專利名稱：勃克明斯特富勒烯在治療神經(jīng)毒性損傷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及式Ⅰ的羧化衍生物C60(C(COOH)2)nⅠ其中C60是勃克明斯特富勒烯，n是1～4。
勃克明斯特富勒烯，即C60，是一種具有交替5碳環(huán)和6碳環(huán)的碳球；30個碳雙鍵容易與氧自由基反應(yīng)(科學(xué)(Science)259,1183-1185,1991)，所以可充當(dāng)自由基清除劑。然而，C60本身只能溶于有限的幾種溶劑，例如甲苯或苯。本發(fā)明有用的化合物是水溶性羧基富勒烯，即用丙二酸進行過單衍生化或多衍生化的勃克明斯特富勒烯，或者藥物上可接受的丙二酸鹽、酯和酰胺，其中丙二酸的亞甲基與富勒烯球的兩個碳連接。因此，本發(fā)明有用的化合物是C60(C(COOH)2)n以及相應(yīng)的鹽、酯和酰胺，其中n是1～4的整數(shù)。當(dāng)n=3時,C60(C(COOH)2)n的兩個異構(gòu)體實例示于

圖1。這些化合物被稱為“O-3a”和“R-3b”，它們是相應(yīng)于應(yīng)用化學(xué)(Angew Chem.Int.Ed.Engl.)33,437-438中作為化合物3a和3b公開的乙基酯的酸。本發(fā)明有用的優(yōu)選化合物是C60(C(COOH)2)3及其藥物上可接受的鹽、酯和酰胺。最優(yōu)選的化合物是C60(C(COOH)2)3該酸自身，尤其是O-3a異構(gòu)體。
意外地發(fā)現(xiàn)了它們是生物自由基清除劑和神經(jīng)保護劑，所以可抑制谷氨酸受體介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷和血清喪失誘發(fā)的編程性神經(jīng)元死亡。Pop/So 8.4.97谷氨酸，即中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性遞質(zhì)，是很多正常神經(jīng)功能(包括學(xué)習(xí)和記憶)所必需的。然而，谷氨酸受體的過度活化以及由它引起的興奮毒性神經(jīng)元損傷與數(shù)種急性損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中神經(jīng)元損傷的病理相關(guān)，所述急性損傷包括缺氧/局部缺血(科學(xué)226,850-852,1984；藥理科學(xué)進展(Trends Pharmacol.Sci.),11,379-387；神經(jīng)病學(xué)紀(jì)事(Ann.Neurol)19,105-111,1986；科學(xué)247,571-574,1990)；外傷(神經(jīng)病學(xué)紀(jì)事23,623-626,1988)；癲癇(神經(jīng)科學(xué)(Neurosci.),12,557-567,1984)，以及某些神經(jīng)變性病(科學(xué)277,1496-1498,1985；神經(jīng)元(Neuron)1,623-634,1988；藥理科學(xué)進展11,379-387,1990；神經(jīng)病學(xué)(Neurol.)40,32-37,1990；神經(jīng)病學(xué)記事31,119-130,1992)。
由活性氧物質(zhì)引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)代表很多相同的急性病和慢性病中相關(guān)的另一損傷機制(中風(fēng)(Stroke)9,445-447,1978；腦研究進展(Prog.Brain Res.)63,227-235,1985；神經(jīng)外科學(xué)雜志(J.Neurosurg)64,803-807,1986；Cerebrovas.Brain Mezab.Rev.1,165-211,1989；自由基生化醫(yī)學(xué)(Free.Radic.Biol.Med.),6,289-301,1989；神經(jīng)化學(xué)雜志(J.Neurochem)59,1609-1623,1992)。活性氧物質(zhì)(例如超氧化物自由基)會引起細胞組分的氧化損壞，例如細胞膜脂質(zhì)的過氧化，轉(zhuǎn)運蛋白的失活，以及對線粒體產(chǎn)生能量的抑制。
谷氨酸興奮毒性和氧化應(yīng)激反應(yīng)這兩件事可能是相互連結(jié)的；活性氧物質(zhì)形成可能是谷氨酸受體過度刺激的直接結(jié)果(Soc.Neurosci.Abs.18,756,1992；自然(Nature)364,535-537,1993)，于是介導(dǎo)谷氨酸神經(jīng)毒性的組分(神經(jīng)元，1,623-634,1988；科學(xué)262,689-694,1993)。反過來，興奮毒性可通過自由基清除劑降低，這類清除劑包括Cu、Zn-超氧化物歧化酶和過氧化氫酶(神經(jīng)化學(xué)雜志，49,1222-1228,1987；Acta Neurochirurgica 51,245-247,1990),21-氨基類固醇“l(fā)azaroids”(神經(jīng)元，5,121-126,1990)，維生素(神經(jīng)化學(xué)雜志，49,1222-1228,1987)；21-氨基類固醇“l(fā)azaroids”，維生素E類似物trolox(腦研究(Brain Res.),637,102-108,1994)，自旋捕獲劑，例如苯基丁基-N-硝酮(腦研究，574,193-197,1992)，以及泛醌類似物艾地苯醌(神經(jīng)科學(xué)通訊(Neurosci.Lett.),178,193-196,1994)，這些物質(zhì)減少活性氧物質(zhì)的量。
自由基清除劑是體外以及體內(nèi)外傷或缺氧性/局部缺血性CNS損傷模型中的神經(jīng)保護劑。N-甲基-D-天冬氨酸和AMPA/紅藻氨酸(kainate)受體拮抗劑是體外氧-葡萄糖喪失損傷中的神經(jīng)保護劑(神經(jīng)元，1,623-634,1988；神經(jīng)科學(xué)雜志，13,3510-3524,1993)，并可減少局部缺血動物模型中腦組織的損失(科學(xué)，226,850-852,1984；科學(xué)，247,571-574,1990)。自由基清除劑還可保護以防體外興奮毒性神經(jīng)元死亡(神經(jīng)化學(xué)雜志，49,1222-1228,187；神經(jīng)元，5,121-126,1990)，并能減少體內(nèi)局部缺血性損傷(美國生理學(xué)雜志(Amer.J.Physiol.),256,H589-593；中風(fēng)，21,1312-1317,1990；中風(fēng)，22,896-901,1991；自由基生化醫(yī)學(xué)，12,29-33,1992)。超量表達自由基清除劑酶(CuZn超氧化物歧化酶(SOD))的轉(zhuǎn)基因動物能抗谷氨酸毒性(Acta Neurochirurgia,51,245-247,1990)，也能抗局部缺血性腦損傷(神經(jīng)病學(xué)紀(jì)事，29,482-486；美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA),88,11158-62,1991)。
編程性細胞死亡也促使某些神經(jīng)疾病中細胞死亡。例如，在局部缺血再灌注數(shù)天后，編程性細胞死亡會介導(dǎo)延遲的神經(jīng)元變性(神經(jīng)化學(xué)雜志，61,1973-1976,1994；神經(jīng)報告(Neuroreport),5,493-496,1994)，并且會是某些神經(jīng)變性病中神經(jīng)元細胞死亡的一個因素(神經(jīng)科學(xué)通訊，170,191-194,1994)。由自由基氧物質(zhì)引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)將是能觸發(fā)編程性細胞死亡的損傷之一(自然，356,397-400,1992；神經(jīng)毒理學(xué)(Neurotoxicol.),15,81-91,1994；國立癌研究所雜志(J.Natl.Cancer Inst.),86,1286-1295,1994)，所以自由基清除劑也應(yīng)能限制編程性細胞死亡(神經(jīng)化學(xué)雜志，62,376-379,1994；神經(jīng)科學(xué)文摘(Neurosci.Abs.),20,432,1994)。Bcl-2似乎作用于自由基清除通道以介導(dǎo)它的抗編程性細胞死亡的細胞保護效果(細胞(Cell.),75,241-251,1993)。
本發(fā)明的主要目的是C60(C(COOH)2)n的羧化衍生物，其中C60是勃克明斯特富勒烯，n是1～4的整數(shù)，在治療或預(yù)防由自由基引起的疾病中的應(yīng)用，尤其當(dāng)該自由基是因谷氨酸神經(jīng)毒性而釋放時，這些化合物在制備相應(yīng)藥劑和包含它們的藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明意義中的治療神經(jīng)毒性損傷表示減小對一中樞神經(jīng)元周圍的中樞神經(jīng)元損傷的程度，這一中樞神經(jīng)元已經(jīng)由于其受神經(jīng)毒性作用的損害而釋放谷氨酸。神經(jīng)毒性作用包括急性神經(jīng)損傷，例如在中風(fēng)、低血糖、癲癇或外傷期間出現(xiàn)的缺氧/局部缺血。神經(jīng)毒性作用也可能是由神經(jīng)變性疾病引起的慢性神經(jīng)元損傷，這類疾病例如亨廷頓舞蹈病、早老性疾呆、肌萎縮性側(cè)索硬化(“ALS”)，以及艾滋病的神經(jīng)變性作用。因此，本發(fā)明還包括治療出現(xiàn)了所述神經(jīng)毒性損傷的疾病的方法。
本發(fā)明又一目的是勃克明斯特富勒烯在抑制患者中神經(jīng)毒性損傷方面的應(yīng)用，其中所述損傷是由花生四烯酸的代謝而引起的，該花生四烯酸是由于谷氨酸刺激所述神經(jīng)元的NMDA受體而由神經(jīng)元釋放的；以及藥劑，它包括本文所述的羧基富勒烯和藥物上可接受的載體，其量足以抑制所述神經(jīng)毒性損傷。
花生四烯酸(“AA”)是由于過量Ca2+流入神經(jīng)元細胞而在神經(jīng)元中釋放的，這種過量流入是由谷氨酸刺激NMDA受體而引起的(谷氨酸已由因神經(jīng)毒性作用本身損壞的神經(jīng)元釋放)。過量的Ca2+流入激活磷脂酶A2(它是一種鈣依賴性酶)，它分裂細胞膜釋放AA。由內(nèi)源性脂肪氧合酶和環(huán)加氧酶引起的AA代謝導(dǎo)致產(chǎn)生氧自由基，后者觸發(fā)神經(jīng)元脂質(zhì)膜的過氧化降解(斯堪的納維亞生理學(xué)學(xué)報(Acta Physiol.Scand.),492,121-128,1980；腦研究進展(Proq.Brain Res.),63,227-232,1985)，這就導(dǎo)致神經(jīng)元損壞或死亡。因此，按本發(fā)明，通過施用包括本文所述的自由基清除性羧基富勒烯的組合物而減少氧衍生的自由基就提供了另一機制，通過它可使谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性得到抑制。
本發(fā)明的優(yōu)選目的包括上述化合物在治療中風(fēng)方面的應(yīng)用。按本發(fā)明，中風(fēng)被定義為患者腦中的急性神經(jīng)毒性作用，其中該神經(jīng)毒性作用是因血液流向腦神經(jīng)元的喪失而發(fā)生的。
本文中描述的羧基富勒烯化合物是作為藥劑而全身施用的，該藥劑包含該活性化合物以及與所述化合物相容的藥物上可接受的載體。在這類藥劑的制備中，可應(yīng)用任意常規(guī)的藥物上可接受的載體。當(dāng)該藥物經(jīng)口施用時，一般以一定間隔施用它。
在治療應(yīng)用中，本發(fā)明的有用化合物可通過任意常規(guī)的施藥途徑施用。這類途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部以及經(jīng)口途徑。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法通過經(jīng)口的或靜脈內(nèi)的施藥途徑實施。
該藥劑可制備成任何常規(guī)形式，包括經(jīng)口施用的固體形式例如片劑、膠囊、丸劑、粉劑、粒劑等。該藥劑可被滅菌和/或可包含輔劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、用于改變滲透壓的鹽和/或緩沖劑。
靜脈內(nèi)施用的典型制劑可以是無菌水溶液，包括水/緩沖溶液。靜脈內(nèi)載體包括流體、營養(yǎng)物和電解質(zhì)補足物。還可存在防腐劑和其它添加劑，例如抗生素和抗氧化劑。用于靜脈內(nèi)施用集合藥團的藥劑可包含高達10mg/ml(10,000mg/升)本文所述的羧基富勒烯。靜脈內(nèi)滴注施藥的藥劑優(yōu)選包含約50mg/升至約500mg/升本文所述的羧基富勒烯。
按本發(fā)明，本文所述的羧基富勒烯適用于藥物上可接受的經(jīng)口方式。這些藥劑包含所述化合物以及相容性藥物上可接受的載體物質(zhì)。可應(yīng)用任意常規(guī)的載體物質(zhì)。任何常規(guī)經(jīng)口劑量形式，例如片劑、膠囊、丸劑、粉劑、粒劑等都可以用。該載體物質(zhì)可以是適合經(jīng)口施用的有機或無機惰性載體物質(zhì)。合適的載體包括水、明膠、阿拉伯樹膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石、植物油、聚亞烷基二醇、礦脂等。此外，該藥劑可包含其它藥物活性劑?？砂垂J的藥物調(diào)和實踐加入其它添加劑，例如調(diào)味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑等。
優(yōu)選的經(jīng)口劑量形式包括片劑，硬的或軟的明膠、甲基纖維素或容易溶于消化道的其它合適物質(zhì)的膠囊。本發(fā)明考慮的經(jīng)口劑量將根據(jù)開處方的醫(yī)師確定的各患者的需要而改變。優(yōu)選的經(jīng)口劑量形式是膠囊或片劑，其中包含50～500mg適用于本發(fā)明的羧基富勒烯。
在實施本發(fā)明的方法時，適用于本發(fā)明的化合物通常每天給成人施用，優(yōu)選經(jīng)口或靜脈內(nèi)施用，日劑量約1.5mg/kg～約1500mg/kg，呈單次的或分開的劑量，優(yōu)選每天約10mg/kg～約60mg/kg，準(zhǔn)確劑量應(yīng)根據(jù)患者的需要而改變。通常，該療法進行約3個月的一段時間?；蛘?，對于具有患急性神經(jīng)毒性病(例如中風(fēng))的高度危險性的那些患者，可預(yù)防性地實施本發(fā)明的方法達不確定的一段時間。用于治療急性神經(jīng)毒性病時，在診斷為急性神經(jīng)毒性病之后應(yīng)盡可能快地用本發(fā)明的方法治療患者，優(yōu)選在神經(jīng)毒性病開始發(fā)作的12小時內(nèi)，最優(yōu)選在6小時內(nèi)。
圖1～11更詳細地闡述本發(fā)明。圖1六羧基富勒烯C60(C(COOH)2)3的結(jié)構(gòu)，異構(gòu)體O-3a和R-3b。圖2純化了的C60(C(COOH)2)3丙二酸酯(O-3a對映體)質(zhì)子NMR譜法的譜圖。圖3純化了的C60(C(COOH)2)3丙二酸酯(O-3a對映體)快速原子轟擊質(zhì)譜分析的譜圖。圖4電子順磁共振譜圖，它闡明了C60(C(COOH)2)3對H2O2(A未處理的，B用O-3a對映體處理了的)和超氧化物自由基O2-(C未處理的，D用O-3a對映體處理了的，E用R-3b對映體處理了的)的自由基清除活性。箭頭指向EPR腔中污染物產(chǎn)生的人為信號。圖5培養(yǎng)的神經(jīng)元接觸NMDA后產(chǎn)生的神經(jīng)毒性，未處理和用3種濃度的C60(C(COOH)2)3處理。圖6培養(yǎng)的神經(jīng)元接觸AMPA后產(chǎn)生的神經(jīng)毒性，未處理和用4種濃度的C60(C(COOH)2)3處理。圖7 NMDA刺激的痕量45Ca2+在培養(yǎng)的神經(jīng)元中的積累，同時應(yīng)用和未同時應(yīng)用C60(C(COOH)2)3。圖8在缺乏神經(jīng)膠質(zhì)的培養(yǎng)物中因血清喪失而產(chǎn)生的編程性神經(jīng)元細胞死亡，未處理和用2種濃度的C60(C(COOH)2)3處理。圖9比較兩種C60(C(COOH)2)3異構(gòu)體的自由基清除活性的EPR譜。圖10比較了兩種C60(C(COOH)2)3異構(gòu)體在保護神經(jīng)元以防因應(yīng)用NMDA而產(chǎn)生的損傷(A)和AMPA-誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡(B)。摻入小鼠腦的脂質(zhì)的自旋標(biāo)記脂質(zhì)(5-或16-doxyl ketostearic acid(酮硬脂酸))的EPR譜(C)，加有兩種C60(C(COOH)2)3異構(gòu)體的任一種。圖11用包含鹽水或15mg/kg/天羧基富勒烯的腹膜內(nèi)微型滲透泵處理的FALS小鼠的存活曲線。
本文的數(shù)據(jù)表明，公開的羧基富勒烯是一類新型抗氧化劑，具有清除多種氧衍生的自由基的能力，而且這些化合物具有不尋常的寬范圍和有效的神經(jīng)保護能力，可減少因谷氨酸興奮毒性引起的神經(jīng)元死亡，以及編程性細胞死亡。
實施例溶液培養(yǎng)基儲備液(MS)，由伊格爾基本必需培養(yǎng)基構(gòu)成，含25mM葡萄糖，無L-谷氨酰胺。
平板培養(yǎng)基，由MS構(gòu)成，補加L-谷氨酰胺(2mM)，5％胎牛血清以及5％馬血清。
生長培養(yǎng)基，含MS,10％馬血清以及2mML-谷氨酰胺。
與NMDA短暫接觸是在HEPES緩沖的平衡鹽溶液中進行的，該溶液pH為7.40(HBBSS)，包含以mM為單位的116NaCl,5.4KCl,0.8MgSO4,1.8NaPO4,12HEPES,25NaHCO3,5.5D-葡萄糖，以及10(ML-甘氨酸。
平衡鹽溶液(BSS)包含以mM為單位的116NaCl,5.4KCl,0.8MgSO4,1.8NaPO4,26.2NaHCO3以及5.5D-葡萄糖。
C60(C(COOH)2)3的起始異構(gòu)體是O-3a異構(gòu)體，它代表合成的主產(chǎn)物。該化合物儲備液是作為25mM水溶液制備的。儲備液應(yīng)在制備后72小時內(nèi)應(yīng)用，在-20℃下暗處貯存。
將未改性的C60溶于甲苯以配制50mM儲備液。
皮質(zhì)細胞培養(yǎng)物小鼠新皮質(zhì)培養(yǎng)物是以神經(jīng)元-星形細胞共培養(yǎng)物(大約50％星形細胞)制備的(Rose等，1992)或者以神經(jīng)元培養(yǎng)物(＜2％星形細胞)制備的。從麻醉了的懷孕Swiss-Webster小鼠取出小鼠胚胎(懷孕第15天)，將新大腦皮質(zhì)與其它腦結(jié)構(gòu)解剖分離。在胰蛋白酶中短暫培養(yǎng)后，將細胞研磨分裂，然后將該細胞懸浮液稀釋入平板培養(yǎng)基，鋪在預(yù)先制備的、用聚(D-賴氨酸)/層粘連蛋白涂覆的24孔Plastek培養(yǎng)板上(用于神經(jīng)元培養(yǎng)物)或者鋪在現(xiàn)有的星形細胞床上(用于共培養(yǎng)物)。體外1～2天后，用神經(jīng)膠質(zhì)條件培養(yǎng)基部分更換“純”神經(jīng)元培養(yǎng)物，在加液抑制神經(jīng)膠質(zhì)增殖后立即添加胞嘧啶阿拉伯糖苷(3μM)。向混合培養(yǎng)物中一周2次加入生長培養(yǎng)基直至在體外11～12天，此時加入含2mML-谷氨酰胺的無血清MS。除非另有說明，在體外14～16天后應(yīng)用細胞。
實施例1羧基富勒烯(2,2-富勒烯丙二酸(2,2-fulleromalonic acids))的合成和性能2,2-富勒烯丙二酸二乙酯將C60(1g,1.39mmol)加入新蒸餾的甲苯(1000ml)并攪拌數(shù)分鐘而得清亮的紫色溶液。在攪拌下往該溶液中滴加溴代丙二酸二乙酯(0.474ml,2.78mmol)。在該富勒烯溶液中加入0.526ml(3.475mmol)DBU(1,8-重氮基二環(huán)[5.4.0]-十一碳-7-烯)使顏色從紫色變成暗紅色。在室溫下的空氣中攪拌一夜后，過濾該溶液以除去銨鹽，真空(varus)蒸發(fā)溶劑。將殘余物溶于少量氯仿，然后加到硅膠柱頂上(填料是得自Merck的70～230目或230～400目的急驟色譜凝膠)。用從甲苯/己烷(1∶1)至甲苯(100％)的梯度洗脫富勒烯產(chǎn)物。初始洗脫得到5個級分，即未反應(yīng)的富勒烯、一加合物、二加合物、三加合物、多加合物。在真空中除去各級分的溶劑，將固體殘余物重復(fù)進行色譜處理直至純凈。含二加合物和三加合物的級分各在再分離后給出兩種主要產(chǎn)物。
2,2-富勒烯丙二酸將含該酯加合物的單一異構(gòu)體的各樣品(100ml)在氮氣下溶于甲苯(50ml)。然后加入20∶1摩爾比過量的NaH。在100℃下攪拌2～3h后，向該熱溶液中滴加1ml甲醇，猛烈放出氣體。同時定量沉淀出鈉鹽。通過離心收集該鹽，真空下干燥。先用2M H2SO4再用水洗滌干燥后的化合物。在真空下將代表相應(yīng)酯的丙二酸衍生物的該產(chǎn)物干燥一夜而得細棕色粉末。
對包含三加合富勒烯酯的O-3a對映體的樣品進行質(zhì)譜分析；然后將該酯水解再酸化而生成最終的羧基富勒烯化合物，即C60(C(COOH)2)3。純化的C60酯的質(zhì)子NMR和質(zhì)譜(分別為圖2和3)指示該樣品包含2,2-富勒烯丙二酸酯的單一異構(gòu)體(O-對映體，質(zhì)量=1194/1195)和少量C60(質(zhì)量=720)，它可能是由該加合物裂解而生成的。本文描述了初始化合物(即O-3a對映體)的結(jié)果。最近對另一對映體(即R-3b)的研究指示它也是一種有效的神經(jīng)保護劑。
羧基富勒烯的溶液呈棕色半透明。然而，過濾通過0.45(m尼龍濾膜的濃(50mM)溶液未在濾膜上留下任何殘余物，表明它是真溶液。對比試驗證實，該化合物不干擾比色LDH分析。濃度高達25mM羧基富勒烯的溶液不能改變試驗溶液的pH。
實施例2興奮性氨基酸毒性以及富勒烯醇(fullerenols)的應(yīng)用通過電子順磁共振譜，證實C60(C(COOH)2)n化合物是有效的自由基清除劑，能清除羥基自由基和超氧化物自由基。圖4顯示的EPR譜圖A～E闡明了C60(C(COOH)2)3的自由基清除活性。譜圖A和B分別示出在15分鐘期間由H2O2產(chǎn)生的羥基自由基(自旋加合物DMPO-OH()，以及當(dāng)150(MO-3a異構(gòu)體被包括于H2O2中時該OH信號的消除。超氧化物自由基(O2(-)也被C60(C(COOH)2)n化合物有效地消除了。構(gòu)成自旋加合物DMPO-OOH的O2(-，是通過黃嘌呤氧化酶與黃嘌呤保溫而生成的(譜圖C)。與40(M O-3a異構(gòu)體或40(M R-3b一起保溫消除了超氧化物自由基信號(分別為譜圖D和E)。n=1或2的其它水溶性C60(C(COOH)2)n化合物的EPR分析證實它們也是有效的自由基清除劑(未給出數(shù)據(jù))。
六羧基化化合物C60(C(COOH)2)3可溶于水到至少50mM濃度，它保護皮質(zhì)神經(jīng)元以抗通過與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和(-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(AMPA)接觸而產(chǎn)生的興奮毒性損傷。二羧基和四羧基富勒烯衍生物較少地溶于水溶液，雖然具有神經(jīng)保護活性，但比六羧基衍生物的神經(jīng)保護效果更小。
將羧基富勒烯(3-300(M)與NMDA一起應(yīng)用于前述的神經(jīng)元-星形細胞共培養(yǎng)物以估測神經(jīng)保護作用。在羧基富勒烯存在下與NMDA的短暫接觸是這樣進行的，即用HBBSS更換培養(yǎng)基3次，接著添加50μM～500μM NMDA與羧基富勒烯達10分鐘。通過用MS更換培養(yǎng)基4次而除去NMDA和羧基富勒烯，將培養(yǎng)物置于加濕的含CO2(5％)的37℃培養(yǎng)箱中達24小時，估測損傷程度。
例行地長時間地(24小時)接觸5～100(M AMPA以產(chǎn)生皮質(zhì)神經(jīng)元損傷。在另一系列試驗中，將羧基富勒烯(3～300(M)與AMPA一起應(yīng)用于前述神經(jīng)元-星形細胞共培養(yǎng)物以估測神經(jīng)保護作用。用MS更換培養(yǎng)基2次后，添加AMPA和羧基富勒烯，再將培養(yǎng)物返回37℃的培養(yǎng)箱中。NMDA受體拮抗劑MK-801(10(M)被包括于AMPA和羧基富勒烯中以消除通過內(nèi)源性谷氨酸釋放而再次活化NMDA受體。
施用NMDA或AMPA 24小時后通過相差顯微術(shù)(200～400x)，并通過測定從死細胞流入培養(yǎng)基浴液的乳酸脫氫酶(LDH)(Koh和Choi,1987)而估測神經(jīng)元死亡。細胞死亡的定量估測在某些試驗中通過錐蟲藍或碘化丙錠染色和細胞計數(shù)而得到了確證。
C60(C(COOH)2)3的結(jié)果示于圖5和6。C60(C(COOH)2)3顯示了增強的抗NMDA(圖5)和AMPA誘導(dǎo)的(圖6)興奮毒性神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護作用。在迄今為止進行的所有試驗中，C60(C(COOH)2)3(300(M)減少NMDA引起的神經(jīng)元死亡至少60％，并在一些試驗中幾乎提供完全保護作用。減去洗滌后的對比物中存在的LDH量以給出NMDA毒性的特定信號。將數(shù)據(jù)以只由NMDA引起的細胞死亡百分數(shù)作圖，每次培養(yǎng)物該接觸殺死總神經(jīng)元的51(9,44(6，以及88(14％。由ANOVA接著由Student-Newman-Keuls檢驗對多個對比試驗取平均值(S.D.*=p＜0.05對NMDA。從3個試驗匯集的數(shù)據(jù)(圖5)闡明神經(jīng)元細胞死亡減少75％。
在100(M時C60(C(COOH)2)3減少由AMPA引起的神經(jīng)元細胞死亡＞80％(圖6)。MK-801(10(M)被包括于AMPA中以消除由釋放的內(nèi)源性谷氨酸引起的NMDA受體的再次活化。這些值是平均值(SEM,n=3～4/試驗，匯集4個試驗的數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)以只由AMPA/MK-801引起的細胞死亡百分數(shù)作圖，表示40～70％的總神經(jīng)元/培養(yǎng)物。*=p＜0.05對AMPA，是由ANOVA接著由Student-Newman-Keuls檢驗對多個對比試驗進行的。
就我們所知，上述試驗是首次將這些化合物用作細胞保護劑或抗氧化劑。
實施例345Ca2+示蹤試驗為了證實抗NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞損傷的保護作用不是由于NMDA誘導(dǎo)的鈣流入量減少的緣故，進行了45Ca2+示蹤研究。用HBBSS洗滌培養(yǎng)物2次，然后將培養(yǎng)物與NMDA(300(M)接觸，該NMDA單獨地或者與C60(C(COOH)2)3一起溶于含示蹤物45Ca2+(0.5(Ci/培養(yǎng)孔；NEN,Boston,MA)的HBBSS中。10分鐘后通過用未標(biāo)記的HBBSS更換培養(yǎng)基4次而終止該接觸，接著添加0.2％十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解細胞。將細胞置于SDS中達2小時，再將裂解液轉(zhuǎn)至閃爍小瓶。另將用SDS洗滌各培養(yǎng)孔的洗液加入小瓶，然后進行(-計數(shù)。
圖7的結(jié)果闡明了羧基富勒烯不是NMDA受體拮抗劑。同NMDA一起應(yīng)用多達300(M的C60(C(COOH)2)3也未影響45Ca2+積累。從所有條件扣除基本的45Ca2+而得對NMDA受體活化呈特異性的45Ca2+增量。平均(SEM,n=4。
實施例4喪失血清的編程性神經(jīng)元死亡缺少神經(jīng)膠質(zhì)的培養(yǎng)物中的皮質(zhì)神經(jīng)元在除去血清后24～48小時經(jīng)歷編程性細胞死亡，特征表現(xiàn)為形態(tài)變化(例如細胞體收縮)，神經(jīng)元過程的裂解，以及由Hoechst 33258染色引起的染色質(zhì)凝聚(Dugan等，1995)。因喪失血清而引起的編程性神經(jīng)元死亡也可通過一起應(yīng)用六羧基富勒烯而減少。已證實該損傷具有典型編程性細胞死亡的特征，包括DNA序列梯，染色質(zhì)凝集，細胞收縮，編程性細胞死亡體的形成，以及通過大分子合成抑制劑的保護。通過用補加了氨基酸(谷氨酰胺除外)的平衡鹽溶液更換含血清的生長培養(yǎng)基而使包含＜1％星形細胞的培養(yǎng)物中的皮質(zhì)神經(jīng)元喪失血清。將洗滌后的對照物返回培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基于BSS中包含2％胎牛血清、2％馬血清。24小時和48小時之后，應(yīng)用相差光學(xué)系統(tǒng)在100～400X下用Nikon倒置顯微鏡對細胞照相。
此外，在除去血清48小時后通過計數(shù)不再能排斥錐蟲藍的細胞而測定神經(jīng)元細胞死亡。如圖8中所示，從開始除去血清的48小時后通過計數(shù)不再能排斥錐蟲藍的細胞而測定的神經(jīng)元細胞死亡，闡明神經(jīng)元死亡的明顯減少。用10M(C60(C(COOH)2)3處理的細胞表明減少了神經(jīng)元死亡的50％。保持在含血清培養(yǎng)基中的洗滌了的對比培養(yǎng)物死亡很少。這些值是平均值(SEM,n=3～4/試驗。該試驗表示3次試驗。*=p＜0.05對喪失血清的，通過ANOVA接著通過Student-Newman-Keuls檢驗對多個對比樣進行的。
實施例5羧基在C60上的極性位置改善了神經(jīng)保護效率按Lamparth和Hirsch的方法(Lamparth和Hirsch(1990))合成并純化了C60(C(COOH)2)3的兩種區(qū)域異構(gòu)體，即O-3a和R-3b。這些化合物的純度通過NMR和紫外/可見光譜分析進行檢驗。就O-3a化合物來說，所有亞甲基橋都位于相互之間的e(平伏)位置(e,e,e)，由1H和13C NMR譜分析證實該分子具有C3對稱現(xiàn)象?；衔颮-3b的亞甲基橋位于沿約為C60骨架的三重軸的大國環(huán)的帶上呈反式-3位置(反-3，反-3，反-3)，并具有D3對稱現(xiàn)象。示于圖1中的3-D結(jié)構(gòu)闡明了O-3a上羧基的極性分布以及R-3b上羧基的平伏分布。
圖9通過化學(xué)法顯示，由自旋捕獲/EPR譜鑒定的這兩種異構(gòu)體表現(xiàn)出相似的清除OH和O2-自由基的能力。圖9示出了用100mM 5，5-二甲基-1-吡啶(pyrolline)-N-氧化物(DMPO)為自旋捕獲劑OH自由基(通過Fenton反應(yīng)從100μM H2O2于Fe2+中而得)和O2-自由基(得自黃嘌呤+黃嘌呤氧化酶獲得)的EPR譜。羥基自由基(左邊的譜圖)OH只存在DMPO時(上圖)，存在4μM O-3a時(中圖)，或者存在4μM R-3b時(下圖)。超氧化物自由基(右邊)O2-只存在DMPO時(上圖)，存在400μM O-3a時(中圖)，存在400μM R-3b時(下圖)。箭頭指示由于腔內(nèi)存在未知自由基而出現(xiàn)的仿真信號。樣品是在Bruker 200,X-帶EPR光譜儀中石英平板池(60×10×0.25mm)中分析的。設(shè)定值為功率=1.6mW，調(diào)制=1G，場調(diào)制=100Hz,R.G.=3.2×105。
EPR結(jié)果表明，在比報道的大多數(shù)其它自由基清除劑小100～1000倍的濃度下，O-3a和R-3b異構(gòu)體都是極有效的OH清除劑。羧基富勒烯對OH的清除能力比對O2-自由基的清除能力大10倍。
雖然由EPR分析證實O-3a和R-3b異構(gòu)體是等效的抗氧化劑，但就生物上抗NMDA和AMPA受體介導(dǎo)的損傷來說，O-3a化合物比R-3b更有效。這些結(jié)果示于圖10。圖10闡明了，O-3a對應(yīng)用NMDA引起的損傷(A)提供稍佳的保護作用，但提供好得多的對AMPA誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡(B)的保護作用。這些值是n=8～12各條件下的平均值±SEM。*=p＜0.05對未處理的損傷條件，應(yīng)用ANOVA接著通過Student-Newman-Keuls檢驗對多個對照樣進行。**=p＜0.05R-3b不同于O-3a。圖10還示出摻入得自小鼠腦的脂質(zhì)、加有O-3a或R-3b的自旋標(biāo)記脂質(zhì)的EPR譜(C)(5-或16-doxyl酮硬脂酸)。以1∶100的比率將自旋標(biāo)記物加入從成熟小鼠腦提取的脂質(zhì)。EPR設(shè)定值與圖9的圖例中列出的那些相同。兩種異構(gòu)體都使5-doxyl基的序參數(shù)(S)產(chǎn)生漂移，但O-3a使S產(chǎn)生更大的變動(表1)。O-3a還比R-3b更大程度地改變16-doxyl酮硬脂酸的液態(tài)信號，表明O-3a增大了脂質(zhì)的無序性或流動性(表1)。兩組結(jié)果表示O-3a比R-3b更大程度地進入脂質(zhì)雙層。
除了在保護神經(jīng)元以抗NMDA和AMPA受體介導(dǎo)的損傷中顯示更大的活性外，O-3a還比R-3b提供更強的保護作用以抗內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物以及肝細胞中的損傷。該差異明顯是由于O-3a異構(gòu)體比R-3b進入膜的能力更強。O-3a的極性使它能更輕易地進入細胞膜。嵌入這些細胞膜的該能力啟示，O-3a將比R-3b提供更好的細胞膜保護作用以防脂質(zhì)過氧化。因此，功能基的位置(極性比圓周)對C60衍生物的保護效率來說很重要。
表1自旋標(biāo)記物/EPR試驗的膜參數(shù)化合物 序參數(shù)a相關(guān)時間b脂質(zhì)/水的分配因子cO-3a0.84±0.01 5.7±0.5ns1.0±0.2R-3b0.86 4.5 0.6對比物 0.88 5.1 0.8a序參數(shù)，S=a(Tl′-T′)/(Tl-T)，其中Tl′是測定的5-doxyl硬脂酸自旋標(biāo)記物/磷脂中平行取向的超精細分裂，T′則是垂直取向。我們假定a=1，且Tl-T=25G，b相關(guān)時間，τc=6.5×10-10W0[(h0/h-1)-1]，其中W0是以高斯表示的中場線寬度，h0和h-1是對5-doxyl硬脂酸測定的一階導(dǎo)數(shù)吸收的中場線和高場線的峰高。c脂質(zhì)/水的分配因子，f=hL/hA，其中hL和hA是對16-doxyl硬脂酸測定的脂質(zhì)相和水相的峰高。為了有效的比較，我們應(yīng)用了hA整個峰高的1/2。
實施例6羧基富勒烯對肌萎縮性側(cè)索硬化的轉(zhuǎn)基因模型中存活量的作用在10,000個人中有一個患有ALS,ALS是由于運動神經(jīng)元疾病而導(dǎo)致死亡的最常見起因。該疾病的家族形式(FALS)通常是常染色體顯性的，構(gòu)成這類病例的10～15％。在1993年，一個關(guān)鍵性突破鑒定了具有FALS的某些家族中Cu,Zn-SOD(sodl)基因中的突變(Rosen等，1993)，于是后續(xù)的工作導(dǎo)致這種假設(shè)，即ALS可能是由于某些FALS形式中由突變體SOD1更多地產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(ROS)。
Gurney及其同事們已培育了攜帶見于FALS家族中的G93A點突變的小鼠(Gurney等，1994),G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的G1系闡明了人FALS的很多特征。該G1系，具有18個拷貝數(shù)和4倍于野生型動物的SOD活性，在3～4個月大小逐步呈現(xiàn)運動神經(jīng)元死亡，變得下肢弱化，損傷的梳理，以及沿它們的脅腹變瘦。感染的小鼠在5個月大小之前死亡(Gurney等，1994)。
將C60(C(COOH)2)3用于治療FALS小鼠(Gurney GI品系)以測定其治療FALS的能力。在10周大小，在腹膜內(nèi)植入包含C60(C(COOH)2)3(混合異構(gòu)體，其中包括＞90％ O-3a)或者鹽水的Alzet微型滲透泵(28天，6(1/天,15mg/kg/天)。在14周大小，置換這些泵。用錄像帶錄下露天場地行走情況并進行評價，應(yīng)用Bresnahan標(biāo)準(zhǔn)記錄脊髓損傷(Basso等，1995)。如Gurney及其同事們報道的那樣，這些動物在大約90天大小出現(xiàn)運動原癥狀，并在125～145天大小瀕臨死亡。
圖11示出用包含鹽水或15mg/kg/天羧基富勒烯的腹膜內(nèi)微型滲透泵處理后FALS小鼠的存活曲線。這些結(jié)果表明，用C60(C(COOH)2)3處理過的組表現(xiàn)為延遲8±2.2天死亡，t-檢驗得p=0.041。用C60(C(COOH)2)3處理過的FALS小鼠還表明癥狀的開始被延遲了。由t-檢驗得知，8天存活率增大達到統(tǒng)計學(xué)顯著性(p=0.041)。對于未接受泵處理(123天，n=4)或者用裝有鹽水的泵處理(125天，n=6)的FALS小鼠來說，它們的存活率沒有差別。此外，用羧基富勒烯(15mg/kg/天)處理兩個月的野生型動物(n=6)未表現(xiàn)健康不良或行為不良的效果-它們與未處理的同窩出生者同樣活潑，體重也類似(同性別間比較)。
權(quán)利要求
1．式Ⅰ的羧化衍生物C60(C(COOH)2)nⅠ其中C60是勃克明斯特富勒烯，n=1～4，及其藥物上可接受的鹽、酯和酰胺在制備用于控制或治療由于谷氨酸NMDA受體刺激神經(jīng)元而釋放自由基氧物質(zhì)引起的疾病的藥劑方面的應(yīng)用。
2．權(quán)利要求1的式Ⅰ化合物的應(yīng)用，其中的疾病包括神經(jīng)毒性損傷，例如急性神經(jīng)損傷如中風(fēng)、低血糖、癲癇期間出現(xiàn)的缺氧/局部缺血；或者神經(jīng)變性病，例如亨廷頓舞蹈病、早老性癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，以及艾滋病的神經(jīng)變性作用。
3．權(quán)利要求1～2的應(yīng)用，其中式Ⅰ中的n是3。
4．一種藥劑，它包含一種或多種權(quán)利要求1中定義的式Ⅰ化合物或其藥物上可接受的鹽、酯和酰胺以及治療上惰性的載體物質(zhì)。
5．用于控制或治療下列疾病的權(quán)利要求4的藥劑急性神經(jīng)損傷，例如在中風(fēng)、低血糖、癲癇或外傷期間出現(xiàn)的缺氧/局部缺血；或者由神經(jīng)變性病如亨廷頓舞蹈病、早老性癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)和艾滋病的神經(jīng)變性作用引起的慢性神經(jīng)元損傷。
6．通過給患有神經(jīng)毒性損傷的患者施用一種組合物而治療所述損傷的方法，其中該組合物包括式C60(C(COOH)2)n的化合物，其中n是1～4的整數(shù)，其藥物上可接受的鹽和藥物上可接受的酯，以及藥物上可接受的載體，其中所述化合物在所述組合物中的存在量是治療所述神經(jīng)毒性損傷的有效量。
全文摘要
本發(fā)明涉及羧化勃克明斯特富勒烯在控制或治療神經(jīng)毒性損傷中的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/194GK1221340SQ97195219
公開日1999年6月30日 申請日期1997年5月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月3日
發(fā)明者D·W·仇, L·杜甘, T－S·T·林, T-Y·劉 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司