專利名稱：含外源dna的副痘病毒,其制備及其在疫苗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組副痘病毒(Parapockenviren)，其制備及含有它們的疫苗和免疫調(diào)制劑。
基因重組改變的副痘病毒在其基因組中攜帶缺失和/或插入。副痘病毒基因組片段的缺失和/或外源DNA的插入可導(dǎo)致其致病性減小或喪失(減毒)。來自病原體或生物活性物質(zhì)的遺傳信息以插入方式摻入副痘病毒基因組中。這種外源遺傳信息作為重組副痘病毒的組分在例如，細胞培養(yǎng)物，組織或在完整生物體中表達。
根據(jù)本發(fā)明制備的重組副痘病毒可加入到例如，疫苗或免疫調(diào)制劑中。外源DNA在副痘病毒基因組中的表達解除了在例如，接種的個體中對由外源遺傳信息所遞呈的病原體的防御反應(yīng)。也可刺激接種的個體的非特異性抗性。(在下文中，術(shù)語副痘病毒簡稱為PPV)。
PPV本身可見有免疫調(diào)制效應(yīng)，因此它們在生物體中刺激非病原體特異性免疫反應(yīng)，因此，例如，副痘病毒的制品可成功地用于獸醫(yī)學(xué)以增強普通抗性。
具有病原體特異性效應(yīng)的疫苗根據(jù)抗原的不同需要幾天到幾周來形成保護，但它們此后會提供持續(xù)幾個月到幾年的長期保護。
因此，基于重組產(chǎn)生的副痘病毒制備的疫苗可用作生物學(xué)產(chǎn)品以提高對傳染病的控制，因為它們在生物體中形成了持久的病原體特異性免疫并且也誘導(dǎo)迅速建立的非病原體特異性保護。
PPV免疫刺激特性與誘導(dǎo)同源和/或異源病原體特異性保護的外源抗原的表達組合是新的。它使得制備出的產(chǎn)品既介導(dǎo)針對感染迅速建立的，廣譜的非病原體特異性保護，又提供對感染持久的，病原體特異性的保護。
脊椎動物副痘病毒科(Chordopoxvirinae)被劃分成不同的，獨立的屬。本發(fā)明涉及PPV屬，它與其余副痘病毒在結(jié)構(gòu)上和遺傳上均有區(qū)別。PPV被分成3個不同的種(文獻1)-Parapoxvira ovis(也稱接觸性深膿皰病毒，接觸性膿皰性皮炎病毒或口瘡病毒)，它被認為是該屬的原型。
-牛副痘病毒2(也稱乳房痘病毒，副牛痘苗病毒，假牛痘病毒或擠奶者結(jié)節(jié)病病毒)。
從駱駝，紅鹿，小羚羊，海豹和海獅分離的副痘病毒代表已被描述。這些病毒是否是副痘病毒屬內(nèi)的獨立的一種或者它們是否是上述種的分離物，尚沒有最終確定。
PPV感染在動物和人類中均可誘發(fā)局部疾病(人獸互傳的病原體)。文獻1提供了迄今已被描述的綜合癥的綜述。諸如疫苗的預(yù)防措施可用于控制疾病。然而，至今可獲得的及唯一根據(jù)Parapoxvirus ovis形成的疫苗的活性還不令人滿意(文獻2)。
本發(fā)明的目的是使用PPV作為表達外源遺傳信息的載體。
已描述了以禽痘病毒，浣熊痘病毒，山羊痘病毒，豬痘病毒或牛痘病毒為基礎(chǔ)的載體作為表達外源遺傳信息的載體。在這一體系中獲得的認識不能轉(zhuǎn)用于PPV。正如比較研究所證實的，在痘病毒不同屬之間存在形態(tài)，結(jié)構(gòu)和遺傳差異。因此，例如，血清學(xué)方法可用于區(qū)分PPV與其它痘病毒屬，一個事實是血清學(xué)方法有助于區(qū)分蛋白質(zhì)類型和區(qū)別與此相關(guān)的遺傳信息。例如，痘病毒的一些代表具有凝集紅細胞的能力。該活性為表面蛋白，即所謂的血細胞凝集素(HA)的方式所介導(dǎo)。PPV不具有該活性。
PPV基因組的組成知識通常局限于測定基因組的大小，核酸的GC含量，比較限制性酶分析，單個基因組片段的克隆，部分區(qū)域的序列分析及相關(guān)的，單個基因的初步描述(作為回顧，見文獻1，文獻5，文獻6)。
使用在牛痘中已知的插入位點通常是不可能的，因為在PPV中要么缺少這些位點，要么未證實這些位點的存在。
與在正痘病毒屬中的情況一樣，在PPV基因組中鑒定胸苷激酶基因并用其作為插入位點的嘗試沒有成功。盡管Mazur及其同事(文獻3)描述了PPV基因組片段的鑒定并聲稱它們類似于牛痘病毒(一種正痘病毒)的胸苷激酶基因，但我們自己的廣泛研究尚不能證實在PPV中存在該基因。其它作者(文獻1)也未能發(fā)現(xiàn)PPV中的胸苷激酶基因。HA基因用作牛痘病毒中外源DNA的插入位點。如上所述，PPV不具有該活性。
在1992年，Robinson和Lyttle提到在PPV基因組中具有可供選擇的插入位點(文獻1)，然而未提供對這些位點的描述或精確鑒定。而且迄今沒有成功應(yīng)用PPV作為載體的任何描述。
在我們自己對PPV病毒D1701株Hind Ⅲ片段I的序列的分析研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個與來自各種哺乳動物種類(例如，小鼠，大鼠，豚鼠，奶牛和人類)的血管肉皮生長因子(VEGF)具有氨基酸同源性(36.1至38.3％的相同性；52.8至58.6％的相似性，GCG,Wisconsin Package 8.1，例如，Programm Pikup)。Seq.ID.No:1顯示了D1701中基因的核苷酸序列，而Seq.ID No:15顯示了相應(yīng)的D1701蛋白質(zhì)的氨基酸序列。最近，已描述了在PPV病毒株NZ2和NZ7中同源基因(文獻6)；然而，該基因的功能是未知的。其它痘病毒，例如，正痘病毒，不知道是有相應(yīng)的基因。在下文中，該基因稱為VEGF基因。
我們對D1701 Hind Ⅲ片段的序列分析導(dǎo)致鑒定了與正痘病毒蛋白質(zhì)激酶基因(其在牛痘中稱為F10L)具有同源性的另一ORF。與牛痘F10L基因的相同性是51％，而相似性是70％。在本申請的下文中，該基因稱為PK基因。Seq.ID.No:2,No:9和No:13顯示了D1701中基因的核苷酸序列的幾種形式，而Seq.ID No:14顯示了相應(yīng)的D1701蛋白質(zhì)的氨基的序列。
已發(fā)現(xiàn)了與PK基因的3′端和VEGF基因的5′端重疊的另一ORF。同源性研究顯示與牛痘中的F9L基因具有較低的相同性(28％)和較低的相似性(51％)。Seq.ID No:15和No:10顯示了D1701中的基因核苷酸序列。在下文中，該基因稱為F9L基因。
在ITR區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)另一ORF，由于其與PPV NZ2中基因的相似性(相同性76％，相似性83％)，被稱為ORF3。Seq.ID No:4顯示了D1701中的基因核苷酸序列。在下文中，該基因稱為ORF3基因。本發(fā)明涉及1．具有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
2．在對病毒復(fù)制為非必需的基因組片段中具有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
3．在為病毒復(fù)制所必需的基因組片段中具有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
4．在不表達的D1701 Hind Ⅲ片段I區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
5．在表達的D1701 Hind Ⅲ片段I區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
6．根據(jù)1至5的重組制備的PPV，其中插入和/或缺失位于D1701Hind Ⅲ片段I中或位于來自其它PPV的相應(yīng)于該片段的DNA中。
7．在VEGF基因區(qū)域或毗鄰該區(qū)域的區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
8．在PK基因區(qū)域或毗鄰該區(qū)域的區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
9．在ITR片段的區(qū)域或毗鄰該區(qū)域的區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
10．在HD1R基因區(qū)域或毗鄰該區(qū)域的區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
11．在F9L基因區(qū)域或毗鄰該區(qū)域的區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
12．在編碼10 KDa蛋白質(zhì)的基因區(qū)域或其鄰近區(qū)域含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
13．在編碼10KDa蛋白質(zhì)的基因位于其中的D1701 Eco RⅠ片段E的區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
14．含有D1701 Hind Ⅲ片段I或其它PPV的相應(yīng)于該片段的DNA的質(zhì)粒。
15．一種質(zhì)粒，它含有來自D1701的Hind Ⅲ片段I，且在該片段中，在為病毒復(fù)制所必需的區(qū)域中含有缺失和/或插入。
16．一種質(zhì)粒，它含有來自D1701的Hind Ⅲ片段I，且在該片段中，在對病毒復(fù)制為非必需的區(qū)域中含有缺失和/或插入。
17．一種質(zhì)粒，它含有來自D1701的Hind Ⅲ片段I，且在該片段中，在對病毒復(fù)制的非必需的且不表達的區(qū)域中含有缺失和/或插入。
18．一種質(zhì)粒，它含有來自D1701的Hind Ⅲ片段I，且在該片段中，在對病毒繁殖的非必需的且位于表達的區(qū)域中含有缺失和/或插入。
19．一種質(zhì)粒，它含有來自D1701的Hind Ⅲ片段I，且在該片段的VEGF基因中或其鄰近區(qū)域含有缺失和/或插入。
20．一種質(zhì)粒，它含有來自D1701的Hind Ⅲ片段I且在該片段的PK基因中或相鄰于該基因含有缺失和/或插入。
21．一種質(zhì)粒，它含有來自D1701的Hind Ⅲ片段I且在該片段的ITR片段中或與其相鄰的片段含有缺失和/或插入。
22．一種質(zhì)粒，它含有來自D1701的Hind Ⅲ片段I，該片段在HD1R基因和/或F9L基因中或與其相鄰的區(qū)域中含有缺失和/或插入。
23．一種質(zhì)粒，它含有來自D1701的Eco RⅠ片段E，該片段在編碼10 KDa蛋白質(zhì)的基因中或相鄰于該基因含有缺失和/或插入。
24．一種質(zhì)粒，它含有來自D1701的Hind Ⅲ片段I的一部分，其中存在根據(jù)14至23的缺失和/或插入。
25．根據(jù)14至24的質(zhì)粒，其中來自D1701的DNA片段被相應(yīng)于該片段的來自于其它PPV的DNA取代。
26．根據(jù)14至25的質(zhì)粒，它含有完整的Hind Ⅲ片段I或只含有其一部分。
27．具有根據(jù)序列表ID No:8或No:12的序列的D1701Hind Ⅲ片段I或其部分或相應(yīng)于該片段的來自其它PPV的片段。
28．D1701 Hind Ⅲ片段I的DNA片段或其部分，或相應(yīng)于該片段的來自其它PPV的片段，或其部分，它編碼根據(jù)序列表IDNo:1的VEGF蛋白質(zhì)。
29．D1701 Hind Ⅲ片段I的DNA片段或其部分，或相應(yīng)于該片段或其部分的來自其它PPV的片段，它編碼根據(jù)序列表IDNo:2,No:9或No:13的PK蛋白質(zhì)。
30．HD1R基因的DNA片段或其部分，具有根據(jù)PPV的序列表IDNo:3的序列。
31．F9L的DNA片段或其部分，具有根據(jù)PPV的序列表IDNo:5或ID No:10的序列。
32．ITR區(qū)域的DNA片段或其部分，具有根據(jù)PPV序列表IDNo:4的序列。
33．以根據(jù)27至32的DNA片段的序列為基礎(chǔ)制備的基因產(chǎn)物。
34．根據(jù)1至13的重組制備的PPV，它含有作為插入的，編碼來自其它病毒原體的致免疫成份的外源DNA。
35．根據(jù)1至13和34的重組制備的PPV，它含有作為插入片段的，編碼細胞因子的外源DNA。
36．制備根據(jù)1至13,34和35的病毒的方法，其特征在于將根據(jù)14至26的質(zhì)粒與PPV以已知的方式在細胞中重組并選擇所需的病毒。
37．制備根據(jù)23的質(zhì)粒的方法，其特征在于1．選擇合適的PPV病毒株，2．純化其基因組，3．用限制性酶處理純化的基因組，4．將所得的片段插入質(zhì)粒中，5．對含有編碼10 KPa蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒進行選擇，且6．如果合適，將插入片段和/或缺失導(dǎo)入編碼10KDa蛋白質(zhì)的基因中，7．4(上文)中所述的片段如果合適，也可使用諸如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或寡核苷酸合成的可供選擇的方法來制備。
38．制備根據(jù)14至22和24至26的質(zhì)粒的方法，其特征在于1．選擇合適的PPV病毒株，2．純化其基因組，3．用限制性酶處理純化的基因組，4．將所得的片段插入質(zhì)粒，和5．對含有Hind Ⅲ片段I或相應(yīng)于該片段的片段或成份的質(zhì)粒進行選擇，6．如果合適，可在所得的質(zhì)粒的這些片段中導(dǎo)入插入和/或缺失。
7．4中所述的片段(上文)如果合適，也可使用諸如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或寡核苷酸合成的可供選擇的方法來制備。
39．制備編碼10KDa蛋白質(zhì)的D1701 Hind Ⅲ片段I或Eco RⅠ片段E，或相應(yīng)于該片段或鏈段的來自其它PPV的區(qū)域或其部分的方法，其特征在于1．選擇合適的PPV病毒株，2．純化其基因組，3．用限制性酶處理純化的基因組，
4．選擇所需的片段或鏈段，或5．如果合適，所得的基因組片段起初插入質(zhì)粒中并分離含有所需片段的質(zhì)粒，然后繁殖這些質(zhì)粒并從中分離所需的片段。
6．4中所述的片段(上文)如果合適，也可使用諸如PCR或寡核苷酸合成的可供選擇的方法來制備。
40．制備根據(jù)33的基因產(chǎn)物的方法，其特征在于，將根據(jù)39可獲得的片段轉(zhuǎn)移進合適的表達系統(tǒng)中且使用這些系統(tǒng)表達基因。
41．根據(jù)1至13的重組制備的PPV在疫苗中的用途。
42．根據(jù)1至13的重組制備的PPV在免疫和刺激非病原體特異性免疫防御的產(chǎn)品中的用途。
43．重組制備的PPV在刺激非病原體特異性免疫防御的免疫調(diào)制劑中的應(yīng)用。
44．重組制備的PPV在異源表達外源DNA中的應(yīng)用。
45．重組制備的PPV作為外源DNA的載體的應(yīng)用。
46．根據(jù)14至16的質(zhì)粒在表達副痘特異性基因組片段中的應(yīng)用。
47．根據(jù)14至26的質(zhì)粒在制備診斷試劑中的應(yīng)用。
48．根據(jù)27至32的基因組片段在制備診斷試劑中的應(yīng)用。
49．根據(jù)序列表ID No:6的DNA片段(VEGF基因的啟動子)。
50．根據(jù)49的DNA片段用作表達DNA的啟動子。
上述PPV的基因組片段可插入質(zhì)?；虿《静⑶铱勺鳛樽杂蒁NA片段存在，它包括給出的DNA序列和其變異體和同源物。
上述備術(shù)語具有下列含義-減毒是指一種過程，其中由于改變了其基因組，PPV已變得對動物或人類具有較小的致病性或無致病性，或具有較小的毒性或無毒性。
-缺失是指從PPV基因組丟失的DNA片段。
-缺失質(zhì)粒是指攜帶除了質(zhì)粒DNA外，已去掉了一些片段的PPV基因組片段的質(zhì)粒。
-對病毒繁殖所必需(必要)的基因組片段是對PPV體外繁殖所必需的整個PPV基因組的一部分，即是對形成感染性病毒后代所必需的。
對病毒復(fù)制所必需的基因的干擾導(dǎo)致病毒復(fù)制被打斷。例如，如果去掉這些基因之一的部分或該完整的基因之一，病毒復(fù)制在病毒復(fù)制周期的某些位點終止。用具有該特性的突變體感染或處理不會導(dǎo)致從動物釋放感染性后代。如果必需基因的部分或整個必需基因被外源DNA取代，或者如果外源DNA被插入必需基因中，則可構(gòu)建在接種個體中不能繁殖且因此不能作為感染性病原體分泌的載體疫苗。
-為病毒復(fù)制所不需要(非必需)的基因組片段是對于PPV的體外復(fù)制，即對于形成感染性病毒后代可省卻的整個PPV基因組的一部分。
-外源性DNA元件(外源DNA)是DNA片段，例如外源性基因或核苷酸序列，它原先在根據(jù)本發(fā)明所用的PPV中不存在。
為下列原因?qū)⑼庠葱訢NA插入PPV中1．為表達外源性DNA2．為使部分PPV DNA的功能失活3．為標記PPV。
根據(jù)這些原因而插入不同的外源性DNA。如果是根據(jù)(1)，表達外源性DNA，那么插入的外源性DNA至少攜帶一個編碼一個或多個所需外源蛋白質(zhì)的開放閱讀框。如果合適，外源DNA另外可含有其自身的或外源調(diào)節(jié)序列。經(jīng)過在病毒基因組中產(chǎn)生缺失可增加接納外源DNA的容量。一般來說，長度為1個核苷酸至35000個核苷酸，優(yōu)選100至大約15,000個核苷酸。
因提及的例子是來自諸如下列病毒的基因，或基因的一部分豬皰疹病毒1，馬皰疹病毒，牛皰疹病毒，口蹄疫病毒，牛呼吸道合胞病毒，牛副流感病毒3，流感病毒杯狀病毒，黃病毒，例如，牛腹瀉病毒或經(jīng)典豬瘟病毒。
或細菌，如巴斯德氏屬種類，沙門氏菌屬種類，放線芽孢桿菌屬種類，衣原體種類，或寄生蟲，如，弓形蟲，惡絲蟲，棘球?qū)佟?br> 如果是根據(jù)(2)插入外源性DNA，合適的外源性核苷酸的插入基本上足以打斷載體病毒的DNA序列。用于插入失活的外源DNA的最大長度取決于載體病毒提納外源DNA的容量。一般來說，外源DNA的長度是1個核苷酸至35,000個核苷酸之間，優(yōu)選100至15,000個核苷酸之間，特別優(yōu)選3至100個核苷酸之間。
如果根據(jù)(3)插入DNA序列用于標記，其長度取決于用于鑒定標記病毒的檢測方法。一般來說，外源DNA的長度是1至25000個核苷酸，優(yōu)選20個核苷酸至15,000個核苷酸，特別優(yōu)選5至100個核苷酸。
-基因文庫是包含在能復(fù)制的載體中的基因組片段的全體。經(jīng)過將基因組片段化并將所有的片段，一些片段或大部分片段插入能復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒中來獲得該文庫。
-基因組片段是能以分離的形式存在或能插入可復(fù)制的載體中的基因組片段。
-插入失活是指插入的外源DNA阻礙了天然PPV基因組序列表達或發(fā)揮功能。
-插入是指另外的DNA片段參入PPV基因組。根據(jù)插入基因，DNA片段的長度可以是1個核苷酸至幾千核苷酸(也見“外源DNA”的定義)。
-插入質(zhì)粒是含有兩側(cè)為PPV DNA序列的待插入的外源DNA的質(zhì)粒，特別是細菌質(zhì)粒。
-插入位點是病毒基因組中適于接受外源DNA的位點。
-克隆是指PPV基因組DNA的分離及片段化。然后將片段或選擇的片段插入常規(guī)DNA載體(細菌質(zhì)?；蛭ňw或真核載體)中。
文獻#11提供了選擇用于制備和克隆DNA片段的方法。使用含有PPV DNA片段作為插入片段的DNA載體，例如，用于制備最初分離的PPV DNA片段的相同拷貝。
-經(jīng)插入標記是指插入的外源性DNA使得能隨后鑒定修飾的PPV。
-ORF(開放閱讀框)理解為限定潛在蛋白質(zhì)的氨基酸序列的DNA水平上的核苷酸的順序。它由許多核苷酸三聯(lián)體組成，在5′端由起始密碼于(ATG),3′端由終止密碼子(TAG,TGA或TAA)限定邊界，三聯(lián)體的數(shù)目由其所限定的蛋白質(zhì)的大小來確定。
-調(diào)節(jié)序列是對基因表達產(chǎn)生影響的DNA序列。具有這一特性的序列從文獻15可知。
優(yōu)選的是序列表ID.No:6所述的VEGF啟動子。
-重組PPV是在其基因組中具有插入和/或缺失的PPV。在這點上，使用分子生物學(xué)方法制備插入和缺失。
-重復(fù)(DNA)序列是在PPV基因組中出現(xiàn)的相同核苷酸序列，它們直接一個接著一個存在或分散在不同的位點。
-載體病毒是PPV，它適合于插入外源DNA且可將在其基因組中的插入的外源DNA運送到感染的細胞或生物體中，如果合適，它能使外源DNA表達。
根據(jù)1至12(上文)的新PPV制備如下1．選擇合適的PPV病毒株。
2．鑒定具有插入位點的PPV基因組中的基因組片段。
2.a．鑒定對病毒復(fù)制非必需的基因中具有插入位點的PPV基因組片段，2.b．鑒定在對病毒復(fù)制必需的基因中具有插入位點的PPV基因組片段，2.c．鑒定在PPV基因組和/或基因復(fù)制的基因之外的區(qū)域中的具有插入位點的基因組片段，2.d．用于鑒定具有插入位點的基因組片段的其它方法，
2.e．在插入位點的要求，2.1．插入位點的鑒定2.1.1．PPV基因組的純化2.1.2．克隆基因組片段和建立基因文庫2.1.3．測序以鑒定基因或基因外的基因組片段2.1.4．選擇含有PPV基因組片段的克隆用于進一步處理2.2．ITR區(qū)域，VEGF基因，PK基因，編碼10KDa蛋白質(zhì)的基因，PK基因和HDIR基因間的區(qū)域作為插入位點2.2.1．克隆VEGF基因2.2.2．克隆蛋白質(zhì)激酶基因2.2.3．克隆編碼10KDa蛋白質(zhì)的基因區(qū)域2.2.4．克隆ITR區(qū)域(顛倒末端重復(fù)區(qū))或位于PK基因和HDIR基因間的基因組片段3．構(gòu)建含有待插入的外源DNA的插入質(zhì)?；蛉笔з|(zhì)粒3.1．鑒定或制備在克隆的基因組片段中只出現(xiàn)一次的限制性酶識別位點，即，單一限制性位點和插入外源DNA3.2．在克隆的基因組片段中缺失基因組序列，和插入外源DNA。
3.3．組合#3.1和#3.24．構(gòu)建根據(jù)1至12(上文)和重組PPV。1．選擇合適的PPV病毒株原則上，所有PPV各類均適合于完成本發(fā)明。優(yōu)選的病毒株能在組織培養(yǎng)物中繁殖到滴度＞105PFV(噬斑形成單位)/ml且能從感染的細胞的培養(yǎng)基中作為細胞外的感染病毒的純化形式制備?？商峒暗淖鳛閮?yōu)選的來自PPV屬兩種類是PPV ovis(口瘡病毒)。
可提及的作為特別優(yōu)選的PPV ovis病毒株是D1701及其變異體和突變體，D1701根據(jù)布達佩斯條約于1988年4月28日以登記號CNCMI-751保藏在巴斯德研究所，C.N.C.M。
在諸如哺乳動物細胞的動物細胞組織培養(yǎng)物以常規(guī)方式繁殖病毒，例如，在羊細胞或牛細胞中，優(yōu)選在中細胞，如永生性牛腎細胞系BK-K1-3A(或其后代)或猴細胞，如永生性猴腎細胞MA104或Vero(或其后代)。
以已知的方式在靜止，旋轉(zhuǎn)或載體培養(yǎng)物中以致密細胞凝聚體的形式或在懸浮培養(yǎng)物中實現(xiàn)繁殖。
用于繁殖病毒的細胞或細胞層以常規(guī)方式繁殖到基本上匯合或達到最佳細胞密度。用相應(yīng)于MOI(=感染復(fù)數(shù)，相應(yīng)于每個細胞的感染病毒顆粒)的病毒稀釋物感染細胞。
加入或不加動物血清繁殖病毒。當(dāng)使用血清時，以1-30vol％，優(yōu)選1-10vol％的濃度加入到繁殖培養(yǎng)基中。
在室溫至40℃，優(yōu)選32至39℃，特別優(yōu)選在37℃的溫度下經(jīng)過幾天，優(yōu)選直到感染的細胞完全被破壞來實現(xiàn)感染和病毒繁殖。收獲病毒時，仍與細胞結(jié)合的病毒可另外經(jīng)機械方法或借助于超聲處理或借助于溫和的酶蛋白水解，例如胰蛋白酶來釋放。
然后，經(jīng)過例如，使用孔經(jīng)為例如0.2-0.45μm進行過濾和/或低速離心去掉細胞碎片來進一步處理來自感染細胞的含病毒的培養(yǎng)基。
濾液離心上清可用于病毒的富集和純化。為此，可對濾液或上清進行高速離心直到病毒顆粒沉淀。如果合適，例如可借助于在密度梯度中離心進行進一步的純化步驟。2．鑒定在PPV基因組中具有插入位點的基因組片段插入外源DNA時，PPV基因組的各種區(qū)域可用作插入位點。外源DNA可插入a．對體外和/或體內(nèi)的病毒繁殖為非必需的基因中，b．對病毒繁殖必需的基因中，和/或c．不具有任何基因功能的區(qū)域中。
2.a．鑒定在對病毒繁殖非必需的基因中具有插入位點的PPV基因的基因組片段?。纾褂貌煌琍PV種類的代表借助于進行比較研究發(fā)現(xiàn)對病毒繁殖非必需的病毒基因。在一種或多種PPV種類分離株或病毒株中不出現(xiàn)而在其它分離株或病毒株中發(fā)現(xiàn)的基因很可能是非必需的。
ⅱ．病毒復(fù)制非必須的基因也可用另一方式來鑒定。測序PPV基因組片段后，其中該片段可能是，例如，作為克隆片段存在，檢查這些DNA序列可能的“開放閱讀框”(ORF)。如果發(fā)現(xiàn)一個ORF，經(jīng)過進行轉(zhuǎn)錄和/或翻譯證實該ORF作為一個基因的功能。為了確定已發(fā)現(xiàn)的基因是否對病毒復(fù)制為非必須的，可使用分子遺傳學(xué)方法從PPV基因組中去掉該基因，或借助于導(dǎo)入一處或多處突變而部分破壞它或打斷它，然后考察所得的病毒的復(fù)制能力。如果即使不存在所加工的基因，病毒也能復(fù)制，則該基因是非必需基因。鑒定的插入位點的例子ⅰ．PPV ovis的VEGF基因是可提及的用作外源DNA插入位點的非必需PPV基因的一個例子。
該基因在已研究的(文獻6)Parapoxvirus:ovis病毒株(NZ-2,NZ-7和D1701)中發(fā)現(xiàn)。在某些PPV病毒株，例如牛PPV1的代表株中尚未發(fā)現(xiàn)該VEGF基因。借助于序列表ID No:1中所示的DNA序列可鑒定在含VEGF基因的PPV基因組中的該區(qū)域?？墒褂梅肿由飳W(xué)的常規(guī)方法借助于雜交實驗，基因組序列分析和/或聚合酶鏈式反應(yīng)發(fā)現(xiàn)PPV基因組中的該基因。
ⅱ．編碼10KDa PPV蛋白的基因是可提及的另一潛在的非必需PPV基因的例子。該基因在Parapoxvirus ovis(NZ-2,NZ-7和D1701)病毒株中發(fā)現(xiàn)。可使用常規(guī)分子生物學(xué)方法鑒定PPV基因組中含10 KDa蛋白南的區(qū)域，例如，借助于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。文獻8給出了10KDa蛋白質(zhì)基因的DNA序列。可用于PCR的引物在，例如文獻#8中限定。序列表ID No:11顯示了來自D1701的10KDa-特異性PCR產(chǎn)物的DNA序列。
為達到插入外源DNA的目的，可從PPV基因組中部分或全部去掉非必需基因。但是，也可不去掉PPV基因的任何區(qū)域而將外源DNA插入非必需基因中。可用例如限制性酶識別位點作為插入位點。
2.b．鑒定在PPV基因組中在必需基因中具有插入位點的PPV基因組片段?。?jīng)過測序病毒基因組片段，例如可作為克隆片段存在的片段可鑒定必需基因，然后鑒定可能的ORF。
如果發(fā)現(xiàn)ORF，經(jīng)過進行轉(zhuǎn)錄和/或翻譯證實其作為基因的功能。為了確定已發(fā)現(xiàn)的基因是否對病毒復(fù)制是必需的，可使用分子遺傳學(xué)方法破壞PPV基因組中的該基因，例如經(jīng)過去掉部分基因，或整個基因、或借助于插入外源DNA，然后考查所得的病毒的繁殖能力。如果所得的病毒突變體不能復(fù)制，則該基因很可能是必需基因。
如果該病毒突變體僅能在互補細胞系上生長，那么這就證實了該基因是必需的。
插入位點的例子PPV D 1701的蛋白質(zhì)激酶基因(PK基因)是可提及的一個例子。PK基因在病毒的繁殖循環(huán)中表達較晚。序列表ID No:2,No:9或No:13所示的DNA序列形式可用于鑒定PPV基因組的PK基因的區(qū)域，例如，借助于雜交實驗，基因組序列分析和/或聚合酶鏈式反應(yīng)。
為了達到插入外源DNA的目的，可從PPV基因組中部分或全部去掉該必需的基因。然而，也可不去掉該PPV基因的區(qū)域而將外源DNA插入必需基因中。
2.c．鑒定PPV基因組中在基因外的區(qū)域和/或在基因重復(fù)區(qū)內(nèi)具有插入位點的基因組片段不編碼功能性基因產(chǎn)物且不具有任何必需調(diào)節(jié)功能的基因組片段(所謂的基因內(nèi)片段)原則上適合于用作外源DNA的插入位點。含重復(fù)序列的區(qū)域特別合適，因為部分區(qū)域的改變可由剩余的序列重復(fù)來補償。存在2個或多個拷貝的基因，也稱基因重復(fù)也歸入這一類。
在ITR區(qū)域或在PPV基因組的重復(fù)片段中的基因在病毒基因組中存在2個拷貝。去掉或改變該基因的一個拷貝并插入外源DNA后，即使這一改變的基因?qū)Σ《緩?fù)制是重要的，也可獲得穩(wěn)定的PPV重組體。第二個，即未改變的基因拷貝可能對于發(fā)揮該基因的功能是足夠的。
?。畬PV基因組的序列分析用于鑒定不編碼基因產(chǎn)物的基因組序列。序列分析后顯示出不是ORF或不顯示病毒特異性轉(zhuǎn)錄且不具有任何調(diào)節(jié)功能的基因組區(qū)域存在潛在的插入位點。具體地說，在這些區(qū)域中的限制性酶裂解位點代表潛在的插入位點。為了檢查是否存在合適的插入位點，可用已知的分子生物學(xué)方法將外源DNA插入潛在的插入位點，然后考察所得的病毒突變體的存活力。如果在可能的插入位點攜帶外源DNA的病毒突變體能繁殖，則所考慮的位點是合適的插入位點。
ⅱ．使用DNA雜交實驗和/或序列分析鑒定重復(fù)序列和重復(fù)基因。在雜交實驗中，來自PPV的克隆或分離的基因組片段用作與PPV DNA片段雜交的探針。與總PPV基因組中一個以上的片段雜交的PPV基因組片段含有一個或多個重復(fù)序列。為了將重復(fù)序列或重復(fù)基因組區(qū)域精確定位到基因組片段上，測定該片段的核苷酸序列。為了確定潛在的插入位點是否是整個PPV基因組中合適的插入位點，必須將外源性DNA插入重復(fù)序列或重復(fù)基因的一個拷貝中且含有插入片段的PPV基因組片段必須摻入病毒基因組中。然后檢查含外源DNA的重組病毒繁殖的能力。如果重組病毒繁殖，則所鑒定的識別位點適合于作為插入位點。插入位點的例子?。鞍踪|(zhì)激酶基因和HD1R基因之間的基因組片段(序列表IDNo:7)是可提及的基因間區(qū)域的一個例子。
ⅱ．ITR區(qū)域(序列表ID No:4)是可提及的重復(fù)序列的一個例子。
ⅲ．潛在的基因“ORF3”(在ITR區(qū)域中)和VEGF基因是可提及的PPV病毒株D1701中重復(fù)基因的例子。雜交研究證實含VEGF基因的區(qū)域已在病毒株D1701中復(fù)制并易位到病毒基因組的另一端，因此存在2個拷貝的VEGF基因。
借助于序列表ID No:4(具有“ORF3”基因的ITR序列)和ID No:7(PK和HD1R基因之間的區(qū)域)的序列，可使用常規(guī)分子生物學(xué)方法，如雜交實驗，基因組序列分析和/或聚合酶鏈式反應(yīng)找到其它PPV中相應(yīng)的基因組區(qū)域。
2.d．鑒定插入位點的其它方法一般來說，對病毒基因組序列的修飾也可用于發(fā)現(xiàn)PPV基因組中可能的插入位點。不阻斷病毒繁殖的核苷酸取代，缺失和/或插入，或其組合的基因組位點構(gòu)成可能的插入位點。為了檢查潛在的插入位點是否是合適的插入位點，可使用已知的分子生物學(xué)方法將外源DNA插入潛在的插入位點并考察所得的病毒突變體的活力。如果病毒重組體能復(fù)制，則所考察的位點是合適的插入位點。
2.1．插入位點的鑒定2.1.1．PPV基因組的純化為達到以分子遺傳學(xué)方法克隆PPV插入位點的目的，首先要純化PPV基因組。從根據(jù)1(上文)制備的病毒分離基因組，然后純化。優(yōu)選經(jīng)過用去污劑和蛋白酶的水溶液處理純化的病毒粒子來提取天然病毒DNA。
可提及的去污劑是陰離子，陽離子，兩性和非離子去污劑。優(yōu)選使用離子去污劑。特別優(yōu)選十二烷基磺酸鈉(月桂烷基磺酸鈉)。
可提及的蛋白酶是在去污劑存在下具有功能的所有蛋白酶，如蛋白酶K和鏈霉素蛋白酶。優(yōu)選可提及的是蛋白酶K。
采用的去污劑濃度為0.1-10vol％，優(yōu)選0.5-3vol％。
采用的蛋白酶濃度為0.01-10mg/ml病毒裂解產(chǎn)物，優(yōu)選0.05-0.5mg/ml病毒裂解產(chǎn)物。
優(yōu)選在DNase抑制劑存在的條件下在水緩沖溶液中進行反應(yīng)。可提及的緩沖物質(zhì)是具強堿性的弱酸鹽，例如，三(羥甲基)氨基甲烷，具有弱堿性的強酸鹽，例如，磷酸二氫鹽或其混合物。
下面的緩沖液系統(tǒng)是優(yōu)選可提及的三(羥甲基)氨基甲烷。
采用的緩沖物質(zhì)或緩沖系統(tǒng)濃度應(yīng)保證pH值為DNA不變性的pH值。優(yōu)選pH值為5-9，特別優(yōu)選6-8.5的pH值，更特別的是優(yōu)選7-8的pH值；具體可提及的是在中性范圍下操作。
DNase抑制劑的例子是0.1-10mM(毫摩爾)濃度的乙二胺四乙酸，優(yōu)選大約1mM。
此后，提取病毒裂解物的親脂成份。諸如酚，氯仿，異戊醇或其混合物的溶劑用作提取劑。優(yōu)選開始使用酚和氯仿/異戊醇的混合物，提取在一步或多步中進行。
分離病毒DNA的其它方法的例子是在CsCl密度梯度中離心病毒裂解物或凝膠電泳(見文獻14)。
核酸的提取在文獻13中描述。
以這種方式提取的DNA優(yōu)選用，例如醇從水溶液中沉淀，優(yōu)選用乙醇或異丙醇，并在加入單價鹽，如堿金屬氯化物或乙酸鹽，優(yōu)選氯化鋰，氯化鈉或乙酸鈉或乙酸鉀(見具體位置引用的文獻)的條件下進行。
2.1.2．基因組片段的克隆現(xiàn)在以這種方式純化的病毒DNA用于制備DNA片段。為此，例如，用限制性酶處理病毒DNA。合適的限制性酶的例子是Eco.RⅠ,BamHⅠ,Hind Ⅲ,和KpnⅠ。另外，可借助于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)合成基因組片段。為此，從已知的病毒基因組序列片段選擇引物，并用例如，Taq聚合酶或Pfu聚合酶體外合成以引物對確定邊界的基因組片段。
限制性消化或PCR所得的DNA片段可用(Sambrock 89)所述的方法克隆進載體系統(tǒng)。例如，根據(jù)在各種情況下待克隆的DNA片段的大小，可獲得為達到該目的的質(zhì)粒載體，λ噬菌體載體或粘粒載體。
2.1.3．測序，鑒定并表征基因，以及證實其表達首先經(jīng)測序分析克隆進載體中的基因組片段。使用不同的限制性酶測插入的DNA片段的圖譜并將合適的亞片段克隆進質(zhì)粒載體中。例如，使用Pharmacia提供的T7測序試劑盒根據(jù)廠家說明實現(xiàn)測序反應(yīng)。為此所需的雙鏈質(zhì)粒DNA優(yōu)選使用PEG方法(Hattori和Sakaki1985)制備。借助于計算機分析(GCG，見上文)鑒定了基因組片段中存在的“開放閱讀框(ORF)”。鑒定的ORF各自的功能信息可借助于比較其序列與數(shù)據(jù)庫中所含的已知功能的其它基因序列來獲得。鑒定的ORF經(jīng)過檢測其在病毒感染的細胞中各自相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄子來進行功能性表征，為此，例如，將AGPC方法(Chomczynski和Sacchi,(20)1987)用于從病毒感染的細胞分離總RNA。然后借助于Northern印跡分析或引物延伸及RNA保護實驗鑒定特異性轉(zhuǎn)錄子和其5′和3′端。作為選擇，可表達由體外鑒定的ORF編碼的病毒蛋白質(zhì)，然后使用表達產(chǎn)物獲得抗血清并使用這些抗血清證實ORF的表達。
為了確定所發(fā)現(xiàn)的基因?qū)Σ《痉敝呈欠袷欠潜匦璧模山柚诨蚱茐幕蚧蛉笔茐脑摶?。在本發(fā)明書中，從PPV基因組中去掉完整的基因或其部分或經(jīng)過插入外源基因序列打斷基因的閱讀框。檢查所得的病毒的繁殖能力。如果即使不存在被破壞的基因病毒也能復(fù)制，那么該基因是非必需基因。
2.1.4．選擇含PPV基因組片段的克隆根據(jù)待制備的重組PPV是(ⅰ)能夠復(fù)制還是(ⅱ)具有復(fù)制缺陷來采用哪一種上述含PPV基因組片段的克隆。
ⅰ．如果待制備的重組PPV不管是插入和/或缺失的PPV均有復(fù)制能力，將對為病毒復(fù)制所非必需或含重復(fù)基因的基因或基因外的基因組區(qū)域的克隆的病毒基因組片段進行進一步加工。
使用病毒突變體試驗待處理的基因或基因組區(qū)域是否是病毒基因組的必需區(qū)域或重復(fù)基因。為此，使用分子生物學(xué)方法失活被考察的PPV中的基因或基因組區(qū)域，例如，經(jīng)過部分或完全缺失所述區(qū)域，檢查病毒突變體的繁殖能力。如果不管所述基因或基因組區(qū)域是否被失活病毒突變體均能繁殖，則所考察的基因或基因組區(qū)域是非必需區(qū)域。
優(yōu)選提供含非必需基因完整形成的PPV的克隆的基因片段。此外，還應(yīng)提供基因或基因組區(qū)域兩端的側(cè)翼病毒基因組區(qū)域。側(cè)翼區(qū)域的長度應(yīng)超過100個堿基對。如果該基因組克隆不可獲得，則可借助于分子生物學(xué)方法從現(xiàn)有基因克隆制備它們。如果克隆的基因組片段還含有該制品所不需要的基因組區(qū)域，則可借助于亞克隆去掉這些區(qū)域。
ⅱ．如果待制備的重組PPV由于插入和/或缺失而喪失了形成感染后代的能力，則可對為病毒繁殖所必需的含基因或基因外基因組區(qū)域的克隆的病毒基因組片段進行進一步加工。
病毒重組體可用于試驗待處理的基因或基因組區(qū)域是否是病毒基因組的必需區(qū)域。為此，使用分子生物學(xué)方法滅活所考察的PPV中的基因或基因組區(qū)域。例如，經(jīng)過部分或完全缺失所述區(qū)域，檢查病毒突變體繁殖的能力。如果由于滅活了所述基因或基因組區(qū)域而使病毒突變體不能繁殖，則所研究的基因或基因組區(qū)域是必需區(qū)域。
優(yōu)選提供含必需基因完整形式的PPV的克隆的基因組片段。此外，在基因或基因組區(qū)域的兩端同樣應(yīng)提供側(cè)翼病毒基因組區(qū)域。側(cè)翼區(qū)域的長度超過100個堿基對。如果該基因組可獲得，則可借助于分子生物學(xué)方法從現(xiàn)存基因組克隆來制備它們。如果克隆的基因組片段含該制品所不需要的其它基因組區(qū)域，則這些區(qū)域可借助于亞克隆來去掉。
2.2．ITR區(qū)域，VEGF基因，PK基因，編碼10KDa蛋白質(zhì)的基因和PK基因與HD1R基因之間的區(qū)域作為插入位點如果ITR區(qū)域，VEGF基因，PK基因，編碼10KDa蛋白質(zhì)的基因或PK基因與HD1R基因之間的基因間區(qū)域用作PPV中的插入位點，則必須分離含有該插入位點的PPV基因組的相應(yīng)區(qū)域。為此，克隆了PPV基因組的相應(yīng)區(qū)域。
2.2.1．克隆VEGF基因編碼VEGF的基因位于PPV基因組上，部分或與其側(cè)翼組片段一起完整地分離該基因。為此，優(yōu)選按照#1繁殖PPV且按照#2.1.1．純化基因組。
a．優(yōu)選借助于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增VEGF基因。為該反應(yīng)所必需的起始序列(引物)來自序列表ID No:1所述的VEGF基因的DNA序列。然后優(yōu)選克隆所得的擴增產(chǎn)物。
b．含VEGF基因及其側(cè)翼基因組片段的區(qū)域優(yōu)選經(jīng)過將PPV基因組片段化并分離和克隆相應(yīng)的基因組片段來獲得。為此，按#2.1.2所述裂解病毒的純化基因組，優(yōu)選使用限制性酶HindⅢ。酶消化后獲得的基因組片段優(yōu)選借助于電泳或色譜方法分離以鑒定攜帶VEGF基因的其側(cè)翼基因組片段的基因組片段。
使用下列文獻所述的標準方法進行瓊脂糖或聚丙烯酰胺中的電泳分離-分子生物學(xué)常規(guī)方法，1987-1988,Wiley-Interscience,1987。
-分子克隆實踐指南，Perbal，第二版，Wiley Interscience,1988。
-分子克隆，loc.cit.
-Virologiche ArbeitsmethodenⅠ病毒學(xué)實踐方法，第Ⅲ卷，Custav Fischer Verlag,1989。
攜帶VEGF基因及其側(cè)翼序列的基因組片段，例如，借助于與確定的核酸探針雜交來鑒定。為此，將分離的基因組片段轉(zhuǎn)移到濾紙上并按照Southern印跡方法與VEGF-特異性的標記的核酸探針雜交。轉(zhuǎn)移基因組片段并雜交的方法可按標準方法，如在分子克隆loc.cit.的“Southern印跡”中所述?？捎米魈结樀墓押塑账峄蚝怂崞慰蓙碜孕蛄斜鞸ep.ID No:1。例如，可借助于Seq.ID.No:1鑒定的Taq Ⅰ亞片段(366 bp)用作雜交探針。
分離并克隆已證實含部分或優(yōu)選含完整的VEGF基因及側(cè)翼基因組片段的基因組片段。合適的基因組片段經(jīng)電泳分離，例如，借助于電洗膠或經(jīng)過使用低熔點瓊脂方法從合適的凝膠區(qū)域分離。
為了克隆VEGF基因，將上面制備的基因組片段插入細菌或真核載體中。開始特別優(yōu)選質(zhì)粒或噬菌體載體。為了插入基因組片段，用限制性酶處理雙鏈質(zhì)?；蚴删w載體DNA分子以產(chǎn)生用于插入的合適的末端。
已知的質(zhì)粒，例如pBR 322及其衍生物，例如pSPT 18/19,pAT153,pACYC184,pUC18119和pSP64165用作質(zhì)粒。
λ噬菌體的已知變異體，如噬菌體λZAP和噬菌體λgt10/11或噬菌體M13mp18/19，例如，用作噬菌體載體。
可使用的限制性酶是已知的，例如，來自基因，92卷，(1989)Elsevier Sciencl Publishers BV Amsterdam。
已用限制性酶處理的質(zhì)?；蚴删w載體與待插入的過剩的DNA片段混合，例如，以大約5∶1的比例混合，此后，用DNA連接酶處理混合物以便將該片段連接到載體上。為了繁殖質(zhì)?；蚴删w，將連接混合物導(dǎo)入原核或真核細胞，優(yōu)選導(dǎo)入細菌(例如，大腸桿菌菌株K12及其衍生物)，然后繁殖后者。
按分子克隆loc.cit.所述轉(zhuǎn)化和選擇細菌。
優(yōu)選借助于雜交實驗，特別優(yōu)選借助于序列分析證實外源DNA的鑒定。如果合適則進行亞克隆。
2.2.2克隆蛋白質(zhì)激酶基因編碼蛋白質(zhì)激酶的基因位于PPV基因組，部分或完整地與其側(cè)翼基因組片段一起分離該基因。
如VEGF基因的克隆中所述，經(jīng)過將PPV基因組片段化(裂解位點，見

圖1)可分離該區(qū)域，優(yōu)選接著克隆該片段并選擇含部分PK基因或優(yōu)選完整的PK基因及其PPV基因組的側(cè)翼DNA序列的片段或克隆?？捎米鱌CR引物或作為雜交探針的DNA分子可來自序列IDNo:1或ID No:9。
如果合適，則進行亞克隆。
2.2.3克隆編碼10KDa蛋白質(zhì)的基因使用對VEGF基因和PK基因詳細所述(上文)的方法將編碼10KDa蛋白質(zhì)的基因定位在PPV基因組上，部分或優(yōu)選完整地與其側(cè)翼PPV基因組序列一起進行分離。
在這種情況下，優(yōu)選借助于PCR和/或克隆和鑒定及選擇合適的克隆獲得含10KDa蛋白質(zhì)或其部分的基因的PPV基因組的區(qū)域。
文獻8提供了可用作PCR引物或作為雜交探針的DNA分子的詳情。如果合適，可進行亞克隆。
2.2.4．克隆位于PK基因和HD1R基因之間的基因片段的顛倒末端重復(fù)區(qū)該研究相應(yīng)于已詳細描述(上文)的VEGF基因的克隆。可用作PCR引物或用作雜交探針以分離合適區(qū)域的DNA分子從序列表IDNo:4(ITR區(qū)域)和No:7(PK基因和HD1R基因之間的區(qū)域)來看是顯而易見的。3．構(gòu)建插入質(zhì)?；蛉笔з|(zhì)粒可用于將外源DNA插入PPV基因組的所謂的插入質(zhì)粒根據(jù)按2部分所述鑒定，定位并克隆的PPV基因組片段來制備。插入質(zhì)粒攜帶待插入PPV的外源DNA，兩側(cè)為PPV基因組片段。為制備插入質(zhì)粒有各種選擇作為例子可提及的如下3.1．鑒定或制備按2.1.4或2.2中所述獲得的克隆的基因組片段中的單一限制性酶識別位點并插入外源DNA僅出現(xiàn)一次，即是單一的限制性裂解位點，例如(見2.1.3)可在測定的PPV核苷酸序列中鑒定。
攜帶新的限制性酶單一裂解位點的經(jīng)合成制備的寡核苷酸可摻入這些單一限制性位點中。
按前面所述繁殖并選擇所得的質(zhì)粒。
另外，可按Jacobs等(文獻12)所述使用PCR將新的單一限制性酶識別位點插入PPV基因組片段中。
已鑒定和/或制備單一限制性酶識別位點用于將外源DNA插入PPV基因組中。
使用已知方法(文獻#11)插入外源DNA。
3.2．缺失克隆的基因組片段中的基因組序列并插入外源DNA亞片段，例如，可從克隆的PPV基因組片段缺失，這經(jīng)過用限制性酶，優(yōu)選具有超過一個，特別是優(yōu)選2個識別位點的限制性酶處理克隆的PPV基因組片段來實現(xiàn)。酶處理后，按上面所述，例如經(jīng)電泳分級分離所得的片段并分離，借助于連接酶處理將合適的片段再次連接起來。繁殖所得的質(zhì)粒并選擇缺失的質(zhì)粒。
另外，PPV基因組片段上的單一限制性酶識別位點用作以核酸內(nèi)切酶，例如酶Bal31雙向降解該片段的起始位點。缺失的大小以酶作用的時期來確定并借助于凝膠電泳來檢查。合成的寡核苷酸按3.1(上文)所述連接到新產(chǎn)生的片段末端上。
外源基因僅以占完整PPV群體較小的百分數(shù)轉(zhuǎn)移進PPV基因組。
因此，需要選擇系統(tǒng)來分離重組PPV與野生型PPV(文獻#Moss)。
優(yōu)選使用gpt選擇系統(tǒng)，它以大腸桿菌脒基-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因為基礎(chǔ)。當(dāng)在真核細胞中表達時，該基因提供對霉酚酸的抗性，它是嘌呤代謝的抑制劑。其在重組載體病毒構(gòu)建中的應(yīng)用已多次被描述(見文獻16和17)。4．構(gòu)建根據(jù)1至12的重組PPV經(jīng)過如下步驟將外源DNA插入PPV基因組a．在合適的宿主細胞中同時轉(zhuǎn)染插入或缺失質(zhì)粒的DNA并用PPV感染，b．在合適的宿主細胞中轉(zhuǎn)染插入或缺失質(zhì)粒的DNA，然后用PPV感染，c．在合適的宿主細胞中感染PPV，然后用插入或缺失質(zhì)粒的DNA轉(zhuǎn)染。
用于適合于該目的的程序的方法是已知的?？墒褂弥T如磷酸鈣技術(shù)，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔的已知方法實現(xiàn)轉(zhuǎn)染(見文獻18)。
1．用PPV感染優(yōu)選允許較好地繁殖病毒并有效轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物，例如，永久性牛腎細胞系BK-K1-3A，用于制備含外源DNA的PPV。
2．插入或缺失質(zhì)粒DNA的制備繁殖以以前所述方法獲得的含插入或缺失質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細胞并以已知方式從細胞中分離質(zhì)粒并進行進一步的轉(zhuǎn)化。例如，借助于在例如CsCl的密度梯度中的等密度離心或借助于在商業(yè)上可獲得的硅質(zhì)顆粒上的親和純化實現(xiàn)純化。
3．轉(zhuǎn)染純化的環(huán)狀或線型質(zhì)粒DNA優(yōu)選用于轉(zhuǎn)染，例如，按2部分(上文)所示實現(xiàn)純化。
4．培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的和感染的細胞使用上述方法培養(yǎng)細胞。當(dāng)出現(xiàn)細胞病理效應(yīng)時，去掉培養(yǎng)基，如果合適，則經(jīng)離心或過濾去掉細胞碎片，如果合適則貯存，也可使用病毒的單一噬斑純化的常規(guī)方法來處理。
制備重組PPV時采用下列方法已生長至匯合的BK-KL-3A細胞用具有以0.001至5，優(yōu)選0.1的MOI(感染復(fù)數(shù))的感染劑量進行感染。2小時后，例如用質(zhì)粒pMT-10的DNA(2-10μg)，使用CaPO4-甘油休克法或使用轉(zhuǎn)染試劑盒根據(jù)廠家說明書(DOSPER,Boehringer-Mannheim)轉(zhuǎn)染感染的細胞。然后在37℃并在5％CO2大氣中用培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細胞培養(yǎng)物3至6天直到致細胞病變效應(yīng)(cpe)或噬斑形成可見。
根據(jù)插入的外源DNA，以下列步驟鑒定重組PPVa．例如，借助于DNA/DNA雜交檢測外源DNA，b．借助于PCR擴增外源DNAc．借助于重組病毒表達外源DNA。
關(guān)于a．為此，從所述病毒中分離該DNA并與至少部分相同于插入的外源DNA的核酸雜交。
已進行單一噬斑純化并被鑒定為重組體的PPV再次試驗外源DNA的存在和/或表達?？色@得穩(wěn)定含有和/或表達外源DNA的重組PPV用于進一步使用。
關(guān)于c．可在蛋白質(zhì)水平上檢測外源DNA的表達，例如，經(jīng)過用病毒感染細胞，然后使用抗外源DNA編碼的蛋白質(zhì)的特異性抗體進行免疫熒光分析，或使用抗外源DNA編碼的蛋白質(zhì)的抗體及使用感染的細胞裂解物進行免疫沉淀或Westem印跡。
經(jīng)過鑒定特異性轉(zhuǎn)錄物可在RNA水平上檢測外源DNA的表達。為此，從病毒感染的細胞分離RNA并與至少部分相同于插入的外源DNA的DNA探針雜交。
實施例下面的實施例描述了適于插入和表達同源和異源基因或其部分的PPV基因組區(qū)域。合適的基因組片段包含在PPV ovis病毒株D1701(及其各自的衍生物)的Hind Ⅲ片段I中(序列表ID No:8和IDNo:12)。
1．克隆Hind Ⅲ片段I用限制性酶Hind Ⅲ裂解純化的病毒DNA后，以瓊脂糖凝膠電泳分離所得的DNA片段，使用Qtaex方法(Qingen)切下，分離并純化大小大約為5.6kbp的片段I。使用標準技術(shù)(Maniatis等)將該DNA片段克隆進載體質(zhì)粒pSPT18(Boehringer,Mannheim)，其中pSPT18已用Hind Ⅲ裂解并用CIP(小牛腸磷酸酶)處理。所得的重組質(zhì)粒pORF-1和pORF-2區(qū)別僅在于插入的方向不同。限制性圖譜的構(gòu)建使其能進行進一步亞克隆，如圖1所示。Southern印跡雜交用于試驗所有的重組質(zhì)粒DNA中限制性酶消化的病毒或質(zhì)粒DNA以檢查其相同性和病毒來源。
2．DNA測序經(jīng)過使用不同重組質(zhì)粒的雙鏈DNA和結(jié)合載體質(zhì)粒pSPT 18的克隆位點兩端的SP 6-特異性和T7特異性引物實現(xiàn)DNA測序。在35S-〔α〕-dATP和T7-DNA聚合酶存在下按廠家(Pharmacia-Biotech)建議實施Sanger的雙脫氧鏈終止法。然后用于測序Hind Ⅲ片段I的兩條鏈。由于病毒DNA插入片段的G+C含量相當(dāng)高(64.78％)。因此7-Deaza-GTP用于分辨測序假象或帶壓縮，如果需要在含甲酰胺的變性聚丙烯酰胺凝膠中分離測序產(chǎn)物。
3．鑒定潛在的基因?qū)λ玫腄NA序列(序列表ID No:8和ID No:12)的計算機輔助分析公開了一些可能的開放閱讀框(ORF)。來自這些ORF的氨基酸序列用于基因同源性研究(例如，GCG程序)。結(jié)果檢測到與下列基因具有明顯的氨基酸同源性(也見圖1)。
3.1．發(fā)現(xiàn)一個ORF與不同哺乳動物種類(例如，小鼠，大鼠，豚鼠，奶牛和人類)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)具有氨基酸同源性(36.1至38.3％相同性；52.8至58.6％相似性)，也與最近在PPV病毒株NZ-2和NZ-7(文獻6)中描述的VEGF基因同源物具有同源性。還未發(fā)現(xiàn)其它痘病毒，如各種正痘病毒具有相應(yīng)的基因同源性。該ORF也稱為VEGF，含有399個核苷酸且編碼含有132個氨基酸的多肽，其計算的分子量為14.77KDa。使用Northarn印跡雜交，RNA保護實驗和引物延伸實現(xiàn)對總的或寡聚(dt)-選擇的RNA進行轉(zhuǎn)錄分析證實VEGF作為早期基因在感染后(p.i.)大約2小時表達。發(fā)現(xiàn)特異性mRNA覆蓋422至425個堿基，它直接從與共有基序的關(guān)鍵區(qū)域表現(xiàn)出100％同源性的序列下游開始，該共有基序?qū)υ缙谂６徊《净虻膯幼邮堑湫偷摹EGF mRNA的3′端定位于，例如，牛痘病毒基因的早期轉(zhuǎn)錄子共同具有的共有序列中。以Northern印跡雜交估測該mRNA的大小為大約500個堿基，表明它具有長度大約為100個堿基的poly(A)片段。
3.2．發(fā)現(xiàn)另一ORF編碼與存在于一些正痘病毒(例如，牛痘病毒，天花病毒或兔纖維瘤病毒)中的相應(yīng)基因具有同源性的有效的蛋白質(zhì)激酶(PK)并且稱為F10L。該基因同源物在PPV病毒株D1701感染循環(huán)的晚期(感染后12至16小時)轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄起始點位于與晚期牛痘病毒基因的已知啟動子表現(xiàn)出高度同源性的區(qū)域下游不遠處。
3.3．發(fā)現(xiàn)的其它可能的ORF至今與已知的基因序列未表現(xiàn)出任何明顯的同源性。其中特別感興趣的是稱為基因HD1R的潛在的基因(圖1)。諸如上面所述的分析證實具有大約1.6kb大小的特異性早期mRNA轉(zhuǎn)錄。
3.4．最后，用計算機發(fā)現(xiàn)了一個與F10L 3′端和VEGF 5′端重疊的ORF(F9L，圖1)。序列比較顯示與牛痘病毒F9L基因具有同源性。
3.5．經(jīng)過與口瘡(orf)病毒株NZ-2和NZ-7的已知DNA序列比較，可將D1701基因組所謂的ITR區(qū)域的起始點定位于Hind Ⅲ片段I的核苷酸位置1611。ITR區(qū)域是在痘病毒基因組末端出現(xiàn)的一個序列區(qū)，它以相反方向同樣存在于基因組的另一端，因此稱為顛倒重復(fù)區(qū)(ITR)(見序列表ID No:4)。序列比較發(fā)現(xiàn)與克隆進pORF-1的D1701 Hind Ⅲ片段I在基因組中的定位實驗吻合。該片段與假定相同的Hind Ⅲ片段H的圖譜在圖2中描述。由此可推斷D1701基因組ITR包含大約2.6kbp。
測定D1701 VEGF mRNA 3′端的實驗揭示至少還有一個病毒特異性RNA在過渡到ITR后以大約40至220 obp的ITR開始。由于與NZ-2具有氨基酸同源性，相應(yīng)的基因稱為ORF3(圖1)。在ORF3 mRNA推斷的5′端前，有一個早期痘病毒啟動子典型的共有序列。至今尚未發(fā)現(xiàn)與其它基因的同源性。
4．將DNA序列導(dǎo)入Hind Ⅲ片段I使用所述的Hind Ⅲ DNA片段(在質(zhì)粒pORF-1和pORF-2中克隆)研究導(dǎo)入同源或異源DNA序列的可能性。在下文中，使用3種不同的策略實現(xiàn)該目的。
構(gòu)建含有在11K牛痘病毒啟動子控制下的來自大腸桿菌的功能性Lac Z基因的質(zhì)粒pGSR用于下列實施例。為達到該目的，分離質(zhì)粒pUCIILZ(見文獻7)的相關(guān)DNA部分并克隆進質(zhì)粒pSPT18。這一功能性11K/LacZ基因組合(下文稱為LacZ表達盒)可經(jīng)過從pGSRZ(圖3)分離3.2kb的SmaⅠ/SalⅠ片段獲得。構(gòu)建選擇表達盒使用圖7所示的質(zhì)粒pGSSRZ(含有在牛痘病毒啟動子P11K控制下的Lac Z基因)，pMT-1(含PPV VEGF啟動子)和pMT5(含大腸桿菌gpt基因)構(gòu)建各種所謂的選擇表達盒。制備代表VEGF啟動子(PVEGF)序列的合成的互補寡核苷酸并插入pSPT18(pMT-1)的SmnⅠ裂解位點。然后經(jīng)過分別借助于Bam HⅠ裂解從p18Z(將pGSRZ的Bam HⅠ片段插入pSPT18獲得)去掉LacZ基因或從pMT-5中去掉gpt基因，然后將其插入pMT-1(圖7)制備質(zhì)粒pMT-2和pMT-4。
借助于PCR從GPT質(zhì)粒pMSG(pharmacia-Biotech)擴增功能性gpt基因，然后借助于所謂的TA克隆按照廠家(Irvitrogen Inc.)說明克隆進載體pCR Ⅱ。
如圖7所示，隨后可構(gòu)建以所示組合和取向在11K啟動子和/或PVEGF控制下分別表達LacZ基因或gpt基因的雙重選擇表達盒。
按照實施例ⅩⅩ(LacZ-VEGF缺失)或YY(基因間的Bal31)，可在合適的限制性酶裂解和分離后將這些選擇表達盒插入所述質(zhì)粒pdv-500后構(gòu)建質(zhì)粒pMT-10,pdN-500具有312bp缺失的PPVD1701 VEGF基因。借助于這一構(gòu)建過程，插入了功能性LacZ和gpt基因來代替經(jīng)缺失去掉的VEG ORF。在瞬時表達試驗后，可證實LacZ基因在PPV D1701-感染的細胞中的活性(未顯示)以便隨后選擇表達gpt和Lac Z的D1701的VEGF缺失突變體。
4.1．插入基因間非編碼區(qū)鑒定或產(chǎn)生位于基因間，非編碼區(qū)的新單一限制性位點。然后這些位點用于插入編碼功能性和可檢測的基因產(chǎn)物(例如，大腸桿菌Lac Z基因)或其部分的外源DNA序列。實施例4.1.1質(zhì)粒pORF-PB(圖1)含有位于蛋白質(zhì)激酶(F10L)和HD1R基因之間的單一NruⅠ裂解位點。用該限制性酶將pORE-PB線性化后，借助于鈍端連接將Lac Z表達盒連接(補齊反應(yīng)后)到其上。例如，用Bgl Ⅰ裂解后選擇含有功能性LacZ基因的重組質(zhì)粒，借助于使用LacZ特異性探針的Southeyn印跡雜交和借助于部分測序LacZ/PPVDNA過渡區(qū)證實正確插入。實施例4.1.2與上面實施例所述相同的研究用于VEGF基因的下游(在BstE Ⅱ位點裂解，圖1)和在ITP區(qū)域潛在的基因ORF 3中(用xbaⅠ部分降解以防止在pSPT 18克隆位點中的xbaⅠ位點裂解)。實施例4.1.3PCR誘變技術(shù)可用于在克隆的PPV DNA片段的任意所需點導(dǎo)入一個新的，單一的限制性位點(見圖10，文獻12)。為達到這一目的，分別使用引物對E1+EV2(PCR A)和EV1+XB(PCR B)分別進行2次PCR反應(yīng)。所有引物含有相同于給定序列位置PPV序列的25個核苷酸。而引物XB構(gòu)成真實的序列，例如圍繞xbaⅠ位點(圖1)，新的Eco RⅠ位點導(dǎo)入引物E1的5′端，新的Eco RⅤ位點導(dǎo)入引物EV1和EV2(它們互相互補)。最初不存在于pORF-1或pORF-2的完整序列中的EcorⅤ位點插入到選擇用于導(dǎo)入Lac Z表達盒的位點。純化從反應(yīng)A和B獲得的PCR產(chǎn)物，變性成單鏈并在復(fù)性條件下混合起來；然后將它們用最后一次PCR反應(yīng)，pPCR C?，F(xiàn)在E1和XB用作引物以便在本實施例中延伸pORF-1的左側(cè)793bp。凝膠分離和純化后，用EcoRT和xbaⅠ裂解反應(yīng)C所得的PCR產(chǎn)物，然后連接到已用Eco RⅠ和xbaⅠ裂解的質(zhì)粒pORF-XBV上。結(jié)果，質(zhì)粒pORF-1EV(圖5)在所需位置含EcoRⅤ限制性位點，然后可將它用于線型化并連接進Lac Z表達盒。
另外，含有限定的堿基變化或單堿基缺失的錯配引物可用于本實施例中所述的方法以便在病毒DNA序列的任何所需位點產(chǎn)生，例如，翻譯終止密碼子或氨基酸缺失。
4.2．沒有缺失的ORE序列的基因內(nèi)插入在僅在選定基因出現(xiàn)一次的限制性位點裂解后將新的或另外的序列導(dǎo)入一個所述ORF的編碼序列中。實施例4.2.1．位于F10L基因同源物右側(cè)部分的單一XcmⅠ位點用于線型化質(zhì)粒pORF-1。將Lac Z表達盒和裂解的pORF-1 DNA使用T4 DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶均變成鈍端，然后連接；然后將感受態(tài)的大腸桿菌細菌(DH2F′)用于轉(zhuǎn)化。使用Lac Z-特異性探針借助于菌落濾膜雜交試驗所得的細菌菌落的陽性重組質(zhì)粒，用限制性酶裂解相應(yīng)的質(zhì)粒DNA。實施例4.2.2VEGF編碼區(qū)含有單個StyⅠ位點，它用于插入Lac Z表達盒，如上所述。4.3．病毒序列的缺失下列實施例描述了編碼區(qū)(基因內(nèi)缺失)和非編碼區(qū)(基因間缺失)的去除實施例4.3.1限制性酶用于除去Hind Ⅲ DNA片段I中的限定部分以便經(jīng)過插入外源基因或這些基因的一部分取代缺失的病毒序列。經(jīng)過用限制性酶NruⅠ裂解質(zhì)粒pORF-PA(在ITR區(qū)域的位點，圖1)實現(xiàn)這點，結(jié)果缺失了396bp的片段。補齊反應(yīng)后，按上文所述連接Lac Z表達盒。圖4顯示了從pORF-PA缺失396bp的片段并插入Lac Z表達盒。圖5和6顯示了以這種方式構(gòu)建的且來自pORF-PA的缺失/插入質(zhì)粒pCE4和pCE9。實施例4.3.2Hind Ⅲ DNA片段中的單個限制性位點用作起點以實現(xiàn)在核酸內(nèi)切酶Bal 31影響下雙向缺失序列，如圖6所示。對于質(zhì)粒pORF-PA和質(zhì)粒pORF-1或pORF-XB分別用酶StyⅠ和XcmⅠ進行限制性降解以分別打開編碼VEGF和蛋白質(zhì)激酶F10L的基因(圖1和6)。加入核酸外切酶Bal31后，每隔2分鐘從反應(yīng)物中取出等分試樣并然后終止反應(yīng)。用例如，限制性酶BglⅠ裂解定時的樣品并隨后進行凝膠電泳，使其能評價以Bal31缺失的DNA片段的大小。然后使用合適的時間點的樣品的混合物借助于補齊反應(yīng)封閉DNA末端。然后雜交組成新的單一SmaⅠ,SalⅠ和Eco RⅤ限制性位點的兩個互補的寡核苷酸并將所得的雙鏈引物分子(稱為Eco RⅤ接頭)連接到鈍端化的Bal31產(chǎn)物上。轉(zhuǎn)化細菌后，分離質(zhì)粒DNA并用Eco RⅤ裂解，Eco RⅤ在PPV Hind Ⅲ片段I的DNA序列中不見有任何識別位點。因此，具有Eco RⅤ位點的每個質(zhì)粒DNA含有插入的接頭序列并隨后用于將鈍端化的Lac Z表達盒連接進新的Eco RⅤ位點。使用單鏈Eco RⅤ接頭和使用合適的LacZ基因特異性引物借助于測序可測定在各所得的重組質(zhì)粒DNA中產(chǎn)生的DNA缺失的精確大小。5．檢測和鑒定其它副痘病毒中的VEGF基因?qū)1701中編碼VEGF的DNA區(qū)域的了解使其可制備特異性DNA探針和PCR引物，用于鑒定在其它副痘病毒株中限制性圖譜有許多區(qū)別的這種基因。為達到這一目的試驗下面的可能性(ⅰ)分離pORF-PA的TagⅠ亞片段(366 bp)作為代表D1701 VEGF基因的中央部分的雜交探針；(ⅱ)使用合適的合成引物擴增完整的VEGFORF并將PCR產(chǎn)物克隆進質(zhì)粒；(ⅲ)含有VEGF基因不同部分的引物用于PCR，其中PPV DNA作為模板，也作為特異性雜交探針。
經(jīng)放射性標記后，這些探針成功地用于與Parqpox ovis，牛副痘病毒1(牛丘疹性口炎；BPS)和牛副痘病毒2(擠奶者結(jié)節(jié)病)的各種分離株和病毒株的基因組DNA進行Southern和斑點印跡雜交。Southern印跡雜交顯示具有限定PPV DNA片段的VEGF-陽性信號，它使得可更詳細地定位各種PPV中的VEGF基因。
另外，可使用相同探針用于比較RNA分析，如Northern印跡雜交，以便試驗潛在的VEGF基因在其它PPV病毒株中的表達。6．D1701重組體的生產(chǎn)用moi(感染復(fù)數(shù))為0.1的感染劑量感染生長到匯合的BK-KL-3A細胞。2小時后，借助于CaPO4-甘油休克方法或使用轉(zhuǎn)染試劑盒(DOSPER,Boehtinger-Mannhein)按照廠家說明用例如，質(zhì)粒pMT-10的DNA(2至10μg)轉(zhuǎn)染感染的細胞。然后用選擇培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基+MPA霉酚酸-黃嘌呤-5％FCS)在37℃下5％CO2的大氣中培養(yǎng)這些細胞培養(yǎng)物3到6天直到致細胞病變效應(yīng)或噬斑形成可見。根據(jù)病毒誘導(dǎo)的致細胞病變效應(yīng)的程度(a)獲得細胞裂解物，制備稀釋系列，在BK-KL-3A細胞上進行噬斑試驗。所加的瓊脂糖培養(yǎng)基混合物含0.3mg/ml Bluo-Gal(GIBCO-BRL生命科學(xué))以鑒定含表達Lac Z，具有MPA抗性的D1701重組子的藍色噬斑。
(b)形成單個噬斑后，加入(a)中所述的瓊脂糖/Bluo Gal混合物。
如下所述采用(a)或(b)獲得的病毒用于感染BK-KL-3A并進行至少2次進一步的噬斑滴定和純化直至獲得100％勻質(zhì)的重組病毒群體。7．VEGF啟動子如3.1章所述，D1701的VEGF基因是早期基因；感染中感染到相對晚期后2至4小時在D1701病毒感染的細胞中大量轉(zhuǎn)錄特異性mRNA。因此，已鑒定的D1701 VEGF啟動子區(qū)域?qū)τ诳刂浦亟MPPV病毒中外源基因或部分這些基因的表達非常有用。含有VEGF啟動子(35至40個核苷酸；序列表ID No:6)的序列可借助于(ⅰ)使用啟動子區(qū)域兩側(cè)的合適引物進行PCR,(ⅱ)亞克隆合適的DNA片段，或(ⅲ)合成作為寡核苷酸的啟動子序列來分離。
將VEGF啟動子連接到感興趣的任意基因或DNA序列上后，所得的基因表達盒可用于根據(jù)前面章節(jié)所述的任意方法來制備重組PPV。8．10KDa基因根據(jù)PPV病毒株NZ-2的10KDa基因的公開的DNA序列(文獻8)建立檢測PPV 10KDa基因的特異性PCR。使用經(jīng)合成制備的引物10K-上游(5′-CAATATGGATGAAAATGACGG-3′)和10K-下游(5′-CAGACGGCAACACAGCG-3′)進行PCR后，在擴增297個堿基對大小的特異性產(chǎn)物中取得了成功。隨后的克隆(TA克隆試劑盒，Invitrogen Inc.)產(chǎn)生了質(zhì)粒pJS-1，它含有作為Eco RⅠ片段的297bp的PCR產(chǎn)物。對pJS-1插入片段的2條DNA鏈的DNA測序證實存在10KDa-特異性序列。根據(jù)這一序列，D1701編碼與NZ-2 PPV病毒株具有93.3％的氨基酸相同性和96.7％的氨基酸相似性的91-個氨基酸的10KDa蛋白質(zhì)。
采用使用放射性標記的pJS-1的Southern印跡雜交定位D1701基因組Eco RⅠ片段E(4.25kbp)中的10KDa基因。因此，作為NZ-2的情況，該基因位于病毒基因組右側(cè)部分且含有Hind Ⅲ片段K和G的裂解位點(圖2)。
含有4.25kbp D1701 EcoRⅠ片段E的質(zhì)粒pDE-E1和pRZ-E1用于制備10KDa基因含插入或缺失(基本上如前所述)的質(zhì)粒。D1701 10KDa基因N端片段(#124-#129，序列ID No:11)中的Hind Ⅲ裂解位點(片段K-G)可用于直接插入外源DNA且用于缺失(見用Bal31雙向消化)10KDa基因。對于后一構(gòu)建體，從質(zhì)粒pDE-E1中去掉第2個Hind Ⅲ裂解位點(載體質(zhì)粒pSPT18的多克隆位點)。為此，用Hind Ⅲ裂解pSPT18 DNA，隨后經(jīng)過用Klenow處理破壞Hind Ⅲ裂解位點并重新連接質(zhì)粒。然后將4.25kbp D1701 EcoRⅠ片段E克隆進新載體質(zhì)粒pSPT18dH的EcoRⅠ限制性位點?，F(xiàn)在所得的質(zhì)粒pRZ-E1(圖8)在10KDa基因中具有單個Hind Ⅲ裂解位點，該位點允許進一步進行簡單的操作。
使用pDE-E1和pJS-1作為放射性標記的探針進行的Southern印跡雜交及PCR研究證實不同的牛副痘病毒1的病毒株的基因組不含任何10KDa特異性序列。這表明10KDa PPV基因是非必需的(Biitter M.等，1996，文獻#10)。參考文獻1．Robinson,A.J.和Lyttle,D,J.1992。
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以硫氰酸胍-酚-氯仿提取分離RNA的單步方法。生物化學(xué)年鑒，162,156-159。ID No:1本申請的序列ID No:1顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701的HindⅢ片段I中的VEGF基因。
其它信息早期啟動子核苷酸50至64，mRNA起點核苷酸78或80mRNA終點核苷酸498至500翻譯起點核苷酸92至94翻譯終點核苷酸488至490ID No:2本申請的序列ID No:2顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701的HindⅢ片段I上的蛋白質(zhì)激酶基因F10L(1型)。
其它信息晚期啟動子核苷酸48至66mRNA起點核苷酸74至78翻譯起點核苷酸94至96翻譯終點核苷酸1738至1740ID No:3本申請的序列ID No:3顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701的HindⅢ片段I上的HDIR基因片段。ID No:4本申請的序列ID No:4顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701的HindⅢ片段I上的ITR區(qū)和在該區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的ORF3基因。
其它信息ITR區(qū)域起點核苷酸7早期啟動子核苷酸18至33ORF3 mRNA起點核苷酸40至41ORF3 mRNA終點核苷酸673至679ORF3翻譯起點核苷酸111至113ORF3翻譯終點核苷酸562至564ID No:5本申請的序列ID No:5顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701的HindⅢ片段I上的F9L基因同源物(1型)。
其它信息起始密碼子核苷酸48至50終止密碼子核苷酸861至863ID No:6本申請的序列ID No:6顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701 HindⅢ片段I上的VEGF啟動子區(qū)。ID No:7本申請的序列ID No:7顯示了位于HD1R和PKF10L基因之間且位于病毒株P(guān)PV D1701的Hind Ⅲ片段I上的基因間區(qū)域。
推斷的HD1R翻譯終點核苷酸25至27，PKF10L翻譯起點核苷酸223至225ID No:8本申請的序列ID No:8顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701的HindⅢ片段I(1型)的完整核苷酸序列。ID No:9本申請的序列ID No:9顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701的HindⅢ片段I上的蛋白質(zhì)激酶F10L基因的2型。
其它信息晚期啟動子核苷酸48至66
RNA起始信號核苷酸72至80mRNA起點核苷酸74至78，翻譯起點核苷酸94至96，翻譯終點核苷酸1585至1588ID No:10本申請的序列ID No:10顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701的HindⅢ片段I上的F9L基因同源物的2型。
其它信息翻譯起點核苷酸50至52翻譯終點核苷酸722至724ID No:11本申請的序列ID No:11顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701 EcoRⅠ片段E上的10KDa基因。
其它信息翻譯起點核苷酸5至7翻譯終點核苷酸275至277ID No:12本申請的序列ID No:12顯示了PPV病毒株D1701的Hind Ⅲ片段I2型的完整核苷酸序列。ID No:13本申請的序列ID No:13顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701的HindⅢ片段I上的蛋白質(zhì)激酶F102基因的3型。
其它信息晚期啟動子核苷酸48至66RNA起始信息核苷酸72至80mRNA起點核苷酸74至78翻譯起點核苷酸94至96翻譯終點核苷酸1585至1588ID No:14序列ID No:14顯示了PPV D1701蛋白質(zhì)激酶F10L同源物的氨基酸序列(從序列ID No:13推斷)。ID No:15序列ID No:15顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701 VEGF同源物的氨基酸序列(從序列ID No:1推斷)。ID No:16序列ID No:16顯示了位于病毒株P(guān)PV D1701 F9L同源物的氨基酸序列(以序列ID No:10推斷)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名BAYER AG(B)街道Bayerwerk(C)城市Leverkusen(E)國家德國(F)郵編(ZIP):D-51368(G)電話0214/3061285(H)電傳0214/303482(ⅱ)發(fā)明名稱含外源DNA的副痘病毒，其制備及其在疫苗中的應(yīng)用(ⅲ)序列數(shù)16(ⅳ)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy disk(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Relense#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度540個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學(xué)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物Parapox ovis(B)病毒株D1701-VEGF基因(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述GGTGCGCTAC CAATTCGCGC GGCCGGCCGC GCTGCGCGCG TAGCCGCGCA AAATGTAAAT 60TATAACGCCC AACTTTTAAG GGTGAGGCGC CATGAAGTTT CTCGTCGGCA TACTGGTAGC 120TGTGTGCTTG CACCAGTATC TGCTGAACGC GGACAGCACG AAAACATGGT CCGAAGTGTT 180TGAAAACAGC GGGTGCAAGC CAAGGCCGAT GGTCTTTCGA GTACACGACG AGCACCCGGA 240GCTAACTTCT CAGCGGTTCA ACCCGCCGTG TGTCACGTTG ATGCGATGCG GCGGGTGCTG 300CAACGACGAG AGCTTAGAAT GCGTCCCCAC GGAAGAGGCA AACGTAACGA TGCAACTCAT 360GGGAGCGTCG GTCTCCGGTG GTAACGGGAT GCAACATCTG AGCTTCGTAG AGCATAAGAA 420ATGCGATTGT AAACCACCAC TCACGACCAC GCCACCGACG ACCACAAGGC CGCCCAGAAG 480ACGCCGCTAG AACTTTTTAT GGACCGCATA TCCAAACGAT GATGCGATCA GGTCATGCGG 540(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1740個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學(xué)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物Parapox ovis(B)病毒株D1701-蛋白質(zhì)激酶基因(1型)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述CGAGTGACTG CCCATCCCGT TGCTGCGCGA CTCGGGACTG CCCTCTGTTT TTCTTTCCCG 60TTTCTTCTTA TTAGGTAGTT GTTGCCCACC TCCATGATCC TCGCACGCGC TGGCGGGCGA 120CCTCGCACGC CCGCGGCGGC CGCGGCGGCC GCCGAGGACG GCAAGAACAG TGATCGCCGG 180AAGCGCAAGC GCAAGACGCC CAACTGCGAA GACGCCGACA ACTCCGACGA CGAGCTAGCG 240CAGACGCCGT GCGACCGCGA GTGGCCGGAC TGTCGCGCGA GCTCGATCAC GAGCTCCGAC 300TCGGTCTCTC TCGGCGACGA GATCTACTTG CGGTACGTAG CCTCGCAGGT GGACTTCGCG 360CAGACCTGGG CCCCGCCGGT GCGGCTGCTG CGCTTCTTCG GGAACTTCTC GAAGGAAACG 420CTCAGCCGCA TGTCGCGGCG CGGGTACGTG AACCGCTCCT ACTTCCAGAT GGCGCACGCG 480CGCTTCTCGC CCACCAACGA CGACATGTAC CACATGGCCA CTGGCGGGTA CGGCATCGTG 540TTCCGCTTCG ACCGCTACGT GGTCAAGTAC GTCTTCGAGC ACCGCAACGG CATGTCCGAG 600ATGGACGCCT CTACGGAGTA CACGGTGCCG CGGTTCCTGC GCAATAACCT CAAGGGCGAC 660GAGCGCGAGT TCGTGGTCTG CGCGCTGGCC ATGGGGCTGA ACTACCGGCT GGGCTTCCTG 720CACTCGCTGT ACCGGCGCGT GCTGCACACG CTGCTGCTGC TCATGCGCGT GGAGGAAGGC 780CAGCGGCCCT CGGTAGAGAT GGCCAAGAAG CCGCTGCTGC GCTGGTTCGA GGCGCGCAAG 840GACAGCGAGT CCTTCGTGCG CCTGGTCTCG TACTTCTACC CCTCGGCCGT GCAGAGCAAC 900GTGAACCTGA TCAACAACTT CCACCACCTG GTGCACTTCT TTGAGCACGA GAAGCGCGCG 960CGGTACGTGT TCGACCGCGG GGCCGTGATC GTGTTCCCTC TGGCGCGCGG GTCCGCGGAC1020TCGATCTCGC CGGAGGCGGC GGCAGCGCTG GGCTTCGCGC CGCACTCGGA GTTCCTCAAG1080TTCGTGTTCC TGCAGATCGC GCTGCTGTAC CTGAAGATAT ACGAGCTCCC GGGCTGCACG1140AACTTCCTGC ACGTGGACCT GAAGCCCGAC AACGTGCTCA TCTTCGACAG CGCGCGCGCT1200CAGCGTGACT GCGGCCGGTG CGACTTTTCG CTTCGAAGAG CCCGTGCGCG CGGCGCTGAA1260CGACTTCGAC TTCGCGCGCG TGGCCACCAT CGAGAACCGC AAGATCGCGG GCAGCGTCCG1320CGTGCCGCAG AACTGGTACT ACGACTTCCA CTTCTTCGCG CACACGCTGC TGCGCGCGTA1380CCCGCACATC GCCGCGGAGG ACCCGGGCTT CCACGCGCTG CTCTCGGAGC TCACGGTCTC1440GTGCTCGCGC GGGACCTGCG ACCGCTTCCG GCTGCGCGTG TCCTCGCCGC ACCCCATCGA1500GCACCTCGCG CGGCTGGTGC GCCGCGACGT CTTCTCCCGC TGGATAAATG CCGCCGCGGA1560CGCCCCCGAC GCCGCACTCT CCTGAGCCCA CGCCCGCGGC GCCGGGCTCG CTGTACGACG1620TCTTCCTCGC GCGCTTCCTG CGCCAGCTGG CCGCGCGCGC GGCGCCGGCC TCGGCCGCCT1680GCGCCGTGCG CGTGGGTGCG GTGCGCGGCC GCCTGCGGAA CTGCGAGCTG GTGGTGCTGA1740(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1080個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學(xué)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)無(ⅵ)原始來源(A)生物Parapox ovis(B)病毒株D1701-HD1R基因區(qū)域(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述AAGCTTGTTG CGCGAGTACG TGGTGACCCG CGCCTACTCG GATCAGACCG AGCCGATCAT60GGACTTGCTC ATCGGCATGG GCGCCGACGT GGACATGCAG GTCGGCGTGT GCCGCACGGC 120GCTGCACGCC TGCCTTACGG GCTTGAACAC GAACCCGTGC ATGATTCGCG CGCTGCTTCG 180GCGCGGCGCC AGCGTGACCG CAAAAGACAC CTACGAGATG ACGCCACTGG CGTGTTGCTG 240AAGTCCGCGA GCGCGACGCC GGAGCTCGTG CGCATCCTCG TGGAAGCAGG CTCCGACGTG 300AGCGCCACCG ACTTCCGCCT CAACGGCATG CTGCACCAGC ACGCAGTCCA CGCGCCCGCG 360CGCGAGCGTC ATGCGCGAGC TCATCCGGCT GGGGTGCAGC CCAGCGGCCA AAAACATGTT 420TGGGAACACG CCGATGCACA TGCTGGCCAT GGAAAGCTCC TGCCGCCGCT CGCTGATCCT 480CCCGCTGCTG GAGGCAGGGC TTTCCGTGAA CGAGGAGAAC CTGCACTACG 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ovis(B)病毒株D1701-VEGF啟動子(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述CCGCGCTGCG CGCGCGTAGC CGCGCAAAAT GTAAATTATA ACGCCCAACT TTTAAGGGTG 60AGGCGCCATG AAGTTTCTCG TCGGCATACT GGTA 94(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度250個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學(xué)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物Parapox ovis(B)病毒株D1701-HD1R和蛋白質(zhì)激酶基因之間的基因間區(qū)域(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述CAAATGCCGC TTAGTTTCCA GCCTTAAAAG GCAAGTGGGA CCCTGCTCGC TGCCCGGCGA 60ACTGGTGGAG CGCGTGCTCG CGACCGTGCC ACTGGCCGAC TTGCGCCGCT CGTGCAGCCG120CCGCGCGCCC GAGTGACTGC CCATCCCGTT GCTGCGCGAC TCGGGACTGC CCTCTGTTTT180TCTTTCCCGT TTCTTCTTAT TAGGTAGTTG TTGCCCACCT CCATGATCCT CGCACGCGCT240GGCGGGCGAC 250(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度5515個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學(xué)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物Parapox ovis(B)病毒株D1701-HindⅢ片段I(1型)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述AAGCTTGTTG CGCGAGTACG TGGTGACCCG CGCCTACTCG GATCAGACCG AGCCGATCAT60GGACTTGCTC ATCGGCATGG GCGCCGACGT GGACATGCAG GTCGGCGTGT GCCGCACGGC 120GCTGCACGCC TGCCTTACGG GCTTGAACAC GAACCCGTGC ATGATTCGCG CGCTGCTTCG 180GCGCGGCGCC 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60Ile Thr Ser Ser Asp Ser Val Ser Leu Gly Asp Glu Ile Tyr Leu Arg65 70 75 80Tyr Val Ala Ser Gln Val Asp Phe Ala Gln Thr Trp Ala Pro Pro Val85 90 95Arg Leu Leu Arg Phe Phe Gly Asn Phe Ser Lys Glu Thr Leu Ser Arg100 105 110Met Ser Arg Arg Gly Tyr Val Asn Arg Ser Tyr Phe Gln Met Ala His115 120 125Ala Arg Phe Ser Pro Thr Asn Asp Asp Met Tyr His Met Ala Thr Gly130 135 140Gly Tyr Gly Ile Val Phe Arg Phe Asp Arg Tyr Val Val Lys Tyr Val145 150 155160Phe Glu His Arg Asn Gly Met Ser Glu Met Asp Ala Ser Thr Glu Tyr165 170 175Thr Val Pro Arg Phe Leu Arg Asn Asn Leu Lys Gly Asp Glu Arg Glu180 185 190Phe Val Val Cys Ala Leu Ala Met Gly Leu Asn Tyr Arg Leu Gly Phe195 200 205Leu His Ser Leu Tyr Arg Arg Val Leu His Thr Leu Leu Leu Leu Met210 215 220Arg Val Glu Glu Gly Gln Arg Pro Ser Val Glu Met Ala Lys Lys Pro225 230 235 240Leu Leu Arg Trp Phe Glu Ala Arg Lys Asp Ser Glu Ser Phe Val Arg245 250 255Leu Val Ser Tyr Phe Tyr Pro Ser Ala Val Gln Ser Asn Val Asn Leu260 265 270Ile Asn Asn Phe His His Leu Val His Phe Phe Glu His Glu Lys Arg275 280 285Ala Arg Tyr Val Phe Asp Arg Gly Ala Val Ile Val Phe Pro Leu Ala290 295 300Arg Gly Ser Ala Asp Ser Ile Ser Pro Glu Ala Ala Ala Ala Leu Gly305 310 315 320Phe Ala Pro His Ser Glu Phe Leu Lys Phe Val Phe Leu Gln Ile Ala325 330 335Leu Leu Tyr Leu Lys Ile Tyr Glu Leu Pro Gly Cys Thr Asn Phe Leu340 345 350His Val Asp Leu Lys Pro Asp Asn Val Leu Ile Phe Asp Ser Ala Arg355 360 365Ala Leu Ser Val Thr Ala Ala Gly Ala Thr Phe Arg Phe Glu Glu Pro370 375 380Val Arg Ala Ala Leu Asn Asp Phe Asp Phe Ala Arg Val Ala Thr Ile385390 395 400Glu Asn Arg Lys Ile Ala Gly Ser Val Arg Val Pro Gln Asn Trp Tyr405 410 415Tyr Asp Phe His Phe Phe Ala His Thr Leu Leu Arg Ala Tyr Pro His420 425 430Ile Ala Ala Glu Asp Pro Gly Phe His Ala Leu Leu Ser Glu Leu Thr435 440 445Val Ser Cys Ser Arg Gly Thr Cys Asp Arg Phe Arg Leu Arg Val Ser450 455 460Ser Pro His Pro Ile Glu His Leu Ala Arg Leu Val Arg Arg Asp Val465 470 475 480Phe Ser Arg Trp Ile Asn Ala Ala Ala Asp Ala Pro Asp Ala Ala Leu485 490 495Ser(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度132氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物Parapox ovis(B)病毒株D1701-VEGF蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:15的序列描述Met Lys Phe Leu Val Gly Ile Leu Val Ala Val Cys Leu His Gln Tyr1 5 10 15Leu Leu Asn Ala Asp Ser Thr Lys Thr Trp Ser Glu Val Phe Glu Asn20 25 30Ser Gly Cys Lys Pro Arg Pro Met Val Phe Arg Val His Asp Glu His35 40 45Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu Met50 55 60Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro Thr65 70 75 80Glu Glu Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Met Gly Ala Ser Val Ser Gly85 90 95Gly Asn Gly Met Gln His Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys Asp100 105 110Cys Lys Pro Pro Leu Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro Pro115 120 125Arg Arg Arg Arg130(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度224氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學(xué)線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)生物Parapox oVis(B)病毒株D1701-蛋白質(zhì)F9L(ⅹⅰ)SEQ ID NO:16的序列描述Met Pro Pro Arg Thr Pro Pro Thr Pro His Ser Pro Glu Pro Thr Pro1 5 10 15Ala Ala Pro Gly Ser Leu Tyr Asp Val Phe Leu Ala Arg Phe Leu Arg20 25 30Gln Leu Ala Ala Arg Ala Ala Pro Ala Ser Ala Ala Cys Ala Val Arg35 40 45Val Gly Ala Val Arg Gly Arg Leu Arg Asn Cys Glu Leu Val Val Leu50 55 60Asn Arg Cys His Ala Asp Ala Ala Gly Ala Leu Ala Leu Ala Ser Ala65 70 75 80Ala Leu Ala Glu Thr Leu Ala Glu Leu Pro Arg Ala Asp Arg Leu Ala85 90 95Val Ala Arg Glu Leu Gly Val Asp Pro Glu His Pro Glu Leu Thr Pro100 105 110Asp Pro Ala Cys Ala Gly Glu Ser Ala Leu Ala Gln Asn Ile Asp Ile115 120 125Gln Thr Leu Asp Leu Gly Asp Cys Gly Asp Pro Lys Gly Arg Arg Leu130 135 140Arg Val Ala Leu Val Asn Ser Gly His Ala Ala Ala Asn Cys Ala Leu145 150 155 160Ala Arg Val Ala Thr Ala Leu Thr Arg Arg Val Pro Ala Ser Arg His165 170 175Gly Leu Ala Glu Gly Gly Thr Pro Pro Trp Thr Leu Leu Leu Ala Val180 185 190Ala Ala Val Thr Val Leu Ser Val Val Ala Val Ser Leu Leu Arg Arg195 200 205Ala Leu Arg Val Arg Tyr Gln Phe Ala Arg Pro Ala Ala Leu Arg Ala210 215 220附圖描述圖1．顯示了質(zhì)粒PORF-1/-2中orfD1701 Hind Ⅲ片段I的物理圖譜。細箭頭表示鑒定的mRNA，而粗箭頭表示ORF。圖2．顯示了D1701基因組上Hind Ⅲ識別位點和在Hind Ⅲ片段I上鑒定的基因以及部分顛倒末端重復(fù)區(qū)的物理圖譜。圖3．顯示了質(zhì)粒pCE4。用NruⅠ裂解后，用LacZ表達盆取代396 bp的片段。圖4．顯示了質(zhì)粒pCE9．其中經(jīng)過用XcmⅠ裂解線型化后插入LacZ表達盒。圖5．如說明書所述圖示了使用PCR產(chǎn)生新的單一裂解位點的策略。圖6．圖示了使用核酸酶Bal 31雙向截短后插入Eco RⅤ接頭和LacZ表達盒。圖7．顯示了制備LacZ/gpt選擇表達盒的策略Pirk牛痘病毒11K啟動子PVEGF:PPV VEGF啟動子Sm:SmaⅠB:Bam H1圖8．圖示了克隆含10 KDa基因的PPV D1701 Eco RⅠ片段E的策略(如說明書所述)。
權(quán)利要求
1．含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
2．在對病毒復(fù)制為非必需的基因組片段中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
3．在為病毒復(fù)制所必需的基因組片段中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
4．在不表達的D1701 Hind Ⅲ片段I區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
5．在表達的D1701 Hind Ⅲ片段I區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
6．根據(jù)權(quán)利要求1至5的重組制備的PPV，其中插入和/或缺失位于D1701 Hind Ⅲ片段I中或位于來自其它PPV的相應(yīng)于該片段的DNA中。
7．在VEGF基因區(qū)域或毗鄰該區(qū)域的區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
8．在PK基因區(qū)域或毗鄰該區(qū)域的區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
9．在ITR片段的區(qū)域或其鄰近區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
10．在HDlR基因區(qū)域或其鄰近區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
11．在F9L基因區(qū)域或其鄰近區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
12．在編碼10 KDa蛋白質(zhì)的基因區(qū)域或其鄰近區(qū)域含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
13．在編碼10 KDa蛋白質(zhì)的基因位于其中的D1701 Eco RⅠ片段E的區(qū)域中含有插入和/或缺失的重組制備的PPV。
14．含有D1701 Hind Ⅲ片段I或來自其它PPV的相應(yīng)于該片段的DNA的質(zhì)粒。
15．一種含有D1701的Hind Ⅲ片段I的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在為病毒復(fù)制所必需的該片段的區(qū)域中含有缺失和/或插入。
16．一種含有D1701的Hind Ⅲ片段I的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在對病毒復(fù)制為非必需的該片段區(qū)域中含有缺失和/或插入。
17．一種含有D1701的Hind Ⅲ片段I的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在對病毒復(fù)制為非必需的且位于不表達的區(qū)域中的片段區(qū)域含有缺失和/或插入。
18．一種含有D1701的Hind Ⅲ片段I的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在對病毒繁殖為非必需的且位于表達區(qū)域中的該片段的區(qū)域中含有缺失和/或插入。
19．一種含有D1701的Hind Ⅲ片段I的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在該片段的VEGF基因中或其鄰近區(qū)域含有缺失和/或插入。
20．一種含有D1701的Hind Ⅲ片段I的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在該片段的PK基因中或相鄰于該基因含有缺失和/或插入。
21．一種含有D1701的Hind Ⅲ片段I的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在該片段的ITR片段中或相鄰于該片段含有缺失和/或插入。
22．一種含有D1701的Hind Ⅲ片段I的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在HD1R基因和/或F9L基因中或與其相鄰的區(qū)域中含有缺失和/或插入。
23．一種含有D1701的Eco RⅠ片段E的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在編碼10KDa蛋白質(zhì)的基因中或相鄰于該基因含有缺失和/或插入。
24．一種含有D1701的部分Hind Ⅲ片段I的質(zhì)粒，其中該部分含有根據(jù)權(quán)利要求14至23的缺失和/或插入。
25．根據(jù)權(quán)利要求14至24的質(zhì)粒，其中D1701的DNA片段被相應(yīng)于該片段的來自于其它PPV的DNA取代。
26．根據(jù)權(quán)利要求14至25的質(zhì)粒，其中含有完整的Hind Ⅲ片段I或只含有其一部分。
27．具有根據(jù)序列表ID No:8的序列的D1701基因組片段HindⅢ片段I或其部分或相應(yīng)于該片段的來自其它PPV的片段。
28．D1701 Hind Ⅲ片段I的DNA片段或其部分，或相應(yīng)于該片段的來自其它PPV的片段，或其部分，它編碼根據(jù)序列表IDNo:1的VEGF蛋白質(zhì)。
29．D1701 Hind Ⅲ片段I的DNA片段或其部分，或相應(yīng)于該片段或其部分的來自其它PPV的片段，它編碼根據(jù)序列表IDNo:2,No:9的PK蛋白質(zhì)。
30．具有根據(jù)序列表ID No:3的序列的PPV基因HD1R的DNA片段或其部分。
31．PPV F9L的DNA片段或其部分，具有根據(jù)序列表ID No:5的序列。
32．PPV ITR區(qū)域的DNA片段或其部分，具有根據(jù)序列表IDNo:4的序列。
33．以根據(jù)權(quán)利要求27至32的DNA片段的序列為基礎(chǔ)制備的基因產(chǎn)物。
34．根據(jù)權(quán)利要求1至13的重組制備的PPV，它含有作為插入片段的，編碼其它病原體致免疫成份的外源DNA。
35．根據(jù)權(quán)利要求1至13和34的重組制備的PPV，它含有作為插入片段的，編碼細胞因子的外源DNA。
36．制備根據(jù)權(quán)利要求1至13,34和35的病毒的方法，其特征在于將根據(jù)權(quán)利要求14至26的質(zhì)粒與PPV以已知的方式在細胞中重組并選擇所需的病毒。
37．制備根據(jù)權(quán)利要求23的質(zhì)粒的方法，其特征在于1．選擇合適的副痘病毒病毒株，2．純化其基因組，3．用限制性酶處理純化的基因組，4．將所得的片段插入質(zhì)粒中，5．對含有編碼10KDa蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒進行選擇，且6．如果合適，將插入片段和/或缺失導(dǎo)入編碼10KDa蛋白質(zhì)的基因中。7．4(上文)中所述的片段如果合適，也可使用諸如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或寡核苷酸合成的可供選擇的方法來制備。
38．制備根據(jù)權(quán)利要求14至22和24至26的質(zhì)粒的方法，其特征在于1．選擇合適的副痘病毒病毒株，2．純化其基因組，3．用限制性酶處理純化的基因組，4．將所得的片段插入質(zhì)粒，和5．對含有編碼Hind Ⅲ片段I或相應(yīng)于該片段的片段或部分的質(zhì)粒進行選擇，6．如果合適，可在所得的質(zhì)粒的這些片段中導(dǎo)入插入和/或缺失。7．4(上文)中所述的片段如果合適，也可使用諸如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或寡核苷酸合成的可供選擇的方法來制備。
39．制備編碼10KDa蛋白質(zhì)的D1701 Hind Ⅲ片段I或D1701Eco RⅠ片段E，或相應(yīng)于該片段或鏈段的來自其它PPV的區(qū)域或其部分的方法，其特征在于1．選擇合適的副痘病毒病毒株，2．純化其基因組，3．用限制性酶處理純化的基因組，4．選擇所需的片段或鏈段，或5．如果合適，所得的基因組片段首先插入質(zhì)粒中，然后分離含有所需片段的質(zhì)粒并繁殖這些質(zhì)粒，從中分離所需的片段。6．4中所述的片段(上文)如果合適，也可使用諸如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或寡核苷酸合成的可供選擇的方法來制備。
40．制備根據(jù)權(quán)利要求33的基因產(chǎn)物的方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求39可獲得的片段轉(zhuǎn)移進合適的表達系統(tǒng)中且使用這些系統(tǒng)表達基因。
41．根據(jù)權(quán)利要求1至13的重組制備的PPV在疫苗中的用途。
42．根據(jù)權(quán)利要求1至13的重組制備的PPV在免疫和刺激非病原體特異性免疫防御的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
43．重組制備的PPV在刺激非病原體特異性免疫防御的免疫調(diào)制劑中的應(yīng)用。
44．重組制備的PPV在異源表達外源DNA中的應(yīng)用。
45．重組制備的PPV作為外源DNA的載體的應(yīng)用。
46．根據(jù)權(quán)利要求14至16的質(zhì)粒用于表達副痘特異性基因組片段的應(yīng)用。
47．根據(jù)權(quán)利要求14至26的質(zhì)粒用于制備診斷試劑的應(yīng)用。
48．根據(jù)權(quán)利要求27至32的基因組片段用于制備診斷試劑的應(yīng)用。
49．根據(jù)序列表ID No:6的DNA片段(VEGF基因的啟動子)。
50．根據(jù)權(quán)利要求49的DNA片段用作表達DNA的啟動子的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組制備的副痘病毒,在其基因組中攜帶缺失或以外源遺傳信息形式的插入片段,且含有遺傳信息,本發(fā)明還涉及該構(gòu)建體的制備及其在疫苗中的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/00GK1217027SQ97194139
公開日1999年5月19日 申請日期1997年2月17日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月28日
發(fā)明者N·施梅爾, W·斯特魯貝, M·比特納, H·J·茲哈 申請人:拜爾公司