專利名稱：對治療rsv感染有效的rna酶l激活劑和反義寡核苷酸的制作方法
本申請要求受益于美國發(fā)明申請序列號60/011,725,1996年2月15日提交。1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及可用于治療人類呼吸道合胞病毒，一種負(fù)鏈RNA病毒，感染的化合物和其使用方法。特別是本發(fā)明涉及一個和RSV的反基因組鏈一部分互補(bǔ)的寡核苷酸和一個共價連接的RNA酶L的激活劑的復(fù)合物(此后，稱之為“反義激活劑復(fù)合物”)。更特別地，本發(fā)明涉及反義激活劑復(fù)合物，其中選擇的寡核苷酸結(jié)合于RSV反基因組鏈通常無自身雜交二級結(jié)構(gòu)的一部分。2．發(fā)明背景呼吸道合胞病毒(RSV)，一種非片段，負(fù)鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科肺病毒屬，是一種廣泛傳播的人類病原體，世界范圍內(nèi)每年引起超過一百萬人死亡(McIntosh和Chanock 1990)。其中主要的嚴(yán)重病例是發(fā)展中國家的兒童，美國估計每年有300,000住院病例(Zisson,1993)。據(jù)估計呼吸病毒感染引起的肺炎造成兒童死亡62％歸因于RSV(Heilman,1994)。唯一證實的RSV的治療是霧化病毒唑(1-b-D-呋喃核糖-1,2,3-三唑-3-碳酰胺)。病毒唑以吸入方式的氣霧劑給藥。病毒唑治療有幾個局限包括臨床應(yīng)用的低效率，病人周圍需要氣罩，堵塞通氣單元的可能，某些動物模型中觀察到的致畸作用(Froelich,1994)，明顯的副作用和高費用。
RSV在多種類型的小泡細(xì)胞中復(fù)制，包括巨噬細(xì)胞和上皮系細(xì)胞(Panuska等，1992,Midulla等，1993)。因此，病毒唑通過吸入氣霧劑對RSV感染個體用藥。Taber等，1983，兒科學(xué)72:613-18；Hall等，1983，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志308:1443-7；Englung等，1994，兒科學(xué)雜志125:635-41。
反義激活劑復(fù)合物(稱為“2-5A:AS”)前已述及(Torrence等1993,WO94/09129出自Torrence等)。盡管反義寡核苷酸已用作抗病毒藥物，例如抑制HIV復(fù)制，參見Zamecnik等，1986；Goodchild等，1988；Letsinger等，1989；Balotta等1993；抑制RSV感染，WO95/22553，出自Killkuskie等，還沒有成功應(yīng)用反義激活劑復(fù)合物作為抗病毒治療的例子的報道。
反義激活劑復(fù)合物的作用機(jī)制與其它反義寡核苷酸的作用機(jī)制不同。反義激活劑復(fù)合物的激活劑部分激活RNA酶L且反義區(qū)作為靶RNA的特異的，高親和力結(jié)合位點。結(jié)果是靶RNA被RNA酶L選擇性剪切。
生理上，RNA酶L作為干擾素系統(tǒng)的一部分在高等脊椎動物的細(xì)胞中在限制病毒復(fù)制中起作用(Silverman綜述，1994)。對細(xì)胞的干擾素治療激活編碼2-5A合成酶的基因，該酶是雙鏈RNA(dsRNA)依賴的從ATP合成5’-三磷酸化的，2’,5’-連接的寡聚腺苷酸(2’,5’A)的酶。病毒dsRNAs是這些酶的潛在激活劑(Gribaudo等，1991)。2’,5’A結(jié)合并激活RNA酶L導(dǎo)致細(xì)胞和病毒RNA的普遍剪切；這樣限制一些小核RNA病毒的復(fù)制(Chebath等，1987；Rysiecki等，1989；和Hassel等，1994)。
RNA酶L非特異剪切病毒RNA。例如，在干擾素治療腦心肌炎病毒感染細(xì)胞中，RNA酶L引起核蛋白體RNA降解(Wreschner等，1981)。通過反義激活劑的作用，RNA酶L由非特異核酸酶轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨忍禺惖倪x擇性剪切mRNA靶的核酸內(nèi)切酶。這已在來自Daudi細(xì)胞，一種人類淋巴瘤細(xì)胞株，的無細(xì)胞體系中證實，其中一個修飾的HIV-1 vifmRNA被定為反義激活劑復(fù)合物剪切的靶(Torrence等，1993)。接著，純化的RNA酶L由反義激活劑復(fù)合物指導(dǎo)在非靶mRNA存在時選擇性剪切一編碼蛋白激酶PKR的mRNA靶(Maran等1994)。進(jìn)一步，在HaLa細(xì)胞中，應(yīng)用針對PKR mRNA的一段序列的反義激活劑復(fù)合物導(dǎo)致PKRmRNA和酶活性的切除(Maram等，1994)，這樣dsRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子NF-kB激活被解除。最近，發(fā)現(xiàn)反義激活劑復(fù)合物激活RNA酶L導(dǎo)致PKR mRNA的催化降解(kcst大約7秒-1)(Maitra等，1995)。3．發(fā)明概述本發(fā)明提供了可用于治療RSV感染的復(fù)合物。復(fù)合物的基本元件是具有與一RSV株的反基因組RNA鏈(即，基因組合成的模板鏈)的大約10到大約30個核苷酸互補(bǔ)的序列的反義寡核苷酸，和RNA酶L的激活劑(此后稱之為“反義激活劑復(fù)合物”)。反義激活劑復(fù)合物的元件優(yōu)選由連接臂(linker)共價連接。
在一可選方案中，本發(fā)明包括一非共價連接的復(fù)合物，其包括一個或兩個激活的RNA酶L分子和至少一條和RSV反基因組RNA鏈的大約10到30個核苷酸互補(bǔ)的反義寡核苷酸(此后，稱之為“反義酶復(fù)合物”)。在進(jìn)一步可選方案中本發(fā)明包括含有至少10-30核苷酸的序列并優(yōu)選15-25核苷酸，更優(yōu)選18或19個核苷酸的反義寡核苷酸。
本發(fā)明的反義激活劑復(fù)合物穿過細(xì)胞膜不用載體或滲透劑。一旦內(nèi)化反義激活劑復(fù)合物導(dǎo)致反義酶復(fù)合物的形成，它引起反義定靶RNA的破壞。為治療RSV感染，反義復(fù)合物可通過氣霧吸入給藥，與病毒唑(ribavirin)給藥方法相同。病毒唑和本發(fā)明的反義復(fù)合物因此可以普通藥學(xué)組成給藥。4．附圖簡述

圖1:1-1:10。RS病毒株A2的序列，以5’-3’方向計數(shù)位置。
圖2A-2H:3.RSV反基因組RNA部分的二級結(jié)構(gòu)MFOLD計算波狀圖輸出，以5’-3’順序計數(shù)位置。圖2A.RSV反基因組RNA的7900-8800殘基的波狀圖。圖2B:1-2B:3.RSV反基因組RNA的1-1124殘基的三個可選波狀圖。圖2C:1-2C:3.RSV的1100-2400殘基的三個可選波狀圖。圖2D:1-2D:3.RSV反基因組RNA的2200-3300殘基的三個可選波狀圖。圖2E:1-2E:2.RSV反基因組RNA的3100-4300殘基的二個可選波狀圖。圖2F:1-2F:3.RSV的4200-5599殘基的三個可選波狀圖。圖2G:1-2G:3.RSV反基因組RNA的5600-6999殘基的三個可選波狀圖。圖2H:1-2H:3.RSV反基因組RNA的6600-7999殘基的三個可選波狀圖。
圖3.spA4-抗RSV3’-3T/(8281/8299)和spA2-抗RSV3’-3T/(8281/8299)的抗-RSV活性比較。5．發(fā)明詳述本發(fā)明的一實施方案包括RNA酶L激活劑和寡核苷酸的共價連接復(fù)合物，寡核苷酸能結(jié)合到RSV的反基因組模板RNA鏈和/或結(jié)合到一種RSV蛋白的mRNA(一種“RSV反義寡核苷酸”)。本發(fā)明的一可選方案包括非共價連接的激活的RNA酶L和RSV反義寡核苷酸的復(fù)合物。
在優(yōu)選方案中反義寡核苷酸和通常是單鏈的RSV反基因組的一部分互補(bǔ)。激活劑通過連接臂和反義寡核苷酸的5’或3’末端連接。在一實施方案中，一個阻斷劑連接到反義寡核苷酸的3’末端且連接臂接到反義寡核苷酸的5’末端。在一可選方案中連接臂連接到反義寡核苷酸的3’末端，既作為連接臂又作為阻斷劑。反義寡核苷酸長度在大約15到大約20核苷酸之間且優(yōu)選18或19核苷酸長。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能理解富含GC的寡核苷酸可比含GC少的寡核苷酸短。
根據(jù)本發(fā)明，與反義寡核苷酸互補(bǔ)的一RSV株的反基因組部分可由此RSV株的序列和二級結(jié)構(gòu)計算法如MFOLD確定。合適的RSV反基因組部分一般是單鏈構(gòu)象，例如，形成莖的環(huán)和RNA二級結(jié)構(gòu)環(huán)。
由于RSV是一種負(fù)鏈病毒，反義寡核苷酸不僅和反基因組RNA互補(bǔ)，還和指導(dǎo)病毒蛋白翻譯的mRNA互補(bǔ)。
反義寡核苷酸核苷酸間的磷酸二酯鍵可以是適合與互補(bǔ)RNA形成Watson-Crick堿基對的任何鍵。這些非限制性例子包括磷酸二酯，硫代磷酸二酯，甲基磷酸二酯和甲基硫代磷酸二酯，它們可增加給藥后的抗降解能力。反義寡核苷酸的核苷酸可以是2’-脫氧核苷酸或2’O-甲基核苷酸。
5.1反義寡核苷酸序列的確定RSV株A的序列在圖1:1-1:10中，以5’-3’方向給出。本發(fā)明可由按病毒株A2指導(dǎo)的寡核苷酸例證，但本發(fā)明可以其它任何有已知的基因組序列RSV株實施。RSV反基因組RNA序列可由常規(guī)技術(shù)獲得。RSV是具有多個基因的負(fù)鏈RNA病毒，即病毒顆粒含有編碼鏈的補(bǔ)充。進(jìn)入宿主細(xì)胞后基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生各種編碼病毒蛋白的mRNA并產(chǎn)生一完整的互補(bǔ)RNA,RSV反基因組，后代病毒的基因組鏈從中轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明選擇反義寡核苷酸的序列以便反義激活劑復(fù)合物的結(jié)合并由此引起RSV反基因組的催化破壞或mRNA的改變。這里所用的詞“反基因組鏈”，“RSV反基因組”和“RSV mRNA”是同義詞。
這樣，在本發(fā)明的一實施方案中選擇本發(fā)明的反義寡核苷酸的序列以便反義寡核苷酸和RSV反基因組的一部分互補(bǔ)并與之結(jié)合，即反義激活劑復(fù)合物使激活的RNA酶L定靶于與反義寡核苷酸互補(bǔ)的RSV反基因組部分。單鏈RNA分子含有通過自身雜交多聚物“反折”的區(qū)域。這些自身雜交雙鏈RNA區(qū)(“莖”)與單鏈“環(huán)”和“泡”可分開。這樣，并非RSV反基因組的所有部分都易于以同樣親和力結(jié)合反義寡核苷酸，并非RSV反基因組的所有部分適于做反義激活劑復(fù)合物的靶點。
鑒于本發(fā)明的目的，RNA分子的哪一部分是莖，哪一部分是環(huán)或泡可以通過位于公用區(qū)的計算機(jī)模擬程序如“FoldRNA”或“MFOLD”確定(例如，通過生物計算室，生物系，印地安那大學(xué)，Boomington，印地安那州)。這些程序系統(tǒng)分析了所有可能的構(gòu)象并確定了熱力學(xué)最優(yōu)化的構(gòu)象，即具有最低的“自由能”。常規(guī)地，具有與優(yōu)化構(gòu)象5％或10％以內(nèi)自由能差別的構(gòu)象也被確定。多數(shù)情況這些近似優(yōu)化構(gòu)象是互相緊密聯(lián)系的。例如某個小泡的位置可以有一兩個核苷酸的區(qū)別。如這里所用，當(dāng)單鏈構(gòu)象具有最低自由能或相當(dāng)于最低自由能的自由能時一條RNA鏈被稱為“正常單鏈”。
這些程序所實施的計算法在Zuker等，1989，科學(xué)244:48中描述。按照Zuker的計算法，計算一個聚核苷酸的最低自由能態(tài)所需的步數(shù)和聚核苷酸的長度的立方成比例。目前，2KB的聚核苷酸構(gòu)象可以常規(guī)計算而計算整個RSV反基因組全長(約15KB)的聚核苷酸是負(fù)擔(dān)沉重的。
然而，由于聚核苷酸分子間的雜交的動態(tài)，盡管模擬程序提示可能提供更低的自由能態(tài)，相隔很遠(yuǎn)的聚核苷酸的部分之間事實上也不可能形成雜交構(gòu)象。這樣計算整個RSV反基因組的熱力學(xué)最穩(wěn)定構(gòu)象是不能滿足實際目的的。而為了本發(fā)明的目的，RSV反基因組的構(gòu)象可以用約1-2KB長的片段來計算。如果預(yù)測的一RSV反基因組的特定部分的構(gòu)象依賴被模擬的核苷酸片段的長度或邊界，那么更短片段的模擬程序，長度大于1KB，和該部分定位于最接近片段中間的片段可認(rèn)為是“正?！卑l(fā)生的構(gòu)象。
在選擇反義基因組的哪一部分作為適合靶點時有以下幾個主要考慮。
1．由于RNA酶L只對單鏈序列而不對雙鏈序列有活性，在所選RNA靶序列附近有明顯的非堿基對或最少堿基對核苷酸延伸是重要的。
2．由于RNA酶L優(yōu)選在UNp序列后切割，優(yōu)選有可能發(fā)生切割的單鏈區(qū)應(yīng)該含有尿苷。這是優(yōu)選而非必需的，因為已有顯示反義激活劑復(fù)合物可以直接切割其它核苷酸。Maran等，1994。
3．由于切割發(fā)生在RNA靶序列的5’一側(cè)，優(yōu)選含尿苷的單鏈區(qū)在靶序列的5’一側(cè)。
4．由于反義激活劑復(fù)合物的反義區(qū)必須和RNA靶序列形成雙螺旋復(fù)合物，優(yōu)選靶序列定位于靶RNA的單鏈或主要是單鏈區(qū)。這是根據(jù)這樣的復(fù)合物形成是一平衡過程的考慮，且根據(jù)特定靶序列內(nèi)二級結(jié)構(gòu)的程度和穩(wěn)定性，該過程的締合常數(shù)的數(shù)值有所降低。
5．由于上述(4)所述原因，用Zuker的MFOLD計算法得出一組近似合理的RNA二級結(jié)構(gòu)。能量上有微小差別的一系列結(jié)構(gòu)可利用此程序產(chǎn)生。典型地，折疊程序產(chǎn)生的二級結(jié)構(gòu)有0.1千卡/摩爾增加的區(qū)別，即在能量方面是極為相似的。
6．上述(1-5)的考慮導(dǎo)致對靶DNA中最優(yōu)化靶序列的搜尋。理想的靶點中作為反義結(jié)合位點的整個序列和RNA上游至少16且優(yōu)選至少21核苷酸區(qū)是完全單鏈的。因此在理想情況下優(yōu)選靶位點長度應(yīng)為反義區(qū)長度(如，18)加16等于34核苷酸。這樣，搜索至少34核苷酸長且更優(yōu)選至少45核苷酸長單鏈區(qū)以尋找潛在的靶RNA區(qū)。
7．設(shè)計反義激活劑復(fù)合物時一附加優(yōu)化涉及反義寡核苷酸的組成。由于反義激活劑復(fù)合物催化性運作，必須有將復(fù)合物從其靶RNA互補(bǔ)序列上解離的必不可少的機(jī)制。這樣，可以預(yù)期有大比例GC堿基對的雙鏈進(jìn)行解離比有大比例dA-rU或dT-rA配對的雙鏈更困難。這個考慮也是一優(yōu)選的設(shè)計考慮。
圖2A顯示mRNA或反基因組鏈的7900-8800殘基的模擬結(jié)果。圖2A也含有下面例子中測試過的反義寡核苷酸定位指示。圖2B:1-2H:3分別顯示RSV反基因組鏈的1-7999,1100-2400,2200-3300殘基片段的可選模擬結(jié)果。顯示每個區(qū)域具幾乎相等能量的2或3個不同模型。這些圖表明，例如優(yōu)選方案中本發(fā)明的靶殘基2490-2534，在所有三種模型中都是單鏈，殘基617-663,3212-3247和5240-5288在至少兩種模型顯示中是單鏈，殘基718-772在三種模型的一種中是單鏈。應(yīng)該記得所產(chǎn)生的整個模型家族僅有1.1千卡/摩爾的區(qū)別，且因此每個模型代表的構(gòu)象可在RSV反基因組證實。
5.2激活劑的結(jié)構(gòu)激活劑結(jié)構(gòu)的例子在專利WO94/09129中描述，在10,45和46-51頁，在此引為文獻(xiàn)參考。簡要地說，激活劑含有至少三個腺苷酸殘基，通過2’-5’磷酸二酯鍵連接，有一游離的5’一，二或三磷酸酯或硫代磷酸酯。5’硫代磷酸酯-四-腺苷酸激活劑(sp5’A2’(p5’A2’)3-O-)是優(yōu)選激活劑。其它激活劑包括p5’A2’(p5’A2’)2-O-,sp5’A2’(p5’A2’)2-O-,和p5’A2’(p5’A2’)3-O-。
腺嘌呤核苷酸間硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯連接可以和磷酸二酯鍵一樣應(yīng)用。應(yīng)用這些連接導(dǎo)致降解減慢但活性也降低。Beigelmann,L等，1995，核酸研究23:3989-94。應(yīng)用5’-硫代磷酸酯導(dǎo)致活性和穩(wěn)定性的巨大改善。本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員了解其它核苷酸可以連到2’-5’三或四腺苷酸的3’羥基或2’羥基而不改變其作為RNA酶L激活劑的活性。這樣，這些方案也被包括在所謂“RNA酶L的激活劑”的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步認(rèn)識到也可以使用在第二核苷酸(由5’-3’計數(shù))含有除腺嘌呤以外的堿基如次黃嘌呤核苷的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可進(jìn)一步認(rèn)識到RNA酶L的非核苷酸激活劑可用于本發(fā)明且等效于核苷酸激活劑。如此處所用術(shù)語“2-5A”指RNA酶L的任何核苷酸激活劑且術(shù)語“RNA酶L的激活劑”指任何RNA酶L的激活劑包括2-5A。術(shù)語2’,5’A特指2’,5’連接的寡聚腺苷酸。
5.3反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)反義寡核苷酸可以有任何反義領(lǐng)域現(xiàn)有的或?qū)⒈话l(fā)展的結(jié)構(gòu)。這些包括磷酸二酯，硫代磷酸二酯，甲基磷酸二酯和甲基硫代磷酸二酯，使給藥后降解阻力增加。反義寡核苷酸的核苷酸可以是2’-脫氧核苷酸或2’O-甲基核苷酸。
修飾和未修飾寡核苷酸的制備在本領(lǐng)域是熟知的(Agrawal等綜述(1992)生物技術(shù)進(jìn)展10:152-158；Agrawal寡核苷酸及其類似物的方法，合成及特點(Agrawal編)，Humana出版，Totowa，新澤西(1993),20章)。例如，核苷酸可以用本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)例如氨基磷酸酯法，H-磷酸酯化學(xué)法，或甲基氨基磷酸酯化學(xué)法共價連接(參見，例如，Uhlmann等(1990)化學(xué)綜述90:543-584；Agrawal等(1987)四面體快報28:(31):3539-3542；Caruthers等(1987)酶學(xué)方法154:287-313；美國專利5,149,798)。寡聚硫代磷酸酯類似物可以用本領(lǐng)域熟知的方法制備如甲氧基亞磷酰胺法(參見，例如，agrawal等(1988)美國國家科學(xué)院院刊85:7079-7083)或H-磷酸酯化學(xué)法(參見，例如，F(xiàn)roethler(1986)四面體快報27:5575-5578)。Bergot等(色譜雜志(1992)559:35-42)描述的合成方法可以應(yīng)用。
5.4連接臂的結(jié)構(gòu)任何共價連接RNA酶L激活劑和反義寡核苷酸且不阻止激活劑激活RNA酶L的連接臂都可使用。在優(yōu)選實施方案中連接臂連接到2-5A激活劑的3’或2’末端。在進(jìn)一步優(yōu)化方案中連接臂包括一個連接2-6A激活劑的3’或2’末端和反義寡核苷酸5’或3’末端的雙-1,4-丁二醇-磷酸二酯。選擇連接到反義寡核苷酸的末端以便合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道連接到一個內(nèi)部的2’羥基或?qū)A基成對不重要的核苷酸堿基的一部分是本發(fā)明的一可選方案。
5.5反義激活劑復(fù)合物的應(yīng)用本發(fā)明的反義激活劑復(fù)合物可通過任何有效將反義激活劑復(fù)合物給藥至患者的支氣管，細(xì)支氣管和肺泡上皮的路線給藥至有RSV感染的個體。在一實施方案中反義激活劑復(fù)合物通過吸入氣霧劑給藥，按照本領(lǐng)域熟知的病毒唑給藥技術(shù)。在本發(fā)明進(jìn)一步的方案中病毒唑和本發(fā)明反義激活劑復(fù)合物的混合物可以用一般藥用載體給藥。
在一可選實施方案中反義激活劑復(fù)合物可通過胃腸道外給藥，例如，通過靜脈內(nèi)輸注。當(dāng)靜脈給藥時，反義激活劑復(fù)合物的劑量可用藥學(xué)工作者熟知的常規(guī)方法測定，以便血清濃度接近下文描述的體外實施例中所見的抗病毒活性的濃度，例如大約10μM的spA4-抗RSV3’-3’T/(8281-8299)的濃度。氣霧劑給藥時應(yīng)選擇劑量以便肺部組織濃度接近體外實施例中所見的抗病毒活性濃度。
實施例6．材料和方法序列慣例。
RSV文獻(xiàn)實施中，RSV基因組(病毒RNA)的1位是3’末端，RSV反基因組(mRNA)的1位是5’末端。這樣，例如，標(biāo)記為反RSV/(8490-8509)的反義寡核苷酸具有RSV基因組的8509-8490殘基的序列(5’-3’)，和RSV反基因組的8490-8509殘基互補(bǔ)。但是注意，圖1:1-1:10的RSV株A2基因組序列習(xí)慣為5’到3’順序。此后其中激活劑是2’,5’A的反義激活劑復(fù)合物稱為“2-5A反義嵌合體”。
2-5A反義嵌合體的合成和純化。
合成的寡核苷酸結(jié)構(gòu)型。
下列同屬的寡核苷酸類型是為本研究制備的。
Ⅰ． (p5′A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)n5′dNⅡ．A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)n5′dNⅢ．dN3′p(5′dN3′p)n5′dNⅣ．p5′A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)m5′dN3′p-3′pdN5′Ⅴ．sp5′A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)m5′dN3′p-3′pdN5′Ⅵ．A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)m5′dN3′p-3′pdN5′Ⅶ．sp5′A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-5′dN3′p(5′dN3′p)n5′dNⅧ．p5′A2′p(5′A2′p)3-[O(CH2)4Op]2-3′dN5′(p3′dN5′)np3′dN用于合成以上Ⅰ-Ⅷ類2-5A-反義嵌合體寡核苷酸的以下方法已闡明。一般依照Lesiak等，1993所發(fā)展的合成策略。
所用試劑和化學(xué)品。
1．合成起始于固體載體dA-3’-lcaa-CPG(500)5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基-2’-脫氧腺苷-3’-lcaa-CPGdC-3’lcaa-CPG(500)5’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲?；?2’-脫氧胞苷-3’-lcaa-CPGdG-3’lcaa-CPG(500)
5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-異丁酰基-2’-脫氧鳥苷-3’-lcaa-CPGdT-3’-lcaa-CPG(500)5’-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-3’-lcaa-CPG這些固體載體都用于合成具有正常的3’→5’磷酸二酯鍵的寡核苷酸。它們均為1μmole大小。這些DMT保護(hù)的核苷酸通過一個琥珀?；潭ㄓ诳乜撞Ａе?CPG)，而長鏈烷基胺(lcaa)連接臂是AppliedBiosystems(Foster City，加拿大)商業(yè)產(chǎn)品。這些載體用于合成同系寡核苷酸類型Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ，和Ⅶ。
dA-5’-lcaa-CPG(500)3’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基-2’-脫氧腺苷-5’-lcaa-CPGdC-5’lcaa-CPG(500)3’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲?；?2’-脫氧胞苷-5’-lcaa-CPGdG-5’lcaa-CPG(500)3’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-異丁酰基-2’-脫氧鳥苷-5’-lcaa-CPGdT-5’-lcaa-CPG(500)3’-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-5’-lcaa-CPG這些固體載體從Glen Research(Sterling,VA)獲得并用于合成具有反向極性5’→3’磷酸二酯鍵的寡核苷酸。它們均為1μmole大小。這些載體用于合成同系寡核苷酸類型Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ和Ⅷ。
2．DNA反義鏈的延長。
為了合成正常3’→5’磷酸二酯鍵寡核苷酸，總量500mg的下列每一種亞磷酰胺(phosphoramidite)(Applied Biosystems)溶于所示量的無水乙腈以形成0.1M亞磷酰胺溶液5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基-2’-脫氧腺苷-3’-(2-氰乙基-N,N-二異丙基)亞磷酰胺(5.6ml)5’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲?；?2’-脫氧胞苷-3’-(2-氰乙基-N,N-二異丙基)亞磷酰胺(5.9ml)
5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-異丁酰基-2’-脫氧鳥苷-3’-(2-氰乙基-N,N-二異丙基)亞磷酰胺(5.8ml)5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-脫氧胸苷-3’-(2-氰乙基-N,N-二異丙基)亞磷酰胺(6.6ml)前述用于制備同系寡核苷酸類型Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ和Ⅶ。
為合成具有反向極性的所有DNA磷酸二酯鍵，以下亞磷酰胺從Glen Research(Sterling,VA)獲得。
3’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲?；?2’-脫氧腺苷-5’-(2-氰乙基-N,N-二異丙基)亞磷酰胺(5.6ml)3’-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲?；?2’-脫氧胞苷-5’-(2-氰乙基-N,N-二異丙基)亞磷酰胺(5.9ml)3’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-異丁?；?2’-脫氧鳥苷-5’-(2-氰乙基-N,N-二異丙基)亞磷酰胺(5.8ml)3 ’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-脫氧胸苷-5’-(2-氰乙基-N,N-二異丙基)亞磷酰胺(6.6ml)以上中間體用于合成同系寡核苷酸類型Ⅷ。
3．連接嵌合區(qū)的連接臂。
連接臂，(2-氰乙基-N,N-二異丙基)-[4-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)丁基]亞磷酰胺，通過上述方法的改進(jìn)法進(jìn)行合成(Lesiak等，1993)，將100mg連接臂溶于1.7mL無水乙腈制成0.1M溶液。
4．嵌合體的2’,5’-寡聚腺苷酸區(qū)的合成。
5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲酰基-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基腺苷-2’-N,N-二異丙基氰乙基亞磷酰胺(ChemGenesCorp.,Waltham,MA,cat no.ANP 5681)。將500mg單體溶于5.0mL無水乙腈制成0.1M溶液。
5．嵌合體的2’,5’-寡聚腺苷酸區(qū)的5’末端所用磷酸化試劑。
用濃度為0.2M的2-[2-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)乙基磺?；鵠乙基-(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)-亞磷酰胺(GlenResearch,Sterling,VA.cat no.10-1900-90)的無水四唑/乙腈(ADI)溶液進(jìn)行半自動合成。
6．其它試劑。
所有其它DNA合成試劑從Applied Biosystems Inc。獲得，包括稀釋劑(乙腈)，活化劑溶液(四唑/乙腈)，加帽溶液(A乙酸酐溶液及B:N-甲基咪唑溶液)，脫保護(hù)試劑(三氯乙酸溶液)，氧化劑(碘溶液)，和二硫化四乙基硫羰硫化試劑。
用氟化四丁基銨的四氫呋喃溶液(Aldrich,Milwaukee,WI)脫去(2’,5’)-寡核糖腺苷區(qū)保護(hù)3’羥基的叔丁基二甲基甲硅烷基。
7．合成步驟2’,5’-寡聚腺苷酸/反義嵌合體用修改的自動或半自動法合成。
所有化學(xué)品用前在真空中用P2O5干燥過夜。使用1μmole脫氧核苷酸-lcaa-CPG柱。
核心(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反義嵌合體是指完全2’,5’A-反義嵌合體減去5’-末端單磷酸基團(tuán)且有為合成目的定義為三區(qū)一個反義區(qū)，一個連接臂區(qū)，和(2’,5’)-寡聚腺苷酸區(qū)。應(yīng)用表1所列的自動方法合成2’,5’A-反義嵌合體。
應(yīng)用1μmole規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)合成循環(huán)。對每一不同的區(qū)改變偶合時間(單體偶合)來修改循環(huán)。通過二變方法將單體/乙腈溶液裝入DNA合成儀以避免污染。每一區(qū)合成后，柱子用氬完全干燥至少3分鐘。且為預(yù)期寡核苷酸的下一區(qū)的合成編輯合成循環(huán)，三苯甲基模式，和序列。
為制備沒有5’-單磷酸基團(tuán)的核心2’,5’A-反義嵌合體，表1的最后步驟被省略。為半自動制備5’單磷酸末端嵌合體，核心寡核苷酸在具有三苯甲基情況下合成，柱子干燥后移出DNA合成儀。5’末端磷酸化依據(jù)表2列出的方法手動合成。
切割和脫保護(hù)1．通過室溫2小時濃氫氧化銨/乙醇(3∶1 v/v)處理將寡核苷酸從CPG載體上切下來。
2．將粗品寡核苷酸的氫氧化銨/乙醇溶液轉(zhuǎn)移到一個3ml管形瓶中并封緊。溶液在55℃孵育8小時以除去堿基上的保護(hù)基。
3．所得寡核苷酸的氫氧化銨/乙醇溶液轉(zhuǎn)移到一玻璃管中，冰浴中完全冷卻。溶液在一快速濃縮器上蒸干并加入氟化四丁基銨(2ml,1.0M)的THF溶液，整個混合物振蕩至少1分鐘。此反應(yīng)混合物在室溫下放置至少10小時。
加入等體積的0.1MTEAA(四乙基銨乙酸鹽)(pH7.0)緩沖液，混均并蒸至半體積以去除THF。殘余物用HPLC純化。
寡核苷酸的純化1．聚苯乙烯反相離子對色譜法(PRP-IPC)(Swiderski等，1994方法的改進(jìn))。
將寡核苷酸溶于大約4-5ml水得到透明溶液(有必要可離心)，透明溶液直接注入PRP-1 HPLC柱(300×7mm)。反應(yīng)混合物由此同時脫鹽并純化。
溶劑A:10mM磷酸四丁基銨(TBAP),pH7.5，水中。
溶劑B:10mM TBAP pH7.5 乙腈/水(8∶2 v/v)。
樣品在60分鐘內(nèi)用A中5-90％峰梯度的溶劑B洗脫，流速1.5mL/分鐘。
合并含有目的寡聚體的餾分并蒸發(fā)至大約1-2mL。寡聚物-TBA離子對通過以下步驟轉(zhuǎn)化為其鈉鹽形式1mL Dowex 50W離子交換濕樹脂(Na+形式)加入到寡核苷酸/水溶液中。溶液在冷室中攪拌至少30分鐘。通過使溶液經(jīng)過Poly-Prep色譜柱(Bio-Rad,Cat#731-1550)將樹脂除去。再用水洗樹脂直到樹脂上沒有寡核苷酸。
或者，Dowex處理前，寡核苷酸依照下面方法通過C-18 Sep-Pak柱。
a．C-18柱用10mL甲醇和10mL水預(yù)洗。
b．寡聚物溶液加入柱子。
c．柱子用20mL水洗以除去柱中的鹽。
d．寡核苷酸用10mL 50％甲醇水溶液洗脫。
e．脫鹽的寡核苷酸用紫外分光光度計檢測，合并含有寡聚物的餾分并濃縮。
透析(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反義嵌合體用HPLC和離子交換純化后，透析寡核苷酸(鈉鹽)以除去小分子和剩余的鹽。透析在4℃進(jìn)行。寡核苷酸先用0.02M NaCl透析4-6小時，再用水透析48小時。若寡核苷酸HPLC純化后用C-18sep-pak柱脫鹽，透析時間可縮短至6-10小時。
寡聚腺苷酸/反義嵌合體的后處理透析后的寡核苷酸通過0.22μmillex-GV濾器(Millipore,Cat.No.SLGV025LS)除菌。所得溶液用UV/Vis分光光度計用0.D.A260定量。
(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反義嵌合體的核苷酸組成分析1．核苷酸組成分析嵌合寡核苷酸的核苷酸組成通過用蛇毒磷酸二酯酶(響尾蛇durissus)(Pharmacia,cat# 27,0821-01)酶消化分析。
純化的寡核苷酸(0.2 A260 O.D.U.)與蛇毒磷酸二酯酶(0.15單位)在50mMTris/HCl,pH8.0,0.5mM MgCl2,pH8.0中孵育。100μL混合物于37℃孵育至少3小時。對于含有3’-3’dN的嵌合寡核苷酸如寡核苷酸結(jié)構(gòu)類型Ⅳ(部分6)，孵育時間延長至10小時。
消化后，溶液用Microcon-10(Amicon,Inc.產(chǎn)品號42406)處理。加入100μL樣品溶液前microcon首先用水漂洗。典型離心時間為45分鐘。透明溶液用于HPLC分析。
一份(5-10μL)水解產(chǎn)物通過反相HPLC用Bekman UltrasphereC-18 ODS柱(0.46×25cm)分析。在下面條件下完成消化產(chǎn)物的分離2％B等濃度20分鐘，線性梯度2-50％B15分鐘。維持等濃度10分鐘，其中溶劑A是100mM磷酸銨，pH5.5且溶劑B是甲醇/水(1∶1v/v)。流速0.5mL/分鐘。標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物dCMP,TMP,dGMP,AMP和dAMP(AldrichChem.Co.)用于比較水解產(chǎn)物的保留時間和洗脫順序。一般地，寡核苷酸酶水解產(chǎn)物所得的峰的保留時間是9.7分鐘(dCMP),27.3分鐘(TMP),29.6分鐘(dGMP),31.7分鐘(AMP),39.5分鐘(Alinker)和41.2分鐘(dAMP)。保留時間隨柱，流動相的pH值，柱的平衡時間而變化。積分峰面積提供了每種核苷酸的相對含量。260nm 100mM磷酸銨pH5.5中測定的消光系數(shù)7610(dCMP),8158(TMP),9969(dGMP),12342(AMP&Alinker),14361(dAMP)用于分析。
寡核苷酸純度確證(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反義嵌合體的純度通過HPLC或毛細(xì)管凝膠電泳(GCE)檢查。純度通過260nm檢測到的峰面積積分獲得。
1．毛細(xì)管凝膠電泳法(GCE)寡核苷酸純度測定在Applied Biosystems 270A-HT毛細(xì)管電泳儀上用MICRO-GEL100(Applied Biosystems Inc.)凝膠充滿毛細(xì)管(50μM i.d.，有效長度27cm，緩沖液，75mM Tris磷酸(pH7.6),10％甲醇)進(jìn)行。260nm檢測。用以下條件獲得典型的(2’,5’)寡聚腺苷酸/反義嵌合體電泳圖樣品濃度大約0.1O.D./mL，動電輸入為-5kv 2s。電壓為-14mA(19mA)，操作溫度為30℃。在此條件下，(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反義嵌合體有比其核心類似物早大約1分鐘的洗脫時間。
2．Dionex PA-100離子交換HPLC法寡核苷酸的純度也可用Dionex離子交換HPLC測定。通常，對(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反義嵌合體的分析，Dionex PA-100離子交換柱比其它HPLC色譜法能提供更高分辨率和更好峰形。
用以下條件獲得典型的(2’,5’)-寡聚腺苷酸/反義嵌合體色譜圖Dionex PA-100(4X250mm)柱(dionex,cat#43010)。溶劑A為25mMTris/HCl,0.5％乙腈(pH7.0)，溶劑B為25mM Tris/HCl,0.5％乙腈1M氯化銨(pH7.0)。樣品在30分鐘內(nèi)用10-70％B溶于A線性梯度洗脫。以1mL/分鐘的流速維持等濃度10分鐘在260nm檢測。
細(xì)胞培養(yǎng)，RSV病毒繁殖和感染，及病毒滴度測定。
人類氣管上皮細(xì)胞株，9HTE,(Gruenert等1988)和CV-1細(xì)胞(American Type Cuiture Collection,Rockville,MD,CCI#70)，一種對RSV感染高度敏感的綠猴腎細(xì)胞株，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)中培養(yǎng)，加入10％(v/v)胎牛血清(FBS),2mM L-谷氨酰胺，1XMEM氨基酸溶液，1XMEM非基本氨基酸溶液，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和0.25μg/ml兩性霉素B(“培養(yǎng)基”)(所有試劑來自GibcoBRL,Bethesda,MD)。RSV株A2(ATCC No.VR1302)在CV-1細(xì)胞中繁殖。CV-1單層細(xì)胞在0.2多重感染(M.O.I.)情況下感染并在MEM,2％FBS,1X青霉素/鏈霉素(PS),5％CO2,95％O237℃培養(yǎng)46小時。然后細(xì)胞在MEM中洗兩遍接著用MEM,2％FBS,1XPS,50mMHEPES(pH7.5),100mM Mg(SO4)覆蓋。37℃2小時后，刮下細(xì)胞并如前述聲處理(Panuska等，1995)。聲處理的等份細(xì)胞(每份1ml)在刮下20分鐘內(nèi)在乙醇/干冰中速凍。若干份細(xì)胞接著融化，通過前述CV-1細(xì)胞空斑法測定滴度(Cirino等，1993)。本方法產(chǎn)生的病毒的滴度范圍是每毫升2到7×106空斑形成單位(pfu)。
9HTE細(xì)胞RSV感染前后以寡核苷酸，干擾素α和病毒唑治療。
9HTE細(xì)胞的感染以前述進(jìn)行(Merolla等，1994)。簡明地說，37℃5％CO2,95％O2，成片的單層細(xì)胞暴露于稀釋在MEM,2％FBS中的RSV 2小時。暴露后，細(xì)胞用無血清MEM培養(yǎng)基洗兩遍再加入新鮮培養(yǎng)基(含10％FBS)。寡核苷酸可在感染前4小時(t-4)或感染后立即加入(t+2)也可在t+14和t+26加入。細(xì)胞于感染36小時后收獲如前述進(jìn)行空斑測定以測定病毒滴度(Cirino等，1993)。細(xì)胞洗兩遍以除去任何殘留的反義寡核苷酸然后刮入含2％FBS,1XPS的MEM.9HTE細(xì)胞冰浴中聲處理20秒后，提取物連續(xù)稀釋并轉(zhuǎn)移到成片的單層CV-1細(xì)胞進(jìn)行感染病毒顆粒定量。CV-1暴露于聲處理的9HTE2小時然后MEM洗一次并鋪于含2％FBS,200U/ml青霉素，200μg/ml鏈霉素，0.5μg/ml兩性霉素B，和0.4％瓊脂的Eagle’s極限必需培養(yǎng)基上(EMEM,BioWhittaker,Walkersville,MD)。五天后，細(xì)胞在10％福爾馬林中固定1小時，除去瓊脂填料，加入溶于10％福爾馬林的0.2％結(jié)晶紫2分鐘。CV-1接著用水洗以除去多余的染料，溶胞(空斑)數(shù)在顯微鏡下定量。
在特定試驗中(數(shù)據(jù)未顯示)，干擾素α(Schering,IntronA，干擾素α-2B,105U/ml)或病毒唑(ICN Pharmaceuticals,Costa Mesa,CA,100μg/ml)也在感染后加入。當(dāng)反義嵌合物加入時，即t+2,t+14和t+26，干擾素α加至最終濃度為50U/ml。作為對照，病毒唑，體內(nèi)半衰期為40天，僅在T+2加至終濃度10-13M。
逆轉(zhuǎn)錄酶偶聯(lián)的聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)從2×105感染后8小時(M.O.I.=10)的9HTE細(xì)胞中用RNAzol依照廠家(Tel-Test,Inc,Freinswood,TX)描述處理提取RNA.8小時后分離RNA以限制RSV復(fù)制于單個循環(huán)。分離的RNA(約1μg)與100pmoles合適的下表所列下游(-)引物或100pmoles隨機(jī)六聚體(用于甘油醛-3-磷酸脫氫酶，GAPDH，僅限mRNA)孵育。RNA和引物加熱至70℃保持10分鐘然后迅速在冰上冷卻5分鐘。最終30ml反應(yīng)體積包括300μM每種dNTP,200U SuperScipt逆轉(zhuǎn)錄酶(GibcoBRL,Bethesda,MD),50mM Tris-HCl(pH8.3),75mMKCl,3mMMgCl2，和10mMDTT.逆轉(zhuǎn)錄在37℃進(jìn)行1小時。
PCR反應(yīng)用50μl Hot-Start管(Molecular Bio-products,SanDiego,CA)進(jìn)行，25μl下層緩沖液含40mM Tris-HCl(pH=8.4),100mMKCl,2mM MgCl2,600μM每種dNTP，和100 pmoles每種合適的引物對；退火靶 序列 溫度RSV(L+)(Seq ID NO:1) [5′-TCAATGGTCCTTATCTCAA-3′]46℃RSV(L-)(Seq ID NO:2) [5′-GAGCTTTATTAGCAGCATC-3′]GAPDH(+)(Seq ID NO:3)[5′-AAATCCCATCACCATCTTC-3′]57℃GAPDH(-)(Seq ID NO:4)[5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′]RSV(M2+)(Seq ID NO:5)[5′-AAACAATCAGCATGTGTTG-3′]46℃RSV(M2-)(Seq ID NO:6)[5′-AATGTAACGATGTGGTGAG-3′]25μl Hot-Start上層緩沖液含5U TaqDNA聚合酶(GibcoBRL)和1/10th RT反應(yīng)的cDNA。PCR反應(yīng)以92℃ 1分鐘，上述退火溫度1.5分鐘，72℃ 5分鐘進(jìn)行30輪。等份RT/PCR混合物在1％瓊脂/TBE凝膠上分析。
實施例8結(jié)果在預(yù)先感染的人類支氣管上皮細(xì)胞中反義2-5A抑制RSV復(fù)制。
為發(fā)展2-5A反義嵌合物阻斷RSV復(fù)制的潛能，我們首先選擇病毒RNA聚合酶(RSV L)mRNA中的一個寡核苷酸結(jié)合位點，它編碼一個RSV復(fù)制必需的低豐度信息。第一個合成并評價的嵌合物是pA4-antiRSV/(8490-8509)。嵌合寡核苷酸的反義區(qū)的結(jié)合位點是相應(yīng)于RSV基因組8490-8509核苷酸的轉(zhuǎn)錄子，這跨越了L蛋白的翻譯起始密碼子，相應(yīng)于反基因組鏈(基因組復(fù)制的模板)的8490-8509核苷酸。由于作為有效治療，候選藥物必須能在診斷后抑制病毒的復(fù)制，2-5A反義嵌合物的抗-RSV結(jié)果已在人支氣管上皮細(xì)胞9HTE測定，在RSV感染4小時前(感染前/后處理)或感染2小時后(感染后處理)開始處理。在感染后處理中，t+2,t+14和t+25時(數(shù)字代表相對感染時間，t0的小時)加入pA4-antiRSV/(8490-8509)(10μM終濃度)。在感染前處理中，除t+2,t+14和t+26外t-4和t0時加入pA4-antiRSV/(8490-8509)(10μM終濃度)。從對照和寡核苷酸處理的9HTE細(xì)胞中收獲的病毒通過感染CV-1細(xì)胞隨后計數(shù)病毒空斑(參見材料和方法)來測定。發(fā)現(xiàn)用pA4-antiRSV/(8490-8509)感染后處理9HTE細(xì)胞與感染前/后處理同樣有效；都導(dǎo)致RSV復(fù)制的約70％抑制。在這些試驗的基礎(chǔ)上，所有后續(xù)試驗只進(jìn)行感染后處理。另外，這些試驗提示這些化合物與預(yù)防性測量相比作為活性感染的治療的潛在用處。
2-5A反義和對照寡核苷酸嵌合物直接針對病毒L聚合酶mRNA翻譯起始位點的抗病毒活性。
一初始系列寡核苷酸包括各種對照和針對細(xì)胞培養(yǎng)中的酶解衰減為穩(wěn)定嵌合體而設(shè)計的附加修飾(表3)。為比較這些寡核苷酸的抗病毒活性，9HTE細(xì)胞用RSV感染，接著用三種濃度的寡核苷酸(3.3,6.6和9.9μM)處理三次(t+2, t+14，和t+26小時)，病毒于36小時后收獲。A4-antiRSV3’-3’C/(8490-8509)中僅缺少5’磷酸的反義嵌合物缺乏激活RNA酶L的能力(Maran等，1994)，用作對照。此衍生物顯示最小抗RSV活性(9.9μM/處理28.3％抑制與5’-磷酸化的衍生物，pA4-antiRSV3’-3’C/(8490-8509)64.8％抑制相比)。為穩(wěn)定嵌合物的3’末端，給這些末端加帽。在一衍生物pA4-3’ANTIRSV5’/(8490-8509)中，嵌合物的2-5A部分連接到反義部分的3’末端而非寡核苷酸的5’末端。用此法，盡管連接至連接臂，反義的3’末端被保護(hù)免受外切酶消化(G.L.,W.E,&P.F.T.，未發(fā)表結(jié)果)。在測試的最高濃度(9.9μM)此類似物對病毒復(fù)制產(chǎn)生69％抑制(表3)。另一嵌合物中，pA4-antiRSV3’-3’C/(8490-8509),3’末端脫氧核苷酸通過3’-3’磷酸二酯鍵連接至倒第二脫氧核苷酸以減慢3’外切酶消化(G.L.,W.X.,&P.F.T.，未發(fā)表結(jié)果)。與標(biāo)準(zhǔn)未修飾嵌合物，pA4-antiRSV3’-3’C/(8490-8509)相同濃度下測試(38.8％抑制)相比，此化合物在6.6μM(64.3％抑制)產(chǎn)生1.6倍增強(qiáng)的抗病毒活性?；蛘?，用5’-硫代磷酸使嵌合物2-5A區(qū)對磷酸酶的穩(wěn)定。與標(biāo)準(zhǔn)，5’-磷酸化的2-5A和反義2-5A相比，這樣的2-5A和反義2-5A的硫代磷酸衍生物前面已顯示完全能激活RNA酶(Xiao等，1994和Maran等，1994)。spA4-antiRSV/(8490-8509)明確顯示抗RSV效果大大增強(qiáng)，在處理濃度分別是6.6μM,9.9μM時對病毒生長抑制71％和94％(表3)。
實施例9．靶點選擇高度有效的2-5A反義嵌合物的選擇基于RNA二級結(jié)構(gòu)的計算機(jī)分析。
對RSVmRNA的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行計算機(jī)輔助分析以分辨單鏈區(qū)作為寡核苷酸結(jié)合位點。計算機(jī)對RSV反基因組鏈核苷酸7900-9079，包括編碼病毒外殼蛋白的M2基因的3’部分，和L基因的5’區(qū)用MFOLD程序進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，此程序可根據(jù)發(fā)表的堆積和環(huán)去穩(wěn)定的能量值找到RNA分子具有最小自由能的二級結(jié)構(gòu)。MFOLD是Michael Zuker的程序(Zuker,1989)。Zuker的程序所用的能量首先由Salser(1977)描述，現(xiàn)在由Turner和同事定義(Freier等，1986)。分析顯示從位置8250到8299的一個大環(huán)。此環(huán)位于主要M2開放讀碼框架下游(3’)一未知功能90密碼子開放讀碼框架中。合成與環(huán)中序列互補(bǔ)的三個嵌合體化合物，spA4-antiRSV3’-3’A/(8251-8270)，spA4-antiRSV3’-3’T/(8261-8279)，和spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)。另外，分別合成與RNA其它區(qū)，包括一個膨出，一個發(fā)夾和一個小環(huán)對應(yīng)的三個寡核苷酸，spA4-antiRSV3’-3’A/(8530-8547),spA4-antiRSV3’-3’C(8562-8578),spA4-antiRSV3’-3’G/(8599-8618)。當(dāng)以3.3μM的濃度加入感染的9HTE細(xì)胞時，針對大環(huán)的三個寡核苷酸具有最大抗病毒活性(78-91％抑制)(表4)。這三個寡核苷酸比前述2-5A反義分子(3-16.5％抑制，3.3μM表3)具有大大提高的抗病毒活性。具有最大抗RSV效果的嵌合物是spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)，它在劑量為6.6和9.9μM時分別產(chǎn)生97和99％的RSV復(fù)制抑制。針對RNA含膨出區(qū)的寡核苷酸，spA4-antiRSV3’-3’A/(8530-8547)，在3.3μM顯示幾乎沒有抗病毒活性(表4)。針對發(fā)夾和小環(huán)的2-5A反義分子，spA4-antiRSV3’-3’C/(8561-8578)和spA4-antiRSV3’-3’G/(8599-8618)有中等活性，在3.3μM濃度有57和43％的RSV復(fù)制抑制。
圖3表示spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)和spA2-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)的比較。只有四腺苷酸是RNA酶L的激活劑，由此spA4連接的寡核苷酸比spA2連接的寡核苷酸強(qiáng)的效能確定了本發(fā)明中RNA酶L活性在保護(hù)效果中的作用。
實施例10．結(jié)果的生化分析抗病毒活性和2-5A反義嵌合物處理后的RSV-感染的9HTE細(xì)胞的RNA水平的相關(guān)性。
為確定RSV RNA水平和抗病毒活性是否相關(guān)，從RSV感染的和未感染的，經(jīng)過和未經(jīng)過spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)或spA4-antiRSV3’3’A/(8530-8547)處理的9HTE細(xì)胞分離RNA進(jìn)行RT-PCR分析。一RSV中M2RNA序列(從核苷酸7879到8465)被轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA并用PCR放大(材料和方法)。來自RSV感染細(xì)胞的M2 RNA產(chǎn)生一明顯可見的RT-PCR產(chǎn)物。相對的spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)處理的RSV感染細(xì)胞中測不到M2RNA。直接針對RSV L mRNA和反基因組RNA中相應(yīng)序列的嵌合物，spA4-antiRSV3’3’A/(8530-8547)，對M2RNA水平幾乎沒有影響(17％抑制)。因此，用spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)處理的9HTE細(xì)胞中病毒M2RNA明顯減少而用相對失活的針對RSV L mRNA的對照嵌合物，spA4-antiRSV3’3’A/(8530-8547)處理，對M2 RNA水平?jīng)]有影響。GAPDH轉(zhuǎn)錄子水平在所有RNA制備中類似。這些顯示特異RSV mRNA靶點消失的結(jié)果與RNA酶L的涉入一致。
實施例11其它反義激活劑復(fù)合物RSV反基因組鏈5’末端的二級結(jié)構(gòu)可比中間部分更容易破壞。這樣，盡管反基因組鏈二級結(jié)構(gòu)模型中缺少大環(huán)，但是下列反義激活劑復(fù)合物仍可用于實施本發(fā)明。
spA4-antiRSV3′-3′T/(1-19):sp5′A2′(p5′A2′)3-[(Bu)p]2-(5′ttg(Seq ID NO:7) tac gca ttt ttt cgc g3′-3′t5′)spA4-antiRSV3′-3′T/(51-69) sp5′A2′(p5′A2′)3-[(Bu)p]2-(5′gta(Seq ID NO:8) ctt atc aaa ttc tta t3′-3′t5′)RSV基因組的3’末端存在一組約50核苷酸沒有并入編碼3’鄰近基因轉(zhuǎn)錄的蛋白，但它轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種小RNA稱為“前導(dǎo)RNA”。證據(jù)顯示基因組3’末端正是轉(zhuǎn)錄運轉(zhuǎn)的入口點并引導(dǎo)RNA合成，它涉及在引導(dǎo)物-模板-NP-基因邊界的富含嘌呤序列終止，是轉(zhuǎn)錄酶通過基因組其它部分過程的強(qiáng)制性前奏。另外，由于該基因組3’末端是復(fù)制性和轉(zhuǎn)錄性RNA合成的起始，此點提供了一個在兩種RNA合成間關(guān)鍵切換操作的位點。最后，RSV基因組的3’末端富含對2-5A-依賴RNA酶剪切更容易敏感的尿嘧啶核苷酸殘基。
基因組鏈的3’末端的這些功能比基因組鏈的其它部分更容易破壞。這樣以下結(jié)合基因組鏈的反義激活劑復(fù)合物可用于實施本發(fā)明。
spA4-antiRSVGe3′-3′T/(1-18):sp5′A2′(p5′A2′)3-[(Bu)p]2-(5′acg(Seq ID NO:9) cga aaa aat gcg tac3′-3′t5′)spA4-antiRSVGe3′-3′T/(84-101) (Seq ID NO:10):
sp5′A2′(p5′A2′)3-[(Bu)p]2-(5′ctc cct tgg tta gag atg3′-3′t5′)spA4-antiRSVGe3′-3′T/(369-386) (Seq ID NO:11):
sp5′A2′(p5′A2′)3-[(Bu)p]2-(5′gaa atg atg gaa tta aca3′-3′t5′)實施例12spA4-antiRSV3’3’T/(8281-8299)的比較數(shù)據(jù)通過測定每種化合物的RSV抑制濃度和細(xì)胞毒濃度可獲得spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)處理和常規(guī)病毒唑處理效率的比較。建立人喉癌細(xì)胞株HEp-2和鼠腎細(xì)胞株MA-104培養(yǎng)并以MOI=0.005感染。培養(yǎng)物每天喂兩次。感染同時用病毒唑或spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)處理并繼續(xù)4天。接著撤除處理，第5天讀數(shù)。處理對RSV感染的結(jié)果報告為1)EC50，可見的感染細(xì)胞病理結(jié)果減少50％的濃度和2)EC90，病毒產(chǎn)生減少90％的濃度。細(xì)胞毒性濃度，IC50是導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)減少50％的濃度。治療效率通過IC50/EC50比例選擇指數(shù)估計。
結(jié)果顯示于表5和表6。表5顯示Hep-2細(xì)胞中spA4-antiRSV3’-3’T(8281—8299)EC50為0.3μM；病毒唑的EC50為4μM.IC50s分別大于10μM和41μM。這樣，spA4-antiRSV3’-3’T(8281-8299)具有比病毒唑高三倍的SI。
表6顯示關(guān)于MA-104細(xì)胞的類似結(jié)果。發(fā)現(xiàn)spA4-antiRSV3’-3’T(8281-8299)和病毒唑的SI分別為大于500和約200。
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為簡明，2-5A-反義寡核苷酸按以下所用常規(guī)縮寫。嵌合物的2-5A區(qū)以粗體大寫字母表示，即，pA2’p(A2’p)3。連接臂部分縮寫為[(Bu)p]2，代表兩個1,4-丁二醇分子通過磷酸二酯鍵相互連接，及-[(Bu)p]2，代表連接于嵌合體的2-5A和反義區(qū)。在下面的例子中，以粗體三倍體重復(fù)序列代表具正常的3’,5’磷酸二酯鍵的反義寡核苷酸，極性如所示，即，(3’ccc tgt ttt acc tag ggt aa5’)。整個鏈或末端3’-核苷酸取向的例外，兩者均清楚地標(biāo)出。嵌合物2-5A區(qū)5’-單磷酸酯修飾為5’-硫代磷酸酯時，所用縮寫為spA2’p(A2’p)3。表4 針對RVS M2和L mRNAs的不同位點的穩(wěn)定的、反義嵌合物的抗病毒活性寡聚物/RSV RNA位點 化合物結(jié)構(gòu) ％RSV復(fù)制的抑制寡核苷酸/處理 3.3μM6.6μM9.9μMspA4-antiRSV3′-3′N Series:SpA4-antiRSV3′-3′A/(8530-8547) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′cta tcg gtt aga taa ac3′-3′a5′) 2.5(1)spA4-antiRSV3′-3′G/(8599-8618) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′gat aag gac cat tga ata t3′-3′g5′) 44(1)spA4-antiRSV3′-3′C/(8561-8578) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′ctc tga gaa aga gat aa3′-3′c5′) 57(1)spA4-antiRSV3′-3′T/(8261-8279) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′gat tga aat ata gtg tgt3′-3′t5′)78(2) 87(1) 87(1)spA4-antiRSV3′-′3A/(8251-8270) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′ata gtg tgt tct ttt gat t3′-3′a5′) 86.7(2)92(1)spA4-antiRSV3′-3′T/(8281-8299) spA2′p(A2′p)3-[(Bu)p]2-(5′atg gtt att tgg gtt gtt3′-3′t5′)91.3 (3) 97(1) 99.6(1)參見表3說明表5spA4-antiRSV3’-3’T/(8281)的抗病毒活性Hep-2細(xì)胞中性紅化合物 EC50IC50SIspA4-antiRSV3’-3’T/(8281) 0.3μM＞10μM＞33病毒唑4μM41μM 10用RSV株A2測定，MOI=0.005新鮮培養(yǎng)基和寡聚物或病毒唑每天加2次共4天第5天讀數(shù)。
EC50是減少RSV產(chǎn)生CPE 50％的有效濃液。
IC50是細(xì)胞的細(xì)胞毒性的50％抑制濃度(如用干病毒測定的迅速分裂細(xì)胞相對靜止細(xì)胞的測定來測定可見和染粒攝入)。
SI選擇指數(shù)=IC50/EC50表6spA4-antiRSV3’-3’T/(8281)的抗病毒活性MA-104細(xì)胞可見CPE和病毒產(chǎn)生的減少化合物 EC50EC90IC50SIspA4-antiRSV3’-3’T/(8281) 0.02μM 0.02μM ＞10μM＞500病毒唑1μM 7μM 210μM210如用RSV株A2測定，MOI=0.005新鮮培養(yǎng)苷和寡聚物或病毒唑每天加2次共4天第5天讀數(shù)。
EC50是減少RSV產(chǎn)生的CPE 50％的有效濃度。
EC90是減少RSV產(chǎn)生90％的有效濃度。
IC50是對細(xì)胞的細(xì)胞毒性的50％抑制濃度(可見和染料攝入如用干病毒測定的快速分裂細(xì)胞相對靜止細(xì)胞的測定)。
SI選擇指數(shù)=IC50/EC50序列列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(ⅱ)發(fā)明題目對治療RSV感染有效的RNA酶L激活劑和反義寡核苷酸(ⅲ)序列數(shù)目23(ⅳ)聯(lián)系地址(A)收件人Pennie & Edmonds LLP(B)街道1155 Avenue，美國(C)城市紐約(D)州NY(E)國家U.S.A(F)郵政編碼10036(ⅴ)計算機(jī)可讀類型(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件Fast SEQ 2.0版(ⅵ)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)簽發(fā)日期(C)分類(ⅶ)優(yōu)先申請資料(A)申請?zhí)?0/011 725(B)簽發(fā)日期2/15/96(ⅷ)代理人/委托人信息(A)姓名Poissant,Brian M.
(B)登記號28462(C)文獻(xiàn)/摘要號8656-009-228(ⅸ)通訊信息(A)電話212-790-9090(B)傳真212-869-9741(C)TELEX(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞RSV(L+)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:1:TCAATGGTCC TTATCTCAA 19(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞RSV(L-)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:2:GAGCTTTATT AGCAGCATC 19(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞GAPDH(+)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:3:AAATCCCATC ACCATCTTC 19(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞GAPDH(-)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:4:CACCACCCTG TTGCTGTAG 19(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞RSV(M2+)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:5:AAACAATCAG CATGTGTTG19(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞RSV(M2-)(B)位置1...19(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:6:AATGTAACGA TGTGGTGAG 19(2)SEQ ID NO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞反義激活劑復(fù)合物(B)位置1...19(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’T/(1-19)(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:7:(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞反義激活劑復(fù)合物(B)位置1...19(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’T/(51-69)(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:8:GTACTTATCA AATTCTTAT 19(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞反義激活劑復(fù)合物(B)位置1...18(D)其它信息spA4-antiRSVGe3’-3’T/(1-18)(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:9:ACGCGAAAAA ATGCGTAC 18(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞反義激活劑復(fù)合物(B)位置1...18(D)其它信息spA4-antiRSVGe3’-3’T/(84-101)(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:10:CTCCCTTGGT TAGAGATG 18(2)SEQ ID 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NO:16信息(ⅰ)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞寡核苷酸(B)位置1...20(D)其它信息spA4-antiRSV/(8490-8509)(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:16:AATGGGATCC ATTTTGTCCC 20(2)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞寡核苷酸(B)位置1...17(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’A/(8530-8547)(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:17:CTATCGGTTA GATAAAC17(2)SEQ ID NO:18信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞寡核苷酸(B)位置1...19(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’G/(8599-8618)(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:18:GATAAGGACC ATTGAATAT 19(2)SEQ ID NO:19信息(ⅰ)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞寡核苷酸(B)位置1...17(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’C/(8561-8578)(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:19:CTCTGAGAAA GAGATAA17(2)SEQ ID NO:20信息(ⅰ)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞寡核苷酸(B)位置1...18(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’T/(8261-8279)(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:20:GATTGAAATA TAGTGTGT 18(2)SEQ ID NO:21信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞其它(B)位置1...19(D)其它信息寡核苷酸spA4-antiRSV3’-3’A/(8251-8270)(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:21:ATAGTGTGTT CTTTTGATT19(2)SEQ ID NO:22信息(ⅰ)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞寡核苷酸(B)位置1...18(D)其它信息spA4-antiRSV3’-3’T/(8281-8299)(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:22:ATGGTTATTT GGGTTGTT 18(2)SEQ ID NO:23信息(ⅰ)序列特征(A)長度15222堿基對(B)類型核酸(C)鏈類型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵詞RSV-A2(B)位置1...15222(D)其它信息(ⅹⅰ)序列的詳細(xì)情況SEQ ID NO:1:ACGCGAAAAA ATGCGTACAA CAAACTTGCA TAAACCAAAA AAATGGGGCA AATAAGAATT 60TGATAAGTAC CACTTAAATT TAACTCCCTT GGTTAGAGAT GGGCAGCAAT TCATTGAGTA 120TGATAAAAGT TAGATTACAA AATTTGTTTG ACAATGATGA AGTAGCATTG TTAAAAATAA 180CATGCTATAC TGATAAATTA ATACATTTAA CTAACGCTTT GGCTAAGGCA GTGATACATA 240CAATCAAATT GAATGGCATT GTGTTTGTGC ATGTTATTAC AAGTAGTGAT ATTTGCCCTA 300ATAATAATAT TGTAGTAAAA TCCAATTTCA CAACAATGCC AGTACTACAA AATGGAGGTT 360ATATATGGGA AATGATGGAA TTAACACATT GCTCTCAACC 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1．包括基本組成為下列的多聚核苷酸的組合物a)一段反義寡核苷酸，在第一末端有羥基部分，其中寡核苷酸和一呼吸道合胞病毒株的反基因組RNA鏈的15至20核苷酸互補(bǔ)；b)與第一末端相連的連接臂；和c)與連接臂相連的RNA酶L的寡核苷酸激活劑。
2．權(quán)利要求1的組合物，其中反義寡核苷酸與通常為單鏈的反基因組RNA鏈中至少15個連續(xù)核苷酸互補(bǔ)。
3．權(quán)利要求1的組合物，其中反義寡核苷酸與通常為單鏈的反基因組RNA鏈中一區(qū)的一部分互補(bǔ)，所述區(qū)大于34個核苷酸。
4．權(quán)利要求1的組合物，其中反義寡核苷酸與通常為單鏈的反基因組RNA鏈中一區(qū)的一部分互補(bǔ)，所述區(qū)大于45個核苷酸。
5．權(quán)利要求1的組合物，其中寡核苷酸激活劑從由sp5’A2’(p5’A2’)2-O-sp5’A2’(p5’A2’)3-O-,p5’A2’(p5’A2’)2-O-和p5’A2’(p5’A2’)3-O-組成的組中選擇。
6．權(quán)利要求1的組合物，其中第一末端是5’末端，反義寡核苷酸的3’末端羥基被封閉劑封閉，封閉劑從由-p3’N5’核苷酸，p-O-烷基胺，p-O-羥基烷基胺，sp-O-烷基胺，sp-O-羥基烷基胺，乙基和甲基組成的組中選擇。
7．權(quán)利要求1的組合物，其中第一末端是3’末端。
8．權(quán)利要求1的組合物，其中呼吸道合胞病毒株是A2株，且反義基因組的部分在殘基617和663或殘基718-772之間，以5’→3’方向編號。
9．權(quán)利要求1的組合物，其中呼吸道合胞病毒株是A2株，且反義基因組的部分在殘基2490和2530之間，以5’→3’方向編號。
10．權(quán)利要求1的組合物，其中呼吸道合胞病毒株是A2株，且反義基因組的部分在殘基8251和8299之間，以5’→3’方向編號。
11．權(quán)利要求10的組合物，其中反義寡核苷酸從由殘基8251-8270,8261-8279和8281-8299組成的組中選擇，以5’→3’方向編號。
12．權(quán)利要求1的組合物，其中反義寡核苷酸含有一個或多個磷酸部分，從包括硫代磷酸酯，甲基磷酸酯和甲基硫代磷酸酯的組中選擇。
13．權(quán)利要求1的組合物，其中反義寡核苷酸含有一個或多個2’O-甲基核苷酸。
14．含有有效濃度權(quán)利要求1的聚合核苷酸和可藥用載體的組合物。
15．權(quán)利要求14的組合物，含有可藥用的，可霧化載體。
16．包含向感染呼吸道合胞病毒的受試者中形成有效數(shù)量復(fù)合物的治療方法，復(fù)合物含有a)一段反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的序列與一呼吸道合胞病毒株的反基因組RNA鏈的通常單鏈部分中15至20個核苷酸互補(bǔ)；和b)激活的RNA酶L。
17．包含一步對感染呼吸道合胞病毒的主體給藥有效數(shù)量含有聚合核苷酸組合物的處理方法，其基本組成為a)一段反義寡核苷酸，在第一末端有羥基部分，其中所述寡核苷酸的序列與呼吸道合胞病毒一株的反基因組RNA鏈的通常單鏈部分中約15至20個核苷酸互補(bǔ)；b)連到第一末端的連接臂；c)連到連接臂的RNA酶L的激活劑；和d)可藥用的，可霧化載體。
18．含有一段有15到20個5’-3’連接核苷酸的反義寡核苷酸的化合物，此寡核苷酸與RSV反基因組RNA鏈的一部分互補(bǔ)，所述部分從由RSV A2株基因組殘基617-663，殘基718-772，殘基2490-2530，殘基3212-3247，殘基5240-5288，和殘基8251-8299組成的組中選擇，以5’→3’方向編號。
19．權(quán)利要求18的化合物，其中反義寡核苷酸是18或19個5’-3’連接的核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療呼吸道合胞病毒感染的化合物和方法。這些化合物包括一個反義部分,和正常的RSV反基因組鏈(mRNA鏈)的單鏈部分互補(bǔ),一個連接子和普遍存在的非特異RNA酶RNA酶L的寡核苷酸激活劑。該方法包括形成激活的RNA酶L和反義分子的復(fù)合物。本申請闡述了確定RSV反基因組鏈的哪部分是正常單鏈的方法。本申請闡述具有RSV基因組8281－8299殘基序列的反義寡核苷酸在實施本發(fā)明中非常有用,并提供優(yōu)于傳統(tǒng)可選藥物,病毒唑的體外結(jié)果。
文檔編號A61K31/7088GK1215994SQ97193797
公開日1999年5月5日 申請日期1997年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月15日
發(fā)明者P·F·托爾倫瑟, R·H·思爾維爾曼, N·M·思里諾, G·李, W·肖 申請人:國家健康學(xué)會, 克里夫蘭診所基金會