專利名稱：肌萎縮性側(cè)索硬化的治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)疾病特別是肌萎縮性側(cè)索硬化的新方法。還涉及能長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)治療因子并可用于治療ALS的載體和藥物組合物。更準(zhǔn)確地講，本發(fā)明涉及系統(tǒng)性給予治療基因治療ALS的方法。
肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，也稱為Charcot病和Lou Gehrig病，由Charcot在1865年第一次報(bào)道。ALS是一種由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和皮層背髓束的退化造成的致死性疾病。ALS現(xiàn)今的新增病例發(fā)生率為2.5/100000并在持續(xù)增長(zhǎng)，新舊病例總發(fā)生率為6-10/100000，在發(fā)達(dá)國(guó)家在大部分仍年輕的成人(50-60歲之間)中有90000人患ALS。該病伴有進(jìn)展性麻痹，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)和呼吸功能的完全喪失，然后導(dǎo)致死亡，這在癥狀第一次出現(xiàn)后的2-8年期間(平均3年)發(fā)生。
5％的ALS病例是家族源性的，而95％的病例是偶發(fā)的。偶發(fā)型ALS的病理生理學(xué)起因仍然未知，但提出過多種假設(shè)。神經(jīng)元退化可能造成谷氨酸代謝的改變，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)皮層和脊髓中這種興奮性氨基酸的濃度增加(“興奮毒性”假說，見Rothstein,1995中的綜述)?；谠谀承┎∪酥写嬖诳闺妷好舾行遭}通道的自身抗體，還提出了自身免疫的可能性(見Appel等，1995中的綜述)。環(huán)境因素的參與也是可能的，如某些病毒的感染(見Gastant,1995的綜述)或與鋁的接觸(Yase,1984)。
對(duì)遺傳性ALS的研究已顯示銅和鋅超氧化物歧化酶基因(位于染色體21q 22-1上)中的一些點(diǎn)突變對(duì)20％家族性ALS的病因負(fù)責(zé)(Rosen等，1993，綜述見Rowland,1995)。這些突變并不引起超氧化物歧化酶(SOD)活性的減弱(綜述見Rowland,1995)。這些突變的酶產(chǎn)生潛在細(xì)胞毒性的羥基自由基，而野生型SOD并不產(chǎn)生這種自由基(Yim等，1996)。對(duì)于突變對(duì)SOD酶活性和細(xì)胞存活的功能效應(yīng)的深入研究可能最終使人理解家族型ALS的病生學(xué)，進(jìn)而明了各種形式ALS的病生學(xué)。
對(duì)于可能影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活的因子的研究顯示許多神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有潛在神經(jīng)保護(hù)作用(Windebank,1995的綜述；Henderson,1995)。例如，已在體外觀察到BDNF(Oppenheim等，1992,Yan等，1992,Sendtner等，1992,Henderson等，1993,Vejsada等，1995)、NT-3(Henderson等，1993)、GDNF(Henderson等，1994,Oppenheim等，1995)、三種細(xì)胞因子CNTF、LIF(Henderson,1995的綜述)和心臟營(yíng)養(yǎng)素-1(cardiotrophine-1,Pennica等，1996)、及IGF-1(Lewis等，1993)和FGF家族的成員(Hughes等，1993)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元保護(hù)作用。這些資料總體上提示，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在不同的實(shí)驗(yàn)條件下增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活力。但神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在ALS動(dòng)物模型中的應(yīng)用或在人的臨床應(yīng)用中迄今還沒有給出有說服力的結(jié)果。這種應(yīng)用從未顯示過治療效果，而且總伴隨著不希望的付作用，如體重減少、炎癥、發(fā)熱等，這都限制了營(yíng)養(yǎng)因子在ALS治療中的意義，并導(dǎo)致了由Regeneron進(jìn)行的第一批ALS-CNTF臨床試驗(yàn)(系統(tǒng)給藥)半途中止(Barinaga等，1994)。因而迄今仍不能證實(shí)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)ALS治療的意義，也不能探索其作為一種可能治療途經(jīng)的特點(diǎn)。
鑒于此，現(xiàn)今還不存在任何治愈ALS的方法，具有療效的藥物也很少。Rilutek是現(xiàn)有的唯一治療途徑。給予riluzole(Rilutek)能延緩疾病的述展，但它沒有顯示出對(duì)運(yùn)動(dòng)功能的治療效果。另外，給予CNTF的臨床試驗(yàn)也由于沒有結(jié)果而半途中止(Barinaga等，1994)。因而現(xiàn)今確實(shí)而且迫切地需要一種治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病特別是ALS的方法。
本發(fā)明的目的特別在于提供一種治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病如ALS的基于基因治療的新途徑。更具體地講，本發(fā)明描述了通過有效持久表達(dá)某些營(yíng)養(yǎng)因子能直接改善這種疾病中涉及的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活力的載體系統(tǒng)。
本發(fā)明第一方面涉及一種ALS的治療方法，包括系統(tǒng)性給予編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的核酸。本發(fā)明的另一方面涉及編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的核酸在制備用于治療ALS的藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一方面在于特別載體的構(gòu)建，該載體能表達(dá)對(duì)ALS治療有效量的營(yíng)養(yǎng)因子。本發(fā)明的另一方面涉及能產(chǎn)生一種或多種營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)系統(tǒng)在治療中的施用，以及含有這些表達(dá)系統(tǒng)的藥物組合物。本發(fā)明還涉及能在體內(nèi)共同表達(dá)幾種營(yíng)養(yǎng)因子的幾種新載體的構(gòu)建。
因而本發(fā)明更準(zhǔn)確地講涉及一種基于營(yíng)養(yǎng)因子的體內(nèi)持續(xù)表達(dá)的ALS的新治療方法。
本發(fā)明現(xiàn)證明通過神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的體內(nèi)產(chǎn)生可能獲得特別顯著的體內(nèi)療效。本申請(qǐng)人特別證實(shí)體內(nèi)系統(tǒng)性注射神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)系統(tǒng)，能夠獲得治療因子的持續(xù)產(chǎn)生，并且治療劑的產(chǎn)生足以在神經(jīng)元疾病特別是ALS中取得療效。例如，申請(qǐng)人證實(shí)施用這些表達(dá)系統(tǒng)可導(dǎo)致存活期的非常顯著的提高，伴隨著運(yùn)動(dòng)肌回應(yīng)的改善，后者如可用肌電描記術(shù)測(cè)得。所述的這些結(jié)果證明這種給藥途徑能獲得神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的適當(dāng)生物利用度，而無毒性作用。因而這種治療途徑能夠產(chǎn)生治療活性量的分子，而保持在這些分子的毒性閾之下。因而，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子類蛋白系統(tǒng)給藥時(shí)由于存在血腦屏障只能低效穿至神經(jīng)系統(tǒng)中，而本發(fā)明的方法卻意外地能獲得顯著療效。另外，本發(fā)明的方法還能使用低于毒性閾值的治療因子劑量，不會(huì)引起付作用。
本發(fā)明的目的之一是一種ALS的治療方法，包括系統(tǒng)性給予一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的另一目的是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)系統(tǒng)在制備用于系統(tǒng)性給藥治療ALS的藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種延長(zhǎng)患ALS之哺乳動(dòng)物壽命的方法，包括系統(tǒng)性給予一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)系統(tǒng)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)系統(tǒng)”指能在體內(nèi)表達(dá)編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之核酸的任何構(gòu)建物。該表達(dá)系統(tǒng)最好包括處于一種轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下的編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的核酸(表達(dá)盒)。這種核酸可以是DNA或RNA。對(duì)于DNA，可以使用cDNA、gDNA或雜合DNA，即含有g(shù)DNA一個(gè)或多個(gè)(但不是全部)內(nèi)含子的DNA。DNA還可以是合成的或半合成的，特別是用于優(yōu)化密碼子或構(gòu)建截短形式核酸的人工合成DNA。
轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子可以是在一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞(優(yōu)選人細(xì)胞)中有功能的任何啟動(dòng)子。當(dāng)在相關(guān)細(xì)胞或機(jī)體中可能有功能時(shí)，可以是負(fù)責(zé)所用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的天然啟動(dòng)子區(qū)。也可以是不同來源的啟動(dòng)子區(qū)(負(fù)責(zé)其他蛋白的表達(dá)，或甚至是合成的)。特別是真核基因或病毒基因的啟動(dòng)子區(qū)。例如，可以用來自靶細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子區(qū)。在真核啟動(dòng)子中可以使用刺激或抑制基因轉(zhuǎn)錄的任何啟動(dòng)子或衍生序列，這種刺激或抑制可以是特異性或非特異性的，可誘導(dǎo)或不可誘導(dǎo)的，強(qiáng)的或弱的。特別可以使用遍在性啟動(dòng)子(HPRT、PGK、α-肌動(dòng)蛋白、微管蛋白等基因的啟動(dòng)子)，中間絲蛋白的啟動(dòng)子(GFAP、結(jié)蛋白、波形蛋白、神經(jīng)絲、角蛋白等基因的啟動(dòng)子)，治療基因的啟動(dòng)子(如MDR、CFTR、Ⅷ因子、ApoA I等基因的啟動(dòng)子)，組織特異性啟動(dòng)子(丙酮酸激酶、絨毛蛋白、脂肪酸結(jié)合腸蛋白、平滑肌α-肌動(dòng)蛋白等基因的啟動(dòng)子)或?qū)Υ碳の飸?yīng)答的啟動(dòng)子(類固醇激素受體、視黃酸受體等)。同樣，可以使用來自病毒基因組的啟動(dòng)子序列，例如腺病毒E1A和MLP基因的啟動(dòng)子，CMV早期啟動(dòng)子，或RSV的LTR啟動(dòng)子等。另外，這些啟動(dòng)子區(qū)可被修飾，如加入活化序列、調(diào)節(jié)序列或使得能組織特異性(或主要)表達(dá)的序列。
在本發(fā)明中最好使用真核或病毒的組成型啟動(dòng)子，特別是選自如下的啟動(dòng)子HPRT、PGK、α-肌動(dòng)蛋白、微管蛋白基因的啟動(dòng)子，或腺病毒E1A和MLP基因的啟動(dòng)子，CMV的早期啟動(dòng)子，或RSV的LTR啟動(dòng)子。
另外，表達(dá)盒中最好帶有指導(dǎo)合成產(chǎn)物至靶細(xì)胞分泌途徑中的信號(hào)序列。這種信號(hào)序列可以是合成產(chǎn)物的天然信號(hào)序列，但也可以是任何其他功能性信號(hào)序列，或是一種人工信號(hào)序列。
最后，表達(dá)盒一般含有位于3′端的一個(gè)區(qū)，它編碼轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和多聚腺苷酸化位點(diǎn)。
可用于本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)因子基本分為三個(gè)家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族、神經(jīng)因子家族和TGFβ家族(綜述見Henderson Adv.Neurol.68(1995)235)。
在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中本發(fā)明更優(yōu)選使用BDNF、NT-3或NT-4/5。
由Thoenen(神經(jīng)科學(xué)趨勢(shì)(Trends in Neurosci),14 (1991)165)報(bào)道的大腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是一種118個(gè)氨基酸的蛋白，分子量為13.5kD。在體外，BDNF刺激軸突的形成和視網(wǎng)膜節(jié)神經(jīng)元、中隔膽堿能神經(jīng)元及中腦多巴胺神經(jīng)元的培養(yǎng)存活期(綜述見Lindsay在《神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子》(Neurotrophic Factors),(1993)257,Academic Press中的文章)。編碼人BDNF和大鼠BDNF的DNA序列(Maisonpierre等，基因組(Genomics)10(1991)558)、特別是編碼豬BDNF的序列(Leibrock等，自然(Nature)341(1989)149)已被克隆和測(cè)序。盡管這些營(yíng)養(yǎng)因子的特性可能令人感興趣，但BDNF的治療應(yīng)用遇到了許多障礙。特別是BDNF缺乏生物可利用性，限制了其任何治療應(yīng)用。本發(fā)明中產(chǎn)生的大腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)可以是人BDNF或動(dòng)物BDNF。
神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT3)是一種119個(gè)氨基酸的分泌蛋白，其在體外甚至在很低濃度下也能改善神經(jīng)元的生存(Henderson等，自然363,266-270(1993))。已報(bào)道了編碼人NT3的cDNA的序列(Holn等，自然344(1990)339)。
TGF-β家族特別包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF(L.-F.Lin等，科學(xué)(Science),260,1130-1132(1993))是一種134個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為16kD。它具有體外促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活的重要特性(綜述見Henderson,1995)。本發(fā)明中產(chǎn)生的GDNF可以是人GDNF或動(dòng)物GDNF。編碼人GDNF和大鼠GDNF的cDNA序列已被克隆并測(cè)序(C.-F.Lin,D.Doherty,J.Lile,S.Besktesh,F.Collins，科學(xué)，260,1130-1132(1993))。
可用于本發(fā)明的另一神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是CNTF(“CiliaryNeuroTrophic Factor”睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)。CNTF是一種可能阻止神經(jīng)元死亡的神經(jīng)因子。如前文所提到的，臨床試驗(yàn)由于沒有結(jié)果而半途中止。本發(fā)明現(xiàn)能單獨(dú)或與其他營(yíng)養(yǎng)因子一起在體內(nèi)持久連續(xù)地產(chǎn)生CNTF，用于治療ALS。人和鼠CNTF的cDNA和基因已被克隆和測(cè)序(EP385060；WO91/04316)。
可用于本發(fā)明的其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子例如有IGF-1(Lewis等，1993)和成纖細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFa,FGFb)。特別是IGF-1和FGFa，它們是特別有意義的侯選物。FGFa基因的序列以及其體內(nèi)表達(dá)載體在文獻(xiàn)中已有報(bào)道(WO95/25803)。
編碼BDNF、GDNF、CNTF及NT3的基因?qū)?shí)施本發(fā)明特別有意義。
根據(jù)第一種實(shí)施方案，本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)在體內(nèi)只產(chǎn)生一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。這時(shí)，該表達(dá)系統(tǒng)只含有一種表達(dá)盒。優(yōu)選本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)可在體內(nèi)產(chǎn)生一種選自神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)因子和TGF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。更優(yōu)選為選自BDNF、GDNF、CNTF、NT3、FGFa和IGF-I的一種因子。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)能在體內(nèi)產(chǎn)生兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。在此實(shí)施方案中，該表達(dá)系統(tǒng)要么含有兩種表達(dá)盒，要么含有能同時(shí)表達(dá)兩種核酸的一種表達(dá)盒(雙順反子單元)。對(duì)于含兩種表達(dá)盒的系統(tǒng)，兩種表達(dá)盒可以使用相同或不同的啟動(dòng)子。
優(yōu)選本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)可在體內(nèi)產(chǎn)生如下的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子組合BDNF+GDNF；BDNF+NT3；GDNF+NT3；CNTF+BDNF；CNTF+NT3；CNTF+GDNF。
有利的是，申請(qǐng)人已證明施用兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)系統(tǒng)可產(chǎn)生強(qiáng)治療效果。在兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)系統(tǒng)中，使用相同或相似效力的啟動(dòng)子，相同或相似的核酸拷貝數(shù)。一般體內(nèi)產(chǎn)生的兩種因子的量相當(dāng)接近。但在某些情形下優(yōu)選產(chǎn)生不同量的每種因子。此時(shí)可使用不同效力的啟動(dòng)子、或?qū)Σ煌虼嬖诓煌截悢?shù)的系統(tǒng)、或變化施用劑量。
在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中，所述一種或多種表達(dá)盒最好是載體的一部分，特別是病毒載體或質(zhì)粒載體。在含多個(gè)表達(dá)盒的表達(dá)系統(tǒng)中，這些表達(dá)盒載于分立的載體中或同一個(gè)載體中。
所用的載體可以是標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒載體，除本發(fā)明的表達(dá)盒外，其含有復(fù)制起點(diǎn)和標(biāo)志基因。另外已報(bào)道了不同類型的改進(jìn)載體，它們不含標(biāo)志基因和復(fù)制起點(diǎn)(PCT/FR96/00274)或含有例如條件性復(fù)制起點(diǎn)(FR9510825)。這些載體可有利地用于本發(fā)明中。
所用的載體還可以是一種病毒載體。已從病毒構(gòu)建了許多載體，其具有轉(zhuǎn)移較大基因的特性?？商貏e舉出腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)和皰疹病毒。為了用作轉(zhuǎn)移基因的載體，修飾這些病毒使其不能在靶細(xì)胞中自主復(fù)制。這些病毒被稱為復(fù)制缺陷型。一般用一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒取代病毒復(fù)制所必需的區(qū)域來修飾基因組。
本發(fā)明中優(yōu)選使用衍生自腺病毒的病毒載體。腺病毒是一些約36kb(千堿基)長(zhǎng)的線性雙鏈DNA病毒。它們的基因組特別含有每一末端的反向重復(fù)序列(ITR)、衣殼化序列(Psi)、早期基因和晚期基因。主要早期基因含于E1、E2、E3和E4區(qū)中，其中含于E1區(qū)中的基因是病毒繁殖必需的。主要晚期基因含于L1至L5區(qū)中。腺病毒Ad5的基因組已被完全測(cè)序，并可從數(shù)據(jù)庫(kù)中得到(特別是Genebank M73260)。同樣，其他腺病毒基因組(Ad2、Ad7、Ad12等)的部分甚至全部也已被測(cè)序。
為了用作基因轉(zhuǎn)移載體，已通過引入不同的治療基因制備了衍生自腺病毒的不同構(gòu)建物。更具體地講，現(xiàn)有技術(shù)中描述的構(gòu)建物是缺失病毒復(fù)制必需的E1區(qū)并在其位置插入了外源DNA序列的腺病毒(Levrero等，基因(Gene)101(1991)195；Gosh-Choudhury等，基因50(1986)161)。另外，為了改善這種載體的特性，已有人提出在腺病毒基因組中制造其他的缺失或修飾。例如已在突變體ts125中引入了一種熱敏感性點(diǎn)突變，使72kDa的DNA結(jié)合蛋白(DBP)失活(Van der Vliet等，1975)。其他載體包括對(duì)病毒復(fù)制和/或增殖必需的另一區(qū)域E4區(qū)的缺失。實(shí)際上E4區(qū)參與晚期基因表達(dá)的調(diào)節(jié)、晚期核RNA的穩(wěn)定性、宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)的消除和病毒DNA復(fù)制的效率。因而缺失了E1和E4區(qū)的腺病毒載體中病毒基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的背景噪音很低。這種載體已在例如專利申請(qǐng)WO94/28152、WO95/02697、WO96/22378中描述。另外還在WO96/10088中描述了在基因IVa2處有修飾的載體。
文獻(xiàn)中描述的重組腺病毒從不同血清型的腺病毒制得。實(shí)際上存在不同的腺病毒血清型，其結(jié)構(gòu)和特性有所區(qū)別，但具有相似的基因結(jié)構(gòu)。更具體地講，這些重組腺病毒可源自人或動(dòng)物。對(duì)于人源的腺病毒，可優(yōu)選舉出劃歸C組的那些，特別是2型(Ad2)、5型(Ad5)、7型(Ad7)或12型(Ad12)腺病毒。對(duì)于源自動(dòng)物的不同腺病毒，可優(yōu)選舉出源自狗的腺病毒，特別是腺病毒CAV2的任何毒株[例如manhattan株或A26/61(ATCCVR-800)]。源自動(dòng)物的其他腺病毒特別在專利申請(qǐng)WO94/26914(引入本文作為參考)中述及。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，重組腺病毒是C組的人腺病毒，更優(yōu)選腺病毒Ad2或Ad5。
這些重組腺病毒是在衣殼化細(xì)胞系中產(chǎn)生的，即反式補(bǔ)充重組腺病毒基因組中一種或多種缺陷功能的細(xì)胞系。這些細(xì)胞系之一例如為293細(xì)胞系，其中已整合了腺病毒基因組的一部分。更準(zhǔn)確地講，293細(xì)胞系是一種人胚腎細(xì)胞系，含有血清型5腺病毒(Ad5)基因組的左端(約11-12％)，包括左側(cè)ITR、衣殼化區(qū)、E1區(qū)(包括Ela和Elb)、編碼蛋白pIX的區(qū)域和編碼蛋白pIVa2的區(qū)域。該細(xì)胞系能夠反式補(bǔ)充E1區(qū)缺陷的重組腺病毒(即不含E1區(qū)全部或部分)，能夠產(chǎn)生高滴度的病毒原液。該細(xì)胞系還能夠在一定溫度(32℃)下產(chǎn)生另外含有熱敏感性E2突變的病毒原液。已報(bào)道了能夠補(bǔ)充E1區(qū)的其他細(xì)胞系，特別是基于人肺癌細(xì)胞A549(WO94/28152)或人成視網(wǎng)膜細(xì)胞(人類基因治療(Hum.Gen.Ther.)(1996)215)的細(xì)胞系。另外，還報(bào)道了能反式補(bǔ)充腺病毒多種功能的細(xì)胞系。特別可舉出補(bǔ)充E1和E4區(qū)的細(xì)胞系(Yeh等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)70(1996)559；癌癥基因治療(Cancer Gen.Ther.)2(1995)322；Krougliak等，人類基因治療，6(1995)1575)和補(bǔ)充E1和E2區(qū)的細(xì)胞系(WO94/28152,WO95/02697,WO95/27071)。一般通過在衣殼化細(xì)胞系中引入病毒DNA，然后在約2或3天后裂解細(xì)胞(腺病毒循環(huán)的動(dòng)力學(xué)為24-36小時(shí))。裂解細(xì)胞后，在氯化銫梯度中離心分離重組腺病毒顆粒。其他替代方法已在專利申請(qǐng)RF9608164(引入本文作為參考)中描述。
治療基因的表達(dá)盒可按現(xiàn)有技術(shù)中描述的技術(shù)插入在重組腺病毒基因組的不同位點(diǎn)。首先可插入在E1缺失部位。還可以插入在E3區(qū)部位，序列插入或替代均可。表達(dá)盒還可以位于缺失的E4區(qū)部位。為了構(gòu)建帶兩種表達(dá)盒的載體，可將一種插入在E1區(qū)部位，另一種插入在E3或E4區(qū)部位。兩種表達(dá)盒也可以插入在同一區(qū)域。
如同前文提到的，對(duì)于帶多個(gè)表達(dá)盒的表達(dá)系統(tǒng)，這些表達(dá)盒可載于分立的多個(gè)載體中，或載于同一個(gè)載體中。本發(fā)明更具體地涉及對(duì)治療活性量GDNF、BDNF、NT3和CNTF的體內(nèi)投送特別有效或可定位投送的載體的制備。更準(zhǔn)確地講，本發(fā)明涉及系統(tǒng)性注射含兩種基因轉(zhuǎn)移載體的表達(dá)系統(tǒng)，每種載體含有編碼一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因。本發(fā)明還涉及系統(tǒng)性注射能使兩種基因共表達(dá)的含雙順反子載體的表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及系統(tǒng)性注射含兩種載體的表達(dá)系統(tǒng)，一種帶有編碼CNTF的基因，另一種帶有編碼NT3的基因，或一種帶有編碼CNTF的基因，另一種帶有編碼BDNF的基因，或一種帶有編碼GDNF的基因，另一種帶有編碼NT3的基因。
更優(yōu)選所用的基因轉(zhuǎn)移載體是腺病毒載體。實(shí)際上，申請(qǐng)人在處理不同的ALS動(dòng)物模型時(shí)證明了靜脈注射使用編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的腺病毒的有效性。特別是，在實(shí)施例中給出的結(jié)果第一次在家族性ALS動(dòng)物模型(FALSG93A小鼠)上顯示出壽命的顯著延長(zhǎng)，并伴有肌電圖的改善?，F(xiàn)今提出的對(duì)ALS患者的唯一治療是riluzole(Rilutek)，它能提高病人預(yù)期壽命達(dá)幾個(gè)月。還證明了給FALSG93A小鼠施用riluzole可提高其平均壽命13天(Gurney等，1996)。因而可以預(yù)言提高FALSG93A小鼠壽命大于13天的治療可能對(duì)病人帶來優(yōu)于riluzole的療效。實(shí)施例中顯示的結(jié)果表明本發(fā)明的治療途徑可提高FALSG93A小鼠平均壽命達(dá)30天左右。這構(gòu)成了對(duì)存活期的非常顯著的改善，代表著在ALS模型上顯示重要療效。
pmn小鼠是ALS的另一模型，其特征是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元較早較快的退化，和平均壽命約40天。實(shí)施例中給出的結(jié)果證明本發(fā)明的治療方法可將pmn小鼠的壽命從40天延長(zhǎng)至53天，這構(gòu)成大于30％的顯著改善。被治療pmn小鼠的壽命延長(zhǎng)伴隨著運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化的顯著降弱。
這種新療法所得總體結(jié)果第一次在兩種不同的ALS模型上證明了臨床、肌電圖和組織學(xué)不同參數(shù)的重要改善。
根據(jù)本發(fā)明，營(yíng)養(yǎng)因子的體內(nèi)產(chǎn)生是通過系統(tǒng)給藥獲得的。在實(shí)施例中給出的結(jié)果證明這種給藥方法可通過患者自身的機(jī)體規(guī)律地、連續(xù)地產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)因子，且這種產(chǎn)生足以造成顯著的療效。這種系統(tǒng)性給藥優(yōu)選為靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射，特別優(yōu)選靜脈內(nèi)注射。這種注射方法就耐受性和易接近性而言也是有利的。另外靜脈注射可以比肌肉注射注入更大的量，也可以重復(fù)注射。
本發(fā)明還涉及包含兩種神經(jīng)因子的表達(dá)系統(tǒng)的任何藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物有利地含有注射制劑用的藥物可接受的載體。特別是無菌等滲鹽水溶液(磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或干組合物特別是凍干品，通過根據(jù)情況加入無菌水或生理血清可產(chǎn)生可注射溶液。也可以使用其他賦形劑，如穩(wěn)定性蛋白質(zhì)(特別是血清白蛋白R(shí)F9603074)或水凝膠。這種水凝膠可從任何生物相容的無毒聚合物(均聚或共聚)制得。一些這樣的聚合物已在例如專利申請(qǐng)WO93/08845中描述過。其中的一些已商業(yè)化，如從環(huán)氧乙烷和/或環(huán)氧丙烷獲得的那些。另外，當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)由質(zhì)粒載體組成時(shí)，在本發(fā)明藥物組合物中最好加入有利于基因轉(zhuǎn)移的化學(xué)或生物化學(xué)試劑。對(duì)此，特別可提及如WO95/21931中所描述的聚賴氨酸、(LKLK)n、(LKKC)n型陽(yáng)離子聚合物、聚乙烯亞胺(WO96/02655)和DEAE葡聚糖或陽(yáng)離子脂類或脂轉(zhuǎn)染試劑。這些試劑具有凝聚DNA并促進(jìn)其與細(xì)胞膜結(jié)合的特性。其中也以舉出脂聚胺(如WO95/18863或WO96/17823中所描述的lipofectamine,transfectam)、不同的陽(yáng)離子或中性脂類(DOTMA、DOGS、DOPE等)，以及核源肽(WO96/25508)，它們可以是為了靶向某些組織而官能化的。使用這種化學(xué)載體的本發(fā)明組合物的制備按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)進(jìn)行，一般是將各種成分簡(jiǎn)單地接觸。
表達(dá)系統(tǒng)的給藥劑量取決于多種因素，特別是所用的載體、涉及的營(yíng)養(yǎng)因子、所用的啟動(dòng)子類型、病程或?qū)で笾委煹某掷m(xù)時(shí)間。一般而言，表達(dá)系統(tǒng)以含0.1-500mg DNA/kg，優(yōu)選1-100mg DNA/kg的劑量給藥。一般使用約10mg DNA/kg的劑量。
對(duì)于重組腺病毒，最好將其配制并以104至1014pfu、優(yōu)選106至1010pfu的劑量給藥。術(shù)語(yǔ)pfu(空斑形成單位)相應(yīng)于腺病毒溶液的感染能力，通過適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物的感染來測(cè)定，并一般在15天后測(cè)定被感染細(xì)胞的空斑數(shù)目。對(duì)病毒溶液pfu滴度的測(cè)定技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的描述。
可通過不同的裝置進(jìn)行注射，特別是注射器或通過灌注法。優(yōu)選借助于注射器注射。另外可進(jìn)行重復(fù)注射以進(jìn)一步提高療效。
根據(jù)本發(fā)明的一種變化方案，這種治療還可以與riluzole聯(lián)合應(yīng)用。因而本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其含有本發(fā)明的一種表達(dá)系統(tǒng)和藥理有效量的riluzole，以在時(shí)間上同時(shí)或分開給藥。
下文給出的結(jié)果只是說明本發(fā)明而不限制其范圍。這些結(jié)果證明本發(fā)明方法的特別有利的特性，據(jù)我們所知，這是第一次在動(dòng)物模型上證明了對(duì)ALS的治療意義。


圖1給予或不給予CNTF-GDNF聯(lián)合表達(dá)系統(tǒng)的FALSG93A小鼠的肌電圖行為比較。
圖2給予或不給予NT3表達(dá)系統(tǒng)的FALSG93A小鼠的肌電圖行為比較。
圖3給予或不給予CNTF表達(dá)系統(tǒng)的pmn小鼠存活的比較。pmn小鼠的存活(天)用所分析動(dòng)物的百分?jǐn)?shù)表示。用CNTF表達(dá)系統(tǒng)給藥處理的pmn小鼠100％,n=7(粗線)；未處理的pmn小鼠100％,n=14(正常線)。
圖4給或不給予CNTF表達(dá)系統(tǒng)的pmn小鼠中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化的比較。在25天齡時(shí)檢查小鼠膈神經(jīng)中有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目。結(jié)果用CNTF表達(dá)系統(tǒng)處理的pmn小鼠(145,n=10)；無CNTF表達(dá)系統(tǒng)處理的pmn小鼠(122,n=8)；用AdlacZ處理的pmn小鼠(111,n=8)；“正常”Xt小鼠(263,n=4)。豎線代表平均標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。
實(shí)施例1．材料和方法以下描述的全部實(shí)驗(yàn)(腺病毒構(gòu)建、給小鼠的注射、功能測(cè)定)都是在L3封閉實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的。1-動(dòng)物已建立了多種品系的表達(dá)SOD突變形式(致家族型ALS)的轉(zhuǎn)基因小鼠，試圖獲得ALS的鼠模型。超量表達(dá)93位甘氨酸被丙氨酸取代的突變?nèi)薙OD的轉(zhuǎn)基因小鼠具有進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化，表現(xiàn)為四肢麻痹，在4-6個(gè)月齡時(shí)死亡(Gurney等，1994)。最早的臨床癥狀是大約90天時(shí)四肢顫抖，隨后在125天時(shí)步長(zhǎng)減小(Chiu等，1995)。組織學(xué)方面，從大約37天可以在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中觀察到來自線粒體的液泡，從90天開始可能觀察到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的丟失(Chiu等，1995)。有髓神經(jīng)軸突的感染主要在腹面骨髓中，在背面區(qū)很少。在運(yùn)動(dòng)板處觀察到代償性側(cè)突重支配象現(xiàn)(Chiu等，1995)。對(duì)實(shí)施例2-10，我們選擇使用FALSG93A小鼠。FALSG93A小鼠是研究ALS病生機(jī)制及開發(fā)其治療策略的很好的動(dòng)物模型。它與家族型ALS具有共同的病生來源(SOD突變)、大量的組織病理學(xué)和肌電圖特征。
因而，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室鑒定了FALSG93A小鼠的肌電圖行為并證明FALSG93A小鼠可滿足ALS的Lambert標(biāo)準(zhǔn)(Kennel等，1996)(1)運(yùn)動(dòng)單元數(shù)目減少，同時(shí)側(cè)突重支配；(2)在前肢和后肢中存在失支配的自發(fā)活動(dòng)(纖維性顫動(dòng))和自發(fā)性收縮；(3)與運(yùn)動(dòng)回應(yīng)降低有關(guān)的運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度的改變；(4)無感覺器官損害。另外我們已證明面部神經(jīng)的損害很少見，甚至在年老的FALSG93A小鼠中也是如此，在病人中也是這樣。
FALSG93A小鼠來自Transgenic Alliance(L′Arbresle，法國(guó))。妊娠雌鼠每周發(fā)放，并在室驗(yàn)室動(dòng)物中心產(chǎn)仔?；疾‰s合幼鼠通過取一段尾巴并提取DNA進(jìn)行PCR來鑒定。
還有其他具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化的動(dòng)物模型(Sillevis-Smilt & De Jong,1989；Price等，1994)，這是由急性神經(jīng)毒性損害造成的(用IDPN、興奮毒素處理)，或由于遺傳錯(cuò)誤造成(Wobbler、pmn、Mnd小鼠、HCSMA狗)。在遺傳性動(dòng)物模型中，pmn小鼠在臨床、組織學(xué)(Schmalbruch 1991)和肌電圖(Kennel,1996)方面已有特別好的表征。pmn突變以隱性常染色體方式傳遞，并已定位在第13號(hào)染色體上。純合pmn小鼠在2-3周齡開始患肌肉萎縮和麻痹并表現(xiàn)在后肢上，然后擴(kuò)展至全身。所有未處理的pmn小鼠都在6-7周齡前死亡。其神經(jīng)元的退化開始于神經(jīng)末稍并導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)中有髓神經(jīng)纖維的大量喪失，特別是保證橫隔神經(jīng)支配的隔神經(jīng)中(Schmalbruch 1991)。與FALSG93A小鼠不同，這種肌肉的失神經(jīng)支配是很快的，基本不伴有由軸突旁側(cè)重新生長(zhǎng)引起的重支配現(xiàn)象。在肌電圖方面，肌肉失神經(jīng)支配過程的特征是纖維性顫動(dòng)的出現(xiàn)和超強(qiáng)電刺激神經(jīng)后肌肉反應(yīng)幅度的大大降低(Kennel等，1996)。
轉(zhuǎn)基因小鼠品系Xt/pmn也用作ALS的另一鼠模型。這些小鼠按如下獲得C57/B156或DBA2雌性小鼠與Xt pmn+/Xt+pmn雄性小鼠(129系)第一次雜交，然后是雜合的Xt pmn+/Xt+pmn+雌性子代(N1)與原雄性之間第二次交雜。在小鼠子代(N2)中，選擇了帶有等位基因Xt(由贅指表型顯示)和等位基因pmn(PCR測(cè)定)的雙雜合子Xt pmn+/Xt+pmn(稱為“Xt pmm”小鼠)用于進(jìn)一步雜交。2．表達(dá)系統(tǒng)2.1．質(zhì)粒載體可使用能表達(dá)一種或兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的不同質(zhì)粒載體。例如可舉出質(zhì)粒pCRⅡ-BDNF和pSh-Ad-BDNF，它們含有一個(gè)表達(dá)和分泌BDNF的盒子(WO95/25804)。還可以提及在LTR啟動(dòng)子控制下含有編碼GDNF的核酸的質(zhì)粒p-LTR-IX-GDNF(WO95/26408)，以及質(zhì)粒p-LTR-IX-preNGF/CNTF，其在βNGF信號(hào)序列之后含有CNTF基因的序列，還含有腺病毒基因組的反向重復(fù)序列(ITR)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子的LTR序列、衣殼化序列及同源重組所必需的腺病毒序列。應(yīng)理解，任何含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和標(biāo)志基因的質(zhì)粒都可用于通過插入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒來構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)。可在真核細(xì)胞或原核細(xì)胞宿主中制備這些質(zhì)粒。2.2．腺病毒如前文所提及的，病毒載體、特別是腺病毒構(gòu)成本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案。
以下所用的重組腺病毒是按現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法通過同源重組獲得的。簡(jiǎn)言之，是在293細(xì)胞中通過如下重組構(gòu)建的，線性化病毒基因組(dl324)和含有左側(cè)ITR、衣殼化序列、轉(zhuǎn)基因及其啟動(dòng)子和重組所需病毒序列的質(zhì)粒之間的重組。病毒在293細(xì)胞中擴(kuò)增。在我們的P3實(shí)驗(yàn)室中定期對(duì)其再純化。病毒基因組還可以在原核細(xì)胞中按WO96/25506中描述的技術(shù)制備。更具體地使用了下列病毒-Ad-CNTF:Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中被缺失的E1區(qū)處含有一個(gè)CNTF基因的表述盒，該表達(dá)盒由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼CNTF的cDNA組成。在WO94/08026中給出了構(gòu)建的詳情。其他構(gòu)建物包括在E4區(qū)中的互補(bǔ)性缺失(如WO96/22378中所述)或在E3區(qū)中的互補(bǔ)性缺失。-Ad-GDNF:Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中被缺失的E1區(qū)處含有一個(gè)GDNF基因的表達(dá)盒，該表達(dá)盒由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼GDNF的cDNA組成。在WO95/26408中給出了構(gòu)建的詳情。另一構(gòu)建物包括在E4區(qū)中的互補(bǔ)性缺失(如WO96/22378中所述)。-Ad-NT3:Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中被缺失的E1區(qū)處含有一個(gè)NT3基因的表達(dá)盒，該表達(dá)盒由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼NT3的cDNA組成。另一構(gòu)建物包括在E4區(qū)中的互補(bǔ)性缺失(如WO96/22378中所述)。-Ad-BDNF:Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中被缺失的E1區(qū)處含有一個(gè)BDNF基因的表達(dá)盒，該表達(dá)盒由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼BDNF的cDNA組成。在WO95/25804中給出了構(gòu)建的詳情。另一構(gòu)建物包括在E4區(qū)中的互補(bǔ)性缺失(如WO96/22378中所述)。-Ad-FGFa:Ad5血清型重組腺病毒，在其基因組中被缺失的E1區(qū)處含有一個(gè)FGFa基因的表達(dá)盒，該表達(dá)盒由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(特別是RSV的LTR)控制下的編碼FGFa的cDNA組成。在WO95/25803中給出了構(gòu)建的詳情。另一構(gòu)建物包括在E4區(qū)中的互補(bǔ)性缺失(如WO96/22378中所述)。
所構(gòu)建病毒的功能性通過感染培養(yǎng)中的成纖維細(xì)胞來驗(yàn)證。用ELISA和/或通過顯示上清液對(duì)神經(jīng)元初級(jí)培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)特性分析培養(yǎng)上清中相應(yīng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的存在。3．重組腺病毒的給藥編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的腺病毒經(jīng)靜脈途徑給予成年或新生的動(dòng)物。對(duì)于成年FALSG93A小鼠，借助于Hamilton型微注射器將109pfu的每種腺病毒注射至尾靜脈內(nèi)。對(duì)于新生的pmn小鼠(2-3天齡)(由無贅指來鑒別)，借助于裝有30G針的胰島素型微注射器將2×109pfu(終體積20μl)的病毒懸液注射至視網(wǎng)膜靜脈內(nèi)。新生動(dòng)物用乙醚輕度麻醉并處在低體溫狀態(tài)。4．其他技術(shù)肌電圖只要其身體狀況充許，腹膜內(nèi)注射2μg/g和60μg/g體重的安定(Valium, Roche，法國(guó))和鹽酸氯胺酮(Ketalar,Parke-Davis，法國(guó))的混合物將動(dòng)物麻醉。
所用的肌電描記儀是帶有獲取和處理肌電圖信號(hào)所需要的成套軟件的最新一代儀器(Keypoint)。該儀器是從Dantec公司(法國(guó)Les Ulis)租借的。
刺激-檢測(cè)的肌電圖運(yùn)動(dòng)刺激反應(yīng)(REM)當(dāng)在神經(jīng)上施加電刺激時(shí)，由該神經(jīng)支配的肌肉是電反應(yīng)的所在地。這種反應(yīng)發(fā)生在一段時(shí)間之后(遠(yuǎn)程潛伏期)，即相當(dāng)于刺激傳導(dǎo)至突觸的時(shí)間加上信號(hào)在突觸內(nèi)的傳遞時(shí)間。這種反應(yīng)的幅度與受神經(jīng)支配的肌肉纖維的量成比例。
純粹出于實(shí)踐的原因，我們選擇刺激坐骨神經(jīng)并在腿肚腓腸肌處接收運(yùn)動(dòng)刺激反應(yīng)。將5只針式電極按如下方式植入并與肌電圖描記儀連接(a)放置兩個(gè)刺激電極，一個(gè)(主電極)在坐骨神經(jīng)通道上，另一個(gè)(參考電極)在尾根部；(b)植入兩個(gè)檢測(cè)電極，一個(gè)在腓腸肌中(主電極)，另一個(gè)在相應(yīng)的腱上(參考電極)；(c)最后一個(gè)電極接地并植入在動(dòng)物大腿中兩個(gè)主電極之間。測(cè)量肌肉響應(yīng)于對(duì)其運(yùn)動(dòng)神經(jīng)刺激的REM的幅度和潛伏期。在相當(dāng)于可獲得最大動(dòng)作潛力之強(qiáng)度150％的所謂超強(qiáng)強(qiáng)度下，REM歷時(shí)200毫秒。在成年小鼠中，如果所研究的神經(jīng)和肌肉健康，在上述條件下，刺激反應(yīng)的幅度大于或等于80mV，潛伏時(shí)間一段等于0.6毫秒。組織學(xué)分析用過量的氯仿處死動(dòng)物并且心內(nèi)灌注戊二醛溶液。將隔神經(jīng)分離、取出、用四氧化鋨后固定并放在環(huán)氧樹脂中。在近橫隔處切割隔神經(jīng)，3μm厚的切片用對(duì)苯二胺染色并用光學(xué)顯微鏡分析。5．給予表達(dá)CNTF基因的表達(dá)系統(tǒng)注射腺病毒載體2-3天齡的純合Xt+pmn/Xt+pmn小鼠(“pmn小鼠”)(由不存在贅指來鑒別)用于注射腺病毒載體。將腺病毒原液稀釋在鹽水-磷酸鹽緩沖液(PBS)中至2×109pfu/μl制得腺病毒CNTF的懸液，按第3點(diǎn)描述的條件給藥。在大腸桿菌中編碼β-半乳糖苷酶的AdlacZ(Stratford-Perricaudet,1992)用作對(duì)照腺病毒載體。結(jié)果用AdCNTF染感的人成纖細(xì)胞的Northern印跡分析表明存在長(zhǎng)度分別為1.1和1.6kb的兩種重組轉(zhuǎn)錄物。ELISA分析揭示感染不同類型細(xì)胞后的上清中存在重組蛋白。在實(shí)驗(yàn)系列中所有未治療的pmn小鼠都在2個(gè)月之前死亡，其平均存活期為40.4±2.4天(n=14)。對(duì)照載體AdlacZ的施用不改變pmn小鼠的存活期。而靜脈內(nèi)注射AdCNTF處理的pmn小鼠最長(zhǎng)存活至73天(圖3)。用AdCNTF治療的pmn小鼠的平均存活期被顯著改善，為52.7±3.9天(n=7,p＜0.011)(已用Studentt檢驗(yàn)分析了健康Xt/pmn小鼠、未處理的純合小鼠和處理的pmn小鼠的結(jié)果之間的差別，數(shù)值以均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)給出。
為了確定用AdCNTF處理的pmn小鼠的存活期延長(zhǎng)是否反映了隔神經(jīng)纖維數(shù)目的增加，在第25天進(jìn)行了光學(xué)顯微鏡檢查，結(jié)果表明在未處理的pmn小鼠中和在靜脈接受AdlacZ的pmn小鼠中，隔神經(jīng)中有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目分別降至122±13(n=6)和111±11(n=8)，而健康小鼠中有髓神經(jīng)纖維為263±8(n=4)。在注射AdCNTF的pmn小鼠的膈神經(jīng)中有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目顯著高于對(duì)照動(dòng)物的(145±11,n=10,p＜0.05)。因而用AdCNTF對(duì)pmn小鼠的處理使有髓神經(jīng)纖維的喪失降低了20％(圖4)。6．給予聯(lián)合產(chǎn)生CNTF-GDNF的表達(dá)系統(tǒng)用微注射器以200μl的終體積給4只99天齡的FALSG93A小鼠注射(尾靜脈)腺病毒Ad-CNTF和Ad-GDNF各109pfu。隨著時(shí)間跟蹤動(dòng)物的肌電圖行為并與對(duì)照組相比較。還記錄了平均存活期。肌電圖所得結(jié)果示于圖1中，觀察到AdCNTF+AdGDNF處理的FALSG93A小鼠及未處理的FALSG93A小鼠的腓腸肌中運(yùn)動(dòng)刺激反應(yīng)(REM)幅度的降低。這種降低反映了進(jìn)行性失神經(jīng)支配的過程，這是ALS的特征之一。但治療小鼠的REM幅度總體上大于對(duì)照的，說明治療后功能損害的減弱。壽命動(dòng)物的存活期如下表中所示。
受治療的動(dòng)物

<p>未處理的動(dòng)物

這些結(jié)果表明，治療組的所有動(dòng)物死亡時(shí)的年齡都大于或等于對(duì)照組中活得最長(zhǎng)的動(dòng)物的年齡。這些結(jié)果還表明，與對(duì)照動(dòng)物相比，治療組的存活期平均提高30天。這些結(jié)果特別出人意料，與Rilutek所得的13天延長(zhǎng)相比，表明本發(fā)明方法的治療潛力。7．給予產(chǎn)生NT3的表達(dá)系統(tǒng)7(a)．給予產(chǎn)生NT3的表達(dá)系統(tǒng)(99天齡的小鼠)用微注射器以200μl的終體積給4只99天齡的FALSG93A小鼠注射(尾靜脈)了109pfu的腺病毒AdNT3。隨著時(shí)間跟蹤動(dòng)物的肌電圖行為并與對(duì)照組比較。所得結(jié)果示于圖2中，其表明受治療的小鼠的REM幅度大于對(duì)照組的，說明由于治療減弱了功能損害。7(b)-給予產(chǎn)NT3的表達(dá)系統(tǒng)(3天齡的小鼠)用微注射器以20μl的終體積給3天齡的小鼠注射(顳靜脈)了5×108pfu的腺病毒Ad-NT3。
動(dòng)物的存活期示于下表中。
受治療的動(dòng)物

<p>未處理的動(dòng)物

這些結(jié)果表明用Ad-NT3靜脈途徑治療的動(dòng)物的平均存活期此未處理的動(dòng)物提高了16.1天。8．給予聯(lián)合產(chǎn)生CNTF-NT3的表達(dá)系統(tǒng)用微注射器以200μ1的終體積給4只99天齡的動(dòng)物注射(尾靜脈)了腺病毒Ad-CNTF和Ad-NT3各109pfu。隨著時(shí)間跟蹤記錄動(dòng)物的肌電圖行為，并與對(duì)照組相比較。還記錄了平均存活期。9．給予聯(lián)合產(chǎn)生BDNF-NT3的表達(dá)系統(tǒng)用微注射器以200μl的終體積給4只99天齡的動(dòng)物注射(尾靜脈)了腺病毒Ad-BDNF和Ad-NT3各109pfu。隨著時(shí)間跟蹤記錄動(dòng)物的肌電圖行為，并與對(duì)照組相比較。還記錄了平均存活期。10．給予產(chǎn)生BDNF的表達(dá)系統(tǒng)用微注射器以200μl的終體積給4只99天齡的動(dòng)物注射(尾靜脈)了109pfu的腺病毒Ad-BDNF。隨著時(shí)間跟蹤記錄動(dòng)物的肌電圖行為，并與對(duì)照組相比較。還記錄了平均存活期。
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權(quán)利要求
1．神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)系統(tǒng)在制備用于系統(tǒng)性給藥治療ALS的藥物組合物中的應(yīng)用。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)系統(tǒng)包含一種表達(dá)盒，后者由在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下的編碼一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的核酸組成。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)系統(tǒng)包含兩種表達(dá)盒，每種表達(dá)盒由在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下的編碼不同的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的核酸組成。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)系統(tǒng)包含一種表達(dá)盒，后者由在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下的編碼不同神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的兩種核酸組成(雙順反子單元)。
5．根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子選自GDNF、CNTF、BDNF和NT3。
6．根據(jù)權(quán)利要求3或4的應(yīng)用，其特征在于每種核酸編碼一種選自GDNF、CNTF、BDNF和NT3的不同的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)系統(tǒng)包含編碼CNTF的核酸和編碼GDNF的核酸。
8．根據(jù)權(quán)利要求2-4之一的應(yīng)用，其特征在于這些表達(dá)盒構(gòu)成載體的一部分。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的應(yīng)用，其特征在于這些表達(dá)盒構(gòu)成質(zhì)粒載體的一部分。
10．根據(jù)權(quán)利要求8的應(yīng)用，其特征在于這些表達(dá)盒構(gòu)成病毒載體的一部分。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的應(yīng)用，其特征在于病毒載體為一種腺病毒載體。
12．根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于啟動(dòng)子是一種真核或病毒的組成型啟動(dòng)子。
13．根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于系統(tǒng)性給藥為靜脈給藥。
14．用于治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化性疾病的藥物組合物，其含有能表達(dá)兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的系統(tǒng)。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其特征在于所述系統(tǒng)包含兩種基因轉(zhuǎn)移載體，每種帶有編碼一種不同的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的核酸。
16．根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其特征在于所述系統(tǒng)包含一種基因轉(zhuǎn)移載體，其帶有能同時(shí)表達(dá)兩種不同的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)盒。
17．根據(jù)權(quán)利要求15或16的組合物，其特征在于這些載體為病毒載體。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，其特征在于這些載體為腺病毒。
19．根據(jù)權(quán)利要求15或16的組合物，其特征在于這些載體為質(zhì)粒載體。
20．根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其特征在于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子選自GDNF、BDNF、CNTF和NT3。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其特征在于它含有兩種缺陷型重組腺病毒，一種帶有編碼CNTF的核酸，另一種帶有編碼GDNF的核酸。
22．根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其特征在于它含有兩種缺陷型重組腺病毒，一種帶有編碼GDNF的核酸，另一種帶有編碼NT3的核酸。
23．根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其特征在于它含有兩種缺陷型重組腺病毒，一種帶有編碼BDNF的核酸，另一種帶有編碼NT3的核酸。
24．根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其特征在于它經(jīng)靜脈內(nèi)途徑注射。
25．一種藥物組合物，其含有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)系統(tǒng)和riluzole，用于同時(shí)或在時(shí)間上分開給藥。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及一種治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)疾病、特別是肌萎縮性側(cè)索硬化的新方法,特別在于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)系統(tǒng)的系統(tǒng)性給藥。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1225131SQ9719641
公開日1999年8月4日 申請(qǐng)日期1997年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月13日
發(fā)明者G·哈斯, A·卡恩, P·肯耐爾, J·馬萊特, F·瑞瓦 申請(qǐng)人:羅納-布朗克羅萊爾股份有限公司, 國(guó)家健康科學(xué)研究所