專利名稱：犬ob蛋白組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及犬OB蛋白和相關核酸，載體，宿主細胞，產(chǎn)物的制備方法，選擇性結合分子，衍生物，藥物組合物，和診斷學、治療學及美容學方法。
背景技術：
雖然肥胖的分子基礎在很大程度上還屬未知，“OB基因”和編碼蛋白(“OB蛋白”)的確定倒是給機體用以調節(jié)脂肪沉積的機制投去了一抹亮光。張等，《自然》雜志372:425-432(1994)；亦見于，《自然校正》(the Correction at Nature)374:479(1995)。在ob/ob突變小鼠(由于OB基因產(chǎn)物的生產(chǎn)缺陷導致的小鼠肥胖)以及正常的、野生型小鼠的體內，OB蛋白都是有活性的。其生物學活性，從各種作用中間，主要顯示出降低體重的作用。總的來看，Barinaga，“肥胖”蛋白使小鼠變苗條，《科學》269:475-476(1995)。
例如，已知在ob/ob突變小鼠，給予OB蛋白導致血清胰島素水平及血清葡萄糖水平的下降。還已知給予OB蛋白導致機體脂肪的減少。這些已在ob/ob突變小鼠及非肥胖正常小鼠都已觀察到。Pelleymounter等，《科學》269:540-543(1995)；Halaas等，《科學》269:543-546(1995)。還見于Campfield等，《科學》269:546-549(1995)(外周和中央給予微克劑量的OB蛋白導致ob/ob及食物誘導的肥胖小鼠食物攝入和機體重量的下降，但在db/db肥胖小鼠無此現(xiàn)象。)在這些報告中均未觀察到毒性，包括最高劑量。
還有一項治療肥胖動物的不合適的需要，尤其是寵物，肥胖會引起與高血脂水平、動脈斑(artherial plaque)，高膽固醇，及高血壓伴隨而來的心血管問題。而且，Ⅱ型糖尿病也與肥胖相關聯(lián)。所有這些情況皆可在狗身上發(fā)生，尤其是當狗的食譜中蛋白和脂肪的水平不適當時。
另外，尤其是對觀賞狗，把狗喂養(yǎng)得有期望數(shù)量的脂肪，這是受歡迎的，或者說是有利可圖的。
因此這樣一種治療或美容組合物將是合乎需要的它可以讓狗安全有效地服用以減輕體重，減少脂肪，治療高-或低脂血癥(dyslipidemias)或糖尿病。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及犬OB蛋白和相關核酸、載體、宿主細胞，生產(chǎn)方法，相關組合物，制造及其應用的方法。
附圖簡述

圖1顯示的是現(xiàn)有犬OB蛋白氨基酸序列的線圖(上部序列，當有一個引導序列存在時指一個前蛋白)和天然的人OB蛋白(張等，上文)(底也指一個蛋白原(pre-protein))。用1994年9月第8版的威斯康星軟件包(Wisconsin Package)程序手冊(Program Manual for the WisconsinPackage)。遺傳學計算機組，575科學Drive,Madison,Wisconsin,USA其相似性百分率為90.476。嚴格應用氨基酸一致性識別，其一致性百分率在80.952。
圖2顯示的是目前的犬OB蛋白的氨基酸序列的線圖(上部序列，同樣指一個蛋白原)及天然的鼠OB蛋白(張等，上文)(下部，也指一個蛋白原)。用圖1同樣的分析方法，相似性百分率是86.905。嚴格應用氨基酸一致性其百分率為78.571。
圖3顯示的是犬、人、鼠的OB蛋白氨基酸序列和一個共有的氨基酸序列的線圖。列出的共有的序列是基于保守的氨基酸區(qū)域。某點上的氨基酸在不同的種如有不同，則在該點指定最常出現(xiàn)的氨基酸。
發(fā)明詳述本發(fā)明指向犬OB蛋白及相關核酸，載體，宿主細胞，生產(chǎn)方法，有關組合物，和生產(chǎn)及其應用的方法。
蛋白組合物全長犬OB蛋白顯示于Seq.ID.No.1(下面)。引導序列(指Seq.ID.No.1的序號)是-21到-1。成熟蛋白基本上由(指Seq.ID.No.1的序號)1到146組成。而且，此處的犬OB蛋白可以有或缺失+28位(指Seq.ID.No.1成熟蛋白的序號)的谷氨酰胺(“Q”)?？梢杂眉毦磉_N-末端是甲硫氨酰殘基的成熟蛋白另一方面，可以選擇附加其他引導序列以利表達。
這樣，現(xiàn)有的犬OB蛋白可以從如下氨基酸序列中選擇(指Seq.ID.No.1)
(a)-21到146；(b)+1到146；(c)+1到146，有N-末端甲硫氨酸(此處經(jīng)常指“+1到146met-1”)；以及(d)氨基酸序列，屬于上述(a),(b)或(c)的一種(subpart)，在其28位上缺失谷氨酰胺殘基。
這些將在下面得到更充分的闡述，任選地，可將現(xiàn)有的犬OB蛋白與藥學上可接受的稀釋劑，佐劑或載體一起配制。
核酸組合物和方法編碼犬OB蛋白的核酸顯示于Seq.ID.No.2(如下)。本發(fā)明的新核酸序列包括用于確保在原核或真核宿主細胞中表達犬OB蛋白的序列，此犬OG蛋白選自如下氨基酸序列(指Seq.ID.No.1)(a)-21到146；(b)+1到146；(c)+1到146,N-末端為甲硫氨酸；以及(d)來自上述(a),(b)或(c)的氨基酸序列，缺乏編碼28位谷氨酰胺殘基的密碼子(指Seq.ID.No.1)。
核酸可經(jīng)純化和分離，以使期望的編碼區(qū)域可用來生產(chǎn)當前的多肽，例如，為了診斷的目的，下面將進行更充分的闡述。本發(fā)明的DNA序列具體地包括(a)Seq.ID.No.2(如下)的DNA；(b)Seq.ID.No.2(如下)編碼氨基酸1到146的DNA序列部分。還包括編碼犬OB蛋白的等位基因變異形式的DNA序列，諸如編碼28位谷氨酰胺缺失的氨基酸序列及經(jīng)改造的編碼犬OB蛋白的DNA序列的那些形式。這些經(jīng)改造的序列可以很容易地按照Alton等的方法構建而成，方法見PCT申請公開WO83/04053。
編碼當前犬OB蛋白的基因組DNA含有附加的非編碼堿基，或內含子，這些基因組DNA可通過將Seq.ID.No.2顯示的全部或部分cDNA與基因組DNA源，諸如一個犬基因組DNA文庫雜交而獲得。這些基因組DNA將編碼功能性犬OB蛋白，然則，可能用cDNAs更切合實際，因為它僅包含編碼區(qū)域，重組操作就便利了。
當前的核酸序列可包括整合進了按所選擇的非哺乳動物宿主“優(yōu)選”表達的密碼子；提供了限制性核酸內切酶的切割位點，提供了附加的起始、終止和中間DNA序列，以利于和已有表達載體相構建。
而且，還可以制備當前DNAs的反義核酸。此反義核酸可能有利于調節(jié)體內OB蛋白的效應。例如，可以制備一個反義核酸，以有效地使一個細胞產(chǎn)生犬OB蛋白的能力喪失。
如上所述本發(fā)明的DNA序列也是用來當成標記探針以分離編碼OB蛋白的人基因組DNA的合適材料，以及相關蛋白如cDNA及其他哺乳動物物種的基因組序列，此DNA序列在不同的蛋白質合成(如，在昆蟲細胞中)方法中或在遺傳治療中可能有用。本發(fā)明的DNA序列可望有利于發(fā)展轉基因哺乳動物，它可用作“真核”宿主以生產(chǎn)目的產(chǎn)物，及大量生產(chǎn)目的產(chǎn)品。一般情況，參考Palmiter等，《科學》222:809-814(1983)。
栽體和宿主細胞對于本發(fā)明的另一個方面，此處敘述的編碼犬OB蛋白的DNA序列，將提供與目前尚未獲得的某些哺乳動物蛋白氨基酸序列有關的有價值的信息。換句話說，本發(fā)明提供的DNA序列將有利于制造新的、有用的病毒和環(huán)狀質粒DNA載體，新的、有用的轉化和轉染的原核及真核宿主細胞(包括培養(yǎng)的細菌和酵母細胞，及哺乳動物細胞)，及新的、有用的培養(yǎng)能表達犬OB蛋白的宿主細胞生長的方法。
此處提供的DNA(或對應的RNAs)也可用于基因治療，例如，治療其特征在于OB蛋白表達不足的情況，例如肥胖。一般來說，適宜于基因治療的載體(例如被修飾用于基因治療目的的反轉錄病毒或腺病毒載體，純度及藥學特性皆可接受者)可處理成比方說可以送進肺內的形式。這些載體可以整合進編碼當前多肽的核酸，以在所期望的位點表達?；蛑委熤袨榱艘环N目的蛋白，一個載體中可以包含多于一份拮欠的該蛋白的基因。另一方面也可不用載體，以利于在宿主中保持相對恒定的表達。例如，同源重組將有利于整合進宿主基因組。(這可用于生產(chǎn)目的，例如，美國專利號5,272,071及WO91/09955。)核酸可置入一種藥學上可接受的載體中，例如一種脂溶液載體(例如，帶電脂類)，一種脂質體，或多肽載體(例如，多聚賴氨酸)。一篇關于基因治療的綜述文章，此處用作參考文獻，即Verma，科學的美國人，1990(11):68-84。
此處還提供了生產(chǎn)犬OB蛋白的方法。這些生產(chǎn)方法包括在合適條件下培養(yǎng)含有編碼犬OB蛋白DNA的宿主細胞。此處所指的是體外擴增此種宿主細胞的方法。這些宿主細胞可以是真核或原核，也可以包含一個包括此處所提供的犬OB編碼DNA的載體。另一方面，這種含有犬OB蛋白DNA的宿主細胞可能是通過同源重組而得到(見例如，美國專利5,272,071和WO91/09955，如上文所提及的)或通過變通了的其他表達犬OB蛋白的方法而得到者。這樣就可以通過收集而得到所要的犬OB蛋白。任選地，可進一步對此犬OB蛋白作進一步純化或處理，制備所需的制劑。
轉基因動物也許有人想要生產(chǎn)不同的狗，它們的犬OB水平有差異。這可以通過轉基因狗來實現(xiàn)。制備轉基因狗的一個方法是用一個“轉基因”對狗胚胎進行遺傳學操作，典型的“轉基因”包括一個啟動子和一個目的DNA。在這個例子中，目的DNA可從以上列舉的那些當中選取。啟動子可選用組織特異性表達者，例如肝特異性表達。隨后可把此轉基因插入狗胚胎。這可通過微注射或其他方式實現(xiàn)。一個或多個此類胚胎隨后移植到假孕的養(yǎng)母狗體內，胚胎發(fā)育，小狗出生。本領域的技術人員可發(fā)現(xiàn)制備轉基因動物的其他方法。這些轉基因動物可以是犬OB蛋白表達水平升高的，這樣就制成了較苗條的動物，或者是通過例如用缺失的犬OB DNA作為轉基因而“剔除”犬OB表達的轉基因動物。一次可制備一或多個類似動物(例如，多胚植入及多胎)；這些動物可進一步喂養(yǎng)。這樣，此處提供的是已改變了犬OB蛋白表達的轉基因狗。這些改變可稱為犬OB蛋白的數(shù)量(即，上升或下降)或定點表達(即組織特異性表達)。此處還提供這種轉基因動物的后代。
這些動物可用于寵物、觀賞犬、養(yǎng)殖等目的，或用于在體生物學測定。
衍生物，藥物組合物此蛋白也可通過將一或幾個化學部分連到蛋白分子上面制備其衍生物。經(jīng)化學修飾的衍生物可進一步制成經(jīng)下述給藥途徑的制劑動脈內，腹膜內，肌肉內，皮下，靜脈內，口服，鼻吸經(jīng)肺的，局部的或其他的給藥途徑。生物活性蛋白的化學修飾已發(fā)現(xiàn)在特定情況下有額外的好處，例如，提高治療蛋白的穩(wěn)定性和循環(huán)時間，降低免疫原性。見美國專利號4,179,337,Davis等，1979年12月18日授權公告。綜述見Abuchowski等，見藥物酶(Enzymes as Drugs)。(J.S.Holcerberg和J.Roberts編，1981:367-383)。闡述蛋白修飾和融合蛋白的綜述文章是Francis，生長因子聚焦(Focus on Growth Factors)3:4-10(1992年5月)(由Mediscript,Mountview Court,Friern Barnet Lane,LondonN20,OLD,UK發(fā)表)。
用于衍生的化學部分宜于衍生的化學部分可選自多種水溶性聚合物。新選擇的聚合物必須是水溶性的，才使得它所連接的蛋白質在水環(huán)境中不會沉淀，例如在生理環(huán)境中。優(yōu)選地為了制備的終產(chǎn)物可用于治療，此聚合物需是藥學上可接受的。本領域的技術人員基于此聚合物/蛋白質偶合物將用于治療的考慮，將會選擇合適的聚合物，倘如此，也將會考慮最佳劑量，循環(huán)時間，對蛋白降解的抵抗力，及其他問題。對此蛋白而言，其修飾作用的效應將要通過給予此蛋白或其衍生物而搞清楚，給藥是通過所需要的方式(即，通過滲透泵，或者，更優(yōu)選地，通過注射或輸注，或者，舉例來說，更進一步配制成口服的，經(jīng)肺或鼻吸給藥)，同時按此處所述的方法觀察其生物學效應。
水溶性聚合物選自，例如，聚乙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧環(huán)己烷，聚-1,3,6-三氧環(huán)己烷，乙烯/馬來酸酐共聚物，聚氨基酸類(或均聚物或隨機或非隨機共聚物)，以及葡聚糖和聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物，聚氧亞乙基化多元醇類，聚苯乙烯馬來酸酯和聚乙烯醇。聚乙二醇(縮)丙醛由于其在水中的穩(wěn)定性而在制備中有好處。所需要的聚合物的分子量是根據(jù)所需的特征以及聚合物的分支程度通過經(jīng)驗來確定的。
融合蛋白可通過將多聚氨基酸類連接到OB蛋白分子而制備。例如，多聚氨基酸可以是一個栽體蛋白，可用以增加該蛋白的循環(huán)半衰期。為了治療和美容目的，這些多聚氨基酸必須是不產(chǎn)生中和抗原反應，或其他副反應的。這些多聚氨基酸可選自血清白蛋白(如犬血清白蛋白)，一種抗體或其部分(例如一種抗體恒定區(qū)，有時稱為“Fc”)或其他多聚氨基酸。如下所示，多聚氨基酸的連接位點可以是OB蛋白分子的N-末端，或其他地方，也可以是通過一個化學“接頭”部分，例如一個多聚氨基酸連接物連接到OB蛋白。
如此連接的聚合物分子的數(shù)目可以變化，本領域的技術人員可以搞清楚它們對功能的影響?？梢灾谱鲉我谎苌?，也可以用相同或不同的化學分子(例如，聚合物，如不同分子量的聚乙二醇類)進行二、三、四或組合的衍生作用。隨著它們在反應混合物中濃度的變化。聚合物分子與蛋白(或多肽)分子的比例將會變化。一般地，最佳比率(描述反應效率的術語，該情況下沒有過剩的未反應的蛋白或聚合物)取決于諸如以下因素所要求的衍生程度(例如，一價，二，三，等等)，所選擇的聚合物的分子量，聚合物分枝與否，及反應條件。
化學部分連到蛋白上，須考慮到此連接對蛋白功能或抗原性區(qū)域的影響。對本領域的技術人員來說有許多可用的連接方法。此處的參考文獻包括E.g.,EP 0 401 384(將PEG連到G-CSF上)，另見Malik等實驗血液學(Exp.Hematol.)20:1028-1035(1992)(報告以tresyl chloride對GM-CSF PEG化)。舉例來說，一個反應基團，例如，可用一個游離的氨基或羧基基團。那些有游離羧基者可能包括賴氨酸殘基及N-末端氨基酸殘基。那些有游離羧基的可硅包括天冬氨酸殘基；谷氨酸殘基以及C-末端氨基酸殘基。巰基基團也可用作反應性基團。如果需要保留受體結合位點，就要避免所連接的是對受體結合重要的殘基。
可以得到特異性的只對N-末端進行化學修飾的蛋白質。選擇性N-末端化學修飾可通過還原性烷基化作用而實現(xiàn)。通過此作用，可以利用特定蛋白質中不同類型的一位氨基基團(N-末端為lys)的不同反應性來進行衍生作用。在理想的反應條件下，基本上實現(xiàn)了含羧基的聚合物對蛋白質N-末端選擇性的衍生作用。例如，可以利用在某一個pH條件下進行反應時該蛋白的lys殘基的ε-氨基基團與N-末端殘基α-氨基基團的pKa有差異，從而實現(xiàn)對該蛋白N-末端選擇性的聚乙二醇化。通過這種選擇性的衍生作用，就能控制一個水溶性聚合物與蛋白的連接聚合物的連接絕大部分發(fā)生在蛋白的N-末端，而對其他的反應性基團不發(fā)生重要的修飾作用，例如對lys的側鏈氨基基團。用還原性烷基化，水溶性聚合物可以是如上所述的類型。還要有一個單獨的反應性醛基以偶連該蛋白。
為了制備容易，所以在治療上更優(yōu)選N-末端單聚乙二醇化的衍生物，N-末端聚乙二醇化保證了產(chǎn)品的同源性，產(chǎn)品的定性就簡單化了，只和二價、三價或其他的多聚乙二醇化產(chǎn)物有關。由于商業(yè)生產(chǎn)容易，所以用如上的還原法烷基化生產(chǎn)N-末端產(chǎn)品的方法受到歡迎。
藥用組合物本發(fā)明的再一個方面，是使用該蛋白及其衍生物的藥用組合物的方法。這些藥用組合物的給藥方法可以是注射，或口服、經(jīng)肺、鼻劑、經(jīng)皮或其他方式。一般說來，本發(fā)明理解的藥用組合物包括本發(fā)明的有效劑量蛋白或衍生物產(chǎn)品，以及藥學上可接受的稀釋劑，防腐劑，溶劑，乳化劑，佐劑和/或載體。這些組合物包括含有不同緩沖液成分(如，Tris-HCl，乙酸鹽，磷酸鹽)的稀釋液，pH和離子強度；添加劑如去污劑和增溶劑(如，Tween 80,Polysorbate 80)，抗氧化劑(如，抗壞血酸，偏二硫酸鈉)，防腐劑(如硫柳汞，(Thimersol)芐醇)和膨脹劑(如，乳糖，甘露糖醇)，在這些聚合組合物如，聚乳酸，聚乙醇酸等的顆粒制備過程中整合進以上物質，或置入脂質體中。Hylauronicacid也可以用，可能有增加在循環(huán)中維持時間的效應。這些組合物將影響到其物理狀態(tài)，穩(wěn)定性，體內釋放率，以及該蛋白及衍生物的體內清除率。參見，例如，雷明頓藥學科學，18版(1990，麥克出版公司，Easton,PA 18042)1435～1712頁，此處引作參考文獻。組合物可制成水劑，或干粉，例如凍干制劑?？芍踩氲木忈寗┮舱诳紤]，它是經(jīng)皮制劑。
此處考慮應用的是口服固體劑量形式，大體情況在雷明頓藥學科學，1990年18版(麥克出版公司，Easton,PA 18042)第89章中已有敘述，此處引作參考文獻。固體劑量形式包括片劑，膠囊，丸劑，錠劑或糖錠，扁囊劑或團球藥丸。而且，脂質或蛋白包囊也用以按方配制現(xiàn)有組合物(舉例而言，美國專利號4,925,673所報道的蛋白樣小球)。脂質包囊也可以用，脂質小體可由多種聚合物衍生而來(例如，美國專利號5,013,556)。關于治療學上可能的固體劑量形式Marshall,K.已有敘述，見G.S Banker和C.T.Rhodes編輯的《現(xiàn)代藥物學》1979年第10章，此處引作參考文獻?？偟膩碚f，制劑當中要包括該蛋白(或類似物或衍生物)，以及在胃環(huán)境中保護藥物而在腸中使生物活性成分釋放出來的惰性成分。
還需特別關注的是上述衍生蛋白質的口服劑量形式。對蛋白進行化學修飾以使其衍生物能通過口服而有效。一般地，此處所說的化學修飾是將至少一個分子連接到蛋白(或多肽)分子之上，此分子將(a)阻止蛋白降解；及(b)從胃或腸中吸收到血流當中。還希望此蛋白的綜合穩(wěn)定性升高，在機體內的循環(huán)時間增長。此類分子的例子包括聚乙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物。羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis，可溶性聚合物-酶加合物，見“藥用酶”，Hocenberg和Roberts編，Wiley-Interscience，紐約NY,(1981)367-383頁；Newmark等，應用生物化學雜志，1982(4)；185～189。其他可用的聚合物包括聚-1,3-二氧環(huán)己烷和聚-1,3,6-三氧雜環(huán)己烷。
蛋白質(或衍生物)的釋放位點可以是胃，小腸(十二指腸，空腸或回腸)，或大腸。本領域的技術人員可以找到有關配制方法使藥物在胃內不溶解，而在十二指腸或腸的其他地方釋放物質。最好是能使藥物釋放避開胃部環(huán)境的有害影響，或者對蛋白(或衍生物)進行保護，或者使生物活性物質的釋放在胃部環(huán)境之外，例如在腸中。
為了確保對胃環(huán)境的抵抗力，有對至少是pH5.0不可透過的包膜是必須的。用作腸衣的更常規(guī)的惰性材料有例如，偏苯三酸酯酸纖維素(CAT)，苯二甲酸羥丙基甲基纖維素(HPMCP),HPMCP 50,HPMCP 55，聚苯二酸乙酸乙烯酯(PVAP),Eudragit L30D,Aquateric，苯二酸·醋酸纖維素(CAP),Eudragit L,Eudragit S，以及Shellac。這些包衣可被用作混合膜。
包膜或包膜混合物也可用于片劑，這倒并不是為了防護胃環(huán)境。它可包括糖衣，或是使片劑容易吞服的包膜。膜囊可包括一個硬殼(如明膠)以送服干藥即粉劑，對液體藥物，可用軟的明膠外殼。扁囊劑的外殼材料可以是厚的淀粉或其他可食用的紙。對丸劑，錠劑，鑄型片劑或研制片劑，濕性聚集技術可敷應用。
該藥物可包括在這樣的制劑中(將藥物)精制成許多顆粒，細?；蛩幫璩叽缧〉?mm左右。該物質膠囊給藥的配制方法也可以是粉劑，輕微壓縮的栓劑或者甚至是片劑形狀的。該藥物可通過濃縮制備。
染料和調味劑都可以包括在內。例如，該蛋白(或衍生物)可通過配制(如用脂質體或微球包囊化)然后進一步用可食用的產(chǎn)品包衣，如食物或飲料。
可以用惰性材料稀釋或增加藥物的體積。這些稀釋劑可以包括碳水化合物，尤其是甘露糖醇，α-乳糖，無水乳糖，纖維素，蔗糖，修飾的葡聚糖或淀粉。某些無機鹽也可用作填充劑，包括三磷酸鈣，碳酸鎂和氯化鈉。一些市場可買到的稀釋劑如Fast-Flo,Emdex,STA-Rx 1500,Emcompress及Avicell。
治療制劑中可包括崩解劑，制成固體劑量形式。用作崩解劑的物質包括但并不局限于淀粉，此淀粉包括基于淀粉的商品化崩解劑Explotab。淀粉羥乙酸鈉，安伯來特(離子交換樹脂商品名稱)，羧甲基纖維素鈉，超支鏈淀粉(ultramylopectin)，藻酸鈉，白明膠，橙皮，酸性羧甲基纖維素，天然海綿和皂土都可以用。崩解劑的另一種形式是不溶性的陽離子交換樹脂。粉狀樹膠也可用作崩解劑以及粘合劑，這些粉狀樹膠包括瓊脂，梧桐膠或黃蓍膠。海藻酸及其鈉鹽也用作崩解劑。
粘合劑可用以使藥劑粘合在一起形成堅硬的片劑，包括的物質來自天然產(chǎn)物，如阿拉伯樹膠，西黃蓍膠，淀粉和明膠。其他包括甲基纖維素(MC)，乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)兩者均可用于酒精溶液中使藥物顆?；?。
藥物制劑中可以包括抗摩擦劑以防在配制過程中粘連。潤滑油可用作藥物與死墻(die Wall)之間的墊層，這些可以包括在內但也不是必需；硬脂酸包括其鎂鹽和鈣鹽，聚四氟乙烯(PTFE)，液體石蠟，植物油和蜂蠟?？扇苄詽櫥瑒┮部梢杂?，如十二烷基硫酸鈉，十二烷基硫酸鎂，不同分子量的聚乙二醇，Carbowax 4000和6000。
可以加入可能有利于改善藥物配制過程中的流體性質，在濃縮過程中幫助分子重排的助流劑。這些助流劑可能包括淀粉，滑石，熱原硅和水化硅鋁醇鹽(silicoaluminate)。
為了幫助藥物溶解到水環(huán)境中，可以加進表面活性劑用作濕潤劑。表面活性劑可以包括陽離子去污劑如十二烷基硫酸鈉，二辛基磺基琥珀酸鈉或二辛基磺酸鈉?？梢允褂藐庪x子去污劑并可包括氯化芐烷胺或氯化芐烯胺(benzethomium)。潛在的非離子型去污劑可包含在制劑中當作表面活性劑的名單是聚月桂乙二醇400,polyoxyl 40 stearate，聚氧乙烯還原蓖麻油10,50和60，甘油單硬酯酸酯，聚山梨酯40,60,65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可以單獨或者以不同化率混合物的形式置于該蛋白或衍生物的制劑中。
有可能增強該蛋白(或衍生物)吸收的添加劑如脂肪酸油酸，亞油酸和亞麻酸。
控制釋放制劑可能是吸引人的。藥物可以摻入惰性基質，即樹膠，它可通過擴散或滲漏機制使藥物釋放。緩慢降解基質也可以摻入制劑中。此藥物緩慢釋放的另一種形式是通過一種基于Oros治療系統(tǒng)的方法(Alza公司)，即藥物用半透膜封閉，它通過滲透效應使水進入而把藥物從單個小孔中推出。有些腸衣也有延遲釋放效應。
在配制中用到其他包衣。它們包括一系列的糖，這樣糖可用于包衣鍋(pan)。治療劑也可以置于膜包片劑，此種情況所用材料分為兩組。第一組是非腸溶物質，包括甲基纖維素，乙基纖維素，羥乙基纖維素，甲基羥-乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基-甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，providone和聚乙二醇。第二組包含腸溶物質，通常是鄰苯二甲酸酯。
可以用各種材料的混合物來制備最理想的膜包衣。膜包衣可以在一個包衣鍋中制出，或在一個流體化了的拉床中或通過濃縮包衣。
此處同時關注的是由肺給服該蛋白或其衍生物。吸氣時該蛋白(衍生物)被送進哺乳動物的肺中，通過肺上皮基底層進入血流中。(這方面的其他報告包括Adjei等，《藥學研究》7:565-569(1990)；Adjei等，《國際制藥學雜志》63:135-144(1990)(醋酸亮丙縮材)；Braquet等，《心血管藥理學雜志》13(增刊，5):s.143-146(1989)(內皮素-1)；Hubbard等，《內科年鑒》3:206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等，《臨床調查雜志》84:1145-1146(1989)(α1蛋白酶)；Oswein等，“蛋白質的煙霧化作用”，《藥物吸入給服專題研究進展Ⅱ》，Keystone,Colorado,1990年3月(重組人生長激素)；Debs等，《免疫雜志》140:3482-3488(1988)(干擾素-γ和腫瘤壞死因子α)和Platz等；美國專利號5,284,656(粒細胞集落刺激因子)。蛋白(或衍生物)的經(jīng)鼻給服也受到關注。通過其他粘膜轉運而給藥也受到關注。
本領域的技術人員可通過給藥和觀察所期望的治療效果而確定有效劑量。優(yōu)選地，該分子的制劑在0.10μg/kg·day-1和19/kg·day-1之間將產(chǎn)生所期望的治療效果。有效劑量將通過應用診斷工具隨后決定。例如，測量血中(或血漿或血清)OB蛋白數(shù)量的診斷可以被首先采用，以判定OB蛋白的內源性水平。這些診斷工具可以是抗體分折形式，例如抗體三明治分折。內源性OB蛋白的數(shù)量一開始得以定量，基線確定下來。在整個治療過程中；內源性和外源性OB蛋白(也即是說，蛋白，類似物或衍生物，在體內找到的都算，不管是自身產(chǎn)生的還是給服的)的定量一直在持續(xù)，由此決定治療劑量。因此在治療過程中，劑量將變化，開始用的劑量相對較高。直到出現(xiàn)治療效果，而在用較低劑量使治療效果得以保持。
選擇性結合分子本發(fā)明的進一步具體化是選擇性結合分子，如選擇性結合犬OB蛋白的單克隆抗體。早先由Kohler和Milstein在《歐洲免疫學雜志》1976(6):511-519報道的雜交瘤技術已被廣泛用于生產(chǎn)雜交瘤細胞系，以分泌針對許多特異性抗原的高水平的單克隆抗體。也可以制備重組抗體(見Huse等，《科學》1989(246):1275)。這些重組抗體可進一步修飾，例如對補體結合區(qū)進行修飾以增加或改變親和力，或改變這些抗體的恒定區(qū)使之像犬的抗體穩(wěn)定區(qū)。這些抗體可以做成試劑盒可用來做診斷。可用一個診斷試劑盒來測定一個個體內犬OB蛋白的定位和/或數(shù)量。診斷試劑盒，例如一個“三明治”類型的分析試驗，可用以測定一個個體是否有結合犬OB蛋白的受體，或者是否有那種在不同程度上降低了結合能力的受體。如后所述，這些抗體可用犬OB蛋白的免疫原性部分制備，尤其是那些只有犬OB蛋白才有的免疫原性部分。
用法治療．治療應用包括減輕體重，糖尿病的預防或治療，降血脂(治療相關癥狀)，增加瘦體重及增加胰島素敏感性。另外，本組合物可用以制造一或多種藥劑以治療或改善以上諸癥。
減輕體重．本組合物和方法可用以減輕體重。這些已在小鼠模型中證實(參見上述)，給予該OB蛋白導致體重丟失。體重丟失主要是針對多脂肪組織，或脂肪。這些體重丟失可以和伴隨癥狀的治療相關聯(lián)，如下所述，這樣就組成了一個治療應用。另外，如果丟失體重的唯一目的是為了改善外觀，例如對觀賞狗或育種狗，則此處提供的方法也可用于美容學。
糖尿病治療本組合物和方法可用于預防和治療Ⅱ型糖尿病。由于Ⅱ型糖尿病可與肥胖相關，用本發(fā)明減輕體重也可以緩和或阻止糖尿病的發(fā)展。而且，甚至在劑量不足以導致體重丟失的情況下，本組合物也可用以預防或改善糖尿病。
降血脂本組合物和方法可用來調節(jié)血脂水平。最終想的還有一點，當只要求血脂水平降低或要保持降低的血脂水平時，劑量將不足以引起體重下降。這樣，在對肥胖動物的起始治療過程中，劑量將定在體重丟失和伴隨的血脂水平下降剛出現(xiàn)的地方。一旦達到了足夠的體重丟失，將采取的劑量水平要求既要足以防止重新增加體重，還要足以維持期望的血脂水平。這些劑量可以通過經(jīng)驗決定，由于OB蛋白的效應是可逆的。例如Campfield等《科學》269:546-549(1995)547頁。這樣，當一個劑量導致了不希望出現(xiàn)體重下降時出現(xiàn)了體重下降，人們就可以采用較低劑量，以獲得期望的血脂水平，卻仍然保持所期望的體重。
增加瘦體重或胰島素敏感性。最理想的情況是，在只希望增加機體瘦肉質量的時候，此劑量不足以引起體重下降。這樣，在治療一個肥胖人的起始階段，劑量可定在這個地方即體重下降及伴隨的脂肪組織減少/瘦肉增加同時發(fā)生。一旦達到足夠的體重降低，就將給予這樣的劑量足以防止體重回升，也足以保持期望的瘦體重增加(或，防止瘦體重減少)。這些劑量可通過經(jīng)驗確定，因為OB蛋白的效應是可逆的。例如，Campfield等，《科學》269:546～549(1995),547頁。這樣，當一個劑量導致了不希望出現(xiàn)體重下降時出現(xiàn)了體重下降，人們就可以采用一個較低劑量，以達到使瘦體重如所期望的增加而仍然保持期望體重的目的。至于增加一個人對胰島素的敏感性，相似的劑量考慮應在重視之列。瘦體重增加同時體重下降，達到這一點足以使一個人治療糖尿病服用的胰島素(或者，可能的情況下，支鏈淀粉或其他可能的糖尿病治療藥物)的量降低。為了增加整體實力，必須有類似的劑量考慮。瘦體重的增加伴隨著整體實力的增強可以通過不足以導致體重丟失的劑量而達到。其他好處，例如紅血細胞的增多(及血中氧合作用的增強)和骨吸收或骨質疏松癥的減少也將在沒有體重下降的情況下達到。
組合治療．本組合物和方法可以和其他治療方法聯(lián)合應用，例如改變食譜和運動。其他藥物，例如那些對糖尿病治療有用的藥物(例如，胰島素，也可能有支鏈淀粉)，膽固醇和降血壓藥物(例如那些降低血脂水平或其他心血管藥物)，活性增強藥物(例如，苯丙胺)，和食欲遏制劑。這些藥物的服用可以是同時的，也可是依次的。另外，本方法也可以和手術程序聯(lián)合使用，例如用以改善身體的整體外觀的美容手術(例如，脂肪抽吸術或激光手術，用以減輕身體質量的，或植入手術用以增加機體外觀體積的)。心臟手術，例如分流術或其他旨在減輕由脂肪沉積引起血管堵塞而導致的有害癥狀，例如動脈蝕斑，同時應用本組合物和方法可能會使機體得到的益處增加。除去膽結石的方法，例如超聲波和激光技術，也可以在本治療方法之前、之中、之后使用。而且，本方法可在骨折、肌肉損傷的手術或治療之后以及其他治療之后使用，它將有利于瘦肉組織的體積增加。
診斷學此處的犬OB蛋白或核酸可用于診斷的目的。例如，RNAs或DNAs可用于定性或檢測個體內犬OB DNA基因或基因產(chǎn)物的缺陷。例如，一個肥胖的個體可能有一個有缺陷的犬OB基因。該DNAs可用以和來自個體的核酸雜交以檢測類似缺陷，例如通過PCR技術。犬OB蛋白可用于定性個體的犬OB蛋白結合OB受體的能力，或檢測其其他生物學活性。例如，可以準備這樣一個分析試驗以分析OB蛋白改變脂肪代謝的能力，即準備一群表達OB受體的脂肪細胞，并用這些細胞去接觸OB蛋白。脂肪含量的調節(jié)，脂肪的特性或其他特性均可以監(jiān)控。為了診斷，該蛋白或核酸可以和一種檢測標記物相結合，例如放射性同位素，熒光素或化學發(fā)光化合物，或本領域的技術人員能得到的其他標記物。這些核酸可用于組織分布分析(例如，檢測犬OB mRNA轉錄物在不同組織類型中的分布)或用于其他分析的決定OB受體的分布。
氨基酸和DNA序列以下是當前所指的犬OB蛋白和相關DNA的序列表。
對氨基酸序列(Seq.ID No.1)而言，其成熟蛋白的第一個氨基酸在位置+1，是一個纈氨酸(“V”)，是用粗體字所顯示?？梢匀∠龑颍谖恢?1加一個甲硫氨酸殘基，以使在細菌系統(tǒng)中易于表達。另一方面，也可進行其他的N-末端修飾，例如切割氨基酸試劑的識別位點，以利于生產(chǎn)沒有N-末端蛋氨基殘基的蛋白質。例如，可在N-末端包括一個酶識別位點以利生產(chǎn)(縮寫成“1-146met-1”)。另外，也可以生產(chǎn)28位沒有谷氨酰胺的版本。
如上所述，可以改變DNA(Seq.ID.No.2)但不改變編碼的氨基酸序列。這些改變可能是，例如，包括限制位點以使復制和載體插入變得容易，或為了包括在某些系統(tǒng)中優(yōu)先表達的密碼子，例如細菌表達或真核表達。
犬OB蛋白(Seq.ID.No.1)-21 MRCGPLCRFL WLWPYLSCVE AVPIRKVQDD TKTLIKTIVA RINDISHTQS30 VSSKQRVAGL DFIPGLQPVL SLSRMDQTLA IYQQILNSLH SRNVVQISND80 LENLRDLLHL LASSKSCPLP RARGLETFES LGGVLEASLY STEVVALSRL130 QAALQDMLRR LDLSPGC*犬OB蛋白DNA(Seq.ID No.2)1ATGCGTTGTG GACCTCTGTG CCGATTCCTG TGGCTTTGGC CCTATCTGTC51 CTGTGTTGAA GCTGTGCCAA TCCGAAAAGT CCAGGATGAC ACCAAAACCC101 TCATCAAGAC GATTGTCGCC AGGATCAATG ACATTTCACA CACGCAGTCT151 GTCTCCTCCA AACAGAGGGT CGCTGGTCTG GACTTCATTC CTGGGCTCCA201 ACCAGTCCTG AGTTTGTCCA GGATGGACCA GACGTTGGCC ATCTACCAAC251 AGATCCTCAA CAGTCTGCAT TCCAGAAATG TGGTCCAAAT ATCTAATGAC301 CTGGAGAACC TCCGGGACCT TCTCCACCTG CTGGCCTCCT CCAAGAGCTG351 CCCCTTGCCC CGGGCCAGGG GCCTGGAGAC CTTTGAGAGC CTGGGCGGCG401 TCCTGGAAGC CTCACTCTAC TCCACAGAGG TGGTGGCTCT GAGCAGACTG451 CAGGCGGCCC TCCAGGACAT GCTTCGGCGG CTGGACCTCA GCCCTGGGTG501 CTGA雖然本發(fā)明已經(jīng)用優(yōu)選的實施方案進行了敘述，容易理解本領域的技術人員可以進行變通和修飾。因此，可以認為所附的權利要求涵蓋了本發(fā)明范圍內的所有等價變異形式。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人AMGEN INC.
(ⅱ)發(fā)明題目犬OB蛋白組合物和方法(ⅲ)序列數(shù)10(ⅳ)通信地址(A)收信人Amgen Inc.
(B)街道1840 Dehavilland Drive(C)城市千橡樹(D)州加里弗尼亞(E)國家美國(F)郵區(qū)91320(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM兼容性個人計算機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(ⅷ)代理人/代理機構信息(A)姓名Pessin,Karol M.
(C)參考號/文檔號A-387(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度167氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單一(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Met Arg Cys Gly Pro Leu cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu1 5 10 15Ser Cys Val Glu Ala Val Pro Ile Arg Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys20 25 30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Ala Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr35 40 45Gln Ser Va1 Ser Ser Lys Gln Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe Ile Pro50 55 60Gly Leu Gln Pro Val Leu Ser Leu Ser Arg Met Asp Gln Thr Leu Ala65 70 75 80Ile Tyr Gln Gln Ile Leu Asn Ser Leu His Ser Arg Asn Val Val Gln85 90 95Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala100 105 110Ser Ser Lys Ser Cys Pro Leu Pro Arg Ala Arg Gly Leu Glu Thr Phe115 120 125Glu Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val130 135 140Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Ala Ala Leu Gln Asp Met Leu Arg Arg145 150 155 160Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys165(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度504堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單一(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:ATGCGTTGTG GACCTCTGTG CCGATTCCTG TGGCTTTGGC CCTATCTGTC CTGTGTTGAA 60GCTGTGCCAA TCCGAAAAGT CCAGGATGAC ACCAAAACCC TCATCAAGAC GATTGTCGCC 120AGGATCAATG ACATTTCACA CACGCAGTCT GTCTCCTCCA AACAGAGGGT CGCTGGTCTG 180GACTTCATTC CTGGGCTCCA ACCAGTCCTG AGTTTGTCCA GGATGGACCA GACGTTGGCC 240ATCTACCAAC AGATCCTCAA CAGTCTGCAT TCCAGAAATG TGGTCCAAAT ATCTAATGAC 300CTGGAGAACC TCCGGGACCT TCTCCACCTG CTGGCCTCCT CCAAGAGCTG CCCCTTGCCC 360CGGGCCAGGG GCCTGGAGAC CTTTGAGAGC CTGGGCGGCG TCCTGGAAGC CTCACTCTAC 420TCCACAGAGG TGGTGGCTCT GAGCAGACTG CAGGCGGCCC TCCAGGACAT GCTTCGGCGG 480CTGGACCTCA GCCCTGGGTG CTGA 504(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度167氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單一(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Met Arg Cys Gly Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu1 5 10 15Ser Cys Val Glu Ala Val Pro Ile Arg Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys20 25 30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Ala Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr35 40 45Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe lle Pro50 55 60Gly Leu Gln Pro Val Leu Ser Leu Ser Arg Met Asp Gln Thr Leu Ala65 70 75 80Ile Tyr Gln Gln Ile Leu Asn Ser Leu His Ser Arg Asn Val Val Gln85 90 95Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala100 105 110Ser Ser Lys Ser Cys Pro Leu Pro Arg Ala Arg Gly Leu Glu Thr Phe115 120 125Glu Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val130 135 140Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Ala Ala Leu Gln Asp Met Leu Arg Arg145 150 155 160Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys165(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度167氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單一(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu1 5 10 15Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys20 25 30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr35 40 45Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro50 55 60Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala65 70 75 80Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln85 90 95Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala100 105 110Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu115 120 125Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val130 135 140Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Mer Leu Trp Gln145 150 155 160Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys165
(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度167氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單一(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Met Arg Cys Gly Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu1 5 10 15Ser Cys Val Glu Ala Val Pro Ile Arg Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys20 25 30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Ala Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr35 40 45Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe Ile Pro50 55 60Gly Leu Gln Pro Val Leu Ser Leu Ser Arg Met Asp Gln Thr Leu Ala65 70 75 80Ile Tyr Gln Gln Ile Leu Asn Ser Leu His Ser Arg Asn Val Val Gln85 90 95Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala100 105 110Ser Ser Lys Ser Cys Pro Leu Pro Arg Ala Arg Gly Leu Glu Thr Phe115 120 125Glu Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val130 135 140Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Ala Ala Leu Gln Asp Met Leu Arg Arg145 150 155 160Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys165
(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度167氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單一(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu1 5 10 15Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys20 25 30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr35 40 45Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro50 55 60Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala65 70 75 80Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln85 90 95Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala100 105 110Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro115 120 125Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val130 135 140Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln145 150 155 160Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys165
(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度167氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單一(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Met Arg Cys Gly Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu1 5 10 15Ser Cys Val Glu Ala Val Pro Ile Arg Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys20 25 30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Ala Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr35 40 45Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Arg Val Ala Gly Leu Asp Phe Ile Pro50 55 60Gly Leu Gln Pro Val Leu Ser Leu Ser Arg Met Asp Gln Thr Leu Ala65 70 75 80Ile Tyr Gln Gln Ile Leu Asn Ser Leu His Ser Arg Asn Val Val Gln85 90 95Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala100 105 110Ser Ser Lys Ser Cys Pro Leu Pro Arg Ala Arg Gly Leu Glu Thr Phe115 120 125Glu Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val130 135 140Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Ala Ala Leu Gln Asp Met Leu Arg Arg145 150 155 160Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys165
(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度167氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單一(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu1 5 10 15Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys20 25 30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr35 40 45Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro50 55 60Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala65 70 75 80Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln85 90 95Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala100 105 110Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu115 120 125Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val130 135 140Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln145 150 155 160Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys165
(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度167氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單一(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu1 5 10 15Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys20 25 30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr35 40 45Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro50 55 60Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala65 70 75 80Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln85 90 95Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala100 105 110Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro115 120 125Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val130 135 140Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln145 150 155 160Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys165
(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度167氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單一(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Met Xaa Trp Gly Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu1 5 10 15Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys20 25 30Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr35 40 45Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro50 55 60Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala65 70 75 80Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Leu Pro Ser Arg Asn Val Xaa Gln85 90 95Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala100 105 110Phe Ser Lys Ser Cys Xaa Leu Pro Xaa Ala Ser Gly Leu Glu Thr Xaa115 120 125Glu Sar Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val130 135 140Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Xaa Gln145 150 155 160Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys16權利要求
1．一種選自下述氨基酸(根據(jù)Seq.ID.No.1的編號)的犬OB蛋白(a)-21到146；(b)+1到146；(c)+1到146met-1；以及(d)上述(a)，(b)，或(c)中的任何一種，在28位缺失谷氨酰胺殘基的一種犬OB蛋白；可任選地存在于一種藥學上可接受的稀釋劑、佐劑或載體中。
2．純化和分離的DNA，編碼選自下述氨基酸(根據(jù)Seq.ID.No.1的編號)的一種犬OB蛋白(a)-21到146；(b)+1到146；以及(c)+1到146met-1。(d)上述(a)，(b)，或(c)中任何一種，在28位上缺乏一個谷氨酰胺殘基。
3．權利要求2的DNA，其為cDNA。
4．權利要求2的DNA，其為基因組DNA。
5．權利要求2的DNA，選自(根據(jù)Seq.ID.No.2)(a)Seq.ID.No.2編碼犬OB蛋白-22到+146的部分(根據(jù)Seq.ID.No.1)；(b)Seq.ID.No.2編碼犬OB蛋白+1到+146的部分(根據(jù)Seq.ID.No.1)；(c)還編碼-1位met殘基的(b)部分的DNA；以及(d)上述(a),(b)或(c)部分的任一DNA，缺乏編碼Seq.ID.No.1中28位谷氨酰胺的密碼子。
6．包含權利要求2,3,4或5中任何一種DNA的載體。
7．一種真核或原核宿主細胞，含有權利要求2,3,4或5的DNA，或含有包含權利要求2,3,4或5的DNA的載體。
8．一種生產(chǎn)犬OB蛋白的方法，包括在合適的條件下，培養(yǎng)原核或真核宿主細胞群體并得到所產(chǎn)生的犬OB蛋白產(chǎn)物，該宿主細胞包含了權利要求2,3,4中的任何一種DNA，或包含了帶有權利要求2,3,4或5中的任何一種DNA的載體。
9．一種選擇性結合分子，它選擇性地結合犬OB蛋白。
10．一種單克隆抗體，它選擇性地結合犬OB蛋白。
11．一種包含選擇性結合分子的試劑盒，該分子選擇性結合犬OB蛋白。
12．一種治療狗的方法，包括施用權利要求1的治療有效量的犬OB蛋白。
13．權利要求12的方法，其中所說的狗是要治療肥胖，Ⅱ型糖尿病，升高的血脂水平，或者是為了增加瘦體重。
14．一種具有改變了的犬OB蛋白表達的轉基因狗。
全文摘要
所提供的是犬OB蛋白和相關組合物及方法。還提供了犬OB氨基酸序列,相關的核酸序列,載體,宿主細胞,生產(chǎn)重組產(chǎn)物的方法,相關的抗體和/或診斷組合物,藥用組合物,及轉基因動物。
文檔編號A61K38/00GK1217023SQ97194312
公開日1999年5月19日 申請日期1997年2月28日 優(yōu)先權日1996年3月1日
發(fā)明者N·赫爾恩戴 申請人:安姆根有限公司