專利名稱：由hla－b44分子呈遞的腫瘤排斥抗原及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及衍生自腫瘤排斥抗原前體并由HLA分子尤其是HLA-B44分子呈遞的分離的肽及其應(yīng)用。此外還涉及鑒別診斷患有特征在于由其異常細(xì)胞呈遞這些肽與HLA分子復(fù)合物的細(xì)胞異常病情的個體患者，呈遞的肽及其結(jié)果的能力。
背景及現(xiàn)有技術(shù)哺乳動物免疫系統(tǒng)識別并與外來異物反應(yīng)是一復(fù)雜過程。該系統(tǒng)的一重要方面是T細(xì)胞應(yīng)答。該應(yīng)答要求T細(xì)胞可識別并與稱作人白細(xì)胞抗原(HLA)或主要組織相容復(fù)合物(MHC)的細(xì)胞表面分子與肽的復(fù)合物反應(yīng)。該肽衍生自由也呈遞HLA/MHC分子的細(xì)胞加工的較大的分子，可參見Male等，Advanced Immunology(J.P.Lipincott Company.1987)，尤其是第6～10章所述。T細(xì)胞與HLA/肽復(fù)合物的相互作用是受限的，要求一種特異于HLA分子和肽的特定組合的T細(xì)胞。如果不存在特異T細(xì)胞，即使有相應(yīng)的配體復(fù)合物也不能產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答。相似地如果缺乏特異復(fù)合物而只有T細(xì)胞也不能產(chǎn)生應(yīng)答。該機(jī)制參與免疫系統(tǒng)對外源異物的應(yīng)答，自身免疫病理及對細(xì)胞異常的應(yīng)答之中。近來有許多工作致力于將蛋白質(zhì)加工成HLA結(jié)合肽的機(jī)制的研究?？梢夿arinage，科學(xué)257:880(1992)；Fremont et al.,科學(xué)257:919(1992)；Matsumura et al.，科學(xué)257:927(1992)；Latron et al.，科學(xué)257:964(1992)中的論述。
T細(xì)胞識別細(xì)胞異常的機(jī)制也被應(yīng)用于癌癥疾病。例如，在申請?zhí)枮镻CT/US92/04354，申請日1992年5月22日，
公開日1992年11月26日的PCT申請(引入本文作參考)中，揭示了一基因家族，其被加工成在細(xì)胞表面表達(dá)的肽，其可通過特異的CTLs導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的溶解。該基因被稱作可編碼“腫瘤排斥抗原前體”或“TRAP”分子，且衍生自此的肽被稱作“腫瘤排斥抗原”或“TRA”?？梢奣raversariet al.，免疫遺傳學(xué)35:145(1992)；Van der Bruggen et al.，科學(xué)254:1643(1991)，其進(jìn)一步闡述了該基因家族。也可參見美國專利5,342,774(引入本文作參考)。
在美國專利5,405,940(引入本文作參考)中，教導(dǎo)了與HLA-A1分子結(jié)合的九肽。該參考文獻(xiàn)教導(dǎo)了給出特定的肽對特定的HLA分子的特異性，則可預(yù)期特定肽與一種HLA分子而非其它分子相結(jié)合。這是重要的，因為不同的個體具有不同的HLA表型。結(jié)果是，盡管對作為一特異HLA分子的配體的特定肽的鑒定具有診斷及治療作用，但是這些僅與那些具有該特定HLA表型的個體相關(guān)。由于細(xì)胞異常并非限于一種特定的HLA表型，且定向治療要求對異常細(xì)胞的一些表型知識，因此在該領(lǐng)域還需做進(jìn)一步研究。
酪氨酸酶可催化將酪氨酸轉(zhuǎn)化為脫羥苯丙氨酸或“DOPA”的反應(yīng)，并似乎在黑色素瘤細(xì)胞中選擇性表達(dá)(Muller et al.,EMBOJ 7:2715(1988))。關(guān)于這一人類酶cDNA的早期報道見于Kwon，美國專利4,898,814。稍遲的由Bouchard et al.,J.Exp.Med.169:2029(1989)的報道展示了一略有不同的序列。由于其參與色素沉著類疾病，因而有許多致力于鑒定該酶抑制劑的努力。這類文獻(xiàn)的實例包括Jinbow,WO9116302；Mishima et al.，美國專利5,077,059，及Nazzaropor，美國專利4,818,768。技術(shù)人員也熟悉其它教導(dǎo)相似物的參考文獻(xiàn)。
美國專利申請08/081,673號，申請日1993年6月23日教導(dǎo)了酪氨酸酶可能以一種與外來抗原或TRAP分子-發(fā)現(xiàn)于在某些細(xì)胞異常如黑色素瘤中-相似的方式被處理，酪氨酸酶被加工并且由其衍生的肽與在某些異常細(xì)胞上的HLA分子形成復(fù)合物。發(fā)現(xiàn)這些復(fù)合物可由胞溶T細(xì)胞(CTL)識別，隨后胞溶T細(xì)胞將呈遞細(xì)胞溶解。討論了該令人驚奇的和未預(yù)料到的現(xiàn)象的應(yīng)用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)由HLA-A2分子呈遞的也可作為腫瘤排斥抗原的其它肽?？梢娒绹鴮＠暾?8/203,054，申請日為1994年2月28日的專利申請所述(該申請引入本文作參考)。
引入本文作參考的美國專利申請08/233,305(申請日1994年4月26日)提示酪氨酸酶也被加工成由HLA-B44分子呈遞的抗原。由于不是所有個體都是HLA-A2+,因而該發(fā)現(xiàn)是非常重要的。由于酪氨酸酶表達(dá)不是普遍的，所以酪氨酸酶可被加工成HLA-B44呈遞的肽這一事實，不能提供通用于所有HLA-B44+腫瘤的診斷和治療方法。進(jìn)一步地，酪氨酸酶是通過正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞表達(dá)這一事實可以提示在治療領(lǐng)域的一些警示。
人群分析表明大約22～24％的高加索人表達(dá)HLA-B44分子。如參見Imanishi,et al.，在Tsuji等人編輯的“HLA 199l,Vol.I，第十一屆組織相容性國際專題討論會”，Oxford牛津大學(xué)出版社，1991；Lee,Lee編輯的HLA系統(tǒng)一個新途徑，Springer,pp.141-178(1990)。前期研究已顯示大約76％的所有轉(zhuǎn)移性黑色素瘤表達(dá)MAGE-3(Brasseur,et al.,Int.J.Cancer 63:375-380(1995))。因此，近17％的高加索人群中的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤應(yīng)在其表面呈遞HLA-B44和MAGE-3衍生的肽的復(fù)合物，從而可明確應(yīng)用于診斷和治療。已鑒別出五種不同的HLA-B44等位基因，這可見于Fleischhauer等，組織抗原37:133-137(1991)；Petersdorf等，組織抗原44:211-216(1994)；Yao等，免疫遺傳學(xué)40:310；Yao等，人類免疫學(xué)，42:54-60(1995)；Yao等，免疫遺傳學(xué)41:387(1995)。在表達(dá)HLA-B44的高加索人群中，61％呈遞HLA-B*4402等位基因，36％呈遞HLA-B*4403等位基因。見Yao等，人類免疫學(xué)42:54-60(1995)。在這兩個等位基因中只有一個發(fā)生在第156位氨基酸的差異。在HLA-B*4402，該位置是由Asp占據(jù)，而HLA-B*4403是Leu。在HLA-B*4402及HLA-B*4403等位基因不同的供體與受體之間已觀測到骨髓異體移植排斥反應(yīng)及移植排斥宿主疾病。由于第156位氨基酸位于α2螺旋中部并延伸至肽結(jié)合位點內(nèi)，所以令人感興趣的是確定這些不同的HLA-B44等位基因是否呈遞不同的肽。
Khanna等，J.Exp.Med.176:169-179(July 1992)揭示了一種HLA-B44結(jié)合肽，在下文將進(jìn)一步闡述。該Khanna肽與本文權(quán)利要求的肽不相關(guān)。
Kita,et al.,Hepatology 18(5):1039-1044(1993)教導(dǎo)了一種據(jù)說與HLA-B44結(jié)合并激發(fā)溶解的20個氨基酸的肽。
Thorpe,et al.,Immunogenetics 40:303-305(1994)描述了與HLA-B44結(jié)合的兩種肽的序列對比，并提示一種通用結(jié)合基序。Thorpe揭示了在第2位是帶負(fù)電荷氨基酸，及在第9位的可能是疏水的或帶正電荷的氨基酸。
Fleischhauer,et al.,Tissue Antigens 44:31l-317(1994)包含了HLA-B44結(jié)合肽的全面評述。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)也表達(dá)一種腫瘤排斥抗原前體的MAGE-3被加工成由HLA-B44分子呈遞的一種腫瘤排斥抗原。引人興趣的是該肽與也衍生自MAGE-3的并已知結(jié)合HLA-A1的肽不同，不同之處是在N末端加了一個氨基酸。這是以下本發(fā)明所揭示的主題。
附圖簡要說明

圖1示出使用三種不同細(xì)胞系(LB33-MELcl,LB33 EBV-B及K562)由胞溶T細(xì)胞克隆159/5所致鉻釋放分析結(jié)果。該數(shù)據(jù)以效應(yīng)器/靶比率對溶解百分率表示。
圖2示出鑒定的細(xì)胞變體“A-”,“B-”及“A-,B-”的溶解研究結(jié)果。再一次應(yīng)用鉻釋放分析。細(xì)胞系LB33-MELcl是A+B+,如用兩種CTL細(xì)胞系溶解均呈陽性所示。CTL159/93是抗-A，而CTL159/5是抗-B。
圖3示出當(dāng)變體A-B-用編碼HLA-A28,HLA-B44及HLA-Cw7的每種序列轉(zhuǎn)染，與對照細(xì)胞系的比較結(jié)果。結(jié)果以靈敏的TNF釋放分析(pg/ml)來描述，其中使用了CTL159/5。
圖4示出由CTL 159/5所致的TNF的釋放，其中COS細(xì)胞用HLA-B44加上本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)染。
圖5A描繪了當(dāng)與CTL 159/5接觸時，在EBV-B細(xì)胞中的51Cr釋放。
圖5B與圖5A相似，但使用的是LB33-MEL B-細(xì)胞。在圖5A和5B中，本發(fā)明的抗原肽在與CTL接觸前與細(xì)胞接觸。
圖6示出各種自身CTL克隆對衍生自黑素瘤克隆系LB33.MEL.A-1的抗原喪失變體的溶解活性。
圖7代表HLA-A24,A28及B13分子經(jīng)LB33-MEL.A-1抗原喪失變體的表達(dá)結(jié)果。腫瘤細(xì)胞已用抗特定HLA分子的小鼠抗體溫育，并隨后用熒光標(biāo)記的羊抗鼠抗體標(biāo)記。
圖8示出通過用各種HLA等位基因轉(zhuǎn)染的抗原喪失變體刺激的、由CTL克隆所致的腫瘤壞死因子(TNF)的產(chǎn)生。使用未轉(zhuǎn)染的LB33-MEL.A-1細(xì)胞及抗原喪失變體作為對照。使用的CTL克隆是分別對應(yīng)于抗-A，抗-B，抗-Ca抗-Cb及抗-D CTL的159/3,159/5及204/26,179c/50和202/1。
圖9進(jìn)一步闡述了圖6和圖8所述的CTL克隆的胞溶活性相關(guān)的數(shù)據(jù)。經(jīng)由1988年的外科手術(shù)獲得LB33-MEL.A細(xì)胞系。從1993年的患者體內(nèi)轉(zhuǎn)移中得到LB33-MEL.B細(xì)胞系。
圖10A描繪了抗-E CTL克隆LB33-CTL-269/1對自身黑素瘤細(xì)胞的溶解活性，而圖10B示出在經(jīng)LB33-MEL.B-1細(xì)胞刺激后，由相同CTL克隆產(chǎn)生的TNF。刺激細(xì)胞(10,000個/微孔)已用3000個CTLs溫育16小時。應(yīng)用TNF敏感性WEHI-164c13細(xì)胞測定由CTLs釋放的TNF濃度。通過加入1/100稀釋的得自用雜交瘤細(xì)胞接種的小鼠的腹水用抗HLA-A24單克隆抗體C7709A2抑制CTL的刺激作用。
圖11A和11B示出分析結(jié)果，其中用競爭結(jié)合分析檢測了SEQ IDNO:17,18,19及3。
圖12描繪了在51Cr釋放分析中，SEQ ID NO:17與天然呈遞HLA-B44的細(xì)胞結(jié)合應(yīng)用所得結(jié)果。
圖13概括了51Cr溶解分析的結(jié)果，其中靶細(xì)胞是天然HLA-B44陽性的，如癌細(xì)胞系。
圖14示出了以競爭結(jié)合分析測試SEQ ID NO:17及3的研究結(jié)果。
圖15A示出在51Cr釋放分析中溶解分析結(jié)果，其中得自供體LB816的淋巴細(xì)胞對HLA-B*4402呈遞細(xì)胞進(jìn)行測試。圖15B是使用得自供體LB822 CTL LB822的淋巴細(xì)胞與HLA-B*4403呈遞細(xì)胞進(jìn)行測試的平行信息。
圖16示出證實特異于SEQ ID NO:17及HLA-B44分子復(fù)合物的CTL的特異性的數(shù)據(jù)。
圖17示出證實特異于MAGE-3及HLA-B44分子的CTL的特異性的數(shù)據(jù)。
圖18描繪了當(dāng)天然呈遞HLA-B44分子并也表達(dá)MAGE-3的細(xì)胞經(jīng)用本申請中揭示的CTL測試時所得結(jié)果。
優(yōu)選實施方案詳述實施例1在以下試驗中應(yīng)用已供研究者使用多年的黑素瘤細(xì)胞系LB33-MEL。還使用了衍生自其中的一個克隆，該克隆在后文稱作LB33-MELcl。
從LB33患者取含單核血細(xì)胞的樣品。將黑素瘤細(xì)胞系與含單核血細(xì)胞的樣品接觸。觀測該混合物的黑素瘤細(xì)胞系的溶解，該溶解表明特異于由黑素瘤細(xì)胞呈遞的肽及HLA分子的復(fù)合物的胞溶T細(xì)胞(“CTL”)存在于樣品中。
所應(yīng)用的溶解分析是一種鉻釋放分析法，參見Herin et al.,Int.J.Cancer 39:390-396(1987)中所述(該文引入本文作參考)。本文再次闡述該分析。體外培養(yǎng)靶黑素瘤細(xì)胞，然后在補(bǔ)加10mM HEPES及30％FCS(即胎牛血清)的DMEM中以107個細(xì)胞/ml將其再懸浮，并在37℃用200μCi/ml的Na(51Cr)O4溫育45分鐘。用補(bǔ)加10mMHepes的DMEM沖洗標(biāo)記的細(xì)胞三次。將其在補(bǔ)加10mM Hepes及10％FCS的DMEM中再懸浮之后將含103個細(xì)胞的100μl等份布于96孔微板。加入在100μl相同培養(yǎng)基中的PBLs樣品，分析以雙份重復(fù)進(jìn)行。將板在100g離心4分鐘，并在37℃含5.5％CO2氣氛中溫育4小時。
將板再離心，收集并計數(shù)上清液的100μl等份。以下式計算51Cr釋放百分率
其中ER是觀測到的實驗51Cr釋放，SR是經(jīng)在200μl培養(yǎng)基中溫育103個標(biāo)記細(xì)胞所測定的自發(fā)釋放，MR是經(jīng)在靶細(xì)胞中添加100μl 0.3％TritonX-100所得的最大釋放。
將那些呈高CTL活性的單核血樣品經(jīng)有限稀釋加以擴(kuò)增及克隆，并用相同方法再篩選。
用相同方法測試K562靶細(xì)胞。當(dāng)使用EBV-B細(xì)胞時，唯一的改變是用補(bǔ)加5％FCS的Hank’s培養(yǎng)基代替DMEM培養(yǎng)基。
這些實驗導(dǎo)致CTL克隆LB33-CTL-159/5的分離。圖1示出該克隆可溶解腫瘤細(xì)胞，而不溶解EBV-B細(xì)胞或K562細(xì)胞。
根據(jù)同樣方法分離到第二種CTL克隆即LB33-CTL-159/3。這些細(xì)胞系分別被稱作“159/5”及“159/3”。該第二種CTL與159/5特異性不同。這可在兩種抗原喪失變體分離后確定，其一由159/5而非159/3溶解，其二由159/3而非由159/5溶解。這些變體分別稱作A-及B-。
然后將A-變體用159/5免疫篩選，并得到第三種變體，其既不能由159/5也不能由159/3溶解。該變體稱作A-B-。圖2描繪了導(dǎo)致變體的分離的溶解分析結(jié)果。
實施例2令人感興趣的是檢測變體A-及B-的HLA表達(dá)模式。衍生母細(xì)胞系LB33-MEL的患者分型為HLA-A24,A28,B13,B44,Cw6,Cw7。當(dāng)進(jìn)行PCR表達(dá)分析時，會發(fā)現(xiàn)LB33-MELcl及B-變體可表達(dá)所有六種等位基因；但A-B-變體不能表達(dá)HLA-A28,B44及Cw7。結(jié)果可斷定這些HLA分子中的一種呈遞抗原導(dǎo)致經(jīng)CTLs的溶解。下例進(jìn)行進(jìn)一步探索。
實施例3將A-及B-變體的樣品用已經(jīng)克隆有HLA-A28,HLA-B44或HLA-Cw7其一的質(zhì)粒pcDNA-Ⅰ/AmpⅠ轉(zhuǎn)染。篩選后，參考Traversari,et al.,Immunogenetics 35:145-152(1992)所述用TNF釋放分析法測試細(xì)胞。結(jié)果示于圖3，示出HLA-B44明顯參與抗原的呈遞。
實施例4一旦鑒別出HLA呈遞分子，則要進(jìn)行研究以鑒別是呈遞的肽來源的后文稱作“腫瘤排斥抗原前體”或“TRAP”的分子。
為此從LB33-MELcl細(xì)胞系中分離總mRNA。應(yīng)用已熟知技術(shù)，使用寡-dT結(jié)合試劑盒分離信使RNA。一旦分離出信使RNA，再使用標(biāo)準(zhǔn)方法，將其轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后將cDNA與EcoRⅠ接頭連在一起，并根據(jù)生產(chǎn)者指導(dǎo)克隆入pcDNA-Ⅰ/Amp質(zhì)粒的EcoRⅠ位點。然后將重組質(zhì)粒電穿孔進(jìn)DH5αE.coli中(電穿孔條件2500V,25μ法拉1脈沖)。
用氨芐青霉素(50μg/ml)篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)菌，然后分成每庫100個細(xì)菌的許多庫。每庫相當(dāng)于大約50種不同cDNA，分析顯示大約50％質(zhì)粒包含一插入片段。將每庫擴(kuò)增至飽和狀態(tài)，并經(jīng)堿溶解，醋酸鉀沉淀及苯酚提取分離質(zhì)粒DNA，參見Maniatis et,al.分子克隆實驗手冊(Cold Spring Harbon,N.Y.,1982)。未使用銫梯度離心。
擴(kuò)增的質(zhì)粒隨后被轉(zhuǎn)染進(jìn)真核細(xì)胞。在含有補(bǔ)加10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)平底微孔中以每孔15,000個細(xì)胞播種COS-7細(xì)胞樣品。將細(xì)胞在37℃溫育過夜，除去培養(yǎng)基，隨后用含10％Nu血清，400μg/ml DEAE-葡聚糖，100μM氯喹及含來自LB33的HLA-B44的cDNA的100ng質(zhì)粒的DMEM培養(yǎng)基以30μl/孔置換。在37℃溫育4小時后，除去培養(yǎng)基并用含10％DMSO的50μl PBS置換。2分鐘后除去該培養(yǎng)基并用200μl補(bǔ)加10％FCS的DMEM置換。
經(jīng)過這種培養(yǎng)基的變化后，在37℃將COS細(xì)胞溫育48小時。隨后棄去培養(yǎng)基，并加入在100μl含10％庫集人血清及25μ/ml IL-2的Iscove培養(yǎng)基中的2000個159/5細(xì)胞。24小時后取上清液，并以如Traversari et al.,Immunogenetics 35:145-152(1992)(該文引入本文作參考)中所述在WEHI細(xì)胞上分析以檢測TNF含量。一個庫刺激TNF釋放高于背景，克隆這些細(xì)菌并用于以下試驗。
實施例5提取實施例4中克隆的細(xì)菌的質(zhì)粒DNA，并以前述相同方式轉(zhuǎn)染入一新COS細(xì)胞樣品中，并再測試159/5對該細(xì)胞的刺激作用。在350/2克隆中發(fā)現(xiàn)一陽性克隆，數(shù)據(jù)示于圖4A。
為證實所得結(jié)果，應(yīng)用了得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心的人絨毛癌細(xì)胞系JAR。該細(xì)胞系不表達(dá)HLA分子，也不能由CTLl59/5識別。當(dāng)JAR用HLA-B44 cDNA轉(zhuǎn)染時，其也不能由CTL159/5識別。而用HLA-B44及350/2cDNA共轉(zhuǎn)染卻導(dǎo)致溶解，見圖4B所示。
提取來自陽性克隆的質(zhì)粒，并用本領(lǐng)域已知技術(shù)測序。結(jié)果顯示質(zhì)粒插入物有1896堿基對長，并顯示出不與數(shù)據(jù)庫中的任何序列同源。該核苷酸序列在本文示為SEQ ID NO:1。
實施例6為確定是腫瘤排斥抗原的肽，將均分為大約300堿基對的SEQ IDNO:1的片段經(jīng)PCR擴(kuò)增，克隆入pcDNA-1/Amp，隨后遵循前例方法與編碼HLA-B44的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞。這些實驗導(dǎo)致鑒別出相應(yīng)于SEQ ID NO:1的第683-955位氨基酸殘基的區(qū)域編碼抗原肽。將該區(qū)域與Khanna et al.,J.Exp.Med.176:169～176(7/92)所述肽相對比，申請日為1994年4月26日的08/233,305所述肽，即Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe(SEQ ID NO:2)相應(yīng)于這些殘基。如此，合成相應(yīng)于該序列的肽，并用于敏化HLA-B44+細(xì)胞系。結(jié)果示于圖6A和6B，其示出使用EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞(圖6A)及前述B-變體(圖6B)的51Cr釋放分析結(jié)果。在加入CTL 159/5(效應(yīng)器/靶比率為10∶1)之前，將該細(xì)胞在37℃用不同濃度的肽溫育30分鐘。用100～200μg/ml肽可得到半最大溶解。
實施例7前述實施例1-6闡述了使用LB33-MELcl細(xì)胞系的研究工作。從LB33患者皮膚轉(zhuǎn)移中也衍生了其它細(xì)胞系。如此細(xì)胞系之一是LB33-MEL.A-1，其被用于以下實施例中。
首先，將該細(xì)胞系以本文前述實施例1-6使用細(xì)胞系的相同方式進(jìn)行應(yīng)用(Herin等，文獻(xiàn)同上)。用照射的腫瘤細(xì)胞(3/105細(xì)胞/孔)在2ml的補(bǔ)加10％庫集人血清，天冬酰胺-各氨酰胺-精氨酸(分別為36μg/ml,216μg/ml,116μg/ml),2-巰基乙醇(0.05mM)及5U/ml人IL-4的Iscove培養(yǎng)基中刺激血單核細(xì)胞(106/孔)。在培養(yǎng)的第3天加入IL-2(10U/ml)。如前述實施例1檢測腫瘤細(xì)胞對自身CTL的敏感度。該實驗產(chǎn)生82個穩(wěn)定的衍生自17個獨立培養(yǎng)物的胞溶T淋巴細(xì)胞。所有這些CTL都是CD8+，其特異于腫瘤細(xì)胞，可溶解LB33-MEL.A-1細(xì)胞，但不能溶解K562或其自身的EVB轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
實施例8LB33-MEL.A-1可被自身CTL溶解的事實提示了下一實驗，其是鑒定由確定的抗原喪失變體識別的抗原。
為此用前述自身CTL克隆LB33-CTL 159/3將細(xì)胞系樣品篩選4次。每次篩選包括以上述相同方式用相似數(shù)目的CTL溫育2-3×107個粘附的腫瘤細(xì)胞2-6小時。在每一輪中，溫育后將CTL洗掉，并在下一輪篩選前將所存活的粘附腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增。
該程序可得一抗CTL159/3的克隆，但當(dāng)用其它自身CTL測試時發(fā)現(xiàn)前述CTL 159/5可溶解該喪失變體，其它的包括204/26及202/1的CTL克隆也溶解該變體。見圖6，標(biāo)記為“MEL.A-1.1”的一欄。相似地可建立其它不能由這四種CTL克隆之一溶解但可由其它CTL克隆溶解的細(xì)胞系，見圖6。這樣由于四種截然不同的抗原喪失變體的鑒定可發(fā)現(xiàn)有至少4種不同抗原在LB33-MEL.A-1表面呈遞，如圖6所示，LB33-MEL.A-1抗原表達(dá)被認(rèn)為是“A+B+C+D+”(被CTL159/3,159/5,204/26及202/1溶解)；MEL.A-1.1為A-B+C+D+(不能被159/3溶解，可被其它溶解)；MEL.A-1.2為A+B-C+D+(不能由159/5溶解，可被其它溶解)；MEL.A-1.3為A+B+C-D+(不能由204/26溶解，可被其它溶解)；MEL.A-1.4為A-B+C+D-(不能由202/1或159/3溶解)。進(jìn)一步地分離到MEL.A-1.1.1細(xì)胞系，其為A-B-C+D-(只能由204/26溶解)。
當(dāng)在這些細(xì)胞系上測試經(jīng)實施例7鑒定的82個CTL時，鑒定出29個抗-A,29個抗-B,10個抗-C及14個抗-D克隆，提示沒有其它抗原被呈遞。
用抗-D CTL克隆202/1的篩選導(dǎo)致鑒定出一種對抗-A CTL克隆(159/3)也有抗性的的細(xì)胞系，用抗-B CTL篩選也是如此(即得到A-B-C+D-細(xì)胞系)。該結(jié)果提示A-D-和A-B-D-抗原喪失變體實際上是HLA喪失變體，抗原A,B和D共享相同的HLA呈遞分子，或不同的I類分子與抗原喪失變體一起喪失。以下實驗繼續(xù)探討該問題。
實施例9衍生LB33細(xì)胞系的患者已經(jīng)血清學(xué)分型為HLA-A24,A28,B13,B44,Cw6,Cw7。然后進(jìn)行研究以檢測細(xì)胞系對HLA I類基因的表達(dá)。
建立由PCR對DNA擴(kuò)增的半定量條件以評價由不同LB33-MEL腫瘤細(xì)胞克隆對6種I類等位基因中每一種的表達(dá)。使用了Browning等人所提出的擴(kuò)增回復(fù)突變系統(tǒng)(ARMS)PCR方法，該方法依賴在引物的3’末端完全配對的核苷酸以保證DNA擴(kuò)增的特異性。參見Browning et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2842(1993)(引入本文作參考)。基于LB33分型時所得序列，合成能將6種等位基因的每一種與其它五種區(qū)別出的等位基因特異性引物(5’引物后接3’引物)。對A24:5’-GCCGGAGTATTGGGACGA和5’-GGCCGCCTCCCACTTGC(SEQ ID NO:5和6)對A28:5’-GGAGTATTGGGACCGGAAG和5’-GGCCGCCTCCCACTTGT(SEQ ID NO:7和8)對B13:5’-CGCCACGAGTCCGAGGAT和5’-CCTTGCCGTCGTAGGCTA(SEQ ID NO:9和10)對B44:5’-CGCCACGAGTCCGAGGAA和5’-CCTTGCCGTCGTAGGCGT(SEQ ID NO:11和12)對Cw6:5’-CCGAGTGAACCTGCGGAAA和5’-GGTCGCAGCCATACATCCA(SEQ ID NO:13和14)對Cw7:5’-TACAAGCGCCAGGCACAGG和5’-CTCCAGGTAGGCTCTGTC(SEQ ID NO:15和16)為進(jìn)行表達(dá)的半定量測定，用每套引物進(jìn)行27輪逆轉(zhuǎn)錄RNA的PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)DNA擴(kuò)增在觀測到的線性范圍內(nèi)。擴(kuò)增的DNA量可用經(jīng)溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠目視估計。將該量與含來自LB33-MEL.A-1細(xì)胞的系列稀釋的RNA的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線相對比?？紤]到β-肌動蛋白基因的表達(dá)水平，將樣品的表達(dá)對RNA的完整性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果以相對于LB33-MEL.A-1細(xì)胞的表達(dá)水平表示。結(jié)果見下表1所示?！?++”表示表達(dá)相當(dāng)于大于LB33-MEL.A-1細(xì)胞表達(dá)水平-半的表達(dá)，“++”指表達(dá)在LB33-MEL.A-1的表達(dá)的1/8～1/2之間，“+”指表達(dá)低于LB33-MEL.A-1的表達(dá)的1/8，“-”指沒有表達(dá)。
表1衍生自LB33-MEL.A-1細(xì)胞的抗原喪失變體對I類HLA的表達(dá)LB33-LB33-MEL.A-1腫瘤細(xì)胞抗原喪失變體MEL.A-1下述分子的表達(dá)A-B-C-A-D-A-B-D-A． 基因表達(dá)A24 +++ ++++++- ++ +++A28 +++ +++++++++ + -B13 +++ +++++++ +++ +++B44 +++ +++++++++ ++ -Cw6 +++ +++++++ +++ +++Cw7 +++ ++ ++++++ + -由此可見，MEL.A-1細(xì)胞及B-變體對6種HLA等位基因的表達(dá)水平相似。A-變體顯示對Cw7的表達(dá)近4倍的降低。其余抗原喪失變體顯示三種等位基因表達(dá)降低。可發(fā)現(xiàn)C-細(xì)胞對HLA-A24,B13及Cw6表達(dá)水平降低，而A-D-及A-B-D-變體對A28,B44及Cw7表達(dá)水平降低。它提示A24-B13-Cw6及A28-B44-Cw7構(gòu)成LB33患者的兩種HLAI類單元型，且這些單元型的表達(dá)降低可能是由免疫篩選的腫瘤細(xì)胞對抗原表達(dá)的喪失的原因。
實施例10以下實驗設(shè)計用來證實在HLA基因表達(dá)及由CTL的溶解之間的相互關(guān)系。為此將以上所確定的HLA基因的表達(dá)與使用標(biāo)準(zhǔn)抗體分析獲得的結(jié)果相比較。只有A24,A28及B13用特異于其的鼠抗體進(jìn)行了測試(C7709A1特異于A24；2.28M1特異于A28,T48特異于B13)。抗體結(jié)合的檢測是經(jīng)用抗體溫育，漂洗然后與熒光素綴合的山羊抗鼠Ig抗體接觸來進(jìn)行的。將細(xì)胞隨后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)流式細(xì)胞計數(shù)進(jìn)行分析。
表2總結(jié)了該結(jié)果，也可見于圖7。在下表2，所表明的HLA表達(dá)水平相當(dāng)于示于圖6的平均熒光強(qiáng)度。數(shù)值以相對于發(fā)現(xiàn)于LB33-MEL.A-1細(xì)胞中的水平表示。
結(jié)果顯示當(dāng)HLA表達(dá)水平估計在LB33-MEL.A-1細(xì)胞表達(dá)水平的1/8以下范圍時，發(fā)現(xiàn)HLA表面分子水平為檢測不到或勉強(qiáng)可檢測，因此提示對于該特定HLA分子CTL的抗原呈遞是不可能發(fā)生的。
鑒于此，并假定C-,A-D-及A-B-D-篩選的細(xì)胞由于缺乏HLA分子已喪失抗原的表達(dá)，似乎抗原A的I類呈遞分子是A28或Cw7,B44是抗原B的I類呈遞分子，A24或B13或Cw6是抗原C的I類呈遞分子，而A28或Cw7是抗原D的I類呈遞分子。
表2LB33-MEL.A-1抗原喪失變體下述分子A-B-C-A-D-A-B-D-的表達(dá) 表面抗原的表達(dá)A24 100 3313441 95A28 100 291431 1B13 100 2722110 230實施例11上述實驗隨后的其它研究工作是明確地確定由LB33-MEL.A-1細(xì)胞表達(dá)的抗原的呈遞分子。為此用傳統(tǒng)磷酸鈣沉淀法將已喪失特定HLA I類分子表達(dá)的腫瘤細(xì)胞用表達(dá)載體pcDNA3轉(zhuǎn)染，該載體已克隆有特定的I類cDNA。該載體包含neoR標(biāo)記。用1.5mg/ml的G418篩選轉(zhuǎn)染子，然后將轉(zhuǎn)染子用于刺激CTL克隆，使用的是如前例闡述的TNF分析法。
圖8示出該結(jié)果。經(jīng)用攜帶HLA-B44的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，抗原B的表達(dá)重建于A-B-D-細(xì)胞中但用含HLA-A28或HLA-Cw7的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不重建。用HLA-B13轉(zhuǎn)染抗原C的表達(dá)重建于C-細(xì)胞中。4種其它抗-C CTL克隆也識別C-細(xì)胞，但5種其它抗-C CTL克隆包括CTL 179c/50不能識別；但這些CTL可識別用HLA-Cw6轉(zhuǎn)染的C-細(xì)胞。這樣可以推斷有兩組抗-C CTL克隆。一種識別由HLA-B13呈遞的抗原，而另一種識別由HLA-Cw6呈遞的抗原。對抗原D，經(jīng)用HLA-A28轉(zhuǎn)染，A-D-細(xì)胞重建為A-D+。盡管抗原A明顯地由HLA I類分子呈遞，(因為由抗-A CTL的溶解完全被抗-I類單克隆抗體W6/32所抑制)，但是沒有一種cDNA重建抗原A的表達(dá)(即測試的HLA-A28,B44,Cw7)。可能是該抗原由非-A、B、C的I類分子呈遞，其中有兩種等位基因存在于LB33患者體內(nèi)，其一與A28-B44-Cw7單元型一起在A-D-,A-B-D-細(xì)胞中喪失。
對抗原C的研究結(jié)果引起命名的改變。后文中有兩種抗原，分別稱作抗原Ca及抗原Cb。
實施例12在進(jìn)一步實驗中，闡述了LB33-MEL.B細(xì)胞系的細(xì)胞能否由自身細(xì)胞系識別的問題。
以前述使用相同方式(Herin等)將照射的LB33-MEL.B.1細(xì)胞用于刺激自身淋巴細(xì)胞。該淋巴細(xì)胞在1990年或1994年取自LB33患者。
只有取自1994年的淋巴細(xì)胞溶解LB33-MEL.B-1細(xì)胞；但其不能溶解LB33-MEL.A細(xì)胞。因此LB33-MEL.B-1細(xì)胞系呈遞一種在LB33-MEL.A-1上未發(fā)現(xiàn)的抗原。
本文所述實驗與前述那些實驗平行，并且正如在以前實驗中一樣建立了另一組CD8+CTL克隆。該CTL 269/1組的反應(yīng)性見于圖10A。注意到與“MEL.B-1”而不是“MEL.A-1”反應(yīng)。由此確定的新抗原稱作“LB33-E”。
在抗體抑制實驗中，HLA-A24的mAbs抑制溶解。見圖10B所示。因此“E”抗原由HLA-A24呈遞。
實施例13
Fleischhauer et al.,Tissue Antigens 44:311～317(1994)(引入本文作參考)中教導(dǎo)了用于HLA-B44結(jié)合的共有基序。該基序被描述為一種9或10個氨基酸多肽，其中Glu主要在第二位，Tyr或Phe在最后一位(9或10位)，且疏水殘基如Met在第三位。
MAGE-3 TRAP氨基酸序列在第167～176位包含一段相當(dāng)于該基序的氨基酸序列。該氨基酸序列是Met Glu Val Asp Pro Ile Gly HisLeu Tyr(SEQ ID NO:17)。
已知HLA-B44基序含有至少兩種重要亞型，稱作HLA-B*4402及HLA-B*4403。該MHC分子在23％的高加索人中呈現(xiàn)。當(dāng)將該數(shù)字與黑素瘤標(biāo)準(zhǔn)分析組合時，可推斷15％高加索人黑素瘤患者應(yīng)在其黑素瘤細(xì)胞表面呈遞HLA-B44。這樣令人大感興趣的是確定SEQ ID NO:17的肽或其相關(guān)分子是否確實可用于鑒定HLA-B44細(xì)胞，并在與MHC分子結(jié)合后誘發(fā)其溶解。如前述實施例所述，SEQID NO:2的肽可與HLA-B44陽性細(xì)胞結(jié)合。設(shè)計一種肽，除了在第8位是Ala而不是Leu之外，與SEQ ID NO:2肽相似。將該新肽即Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe(SEQ ID NO:18)用SEQ IDNO:2進(jìn)行競爭分析測試。參考得自本文未報道的實驗結(jié)果而使用該肽。概括地，制備SEQ ID NO:2的衍生物，其中每個衍生物在未被SEQ ID NO:2中Ala占據(jù)的位置含有一個Ala。克隆159/5識別含SEQ ID NO:18的復(fù)合物比識別含SEQ ID NO:2的復(fù)合物稍好一些，使之成為優(yōu)異的競爭分析試劑。如Storkus et al.,J.Immunol138:1657～1659(1987)所述，使用C1R細(xì)胞進(jìn)行競爭。這些C1R細(xì)胞是MHC I類陰性的淋巴母樣細(xì)胞。將C1R細(xì)胞如前述相同方法用HLA-B*4402的cDNA或HLA-B*4403的基因組DNA轉(zhuǎn)染。該HLA-B*4402的cDNA見Fleischhauer等在Tissue Antigens 44:311～317(1994)中所闡述，而HLA-B*4403的基因組DNA見Fleischhauer等(1990)New Eng.J.Med 323:1818-1821(1990)所述。兩文章均作為參考。
在抗-HLA I類單克隆抗體W6/32存在條件下(30％(v/v)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基)，在37℃用51Cr將細(xì)胞標(biāo)記一小時。這可提高細(xì)胞對T細(xì)胞呈遞抗原肽的能力。
洗滌標(biāo)記的細(xì)胞，并在無血清培養(yǎng)基中與各種濃度的競爭肽一起在20℃溫育30分鐘。這些肽包括Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:3)，如前述其與HLA-B44分子結(jié)合；Phe Leu Arg GlyArg Ala Tyr Gly Leu(SEQ ID NO:19)其由EBV基因EBNA-3A編碼并與HLA-B8(Burrows,J.Exp Med 171:345-349(1990))結(jié)合；及SEQ ID NO:17。
然后加入在無血清培養(yǎng)基中的SEQ ID NO:18肽至終濃度為45ng/ml(C1R-B4402+細(xì)胞)或160ng/ml(C1R-B4403+細(xì)胞)。將細(xì)胞在20℃溫育30分鐘并用Iscove’s培養(yǎng)基加2％胎牛血清洗二次。以E∶T=20的比率加入在Iscove’s培養(yǎng)基及10％人血清中的CTL克隆LB33-CTL 159/5。3小時后檢測C1R-B*4402及C1R-B*4403細(xì)胞51Cr的釋放，見圖11A和11B所示。圖11所示數(shù)據(jù)明顯示出競爭的證據(jù)。
實施例14在實施例13所述之后進(jìn)行另外的實驗。
胞溶T細(xì)胞克隆(CTLs)衍生自兩個受試者，分別稱作LB816及LB822。這些受試者示出無癌癥跡象。
使用密度梯度離心法從受試者中分離血單核細(xì)胞(BMCs)。使用已經(jīng)用溴化氨乙基異硫脲翁處理的綿羊紅血細(xì)胞將BMCs中的T淋巴細(xì)胞經(jīng)rosetting提純，然后用與磁性微珠綴合的抗-CD8單克隆抗體標(biāo)記。經(jīng)過磁場選出CD8+細(xì)胞，然后在-80℃貯于補(bǔ)加10％人血清，116mg/l L-精氨酸，36mg/ml L一天冬酰胺，216mg/ml L-谷氨酰胺，0.05mM 2-巰基乙醇及10％DMSO的Iscove培養(yǎng)基中。
將任何非rosetting的BMC在37℃在組織培養(yǎng)板上粘附2小時。棄去未粘附細(xì)胞，并將粘附的細(xì)胞在有IL-4(50U/m1)及GM-CSF(100ng/ml)的條件下培養(yǎng)7天。所得群體富集了抗原呈遞細(xì)胞(“APCs”，在此處為樹狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)。然后將5×105-5×106的這些細(xì)胞在400μl補(bǔ)加2.5μg/ml人β2微球蛋白及50μg/ml SEQID NO:17肽的Isove’s培養(yǎng)基中，在2ml孔中于37℃溫育4小時。然后將粘附的、肽脈沖細(xì)胞以5000rads照射并洗滌。接著加入在補(bǔ)加1000U/ml IL-6及5ng/ml IL-12的培養(yǎng)基中的2×106個自身CD8+T細(xì)胞。
7天后，如上所述用粘附的自身BMCs再次刺激淋巴細(xì)胞并用肽脈沖。將5×106個BMCs在400μl上述含β2-微球蛋白和SEQ IDNO:17的Iscove’s培養(yǎng)基中于37℃粘附2小時。照射所有肽脈沖的粘附細(xì)胞并洗滌。然后加入在補(bǔ)加10U/ml IL-2及5ng/ml IL-7的培養(yǎng)基中的應(yīng)答細(xì)胞。
在第14天，用自身BMCs再刺激淋巴細(xì)胞并用SEQ ID NO:17脈沖。將BMCs在含β2-微球蛋白及SEQ ID NO:17的Iscove’s培養(yǎng)基中以2×107細(xì)胞/ml溫育。溫育(20℃)2小時后，肽脈沖的BMCs被照射，洗滌并在補(bǔ)加IL-2及IL-7的培養(yǎng)基中以2×106細(xì)胞/ml重懸。將這些刺激細(xì)胞(2×106)樣品加入含應(yīng)答細(xì)胞的每個孔中。
在第21天克隆應(yīng)答淋巴細(xì)胞，在已補(bǔ)加50U/ml IL-2及5U/ml IL-4的培養(yǎng)基中以10～0.3個細(xì)胞/孔播種在微孔中。然后通過加入同種異型EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞(LG2-EBV-B)進(jìn)行刺激，并在10,000rads，以每孔20,000個細(xì)胞照射，并加入(ⅰ)肽脈沖的HLA-B4402+細(xì)胞，或(ⅱ)肽脈沖的HLA-B4403+細(xì)胞。對(ⅰ)或(ⅱ)，以15,000rads，每孔8000個細(xì)胞進(jìn)行照射。
以同在第1天相同方式將微培養(yǎng)物每周再刺激一次。一個改變是在第28及35天，每孔分別加入40,000及60,000個EBV-B細(xì)胞，而第21天加入20,000個細(xì)胞。
在第41-52天之間，增殖的微培養(yǎng)物等份被轉(zhuǎn)至V-底微孔中以測試對經(jīng)SEQ ID NO:17脈沖或未脈沖的HLA-B4402+或HLA-B4403+靶細(xì)胞的溶解活性。
將呈抗肽溶解活性的微培養(yǎng)物用5×104個照射的、肽脈沖的B4402+或B4403+細(xì)胞，在800μl補(bǔ)加50U/ml IL-2及5U/ml IL-4的培養(yǎng)基中再刺激。
7天后，將CTL克隆每周用2×105個照射的肽脈沖的B4402+或B4403+細(xì)胞與106個照射的LG2-EBV-B細(xì)胞一起再刺激。由此得到CTLs LB816-CTL-340A/1及LB822-CTL-346A/1。這些克隆分別特異于SEQ ID NO:17與HLA-B*4402或HLA-B4403的復(fù)合物。
實施例15在一套進(jìn)一步實驗中，將不表達(dá)MAGE-3的HLA-B4402+或HLA-B4403+EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞用51Cr在有單克隆抗體W6/32存在下，在37℃標(biāo)記1小時，見Brodsky,et al.,J.Immunol 128:129-135(1982)。洗細(xì)胞并使用不同濃度的SEQ ID NO:17在無血清培養(yǎng)基中在20℃溫育細(xì)胞30分鐘。用51Cr釋放分析測試實施例14所述的每個CTL,4小時后測定鉻釋放。
結(jié)果示于圖12，示出該肽確實可激發(fā)溶解。
實施例16在以下實驗中，檢測的是HLA-B44陽性的其它腫瘤細(xì)胞系。
所有測試的細(xì)胞系都用51Cr在37℃標(biāo)記1小時。然后將其在Iscove’s培養(yǎng)基加2％胎牛血清中加入到各種數(shù)目的實施例14所述的兩個CTL克隆中。4小時后測51Cr釋放。還使用了對照組，見圖13所示。需指出的是在分析前將LB33-MEL細(xì)胞系用IFN-γ2(50U/ml)溫育48小時。
這些實驗結(jié)果示于圖13。CTL克隆LB816-CTL-340A/1和LB822-CTL-346A/1可溶解表達(dá)MAGE-3的腫瘤細(xì)胞，但不能溶解不表達(dá)MAGE基因的LB33-EBV-B細(xì)胞。CTL克隆LB822-346-A/1可溶解表達(dá)MAGE-3的HLA-B*4403+腫瘤細(xì)胞系MZ2-MEL，但不能溶解抗原喪失變體MZ2-MEL.61.2D-。
實施例17為最終檢測SEQ ID NO:17肽與HLA-B44的復(fù)合物是否刺激CTL，進(jìn)行實驗以檢測腫瘤壞死因子的釋放是否被刺激。
首先，用在表達(dá)載體pcDNA-1/AMP中的編碼MAGE-3的cDNA(見Gaugler等，J.Exp.Med 179:921～930(1994))轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，一種HLA-B*4402 cDNA克隆入載體pcDNA3，或?qū)LA-B*4403 cDNA克隆入載體pcDNA1/AMP。使用如Aruffo,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 84:3365～3369(1987)所述DEAE葡聚糖氯喹法。
在37℃將轉(zhuǎn)染子溫育24小時，后加入3000個CTLs/孔。在37℃將其溫育18小時，然后收集上清液，并參見Espevik等J.Immunol.Meth.95:99-105(1986)所述經(jīng)測試對TNF敏感的WEHI-16克隆13細(xì)胞的胞溶作用來確定TNF含量。
下表2示出該結(jié)果，其中TNF釋放以pg/ml表示。在分析前將LB33-MEL及LB494-MEL用100U/ml IFNγ溫育24小時。同樣也測試了腫瘤細(xì)胞系LB33-MEL,LB494-MEL及MZ2-MEL。這些細(xì)胞系都表達(dá)MAGE-3 cDNA，并且是HLA-B*4402+(LB33-MEL,LB494-MEL)或HLA-B*4403+(MZ2-MEL)。這樣就不需對這些細(xì)胞轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示有TNF釋放，因此可推斷SEQ IDNO:17由HLA-B44 MHC分子呈遞，并且這些復(fù)合物可激發(fā)CTL活性。
表2抗MAGE-3.B44 CTL克隆的TNF產(chǎn)生CTL克隆 刺激細(xì)胞 TNF(pg/ml)LB816-CTL-340A/1 COS0.7(B4402) COS+MAGE-3 0.6COS+HLA-B4402 0.5COS+HLA+B4402+MAGE-3 33.7LB33-MEL(B4402, MAGE-3+++) 74.9LB494-MEL(B4402, MAGE-3+++) 32.3LB822-CTL-346A/1 COS1.2(B4403) COS+MAGE-3 1COS+HLA-B4403 1.2COS+HLA-B4403+MAGE-3 26.6MZ2-MEL(B4403,MAGE-3+++) 67.3實施例18前面呈現(xiàn)的結(jié)果結(jié)合如Brichard，等在Eur.J.Immunol.[CITE](1995)；Buseyne，等在J.Virol 67:694～702(1993)；Coulie等在Proc.Natl.Acad.Sci USA91:2105～2109(1994)；DiBrino等在Biochemistry34:10130～10138(1995)；Fleischhauer等在Tissue Antigens 44:311～317(1994)；Khanna等在J.Exp.Med.176:169～176(1992)；Kita等在Hepatology 18:1039～1044(1993)所述數(shù)據(jù)可示出與HLA-B44分子結(jié)合的肽通常在第2位包含Glu，而在最后一位是Tyr或Phe。對MAGE-3序列分析揭示有4種肽序列符合這些限制要求，即Gln Glu Glu Gly Pro Ser Thr Phe (SEQ ID NO:20)Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO:17)Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe (SEQ ID NO:21)Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe (SEQ ID NO:22)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的固相技術(shù)合成這些肽，然后用于實驗以檢測它們是否與HLA-B44 MHC分子結(jié)合。
用于實驗的是已經(jīng)用Epstein Barr病毒(EBV)轉(zhuǎn)化的C1R細(xì)胞。這些細(xì)胞與其它EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞的不同之處在于其可表達(dá)MAGE-3基因。它們還是MHC陰性的，因此能作為用編碼MHC分子的基因轉(zhuǎn)染的主體。用編碼HLA-B*4402的cDNA分子或用編碼HLA-B*4403的基因組DNA轉(zhuǎn)染樣品，參見Fleischhauer等在TissueAntigens 44:311～317(1994)或Fleischhauer等在N.Eng.J.Med.323:1828～1822(1990)所述。將轉(zhuǎn)染子在已補(bǔ)加10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
在競爭分析中，使用肽Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe(SEQID NO:18)，因為其已經(jīng)報道可與HLA-B44結(jié)合，例見Coulie等在Proc.Natl.Acad Sci.USA 92:7976～7980(1995)中所述(該文引入本文作參考)。同樣也報道了胞溶T細(xì)胞克隆LB33-CTL-159/5可識別并溶解在表面呈遞肽與HLA-B44復(fù)合物的細(xì)胞。將該克隆與恒量SEQ ID NO:18及變化量的SEQ ID NO:20,17,21,22中的每種及以下對照肽Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ IDNO:3)及Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu(SEQ ID NO:19)一起用于分析。
為進(jìn)行該分析，將轉(zhuǎn)染的C1R(C1R-B*4402,C1R-B*4403)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在37℃用51Cr在有抗人I類MHC單克隆抗體W6/32存在下(30％w/v的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基)標(biāo)記1小時并洗3次。在20℃在無血清X-VIVO10培養(yǎng)基中于V形底微孔中將標(biāo)記的細(xì)胞(80μl中1000個細(xì)胞)溫育30分鐘。如前所述以各種濃度加入受試肽，隨后對C1R-B*4402以50 ng/ml，對C1R-B*4403以160ng/ml加入在40μl X-VIVO10培養(yǎng)基中的肽Glu Glu Lys Leu Ile Val Val AlaPhe(SEQ ID NO:18)。該肽已知可與HLA-B*4402及HLA-B*4403同型結(jié)合(例見Coulie等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7976～7980(1995)所述)。將已用SEQ ID NO:18刺激的細(xì)胞在20℃溫育30分鐘并隨后在含2％胎牛血清的Iscove’s培養(yǎng)基中洗滌。然后將Coulie等所述可識別并溶解在其表面呈遞SEQ ID NO:18和HLA-B44復(fù)合物的細(xì)胞的CTL克隆LB33-159/5，以20,000個細(xì)胞在150μl補(bǔ)加10％人血清的Iscove’s培養(yǎng)基中加入。
以各種濃度加入競爭肽，直至由CTL 159/5所致溶解被抑制50％。使用前述公式確定溶解。當(dāng)不使用競爭肽時，C1R-B*4402轉(zhuǎn)化子的溶解為58％，而C1R-B*4403的溶解為72％。
在下表中，SEQ IDNO:3及19用作對照。前者即Ser Glu Ile TrpArg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:3)衍生自酪氨酸酶，并已知與HLA-B*4402及HLA-B*4403都可結(jié)合(Brichard et al.,Eur.J.Immunol.(1995))，而后者即Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu(SEQ ID NO:19)可與HLA-B8結(jié)合(Burrows,et al.,J.Exp.Med171:345～349(1990))。以下所示結(jié)果示出抑制由SEQ ID NO:8敏化的C1R-B44細(xì)胞溶解所需肽的濃度，以μM表示。肽 C1R-B*4402 C1R-B*4403SEQ ID NO:206015SEQ ID NO:172 1SEQ ID NO:21807SEQ ID NO:22205SEQ ID NO:3 1 ＜1SEQ ID NO:19＞100 ＞100可以看出，SEQ ID NO:17,20,21及22都可抑制C1R-B44細(xì)胞的溶解，這表明它們都可與HLA-B44分子結(jié)合。SEQ ID NO:17肽是HLA-B*4402及HLA-B*4403兩者的最佳結(jié)合者。見圖14所示，其中SEQ ID NO:17,19及3被描繪為對競爭肽濃度的溶解的函數(shù)。
在本文未報道的實驗中，也測試了與SEQ ID NO:17同源的，衍生自MAGE-1,2,4,6及12的氨基酸序列的肽，并發(fā)現(xiàn)它們與HLA-B44分子結(jié)合。
實施例19一旦明了各種肽確實可與HLA-B44同型結(jié)合，感興趣的是檢測該肽是否能用于激發(fā)特異于該肽與MHC分子復(fù)合物的胞溶T細(xì)胞克隆。
為檢測此點，從稱作LB816的供體內(nèi)分離出粘附的周圍血單核細(xì)胞，該供體未患癌癥且是HLA-B*4402陽性的。
使用密度梯度離心法將粘附細(xì)胞首先從周圍血單核細(xì)胞(“PBMCs”)樣品中分離出。使用2-氨乙基-異硫脲翁溴化物處理的綿羊紅血細(xì)胞經(jīng)rosetting將T淋巴細(xì)胞從樣品中提純，參見Mikamo,J.Immunol.Meth.107:189～196(1988)所述，然后用與磁性微珠結(jié)合的抗-CD8單克隆抗體標(biāo)記，隨后通過磁場選出CD8+細(xì)胞。將這樣分離的細(xì)胞冷凍貯存。未rosetting的PBMC在NUNC組織培養(yǎng)孔上在37℃粘附2小時，棄去未粘附的細(xì)胞。
然后將粘附的細(xì)胞在補(bǔ)加10％FCS，含有IL-4(50U/ml)及GM-CSF(100ng/ml)的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。使用GM-CSF和IL-4是為提高培養(yǎng)物中樹狀細(xì)胞的比例。見Romain等在J.Exp.Med.180:83～93(1994)；Sallusto等在J.Exp.Med.179:1109～1118(1994)中所述。當(dāng)分析細(xì)胞群時，發(fā)現(xiàn)那些取自供體LB816的大部分細(xì)胞是CD11C+及CD14+，而取自供體LB822的細(xì)胞多是CD11C+和CD14-。
5×105-5×106個這些抗原呈遞細(xì)胞隨后在2ml孔中在37℃,400μl補(bǔ)加入β2微球蛋白(2.5μg/ml)及50μg/ml SEQ ID NO:17的Iscove’s培養(yǎng)基中溫育4小時。在此之后以50Gy照射細(xì)胞并洗滌。隨后這些細(xì)胞如前所述用作自身CD8+細(xì)胞的刺激細(xì)胞。
建立6個自身CD8+細(xì)胞培養(yǎng)物。在每個培養(yǎng)物中，2×106個CD8+細(xì)胞與培養(yǎng)基結(jié)合(Iscove’s培養(yǎng)基加10％人血清，L-精氨酸，L-谷氨酰胺，L-天冬酰胺，0.05mM 2-巰基乙醇，1000U/ml IL-6和5ng/ml IL-12)。在第7和第14天，用刺激細(xì)胞刺激這些應(yīng)答細(xì)胞。為此如上所述在第7天將5×106個PBMC在37℃,400μl含β2-微球蛋白及SEQ ID NO:17肽的Iscove’s培養(yǎng)基中粘附2小時。如同前述照射粘附的細(xì)胞并洗滌。加入在已補(bǔ)加10U/ml IL-2和5ng/ml IL-7的培養(yǎng)基中的應(yīng)答淋巴細(xì)胞(如CD8+細(xì)胞)。在第14天，用已經(jīng)肽脈沖的PBMC再刺激該淋巴細(xì)胞。在此再刺激中，將2×107/ml PBMCs在20℃，如前述含β2微球蛋白及SEQ ID NO:17肽的Iscove’s培養(yǎng)基中溫育2小時。再一次將這些PBMCs照射，洗滌，并以2×106細(xì)胞/ml在補(bǔ)加IL-2和IL-7的培養(yǎng)基中再懸浮，隨后再如前述加入到應(yīng)答細(xì)胞中。
在第20天評價對已用SEQ ID NO:17敏化的LB816細(xì)胞(HLA-B*4402陽性細(xì)胞)的溶解活性。應(yīng)用前述51Cr釋放分析檢測溶解活性。結(jié)果示于圖15A。用未標(biāo)記的K562靶細(xì)胞(50,000個細(xì)胞/孔)將效應(yīng)細(xì)胞溫育45分鐘以抑制由類NK效應(yīng)細(xì)胞所致的溶解。用1μM的SEQ ID NO:17(實心圓)或不用該肽(空心圓)將51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞(1000個細(xì)胞/孔)溫育。4小時后測51Cr釋放。該6個自身CD8+培養(yǎng)物只有-個較好溶解靶細(xì)胞。
相似地，測試了HLA-B*4403陽性細(xì)胞(LB822)。結(jié)果見圖15B所示，可見受試的5個培養(yǎng)物中有一個可較好溶解細(xì)胞。
基于以上這些結(jié)果，可推斷抗-SEQ ID NO:17/HLA-B44細(xì)胞的前體的出現(xiàn)率是每107個CD8+淋巴細(xì)胞中出現(xiàn)1個。
該陽性培養(yǎng)物的淋巴細(xì)胞經(jīng)有限稀釋克隆。具體地，在第21天將這些細(xì)胞在補(bǔ)加50U/ml IL-2和5U/ml IL-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用已與1μg/ml SEQ ID NO:17在20℃溫育1小時的照射的C1R-B*4402細(xì)胞(150Gy,8000個細(xì)胞/孔)刺激LB816細(xì)胞，并洗滌。LB822克隆用是HLA-B*4403陽性黑素瘤細(xì)胞的照射的MZ2-MEL細(xì)胞(100Gy,8000細(xì)胞/孔)刺激。將照射的同種異體LG2-EBV細(xì)胞(100Gy,20,000細(xì)胞/孔)作為飼養(yǎng)細(xì)胞加入。每周刺激一次微培養(yǎng)物。由這種方式分離出CTL克隆LB816-CTL-340/1和LB822-CTL-346/8。
實施例20前述CTL克隆每周在2ml孔內(nèi)用2×105個已用1μg/ml SEQ IDNO:17在20℃溫育1小時的照射的C1R-B*4402或C1R-B*4403細(xì)胞刺激，然后洗滌，再加入照射的LG2-EBV細(xì)胞，所有細(xì)胞均在補(bǔ)加IL-2及IL-4的培養(yǎng)培養(yǎng)基中，參見前述。
為證實這樣分離的CTL克隆可識別SEQ ID NO:17和HLA-B44的兩種同種異型(allotypes)的復(fù)合物，將每種CTL克隆的10,000個細(xì)胞(每孔)與1000個/孔51Cr標(biāo)記的淋巴母樣B細(xì)胞(LB33-EBV,HLA-B*4402陽性的)合并，該淋巴母樣B細(xì)胞已經(jīng)在無血清培養(yǎng)基中與各種濃度的SEQ ID NO:17于20℃溫育30分鐘，然后洗滌。4小時后使用本文所述方法測51Cr的釋放。
結(jié)果示于圖15，示出對CTL340/1而言在大約40nM得到半最大溶解，而對CTL346/8而言在大約100nM得到半最大溶解。
在只在此處總結(jié)的實驗中，測試了與SEQ ID NO:17同源的，但在9位氨基酸不同，以Val代替Leu的肽。該肽來自MAGE-6。盡管所討論的特異性CTL克隆不能識別該肽，但其可有效地與HLA-B44亞型結(jié)合。因此，對于結(jié)合HLA-B44分子之目的，第9位是非關(guān)鍵的。
實施例21進(jìn)行進(jìn)一步實驗以檢測SEQ ID NO:17是否可在表達(dá)MAGE-3基因的細(xì)胞上被天然呈遞。
為檢測此點，將COS-7細(xì)胞(15,000個/孔)用50ng的含MAGE-3的cDNA的pcDNAI/Amp及50ng的含HLA-B*4403的cDNA的pcDNAI/Apm或50ng含HLA-B*4402的cDNA的pcDNA3/Amp共轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染可參見如Seed,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3365～3369(1987)所述已熟知的方法進(jìn)行。同樣也將NA8-MEL黑素瘤細(xì)胞共轉(zhuǎn)染。這些細(xì)胞既不表達(dá)HLA-B44也不表達(dá)MAGE-3分子。為共轉(zhuǎn)染NA8-MEL(30,000個細(xì)胞/孔)，應(yīng)用LIPOFECTAMINE使用前供質(zhì)粒的100ng樣品。
共轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞在37℃溫育36小時，然后測試其在有CTL克隆340/1及346/8存在下對腫瘤壞死因子(TNF)產(chǎn)生的刺激能力。可參考在此簡述的Lehman等在Eur.J.Immunol.25:340～347(1995)(引入本文作參考)所述方法檢測TNF的產(chǎn)生。在這些實驗中，將3000個CTL在含10％人血清及25U/ml IL-2的100μl Iscove’s培養(yǎng)基中加入。20小時后，收集上清液，并參考Espevik等在J.Immunol.Meth.95:99～105(1986)所述，通過測試其對WEHI 164 c13細(xì)胞的胞毒性來檢測TNF的含量。在這些實驗中，如圖17所示，用單轉(zhuǎn)染(MAGE-3或HLA-B*4402或HLA-B*4403)制備對照物。
圖17示出，用兩種構(gòu)建物共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞刺激TNF釋放，而用一個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則不能。該結(jié)果在兩種細(xì)胞類型及兩種CLT中均觀察到。對MAGE-3/HLA-B44復(fù)合物的識別不需由COS-7細(xì)胞提供的高拷貝數(shù)，如對NA8-MEL研究所示。
實施例22接著測試前述CTL即340/1及346/8的溶解呈遞HLA-B44腫瘤細(xì)胞的能力。所用細(xì)胞包括已知可表達(dá)MAGE-3的細(xì)胞系，包括LB-33-MEL-A-1,LB373-MEL,LB494-MEL,LB831-BLC,LG2-MEL及MZ2-MEL.43，除LB831-BLC外均是黑素瘤細(xì)胞，LB831-BLC細(xì)胞是膀胱癌衍生的細(xì)胞系。MZ2-MEL.61.2是已喪失MAGE-3表達(dá)的黑素瘤細(xì)胞系。在圖18中，如下所述，該細(xì)胞以空心圓(“○”)而不是實心圓(“●”)表示。除MZ2-MEL.43，MZ2-MEL.61.2及LG2-MEL之外，所有細(xì)胞在用于51Cr釋放分析之前，在有50U/ml IFN-γ存在下溫育48小時以上。在每種情況下，用在此不再重復(fù)的RT-PCR方法測試HLA-B*4402，或HLA-B*4403及MAGE-3的表達(dá)。
示于圖18的結(jié)果示出CTLS可識別并溶解這些天然表達(dá)MAGE-3/HLA-B44的細(xì)胞。
前述實驗闡述了編碼腫瘤排斥抗原前體即“TRAP”分子的分離的核酸分子。由此編碼的蛋白質(zhì)分子以一種產(chǎn)生至少一種由HLA-B44分子呈遞的腫瘤排斥抗原或“TRA”的方式在細(xì)胞內(nèi)被加工。盡管以前已明顯觀測到HLA-B44分子呈遞衍生自酪氨酸酶的肽，但本發(fā)明的核酸分子不編碼酪氨酸酶，且TRA不是酪氨酸酶衍生的。
本發(fā)明的腫瘤排斥抗原是在第2位為Glu，在第9或第10位為Phe或Tyr殘基的分離的九肽。尤其優(yōu)選的是具有下式的肽Xaa GluXaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr(SEQ ID NO:23)或Xaa Glu Xaa ValXaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr(SEQ ID NO:24)，其中Xaa是任何氨基酸。這些通式包括SEQ IDNO:17及衍生自不同MAGE蛋白質(zhì)且也與HLA-B44分子結(jié)合的同源肽。這些同源肽包括Lys Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr (SEQ ID No:25)；Val Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr (SEQ ID No:26)；Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID No:27)；Met Glu Ala Asp Pro Thr Set Asn Thr Tyr (SEQ ID No:28)；Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr (SEQ ID No:29)；及Val Glu Val Val ArgIle Gly His Leu Tyr(SEQ ID No:30)。
這些肽相應(yīng)于與SEQ ID NO:17同源的肽序列，分別發(fā)現(xiàn)于MAGE-1,2,4,5,6及12的相應(yīng)位置。它們與HLA-B44分子結(jié)合的能力使其特別可用于鑒別在其表面呈遞HLA-B44分子的細(xì)胞。
本發(fā)明的肽與已轉(zhuǎn)讓給本申請的受讓人的美國申請08/233,305所揭示的肽相似，該肽為Set Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ IDNO:3)。Khanna等(前述)教導(dǎo)了一個十聚體即Glu Glu Asn Leu LeuAsp Phe Val Arg Phe(SEQ ID NO:4)，但未討論怎樣修飾該十聚體才可產(chǎn)生有效的九聚體。
因此本發(fā)明包含可與HLA-B44分子結(jié)合然后激發(fā)CTL所致溶解的腫瘤排斥抗原。
如上所示，TRA和HLA分子的復(fù)合物可誘導(dǎo)胞溶T細(xì)胞應(yīng)答，且如此的腫瘤排斥抗原和HLA-B44分子的分離的復(fù)合物也包含在本發(fā)明內(nèi)，由前述核酸分子編碼的分離的腫瘤排斥抗原前體也包含在本發(fā)明內(nèi)。給定結(jié)合特異性，肽也可用于方便地鑒別HLA-B44陽性細(xì)胞。
本發(fā)明還有許多用途，在此闡述其中一部分。首先，由HLA-B44分子特異性呈遞的腫瘤排斥抗原及編碼其平行腫瘤排斥抗原前體的核酸分子的鑒別可使得技術(shù)人員能診斷特征在于TRAP表達(dá)的疾病。這些方法包括檢測TRAP基因的表達(dá)和/或衍生自其中的TRA如由HLA分子呈遞的TRA。其它TRA也可衍生自本發(fā)明的TRAP并由不同HLA分子呈遞。在前者情況下，可以通過一些標(biāo)準(zhǔn)核酸檢測分析進(jìn)行檢測，包括聚合酶鏈反應(yīng)，或用標(biāo)記的雜交探針分析。在后者情況下特別優(yōu)選使用TRA與HLA復(fù)合物的結(jié)合配體如抗體進(jìn)行分析。
TRAP基因的分離使得能分離TRAP本身，尤其是含SEQ ID NO:1氨基酸序列的TRAP分子。這些分離的分子的肽片段當(dāng)作為TRA或TRA與HLA的復(fù)合物呈遞時，可與佐劑等物質(zhì)組合以生產(chǎn)對治療特征在于TRAP分子的表達(dá)的疾病有用的疫苗。另外可從在表面呈遞TRA/HLA復(fù)合物的細(xì)胞如非增殖性癌細(xì)胞，非增殖性轉(zhuǎn)染子等中制備疫苗。在將細(xì)胞用作疫苗的所有情況下，它們可以是用編碼誘導(dǎo)CTL應(yīng)答所需的一種或兩種組分的序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或是不用轉(zhuǎn)染而表達(dá)該兩種分子的細(xì)胞。進(jìn)一步地，TRAP分子，其相關(guān)TRA及TRA與HLA的復(fù)合物可用本領(lǐng)域熟知技術(shù)用于產(chǎn)生抗體。
本文中“疾病”意指任何腫瘤排斥抗原前體被表達(dá)的病理狀態(tài)。該疾病的一實例是癌癥，尤其是黑素瘤。
基于本文的治療方法的前提是患者免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，導(dǎo)致TRA呈遞細(xì)胞如呈遞相關(guān)HLA分子的細(xì)胞的溶解。一種如此方法是將特異于復(fù)合物的CTL給予具有異常細(xì)胞表型的患者。體外開發(fā)這種CTL在本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍內(nèi)。具體地，將如血細(xì)胞的細(xì)胞樣品與呈遞復(fù)合物并能誘發(fā)特異性CTL增殖的細(xì)胞接觸。靶細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)染子，如前述COS細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)染子在其表面呈遞所需的復(fù)合物，并且當(dāng)與相應(yīng)CTL結(jié)合時刺激其增殖。如那些本文所用的COS細(xì)胞及其它合適的宿主細(xì)胞是廣泛可得的。
稱作過繼轉(zhuǎn)移的治療方法(Greenberg,J.Immunol.136(5):1917(1986)；Reddel et al.,Seience 257:238(7-10-92)；Lyhch et al.,Eur.J.Immunol.21:1403-1410(1991)；Kast et al.,Cell 59:603-614(11-17-891)，是將呈遞所需復(fù)合物的細(xì)胞與CTL結(jié)合以導(dǎo)致特異性CTLs的增殖。然后將增殖的CTL給予其特征在于呈遞特定的復(fù)合物的某些異常細(xì)胞的細(xì)胞異常疾病患者。該CTL隨后溶解異常細(xì)胞，從而達(dá)到所需治療目的。
前述的治療假定至少一些患者的異常細(xì)胞呈遞HLA/TRA復(fù)合物。這非常容易被檢測，因為本領(lǐng)域非常熟知鑒別呈遞一特定的HLA分子的細(xì)胞的方法，及怎樣去鑒別表達(dá)含指定序列的DNA的細(xì)胞的方法。一旦分離出，如此細(xì)胞與患者異常細(xì)胞樣品一起用于檢測在體外溶解。如果觀測到溶解，則在如此治療中使用特異性CTL會緩解與異常細(xì)胞相關(guān)的病癥。一種更簡便的方法是使用標(biāo)準(zhǔn)分析檢測異常細(xì)胞的HLA表型并經(jīng)如PCR擴(kuò)增檢測表達(dá)。
過繼轉(zhuǎn)移不是根據(jù)本發(fā)明的唯一治療方式。也可在體內(nèi)使用多種方式激發(fā)CTL。一種方法是如前述使用表達(dá)復(fù)合物的非增殖性細(xì)胞。用于該方法的細(xì)胞可以是那些正常表達(dá)復(fù)合物的細(xì)胞，如照射過的黑素瘤細(xì)胞或用一種或兩種呈遞復(fù)合物所需基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。Chen等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:110-114(January,1991)中舉例說明了該方法，示出在治療方法中使用表達(dá)HPVE 7肽的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞?？墒褂迷S多細(xì)胞類型。相似地可使用攜帶一種或兩種相應(yīng)基因的載體。尤其優(yōu)選病毒或細(xì)菌載體。在這些系統(tǒng)中，相應(yīng)的基因由如痘苗病毒或BCG菌攜帶，且該類物質(zhì)“感染”宿主細(xì)胞。所得細(xì)胞呈遞相應(yīng)復(fù)合物并由隨后增殖的自身CTL識別。通過將腫瘤排斥抗原或其前體與一種促進(jìn)摻入呈遞相應(yīng)HLA分子的細(xì)胞中的佐劑合并可得到相似功效。TRAP被加工產(chǎn)生HLA分子的肽配體，而TRA不需進(jìn)一步加工而被呈遞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚本發(fā)明的其它方面，在這里不需重復(fù)。
本文使用的術(shù)語及表達(dá)法是用作敘述術(shù)語而非限制性的，且在使用這些術(shù)語及表達(dá)法時沒有排除使用任何同義詞語的目的，同樣也可在本發(fā)明范圍內(nèi)做各種修改。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人讓·赫爾曼，皮埃爾·庫利，蒂爾瑞·博恩-法勒爾，皮埃爾·范德布魯根，伊曼努爾·呂舍爾(ⅱ)發(fā)明名稱由HLA-B44分子呈遞的腫瘤排斥抗原及其應(yīng)用(ⅲ)序列數(shù)30(ⅳ)通訊地址(A)收信人Felfe & Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市紐約市(D)州紐約州(E)國家美國(F)郵編10022(ⅴ)計算機(jī)可讀形式(A)媒介類型3.5英寸軟盤，360kb存儲(B)計算機(jī)IBM(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件Wordperfect(ⅵ)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/602,506(B)申請日1996年2月20日(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/531,864(B)申請日1995年9月21日(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/373,636(B)申請日1995年1月17日(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/253,503
(B)申請日1994年6月3日(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Norman D.Hanson(B)注冊號30,946(C)卷號LUD 5436-PCT(ⅸ)電訊信息(A)電話(212)688-9200(B)電傳(212)838-3884
(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1896bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1GCGGCGGTGG CGGAGGCGGA CACATTGGCG TGAGACCTGG GAGTACGTTG TGCCAAATCA60TTGCCACTTG CCACATGAGT GTAAATGATG GCGGATGCAA GTATGTCCTC TGCCGATGGG 120AAAAGCGATT ATGGCCTGCG AAGGTGACAG CCATTATTCT GTAACTTCAG GACTTAGAAA 180TGACTTTCGG GTGACAAGTA AAATCTTGAT CAGGAGATAC CTAGGATTTG CTTCAGTGAA 240ATAATTGAGC CAGAACACGG TTGGCACTGA TTCTCGTTCC CCATTTAATG GGGTTTTGGT 300CTAGTGCTTC CAAGGTTACA CTTCCAGAAA TGTCTTTTTT TTTTCACACT AAAAAAAAAA 360AAAAGAATCA GCTGTAAAAA GGCATGTAAG GCTGTAACTC AAGGAAAGAT CTGGCAAGCA 420GCCCTGTGAT AGTAAATTAT GGTCGTGTTC AGGGAATGCT TTCCAGCAAT TCAGTAGACA 480GTGCTCAGCT GCAATGCAAA AGCCCAGGTC CTTGTCTTTG TCTGCCACTG GCCTCTCATG 540CCTCAGTTTC CCCATCTGTG AAACAATGGG GATTGGACCA AATATCTGAA ATCCCATGGT 600TATAGGCCTT CAGGATTACC TGCTGCATTT GTGCTAAAGT TTGGCACTGT TTCTCACTGT 660CAGCTGTTGT AATAACAAGG ATTTTCTTTT GTTTTAAATG TAGGTTTTGG CCCGAACCGC 720GACTTCAACA AAAAATAAGA GAAGAAAGGA ATATTTTCTA GCTGTGCAAA TCCTCTCCCT 780AGAGGAAAAG TTAATTGTTG TGTTGTTTTA ATACTGTTTT TTCCCGTGTA GATTTCTGAT 840ACTTCAATCC CCTACTCCCC CAAAACAGTT GAAGCCCAGC CCACTCTTAA TGGGCTTATT 900CACCATTTGT GTAATTCATT AATGCTCATA ATAACCTCAT GAGAAAGCAA CTAGTTTGAT 960TTTATGTCAG TTTGGAAGCT GAAGATCCAA ACGAGGCATT CTGTGAGATC TATGGAGAGA 1020TTGGTACAAA CACTGAATAC ATGTAAATTA TACTCAGGGT AGACCCTATT TGTGGTTAAA 1080ATAGGGATAT TTCCTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTGACTGT TTCTTAATCA GTGCCATGCC 1140AGGAAAATAG GGATGTTTCC TTCCCAGAGA TCTGTGTGTC TTTTTTCAGA AACGTCTGTG 1200ACAGGCCCAT CAATTTTGAA ATATTTGGTT TTTGAGCCTG TCACTCTAAA CCAGCGTTTA 1260ACGTTCAAAA GGCAAATAAC TGATGACCAG GCGGCACATT GTTCTGCTCC GTGAGTGTCT 1320GGCACTGGGA AAGGTGTAGA TTGTCTAGAA TGACAGCAAT TCCGACGCCC CAGTCAGTCC 1380TGCGTGATTG TGGCGAGGGC GCGTCTGGCA CCGGGAAGGT GTAGATCATC TAGAATGACG 1440GCGATTCCGA CGCCCCGGTC AGTCCTGCGT GATTGGCGAG GGTGCATCTG TCGTGAGAAT 1500TCCCAGTTCT GAAGAGAGCA AGGAGACTGA TCCCGCGTAG TCCAAGGCAT TGGCTCCCCT 1560GTTGCTCTTC CTTGTGGAGC TCCCCCTGCC CCACTCCCTC CTGCCTGCAT CTTCAGAGCT 1620GCCTCTGAAG CTCGCTTGGT CCCTAGCTCA CACTTTCCCT GCGGCTGGGA AGGTAATTGA 1680ATACTCGAGT TTAAAAGGAA AGCACATCCT TTTAAACCAA AACACACCTG CTGGGCTGTA 1740AACAGCTTTT AGTGACATTA CCATCTACTC TGAAAATCTA ACAAAGGAGT GATTTGTGCA 1800GTTGAAAGTA GGATTTGCTT CATAAAAGTC ACAATTTGAA TTCATTTTTG CTTTTAAATC 1860CAGCCAACCT TTTCTGTCTT AAAAGGAAAA AAAAAA 1896(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe5(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵HLA-B44結(jié)合肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵Khanna肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4
Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe5 10(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5GCCGGAGTAT TGGGACGA18(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6GGCCGCCTCC CACTTGC 17(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7GGAGTATTGG GACCGGAAG 19
(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8GGCCGCCTCC CACTTGT 18(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9CGCCACGAGT CCGAGGAT18(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10CCTTGCCGTC GTAGGCTA18(2)SEQ ID NO:11的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11CGCCACGAGT CCGAGGAA18(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12CCTTGCCGTC GTAGGCGT18(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13CCGAGTGAAC CTGCGGAAA 19(2)SEQ ID NO:14的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度19bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14GGTCGCAGCC ATACATCCA 19(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15TACAAGCGCC AGGCACAGG 19(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵PCR引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16CTCCAGGTAG GCTCTGTC18(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵Mage-3肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr5 10(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe5(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu5(2)SEQ IDNO:20的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵Mage-3肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20Gln Glu Glu Gly Pro Ser Thr Phe5(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵Mage-3肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe5 10(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵Mage-3肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe5
(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵HLA-B44基序(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23Xaa Glu Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr5 10(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵HLA-B44基序(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24Xaa Glu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr5 10(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵Mage-1/HLA-B44(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25Lys Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr5 10
(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵Mage-2/HLA-B44(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26Val Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr5 10(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵Mage-4/HLA-B44(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr5 10(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵Mage-5/HLA-B44(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28Met Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr5 10
(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵Mage-6/HLA-B44(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr5 10(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵Mage-12/HLA-B44(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30Val Glu Val Val Arg Ile Gly His Leu Tyr5 10
權(quán)利要求
1.與HLA-B44分子結(jié)合的分離的肽，其包括如下氨基酸序列Xaa Glu Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr(SEQ ID NO:23)，或氨基酸序列Xaa Glu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr(SEQ ID NO:24)，條件是所述肽不是SEQ ID NO:17。
2.如權(quán)利要求1的分離的肽，選自由SEQ ID No:25,SEQ ID No:26,SEQ ID No:27,SEQ ID No:28,SEQ ID No:29及SEQ ID No:30組成的一組。
3.在樣品中鑒別HLA-B44陽性細(xì)胞的方法，包括將所述樣品與權(quán)利要求1的肽接觸，并檢測所述肽的結(jié)合作為對在所述樣品中存在HLA-B44陽性細(xì)胞的指征。
4.分離的、特異于SEQ ID NO:17與HLA-B44分子的復(fù)合物的胞溶T細(xì)胞克隆。
5.權(quán)利要求4的分離的胞溶T細(xì)胞克隆，其中所述HLA-B44分子是HLA-B*4402分子。
6.權(quán)利要求4的分離的胞溶T細(xì)胞克隆，其中所述HLA-B44分子是HLA-B*4403分子。
全文摘要
本發(fā)明描述了由HLA－B44分子呈遞的腫瘤排斥抗原,這些肽可用于診斷和治療。所述的腫瘤排斥抗原衍生自MAGE腫瘤排斥抗原前體。
文檔編號A61K35/14GK1214692SQ97193299
公開日1999年4月21日 申請日期1997年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月20日
發(fā)明者讓·赫爾曼, 皮埃爾·庫利, 蒂爾瑞·博恩-法勒爾, 皮埃爾·范德布魯根, 伊曼努爾·呂舍爾 申請人:路德維格癌癥研究所