yàn)測定由該純化產(chǎn)生的所述抗炎成分的活性。
可以通過給與所述蛋、蛋產(chǎn)品和/或本發(fā)明抗炎成分治療的炎性疾病實(shí)例包括急性和亞急性粘液囊炎、急性非特異性腱炎、全身性紅斑狼瘡、全身性皮膚肌炎、急性風(fēng)濕性心炎、天皰瘡、大皰性皮炎、皰疹樣嚴(yán)重紅斑、多形性剝落性皮炎、肝硬變、季節(jié)性常年性鼻炎、支氣管性哮喘、異位性皮炎、血清病、角膜炎、眼虹膜炎、diffuse ureitis、聲帶炎、視神經(jīng)炎、交感性眼炎、癥狀性結(jié)節(jié)病、呂弗勒綜合癥、鈹中毒、溶血性貧血癥、乳腺炎、乳突炎、接觸性皮炎、過敏性結(jié)膜炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、帶狀皰疹性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、任何其它退化性關(guān)節(jié)疾病和任何相關(guān)的自身免疫疾病。此外，所述分離和純化的蛋產(chǎn)品可以用來治療接觸潛在炎性因子(諸如變應(yīng)原)個(gè)體。有效量關(guān)于給與受治療者所述超免疫蛋或蛋產(chǎn)品，已經(jīng)測定并在以下實(shí)施例中詳細(xì)描述了，待給與受治療者超免疫蛋或蛋產(chǎn)品的優(yōu)選劑量范圍為1-40克/公斤受治療者體重。
關(guān)于所述高度純化的抗炎成分本身，已經(jīng)測定了從超免疫蛋全蛋、蛋黃和蛋清純化和分離的所述高度純化成分的優(yōu)選劑量范圍為1微克至400毫克抗炎成分?？寡滓蜃右坏┓蛛x和純化所述抗炎成分，則可以進(jìn)一步純化和檢測活性部分的結(jié)構(gòu)和活性，以測定更具體活性抗炎化合物的特征。特別是，使用高壓液相色譜(HPLC)，已經(jīng)鑒定出顯示抗炎活性的單一的超純峰。據(jù)信該單一的超純峰代表具有基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的單一化合物。該化合物已經(jīng)標(biāo)記為所述蛋的“抗炎因子”。
現(xiàn)在已經(jīng)一般描述了本發(fā)明，通過一些具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，提供這些實(shí)施例僅僅為了說明，而不是為了限制，除非另外具體說明。
實(shí)施例實(shí)施例1S-100疫苗的制備在美國專利5,215,746中公開的已知為“系列100”或“S-100”并含有表1所示細(xì)菌(得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心)的多價(jià)疫苗用15ml培養(yǎng)基重建，并于37℃過夜培養(yǎng)。一旦獲得良好的生長，則用大約一半的細(xì)菌懸浮液接種1升液體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)。其余的懸浮液轉(zhuǎn)移到無菌乙二醇試管中，并于-20℃貯存直至6個(gè)月。
在該培養(yǎng)物中見到良好生長后，通過離心收獲所述細(xì)菌。將所述細(xì)茵沉淀重懸浮于無菌鹽水溶液中，將所述細(xì)菌懸浮液離心3次，以清洗所述細(xì)胞。第三次清洗后，將獲得的沉淀重懸浮于少量雙蒸水中。
通過將無培養(yǎng)基細(xì)菌懸浮液置于80℃水浴中的玻璃燒瓶中過夜，熱殺死該細(xì)菌懸浮液。用少量熱殺死細(xì)菌測試液體培養(yǎng)物的生活能力。用熱殺死細(xì)菌接種液體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)5天，每天檢查其生長，因?yàn)楸仨殮⑺浪黾?xì)菌以用于所述疫苗。
將所述熱殺死細(xì)菌凍干直至干燥。然后將干細(xì)菌與無菌鹽水溶液混合至濃度為2.2×108細(xì)菌細(xì)胞/ml鹽水(于660nm下的光密度為1.0)。
表1S-100疫苗中的抗原
實(shí)施例2超免疫蛋的抗炎作用該實(shí)施例表明在包括超免疫蛋的飲食中，實(shí)施例1所述超免疫蛋對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)狗皮膚腫脹的抗炎作用。這些結(jié)果證實(shí)超免疫蛋減輕炎癥。對(duì)炎癥的作用與用非類固醇抗炎藥10mg/kg(在該試驗(yàn)中ED50劑量)布洛芬的作用相當(dāng)。
喂20只白鷹犬(四組，每組5只)市售羔羊和大米狗食的基本膳食(350克)。如表2說明的，2組5只狗(組1和組2)在大約100天的調(diào)節(jié)時(shí)間期間只接受基本膳食。另外，組2的狗在用角叉菜膠炎癥攻擊前，用非類固醇抗炎藥布洛芬處理。在同一期間，其余2組(組3和組4)喂給所述基本膳食和超免疫蛋(HIE)。組3接受加入所述膳食中的3.5克超免疫蛋，而組4接受35克超免疫蛋。調(diào)節(jié)膳食處理結(jié)束時(shí)，所述狗皮內(nèi)注射2％角叉菜膠攻擊，引起炎癥反應(yīng)。
所述攻擊過程如下。每天每組隨機(jī)挑選一只狗進(jìn)行攻擊和測試。每天重復(fù)該步驟5天，直至測試所有組的所有狗。所述攻擊步驟前15分鐘時(shí)，給與組2的狗口服10mg/kg布洛芬。通過靜脈注射麻醉所有的狗，在左側(cè)面進(jìn)行修剪(大約6×8英寸)。在修剪面上做2條線，每條線3個(gè)標(biāo)記，標(biāo)號(hào)為1-6。在標(biāo)記1處皮內(nèi)注射0.1ml鹽水作為陰性對(duì)照。標(biāo)記2-6給與0.1ml皮內(nèi)注射2％的角叉菜膠溶液。在該研究期間由同一個(gè)人進(jìn)行注射。先前確定皮內(nèi)注射該濃度的角叉菜膠在100％所述動(dòng)物中引起可測量的腫脹，該腫脹可以用10mg/kg布洛芬減輕。在最后一次注射角叉菜膠后，用測微計(jì)測量每處腫脹并記錄數(shù)值。讓所述麻醉動(dòng)物蘇醒，6小時(shí)后重復(fù)測量并記錄。測量每組的炎癥反應(yīng)平均大小。
表2
這些結(jié)果表明，喂給超免疫蛋(3.5克加上基本膳食和35克加上基本膳食)的動(dòng)物中腫脹顯著減小表明口服所述超免疫蛋對(duì)炎癥的預(yù)防作用。此外，這些結(jié)果表明，所述超免疫蛋的抗炎活性與用抗炎藥布洛芬見到的作用相當(dāng)。在處理組和對(duì)照組之間觀察到顯著性P＜0.05水平下的差異。實(shí)施例3從超免疫烏蛋中分離＜30,000道爾頓蛋抗炎成分步驟1從蛋中制備水溶性濾液加工液體蛋黃、液體蛋清和蛋黃粉以獲得所述水溶性部分。用在這些實(shí)施例中描述的Lee(美國專利5,367,054號(hào))公開的辛酸相分離法(CAPS)將液體蛋黃脫脂。將液體蛋清加熱這些實(shí)施例中描述的特定時(shí)間長度。蛋黃粉按這些實(shí)施例中所述用雙溶劑、超臨界CO2或酶脫脂。步驟2所述水溶性部分的超濾在備有卷膜式30K MWCO超濾膜的Amicon DC10L超濾系統(tǒng)中濃縮所述水溶性部分。超濾柱的膜表面積為10ft2，入口的操作壓接近40psi，而出口壓為33psi(穿膜壓為7psi)，循環(huán)流速為10.4L/min，通量流速為2.3L/min。步驟3離子交換色譜來自所述水溶性部分DC10L超濾的濾液通過陰離子交換色譜進(jìn)一步加工。在該步驟中，用DEAE Sepharose快速凝膠(Pharmacia)填裝3×15cm玻璃柱，該柱用pH7.0的無菌雙蒸水平衡。
將通過0.2微米濾器預(yù)過濾的500ml所述濾液(＜30,000道爾頓)上該柱，該柱用pH7.0的500ml無菌雙蒸水清洗，流速為10ml/min。用250ml 0.15M NH4OAc洗脫預(yù)計(jì)含有蛋抗炎成分的結(jié)合部分。收集分部收集液并在LKB Uvicord 2138監(jiān)測器中于280nm處監(jiān)測，在相聯(lián)的記錄儀上打印光密度。無內(nèi)毒素的大致純的蛋抗炎成分的洗脫圖示于圖1。將所述蛋抗炎成分部分凍干，以用于進(jìn)一步加工。
從液體蛋黃和液體蛋清中制備＜30,000道爾頓的蛋抗炎成分用Lee(美國專利5,367,054號(hào))公開的所述辛酸相分離法(CAPS)將2升超免疫蛋黃脫脂。簡單地說，在含1％辛酸和0.06M氯化鈉的0.02M乙酸鹽pH5.0的緩沖液中將S-100蛋黃稀釋15倍。通過從絮凝物相過濾分離水相，用0.5M NaOH將其調(diào)至pH7。將所述水相超濾，直至留下2L保留液。將所述超濾液上所述DEAE Sepharose柱，在DEAESepharose柱色譜后從2L蛋黃獲得46.6g蛋黃抗炎成分(參見圖4)。
1升超免疫蛋清用3L去離子水稀釋。將該混合物加熱至90℃1小時(shí)，冷卻并離心。將上清液通過40微米濾紙過濾并超濾，直至獲得大約64ml保留液。將500ml超濾液上DEAE Sepharose柱。在DEAESepharose柱色譜后，從1L蛋清中獲得4.4g抗炎成分。(參見圖5)。
從蛋黃粉中制備＜30.000道爾頓的蛋抗炎成分使用三種方法將蛋黃粉脫脂，然后從脫脂蛋黃粉中分離蛋抗炎成分(圖7)。步驟1雙溶劑萃取將超免疫蛋黃粉與由無水乙醇和己烷組成的混合物混合，以從蛋黃中除去脂質(zhì)，然后水分離所述蛋抗炎成分部分。簡單地說，將400g超免疫蛋黃粉與2L雙溶劑(25％無水乙醇-75％己烷或25％異丙醇-75％己烷)合并并混合。除去溶劑上清液，進(jìn)行另外兩次溶劑萃取，總共進(jìn)行三次脂質(zhì)萃取。最后一次萃取的混合物離心以協(xié)助最后的分離。將脫脂蛋黃材料干燥，與4,000ml去離子水混合，并用0.5M NaOH調(diào)至pH7。然后在Amicon Dc10L超濾系統(tǒng)中將其濃縮至500ml。
所述超濾液中的所述蛋抗炎成分(＜30,000道爾頓)進(jìn)一步通過DEAE Sepharose色譜分離，將所述蛋抗炎成分部分凍干，以用于進(jìn)一步加工。DEAE色譜分離后，從所述超濾液中回收0.45g抗炎成分，測定其活性(圖3)。步驟2超臨界CO2提取將超免疫蛋黃干粉置于超臨界條件下，以從蛋黃除去脂質(zhì)，然后水分離蛋抗炎成分部分?？傊瑢⒋蠹s400g免疫蛋黃干粉置于Autoclave EngineersSCE裝置中，讓其于32.2℃、～5400psi下經(jīng)過靜態(tài)CO2提取20小時(shí)。用4,000ml去離子水將部分脫脂蛋黃勻漿，并于10,000rpm離心30分鐘。分離含水上清液，然后在Amicon DC10L超濾系統(tǒng)中濃縮至500ml。過濾液中的所述蛋抗炎成分(＜30,000道爾頓)進(jìn)一步通過DEAE-Sepharose陰離子交換色譜分離。
將所述蛋抗炎成分部分凍干，以用于進(jìn)一步加工，DEAE色譜分離后，從超濾液中獲得1.86g蛋抗炎成分。圖6顯示通過超臨界CO2提取、超濾和DEAE色譜后的大致純的成分的生物檢定活性。步驟3酶處理提取超免疫蛋黃粉與由Newlase F乳酸鹽緩沖液組成的混合物一起保溫，以從蛋黃中分離脂質(zhì)，然后水分離所述抗炎成分部分。簡單地說，將300克S-100蛋黃干粉與6L 0.05M乳酸鹽緩沖液pH4.0和27gNewlase F(Sigma#P-5027)混合并勻漿。該混合物于50℃保溫1小時(shí)，然后過濾底部水相。產(chǎn)生的水相用0.5M NaOH中和，然后在AmiconDCl0L(30K MWCO)上濃縮，直至收集3L過濾液，將276ml過濾液上DEAE Sepharose柱。在DEAE色譜分離后，分析30,000MW過濾液的抗炎活性。
除熱原和分析＜30,000道爾頓的蛋抗炎成分分離物的內(nèi)毒素含量除熱原將蛋抗炎成分分離物除熱原，以消除模擬抗炎成分活性的內(nèi)毒素。簡單地說，將60mg蛋抗炎粉溶于15ml無菌生理鹽水溶液中。通過在3K MWCO Centriplus濃縮器(Amicon)中超濾，將該混合物除熱原。使用層流下的無菌技術(shù)，用PyroCLEAN(AlerCHECK,Inc.)將Centriplus濃縮器預(yù)先除熱原。內(nèi)毒素也可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的標(biāo)準(zhǔn)方法除去，不必基于分子量的分離。分析為了證實(shí)，通過腫瘤壞死因子(TNF)酶聯(lián)免疫吸附檢定(ELISA)分析除熱原的蛋抗炎成分的內(nèi)毒素含量。簡單地說，將一等份用生理鹽水稀釋的蛋抗炎成分加入在具有10％胎牛血清的Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)培養(yǎng)基中生長的J774巨噬細(xì)胞的平板中。于37℃溫育4小時(shí)后，將上清液加入包被單克隆抗TNF抗體的板中，用含2％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)封閉。所述板于室溫下過夜溫育后，加入生物素化抗體和抗生蛋白鏈菌素過氧化物酶。將3,3’5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物加入所述板中以顯色。于450nm下讀出所述板孔內(nèi)容物的吸收值。通過由標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)推，測定所述蛋抗炎成分樣品中的TNF含量。除熱原后蛋抗炎成分分離物的TNF含量可忽略。(參見表3)。
表3
a培養(yǎng)基只有46.5pg TNF/ml。b培養(yǎng)基沒有TNF。
＜30,000道爾頓無內(nèi)毒素抗炎成分對(duì)白細(xì)胞遷移的作用通過與對(duì)照大鼠相比，通過在大致純蛋抗炎成分處理的大鼠的胸膜滲出液中白細(xì)胞數(shù)減少，測定每個(gè)劑量的大致純的＜30,000道爾頓蛋抗炎成分的抗炎作用。(參見表4，圖2)。圖2和表4比較了所述大致純的超免疫蛋黃和蛋清部分的作用與普通餐桌上的雞蛋的作用。所有劑量的大致純超免疫抗炎成分都導(dǎo)致遷移到胸膜滲出液中的白細(xì)胞數(shù)減少。在給與2mg來自蛋黃的所述大致純成分的那些受治療者中觀察到最大的作用。
表4在不同蛋抗炎成分劑量下白細(xì)胞遷移到胸膜滲出液中的抑制<
蛋抗炎成分的特征用上述方法制備的大致純的蛋抗炎成分的分子量發(fā)現(xiàn)低于30,000道爾頓。這是由以下事實(shí)得出的從蛋黃和蛋清中分離該成分的第一步驟為采用不允許分子量＞30,000道爾頓的物質(zhì)通過的膜進(jìn)行超濾。
該成分在普通條件下具有負(fù)電荷，該凝膠的pKa值為9.5。這是通過將蛋超濾液上DEAE Sepharose離子交換柱測定的。所述抗炎成分不能用水從該柱上洗脫。將所述洗脫介質(zhì)變?yōu)镹H4OAc溶液、或pH高于9.5的任何鹽溶液或緩沖液，使得所述蛋抗炎成分洗脫。當(dāng)將所述超濾液上DEAE柱時(shí)，各種蛋白和鹽構(gòu)成未結(jié)合部分(峰1，圖1)。當(dāng)用NH4OAc溶液(峰2)洗滌，然后用NaCl溶液(峰3)時(shí)記錄峰。由峰2分離的部分在大鼠檢定上表現(xiàn)出抗炎活性。第三個(gè)峰表現(xiàn)出可忽略的活性。蛋清抗炎成分于90℃熱穩(wěn)定1小時(shí)。
此外，可以從蛋黃和蛋清中分離所述蛋抗炎成分。來自蛋黃的蛋抗炎成分表現(xiàn)出的活性高于來自蛋清的蛋抗炎成分(圖2，表4)。實(shí)施例4從蛋中制備高度純化的抗炎成分的優(yōu)選方法以下實(shí)施例描述從鳥蛋中以高度純、最低分子量、非聚集形式獲得抗炎成分的方法(示于大規(guī)模純化)。將超免疫蛋和對(duì)照餐桌上的雞蛋的全蛋壓碎，將蛋清與蛋黃分離，將兩者噴霧干燥。按實(shí)施例1所述方法獲得超免疫蛋。單獨(dú)加工蛋清粉，以獲得用于超濾的水性部分。
進(jìn)行所有的純化步驟，以減小可能的細(xì)菌和熱原污染。用無菌水制備溶液，將所有的玻璃器皿除熱原。另外，將該溶液無菌過濾。實(shí)施例4a從蛋黃粉中制備蛋抗炎成分溶劑萃取將干燥蛋黃或者用丙烷或者用丁烷經(jīng)過液體溶劑提取，從含有所述抗炎成分的含水蛋黃部分中分離脂質(zhì)。簡單地說，將500克蛋黃干粉置于柱中，在柱中加入4升液體丙烷溶劑。除去溶劑上清液和萃取的脂質(zhì)。進(jìn)行另外6次溶劑萃取，總共進(jìn)行6次脂質(zhì)萃取。超濾400克干脫脂蛋黃用4升無菌蒸餾水稀釋，并用Virtis handishear勻漿。該蛋黃混合物或者以24RPM離心，或者讓其冷藏靜置，直至不溶蛋黃顆粒沉淀。產(chǎn)生的含水部分用備有3,000MW截留分子卷膜的Amicon RA1000超濾系統(tǒng)超濾。該泵的速度保持在入口壓為20psi，出口壓為15psi。＜3,000分子量的過濾液用0.45μm無茵一次性Nalgene濾器除菌過濾，凍干或冷凍，以用于貯存、生物檢定測試或進(jìn)一步純化。圖8顯示純化過程的流程圖。
來自蛋黃的低于3,000道爾頓的分子物質(zhì)含有低分子量非聚集形式的抗炎成分。從400克原材料，抗炎成分的產(chǎn)量為約12克或總重量的3％。生物檢定測試該3K部分的抗炎活性顯示出高水平活性(實(shí)施例6a)。實(shí)施例4b從蛋清粉中制備蛋抗炎活性將按實(shí)施例1所述的超免疫蛋和對(duì)照餐桌上的蛋分離的4克蛋清用1升去離子水稀釋。將該混合物勻漿，并通過40μm濾器過濾，通過3K MW CO超濾系統(tǒng)超濾(圖9)。從400g蛋清粉中回收8.6g或2.15％的抗炎成分。該材料在抑制大鼠白細(xì)胞遷移到損傷誘導(dǎo)部位中表現(xiàn)出生物檢定活性(實(shí)施例6a)。
該實(shí)施例表明從超免疫蛋和對(duì)照餐桌上的蛋的蛋清材料中制備活性抗炎成分。實(shí)施例5DEAE離子交換色譜所述蛋抗炎成分也通過陰離子交換色譜進(jìn)行進(jìn)一步表征。該實(shí)施例證明所述抗炎成分在中性pH下帶負(fù)電。
以實(shí)施例4a所述的同樣方式獲得來自蛋清和蛋黃材料的10K超濾，只是使用10,000MW膜代替3000MW膜。
DEAE-Poros 50柱(10/50毫米)用無茵雙蒸無熱原水(Sigma)pH7.0平衡。將溶于100ml無菌無熱原雙蒸水中的10毫克超濾液(＜10,000MW)在BioCad 700(Perseptives Biosystems)上DEAE Poros柱。以10ml/min的流速將該材料上柱。用蒸餾水除去未結(jié)合到該柱的材料的流出物，并將其收集。用乙酸銨的線性梯度(0％-100％)洗脫結(jié)合到該柱的材料，并用280nm和254nm處的UV吸收監(jiān)測部分，通過Avantec分部收集器收集10ml的部分。用NaCl(0.15M)除去結(jié)合到該柱的其余材料。該柱用蒸餾水洗滌，直至280nm和254nm的吸收回到基線。
圖10顯示典型的色譜圖。箭頭指出該活性抗炎成分(峰2)。用NH4OAc的典型洗脫圖由箭頭所指洗脫緩沖液的變化所證明。洗脫液用0.45μm無菌濾器除菌過濾，凍干至干燥并稱量。所述各個(gè)峰的生物檢定表明，含有所述活性的峰發(fā)現(xiàn)在峰2中(實(shí)施例6b)。通過DEAE離子交換色譜分離的部分證明所述抗炎成分帶負(fù)電。實(shí)施例6抗炎活性檢定對(duì)餐桌上的蛋和超免疫蛋的蛋黃和蛋清的大致純部分進(jìn)行盲檢分析抗炎活性。該試驗(yàn)檢定測定抑制大鼠胸膜腔中白細(xì)胞從小靜脈遷移到損傷誘導(dǎo)部位。
將2ml含1％角叉菜膠(一種刺激劑)的生理鹽水注射到重120-150克的雌性大鼠(Charles River,MA)的胸膜腔中以誘導(dǎo)白細(xì)胞遷移至該胸膜腔。然后給所述大鼠腹膜內(nèi)注射0.5ml劑量的選定濃度含每種測試部分的生理鹽水。每個(gè)濃度注射2只大鼠。注射鹽水用作對(duì)照。注射后4小時(shí)，用符合動(dòng)物保護(hù)法案的方法殺死動(dòng)物。取出胸膜滲出液并固定所述白細(xì)胞用于評(píng)價(jià)。將50微升滲出液加到相應(yīng)標(biāo)記的玻片上，加到cytospin上。完成cytospin循環(huán)后，用cytoprep固定劑(FisherScientific Co.Atlanta)噴霧所述玻片，并用蘇木精染色。評(píng)價(jià)每個(gè)玻片的5個(gè)代表區(qū)，用Bioscan Optimas圖象分析程序計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)。所有5個(gè)計(jì)數(shù)的平均用于每只大鼠的總平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)。與對(duì)照鹽水注射相比，計(jì)算每個(gè)樣品濃度的抑制百分比。實(shí)施例6a來自超免疫蛋和餐桌上的蛋清、蛋黃的抗炎活性比較對(duì)按實(shí)施例4所述的來自餐桌上的蛋和超免疫蛋的噴霧干燥脫脂蛋黃和蛋清的純化部分測試其抗炎活性。按實(shí)施例4和5所述進(jìn)行超濾后，獲得來自餐桌上的蛋清、超免疫蛋黃和超免疫蛋清的低于3,000MW的過濾液。每個(gè)樣品用2只動(dòng)物，或者腹膜內(nèi)注射鹽水、或者腹膜內(nèi)注射1mg、5mg、10mg或20mg測試部分，并按實(shí)施例6所述進(jìn)行評(píng)價(jià)。
圖11表明，來自超免疫雞的高度純化的、低于3,000MW蛋黃部分證明在1mg/大鼠的劑量下65％的抑制白細(xì)胞遷移。這些超免疫蛋黃部分也證明活性(在1mg/大鼠的劑量下65％的抑制)高于由同樣劑量的超免疫蛋清獲得部分的活性(38％)。對(duì)照蛋清證明抗炎活性較低(在1mg/大鼠的劑量下25％的抑制)。非超免疫蛋部分也含有所述抗炎活性，因?yàn)樗心鸽u都接種疫苗并由于環(huán)境中存在微生物和變應(yīng)原而經(jīng)過天然免疫。然而，令人驚訝地是，通過超免疫方法，在蛋黃和蛋清中所述抗炎成分的水平都提高。由于蛋中的組分一般劃分為或者富含脂質(zhì)的蛋黃或蛋清，令人驚訝的是在蛋黃和蛋清的低于3,000MW的部分中都發(fā)現(xiàn)所述抗炎活性。
該實(shí)施例表明，所述抗炎成分低于3,000道爾頓，在蛋黃和蛋清中發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在超免疫蛋部分比對(duì)照餐桌上的蛋的有效量高得多。事實(shí)上，所述高度純化的抗炎成分在超免疫蛋中發(fā)現(xiàn)的量有效地治療炎癥。實(shí)施例6b所述帶負(fù)電的DEAE部分對(duì)白細(xì)胞遷移的作用按照所述抗炎生物檢定步驟后，測試來自超免疫蛋黃的用乙酸銨洗脫的帶負(fù)電的DEAE峰2和3K和10K超濾液的活性。在指定的劑量下測試每個(gè)樣品。
圖12表明，超免疫雞蛋的所述帶負(fù)電DEAE部分、3K和10K超濾液與鹽水對(duì)照相比時(shí)，表現(xiàn)出高水平的抗炎活性。實(shí)施例6c與抗炎藥的比較將抗炎藥消炎痛和阿斯匹林與所述蛋的3K超濾液比較體內(nèi)對(duì)白細(xì)胞遷移的抑制。在該檢定中，腹膜內(nèi)注射給與1000μg、100μg、10μ9、1μg的消炎痛、阿斯匹林和來自超免疫蛋的3K蛋抗炎成分。
圖13表明，所述3K超濾液和阿斯匹林表現(xiàn)出相似水平的抗炎活性。消炎痛的白細(xì)胞遷移抑制水平似乎在較低劑量(1-100μg/大鼠)下較低。
該實(shí)施例表明，來自蛋的抗炎部分在白細(xì)胞遷移檢測中與已知抗炎藥的作用相當(dāng)。實(shí)施例7通過反相高效液相色譜(HPLC)純化抗炎部分來自蛋黃大致純的低于3K、10K的DEAE部分和來自蛋清的30K DEAE部分在Waters C8對(duì)稱反相柱(3.9×250mm)上分離。在具有717加自動(dòng)加樣器和996光電二極管陣列檢測器的Waters 2010型HPLC上，將10％-80％的甲醇和H2O的線性梯度用作流動(dòng)相。凍干樣品在100-200ml無茵雙蒸水中稀釋。該柱以2ml/min的流速洗脫，貯存在200nm-350nm的所有波長下的流出物二極管陣列數(shù)據(jù)。
圖14顯示3K過濾液分離的MAX色譜圖。該色譜圖顯示產(chǎn)生高度純化的蛋抗炎成分的分子量低于3K的2個(gè)主峰。圖15說明來自10K過濾液成分的分離，該過濾液在DEAE離子交換柱上按實(shí)施例5概述進(jìn)行分離。獲得與用3K超濾液部分觀察到的相似的2個(gè)峰。這些結(jié)果表明，低于3K和也表現(xiàn)出抗炎活性的DEAE(實(shí)施例7)的兩個(gè)部分都可以用來獲得高度純化的帶負(fù)電組分。
3K蛋黃部分的成分分析表明，存在在1-2分鐘時(shí)洗脫的最初系列的峰和在10-20分鐘時(shí)洗出的3個(gè)峰。該實(shí)施例表明，所述抗炎成分低于3,000MW，并可以用該方法分離為相對(duì)純的峰。制備型HPLC為了在超濾后獲得大量的所述抗炎因子，優(yōu)選步驟是在制備型HPLC柱上分離所述高度純化的低于3,000分子量的成分。因此，用Zorbax C8填充材料填充5.08×20cm柱，在每次運(yùn)行期間純化4克低于3,000MW的超濾液。使用具有0.05％TFA的80/20H2O/甲醇作為流動(dòng)相，流速為90ml/min，將所述滲透物分離為高度純化的成分，將其收集并凍干。接著在分析型C8柱上重測試收集的峰。用所述方法，通過制備型HPLC獲得大量的超純峰，并分析生物檢定活性、元素組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)。使用質(zhì)譜、元素分析、紅外光譜法和核磁共振(NMR)測定該因子的結(jié)構(gòu)。買施例8蛋抗炎成分的物理特性該實(shí)施例說明對(duì)加熱、酸堿變化、蛋白酶處理的穩(wěn)定性。
4毫克低于3,000MW的超濾液在無菌水中稀釋并于100℃經(jīng)過30分鐘。低于3K的超濾液樣品在中和前經(jīng)受酸HCl pH2.0、中性pH7.4或堿NaOH pH9.030分鐘。3K部分也用1單位的鏈霉蛋白酶處理1小時(shí)。將所有的樣品無菌過濾、凍干、稱量并測試生物學(xué)活性。
處理過部分(高熱、pH變化和鏈霉蛋白酶處理)與未處理對(duì)照和注射鹽水動(dòng)物的生物檢定活性的比較顯示出對(duì)這些處理的令人驚訝的穩(wěn)定性。除尺寸小(低于3,000MW)外，對(duì)高熱、pH變化和鏈霉蛋白酶處理的穩(wěn)定性表明該抗炎成分不是蛋白質(zhì)。
確定所述高度純的抗炎成分具有以下特性。其分子量低于3,000道爾頓。該特性由該成分的分離純化得出，其中所述分離純化方法使用不允許大于3,000道爾頓的分子物質(zhì)通過的超濾膜。確定該成分為非蛋白性的和非類固醇的，因?yàn)樗某叽缧。⑶也槐唤到獾鞍踪|(zhì)的酶降解。此外，該成分具有口服活性，不被消化酶降解。該成分的小穩(wěn)定形式(有別于大得多的蛋白質(zhì))有助于其消化道的吸收。
該成分抗酸堿，甚至在用pH9.0的條件處理后也轉(zhuǎn)化為活性形成。另外，該成分于100℃熱穩(wěn)定至少30分鐘，在中性pH下具有負(fù)電荷。
所述蛋抗炎成分可以從全蛋、蛋黃和蛋清中分離。從蛋黃分離的抗炎成分顯示出的抗炎活性高于從蛋清中純化的抗炎成分。
可以從超免疫全蛋、超免疫蛋黃和超免疫蛋清中分離超常水平的抗炎成分。
權(quán)利要求
1．高度純化形式的抗炎成分，其中所述成分的特征在于(1)存在于由產(chǎn)蛋動(dòng)物產(chǎn)的蛋的蛋清和蛋黃中；(2)于100℃熱穩(wěn)定至少30分鐘；(3)在中性pH下具有負(fù)電荷；(4)在pH4.0-pH9.0的條件下抗酸堿；(5)具有口服活性；以及(6)分子量低于3,000道爾頓。
2．預(yù)防、對(duì)抗或減輕受治療者炎癥的方法，該方法包括給與所述受治療者有效量的權(quán)利要求1的抗炎成分。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述抗炎成分的有效量為5微克至300毫克。
4．抑制白細(xì)胞在受治療者中遷移的方法，其中所述方法包括給與所述受治療者權(quán)利要求1的成分，其劑量足以抑制所述白細(xì)胞遷移。
5．來自產(chǎn)蛋動(dòng)物蛋的抗炎成分的高度純化方法，包括(1)從所述全蛋、蛋黃或蛋清中分離水溶性部分；(2)從所述水溶性部分分離低于3,000道爾頓的過濾液；(3)分級(jí)分離所述低于3,000道爾頓的過濾液，以回收生物學(xué)活性部分。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所述分級(jí)分離步驟還包括所述低于3,000道爾頓過濾液的反相高壓液相色譜。
7．權(quán)利要求5的方法，還包括將所述全蛋和所述蛋黃在步驟(1)之前脫脂。
8．權(quán)利要求5的方法，還包括將步驟(2)的所述3,000道爾頓的過渡液凍干。
9．權(quán)利要求5的方法，其中所述分離步驟還包括將所述水溶性部分通過截留分子量為3,000道爾頓的濾膜進(jìn)行超濾。
10．權(quán)利要求5的方法，其中所述產(chǎn)蛋動(dòng)物保持在超免疫狀態(tài)。
11．權(quán)利要求10的方法，其中用抗原疫苗、基因疫苗或生物工程疫苗誘導(dǎo)所述超免疫狀態(tài)。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所述基因疫苗包含至少一種選自裸露DNA片段、質(zhì)粒DNA、病毒DNA、DNA表達(dá)文庫、DNA-RNA抗原、DNA-蛋白質(zhì)綴合物和DNA脂質(zhì)體綴合物以及它們的組合的抗原編碼DNA構(gòu)建物。
13．權(quán)利要求11的方法，其中所述抗原疫苗包含至少一種選自細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真菌和細(xì)胞抗原的抗原。
14．由以下方法產(chǎn)生的高度純化形式抗炎成分，該方法包括(1)從所述全蛋、蛋黃或蛋清中分離水溶性部分；(2)從所述水溶性部分分離低于3,000道爾頓的過濾液；(3)分級(jí)分離所述低于3,000道爾頓的過濾液，以回收生物學(xué)活性部分。
15．權(quán)利要求14的抗炎成分，其中所述產(chǎn)蛋動(dòng)物處于超免疫狀態(tài)。
16．權(quán)利要求14的抗炎成分，其中用抗原疫苗、基因疫苗或生物工程疫苗誘導(dǎo)所述超免疫狀態(tài)。
17．權(quán)利要求16的抗炎成分，其中所述基因疫苗包含至少一種選自裸露DNA片段、質(zhì)粒DNA、病毒DNA、DNA表達(dá)文庫、DNA-RNA抗原、DNA-蛋白質(zhì)綴合物和DNA脂質(zhì)體綴合物以及它們的組合的抗原編碼DNA構(gòu)建物。
18．權(quán)利要求16的抗炎成分，其中所述抗原疫苗包含至少一種選自細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真菌和細(xì)胞抗原和它們的組合物的抗原。
19．預(yù)防、對(duì)抗或減輕受治療者炎癥的方法，該方法包括給與所述受治療者有效量的權(quán)利要求14的抗炎成分。
20．權(quán)利要求19的方法，其中所述抗炎成分的有效量為5微克至300毫克。
21．抑制白細(xì)胞在受治療者中遷移的方法，其中所述方法包括給與所述受治療者權(quán)利要求14的蛋抗炎成分，其劑量足以抑制所述白細(xì)胞遷移。
22．通過超免疫產(chǎn)蛋動(dòng)物制備的抗炎蛋或蛋部分。
23．權(quán)利要求22的抗炎蛋或蛋部分，其中用抗原疫苗、基因疫苗或生物工程疫苗超免疫所述產(chǎn)蛋動(dòng)物。
24．權(quán)利要求23的抗炎蛋或蛋部分，其中所述基因疫苗包含至少一種選自裸露DNA片段、質(zhì)粒DNA、病毒DNA、細(xì)菌DNA、DNA表達(dá)文庫、DNA-RNA抗原、DNA-蛋白質(zhì)綴合物和DNA脂質(zhì)體綴合物以及它們的組合的抗原編碼DNA構(gòu)建物。
25．權(quán)利要求23的抗炎蛋或蛋部分，其中所述抗原疫苗包含至少一種選自細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真茵和細(xì)胞抗原的抗原。
26．權(quán)利要求22的包含至少一種抗炎成分的抗炎蛋或蛋部分，所述抗炎成分以超常水平存在，所述水平有效地治療受治療者的炎癥。
27．權(quán)利要求26的抗炎蛋或蛋部分，其中所述抗炎成分的特征在于(1)存在于所述抗炎蛋的蛋清和蛋黃中；(2)于100℃熱穩(wěn)定至少30分鐘；(3)在中性pH下具有負(fù)電荷；(4)在pH4.0-pH9.0的條件下抗酸堿；(5)具有口服活性；以及(6)分子量低于3,000道爾頓。
28．權(quán)利要求26的抗炎蛋或蛋部分，其中所述抗炎成分是從所述抗炎蛋或抗炎蛋產(chǎn)品中通過以下方法高度純化的(1)從所述全蛋、蛋黃或蛋清中分離水溶性部分；(2)從所述水溶性部分分離低于3,000道爾頓的過濾液；(3)分級(jí)分離所述低于3,000道爾頓的過濾液，以回收生物學(xué)活性部分。
29．預(yù)防、對(duì)抗或減輕具有一定體重的受治療者炎癥的方法，該方法包括給與所述受治療者有效量的權(quán)利要求22的抗炎蛋或蛋產(chǎn)品。
30．權(quán)利要求29的方法，其中所述抗炎蛋或蛋產(chǎn)品的有效量為每公斤受治療者體重1-40克。
31．抑制白細(xì)胞在受治療者中遷移的方法，其中所述方法包括給與所述受治療者有效量的權(quán)利要求22的抗炎蛋或蛋產(chǎn)品。
32．用以下方法生產(chǎn)的大致純化形式的抗炎成分(1)從產(chǎn)蛋動(dòng)物產(chǎn)的蛋中分離水溶性部分；和(2)從所述水溶性部分分離低于30,000道爾頓的過濾液；以回收生物學(xué)活性過濾液。
33．權(quán)利要求32的抗炎成分，還包含在步驟(4)后使所述＜30,000道爾頓的過濾液經(jīng)過離子交換色譜。
34．權(quán)利要求33的抗炎成分，其中所述分離步驟還包括將所述水溶性部分通過截留分子量為30,000道爾頓的濾膜進(jìn)行超濾。
35．權(quán)利要求32的抗炎成分，還包括從所述＜30,000道爾頓過濾液中除去內(nèi)毒素。
36．權(quán)利要求35的抗炎成分，其中所述產(chǎn)蛋動(dòng)物保持于超免疫狀態(tài)。
37．權(quán)利要求36的抗炎成分，其中用抗原疫苗、基因疫苗或生物工程疫苗超免疫所述產(chǎn)蛋動(dòng)物。
38．權(quán)利要求37的抗炎成分，其中所述抗原疫苗包含至少一種選自細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真菌和細(xì)胞抗原的抗原。
39．權(quán)利要求37的抗炎成分，其中所述基因疫苗包含至少一種選自裸露DNA片段、質(zhì)粒DNA、病毒DNA、細(xì)菌DNA、DNA表達(dá)文庫、DNA-RNA抗原、DNA-蛋白質(zhì)綴合物和DNA脂質(zhì)體綴合物以及它們的組合的抗原編碼DNA構(gòu)建物。
40．權(quán)利要求32的抗炎成分，還包括在步驟(1)之前將所述蛋脫脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及由已經(jīng)用一種或多種抗原(特別是細(xì)菌抗原)超免疫鳥的蛋獲得的抗炎成分。本發(fā)明還涉及包含有效量所述抗炎成分的蛋或蛋產(chǎn)品。本發(fā)明也涉及分離所述抗炎成分的方法。本發(fā)明最后涉及用所述抗炎成分和/或包含有效量的所述抗炎成分的蛋或蛋產(chǎn)品治療炎癥的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1226830SQ97193248
公開日1999年8月25日 申請日期1997年3月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月26日
發(fā)明者S·G·菲茨帕特里克-麥埃利戈特, J·G·亨查爾, Y·Z·李, L·R·貝克 申請人:Dcv生物學(xué)公司