專利名稱：得自宿主的誘導(dǎo)類異戊二烯基因表達(dá)的信號(hào)及其用途的制作方法
關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究的聲明本發(fā)明部分用政府基金而創(chuàng)造，因此政府對(duì)本發(fā)明有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
構(gòu)成植物-病原體相互作用基礎(chǔ)的機(jī)制模型通常涉及宿主特異性的受體，所述受體識(shí)別入侵病原體釋放的病原體特異性配合體(Dixon等，Annu.Rev.Phytopathol 32:479-501,1994；Lamb,Cell 76:419-422,1994；Boller,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.46:189-214,1995)。然后這種信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致誘導(dǎo)宿主防御的所有組成成分，包括植物抗毒素的生物合成(Keen，載于Plant.Diseuse Control.R.C.Staple編輯，John Wiley & Sons，紐約，第155-177頁，1981)、水解酶的合成及分泌(Kombrink等，Proc Natl Acad.Sei.USA 84:6750-6754,1988)，植物細(xì)胞壁的僵化(Bradley等，Cell 70:21-30,1992)、以及激活的局部細(xì)胞死亡發(fā)育程序。如果成功的話，這些反應(yīng)最終會(huì)阻止入侵微生物的生長。
除了誘導(dǎo)宿主防御基因表達(dá)的病原體特異性信號(hào)外，已有許多報(bào)告提出從宿主得到的可擴(kuò)散的或可傳遞的信號(hào)涉及使植物防御反應(yīng)和諧地組織起來。例如，Dixon等(Plant Physiol.71:251-256,1983)已報(bào)道變性的RNA酶能誘導(dǎo)低分子量可溶性因子的釋放，該因子在大豆胚軸和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中激活苯丙類化合物(Phenylpropanoid)生物合酶及植物抗毒素的積聚。Graham和Graham(Plant Physiol.105:571-578,1994)也已報(bào)道從受傷的細(xì)胞釋放出一種稱為引發(fā)感受態(tài)因子(elicitation competency factor)的可傳遞信號(hào)，并發(fā)現(xiàn)它在接近或緊鄰(傷口)的細(xì)胞中誘導(dǎo)及加強(qiáng)對(duì)創(chuàng)傷的細(xì)胞反應(yīng)。另外，H2O2已被鑒定為一種可擴(kuò)散的信號(hào)，它能選擇性地觸發(fā)誘導(dǎo)一個(gè)亞類的宿主防御基因(Levine等，Cell l79:583-593,1994)。
發(fā)明概述一般而言，本發(fā)明描述制備組合物方法的特征，該組合物能激活參與一種類異戊二烯(例如植物類異戊二烯)合成的基因的表達(dá)，該組合物例如為如本文所述產(chǎn)生的一種引發(fā)物誘導(dǎo)的組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包含(a)在下述條件下用一引發(fā)物與植物細(xì)胞接觸，所述條件允許激活類異戊二烯合成的化合物的引發(fā)物誘導(dǎo)的釋放；以及(b)回收包含該化合物的組合物，其中該化合物是可擴(kuò)散的并具有小于或等于10,000道爾頓的分子量。在一最佳實(shí)施例中，該化合物是可擴(kuò)散的，并具有小于或等于1,000道爾頓的分子量；該組合物通過透析而回收；且通過已知為Cryptogein的引發(fā)物誘導(dǎo)而釋放該化合物。
在一相關(guān)的方面，本發(fā)明描述按照上述方法產(chǎn)生的大致純的組合物的特征。
在另一相關(guān)的方面，本發(fā)明描述大致純的組合物的特征，該組合物能激活參與類異戊二烯(例如植物類異戊二烯)合成的基因的表達(dá)。在最佳實(shí)施例中，該組合物包含一化合物，它小于或等于10,000道爾頓(且最好小于或等于1,000道爾頓)；在溫度75-80℃熱穩(wěn)定15分鐘；對(duì)凍-融循環(huán)穩(wěn)定；對(duì)凍干穩(wěn)定；在有機(jī)溶劑中不容易溶解；和/或在植物細(xì)胞中能激活倍半萜烯合酶的活性(例如表-5-馬兜鈴烯(epi-s-anstolocherne)合酶活性)。
所述“類異戊二烯”意指衍生于異戊二烯結(jié)構(gòu)單元的化合物。詳細(xì)地，類異戊二烯化合物包括但不限于單萜、雙萜、倍半萜烯及甾醇。本文提及的術(shù)語“植物類異戊二烯”是指在植物中發(fā)現(xiàn)的類異戊二烯化合物，但不應(yīng)該解釋為把同樣在其它生物例如動(dòng)物、真菌或細(xì)菌來源中發(fā)現(xiàn)的類異戊二烯排出在外。
所述“引發(fā)物”意指病原體產(chǎn)生的能啟動(dòng)植物防御反應(yīng)的任何分子。引發(fā)物的實(shí)例包括但不限于一種或多種例如汞離子的有毒的離子、其它化學(xué)定義的組合物、代謝抑制物、細(xì)胞壁聚糖、C-糖苷引發(fā)物(例如Midland等，J.Organic.Chemistry 58:2940；Smith等，Tetrahedron Letters 34:223,1993)、某些糖蛋白、某些酶、真菌孢子、脫乙酰殼多糖及引發(fā)蛋白(elicitin)(諸如harpin,cryptogein和pariscein)。
所述“引發(fā)蛋白”意指蛋白引發(fā)物，例如象Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4088-4094,1995所描述的那種。
所述“引發(fā)物誘導(dǎo)的組合物”意指用一引發(fā)物接觸植物細(xì)胞后，從所述植物細(xì)胞得到的組合物。
所述“大致純的引發(fā)物誘導(dǎo)的組合物”意指一種組合物(例如本文描述的ECM組合物)，它已被從與其天然相伴的組分中分離出來，至少是部分分離。通常，當(dāng)從所述化合物及天然產(chǎn)生的與其天然相聯(lián)的有機(jī)分子組合物中將所述化合物純化至少100倍、優(yōu)選200倍、更優(yōu)選300倍、且最優(yōu)選400倍時(shí)，該組合物大致為純的。例如按照本文公開的方法(諸如從植物細(xì)胞)可得到大致純的引發(fā)物誘導(dǎo)的組合物。純度可用任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定，例如用標(biāo)準(zhǔn)的層析法諸如高效液相層析(HPLC)測(cè)定。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)從下面的最佳實(shí)施例的描述中將顯而易見。
詳細(xì)描述首先描述附圖。附1是顯示涉及一生物測(cè)定步驟的圖解說明，該生物測(cè)定確定一種輔助的、得自宿主的第二信號(hào)是否能夠引發(fā)觸發(fā)類異戊二烯生物合酶的誘導(dǎo)。將加Cryptogein引發(fā)蛋白和不加Cryptogein引發(fā)蛋白的Murashige-Skoog(Ms)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的煙草細(xì)胞在透析管(1,000道爾頓截留)中密封不同的時(shí)間，且在外部Ms培養(yǎng)基渣培養(yǎng)。隨后收集外部MS培養(yǎng)基樣品，通過凍干濃縮，并評(píng)價(jià)在新鮮制備的煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中能誘導(dǎo)倍半萜烯合酶活性的分子的存在。
圖2是一曲線圖，它表示從煙草細(xì)胞釋放一種可擴(kuò)散第二信號(hào)的時(shí)間進(jìn)程。10ml煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物加4μg引發(fā)蛋白被密封于透析管中，并于外部MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在指定時(shí)間收集外部MS培養(yǎng)基樣品，通過凍干濃縮6倍，將相當(dāng)于收集樣品1/20的樣品等份用于測(cè)試其在煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中誘導(dǎo)倍半萜烯合酶活性的能力。
圖3是一曲線圖，顯示在用引發(fā)蛋白處理或用引發(fā)蛋白條件培養(yǎng)基處理的煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中，對(duì)倍半萜炮合酶誘導(dǎo)的時(shí)間進(jìn)程的比較。在從對(duì)照培養(yǎng)物(如空心圓所示)、接受對(duì)照條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)物(CCM，如空心方塊所示)、引發(fā)蛋白條件培養(yǎng)基(ECM，如實(shí)心方塊所示)、或引發(fā)蛋白(0.1μg/ml)(如實(shí)心圓所示)制備的提取物中測(cè)定倍半萜烯酶的活性；以相應(yīng)于收集的外部MS培養(yǎng)基樣品1/20的濃度加入條件培養(yǎng)基樣品(CCM或ECM)。
圖4A、4B、4C、4D及4E是RNA印跡的照片，顯示了在用ECM處理的煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中對(duì)植物防御基因表達(dá)的誘導(dǎo)。該印跡用下列基因探針雜交倍半萜烯合酶(圖4A)、酸性幾丁質(zhì)酶(圖4B)、堿性幾丁質(zhì)酶(圖4C)、PRl(圖4D)及Hsr203(圖4E)。
圖5是圖解說明，它表示ECM不調(diào)節(jié)另一種可擴(kuò)散第二信號(hào)的產(chǎn)生。將密封于透析管中的具有或不具有5ml煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的Ms培養(yǎng)基或ECM樣品(5ml)在25ml外部MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)3、6及12小時(shí)后，取出1毫升等份的外部MS培養(yǎng)基，通過凍干濃縮，并將再懸浮樣品的一半用于測(cè)試在煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中誘導(dǎo)倍半萜烯合酶的能力。
現(xiàn)在接著描述一系列實(shí)驗(yàn)，來報(bào)道激活類異戊二烯合酶基因表達(dá)的、可擴(kuò)散的、得自宿主的信號(hào)化合物的分離和特征記述。為了說明本發(fā)明之目的而提供該實(shí)施例，不應(yīng)認(rèn)為僅限于此。在煙草細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)倍半萜烯合酶活性的第二信號(hào)的生物測(cè)定

圖1顯示一實(shí)驗(yàn)策略，用于研究引發(fā)物攻擊過的煙草細(xì)胞的可擴(kuò)散的、得自宿主的信號(hào)釋放。條件培養(yǎng)基樣品制備如下將2ml細(xì)胞、2ml含0.5μg引發(fā)蛋白的MS培養(yǎng)基(僅含引發(fā)蛋白的培養(yǎng)基)、或2ml細(xì)胞(CCM)和0.5μg引發(fā)蛋白(ECM)密封于截留值為1,000道爾頓的透析管中，并將每個(gè)樣品于20ml外部MS培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)16小時(shí)。然后通過凍干把每個(gè)處理的外部MS培養(yǎng)基樣品濃縮8倍，并在50μl的等份(相當(dāng)于最初20ml培養(yǎng)基樣品的1/50)和1ml煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物一起進(jìn)行第二次培養(yǎng)中，測(cè)定它對(duì)倍半萜烯合酶誘導(dǎo)的能力。
這些測(cè)定的結(jié)果示于表Ⅰ(下面)。發(fā)現(xiàn)在單獨(dú)的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的煙草細(xì)胞所含倍半萜烯合酶的活性水平是測(cè)不出來的。然而在用引發(fā)蛋白直接處理的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)倍半萜烯合酶活性被誘導(dǎo)。為了確定可擴(kuò)散信號(hào)的存在，發(fā)現(xiàn)對(duì)照條件培養(yǎng)基(CCM)(即密封在透析管內(nèi)煙草細(xì)胞在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)所產(chǎn)生的外部MS培養(yǎng)基)不誘導(dǎo)倍半萜烯合酶的活性。對(duì)比之下，發(fā)現(xiàn)引發(fā)蛋條件培養(yǎng)基(ECM)(即在透析管內(nèi)的煙草加引發(fā)蛋白于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)所產(chǎn)生的外部培養(yǎng)基)誘導(dǎo)倍半萜烯合酶的活性，其誘導(dǎo)酶活性的程度與直接將Cryptogein引發(fā)蛋白加入細(xì)胞中的程度相類似。因?yàn)閮H含引發(fā)蛋白的培養(yǎng)基(即透析管內(nèi)的一等份引發(fā)蛋白在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)所產(chǎn)生的外部MS培養(yǎng)基)不誘導(dǎo)顯著的合酶活性，所以通過ECM誘導(dǎo)的合酶活性不是由于引發(fā)蛋白制備物內(nèi)的某些低分子量可擴(kuò)散的組分引起的。
表Ⅰ
在煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中由ECM導(dǎo)致的倍半萜烯合酶活性的劑量依賴型誘導(dǎo)為了評(píng)價(jià)倍半萜烯合酶活性的誘導(dǎo)是否是劑量依賴型的，將煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物與不同量的引發(fā)蛋白或ECM一起培養(yǎng)。條件培養(yǎng)基樣品制備如下把20ml單獨(dú)的細(xì)胞或含8μg引發(fā)蛋白的20ml細(xì)胞密封到截留值為1,000道爾頓的透析管中，并在50ml MS培養(yǎng)中培養(yǎng)16小時(shí)。然后通過凍干將外部MS培養(yǎng)基樣品濃縮5倍，相當(dāng)于最初50ml樣品的1/200、1/50和1/25的等份被用于評(píng)估在煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中誘導(dǎo)倍半萜烯合酶的能力。對(duì)照分析包括將4ml煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物和適量的MS培養(yǎng)基(即單一的MS)一起培養(yǎng)，并把細(xì)胞同0.5μg/ml引發(fā)蛋白及適量的MS培養(yǎng)基(即MS加引發(fā)蛋白)一起培養(yǎng)。
如表Ⅱ所示(下面)，觀察到在煙草細(xì)胞中ECM誘導(dǎo)的倍半萜烯合酶活性是劑量依賴型的。用等于外部MS培養(yǎng)基的1/25至1/50的量通常觀察到對(duì)合酶活性的最大誘導(dǎo)。此計(jì)算假定外部培養(yǎng)基與密封于透析管內(nèi)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化體積比分別為2.5∶1，然而，外部培養(yǎng)基與密封細(xì)胞體積的比例為5∶1至10∶1則看來表示對(duì)可擴(kuò)散第二信號(hào)的提取更有效。
表Ⅱ
如圖2所示，可擴(kuò)散信號(hào)化合物從煙草細(xì)胞培養(yǎng)物的釋放是時(shí)間依賴型的，在引發(fā)蛋白處理啟動(dòng)4小時(shí)內(nèi)，約為最大量1/2的可擴(kuò)散信號(hào)組分被釋放出來。也觀察到另一第二信號(hào)因子在緊接著的20小時(shí)內(nèi)的較慢釋放?？蓴U(kuò)散化合物對(duì)選用的水解酶有抗性為了確定信號(hào)化合物的化學(xué)性質(zhì)，評(píng)價(jià)了ECM對(duì)幾種水解酶的敏感性。制備起始濃度為10mg/ml的各種水解酶(即米曲霉Ⅱ型蛋白酶、種名未定的根瘤菌(Rhizobus)果膠酶、牛胰RNA酶A及DNA酶Ⅰ)并于1,000道爾頓截留管中透析過夜。然后將相當(dāng)于5mg等份的水解酶與1ml ECM溫育2-4小時(shí)。所述ECM-水解酶混合物在1,000道爾頓截留透析管中，對(duì)5ml水進(jìn)行第二次透析。收集外部水樣品，凍干，以終體積為100μl重新懸浮，并在測(cè)定倍半萜烯合酶酶活性之前將每個(gè)樣品與煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物一起培養(yǎng)16小時(shí)。
用蛋白酶、果膠酶、RNA酶或DNA酶處理ECM不破壞ECM誘導(dǎo)合酶活性的能力(表Ⅲ)，表明該因子或者是對(duì)這些酶有抗性，或者該因子不是蛋白質(zhì)或含果膠的因子，不是RNA或DNA因子。該可擴(kuò)散化合物也不太可能是H2O2或相關(guān)活化的氧物質(zhì)，因?yàn)橛眠^氧化氫酶處理ECM、凍干ECM都不減少合酶誘導(dǎo)活性；曾期望用這兩種處理消除ECM中的H2O2或相關(guān)的氧基(數(shù)據(jù)未顯示)。與此看法一致的是，向所述細(xì)胞培養(yǎng)物直接加入各種各樣濃度的H2O2沒有誘導(dǎo)合酶的活性。另外，該擴(kuò)散信號(hào)看來不是疏水性的，因?yàn)樗环峙涞街T如氯仿或己烷的有機(jī)溶劑中；通過這些處理也不改變ECM激活倍半萜烯活性的能力。
表Ⅲ<
作為主要誘導(dǎo)物的可擴(kuò)散信號(hào)可擴(kuò)散信號(hào)可能或者代表第一誘導(dǎo)物(即施行誘導(dǎo)防御反應(yīng)所有組成成分的信號(hào)傳導(dǎo)鏈的整合組分)，或該信號(hào)可能代表第二信息(即相對(duì)低效且特異性誘導(dǎo)防御反應(yīng)的組分，它可能從壞死細(xì)胞非特異性地釋放出來)。如果可擴(kuò)散因子為第一誘導(dǎo)物，那么可以預(yù)期該因子誘導(dǎo)倍半萜烯合酶酶活性和其它防御反應(yīng)的內(nèi)在活性大于引發(fā)蛋白本身誘導(dǎo)的活性。為了區(qū)別這些可能性，用最適量的ECM和引發(fā)蛋白測(cè)定了誘導(dǎo)倍半萜烯合酶活性的時(shí)間進(jìn)程。
如圖3所示，和單一的引發(fā)蛋白處理相比，ECM處理導(dǎo)致對(duì)合酶活性明顯較快的誘導(dǎo)，在ECM處理開始后5-6小時(shí)產(chǎn)生最大活性一半的活性，而在單一引發(fā)蛋白處理開始后10或更長時(shí)間，才達(dá)到最大活性的一半。然而，至處理開始后14-15小時(shí)時(shí)，ECM處理和單一引發(fā)蛋白處理都誘導(dǎo)合酶活性達(dá)到同樣最大的活性水平。
由于ECM和引發(fā)蛋白的這種有差異的合酶誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)程也延伸至合酶mRNA穩(wěn)定狀態(tài)的測(cè)定(圖4A)。在處理開始后3至6小時(shí)首先觀測(cè)到引發(fā)蛋白誘導(dǎo)的合酶mRNA，并且在整個(gè)14小時(shí)的實(shí)驗(yàn)中，合酶mRNA的含量呈現(xiàn)出累積。相比之下，ECM處理誘導(dǎo)合酶mRNA的快速累積，在處理開始后大約3小時(shí)產(chǎn)生mRNA的最大聚積(圖4A)。在3小時(shí)以后，合酶mRNA的水平下降。引發(fā)物和引發(fā)蛋白處理通常與幾個(gè)其它防御基因的誘導(dǎo)相聯(lián)系，這些基因包括PR蛋白基因和諸如幾丁質(zhì)酶及葡聚糖酶的水解酶基因。
為了評(píng)價(jià)由ECM誘導(dǎo)的防御基因系列，測(cè)定了幾丁質(zhì)酶、PRl和Hsr203的基因誘導(dǎo)類型，并與由引發(fā)蛋白處理的誘導(dǎo)類型相比較(圖4B-4E)。與引發(fā)蛋白處理相比，ECM處理更快速地誘導(dǎo)酸性和堿性幾丁質(zhì)酶(圖4B和4C)，盡管對(duì)于合酶mRNA的誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)程而言，此誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)程被相對(duì)大大地推遲了。PRl mRNA容易在對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測(cè)到，且如果ECM或引發(fā)蛋白處理對(duì)這種mRNA的水平有調(diào)節(jié)，看來也是很小的(圖4D)。在對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物中也檢測(cè)到Hsr203mRNA，但它的表達(dá)水平既被ECM處理誘導(dǎo)又被引發(fā)蛋白處理誘導(dǎo)(圖4E)。然而，基于雜交信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度，與引發(fā)蛋白處理相比，ECM處理誘導(dǎo)更多Hsr203 mRNA的積累?？蓴U(kuò)散信號(hào)不控制另一信號(hào)的釋放如果在ECM中發(fā)現(xiàn)的可擴(kuò)散信號(hào)作為警告相鄰細(xì)胞有病原體攻擊的一種手段而起作用，那么它也可能刺激另外的可擴(kuò)散信號(hào)從其接觸的細(xì)胞釋放。為了評(píng)價(jià)這種可能性，將來自密封于含ECM且截留值為1,000道爾頓的透析管中細(xì)胞的可擴(kuò)散因子的釋放和來自密封于透析管中單一ECM的可擴(kuò)散因子的釋放進(jìn)行了比較(圖5)。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)的最初3小時(shí)內(nèi)，大多數(shù)可擴(kuò)散因子從單一ECM樣品中釋放出來。同樣在這個(gè)時(shí)間框內(nèi)，一水平略低的可擴(kuò)散信號(hào)從ECM加細(xì)胞的處理中被釋放出來。在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)，在ECM加細(xì)胞的樣品中檢測(cè)不到另外的可擴(kuò)散因子，表明該可擴(kuò)散信號(hào)本身不誘導(dǎo)其它信號(hào)分子的釋放。
用下面的技術(shù)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)物和實(shí)驗(yàn)處理將煙草栽培品種Kentucky 14細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物保存于Murashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基中，每周繼代培養(yǎng)一次，并根據(jù)Chappell和Nable(Plant Physiol.85:469-473,1987)所述，通過測(cè)定鮮重的增加來監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長?？焖偕L期的培養(yǎng)物用于上面介紹的所有實(shí)驗(yàn)中。在12孔組織培養(yǎng)板上常規(guī)地進(jìn)行誘導(dǎo)處理，每孔含1ml等份的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。通過在每毫升細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中加入0.1-至0.5μg隱地疫霉的Cryptogein引發(fā)蛋白，開始引發(fā)物處理(Blein等Plant Physiol.95:486-491,1991)。通過真空抽濾收獲細(xì)胞并于液氮中冷凍保藏直至分析。為了分析一可擴(kuò)散的、得自宿主的第二信號(hào)，將煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物等份加或不加Cryptogein引發(fā)蛋白，密封到1,000道爾頓分子量截留值的透析膜內(nèi)(specrta/por)。然后把該透析管在MS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，且在不同的時(shí)期收集所述外部MS培養(yǎng)基樣品并凍干。用無菌水重新懸浮凍干樣品，其濃度比收集樣品的高5至10倍，并如上所述，在煙草培養(yǎng)物中直接用于隨后的倍半萜烯合酶的培養(yǎng)分析。倍半萜烯合酶酶分析在400-800μl 80mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、20％甘油、10mM焦亞硫酸氫鈉、10mM維生素C鈉鹽、15mM氯化鎂及5mM DTT中，用一為用于eppendorf管而設(shè)計(jì)的機(jī)械勻漿器把冰凍的煙草細(xì)胞勻漿，并將產(chǎn)生的漿液在小離心機(jī)中以12,000g離心10分鐘。所述合酶分析進(jìn)行如下在用150μl正己烷抽提前，將5-10μl等份的上清液(總蛋白5-25μg)、1.5納摩爾[3H]FPP(87μCi/μmol)及足夠的反應(yīng)緩沖液(0.5M Tris pH7.5.,0.2M MgCl2)混合，使終體積為50μl，于37℃溫育30分鐘。然后，將己烷相與二氧硅粉末反應(yīng)，以結(jié)合由磷酸酶活性產(chǎn)生的任何法呢醇。然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定一等份(50μl)己烷相樣品中的放射性。倍半萜烯合酶的活性表示為每小時(shí)每毫克蛋白形成的環(huán)狀產(chǎn)物的納摩爾量。Whitehead和Threlfall(1992)先前將所述倍半萜烯產(chǎn)物的確定結(jié)構(gòu)描述為5-表-馬兜鈴烯。RNA印跡按Pepper等(Cell 78:109-116,1994)所述提取細(xì)胞總RNA并雜交。雜交探針為煙草倍半萜烯合酶cDNA(Back和Chappell,J.Biol.Chem.270:7375-7381(1995))、酸性和堿性幾丁質(zhì)酶(參見例如Lawton等，Plant Mol.Biol.19:735-743)、PRl(參見例如Payne等，Plant MolBiol.11:89-94,1988)和HSR 203(參見例如Pontier等，Plant J.5:507-521,1994)。特征鑒定通過用常規(guī)純化方法完成對(duì)大致純的引發(fā)物誘導(dǎo)的組合物(例如ECM)的進(jìn)一步分析。例如，用諸如層析(如離心交換層析、分子量大小凝膠過濾層析、HPLC或RP-HPLC)、氣相色譜法(GC)、GC-質(zhì)譜法或其它光譜學(xué)的方法例如紅外線及核磁共振譜法的這些技術(shù)，進(jìn)行所述組合物進(jìn)一步的特征鑒定和分級(jí)分離。另外，在各種標(biāo)準(zhǔn)條件下，采用種種水解酶(例如纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠酶、溶果膠酶、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶或蛋白酶)以及標(biāo)準(zhǔn)酸-堿水解，測(cè)定本發(fā)明引發(fā)物誘導(dǎo)的組合物的其它特性。用途本文描述的本發(fā)明可用于種種農(nóng)業(yè)和商業(yè)目的，包括(但不限于)控制、調(diào)節(jié)或調(diào)控基因的表達(dá)(例如，藥學(xué)上有用的化合物的表達(dá))、增加作物產(chǎn)量、改良作物和觀賞植物品質(zhì)及降低農(nóng)產(chǎn)品成本。本發(fā)明方法為制備大致純的組合物提供了一種簡易的方法，對(duì)于多種類異戊二烯化合物(例如，諸如甾醇、類胡蘿卜素的代謝物、生長調(diào)節(jié)劑及多萜醇的聚異戊二烯醇(polyprenol)取代物、醌和蛋白質(zhì)；單萜；二萜及倍半萜烯)中的任一種，所述組合物能激活參與其合成的基因。通過活化這些基因途徑，所述組合物調(diào)節(jié)各種各樣的生物功能，包括但不限于膜完整性的保持、光保護(hù)作用和有關(guān)防御的相互作用。因而，本文描述的方法對(duì)用作植物保護(hù)劑的組合物的制備具有農(nóng)業(yè)價(jià)值。
可從各種各樣的植物制備這種引發(fā)物誘導(dǎo)的組合物，所述植物包括但不限于樹類、觀賞植物類、溫帶水果類、熱帶水果類、蔬菜類、豆科植物類、單子葉植物、雙子葉植物、或具有商業(yè)或農(nóng)業(yè)意義的任何植物。合適植物的具體實(shí)例包括但不限于松柏類植物、矮牽牛屬植物、番茄、土豆、煙草、萵苣、向日葵、油籽油菜(oilseed rape)、亞麻、棉花、糖甜菜、芹菜、大豆、苜蓿、苜蓿屬、荷、豇豆屬、黃瓜、胡蘿卜、茄子、花椰菜、辣根、牽牛花、楊樹、胡桃屬植物、蘋果樹、石刁柏、水稻、玉米、黍、洋蔥、大麥、果園草、燕麥、黑麥和小麥。
為了農(nóng)業(yè)的目的，本文公開方法的引發(fā)物誘導(dǎo)的組合物或用本文公開的方法鑒定的因子(agent)，可象藥劑一樣用作撒到植物葉子上的噴藥或粉劑。通常，在病原體攻擊前將這類因子施于所述植物表面以預(yù)防感染。也可處理種子、鱗莖、根、塊莖和球莖，通過控制攜帶在其上的病原體或存在于栽種地土壤中的病原體，來防止栽種后病原體的攻擊。也可把引發(fā)物誘導(dǎo)的組合物用作熏蒸劑處理栽培蔬菜、觀賞植物、灌木或樹的土壤，以控制種種微生物病原體。最好在栽種前幾天或幾周進(jìn)行處理。本發(fā)明的組合物能通過例如拖拉機(jī)的標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械化方法施用或用手工施用。
本發(fā)明組合物也應(yīng)用于發(fā)揚(yáng)或改善各種各樣植物的特性，所述特性包括光保護(hù)作用或生長調(diào)節(jié)物或植物色素的合成。
在本說明書中提到的所有出版物在同等程度上通過引用結(jié)合到本文中，好象每個(gè)單獨(dú)的出版物被具體而單獨(dú)指明通過引用而結(jié)合似的。其它實(shí)施例顯然，根據(jù)上面描述可以對(duì)本文描述的本發(fā)明進(jìn)行變動(dòng)和修改，以便使其用于不同的用途和條件下。
權(quán)利要求
1．制備組合物的方法，該組合物能激活參與類異戊二烯合成的基因的表達(dá)，所述方法包括(a)在允許釋放激活類異戊二烯合成的一種化合物的條件下，用一引發(fā)物與植物細(xì)胞接觸；以及(b)回收包含所述化合物的組合物，其中所述化合物是可擴(kuò)散的，并具有小于或等于10,000道爾頓的分子量。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是可擴(kuò)散的，并具有小于或等于1,000道爾頓的分子量。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物通過透析回收。
4．權(quán)利要求1的組合物，其中所述引發(fā)物為Cryptogein。
5．按照權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的大致純的組合物。
6．大致純的引發(fā)物誘導(dǎo)的組合物，所述組合物能激活參與類異戊二烯合成的基因的表達(dá)。
7．權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物包含一種化合物，它具有小于或等于10,000道爾頓的分子量。
8．權(quán)利要求7的組合物，其中所述化合物具有小于或等于1,000道爾頓的分子量。
9．權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物在75-80℃的溫度下熱穩(wěn)定15分鐘。
10．權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物對(duì)凍融循環(huán)穩(wěn)定。
11．權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物對(duì)凍干穩(wěn)定。
12．權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物在有機(jī)溶劑中不容易溶解。
13．權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物在植物細(xì)胞中激活倍半萜烯合酶的活性。
14．權(quán)利要求13的組合物，其中所述活化的倍半萜烯合酶活性是表-5-馬兜鈴烯(epi-5-aristolochene)合酶活性。
全文摘要
公開了制備一種組合物的方法,該組合物能激活參與類異戊二烯合成的基因的表達(dá),該方法包括:(a)用允許引發(fā)物誘導(dǎo)釋放激活類異戊二烯合成的一種化合物的條件下,使植物細(xì)胞與引發(fā)物接觸;以及(b)回收包含該化合物的組合物,其中該化合物是可擴(kuò)散的并具有小于或等于10,000道爾頓的分子量。同樣公開了一大致純的引發(fā)物誘導(dǎo)的組合物,該組合物能夠激活參與植物類異戊二烯合成的基因。
文檔編號(hào)A61K36/81GK1221317SQ97195318
公開日1999年6月30日 申請(qǐng)日期1997年4月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月12日
發(fā)明者J·查佩爾, M·魯索 申請(qǐng)人:肯塔基州州立大學(xué)托管委員會(huì)