專利名稱：祛除齒斑的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有一種淡紫擬青霉葡聚糖酶和一種齒斑葡聚糖酶(mutanase)，以及其他可選擇性性含有的酶類的口腔保健組合物及其產(chǎn)品。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的組合物及產(chǎn)品在祛除齒斑和防止齒斑形成中的應用。
背景技術：
齒斑的形成會引起齲齒、牙齦炎、牙周病，最終導致牙齒脫落。齒斑是細菌、上皮細胞、白細胞、巨噬細胞和其他口腔滲出液的混合物。所說的細菌產(chǎn)生多支鏈多糖與口腔微生物一起形成黏性物質(zhì)，引起齒斑進一步擴散。
隨著齒斑繼續(xù)積聚，會生成堅硬的白色或黃色沉積物。這些沉積物被稱作鈣化斑或牙垢，是由齒斑和尤其是鈣等礦物質(zhì)在唾液中形成的。
口腔多糖口腔多糖是由食物和飲料中所含的蔗糖在口腔中的生齲微生物如變異鏈球菌(Streptococcus mutans)或血鏈球菌(Streptococcussanguis)的作用下生成的。
上述口腔多糖含有水溶性的帶有大量α-1,6糖苷鍵的葡聚糖，還含有水不溶的被稱為齒斑葡聚糖(mutan)的胞外多糖的主要成分，該齒斑葡聚糖的碳鏈以α-1,3糖苷鍵連接，支鏈以α-1,6糖苷鍵連接。
齒斑葡聚糖結(jié)合羥磷灰石(形成牙齒堅硬的多孔外層)并與黏附在牙齒表面的所述生齲細菌的細胞表面受體蛋白結(jié)合。
齒斑葡聚糖酶齒斑葡聚糖酶是α-1,3葡聚糖酶(又稱α-1,3葡聚糖水解酶)，降解齒斑葡聚糖的α-1,3糖苷鍵。據(jù)報道齒斑葡聚糖酶來源于木霉屬(Hasegawa等,1969，生物化學雜志，244,p.5460-5470；Guggenheim and Haller,1972，牙科研究雜志，51,p.394-402)及鏈霉菌(Takehara等,1981，細菌學雜志，145,p.729-735)、樹脂枝孢菌(Cladosporium resinae)(Hare等,1978，糖研究,66,p.245-264)，假單孢菌(美國專利號4,438,093)，黃桿菌(日本專利號77038113)，環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulanse)(日本專利號63301788)和曲霉的菌株。一個來源于哈氏木霉(Trichoderma harzianum)的齒斑葡聚糖酶基因已被克隆并測序(日本專利號4-58889/A)。
葡聚糖酶葡聚糖酶是α-1,6葡聚糖酶(又稱為1,6-α-D-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶)，降解葡聚糖的α-1,6糖苷鍵。能產(chǎn)生葡聚糖酶的一些微生物包括青霉、擬青霉、曲霉、鐮刀菌、穗霉、輪枝孢霉、長蠕孢屬和毛殼菌等屬的真菌；乳桿菌屬、鏈球菌屬、纖維孤菌屬、噬纖維菌屬、短桿菌屬、假單孢菌屬、棒桿菌屬、節(jié)桿菌屬和黃桿菌屬等屬的細菌以及如斯達氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)等酵母菌。
市場上的產(chǎn)品包括Novo Nordisk A/S通過淡紫青霉(Penicilliumlilacium)菌株發(fā)酵生產(chǎn)的葡聚糖酶50L。葡聚糖酶50L可用于糖加工業(yè)中降解粗糖液或糖漿中的葡聚糖。
為了保證牙齒能有效地咀嚼食物等功能，有必要一生中保護牙齒、維持良好的口腔衛(wèi)生。為達到上述目的，可以經(jīng)常使用牙膏等刷牙，并且最好用含抗菌劑的漱口液對口腔進行清洗。
有人曾建議，在口腔保健組合物和產(chǎn)品中加入葡聚糖酶和/或齒斑葡聚糖酶和/或其它酶類來防止齲齒、齒斑、牙垢的產(chǎn)生。
美國專利號4,353,891(Guggenheim等)涉及將用哈氏木霉CBS243.71菌株產(chǎn)生的齒斑葡聚糖酶用于降解變異鏈球菌CBS350.71菌株(又編號為OMZ176)產(chǎn)生的齒斑葡聚糖，以此祛除齒斑。齒斑的關鍵成分是具有α-1,3-糖苷鍵的水不溶性多糖，這種稱為齒斑葡聚糖的多糖物質(zhì)不被葡聚糖酶作用。
Guggenheim等(1972，齲齒研究，6,p.289-297)發(fā)現(xiàn)同時使用葡聚糖酶和1,3-葡聚糖酶(齒斑葡聚糖酶)對大鼠齒斑的擴展無顯著影響。
Hare等(1978，糖研究，66,p.245-264)發(fā)現(xiàn)樹脂枝孢菌產(chǎn)生的細菌α-1,3-葡聚糖酶和另一種細菌葡聚糖酶組合使用，在水解和溶解口腔葡聚糖時具有協(xié)同效應。
美國專利4,438,093號(Osaka微生物疾病研究基金)描述了含有一種葡聚糖酶和一種α-1,3-葡聚糖酶(齒斑葡聚糖酶)的口腔保健組合物，每克該組合物中兩種酶的含量均為0.5到100個酶單位，酶單位比值為1∶2到2∶1。所說的葡聚糖酶由棒桿菌屬的一個菌株產(chǎn)生，α-1,3-葡聚糖酶來自假單孢菌屬的一個菌株。
英國專利號2,206,585(Dental Chem.Co.LTD)描述了一種牙齒清潔劑，該牙齒清潔劑含有羥磷灰石作為磨光劑，所述羥磷灰石上固定有果聚糖酶(laevanase)、葡聚糖酶和齒斑葡聚糖酶。
美國專利5,145,665號(Henkel)公開了一種用于口腔和牙齒保健的組合物，該組合物中含有葡聚糖酶和/或1,3-葡聚糖酶，可清除口腔中的多糖。
法國專利2,651,433號(DANA)涉及的潔齒劑(dentifrice)產(chǎn)品中含有的葡聚糖酶可作用于形成不久的齒斑，齒斑葡聚糖酶可作用于形成較久及不溶性齒斑，該產(chǎn)品中還含有其它幾種有殺菌作用的酶。
美國專利5,320,830號(寶潔公司)描述了一種可減少齒斑和牙齦炎的牙膏，該牙膏劑含有a)一種表面活性劑，b)一種酶，c)螯合劑，d)一種氟化物，e)一種硅磨光劑，以及f)一種載體。其中所述酶是內(nèi)切葡聚糖酶，木瓜蛋白酶，葡聚糖酶和/或齒斑葡聚糖酶。
發(fā)明概述本發(fā)明目的是提供可安全(即對口腔組織、結(jié)構無損害)、有效防止齒斑形成和/或清除已形成的齒斑的口腔保健產(chǎn)品。
本發(fā)明首先涉及含有淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinum)葡聚糖酶和一種齒斑葡聚糖酶的口腔保健組合物。本發(fā)明也涉及相應的口腔保健產(chǎn)品，如牙膏。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的組合物或產(chǎn)品在防止齒斑形成和祛除齒斑中的應用。
附圖簡述

圖1表示在pH5.0-8.0之間，淡紫擬青霉葡聚糖酶和/或哈氏木霉齒斑葡聚糖酶對齒斑葡聚糖的水解作用。
圖2表示在pH7時，體外試驗中齒斑的祛除情況。
圖3表示pH7時，葡聚糖酶和齒斑葡聚糖酶組合使用對齒斑的祛除效果。
發(fā)明詳述本發(fā)明目的是提供可安全(即對口腔組織、結(jié)構無損害)、有效防止齒斑形成和/或清除已形成的齒斑的口腔保健產(chǎn)品。
所述口腔保健產(chǎn)品應被理解為同時有其它直接或間接口腔保健功能，如抑制蛀牙或牙齦炎。
本發(fā)明涉及的所有口腔保健組合物和相應產(chǎn)品中都含有酶類，這些組合物和產(chǎn)品的pH范圍是pH 6.0到大約pH 8.0，這是多數(shù)口腔保健產(chǎn)品的pH范圍。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在口腔保健產(chǎn)品中同時使用特定的葡聚糖酶和齒斑葡聚糖酶可以產(chǎn)生協(xié)同效應。
口腔保健組合物如上所述，本發(fā)明首要目的是提供一種含有淡紫擬青霉產(chǎn)生的葡聚糖酶和一種齒斑葡聚糖酶的口腔保健組合物。
所需酶量的減少具有經(jīng)濟效益，因為這可以使生產(chǎn)本發(fā)明所述的口腔保健品的成本降低。另外，若產(chǎn)品中加入原有酶量將得到效果強化的產(chǎn)品。使用由本發(fā)明所述的口腔保健組合物制備而成的口腔保健產(chǎn)品(下文將有詳述)將可受益非淺，這是由于它能夠比原有產(chǎn)品更安全、更有效地防止直接或間接的不良后果(如牙齒上的黃色沉積物，蛀牙、牙齦炎的預防)。
一種適于在本發(fā)明所述口腔保健組合物中與葡聚糖酶組合使用的齒斑葡聚糖酶可由選自含有下述菌的絲狀真菌組內(nèi)的菌株產(chǎn)生木霉屬，尤其是哈氏木霉菌株，如哈氏木霉CBS243.71；或青霉屬，特別是索青霉(Penicillium funiculosum)，如索青霉NRRL1768，或淡紫青霉，如淡紫青霉NRRL896，或產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)，如產(chǎn)紫青霉CBS238.95；或假單孢菌屬(Pseudomonas)的一個菌株；或黃桿菌屬(Flavobacterium)的一個菌株；或環(huán)狀芽孢桿菌的一個菌株，或曲霉屬的一個菌株，或鏈霉菌屬的一個菌株等。
齒斑葡聚糖酶還可以從產(chǎn)紫青霉中獲得。
美國專利4,353,981(Guggenheim等)公開了哈氏木霉CBS243.71齒斑葡聚糖酶，索青霉NRRL1768齒斑葡聚糖酶和淡紫青霉NRRL896齒斑葡聚糖酶在祛除齒斑中的應用。
其它幾種提到的齒斑葡聚糖酶，其文獻可在發(fā)明背景部分找到。
本發(fā)明的口腔保健組合物中可適當?shù)睾械蠑M青霉產(chǎn)生的一定量葡聚糖酶和有等效酶活的一種齒斑葡聚糖酶。以在終口腔保健產(chǎn)品中的酶活單位計量，這兩種酶的含量分別是0.001KDU/ml～1000KDU/ml，優(yōu)選0.01KDU/ml～500 KDU/ml，尤其是0.1 KDU/ml～100 KDU/ml；以及0.001MU/ml～1000 MU/ml，優(yōu)選0.01 MU/ml～500MU/ml，尤其是0.01 MU/ml～100MU/ml。
本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉產(chǎn)生的葡聚糖酶和哈氏木霉產(chǎn)生的齒斑葡聚糖酶組合使用時，在體外實驗中，pH7.0條件下，祛除齒斑具有協(xié)同效應(見實施例2)。
在優(yōu)選的實施方案中使用的齒斑葡聚糖酶是重組體。
這些酶(即葡聚糖酶和齒斑葡聚糖酶)應在20～45℃基本上有活性，尤其是在37℃附近，因為人類口腔溫度處于上述溫度區(qū)間內(nèi)。
術語“基本上有活性”在本發(fā)明正文中，是指所研究的酶的相對活性是該酶在最適溫度時的活性的70％以上，尤其是80％以上，特別是90％以上。
根據(jù)本發(fā)明，在口腔保健組合物中還可含有其他的酶活性。除了葡聚糖酶和齒斑葡聚糖酶以外，可能含有的酶包括蛋白酶如木瓜蛋白酶，葡糖苷內(nèi)切酶，脂酶，淀粉酶和相應的混合物。
口腔保健產(chǎn)品本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的口腔保健組合物的口腔保健產(chǎn)品。所述口腔保健產(chǎn)品可以取任意適宜的物理形態(tài)(如粉末、膏、凝膠、液態(tài)、軟膏、片劑等)?！翱谇槐＝‘a(chǎn)品”可以定義為可用于通過防止齒斑形成、祛除齒斑、防止和/或治療牙病等方式而保持或改善人類和動物的口腔衛(wèi)生狀況的一種產(chǎn)品。
至少在本發(fā)明內(nèi)容中，口腔保健產(chǎn)品還包括可清洗牙齒、假牙等的產(chǎn)品。
這些口腔保健產(chǎn)品的例子包括牙膏、牙膠或牙粉，牙齒清潔劑、漱口液，刷牙前后用的沖洗劑，口香糖，糖錠和糖果等。
典型的牙膏和牙膠包括磨光性物質(zhì)，起泡劑、芳香劑、保濕劑、黏合劑、增稠劑、增甜劑、增白/漂白/去污劑、水和可選擇性含有的酶。
漱口液，包括祛斑液，典型地含有水/酒精溶液、芳香劑、保濕劑、增甜劑、起泡劑、著色劑和可選擇性含有的酶。
磨光劑也可將磨光性物質(zhì)加入到本發(fā)明的潔齒劑產(chǎn)品中。根據(jù)本發(fā)明，所述磨光性物質(zhì)包括氧化鋁及其水合物，比如α-三水合氧化鋁、三硅酸鎂、碳酸鎂、高嶺土、硅鋁酸鹽如煅燒硅酸鋁和硅酸鋁、碳酸鈣、硅酸鋯，還包括粉狀塑料，如聚氯乙烯、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、酚醛樹脂、蜜胺甲醛樹脂、尿素甲醛樹脂、環(huán)氧樹脂、粉狀聚乙烯、二氧化硅干凝膠、水凝膠、氣凝膠等。另外一些適合做磨光劑的有焦磷酸鈣、水不溶的堿性偏磷酸鹽、磷酸二鈣和/或其二水合物、正磷酸二鈣、磷酸三鈣、顆粒狀羥基磷灰石等。也可以使用這些物質(zhì)的混合物。
根據(jù)口腔保健產(chǎn)品的不同，磨光性物質(zhì)所占的重量百分比為0-70％，優(yōu)選1％-70％。在牙膏中，磨光性物質(zhì)成分一般是占到成品重量的10％-70％。
保濕劑用于防止牙膏等產(chǎn)品喪失水分。適用于本發(fā)明的口腔保健產(chǎn)品的保濕劑包括以下化合物及其混合物甘油、多羥基化合物、山梨糖醇、聚乙二醇、丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、氫化的部分水解多糖。保濕劑一般在牙膏中的重量百分比為0～80％，優(yōu)選5％～70％。
二氧化硅、淀粉、黃蓍膠、黃原膠、愛爾蘭蘚提取物、海藻膠質(zhì)、果膠、纖維素衍生物如羥乙基纖維素、羥甲基化鈉鹽纖維素和羥基丙基纖維素，聚丙烯酸及其鹽類，聚乙烯吡咯烷酮等可做為適宜的黏合劑和增稠劑的例子，它們有助于穩(wěn)定潔齒劑產(chǎn)品。增稠劑在牙膏或牙膠中所占的重量百分比可以為0.1％～20％，黏合劑在成品中所占的重量百分比可以為0.01％～10％。
起泡劑脂肪酸鹽、陰離子、陽離子、非離子、兩性和/或偶極離子的表面活性劑可以用作起泡劑。其重量在成品中可以占到0％～15％，優(yōu)選0.1％～13％，更優(yōu)選是0.25％～10％。
表面活性劑表面活性劑的用量以不影響產(chǎn)品中所含酶的活性為限度。表面活性劑包括脂肪醇硫酸鹽、單甘油酯磺酸鹽、或10～20個碳原子的脂肪酸、脂肪酸-清蛋白縮合產(chǎn)物、脂肪酸酰胺和氨基乙磺酸鹽和/或羥基乙磺酸的脂肪酸酯鹽。
增甜劑(sweetening agent)適當?shù)脑鎏饎┌ㄠ徎酋１郊柞啺?糖精)。
芳香劑例如留蘭香(spearmint)，一般含量少，如其重量百分比可為0.01％到約5％，尤以0.1％～5％為宜。
增白/漂白劑增白/漂白劑包括雙氧水，一般含量少于成品重量的5％，優(yōu)選為成品重量的0.25％～4％。
水水的含量通常以使牙膏等產(chǎn)品呈流體狀態(tài)為宜。
添加劑本發(fā)明的產(chǎn)品中還可含有水溶性的抗菌劑，如雙氯苯雙胍己烷二葡糖酸鹽(chlorhexidine digluconate)、雙辛氫啶(hexetidine)、alexidine、季銨抗菌化合物和水溶性的金屬離子如鋅、銅、銀、二價錫等(如鋅、銅和二價錫的氯化物，以及硝酸銀)。
根據(jù)本發(fā)明，還可加入化合物作為氟化物來源、染料/著色劑、防腐劑、維生素、pH調(diào)節(jié)劑、抗齲齒藥物、脫敏劑等。
酶另外一些應用于眾多口腔保健產(chǎn)品以及本發(fā)明的口腔保健產(chǎn)品中的必要成分是酶類。酶是活體組織中化學反應的生物催化劑。酶與它們所作用的底物相結(jié)合形成酶-底物復合物中間體，然后這種復合物被轉(zhuǎn)化為反應產(chǎn)物，酶則釋放下來并繼續(xù)進行其特異的酶促功能。
在用于清潔口腔時，酶具有多種功能。唾液蛋白可以吸附于牙齒的表面形成薄膜，這正是后來形成的牙斑的第一層，而蛋白酶則可以降解這類唾液蛋白。蛋白酶和脂酶一起可以降解組成細菌細胞壁和細胞膜的結(jié)構成分的蛋白和脂類，從而殺死細菌。葡聚糖酶可以降解細菌產(chǎn)生的可用于形成細菌吸附所需基質(zhì)的有機骨架結(jié)構。蛋白酶和淀粉酶不僅可以抑制牙斑的形成，還通過降解可與鈣結(jié)合的糖-蛋白組合物，抑制礦化作用，從而防止牙垢的產(chǎn)生。
一種應用本發(fā)明的口腔保健組合物制備的牙膏典型地含有以下成分(牙膏組合物成品的重量百分比)磨光劑10～70％保濕劑0～80％增稠劑0.1～20％黏合劑0.01～10％增甜劑0.1～5％起泡劑0～15％增白劑0～5％
酶 0.0001～20％在本發(fā)明的一個特定實施方案中，所述口腔保健產(chǎn)品是pH值范圍為pH6.0～8.0，并含有下列組分的牙膏a)10～70％的磨光劑b)0～80％的保濕劑c)0.1～20％的增稠劑d)0.01～10％的黏合劑e)0.1～5％的增甜劑f)0～15％的起泡劑g)0～5％的增白劑i)0.0001～20％的酶上述i)中涉及的酶包括前面所述的來源于淡紫擬青霉的葡聚糖酶和齒斑葡聚糖酶，并可選擇性地含有上文提及的可用于牙膏等的其他酶類。
一種應用本發(fā)明的口腔保健組合物生產(chǎn)的漱口液典型地含有以下成分(漱口液組合物成品的重量百分比)0～20％的保濕劑0～2％的表面活性劑0～5％的酶0～20％的乙醇0～2％的其他成分(如芳香劑、增甜劑、活性成分如氟化物)0～70％的水漱口液組合物可使用一種適當?shù)木彌_液，如pH值為pH6～8的檸檬酸鈉或磷酸鈉緩沖液。
漱口液可以是非稀釋狀態(tài)(即使用前必須稀釋)。
上文提及的酶類包括前面所述的來源于淡紫擬青霉的葡聚糖酶和齒斑葡聚糖酶，并可選擇性包含上文提及的可用于漱口液的其他酶類。
口腔保健組合物及產(chǎn)品的應用本發(fā)明的第三方面涉及本發(fā)明的組合物及口腔保健產(chǎn)品在防止牙斑的形成或祛除牙斑中的應用。
本發(fā)明的產(chǎn)品的應用典型地包括將安全、有效量的所述產(chǎn)品應用于口腔中。例如對牙膏或牙膠來說，這些劑量(如大約0.3克到2克)在口腔中停留大約15秒到12小時。
制備方法可以使用口腔產(chǎn)品領域的常規(guī)方法生產(chǎn)本發(fā)明的口腔保健組合物和產(chǎn)品。
材料和方法材料淡紫擬青霉產(chǎn)生的葡聚糖酶(來源于Novo Nordisk A/S)哈氏木霉CBS243.71菌株產(chǎn)生的齒斑葡聚糖酶(來源于NovoNordisk A/S)微生物變異鏈球菌CBS350.71菌株(又編號為OMZ176)粘放線菌(Actinomyces viscosus)DSM43329具核梭桿菌多形亞種(Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum)DSM 20482溶液Britton-Robinson緩沖液赤蘚紅B(Erythrosin B)(Sigma)儀器比色儀CR-200(Minolta)。
羥基磷灰石盤的制備制備羥基磷灰石盤時，在盤型模具中加入250mg羥基磷灰石，加壓大約5900kg((13,000lbs)壓縮5分鐘。然后在600℃燒結(jié)4小時，最后用無菌的去離子水水化處理。
羥基磷灰石盤的滅菌羥基磷灰石盤在180℃滅菌兩個小時，用無菌的去離子水水化，置于Nunc管(10ml體積)的蓋子上。
齒斑葡聚糖的制備制備齒斑葡聚糖時，先將變異鏈球菌CBS350.71在pH6.5、37℃恒溫、75rpm振蕩通氣的條件下，在含有以下成分的培養(yǎng)量中培養(yǎng)NZ-Case 6.5g/L酵母提取物6g/L(NH4)2SO420g/LK2PO43g/L葡萄糖50g/LPluronic PE6100 0.1％35小時后，加入蔗糖至終濃度為60g/L，以誘導產(chǎn)生葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。整個發(fā)酵時間為75小時，發(fā)酵后的上清液離心并過濾(無菌)，然后在上清液中加入蔗糖至終濃度為5g/L(乙酸調(diào)節(jié)pH7.0)，將該溶液于37℃攪拌過夜。過濾該溶液，不溶的齒斑葡聚糖收集在Propex上，用pH5.0(乙酸調(diào)節(jié))的含有1％苯甲酸鈉的去離子水粗洗。最后，將該不溶性齒斑葡聚糖凍干并粉碎。
葡聚糖活性測定(KDU)一千個Novo葡聚糖酶活單位(1KDU)是指參照下述標準條件，利用Novo Nordisk測定葡聚糖酶活性的方法，每小時能降解葡聚糖產(chǎn)生相當于1克麥芽糖的還原糖的酶量底物 葡聚糖500(Pharmacia)反應時間 20分鐘溫度 40℃pH 5.4根據(jù)需求，可提供Novo Nordisk公司分析方法的詳細說明(AF120)。
齒斑葡聚糖酶活性測定(MU)一個齒斑葡聚糖酶活單位(MU)是在標準條件下，每分鐘催化反應生成1μmol還原糖(以葡萄糖計算)的酶量。
標準條件底物 1.5％齒斑葡聚糖反應時間 15分鐘溫度 40℃pH5.5根據(jù)要求，可從Novo Nordisk公司(A/S)獲得Novo Nordisk公司分析方法的詳細說明(AF180/1-GB)。
制備貼壁的齒斑葡聚糖將變異鏈球菌OMZ176(CBS350.71)接種至盛有10ml含2％蔗糖的Todd Hewitt肉湯的玻璃試管(22mm直徑×150mm高度)中，將試管于37過夜。棄去肉湯，用10ml 0.85％NaCl溶液將附著在玻璃壁上的齒斑葡聚糖和變異鏈球菌細胞洗滌兩次。
齒斑祛除效果評價用于齒斑祛除效果評價的方法是基于Kao在JP2250816所述的方法。本方法中，所述羥基磷灰石盤覆蓋有一層由三株口腔微生物(變異鏈球菌、粘放線菌、具核梭桿菌)組成的生物膜。
測定齒斑祛除效果時，利用PBS中的0.1％赤蘚紅B將羥基磷灰石盤上的齒斑染成紅色，紅色的強度(即a*)用比色儀CR-200測定。a*的最大值為60。低于該值表明紅色強度較小(即齒斑較少)。若測得a*值為零，說明無紅色(即沒有齒斑)。
實施例1齒斑葡聚糖在pH5.0～8.0的水解用超聲發(fā)生器將根據(jù)“材料與方法”所述得到的齒斑葡聚糖分散于去離子水中至濃度為16mg/ml，制備成底物懸液。
溶于0.05M乙酸緩沖液的淡紫擬青霉齒斑葡聚糖酶和哈氏木霉CBS243.71葡聚糖酶用去離子水稀釋。
制備如下酶溶液—葡聚糖酶溶液(4KDU/ml)，
—齒斑葡聚糖酶溶液(4MU/ml)，以及—混合酶溶液(4KDU和4MU/ml)此外，制備pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的50mM Britton-Robinson緩沖液。取250μl上述酶液和500μl緩沖液在微量離心管中混合，立即加入250μl已制好的齒斑葡聚糖懸液，于37℃在搖床中以最大轉(zhuǎn)速保溫。30分鐘后立即加入250μl0.5N HCl終止酶促反應。離心各個反應混合物，按照蒽酮反應方法(J.H.Roe,1955，生物化學雜志，212,P335)測定所獲得的上清液中的可溶性糖含量。
實驗結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，在pH5.0～8.0范圍內(nèi)，組合使用葡聚糖酶和齒斑葡聚糖酶水解齒斑葡聚糖時，可產(chǎn)生協(xié)同效應。
實施例2pH7.0時貼于玻璃壁上的齒斑葡聚糖的水解按照“材料與方法”部分所述，制備粘附有齒斑葡聚糖的玻璃試管，以模擬粘在牙齒表面的牙斑。
將下列溶于0.05M乙酸緩沖液的齒斑葡聚糖酶和葡聚糖酶用30mM Britton-Robinson緩沖液(pH7.0)稀釋—葡聚糖酶溶液(1KDU/ml)，—齒斑葡聚糖酶溶液(1MU/ml)，以及—混合性葡聚糖酶和齒斑葡聚糖酶溶液(1KDU和1MU/ml)從上述每種酶溶液中分別取5ml，先在37℃預熱15分鐘，然后加入至帶有貼壁齒斑葡聚糖的玻璃管中，將其在37℃保溫。
保溫時間為0時立即取出1000μl作為對照，并與500μl 0.5NHCl混合以終止酶促反應。在保溫5、10、15、30分鐘時，分別取出1000μl樣品并立即與500μl 0.5N HCl混合。
將每一個反應混合物離心，利用實施例1所述的同樣方法測定所得上清中的可溶性糖含量。
實驗結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看到，在pH7.0時，組合使用葡聚糖酶和齒斑葡聚糖酶水解玻璃壁上粘附的齒斑葡聚糖可產(chǎn)生協(xié)同效應。
實施例3pH7.0時牙斑祛除效果將三種口腔微生物(分別為變異鏈球菌、粘放線菌、具核梭桿菌多形亞種)在37℃分別厭氧培養(yǎng)三天。在培養(yǎng)過程中，將涂有無菌唾液的羥基磷灰石盤浸入培養(yǎng)肉湯中，這樣，在該盤表面就形成了口腔生物膜。培養(yǎng)后，羥基磷灰石盤用PBS快速地沖洗一下，然后用制備于40 mM Britton-Robinson緩沖液(pH7.0)的酶溶液在37℃作用20分鐘，如下表所示
羥基磷灰石盤用PBS快速沖洗一下，然后在1ml含溶于PBS的0.1％赤蘚紅B中溫育1分鐘，以將羥基磷灰石盤上的斑染成紅色。將盤風干過夜。用比色儀CR-200測定紅顏色的強度(即a*)。a*值越高，羥基磷灰石盤就越紅。除去赤蘚紅B溶液，將盤用PBS沖洗幾分鐘。
測試的結(jié)果如圖3所示?？梢钥吹?，用1KDU/ml的葡聚糖酶和1MU/ml的齒斑葡聚糖酶處理羥基磷灰石盤時，比分別使用這兩種酶時能更有效地祛除羥基磷灰石盤上的斑。在pH7.0時，組合使用葡聚糖酶和齒斑葡聚糖酶在祛除牙斑時有協(xié)同效應。
本發(fā)明及權利要求并不僅限于此處所公開的幾個特殊實施方案的范圍，因為這些實施方案僅用于描述本發(fā)明的幾個方面，所有相似的的實施方案均落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上，根據(jù)前面的描述，除本文所公開的各個實施方案外，本領域的技術人員易于作出本發(fā)明的各種改進，這些改進也落在本發(fā)明權利保護范圍之內(nèi)。
本文引用多篇參考文獻，這些參考文獻所公開的內(nèi)容均全文引入本文作為參考。
權利要求
1．一種含有淡紫擬青霉葡聚糖酶和一種齒斑葡聚糖酶的口腔保健組合物。
2．根據(jù)權利要求1所述的口腔保健組合物，其特征在于其pH范圍為pH 6.0～8.0。
3．根據(jù)權利要求1或2的口腔保健組合物，其中所述葡聚糖酶來源于擬青霉屬，特別是淡紫擬青霉。
4．根據(jù)權利要求1到3中任一項的口腔保健組合物，其中所述齒斑葡聚糖酶來源于木霉屬，主要是哈氏木霉，尤其是哈氏木霉CBS243.71，或來源于青霉屬，主要是索青霉，尤其是索青霉NRRL1768，或淡紫青霉，尤其是淡紫青霉NRRL896，或產(chǎn)紫青霉，例如產(chǎn)紫青霉CBS238.95，或來源于假單孢菌屬的一個菌株，或黃桿菌屬的一個菌株，或環(huán)狀芽孢桿菌的一個菌株，或曲霉屬的一個菌株，或鏈霉菌屬的一個菌株。
5．根據(jù)權利要求4的口腔保健組合物，其中所述齒斑葡聚糖酶是重組體。
6．根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的口腔保健組合物，其特征在于所述酶類在組合物中在20-40℃溫度下、尤其是37℃左右基本上有活性。
7．根據(jù)權利要求1至6中任一項所述的口腔保健組合物，其特征在于其中還含有選自由蛋白酶如木瓜蛋白酶、葡糖苷內(nèi)切酶、脂酶、淀粉酶及其混合物等組成之組的酶類。
8．一種含有權利要求1至7中任一項所述的口腔保健組合物的口腔保健產(chǎn)品。
9．根據(jù)權利要求8所述的口腔保健產(chǎn)品是一種潔齒劑，例如牙膏、牙粉或漱口液。
10．根據(jù)權利要求9所述的口腔保健產(chǎn)品，其中該產(chǎn)品是pH范圍為pH 6.0至pH 8左右的牙膏或漱口液。
11．權利要求1至7所述的組合物或8至10所述的口腔保健產(chǎn)品在抑制齒斑形成或祛除齒斑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有一種淡紫擬青霉葡聚糖酶和一種齒斑葡聚糖酶、以及其他可選擇性含有的酶類的口腔保健組合物及其產(chǎn)品。
文檔編號A61K8/30GK1216463SQ9719387
公開日1999年5月12日 申請日期1997年4月16日 優(yōu)先權日1996年4月16日
發(fā)明者土屋理惠 申請人:諾沃挪第克公司