專利名稱：改進(jìn)分子試劑光激活選擇性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明普遍涉及用于高度空間控制地選擇性光激活一種或多種分子試劑的方法和儀器。所講授的用于達(dá)到選擇性光激活的方法運(yùn)用了非線性光能的特殊性質(zhì)，即以高度的空間和分子專一性激發(fā)或促進(jìn)試劑從一個(gè)分子能級(jí)躍遷到另一個(gè)能級(jí)。本方法的特性適用于處理各種類型的材料，特別是在治療人和動(dòng)物疾病中有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。尤其是，非線性激發(fā)方法的使用有助于用近紅外到紅外輻射可控地治療性激活深部組織中的光促(photodynamic)治療試劑，所述近紅外到紅外輻射比目前所用方法和輻射的吸收和散射程度都要更低。
背景技術(shù)：
許多領(lǐng)域都迫切需要一種能選擇性控制各種分子試劑激活的方法。在激活方面所需的改進(jìn)包括增強(qiáng)對(duì)激活位置和深度的空間或時(shí)間控制，減少對(duì)其它共存或近旁的分子試劑或結(jié)構(gòu)的不希望的激活，增強(qiáng)所需分子試劑相對(duì)于不需要的分子試劑的激活的優(yōu)先性。已開(kāi)發(fā)出了多種線性和非線性光化學(xué)和光物理學(xué)方法，以對(duì)某些這類試劑作些這類改進(jìn)。然而，總的說(shuō)來(lái)，這些方法的效果和實(shí)用性都不盡人意。具體地說(shuō)，很需要幾種改進(jìn)的光激活方法，它們可用于選擇性光激活各種分子治療試劑，同時(shí)在控制這種光激活的應(yīng)用中有較好效果。
多年來(lái)已知光輻射可用于探測(cè)或轉(zhuǎn)化分子試劑。線性光激發(fā)作為達(dá)到分子治療試劑半選擇性激活的途徑已有廣泛研究。例如，Tessman等(J.W.Tessman,S.T.Isaacs和J.E.Hearst,“DNA螺旋中呋喃側(cè)8-甲氧基補(bǔ)骨脂素-胸苷單加成物的光化學(xué)，轉(zhuǎn)變?yōu)槎映晌锖瓦拎獋?cè)單加成物”，生物化學(xué)，24(1985):1669-1676)講到可利用特定能級(jí)的光作為獲得目標(biāo)分子試劑和DNA(脫氧核糖核酸)之間分子鍵形成的部分選擇性的途徑。Kennedy等(J.C.Kennedy,R.H.Pottier和D.C.Ross，“基于內(nèi)源性原卟啉Ⅸ的光促治療基本原理和目前的臨床經(jīng)驗(yàn)”，光化學(xué)和光生物學(xué)雜志，B生物學(xué)，6(1990)143-148)綜述了用于疾病臨床治療的各種光敏感分子試劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用進(jìn)展。而且Teuchner等(K.Teuchner,A.Pfarrherr,Ⅱ.Stiel,W.Freyer和D.Lsupold的“用于通過(guò)兩步激發(fā)電子態(tài)的各種新的光促治療起始機(jī)制的諸潛在激活劑的光譜性質(zhì)”，光化學(xué)和光生物學(xué)，57(1993)465-471)講授了用光譜學(xué)性質(zhì)篩選出待用的光敏試劑。然而這些試劑的效果特別是用于激活這些試劑的諸方法不象預(yù)期那樣成功。例如，Young(A.R.young，“用于PUVA治療的補(bǔ)骨脂素的光致癌性在小鼠和人中的現(xiàn)狀”，光化學(xué)和光生物學(xué)雜志，B生物學(xué)，6(1990)237-247)提供了有力的證據(jù)說(shuō)明基于光敏分子試劑線性光激發(fā)而用于普通治療方法中的光輻射，本身能導(dǎo)致疾病和其它不希望的副作用。而且，主要由于在這些試劑線性吸收波段附近的波長(zhǎng)處的入射探測(cè)輻射的光散射和吸收效應(yīng)，在分子治療試劑的線性光激發(fā)上的嘗試受不能達(dá)到期望的穿透深度所困擾。實(shí)際上，幾乎所有用線性光激發(fā)進(jìn)行分子轉(zhuǎn)化的例子都受困于基本的效果限制，原因在于周圍基質(zhì)對(duì)入射光輻射的不希望的吸收和散射，對(duì)探測(cè)器分子種類的激發(fā)專一性較低，并且缺乏適當(dāng)?shù)奈锢頇C(jī)制來(lái)精確控制激活的范圍和深度。
各種非線性光激發(fā)方法已被用來(lái)嘗試提高某些應(yīng)用中光激活的選擇性，以及闡明由線性激發(fā)方法引起的許多限制。這些方法中利用了從單一模式、連續(xù)波(CW)激光器到有超過(guò)1GW峰值功率的脈沖Q-開(kāi)關(guān)的激光器作為激發(fā)源。例如，Wirth和Lytle(M.J.Wirth和F.E.Lytle，“在光密介質(zhì)中雙光子激發(fā)的分子熒光”，分析化學(xué)，49(1977)2054-2057)中提出用非線性光激發(fā)作為刺激光密介質(zhì)中目標(biāo)分子的手段。該方法被證明適于用來(lái)限制探測(cè)輻射與介質(zhì)自身之間不希望的直接相互作用，并提供了一條可有效激發(fā)強(qiáng)吸收或散射基質(zhì)中存在的目標(biāo)分子試劑的途徑。Yeung等進(jìn)一步提出可將非線性光激發(fā)用于很小體積內(nèi)存在的目標(biāo)分子的高度專一性激發(fā)(M.J.Sepaniak和E.S.Yeung，“用于高壓液相色譜的激光雙光子激發(fā)熒光檢測(cè)”，分析化學(xué)，49(1977)1554-1556；M.J.Sepaniak和E.S.Yeung，“用基于激光的探測(cè)器進(jìn)行碳液的高效液相色譜”，色譜學(xué)雜志，211(1981),95-102；和W.D.Pfeffer和E.S.Yeung，“用于微內(nèi)徑液相色譜的激光雙光子激發(fā)的熒光探測(cè)器”，分析化學(xué)，58(1986)2103-2105)。這些工作講授了在復(fù)合基質(zhì)中諸目標(biāo)分子試劑的非線性光激發(fā)的誘人效能優(yōu)勢(shì)，特別是由非線性方法而導(dǎo)致的背景激發(fā)減少，低探測(cè)體積，以及由非線性方法所提供的互補(bǔ)選擇法則有助于提高該分析的選擇性。在活性區(qū)內(nèi)改進(jìn)的空間調(diào)控已由Wirth進(jìn)一步發(fā)展(M.J.Wirth和H.O.Fatunmbi，“雙光子光譜學(xué)中的超高檢測(cè)”，分析化學(xué)，62(1990)973-976)；專門地，Wirth講授了使用顯微成像系統(tǒng)在目標(biāo)分子試劑的激發(fā)中實(shí)現(xiàn)極高空間選擇性的方法。
Denk等還應(yīng)用了類似的控制(W.Denk,J.P.Strickler和W.W.Webb，“雙光子激光顯微術(shù)”，美國(guó)專利第5034613號(hào))，他們提出了一種特殊的共焦激光掃描顯微鏡，其中利用非線性激光激發(fā)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上對(duì)多種分子熒光團(tuán)試劑的光激活達(dá)到內(nèi)部高度三維控制。然而，Denk特別致力于顯微術(shù)，其中使用顯微鏡來(lái)觀察載玻片上的樣品。該顯微鏡是用來(lái)激發(fā)被添加到生物標(biāo)本中構(gòu)成光密介質(zhì)的分子熒光團(tuán)試劑的。在Denk看來(lái)，源于激光器的光因反射鏡反射而下行至物平面。然后熒光沿相同光路返回，穿過(guò)物鏡及一系列反射鏡而最終進(jìn)入光電倍增管。利用非線性光激發(fā)的特性來(lái)將激發(fā)基本限于物鏡焦點(diǎn)處的共焦區(qū)，從而通過(guò)精確控制焦點(diǎn)的深度可使三維成像成為可能?？刂乒饧ぐl(fā)以在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平產(chǎn)生基于發(fā)光的圖象已示于置于載物臺(tái)上的目標(biāo)樣品中。這種顯微鏡也可用于載物臺(tái)上單個(gè)細(xì)胞中鎖定的效應(yīng)器分子的局部光解釋放，據(jù)稱這種顯微鏡可用來(lái)誘導(dǎo)這類細(xì)胞中的進(jìn)一步光化學(xué)反應(yīng)。然而，據(jù)稱位于焦平面上的細(xì)胞的光誘導(dǎo)壞死的減少是這種顯微術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)，這是由于用近紅外輻射代替了紫外激發(fā)輻射。Denk的方法和儀器似乎不適于用來(lái)處理軀體上基本位于組織表面下的組織的特定體積。相反，光僅聚集于載玻片的物平面上并反射回來(lái)。
美國(guó)專利4,822,335(Kwai等)公開(kāi)了一種依次雙光子激發(fā)的方法。Kwai利用第一個(gè)光電二極管來(lái)將一種光敏物質(zhì)從基態(tài)激發(fā)至高能級(jí)的單線態(tài)，然后用第二個(gè)光電二極管將已由單線態(tài)躍遷到三線態(tài)的光敏物質(zhì)從一個(gè)能級(jí)激發(fā)到更高能級(jí)。如以下所述，依次雙光子激發(fā)相比于同時(shí)雙光子激發(fā)有大量缺點(diǎn)和劣勢(shì)。
這些舉例示范的現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)體清楚地闡明了光激活方法的許多吸引人的特點(diǎn)，但以前未講過(guò)一種能滿足工業(yè)不同需要的通用方法，用以高度空間控制性地選擇性光激活一種或多種分子試劑。特別地，以前一直未講授過(guò)在治療應(yīng)用或一般材料加工應(yīng)用中比較重要的水平上達(dá)到這類控制的實(shí)用方法。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種可高度空間選擇性地處理植物或動(dòng)物組織的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供這樣一種方法，其中使用一種光源和各光敏材料以強(qiáng)化這種高度空間選擇性。
本發(fā)明的又一目的是提供這樣一種方法，其中所用光的波長(zhǎng)較目前用于處理植物或動(dòng)物組織的光的波長(zhǎng)對(duì)該植物或動(dòng)物組織的損傷更小。
本發(fā)明還有一目的是提供這樣一種方法，其中所用光較目前用于處理植物或動(dòng)物組織的光波長(zhǎng)更不易在植物或動(dòng)物組織中散射和被其吸收。
根據(jù)本說(shuō)明書(shū)，包括下述的幾個(gè)附圖和實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的其它目的和優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明概述考慮到以上及其它目的和優(yōu)勢(shì)，總的說(shuō)來(lái)本發(fā)明提供了一種處理植物或動(dòng)物組織的特定體積的方法，包括以下步驟用至少一種光敏分子試劑處理該植物或動(dòng)物組織，其中所述植物或動(dòng)物組織的該特定體積保留了所述至少一種光敏分子試劑的至少一部分，然后用足以促進(jìn)保留于植物或動(dòng)物組織的特定體積中的至少一種光敏分子試劑中的至少一種試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光處理該植物或動(dòng)物組織的該特定體積，其中該至少一種光敏分子試劑在該植物或動(dòng)物組織的該特定體積中變得有活性。
本發(fā)明也提供了一種用于治療植物或動(dòng)物組織中惡性腫瘤的方法，包括以下步驟用至少一種光敏分子試劑處理該植物或動(dòng)物組織，其中該植物或動(dòng)物組織中的惡性腫瘤內(nèi)保留了該至少一種光敏分子試劑中的至少一種的至少一部分，然后用足以促進(jìn)保留于該植物或動(dòng)物組織中的惡性腫瘤內(nèi)的該至少一種光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光來(lái)處理該植物或動(dòng)物組織，其中該至少一種光敏分子試劑在該植物或動(dòng)物組織中的惡性腫瘤內(nèi)變得有活性。
本發(fā)明還提供了用于在一塊材料的特定體積中產(chǎn)生至少一種被光激活的分子試劑的方法。該方法包括用足以促進(jìn)該材料的該特定體積中所包含的至少一種光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光來(lái)處理該材料的該特定體積，從而所述至少一種光敏分子試劑在該材料的特定體積中成為已被光激活的分子試劑。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述材料選自植物組織或動(dòng)物組織，該材料已預(yù)先用至少一種光敏分子試劑處理，從而在足以促進(jìn)該光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光處理該材料的特定體積時(shí)該材料中會(huì)保留至少一部分光敏試劑。
本發(fā)明還提供了在一種材料的特定體積中產(chǎn)生至少一種已被光激活的分子試劑的方法，包括用足以促進(jìn)該材料的特定體積中至少一種光敏分子試劑發(fā)生光激發(fā)的光來(lái)處理該材料的該特定體積，其中所述至少一種光敏分子試劑在該材料的特定體積中成為一種已被光激活的分子試劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，足以促進(jìn)光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光是激光，且最好是脈沖激光。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，足以促進(jìn)光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光是一束聚焦光束，優(yōu)選是聚焦激光束，更優(yōu)選是聚焦過(guò)的脈沖激光。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述光敏分子試劑選自下述成員補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂素衍生物，卟啉衍生物，血卟啉衍生物，四氮雜卟啉(tetraazaporphyrin)衍生物，酞菁衍生物，若丹明衍生物，香豆素衍生物，苯并吩噁嗪衍生物，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，葉綠素衍生物，細(xì)菌葉綠素衍生物，金屬-配基絡(luò)合物，脫鎂葉綠甲酯一酸a，部花青540，維生素D,5-氨基-γ-酮戊酸，photosan，二氫卟酚e6，二氫卟酚e6亞乙基二酰胺，單-L-天冬氨酰二氫卟酚e6，以及吩噁嗪尼羅藍(lán)衍生物。
更優(yōu)選光敏分子試劑選自下列成員補(bǔ)骨脂素，5-甲氧基補(bǔ)骨脂素(5-MOP),8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP),4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素(TMP),4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素(AMT),5-氯甲基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(HMT)，當(dāng)歸根素(異補(bǔ)骨脂素)，5-甲基當(dāng)歸根素(5-MIP)，以及3-羧基補(bǔ)骨脂素。
同樣更優(yōu)選光敏分子試劑選自下列成員卟啉，血卟啉衍生物(HPD),photofrinⅡ，苯并卟啉衍生物(BPD)，原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，染料血卟啉醚(DHE)，多血卟啉酯類(PHE)，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯(PH1008)，四(3-羥基苯基)卟啉(3-THPP)，四苯基卟啉單磺酸鹽(TPPS1)，四苯基卟啉二磺酸鹽(TPPS2a)，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶基)卟啉(T4MpyP)，以及八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪(octa-(4-tert-butylphenyl)tetrapyrazinoporphyrazine，OPTP)。
還要更優(yōu)選的光敏分子試劑選自下述成員酞菁，四(4-叔丁基)酞菁(t4PcH2)，四(4-叔丁基)酞菁鎂(t4PcMg)，氯化鋁酞花青磺化的酞菁(CASPc)，氯化鋁酞花青酞菁四硫酸鹽(AlPcTs)，單磺化的鋁酞菁(AlSPc)，二磺化的鋁酞菁(AlS2Pc)，三磺化的鋁酞菁(AlS3Pc)，四磺化的鋁酞菁(AlS4Pc)，硅酞菁(SiPc Ⅳ)，鋅Ⅱ酞菁(ZnPc)，雙(二異丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(naphthalocyanine)(isoBOSINC)，以及鍺Ⅳ八丁氧基酞菁(GePc)。
進(jìn)一步優(yōu)選的光敏分子試劑選自下述成員若丹明101(Rh-101)，若丹明110(Rh-110)，若丹明123(RH-123)，若丹明19(Rh-19)，若丹明560(Rh-560)，若丹明575(Rh-575)，若丹明590(Rh-590)，若丹明610(Rh-610)，若丹明640(Rh-640)，若丹明6G(Rh-6G)，若丹明700(Rh-700)，若丹明800(Rh-800)，若丹明B(Rh-B)，磺基若丹明101(sulforhodamine 101)，磺基若丹明640以及磺基若丹明B。
還要進(jìn)一步優(yōu)選的光敏分子試劑選自下述成員香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A以及香豆素548。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述光敏分子試劑選自下述成員5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噁嗪鎓鹽(EtNBA),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓鹽(EtNBS)和5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓鹽。此外，還優(yōu)選光敏分子試劑選自下述成員二氯化三(2,2′-雙吡啶)釕(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2′-雙吡啶)銠(Ⅱ)(RhBPY)，以及二氯化三(2,2′-雙吡啶)鉑(Ⅱ)(PtBPY)。
此外，更優(yōu)選光敏分子試劑選自下述成員芪，芪衍生物以及4-(N-(2-羥乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4′-(6-羥基己基磺?；?芪(APSS)。
而且，更優(yōu)選所述至少一種光敏分子試劑包括至少一種生物源性光敏分子試劑，其中所述至少一種生物源性試劑包括選自下述成員的片段DNA,RNA，氨基酸，蛋白質(zhì)，抗體，配體，半抗原，糖受體或絡(luò)合試劑，脂類受體或絡(luò)合試劑，蛋白質(zhì)受體或絡(luò)合試劑，螯合劑以及被囊載體，所述至少一種生物源性光敏分子試劑還要更優(yōu)選包括一個(gè)片段，該片段在受到足以促進(jìn)同時(shí)雙光子激活的光照下會(huì)被光激活。
附圖簡(jiǎn)介參考示范性實(shí)施方案的下述詳細(xì)描述可有助于更好地解釋本發(fā)明。結(jié)合附圖理解說(shuō)明書(shū)，其中

圖1展示了線性和非線性光激發(fā)的能級(jí)圖例；
圖2展示了用于單光子與雙光子激發(fā)的入射光功率與激發(fā)效率之間的關(guān)系；圖3展示了單光子和雙光子光電離的簡(jiǎn)要描述；圖4展示了單光子和雙光子光電離的激發(fā)態(tài)行為；圖5比較了單光子激發(fā)和同時(shí)雙光子激發(fā)時(shí)RuBPY分子發(fā)光性質(zhì)作為發(fā)射波長(zhǎng)的函數(shù)；圖6是發(fā)光壽命作為激發(fā)態(tài)猝滅劑濃度函數(shù)的Stern-Volmer圖；圖7比較了使用單光子激發(fā)和同時(shí)雙光子激發(fā)時(shí)1,4-萘二酚吸收截面作為激發(fā)波長(zhǎng)的函數(shù)；圖8給出了動(dòng)物組織從紫外到近紅外光譜范圍內(nèi)的吸收光譜圖例；圖9給出了動(dòng)物組織從紫外到近紅外光譜范圍內(nèi)的散射光譜；圖10顯示了動(dòng)物組織對(duì)短波長(zhǎng)和長(zhǎng)波長(zhǎng)光的光吸收性質(zhì)的一般趨勢(shì)；圖11比較了用單光子和雙光子激發(fā)方法時(shí)光誘導(dǎo)的組織損傷；圖12顯示了均勻分布于一塊瓊脂糖凝膠中的染料分子香豆素480的雙光子激發(fā)的熒光照片；圖13顯示了均勻分布于一塊腫瘤標(biāo)本中的染料分子香豆素480的雙光子激發(fā)的熒光照片；圖14展示了本發(fā)明用于PDT試劑的選擇性雙光子NIR(近紅外)光激活的第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案；圖15顯示了第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的一種變更，其中用聚焦過(guò)的NIR光進(jìn)行局部光促治療；圖16顯示了第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的一種變更，其中用非聚焦的NIR光進(jìn)行局部光促治療；圖17顯示了第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的一種變更，其中用非聚焦的NIR光來(lái)光促治療皮下?lián)p傷；圖18顯示了長(zhǎng)期暴露于連續(xù)的365nm UV輻射中，添加的AMT(4′-氨甲基-4,5′8-三甲基補(bǔ)骨脂素)的發(fā)光帶的典型逐步偏移；圖19顯示長(zhǎng)期暴露于364nm的紫外光的亞微微秒脈沖時(shí)，添加的AMT的熒光帶位置的逐步偏移；圖20顯示了暴露于室內(nèi)熒光時(shí)添加的AMT的對(duì)照結(jié)果；圖21顯示了長(zhǎng)期暴露于728nm的近紅外光的亞微微秒脈沖時(shí)，添加的AMT的熒光帶位置的逐步偏移；圖22顯示了遺傳性PDT試劑的細(xì)胞內(nèi)光激活；和圖23顯示了本發(fā)明用于諸生物源性PDT試劑的第二個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。
附圖詳述此處所述發(fā)明利用諸分子試劑的非線性光激發(fā)的獨(dú)特物理性質(zhì)來(lái)有效地改進(jìn)對(duì)那些試劑進(jìn)行光激活的空間控制。此外，在醫(yī)藥試劑及其它試劑的光激活中，非線性光激發(fā)已顯示有更多優(yōu)勢(shì)，包括減少沿著激發(fā)途徑的附屬激發(fā)和損傷，減少有害光波長(zhǎng)的照射，減少由于被激發(fā)試劑的周圍環(huán)境的吸收和散射過(guò)程而引起的干擾，增強(qiáng)試劑激發(fā)中的分子專一性。用于本發(fā)明的非線性光激發(fā)方法，即同時(shí)雙光子激發(fā)，顯示出能提供一種治療許多疾病的較好方法。線性和非線性光激活過(guò)程的能級(jí)模型本公開(kāi)內(nèi)容所講授的發(fā)明的基本意義在于用非線性光激發(fā)方法來(lái)高度空間控制性地選擇性地光激活一種或多種分子試劑。這種選擇性的光激活是通過(guò)利用一種試劑從一個(gè)分子能級(jí)到另一個(gè)能級(jí)的非線性光激發(fā)的特殊性質(zhì)來(lái)達(dá)到的。為充分理解這個(gè)過(guò)程的顯著特征，有必要發(fā)展一種非線性的同時(shí)雙光子激發(fā)以及用于相關(guān)的線性和非線性過(guò)程的概念模型。這可用能級(jí)圖形式很方便地說(shuō)明。
圖1顯示了幾種線性和非線性光激發(fā)過(guò)程的典型分子能級(jí)圖。在這個(gè)簡(jiǎn)化的Jablonski圖表中，垂直方向?qū)?yīng)于能量的變化，而水平方向代表從左到右事件發(fā)生的次序。水平實(shí)線代表量子力學(xué)允許的分子能級(jí)，而水平虛線代表不允許的虛擬能級(jí)。量子力學(xué)允許的分子能級(jí)相對(duì)長(zhǎng)壽，且通過(guò)吸收能量而使分子激發(fā)的概率，如通過(guò)吸收一個(gè)適當(dāng)能量的光子而激發(fā)分子的概率較高。虛擬能級(jí)可通過(guò)多種激發(fā)過(guò)程達(dá)到，但與允許的分子躍遷相比，它們的壽命極短(在10-15秒數(shù)量級(jí)，根據(jù)Heisenberg的不確定原理所估測(cè))，使它們僅在特定的激發(fā)條件下有意義。Jablonski簡(jiǎn)圖中直線箭頭代表輻射能量轉(zhuǎn)移過(guò)程向上的箭頭表示吸收能量，而向下的箭頭代表輻射發(fā)射，如光子的熒光發(fā)射。曲線箭頭代表非輻射能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，如振動(dòng)弛豫。直線或曲線箭頭的垂直長(zhǎng)度與給定過(guò)程中吸收或發(fā)射的能量成比例。
對(duì)圖1中第一個(gè)Jablonski簡(jiǎn)圖表示，吸收了具有足夠能量而能直接促進(jìn)該分子從一允許的電子能級(jí)6(一般為最低電子能級(jí)，或基態(tài)，稱為S0)躍遷到另一允許的具有較高總能級(jí)的電子能級(jí)8(此處用S2態(tài)表示)的光子4后，就發(fā)生單光子激發(fā)至一個(gè)允許的能級(jí)2的情形。注意有可能向多個(gè)允許的較高電子能級(jí)發(fā)生激發(fā)，如第二允許電子能級(jí)8和第三允許電子能級(jí)10所代表的那些能級(jí)。隨著能量增加，它們通常被稱為S1,S2，等等。而且，每一允許的電子能級(jí)可進(jìn)一步細(xì)分為不連續(xù)的振動(dòng)能級(jí)群12；這些不連續(xù)的振動(dòng)能級(jí)12中的每個(gè)能級(jí)同樣可進(jìn)一步細(xì)分為不連續(xù)的旋轉(zhuǎn)能級(jí)群。因此，每個(gè)允許的電子能級(jí)S0、S1、S2等，由于可能存在大量的振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)態(tài)，從而構(gòu)成了多個(gè)允許能級(jí)的復(fù)雜帶。通過(guò)吸收光子4的能量，分子被激發(fā)至一具體的獨(dú)特電子振動(dòng)能級(jí)14，有時(shí)稱作電子振動(dòng)能級(jí)。然后該分子可從這一激發(fā)態(tài)進(jìn)行快速內(nèi)部轉(zhuǎn)換16，例如轉(zhuǎn)換到第三允許電子能級(jí)10的最低允許的被激發(fā)的電子振動(dòng)能級(jí)18，此處以S1態(tài)表示。這一內(nèi)部轉(zhuǎn)換16通常很快，進(jìn)行的時(shí)間范圍在10-12秒到10-15秒數(shù)量級(jí)。最后，被激發(fā)的分子可通過(guò)諸如發(fā)射光子20進(jìn)一步發(fā)生弛豫，從而回復(fù)到初態(tài)，即第一能級(jí)6；可能的弛豫過(guò)程包括碰撞失活，發(fā)熒光和磷光。這一過(guò)程的一個(gè)例子是通過(guò)吸收400nm的一個(gè)光子，將染料分子香豆素從基電子態(tài)激發(fā)至激發(fā)電子態(tài)，隨后發(fā)射一個(gè)480nm的熒光光子。這一實(shí)例中激發(fā)的概率與入射光輻射的功率線性相關(guān)，因此稱單光子激發(fā)至一個(gè)允許能級(jí)2為線性激發(fā)過(guò)程。
在圖1第二個(gè)Jablonski簡(jiǎn)圖中，吸收了不具有足夠能量以直接激發(fā)該分子至一個(gè)允許電子能級(jí)26的一個(gè)光子24時(shí)，就出現(xiàn)單光子激發(fā)至一個(gè)虛擬能級(jí)22的情形。然而，該分子被激發(fā)至一個(gè)壽命極短的虛擬能級(jí)28。此虛擬能級(jí)28的壽命通常是10-15秒的數(shù)量級(jí)。通過(guò)諸如彈性散射這類過(guò)程，吸收的光子24通常從此虛擬能級(jí)28發(fā)生實(shí)質(zhì)上瞬時(shí)的再發(fā)射。這一過(guò)程的重要例子是在用800nm的光激發(fā)香豆素時(shí)，香豆素在800nm處發(fā)生的Rayleigh散射過(guò)程。另一個(gè)例子是Raman散射，當(dāng)分子回復(fù)到與基態(tài)相關(guān)的各種振動(dòng)能級(jí)時(shí)即發(fā)生這種散射。在這些示例性的過(guò)程中，激發(fā)概率也與入射光輻射的功率線性相關(guān)，故單光子激發(fā)至一個(gè)虛擬能級(jí)22的過(guò)程也稱為線性激發(fā)過(guò)程。
示于圖1的第三個(gè)Jablonski簡(jiǎn)圖中，在依次吸收了第一個(gè)光子34和第二個(gè)光子36后，即發(fā)生依次雙光子激發(fā)至一個(gè)允許能級(jí)32的情形，所述兩個(gè)光子都有足夠能量來(lái)直接激發(fā)該分子從一個(gè)允許能級(jí)躍遷至另一個(gè)允許能級(jí)。吸收第一個(gè)光子34后，分子從第一允許電子能級(jí)6，如基態(tài)S0，被激發(fā)至第二允許電子能級(jí)38，如激發(fā)態(tài)S1，該分子一般能從這一能級(jí)進(jìn)行快速內(nèi)部轉(zhuǎn)換42至一相對(duì)長(zhǎng)壽的最低允許的被激發(fā)的電子振動(dòng)能級(jí)44，其壽命通常在10-7秒至10-9秒數(shù)量級(jí)。當(dāng)分子仍在最低允許的被激發(fā)的電子振動(dòng)能級(jí)44時(shí)再吸收第二個(gè)光子36，將激發(fā)該分子至第三允許電子能級(jí)40，如激發(fā)態(tài)S2。第二個(gè)光子36與第一個(gè)光子34的能量可能相同，也可能不同。激發(fā)至第三允許能級(jí)40后，該分子可進(jìn)行一系列過(guò)程，包括進(jìn)一步的內(nèi)部轉(zhuǎn)換46及能量的再發(fā)射48。另一種情形是，若第二個(gè)光子36有足夠能量，它可通過(guò)光電離子化過(guò)程電離該分子。這一過(guò)程的一個(gè)例子是染料香豆素經(jīng)過(guò)440nm光的極強(qiáng)激發(fā)產(chǎn)生離子化分子的光電離作用，其中該香豆素分子依次吸收了440nm光的兩個(gè)光子。在這第三個(gè)實(shí)例中，激發(fā)的概率不再與入射光輻射的功率線性相關(guān)，而與第一個(gè)光子34和第二個(gè)光子36的功率的乘積有關(guān)；因此，依次雙光子激發(fā)至一允許能級(jí)32被稱為是非線性激發(fā)過(guò)程。
圖1所示最后一個(gè)Jablonski簡(jiǎn)圖中，當(dāng)同時(shí)吸收雙光子中的第一個(gè)光子52和雙光子中的第二個(gè)光子54時(shí)，就發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)至一允許能級(jí)50的情形。此情形下雙光子中的第一個(gè)光子52和雙光子中的第二個(gè)光子54的組合能量足以激發(fā)該分子從第一允許能級(jí)6躍遷至第二允許能級(jí)56。通常雙光子中的第一個(gè)光子52和雙光子中的第二個(gè)光子54各自的能量均不足以直接激發(fā)這個(gè)或者任何其它允許的電子躍遷。然而，雙光子中的第一個(gè)光子52激發(fā)該分子至一壽命極短的虛擬能級(jí)58，這一能級(jí)與第二個(gè)Jablonski簡(jiǎn)圖中所示的虛擬能級(jí)相同。在弛豫發(fā)生前，雙光子中的第二個(gè)光子54立即激發(fā)該分子躍遷至第二允許電子能級(jí)56。其結(jié)果是發(fā)生與用線性單光子激發(fā)至一個(gè)允許能級(jí)2時(shí)等效的激發(fā)。注意雙光子中的第一個(gè)光子52和雙光子中的第二個(gè)光子54的能量可以相同，也可以不同。而且，入射激發(fā)光的瞬時(shí)輻照度，或Wm-2，必須極高，以便在虛擬能級(jí)58發(fā)生弛豫回復(fù)到最初的第一允許電子能級(jí)6之前，能夠足夠有效地吸收雙光子中的第二個(gè)光子54。實(shí)際上，因虛擬能級(jí)58的壽命在10-15秒數(shù)量級(jí)，故常用峰值功率很高的脈沖激發(fā)源來(lái)有效激發(fā)這些過(guò)程；這類光源常常是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兡茉谔摂M能級(jí)58的短壽命期間提供大量光子給激發(fā)過(guò)的分子。這種同時(shí)雙光子激發(fā)過(guò)程的一個(gè)實(shí)例是通過(guò)同時(shí)吸收800nm的兩個(gè)光子而激發(fā)染料分子香豆素從基電子態(tài)躍遷至激發(fā)電子態(tài)，隨后發(fā)射出480nm的一個(gè)熒光光子。在這第四個(gè)實(shí)例中，激發(fā)概率與雙光子中的第一個(gè)光子52和雙光子中的第二個(gè)光子54的瞬時(shí)或峰值功率的乘積有關(guān)。這可用光化學(xué)反應(yīng)的形式表示出來(lái)分子基態(tài)+2hν800nm→分子激發(fā)態(tài)(1)這一式子表示一個(gè)基態(tài)分子在同時(shí)吸收2個(gè)800nm的光子-hν800nm后將躍遷至一激發(fā)態(tài)。反應(yīng)速率R由下式計(jì)算R=k[分子基態(tài)][hν800nm]2，其中k是速率常數(shù)，而[分子基態(tài)]和[hν800nm]分別代表基態(tài)分子和激發(fā)光子的濃度。這樣，由于眾所周知的對(duì)瞬時(shí)光子輻照度的二次方的相關(guān)性，同時(shí)雙光子激發(fā)至一允許能級(jí)50也被稱為非線性激發(fā)過(guò)程。
明確依次雙光子激發(fā)至一允許能級(jí)32和同時(shí)雙光子激發(fā)至一允許能級(jí)50之間的主要區(qū)別非常重要。在依次雙光子激發(fā)至一允許能級(jí)32中，第一個(gè)光子34和第二個(gè)光子36各自的能量均必須足以激發(fā)分子直接躍遷至第二允許電子能級(jí)38和第三允許電子能級(jí)40，然而，同時(shí)雙光子激發(fā)至一允許能級(jí)50則更為廣泛，因它只須雙光子中的第一個(gè)光子52和雙光子中的第二個(gè)光子54的組合能量足以激發(fā)分子躍遷至第二允許電子能級(jí)56即可。
此處所講授的發(fā)明利用了非線性同時(shí)雙光子激發(fā)到一允許能級(jí)50的過(guò)程。在此公開(kāi)內(nèi)容的后續(xù)部分，同時(shí)雙光子激發(fā)至一允許能級(jí)50的過(guò)程稱為“同時(shí)雙光子激發(fā)”。當(dāng)需要區(qū)分“同時(shí)雙光子激發(fā)”和依次雙光子激發(fā)至允許能級(jí)32過(guò)程時(shí)，用術(shù)語(yǔ)“依次雙光子激發(fā)”來(lái)表示后者。依次雙光子激發(fā)可用于誘導(dǎo)諸分子試劑的光電離作用，特別是在實(shí)驗(yàn)室條件下，但其商業(yè)應(yīng)用的價(jià)值很小，這是由于它具有若干缺點(diǎn)，包括難于對(duì)應(yīng)用進(jìn)行空間控制，且需要可提供多種必需光子能量的激發(fā)光源。單光子激發(fā)和同時(shí)雙光子激發(fā)的比較當(dāng)光與一個(gè)分子系統(tǒng)相互作用時(shí)，它誘導(dǎo)一個(gè)極化過(guò)程，該極化過(guò)程與線性極化率和所施加的電場(chǎng)強(qiáng)度的乘積成正比例。當(dāng)該電場(chǎng)很強(qiáng)時(shí)，系統(tǒng)不能簡(jiǎn)單描述，描述誘導(dǎo)的極化作用時(shí)必須引入較高階的相互作用的項(xiàng)。同時(shí)雙光子激發(fā)被稱為一種非線性過(guò)程，這是因?yàn)樗霈F(xiàn)在來(lái)自兩個(gè)光子的電磁場(chǎng)通過(guò)這些高階項(xiàng)，特別是三階極化率的虛部X(3)”，組合在一起，從而引起一次電子能級(jí)躍遷的時(shí)候。這是描述同時(shí)雙光子吸收的非線性的另一途徑。即，該分子系統(tǒng)非線性地與強(qiáng)電磁場(chǎng)反應(yīng)。與之相比，單光子激發(fā)過(guò)程可用線性極化率描述，它們與激發(fā)功率成線性關(guān)系。單光子激發(fā)60和同時(shí)雙光子激發(fā)62的入射功率與激發(fā)效率之間完全不同的關(guān)系示于圖2。注意同時(shí)雙光子激發(fā)的截面一般約比等效的單光子激發(fā)過(guò)程的截面小10萬(wàn)倍。這是由于雙光子在極短的虛擬能級(jí)壽命期內(nèi)同時(shí)與一個(gè)分子相互作用的概率較低。然而，獲得能提供極高峰值功率的光學(xué)激發(fā)源，如鎖模激光器，就能通過(guò)增大瞬時(shí)入射功率而極大地提高同時(shí)雙光子激發(fā)的有效效率，從而大大改善這種低效率。例如，用連續(xù)波激發(fā)時(shí)，對(duì)特定分子系統(tǒng)，雙光子激發(fā)效率可能比單光子激發(fā)的效率小105倍。然而，若以一系列極短脈沖的形式發(fā)出同樣的平均光功率，則該峰值與平均功率的換算關(guān)系將改變這個(gè)比值，使之接近于1。
同時(shí)雙光子激發(fā)的非線性性質(zhì)可導(dǎo)致同時(shí)雙光子激發(fā)和線性激發(fā)在空間激發(fā)性質(zhì)上的重要差別。例如，圖3表明，當(dāng)激光束70聚焦72到樣品74時(shí)，單光子激發(fā)效率曲線64和同時(shí)雙光子激發(fā)效率曲線66作為該光束亮度曲線68的函數(shù)可完全不同。該樣品74可以是盛于比色杯76壁之間的激光染料溶液。用透鏡78聚焦72激光束70，產(chǎn)生一光束亮度曲線68，它作為穿過(guò)樣品74的距離的函數(shù)而變化，根據(jù)經(jīng)典Gaussian光學(xué)理論推測(cè)其在焦點(diǎn)80的中心達(dá)到最大值。對(duì)單光子激發(fā)過(guò)程而言，由光束亮度(或入射功率)與激發(fā)效率之間的線性關(guān)系得到單光子激發(fā)效率曲線64，它與光束亮度曲線68成線性關(guān)系。相比之下，對(duì)同時(shí)雙光子激發(fā)過(guò)程而言，光束亮度(或入射功率)與激發(fā)效率之間的非線性關(guān)系產(chǎn)生的同時(shí)雙光子激發(fā)效率曲線66與光束亮度曲線68的平方相關(guān)。因此，當(dāng)用同時(shí)雙光子激發(fā)時(shí)，對(duì)激光束70進(jìn)行聚焦72能基本上將激發(fā)范圍限制在一個(gè)小的焦點(diǎn)區(qū)。這有時(shí)被稱作共焦區(qū)，定義為延伸距離為2πW02/λ的區(qū)域，其中W0是最小光束腰部的直徑，而λ是光輻射的波長(zhǎng)。相比之下，用線性激發(fā)時(shí)，基本上沿著整條光徑發(fā)生激發(fā)，使激發(fā)的空間定位相當(dāng)不確定。
一旦一個(gè)分子已被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，則可發(fā)生各種物理和化學(xué)過(guò)程，包括光子的光發(fā)射，光化學(xué)轉(zhuǎn)化，如異構(gòu)化或氧化，或者光電離。重要的是，是由激發(fā)態(tài)及其環(huán)境的基本性質(zhì)決定該分子的最終命運(yùn)。導(dǎo)致分子躍遷至激發(fā)態(tài)的機(jī)制對(duì)其命運(yùn)無(wú)顯著影響，這是由于激發(fā)過(guò)程本身并不直接影響被激發(fā)的分子或其環(huán)境的隨后性質(zhì)。
分子試劑如全氯乙烯的單光子光電離82和同時(shí)雙光子光電離84的激發(fā)態(tài)行為的等同形式簡(jiǎn)要示于圖4(以Jablonski簡(jiǎn)圖方式)。在單光子光電離82中，吸收單光子86的能量可激發(fā)一個(gè)分子從其基態(tài)88躍遷至相當(dāng)于或高于該分子的電離電位90的一個(gè)能級(jí)。此電離電位90應(yīng)高于一般的激發(fā)態(tài)能級(jí)92。當(dāng)通過(guò)吸收單光子86而躍遷至相當(dāng)于或高于該電離電位90的能級(jí)時(shí)，該分子將發(fā)生光電離94，此處以反應(yīng)R→R+表示，其中R為該分子的最初形式，而R+為該分子的離子化形式。對(duì)全氯乙烯分子而言，當(dāng)吸收254nm的單光子86(4.88ev)時(shí)會(huì)發(fā)生光電離94。在同時(shí)雙光子光電離84中，將同時(shí)吸收雙光子中的第一個(gè)光子96和雙光子中的第二個(gè)光子98的能量。如果雙光子中的第一個(gè)光子96和雙光子中的第二個(gè)光子98的合并能量等于單光子光電離82實(shí)例中所吸收的單光子86的能量，則對(duì)該分子的效果是相同的。雙光子中的第一個(gè)光子96激發(fā)該分子至一虛擬能級(jí)100后，經(jīng)吸收雙光子中的第二個(gè)光子98提供的附加能量可立即激發(fā)分子由該虛擬能級(jí)100躍遷至相當(dāng)于或高于該電離電位90的能級(jí)。一旦發(fā)生激發(fā)，光電離94即以與單光子激發(fā)82中所示的相同方式進(jìn)行。對(duì)全氯乙烯這一例子而言，同時(shí)吸收508nm的雙光子中的第一個(gè)光子96(2.44ev)和508nm的雙光子中的第二個(gè)光子98(2.44ev)會(huì)導(dǎo)致光電離94，這與吸收254nm的單光子(4.88eV)時(shí)發(fā)生的光電離相同。
注意除圖示于圖1和圖4中的例舉能級(jí)簡(jiǎn)圖以外，許多其它可能的躍遷和能級(jí)狀態(tài)也是可能的，這取決于大量因素，包括該分子系統(tǒng)的特性，其環(huán)境，以及吸收和釋放形式的能的具體能量，還有它們的時(shí)間和空間相關(guān)性。例如，為了簡(jiǎn)潔，圖1和圖4中略去了從單線激發(fā)態(tài)到三線激發(fā)態(tài)的系統(tǒng)間跨越這個(gè)重要的躍遷。這一躍遷在發(fā)光過(guò)程和許多光化學(xué)過(guò)程中尤為重要。示于圖1和圖4中的單線電子躍遷，如S0→S2，依據(jù)Pauli不相容原理，構(gòu)成了在量子力學(xué)中允許的躍遷，其中所有電子的自旋都是成對(duì)的，且這些成對(duì)的電子自旋均方向相反。三線態(tài)不同于單線態(tài)之處在于其中高能級(jí)電子與低能能級(jí)電子的自旋方向相同。雖然這種單線-三線躍遷在量子力學(xué)中是不允許的，但對(duì)于某些分子系統(tǒng)，由于其S1態(tài)的壽命相比于系統(tǒng)間跨越的速率常數(shù)相對(duì)要長(zhǎng)一些，因此這種內(nèi)部轉(zhuǎn)換的概率要大于0。由于從三線態(tài)回復(fù)到單線態(tài)的躍遷也是不允許的，如T1→S0，因此三線激發(fā)態(tài)的壽命可能特別長(zhǎng)，一般在10-6到101秒之間。這很重要，因?yàn)檫@么長(zhǎng)的三線態(tài)壽命可允許被激發(fā)的分子進(jìn)行各種化學(xué)反應(yīng)，特別是那些涉及將能量轉(zhuǎn)移至另一分子的那些反應(yīng)。涉及三線態(tài)中間產(chǎn)物的反應(yīng)在許多大的有機(jī)或生物有機(jī)分子的光化學(xué)中特別重要，且在很多用于光促治療的分子試劑的光激活中可作為主要的動(dòng)力學(xué)步驟。
前述關(guān)于激發(fā)態(tài)行為等價(jià)的討論可擴(kuò)展到涉及三線激發(fā)態(tài)的那些情形，原因在于分子激發(fā)、反應(yīng)與發(fā)射的途徑，包括那些涉及三線態(tài)的過(guò)程，都是由該分子及其環(huán)境所決定的。因此，在激發(fā)至三線態(tài)時(shí)發(fā)生特定光化學(xué)和光物理轉(zhuǎn)變的分子將經(jīng)歷相同的轉(zhuǎn)化，不管它是由單光子過(guò)程激發(fā)的還是由同時(shí)雙光子過(guò)程激發(fā)的。例如，我們已顯示，金屬-配基絡(luò)合物二氯化三(2,2′-雙吡啶)釕(Ⅱ)(RuBPY)在發(fā)生390nm單光子激發(fā)或780nm同時(shí)雙光子激發(fā)(其中780nm的雙光子的合并能量與390nm的單光子等同)時(shí)表現(xiàn)出相同的激發(fā)態(tài)性質(zhì)。圖5比較了經(jīng)390nm單光子激發(fā)102以及經(jīng)780nm同時(shí)雙光子激發(fā)104后，RuBPY的發(fā)光性質(zhì)作為發(fā)射波長(zhǎng)的函數(shù)，前者以圓圈表示，后者以實(shí)線表示。這兩種方法中三線激發(fā)態(tài)的發(fā)射性質(zhì)相同，表明激發(fā)態(tài)及其隨后的性質(zhì)相同，而與激發(fā)方法無(wú)關(guān)。
作為這種激發(fā)態(tài)行為等同的進(jìn)一步證實(shí)，圖6顯示，若測(cè)量用386.5nm的單光子激發(fā)106時(shí)RuBPY的發(fā)光壽命(以圓圈表示)及用782nm的同時(shí)雙光子激發(fā)108時(shí)RuBPY的發(fā)光壽命(以方塊表示)，則再次觀察到相同的激發(fā)態(tài)性質(zhì)。特別地，圖6是發(fā)光壽命作為激發(fā)態(tài)淬滅劑濃度的函數(shù)的Stern-Volmer曲線。若一分子躍遷至激發(fā)態(tài)，則該分子在激發(fā)態(tài)的停留時(shí)間長(zhǎng)短ι由該分子的基本性質(zhì)決定，可定義為τ=τ0。若向系統(tǒng)中加入一種激發(fā)態(tài)淬滅劑，則其壽命將變至不同τ值。眾所周知，若將τ0/τ的比值作為激發(fā)態(tài)淬滅劑濃度的函數(shù)作圖，則可得到線性關(guān)系。這就是Stern-Volmer圖。圖6顯示，對(duì)于添加了不同量的Fe3+淬滅劑的RuBPY水溶液而言，單光子激發(fā)106和同時(shí)雙光子激發(fā)108的Stern-Volmer曲線是相同的。這進(jìn)一步證實(shí)了分子的激發(fā)態(tài)性質(zhì)是相同的，并且這些性質(zhì)與躍遷至激發(fā)態(tài)的機(jī)理無(wú)關(guān)。
對(duì)單光子和同時(shí)雙光子激發(fā)而言，激發(fā)過(guò)程的選擇定則和截面也許相去甚遠(yuǎn)，但是分子的特定激發(fā)態(tài)的屬性是相同的，而與用于激發(fā)該分子躍遷到激發(fā)態(tài)的機(jī)理無(wú)關(guān)。圖7給出了單光子激發(fā)112和同時(shí)雙光子激發(fā)114的吸收截面的相對(duì)比較，這些吸收截面是用于1,3-萘二酚110的激發(fā)波長(zhǎng)的函數(shù)。要注意的是，用于代表同時(shí)雙光子激發(fā)114的數(shù)據(jù)的波長(zhǎng)范圍已經(jīng)過(guò)了調(diào)整，以反映出同時(shí)雙光子吸收在能量上等效于對(duì)一個(gè)能量?jī)杀队陔p光子中每個(gè)光子能量(或波長(zhǎng)的一半)的單光子的吸收。比較1,4-萘二酚110的單光子激發(fā)112和同時(shí)雙光子激發(fā)114的相對(duì)截面，可以看出它們作為波長(zhǎng)的函數(shù)的明顯差別。這些在截面上的差異可歸因于用于特定分子躍遷的單光子和雙光子的選擇定則不同，并且可基于單、雙光子選擇定則的差異，利用在截面方面的這些差異來(lái)優(yōu)化激發(fā)的選擇性，或者用來(lái)設(shè)計(jì)具有特殊雙光子吸收屬性的特定分子試劑。然而，總之，雖然特定分子試劑的選擇定則和截面可能存在也可能不存在顯著差異，但這些特定分子試劑的激發(fā)態(tài)屬性在每個(gè)有效激發(fā)波長(zhǎng)都基本一樣，而與激發(fā)方法無(wú)關(guān)。
單光子和同時(shí)雙光子過(guò)程中吸收和散射性質(zhì)的重要性盡管同時(shí)雙光子激發(fā)的截面可能明顯低于在單光子激發(fā)中所觀察到的截面，但在很多情況下，利用同時(shí)雙光子激發(fā)方法可能會(huì)比單光子激發(fā)更有利，原因在于較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光輻射的基質(zhì)吸收和光散射較低。例如，圖8表示動(dòng)物組織如人真皮從紫外(UV)到近紅外(NIR)光譜區(qū)的吸收光譜116。圖9表示動(dòng)物組織如人真皮在相似條件下的散射光譜122。特別地，圖8表明高能光子118怎樣經(jīng)歷比低能光子120明顯更強(qiáng)的組織吸收。例如，人類皮膚強(qiáng)烈吸收400nm的高能光子118，但對(duì)800nm的低能光子比較通透。這是皮膚中色素、蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)以及其它天然成分對(duì)高能光子118的天然吸收結(jié)果。圖9進(jìn)一步顯示高能光子124怎樣經(jīng)歷比低能光子126明顯更強(qiáng)的組織散射。任何光密介質(zhì)，例如人皮膚，都會(huì)強(qiáng)烈散射高能光子124，比如說(shuō)600nm的光子，但對(duì)1200nm的低能光子126，其散射卻低得多。這些光學(xué)性質(zhì)上的不同導(dǎo)致兩個(gè)重要結(jié)果。第一，當(dāng)暴露在UV或其它高能光時(shí)，組織會(huì)吸收短波長(zhǎng)、高能量光子118，造成不期望的組織損傷。相比之下，在低能光子120如NIR光的照射下，即使NIR光的光功率比UV輻射的光功率高許多倍，但其效果仍是可忽略的。第二，組織對(duì)高能光子118所固有的強(qiáng)吸收和散射會(huì)導(dǎo)致組織穿透深度很淺，而低能光子120的穿透深度通常要深得多。
高能和低能光在吸收和穿透深度性質(zhì)上的這些重要差別圖示于圖10中。若將UV光128，例如400nm的光照射到人組織130上，光能中的大部分很快被最外層132如表皮和真皮吸收和散射，該組織的細(xì)胞中某些分子，比如那些組成細(xì)胞核中遺傳物質(zhì)的分子的激發(fā)可能是吸收的原因。細(xì)胞成分吸收這種高能光可以起始這些細(xì)胞中的多種附帶的光化學(xué)變化134。由于對(duì)UV光128的吸收引起的這些附帶光化學(xué)變化134可以包括不可逆的遺傳損傷和癌癥的誘導(dǎo)。相比之下，組織130對(duì)NIR光136如800nm的光的吸收或散射就沒(méi)有如此可觀。穿透的總深度會(huì)深得多，對(duì)細(xì)胞的附帶損傷也會(huì)明顯減弱。因此，如果用長(zhǎng)波長(zhǎng)的激發(fā)光代替高能的單光子激發(fā)光，就有可能利用相對(duì)來(lái)說(shuō)無(wú)損傷、具高穿透深度的同時(shí)雙光子激發(fā)方法來(lái)光激發(fā)特定分子。
此外，與NIR光固有的無(wú)損傷屬性和低吸收性聯(lián)系起來(lái)后，圖3所示的非線性激發(fā)的性質(zhì)具有其它意義。例如，利用單光子激發(fā)138和同時(shí)雙光子NIR激發(fā)140方法照射皮下腫瘤142時(shí)，組織中光誘導(dǎo)損傷范圍的比較如圖11所示。單光子激發(fā)138造成了一個(gè)光損傷區(qū)144，其范圍基本上沿著整條光路，并且沒(méi)有明顯的生物特異性。這樣，除了在腫瘤142中誘導(dǎo)期望的光損傷外，整個(gè)周圍組織都會(huì)受到附帶損傷，例如表皮146和周圍的真皮148。如果單光子激發(fā)138被聚焦，在焦點(diǎn)150處的光損傷區(qū)144會(huì)稍微增強(qiáng)。然而值得一提的是，如果UV或可見(jiàn)光未到達(dá)腫瘤142之前就被表皮146和真皮148吸收掉，那么這一光損傷區(qū)144甚至不會(huì)延伸到腫瘤142。這是由于組織對(duì)短波長(zhǎng)的固有高吸收所造成的。相比之下，利用NIR同時(shí)雙光子激發(fā)140時(shí)，由于這一激發(fā)方法的非線性屬性所致，將引起窄范圍的遠(yuǎn)程光損傷區(qū)152，該區(qū)基本定位于焦點(diǎn)154處。此外，由于組織不會(huì)大量吸收NIR光，因而對(duì)其周圍表皮146和真皮148的附帶損傷能減到最小程度。
圖12表示在光密介質(zhì)中，一種定位的遠(yuǎn)程光激活響應(yīng)的激發(fā)。該圖給出了均勻分布于瓊脂糖凝膠塊中的染料分子香豆素480經(jīng)雙光子激發(fā)后的熒光照片。以78MHz的脈沖重復(fù)頻率、在一個(gè)直徑約為1mm的光束中，發(fā)出波長(zhǎng)為730mm、光脈沖(寬度)短于200fs的連續(xù)序列的鎖模鈦藍(lán)寶石激發(fā)器的近紅外輸出，用一個(gè)擴(kuò)散光束的望遠(yuǎn)鏡將其擴(kuò)散，以便產(chǎn)生一個(gè)直徑約為50mm的準(zhǔn)直光束。然后使用一塊100mm焦距、50mm直徑的雙凸單玻璃透鏡，將這個(gè)已擴(kuò)散的光束聚焦到該凝膠塊上。然后調(diào)整凝膠塊的方位，使得100mm焦距的透鏡的焦點(diǎn)落在凝膠塊內(nèi)40mm處。圖12明確表明香豆素480的熒光只有在NIR光束的焦點(diǎn)才被激發(fā)。由于雙光子激發(fā)和瞬時(shí)激光功率之間的二次方關(guān)系，光路中焦點(diǎn)前后各位置的分子激發(fā)是可以忽略的。因此在焦點(diǎn)區(qū)域外，僅有少量或沒(méi)有附帶光激活發(fā)生。而且，由于NIR激發(fā)光僅被凝膠微弱散射，因此在凝膠中較深的穿透深度仍能維持清晰的焦點(diǎn)。由于焦點(diǎn)的清晰度是由Gaussian光學(xué)性質(zhì)所決定的，那么可以通過(guò)改變用于光束擴(kuò)散和隨后聚焦的光學(xué)參數(shù)來(lái)方便地調(diào)節(jié)焦區(qū)的長(zhǎng)度。如果以等效的方法作用于標(biāo)記的腫瘤樣品，可以得到相似的結(jié)果，如圖13所示。該圖給出了均勻分布于整塊小鼠癌組織中的染料分子香豆素480經(jīng)雙光子激發(fā)后的熒光照片。象圖12中一樣，該圖也表明了激活的嚴(yán)格定位。
同時(shí)雙光子激發(fā)在醫(yī)療上的應(yīng)用上述討論表明組織和細(xì)胞成分對(duì)UV和NIR光吸收的根本差別，與同時(shí)雙光子激發(fā)的特殊非線性性質(zhì)一起在疾病治療的改進(jìn)上尤其是在光促治療(photodynamic therapy,PDT)領(lǐng)域中應(yīng)該有直接應(yīng)用。傳統(tǒng)的PDT，或者最近發(fā)展起來(lái)的“雙光子”PDT方法中利用光能對(duì)施用于患病組織的光敏藥物制劑進(jìn)行半選擇性光激活。這些制劑的施藥途徑主要是患病組織的局部施藥，或通過(guò)系統(tǒng)施藥途徑。在理想條件下，PDT試劑會(huì)分布于或者富集于患處。這種富集可能是對(duì)淺層患處直接局部施藥的結(jié)果，或者是由于患處的物理或化學(xué)性質(zhì)不同而導(dǎo)致PDT試劑分布于患處。PDT試劑施加后，利用光輻射來(lái)激發(fā)PDT試劑的光化學(xué)變化，達(dá)到治療效果。另一種方法是，將兩種或多種試劑施于患病組織，其中至少有一種試劑可以通過(guò)與光的相互作用而直接激發(fā)，且這些被激發(fā)的試劑可以通過(guò)能量轉(zhuǎn)移過(guò)程(例如電荷轉(zhuǎn)移或光的再發(fā)射)將捕獲的光能傳遞到一種或多種其它的共存試劑，從而產(chǎn)生治療效果。一個(gè)實(shí)例是聯(lián)合使用一種染料分子和一種PDT試劑，其中該染料分子捕獲激活光，隨后把能量傳遞給該P(yáng)DT試劑，由此引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)。就一切情況而論，使用PDT的醫(yī)療人員希望這些光化學(xué)變化可以導(dǎo)致患處局部的細(xì)胞增殖中止或細(xì)胞壞死。
已有的PDT激發(fā)方法是基于基本上與圖1所示方法等效的多種方法，其中利用直接單光子激發(fā)2或依次雙光子激發(fā)32；后者是在技術(shù)和專利文獻(xiàn)中的所有在前所述“雙光子”PDT方法的基礎(chǔ)。這兩大類激發(fā)方法都依賴于相對(duì)高能量、短波長(zhǎng)光，從而導(dǎo)致穿透深度較淺，并且附帶組織損傷的可能性較高。例如，利用PDT治療食道癌，對(duì)于表層病灶的治療很有效，但對(duì)于未局部暴露的病灶，其效果要差得多。再如基于8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP)的PDT治療牛皮癬，已證明當(dāng)用波長(zhǎng)為大約250到400nm的UV輻射來(lái)激發(fā)8-MOP時(shí)它是有效，但這一UV輻射與周圍部分皮膚癌的發(fā)生密切相關(guān)。正在開(kāi)發(fā)可利用NIR光進(jìn)行光激活的新型PDT試劑，以避免與UV輻射相關(guān)的危害。多數(shù)情況下，已證明這些試劑不太穩(wěn)定，且常常有毒。這可能部分由于這些試劑的激活閾值較低，使它們對(duì)目的治療區(qū)外的自發(fā)或不希望的反應(yīng)更加敏感。常規(guī)PDT方法的其它缺點(diǎn)還有施藥位點(diǎn)的特異性較低，并且有可能使激發(fā)通路上的健康組織壞死。
本發(fā)明講述的同時(shí)雙光子激發(fā)PDT方法可以避免傳統(tǒng)PDT方法的局限性和復(fù)雜性，并且可以與現(xiàn)有的PDT藥物試劑和新型NIR激活的PDT試劑兼容。尤其是，本發(fā)明能夠提高PDT試劑的光激活的定位，而且與傳統(tǒng)方法相比，可以顯著降低附帶組織損傷的可能性。如果對(duì)于穿透的控制不是很嚴(yán)格，則未聚焦的NIR光可以用來(lái)刺激位于較大輻照范圍內(nèi)的PDT試劑發(fā)生同時(shí)雙光子光激活。這種情況下，通過(guò)改變暴露于NIR光束中的位置、亮度和時(shí)間來(lái)控制PDT試劑的光激活范圍。如果需要對(duì)穿透深度或藥物施加的體積范圍進(jìn)行精確控制，可用聚焦的NIR光來(lái)刺激同時(shí)雙光子光激活過(guò)程。這種情況下，可利用光束輻射、暴露時(shí)間和聚焦程度來(lái)控制PDT試劑的光激活范圍。上述兩種情況下，可利用高輻照度NIR輻射來(lái)達(dá)到最高效率。而且，NIR輻射所達(dá)到的高穿透深度和光激活的固有定位(聚焦的同時(shí)雙光子激發(fā)使其成為可能)一起提供了一種用于光激活皮下病灶中的PDT試劑而不傷及上方或下方健康組織的獨(dú)特方法。
發(fā)明的第一個(gè)具體實(shí)施方案因此本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案就是應(yīng)用NIR光源，如鎖模的鈦-藍(lán)寶石激光器的輸出，使用波長(zhǎng)大約兩倍于傳統(tǒng)的單光子光激活所必需的波長(zhǎng)的光來(lái)誘導(dǎo)PDT試劑發(fā)生同時(shí)雙光子光激活。這個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案如圖14所示。NIR光源156生成的一束NIR輻射158由一系列快速的NIR輻射的高峰值功率的脈沖組成。例如，標(biāo)準(zhǔn)的市售鎖模鈦-藍(lán)寶石激光器能夠發(fā)射出鎖模脈沖，脈沖持續(xù)時(shí)間小于200fs，脈沖重復(fù)頻率超過(guò)75MHz，脈沖能量大約20nJ；這一光源發(fā)出準(zhǔn)連續(xù)光束，該光束具有較低的平均功率(上至幾瓦)，但都有高的峰值功率(在大約100kW的數(shù)量級(jí))，在NIR的波長(zhǎng)范圍由約690nm到1080nm連續(xù)可調(diào)。來(lái)自NIR光源156的脈沖串形成NIR輻射光束158，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的光學(xué)方法，如反射或折射光學(xué)系統(tǒng)160，可以方便地聚焦。聚焦過(guò)的NIR光束162隨后可被直接投射到患病組織164上。PDT試劑的同時(shí)雙光子光激活基本上被限定在聚焦光束162的共焦區(qū)166，因?yàn)橹挥性诮裹c(diǎn)處才表現(xiàn)高的瞬時(shí)輻照水平。而且，不管PDT試劑是否存在于周圍的健康組織168或皮膚170中，發(fā)生在共焦區(qū)166之外的附帶光激活或光損傷都不顯著。這是瞬時(shí)光功率和同時(shí)雙光子激發(fā)之間非線性關(guān)系的結(jié)果，這使得顯著的激發(fā)僅限于共焦區(qū)166范圍內(nèi)；即使PDT試劑存在于共焦區(qū)166之外，激活功率水平也不足以形成明顯的光激活。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案在這方面與現(xiàn)有技術(shù)有明顯差別，在現(xiàn)有技術(shù)中未能提供可行的途徑來(lái)嚴(yán)格限定沿著光束的面積范圍及其輻射通路的光激活區(qū)的范圍。通過(guò)掃描整個(gè)患病組織164的體積內(nèi)光束162的焦點(diǎn)的位置，遍布其中的PDT試劑便全部被光激活。掃描的實(shí)現(xiàn)可以通過(guò)改變焦點(diǎn)162相對(duì)于患病組織164的位置，或使患病組織164相對(duì)于固定的焦點(diǎn)162的位置發(fā)生移動(dòng)。在用標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)方法聚焦之前使用光束擴(kuò)展器或其它設(shè)備，對(duì)NIR輻射158的光束進(jìn)行預(yù)光擴(kuò)散，可以使聚焦的NIR光束162的共焦區(qū)166質(zhì)量得到提高。
這種同時(shí)雙光子光激活的實(shí)施方案在治療局部患病組織方面有不同的形式，如圖15和圖16所示。例如，圖15中的聚焦NIR光，或圖16中的未聚焦的NIR光的無(wú)損傷性使得局部位點(diǎn)的PDT試劑可發(fā)生光激活，同時(shí)對(duì)下層或周圍組織沒(méi)有危害。
如圖15所示，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)裝置，如散射或折射光學(xué)儀器，將來(lái)自NIR光源的一束NIR輻射光束158聚焦162到患病組織164上時(shí)，就可使用于局部治療的PDT試劑發(fā)生聚焦的NIR同時(shí)雙光子光激活。這種情況下，PDT試劑的光激活僅發(fā)生在共焦區(qū)166。即使周圍的健康組織168和皮膚170也含有PDT試劑，在此過(guò)程中它們也不會(huì)受到影響，因?yàn)楣饧せ罨旧媳幌拗圃诠步箙^(qū)166。如前文所述，可以通過(guò)掃描來(lái)達(dá)到整個(gè)患病組織164全部體積內(nèi)的PDT試劑的光激活。
如圖16所示，當(dāng)將NIR源156發(fā)出的非聚焦或發(fā)散光束172投射到患病組織164上時(shí)，就可使用于局部治療的PDT試劑發(fā)生未聚焦的NIR同時(shí)雙光子光激活。光束172的截面積可以小于、等于或大于患病組織164的面積。如果通過(guò)施藥控制或應(yīng)用優(yōu)先的系統(tǒng)性富集的方法使PDT試劑基本上限定在患病組織164的該體積內(nèi)，那么治療就基本上限定在患病組織164的該體積中。由于光束172對(duì)不含高濃度PDT試劑的組織無(wú)害，故避免了對(duì)周圍健康組織168和皮膚170的損傷。在對(duì)患病組織164的確切位置，大小和形狀不清楚，或由于精細(xì)控制光束172的定位對(duì)于治療方法的成功實(shí)施不是很重要，從而沒(méi)必要精確控制光線172的定位的情況下，這一實(shí)施方案尤其有用。使用非聚焦的光束時(shí)，利用極高峰值功率的激發(fā)源如Q-開(kāi)關(guān)激光器或再生放大的鎖模激光器可能會(huì)有利，因?yàn)槠渚哂歇?dú)特的高峰值輻射功率(在GW范圍內(nèi))，能夠在大面積內(nèi)提供高的瞬時(shí)輻照。
同時(shí)雙光子光激活的優(yōu)選實(shí)施方案的最后一種有關(guān)的變更如圖17所示，其中將NIR源156發(fā)出的非聚焦或發(fā)散光束172投射到皮下患病組織164上。光束172的截面積可能會(huì)小于、等于或大于患病組織164。如果通過(guò)施藥控制或應(yīng)用優(yōu)先的系統(tǒng)性富集方法，使PDT試劑基本上限定在患病組織164的體積內(nèi)，那么治療就基本限定在該患病組織164的該體積內(nèi)。由于光束172對(duì)不含高濃度PDT試劑的組織無(wú)害，故避免了對(duì)周圍健康組織168和皮膚170的損傷。在對(duì)患病組織164的確切位置、大小和形狀不清楚，或由于精細(xì)控制光束172的定位對(duì)于治療方法的成功實(shí)施不很重要，從而沒(méi)必要精確控制光束172的定位的情況下，這一實(shí)施方案尤其有用。象前面非聚焦的實(shí)施方案中一樣，利用極高峰值功率激發(fā)源可能較為有利，因?yàn)槠渚哂刑貏e高的峰值輻射功率，可能對(duì)大面積有很高的瞬時(shí)輻照。
單光子和同時(shí)雙光子激發(fā)在醫(yī)療應(yīng)用中的比較補(bǔ)骨脂素類衍生物AMT(4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素)是已知的DNA雙螺旋嵌入劑，暴露于UV照射后，嵌入形式會(huì)逐步出現(xiàn)加成物形成和交聯(lián)現(xiàn)象。嵌入的補(bǔ)骨脂素類的加成物形成和交聯(lián)主要是暴露在320-400nm光中時(shí)由單光子誘導(dǎo)造成的。這些反應(yīng)導(dǎo)致嵌入的AMT在加成物形成和交聯(lián)時(shí)在發(fā)光性質(zhì)上發(fā)生光譜移動(dòng)。因此可通過(guò)測(cè)量這些發(fā)光性質(zhì)的光譜移動(dòng)來(lái)檢測(cè)加成物形成和交聯(lián)現(xiàn)象。圖18表示在連續(xù)的365nm UV照射中暴露不同的累加時(shí)間，插入的AMT的熒光帶位置發(fā)生的典型逐步移動(dòng)。具體地說(shuō)，隨著暴露于UV而形成加成物，AMT熒光帶的位置會(huì)從450nm移到390nm。如果波長(zhǎng)364nm UV光的亞微微秒脈沖(由頻率兩倍于鎖模鈦藍(lán)寶石激光器的728nm NIR輸出而生成)被用來(lái)照射類似被嵌入的AMT樣品，可得到等效的結(jié)果，如圖19所示。用于圖18和圖19所示數(shù)據(jù)的平均光子流被調(diào)整到相似水平，因此說(shuō)明AMT分子基本上對(duì)激發(fā)脈沖寬度不敏感，而與累加光子劑量有關(guān)。圖20所示的對(duì)照實(shí)驗(yàn)確證了插入的AMT暴露于后并未出現(xiàn)明顯的加成物形成。用728nm NIR光的亞皮秒脈沖(由鎖模鈦藍(lán)寶石激光生成)照射類似被嵌入的AMT樣品，得到與暴露于UV光時(shí)等效的結(jié)果，如圖21所示。因此利用直接單光子激發(fā)或同時(shí)雙光子激發(fā)模型化合物AMT，能等效激發(fā)PDT作用。
技術(shù)文獻(xiàn)中的報(bào)道表明需要相對(duì)較長(zhǎng)的激發(fā)脈沖來(lái)最有效地刺激一些PDT試劑的完全激活。尤其是在依次多步激活過(guò)程中，例如加成物形成后再交聯(lián)，以合適的間隔為后繼步驟提供光能很重要。例如，Hearst及其同事(J.E.Hearst,T.T.Isaacs,d.Kane,H.Rapoport,和K.Straub,“補(bǔ)骨脂素類和脫氧核糖核酸的反應(yīng)”，Quarterly Review of Biophysics,17(1984)1-44)用多脈沖激光激發(fā)方法和嵌入的補(bǔ)骨脂衍生物來(lái)表明最有效的交聯(lián)發(fā)生在加成物形成的最初刺激后延遲大約1μs的時(shí)間后時(shí)提供光能時(shí)。這已被歸因?yàn)閯?dòng)力學(xué)延遲，其與加成物形成步驟和交聯(lián)步驟之間必要的緩慢的構(gòu)象變化有關(guān)。鎖模激光器如鎖模鈦藍(lán)寶石激光器的輸出的準(zhǔn)連續(xù)性質(zhì)與上述要求很吻合，因?yàn)檫@種激光器通常以10-20ns的間隔發(fā)射連續(xù)的脈沖串；被激發(fā)的分子有許多機(jī)會(huì)從這列脈沖串中吸收后繼光激活步驟所必需的能量。然而再生放大鎖模激光器如再生放大鎖模鈦-藍(lán)寶石激光器更有效地符合上述要求。這些激光器以1-10μs為間隔發(fā)射短而極強(qiáng)的光脈沖；通常，這一間隔在脈沖間延遲的較大范圍內(nèi)可調(diào)。因此所能達(dá)到的極高的峰值功率(與標(biāo)準(zhǔn)鎖模激光器相比)以及微秒級(jí)的脈沖頻率一起使這種光源成為激發(fā)依次的多步驟同時(shí)雙光子光激活過(guò)程的理想工具。通過(guò)AmesⅡ試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)PDT試劑的同時(shí)雙光子激發(fā)補(bǔ)骨脂素衍生的PDT試劑AMT(4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素)通過(guò)DNA的光激活的加成物形成和交聯(lián)可以產(chǎn)生治療效果。這些反應(yīng)綜合起來(lái)可以使受處理細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞的增殖和生理過(guò)程減緩或停止。通常在UV波長(zhǎng)(也就是365nm)利用單光子激發(fā)可使AMT光激活；由于AMT與DNA形成加成物和交聯(lián)使DNA發(fā)生突變。這樣，為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)同時(shí)雙光子光激活作為PDT試劑光激活的改進(jìn)方法的性質(zhì)，可以應(yīng)用AmesⅡ致突變力分析法。具體而言，就是利用AMAX GTA-225基因毒性分析(源自Xenometrix,Boulder,CO)來(lái)檢測(cè)730nm雙光子激活引起的AMT的致突變力。
AMAX GTA-225試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏桿菌組氨酸(His)操縱子中的突變來(lái)分析一種試劑或過(guò)程的致突變力。試驗(yàn)菌株是組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型(His-)，這是由于His操縱子中存在特定點(diǎn)突變，會(huì)使細(xì)菌不能合成組氨酸；如果不向它們提供組氨酸，這種His-有機(jī)體就不能生長(zhǎng)。這樣，當(dāng)處于不合組氨酸的環(huán)境時(shí)，那些His-營(yíng)養(yǎng)缺陷型只有經(jīng)歷了回復(fù)突變(變成His+)方可存活。在非細(xì)胞毒條件下，應(yīng)用誘變劑可以提高試驗(yàn)菌株回復(fù)體的數(shù)量，使其高于自發(fā)回復(fù)體基線。AMAX GTA-225分析中使用的試驗(yàn)菌株有堿基對(duì)替代突變(TA7001-TA7006株)，也有移框突變(品系TA98株)。試驗(yàn)在兩類試驗(yàn)菌株中獨(dú)立實(shí)施，條件有五種(1)負(fù)對(duì)照(無(wú)菌水)；(2)正對(duì)照；(3)光照射加上無(wú)菌水；(4)只有AMT；和(5)AMT加上光照射。用于堿基對(duì)替換和移框突變的正對(duì)照分別是N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG,Sigma，檢測(cè)中用0.25μM)和2-硝基芴(2-NF,Aldrich，檢測(cè)中0.5μM)。每種條件的試驗(yàn)重復(fù)三次，15種試驗(yàn)中的每一個(gè)分布到48孔板上進(jìn)行原養(yǎng)型生長(zhǎng)，隨后計(jì)數(shù)分析。
分別測(cè)定兩類試驗(yàn)菌株的適宜AMT濃度。將AMT滴入特定的試驗(yàn)菌株類型中，然后在37℃于摻入了組氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)90分鐘，輕微振蕩。在無(wú)細(xì)胞毒性的AMT濃度下，營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)發(fā)生在培養(yǎng)過(guò)程中?；谂囵B(yǎng)后測(cè)量600nm的光密度，將檢測(cè)中所用AMT濃度選定為最大的非細(xì)胞毒性劑量。檢測(cè)中用于堿基對(duì)替換和移框突變的AMT濃度分別為720μM和390μM。為了使必需的照射體積降到最小，只把試驗(yàn)化學(xué)物質(zhì)(水，AMT或正對(duì)照)和試驗(yàn)菌株混合達(dá)到64μL的總樣品體積。將要接受后繼照射的樣品轉(zhuǎn)移到石英比色皿，利用來(lái)自鎖模鈦-藍(lán)寶石激光器的730nm NIR激光束照射這些樣品30分鐘，該激光束沿著比色皿的縱軸被聚焦。在不照射時(shí)，每個(gè)64μl的樣品在環(huán)境條件下，加蓋保存在防UV的小瓶中。
在起始光照后(對(duì)正或負(fù)對(duì)照，AMT，光，或AMT和光)，每個(gè)64μl樣品中加入440μl摻入了組氨酸的培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)90分鐘，并輕微振蕩。此培養(yǎng)基中稀釋的組氨酸濃度允許營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞有限增殖，并因此通過(guò)His+回復(fù)突變表達(dá)致突變力。培養(yǎng)后，大約5x不含組氨酸的指示培養(yǎng)基加入每一樣品，接著每一樣品分成50μl的等分試樣加入48孔板中。這些微樣品在37℃培養(yǎng)大約40小時(shí)，不用振蕩。由于第二種培養(yǎng)基不含組氨酸，在這一步培養(yǎng)只支持His+菌的原養(yǎng)型生長(zhǎng)，它是在起始培養(yǎng)期間發(fā)生的回復(fù)突變菌發(fā)展起來(lái)的。因此原養(yǎng)型生長(zhǎng)可以指示致突變力。指示培養(yǎng)基中含有pH指示劑，可用來(lái)估計(jì)原養(yǎng)型生長(zhǎng)的程度。給定試驗(yàn)條件的相對(duì)突變的檢測(cè)是通過(guò)對(duì)每個(gè)條件下的陽(yáng)性微孔的計(jì)數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。堿基對(duì)替換和移框突變的結(jié)果如表Ⅰ、Ⅱ所示。表Ⅰ．培養(yǎng)35小時(shí)的鼠傷寒沙門氏菌中堿基對(duì)替換突變的AmesⅡ試驗(yàn)結(jié)果。AMT濃度，720μM；負(fù)對(duì)照，無(wú)菌蒸餾水；正對(duì)照，MNNG(N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍，檢測(cè)中0.25μM)。
標(biāo)準(zhǔn)PDT試劑和新PDT試劑的同時(shí)雙光子激活方法的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)PDT試劑具有組織特異性，這主要基于試劑和組織(如癌癥患處)兩方面結(jié)合的化學(xué)和物理特性。例如，·補(bǔ)骨脂素及其衍生物(包括5-甲氧基補(bǔ)骨脂素[或5-MOP]；8-甲氧基補(bǔ)骨脂素[8-MOP]；4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素[TMP]；4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素[AMT]；4′-羥甲基-4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素[HMT]；5-氯甲基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素，當(dāng)歸根素[異補(bǔ)骨脂素]；5-甲基當(dāng)歸根素[5-MIP]；和3-乙氧甲酰基補(bǔ)骨脂素)；·各種卟啉和血卟啉衍生物(包括血卟啉衍生物[HPD]；PhotofrinⅡ；苯并卟啉衍生物[BPD]；原卟啉Ⅸ[PpⅨ]；染料血卟啉醚[DHE]；多血卟啉酯類[PHE]；原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯[PH1008]；四(3-羥基苯基)卟啉[3-THPP]；四苯基卟啉單磺酸鹽[TPPS1]；四苯基卟啉二磺酸鹽[TPPS2a]；二血卟啉醚；meso-四苯基卟啉；和meso-四[4N-甲基吡啶基)卟啉[T4MPyP])以及多種四氮雜卟啉類(包括八(4-叔丁基苯基)-四吡嗪基紫菜嗪[OPTP]；四(4-叔丁基)酞菁[t4-PcH2]；和四(4-叔丁基)酞菁鎂[t4-PcMg])；·各種酞菁衍生物(包括氯化鋁酞花青磺化的酞菁[CASPc]；氯化鋁酞花青酞菁四硫酸鹽[AlPcTS]；單-，雙-，三-和四-磺酸化的鋁酞菁[包括AlSPc,AlS2Pc,AlS3Pc和AlS4Pc]；硅酞菁[SiPcⅣ]；鋅(Ⅱ)酞菁[ZnPc]；雙(二異丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(isoBOSINC])；和鍺(Ⅳ)八丁氧基酞菁。
·各種若丹明衍生物(包括若丹明101[Rh-101]；若丹明110[Rh-110]；若丹明123[Rh-123]；若丹明19[Rh-19]；若丹明560[Rh-560]；若丹明575[Rh-575]；若丹明590[Rh-590]；若丹明610[Rh-610]；若丹明640[Rh-640]；若丹明6G[Rh-6G]；若丹明700[Rh-700]；若丹明800[Rh-800]；若丹明B[Rh-B]；磺基若丹明640或101；和磺基若丹明B)；·各種香豆素衍生物(包括香豆素1,2,4,6,6H,7,30,47,102,106,120,151,152,152A,153,311,307,314,334,337,343,440,450,456,460,461,466,478,480,481,485,490,500,503,504,510,515,519,521,522,523,535,540,540A,548)；·各種苯并吩噁嗪衍生物(包括5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噁嗪鎓鹽[TtNBA]；5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噻嗪鎓鹽[EtNBS]；和5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓鹽[EtNBSe])；·氯丙嗪及其衍生物；·各種葉綠素和細(xì)菌葉綠素衍生物(包括細(xì)菌二氫卟酚a[BCA])；·各種金屬-配基絡(luò)合物，例如二氯化三(2,2′-二吡啶)釕(Ⅱ)(RuBPY)；·脫鎂葉綠甲酯一酸a[Pheo a]；部花青540[MC540]；維生素D；5-氨基-γ-酮戊酸[ALA]；photosan；二氫卟酚e6，二氫卟酚e6亞乙基二酰胺，和單-L-天冬氨酰基二氫卟酚e6；脫鎂葉綠甲酯一酸-a[Ph-a]；吩噁嗪尼羅藍(lán)衍生物(包括各種吩噁嗪染料)；·各種電荷轉(zhuǎn)移和輻射轉(zhuǎn)移試劑，如芪，芪衍生物和4-(N-(2-羥乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4′-(6-羥基己基磺酰基)芪(APSS)；和·許多其它光激活或光敏試劑，這些試劑通常會(huì)聚集在施藥點(diǎn)或其附近，或者半選擇性地位于特定組織內(nèi)，這是由于該組織的物理或化學(xué)性質(zhì)的不同導(dǎo)致該P(yáng)DT試劑摻入該組織中。而且，通常利用單光子或依次雙光子激活的方法來(lái)激活這些PDT試劑，該方法會(huì)促進(jìn)一個(gè)或多個(gè)光化學(xué)或光物理過(guò)程，包括鍵的生成或裂解，加成物形成，交聯(lián)，自由基的產(chǎn)生，單一氧的產(chǎn)生，有毒物質(zhì)的生成，和能量轉(zhuǎn)移，但并不限于上述幾種。傳統(tǒng)激活方法在激活的范圍或深度上所提供的選擇性很小，應(yīng)用通常局限在淺層的組織或患處。誘導(dǎo)PDT作用的機(jī)制可能是單一試劑的直接激活(如AMT光激活后刺激形成加成物形成)，或間接光激活(如光吸收劑如APSS的光激活，它可以隨后將能量傳遞到鄰近的生物活性劑，如photofrin)。然而，上文的第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案以及支持性論述和效能數(shù)據(jù)清晰地表明，本申請(qǐng)中所講授的發(fā)明對(duì)于所有這些列出的及其它未特別列出的PDT試劑和光敏劑均適用。具體說(shuō)，所有這些試劑都會(huì)對(duì)波長(zhǎng)約為單光子激發(fā)中所用波長(zhǎng)兩倍的同時(shí)雙光子激發(fā)產(chǎn)生響應(yīng)，并且一旦被激發(fā)，它們所表現(xiàn)出的行為與單光子激發(fā)中表現(xiàn)的行為等效。具體而言，本申請(qǐng)中用于證明單光子激發(fā)和同時(shí)雙光子激發(fā)的激發(fā)態(tài)行為在光物理和光化學(xué)性質(zhì)上等效的不同例證中所出示的結(jié)果(如RuBPY的光化學(xué)，DNA中的AMT加成物形成，以及DNA和細(xì)胞活力的AmesⅡ檢測(cè)效果)證明了同時(shí)雙光子激發(fā)適用于所有PDT試劑的成功激活和試劑激活機(jī)理。而且，利用同時(shí)雙光子激發(fā)在施藥點(diǎn)的控制上和減少附帶損傷方面的改進(jìn)比傳統(tǒng)的單光子或依次雙光子激活具有特殊的優(yōu)勢(shì)。這包括穿透深度的提高，對(duì)施藥點(diǎn)空間控制的提高，和PDT治療副作用的減少。
正在開(kāi)發(fā)許多新的對(duì)NR的直接單光子激活敏感的PDT試劑；這些試劑的意義在于減少伴隨常規(guī)UV和可見(jiàn)光激活的副效應(yīng)及其它限制。一個(gè)例子是PhotofrinⅡ及相關(guān)試劑，它們可用波長(zhǎng)大于500nm的單光子激發(fā)光激活。本申請(qǐng)所教導(dǎo)的發(fā)明中這類PDT試劑一樣有特定的優(yōu)勢(shì)。特別地，1.0到2.0μm光譜帶內(nèi)波長(zhǎng)的同時(shí)雙光子激活的使用能提供比單光子激活相對(duì)較深的穿透深度，因該譜帶內(nèi)波長(zhǎng)的光較之0.5到1μm譜帶大幅度降低了組織吸收和散射，而且，與單光子激活方法相比，此處提出的同時(shí)雙光子激活的空間定位優(yōu)勢(shì)能在這類治療應(yīng)用上提供更好的調(diào)控。NIR激光器光源如鎖模光參數(shù)振蕩器和其它類似儀器可方便地用來(lái)提供適用于同時(shí)雙光子激活NIR PDT試劑的光能。同時(shí)雙光子激活的方法對(duì)高級(jí)生物源性PDT試劑的意義在理想條件下，標(biāo)準(zhǔn)PDT試劑基于對(duì)患病組織的化學(xué)或物理親和而獲得目標(biāo)專一性。通過(guò)這種方法，PDT試劑將分散于患病組織或者集中在患病組織的表面或內(nèi)部。遺憾的是這種目標(biāo)專一性常常不是很精確。事實(shí)上，有必要產(chǎn)生一種能夠提高PDT試劑目標(biāo)瞄準(zhǔn)和激活專一性的改進(jìn)方法。一種提高PDT試劑目標(biāo)專一性的方法源于疾病的特殊生物學(xué)特征的應(yīng)用。特別地，通過(guò)反義寡聚核苷酸試劑和一個(gè)或更多光敏部分如補(bǔ)骨脂素或其衍生物相耦合，就會(huì)生成能夠選擇性攻擊病變細(xì)胞的新型生物源性PDT試劑。另外，通過(guò)改變用于生物源性探針的寡聚物密碼，這種基礎(chǔ)的方法可很容易擴(kuò)展到大量基于遺傳的疾病或紊亂。同時(shí)雙光子激活的使用，使得這種強(qiáng)有力的方法依靠該生物源性探針的生物專一性與同時(shí)雙光子光激活過(guò)程固有的高空間定位相結(jié)合而得到了應(yīng)用。這樣，基于遺傳和光子特異性相結(jié)合的一種新的PDT療法就可以非常專一地瞄準(zhǔn)特定的器官，組織或病灶。
例如，一個(gè)生物源性探針可以被一個(gè)能夠承受有效的同時(shí)雙光子激活的光敏基團(tuán)如異硫氰酸熒光素(或FITC)所“化學(xué)標(biāo)記”。如圖22所示，以一段和人p53腫瘤抑制基因互補(bǔ)(反義)的DNA序列作為模型。之所以選用這個(gè)基因是因?yàn)樗谌祟惡托∈蟮男夭磕[瘤的發(fā)展中起著很重要的作用。大部分人類胸部腫瘤的發(fā)展都是由于這個(gè)關(guān)鍵的生長(zhǎng)抑制基因的缺失或者突變。既然p53的變化是在腫瘤發(fā)展之前發(fā)生的，可利用一種基于改變這個(gè)基因的治療方法在腫瘤發(fā)展之前破壞癌前細(xì)胞。分化和生長(zhǎng)促進(jìn)基因(原癌基因)的改變對(duì)于腫瘤毒性的發(fā)生和發(fā)展也起著很關(guān)鍵的作用。通過(guò)反義DNA治療以抑制生長(zhǎng)促進(jìn)活性被認(rèn)為是一種潛在的治療癌癥的方法。然而，對(duì)于正常的細(xì)胞，這些基因的不受控制的反義抑制是高毒性的。利用精確瞄準(zhǔn)的雙光子光激活對(duì)反原癌基因(anti-oncogene)探針的激活位點(diǎn)的二級(jí)調(diào)控使這種方法用于活體治療癌癥成為可能。圖22顯示生物源性PDT試劑的細(xì)胞內(nèi)光激活可通過(guò)雜交174或去阻遏176實(shí)現(xiàn)。特別地，對(duì)于雜交174后的生物源性PDT試劑激活，將經(jīng)耦聯(lián)劑180耦聯(lián)至光敏試劑182的反義基因探針178與DNA或RNA188中所含的目標(biāo)基因序列186雜交184。雜交前探針的傳遞通過(guò)引導(dǎo)該生物源性PDT探針進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法或其它方式實(shí)現(xiàn)。在被光激活前，用于雜交的探針190不會(huì)影響細(xì)胞的行為，基因轉(zhuǎn)錄或其它細(xì)胞過(guò)程。利用光能192輻照雜交探針190來(lái)激活。利用光能192照射而光激活雜交探針190能導(dǎo)致細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一系列修飾194，包括交聯(lián)，切割和堿基取代，這將影響細(xì)胞的功能，再生或生活力?；蛘?，利用光能192照射對(duì)雜交探針190的光激活能通過(guò)啟動(dòng)毒性反應(yīng)或產(chǎn)生毒性物質(zhì)198(如自由基化合物和單態(tài)氧)而導(dǎo)致細(xì)胞壞死196。一個(gè)基因探針200因通過(guò)耦聯(lián)劑204耦聯(lián)于該反義基因探針200上的光敏試劑202的存在而被阻遏，在該反義基因探針200被利用光能206光激活該光敏試劑202而去阻遏176時(shí)，即通過(guò)去阻遏176實(shí)現(xiàn)PDT試劑的激活。注意去阻遏176前，被阻遏的反義基因探針200不能與其目標(biāo)基因序列186雜交或相互作用。這可能是因?yàn)楣饷粼噭?02的存在而產(chǎn)生的位阻，極性及三級(jí)或四級(jí)構(gòu)象的變化或其它效應(yīng)。因去阻遏，反義基因探針200可自由地與目標(biāo)基因序列186雜交208或相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞功能、再生或生活力的變化。
在圖22所顯示的實(shí)例中用了原核或真核細(xì)胞的遺傳物質(zhì)作為例子。但是，必須說(shuō)明的是這里所講授的發(fā)明并不僅限于細(xì)胞遺傳物質(zhì)，它還可以應(yīng)用于組成或源于病毒或其它來(lái)源的遺傳物質(zhì)。同樣必須說(shuō)明的是，基于免疫學(xué)或其它生物特定方法而不是遺傳學(xué)方法的瞄準(zhǔn)方法可以被替換而不會(huì)失去本發(fā)明的效力。值得一提的是，基于抗原-抗體法的試劑的特異性為疾病和感染的治療提供了一種極為有效的新方法，這里的抗體探針結(jié)合了一個(gè)光敏基團(tuán)。獲得試劑瞄準(zhǔn)生物特異性的其它方法還包括但限于利用配基、半抗原、糖類、脂類，或者蛋白質(zhì)受體或絡(luò)合試劑，螯合劑，和被囊載體，例如脂質(zhì)體，富勒烯(fullerenes)，冠醚和環(huán)糊精。不管探針試劑靶向的機(jī)制如何，同時(shí)雙光子激活探針試劑的使用使得對(duì)應(yīng)用位點(diǎn)的進(jìn)一步調(diào)控成為可能，它基于對(duì)非線性光激活位點(diǎn)進(jìn)行控制的內(nèi)在精確性。這種通過(guò)空間特異的光激活而進(jìn)行的二級(jí)水平調(diào)控對(duì)于許多基于生物源性的治療是極其重要的，因?yàn)檫@類治療在正常細(xì)胞中有潛在毒性。因而，同時(shí)雙光子激活的應(yīng)用在這類治療的成功使用中很關(guān)鍵。
本發(fā)明的第二個(gè)示范性實(shí)施方案這是本發(fā)明中用生物源性PDT試劑以改進(jìn)PDT用藥的目標(biāo)專一性和效力的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案，尤其是當(dāng)這類試劑與雙光子光激活的獨(dú)特性質(zhì)結(jié)合使用時(shí)。這一優(yōu)選實(shí)施方案示于圖23。生物源性PDT試劑210局部用于212或系統(tǒng)用于212病灶214，如瘤生長(zhǎng)區(qū)或微生物感染區(qū)；該病灶214也可位于其它健康組織216之上或之內(nèi)。該生物源性PDT試劑210基于病灶性生物目標(biāo)序列218達(dá)到對(duì)病灶214的特異性，該目標(biāo)序列基本上是病灶214的特異序列，且與試劑性生物目標(biāo)序列220互補(bǔ)。所述試劑性生物目標(biāo)序列220帶有光敏基團(tuán)222。該試劑性生物目標(biāo)序列220與病灶性生物目標(biāo)序列218的結(jié)合224產(chǎn)生一基本局限于病灶214位點(diǎn)的目標(biāo)試劑226。通過(guò)與光輻射228相互作用，目標(biāo)試劑226的光敏基團(tuán)222隨后轉(zhuǎn)變?yōu)橐驯患せ畹墓饷艋鶊F(tuán)230；這種轉(zhuǎn)變?cè)从谌肷涔廨椛?28對(duì)光敏基團(tuán)222內(nèi)光化學(xué)或光物理轉(zhuǎn)變過(guò)程的激發(fā)。光敏基團(tuán)222轉(zhuǎn)變?yōu)楸患せ畹墓饷艋鶊F(tuán)230導(dǎo)致局部細(xì)胞壞死或其它期望的治療過(guò)程232。光敏基團(tuán)222的這種轉(zhuǎn)變可通過(guò)雙光子激活過(guò)程的應(yīng)用而空間定位，此激發(fā)過(guò)程源于高輻射度光源如鎖模鈦藍(lán)寶石激光器產(chǎn)生的聚焦或未聚焦光束對(duì)光敏基團(tuán)222的照射。通過(guò)這種方式，治療過(guò)程232作用的位點(diǎn)可通過(guò)試劑性生物目標(biāo)序列220的特異性與對(duì)入射光輻射228作用位點(diǎn)的控制的特異性相結(jié)合來(lái)調(diào)控。
象癌癥和繼承性遺傳缺陷這樣的疾病可用基于生物源性PDT的療法選擇性地治療，尤其是這個(gè)方法本身能夠非侵犯性地修飾遺傳物質(zhì)。一個(gè)有目標(biāo)的、非侵犯性的專門用于破壞或修飾異常生長(zhǎng)基因的方法可大大提高癌癥治療的有效性，而且治療僅局限于癌癥細(xì)胞。事實(shí)上，在特定組織中由于繼承或自發(fā)的遺傳事件引起的任何遺傳因子的異常表達(dá)都可以用這種方法治療。這種方法還可用于治療傳染性疾病，尤其是但不限于由逆轉(zhuǎn)錄病毒感染因子引起的那些疾病(包括AIDS)，以及微生物感染(例如局部的或系統(tǒng)性細(xì)菌感染)。
可選擇或設(shè)計(jì)特殊的發(fā)色光敏基團(tuán)，這種基團(tuán)可通過(guò)同時(shí)雙光子激活而為所選擇的轉(zhuǎn)換如鍵的斷裂或自由基的形成提供更好的截面和更高的效率。這樣的分子可作為高級(jí)PDT試劑單獨(dú)使用，或者摻入到生物源性PDT試劑中。例如，通過(guò)使用可選擇性結(jié)合目標(biāo)序列從而被光輻射激活的這種試劑，可破壞、修飾特殊基因序列，或者改變它們的體內(nèi)表達(dá)水平。
必須清楚的是，盡管前面的公開(kāi)內(nèi)容集中于使用鎖模鈦藍(lán)寶石激光器產(chǎn)生的脈沖NIR光輻射以及同時(shí)雙光子激活PDT試劑進(jìn)行治療性應(yīng)用的實(shí)例，但本發(fā)明并不僅限于這樣的雙光子激發(fā)或者這種狹義上的光源。事實(shí)上，本發(fā)明的各個(gè)方面在利用線性或其它非線性方法光進(jìn)行激發(fā)時(shí)都是適用的。例如，這里所描述的生物源性PDT試劑對(duì)線性光激發(fā)過(guò)程也是有反應(yīng)的。同樣，各種其它光源也是適用的，它們可單獨(dú)或聯(lián)合使用，例如連續(xù)波和脈沖燈，二極管光源，半導(dǎo)體激光器；其它類型的氣體、染料和固態(tài)的連續(xù)的、脈沖的或鎖模激光器，包括氬離子激光器；氪離子激光器；氦氖激光器；氦鎘激光器；紅寶石激光器；Nd:YAG,Nd:YLF,Nd:YAP,Nd:YVO4,Nd:Glass,和Nd:CrGsGG激光器；再生放大激光器；Cr:LiSF激光器；Er:YAG激光器；F中心激光器；Ho:YAF和Ho:YLF激光器；銅蒸氣激光器；氮激光器；光參量振蕩器，放大器和發(fā)生器；和太陽(yáng)光。
另外，盡管前文公開(kāi)內(nèi)容集中于疾病的活體治療的應(yīng)用，但必須說(shuō)明的是，在期望選擇性修飾標(biāo)記試劑或有反應(yīng)性目標(biāo)試劑的任何時(shí)候，本發(fā)明都有進(jìn)一步應(yīng)用。尤其是在對(duì)生物物質(zhì)制備或純化或者生物物質(zhì)污染的控制中，本發(fā)明的應(yīng)用都包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。例如，基于光敏試劑和目標(biāo)實(shí)體如HIV病毒之間的靶向相互作用，選擇性地處理或純化生物流體，如血液或原生質(zhì)，都是在預(yù)料之中的。這種方法能在HIV感染的治療中起治療作用，也可作為保護(hù)手段來(lái)防止HIV通過(guò)輸血感染。第二個(gè)例子是可以應(yīng)用于極純的生物制品如細(xì)胞培養(yǎng)物的制備中，其中通過(guò)目標(biāo)污染試劑的破壞來(lái)提純異源親本培養(yǎng)物。第三個(gè)例子是有可能用于選擇性激發(fā)目標(biāo)生物試劑中一種或多種特定基因序列的遺傳誘導(dǎo)生物產(chǎn)品的生產(chǎn)中。
除了各種生物學(xué)上的應(yīng)用，還需要說(shuō)明的是許多非生物學(xué)的應(yīng)用也是可能的，或者通過(guò)利用本發(fā)明可使其效率得到顯著提高，包括高純度的產(chǎn)品或者商品的生產(chǎn)，尤其是在非線性光激發(fā)的特殊性質(zhì)很重要的地方。例如，特征手性化合物，顏料，油漆，聚合物材料和其它工業(yè)或商業(yè)試劑的生產(chǎn)或加工都可以通過(guò)本發(fā)明各方面的應(yīng)用而得到改進(jìn)。特別是，獨(dú)特的選擇定則、選擇優(yōu)勢(shì)和定位激活給許多物質(zhì)生產(chǎn)或加工步驟提供了便利。事實(shí)上，這些例子說(shuō)明本發(fā)明的確構(gòu)成了一個(gè)通用的物質(zhì)加工范例，其中非線性光激發(fā)的特殊性質(zhì)被用到生物或非生物材料上以特別改進(jìn)由原材料到產(chǎn)品的選擇性轉(zhuǎn)變，而不管這種轉(zhuǎn)變是從腫瘤到壞死組織還是從一種分子試劑到另一種。
還要說(shuō)明的是，在一些特殊情況下，非線性光激發(fā)的獨(dú)特性質(zhì)會(huì)有用處，即使沒(méi)有添加特定響應(yīng)試劑至系統(tǒng)中。例如，可見(jiàn)或NIR波長(zhǎng)的非線性光輻射的定位應(yīng)用也許對(duì)定位過(guò)程的激活有用，它在很多方面都和通常用UV波長(zhǎng)直接處理達(dá)到的效果不相上下。又例如，對(duì)于表面或表面下癌癥患處的治療，也可利用可見(jiàn)的或NIR非線性激發(fā)來(lái)引起局部的壞死，這和線性UV激發(fā)可能達(dá)到的效果一樣，但能夠更有效定位。這種方法還有望延展至其它的光波段，例如，10μm的光可用來(lái)對(duì)眼睛或皮膚的病灶進(jìn)行高度定位的切除。
同樣，上述例子主要集中于對(duì)人進(jìn)行治療，而對(duì)于微生物、植物和動(dòng)物樣品的直接應(yīng)用也是很明顯的。例如，預(yù)計(jì)上述方法對(duì)家畜、育種牲畜的疾病的治療或?qū)ζ渌鼊?dòng)物的疾病的治療同樣有效。另外，估計(jì)上述方法也能作為處理方法或方式來(lái)獲得微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物的選擇性。例如，本發(fā)明各部分可以應(yīng)用于異源細(xì)胞培養(yǎng)物的純化和體外細(xì)胞功能的表達(dá)中。因此，本發(fā)明可應(yīng)用于遺傳工程、畜牧業(yè)、再生療法、克隆和許多其它領(lǐng)域。
應(yīng)理解以上描述的每一個(gè)要素，或者兩個(gè)或更多個(gè)要素一起，在不同于上述類型的其它工作或應(yīng)用中同樣可能有用。
雖然本發(fā)明作為一種用于改進(jìn)治療試劑光激活的選擇性的通用方法已被圖解和描述過(guò)了，但這并不意味著本發(fā)明僅限于已敘述的那些細(xì)節(jié)，這是因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)Ρ景l(fā)明中圖示的方法在形式和細(xì)節(jié)上及其運(yùn)作上進(jìn)行各種刪節(jié)、修改、替換和改變，而同時(shí)并不以任何方式背離本發(fā)明的精神。
沒(méi)有進(jìn)一步的分析，前述也能夠充分揭示本發(fā)明的主旨，使他人可通過(guò)利用現(xiàn)有知識(shí)，輕而易舉地將它用于各種應(yīng)用中，而不用忽略從現(xiàn)有技術(shù)的角度看還能構(gòu)成本發(fā)明普通或特定方面的基本特性的那些性質(zhì)。
后附的權(quán)利要求書(shū)中，給出了據(jù)稱是新的并期望得到專利保護(hù)的各項(xiàng)權(quán)利要求。
權(quán)利要求
1．一種處理植物或動(dòng)物組織的特定體積的方法，該方法包含以下步驟(a)用至少一種光敏分子試劑處理所述植物或動(dòng)物組織，其中該植物或動(dòng)物組織的該特定體積中保留了所述至少一種光敏分子試劑的至少一部分；和(b)用光來(lái)處理該植物或動(dòng)物組織的該特定體積，所用光應(yīng)足以激發(fā)促進(jìn)該植物或動(dòng)物組織的該特定體積中所保留的該至少一種光敏分子試劑中的至少一種分子發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)，其中該至少一種被激發(fā)的光敏分子試劑在該植物或動(dòng)物組織的該特定體積中變得有活性。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述足以促進(jìn)該至少一種光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光是一種激光。
3．按照權(quán)利要求2的方法，其中所述激光是一種脈沖激光。
4．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述足以促進(jìn)該至少一種光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光是聚焦光束。
5．按照權(quán)利要求4的方法，其中所述聚焦光束是聚焦激光。
6．按照權(quán)利要求5的方法，其中所述聚焦激光是脈沖激光。
7．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種光敏分子試劑選自以下成員補(bǔ)骨脂素，5-甲氧基補(bǔ)骨脂素(5-MOP),8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP),4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素(TMP),4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素(AMT),5-氯甲基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(HMT)，當(dāng)歸根素(異補(bǔ)骨脂素)，5-甲基當(dāng)歸根素(5-MIP),3-羧基補(bǔ)骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物(HPD)，photofrinⅡ，苯并卟啉衍生物(BPD)，原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，染料血卟啉醚(DHE)，多血卟啉酯類(PHE)，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯(PH1008)，四(3-羥基苯基)卟啉(3-THPP)，四苯基卟啉單磺酸鹽(TPPS1)，四苯基卟啉二磺酸鹽(TPPS2a)，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶基)卟啉(T4MpyP)，以及八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪(OPTP)，酞菁，四(4-叔丁基)酞菁(t4PcH2)，四(4-叔丁基)酞菁鎂(t4PcMg)，氯化鋁酞花青磺化的酞菁(CASPc)，氯化鋁酞花青酞菁四硫酸鹽(AlPcTs)，單磺化的鋁酞菁(AlSPc)，二磺化的鋁酞菁(AlS2Pc)，三磺化的鋁酞菁(AlS3Pc)，四磺化的鋁酞菁(AlS4Pc)，硅酞菁(SiPcⅣ)，鋅Ⅱ酞菁(ZnPc)，雙(二異丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(isoBOSINC)，以及鍺Ⅳ八丁氧基酞菁(GePc)，若丹明101(Rh-101)，若丹明110(Rh-110)，若丹明123(RH-123)，若丹明19(Rh-19)，若丹明560(Rh-560)，若丹明575(Rh-575)，若丹明590(Rh-590)，若丹明610(Rh-610)，若丹明640(Rh-640)，若丹明6G(Rh-6G)，若丹明700(Rh-700)，若丹明800(Rh-800)，若丹明B(Rh-B)，磺基若丹明101,磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噁嗪鎓鹽(EtNBA),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓鹽(EtNBS),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓鹽，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，葉綠素衍生物，細(xì)菌葉綠素衍生物，金屬-配基絡(luò)合物，二氯化三(2,2′-雙吡啶)釕(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2′-雙吡啶)銠(Ⅱ)(RhBP)，二氯化三(2,2′-雙吡啶)鉑(Ⅱ)(PtBPY)，脫鎂葉綠甲酯一酸a，部花青540，維生素D,5-氨基-γ-酮戊酸，photosan，二氫卟酚e6，二氫卟酚e6亞乙基二酰胺，單-L-天冬氨酰二氫卟酚e6，吩噁嗪尼羅藍(lán)衍生物，芪，芪衍生物以及4-(N-(2-羥乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4′-(6-羥基己基磺酰基)芪(APSS)。
8．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種光敏分子試劑包括至少一種生物源性光敏分子試劑，它對(duì)于植物或動(dòng)物組織的特定體積中的特定組織是特異的。
9．按照權(quán)利要求8的方法，其中所述至少一種生物源性光敏分子試劑包括選自下列成員的一個(gè)片段DNA,RNA，氨基酸，蛋白質(zhì)，抗體，配基，半抗原，糖受體或絡(luò)合劑，脂類受體或絡(luò)合劑，蛋白質(zhì)受體或絡(luò)合劑，螯合劑和被囊載體。
10．按照權(quán)利要求9的方法，其中所述至少一種生物源性光敏分子試劑還包括在受到足以促進(jìn)發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光照射下能被光激活的一個(gè)片段。
11．一種治療植物或動(dòng)物組織中癌癥的方法，它包含以下步驟(a)用至少一種光敏分子試劑處理該植物或動(dòng)物組織，其中該植物或動(dòng)物組織中的癌變部分保留了該至少一種光敏分子試劑中的至少一部分；和(b)用光處理該植物或動(dòng)物組織，這種光應(yīng)足以促進(jìn)保留于該植物或動(dòng)物組織中癌變部分內(nèi)的該至少一種光敏分子試劑中的至少一種發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)，其中所述至少一種光敏分子試劑在該植物或動(dòng)物組織的癌變部分變得有活性。
12．按照權(quán)利要求11的方法，其中所述足以促進(jìn)至少一種光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光是一種激光。
13．按照權(quán)利要求12的方法，其中所述激光是脈沖激光。
14．按照權(quán)利要求11的方法，其中所述足以促進(jìn)至少一種光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光是聚焦光束。
15．按照權(quán)利要求14的方法，其中所述聚焦光束是一種聚焦激光。
16．按照權(quán)利要求15的方法，其中所述聚焦激光是一種脈沖激光。
17．按照權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一種光敏分子試劑選自下列成員補(bǔ)骨脂素，5-甲氧基補(bǔ)骨脂素(5-MOP),8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP),4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素(TMP),4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素(AMT),5-氯甲基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(HMT)，當(dāng)歸根素(異補(bǔ)骨脂素)，5-甲基當(dāng)歸根素(5-MIP),3-羧基補(bǔ)骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物(HPD)，photofrinⅡ，苯并卟啉衍生物(BPD)，原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，染料血卟啉醚(DHE)，多血卟啉酯類(PHE)，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯(PH1008)，四(3-羥基苯基)卟啉(3-THPP)，四苯基卟啉單磺酸鹽(TPPS1)，四苯基卟啉二磺酸鹽(TPPS2a)，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶基)卟啉(T4MpyP)，以及八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪(OPTP)，酞菁，四(4-叔丁基)酞菁(t4PcH2)，四(4-叔丁基)酞菁鎂(t4PcMg)，氯化鋁酞花青磺化的酞菁(CASPc)，氯化鋁酞花青酞菁四硫酸鹽(AlPcTs)，單磺化的鋁酞菁(AlSPc)，二磺化的鋁酞菁(AlS2Pc)，三磺化的鋁酞菁(AlS3Pc)，四磺化的鋁酞菁(AlS4Pc)，硅酞菁(SiPcⅣ)，鋅Ⅱ酞菁(ZnPc)，雙(二異丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(isoBOSINC)，以及鍺Ⅳ八丁氧基酞菁(GePc)，若丹明101(Rh-101)，若丹明110(Rh-110)，若丹明123(RH-123)，若丹明19(Rh-19)，若丹明560(Rh-560)，若丹明575(Rh-575)，若丹明590(Rh-590)，若丹明610(Rh-610)，若丹明640(Rh-640)，若丹明6G(Rh-6G)，若丹明700(Rh-700)，若丹明800(Rh-800)，若丹明B(Rh-B)，磺基若丹明101，磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噁嗪鎓鹽(EtNBA),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓鹽(EtNBS),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓鹽，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，葉綠素衍生物，細(xì)菌葉綠素衍生物，金屬-配基絡(luò)合物，二氯化三(2,2′-雙吡啶)釕(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2′-雙吡啶)銠(Ⅱ)(RhBP)，二氯化三(2,2′-雙吡啶)鉑(Ⅱ)(PtBPY)，脫鎂葉綠甲酯一酸a，部花青540，維生素D,5-氨基-γ-酮戊酸，photosan，二氫卟酚e6，二氫卟酚e6亞乙基二酰胺，單-L-天冬氨酰二氫卟酚e6，吩噁嗪尼羅藍(lán)衍生物，芪，芪衍生物以及4-(N-(2-羥乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4′-(6-羥基己基磺?；?芪(APSS)。
18．按照權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一種光敏分子試劑包括對(duì)植物或動(dòng)物組織的該特定體積內(nèi)的特殊組織特異的至少一種生物源性光敏分子試劑。
19．按照權(quán)利要求18的方法，其中所述至少一種生物源性光敏分子試劑包含選自下列成員的一個(gè)片段DNA,RNA，氨基酸，蛋白質(zhì)，抗體，配基，半抗原，糖受體或絡(luò)合劑，脂類受體或絡(luò)合劑，蛋白質(zhì)受體或絡(luò)合劑，螯合劑和被囊載體。
20．按照權(quán)利要求19的方法，其中所述至少一種生物源性光敏分子試劑還包括在受到足以促進(jìn)發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光照射時(shí)能被光激活的一個(gè)片段。
21．一種用于在材料的特定體積中產(chǎn)生至少一種被光激活的分子試劑的方法，這種方法包括用足以促進(jìn)包含于該材料的該特定體積中的至少一種光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光處理該材料的該特定體積，其中所述至少一種光敏分子試劑在該材料的該特定體積中變成一種被光激活的分子試劑。
22．按照權(quán)利要求21的方法，其中所述材料選自由植物和動(dòng)物組織組成之組。
23．按照權(quán)利要求21的方法，其中所述足以促進(jìn)該光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光是激光。
24．按照權(quán)利要求23的方法，其中所述激光是脈沖激光。
25．按照權(quán)利要求21的方法，其中所述足以促進(jìn)該光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光是聚焦光束。
26．按照權(quán)利要求25的方法，其中所述聚焦光束是激光。
27．按照權(quán)利要求26的方法，其中所述激光是脈沖激光。
28．按照權(quán)利要求21的方法，其中所述材料用至少一種分子試劑進(jìn)行預(yù)處理，以便在用足以促進(jìn)所述至少一種光敏分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光處理該材料的該特定體積時(shí)，該材料會(huì)保留所述至少一種光敏分子試劑的一部分。
29．按照權(quán)利要求28的方法，其中所述至少一種光敏分子試劑選自以下成員補(bǔ)骨脂素，5-甲氧基補(bǔ)骨脂素(5-MOP),8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP),4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素(TMP),4′-氨甲基-4,5′,8-三甲基補(bǔ)骨脂素(AMT),5-氯甲基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(HMT)，當(dāng)歸根素(異補(bǔ)骨脂素)，5-甲基當(dāng)歸根素(5-MIP),3-羧基補(bǔ)骨脂素，卟啉，血卟啉衍生物(HPD)，photofrinⅡ，苯并卟啉衍生物(BPD)，原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，染料血卟啉醚(DHE)，多血卟啉酯類(PHE)，原卟啉的13,17-N,N,N-二甲基乙基乙醇胺酯(PH1008)，四(3-羥基苯基)卟啉(3-THPP)，四苯基卟啉單磺酸鹽(TPPS1)，四苯基卟啉二磺酸鹽(TPPS2a)，二血卟啉醚，meso-四苯基卟啉，meso-四(4N-甲基吡啶基)卟啉(T4MpyP)，以及八(4-叔丁基苯基)四吡嗪紫菜嗪(OPTP)，酞菁，四(4-叔丁基)酞菁(t4PcH2)，四(4-叔丁基)酞菁鎂(t4PcMg)，氯化鋁酞花青磺化的酞菁(CASPc)，氯化鋁酞花青酞菁四硫酸鹽(AlPcTs)，單磺化的鋁酞菁(AlSPc)，二磺化的鋁酞菁(AlS2Pc)，三磺化的鋁酞菁(AlS3Pc)，四磺化的鋁酞菁(AlS4Pc)，硅酞菁(SiPcⅣ)，鋅Ⅱ酞菁(ZnPc)，雙(二異丁基十八烷基甲硅烷氧基)硅2,3-萘酞菁(isoBOSINC)，以及鍺Ⅳ八丁氧基酞菁(GePc)，若丹明101(Rh-101)，若丹明110(Rh-110)，若丹明123(RH-123)，若丹明19(Rh-19)，若丹明560(Rh-560)，若丹明575(Rh-575)，若丹明590(Rh-590)，若丹明610(Rh-610)，若丹明640(Rh-640)，若丹明6G(Rh-6G)，若丹明700(Rh-700)，若丹明800(Rh-800)，若丹明B(Rh-B)，磺基若丹明101，磺基若丹明640，磺基若丹明B，香豆素1，香豆素2，香豆素4，香豆素6，香豆素6H，香豆素7，香豆素30，香豆素47，香豆素102，香豆素106，香豆素120，香豆素151，香豆素152，香豆素152A，香豆素153，香豆素311，香豆素307，香豆素314，香豆素334，香豆素337，香豆素343，香豆素440，香豆素450，香豆素456，香豆素460，香豆素461，香豆素466，香豆素478，香豆素480，香豆素481，香豆素485，香豆素490，香豆素500，香豆素503，香豆素504，香豆素510，香豆素515，香豆素519，香豆素521，香豆素522，香豆素523，香豆素535，香豆素540，香豆素540A，香豆素548,5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]-吩噁嗪鎓鹽(EtNBA),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩噻嗪鎓鹽(EtNBS),5-乙氨基-9-二乙氨基苯并[a]吩硒嗪鎓鹽，氯丙嗪，氯丙嗪衍生物，葉綠素衍生物，細(xì)菌葉綠素衍生物，金屬-配基絡(luò)合物，二氯化三(2,2′-雙吡啶)釕(Ⅱ)(RuBPY)，二氯化三(2,2′-雙吡啶)銠(Ⅱ)(RhBPY)，二氯化三(2,2′-雙吡啶)鉑(Ⅱ)(PtBPY)，脫鎂葉綠甲酯一酸a,部花青540，維生素D,5-氨基-γ-酮戊酸，photosan，二氫卟酚e6，二氫卟酚e6亞乙基二酰胺，單-L-天冬氨酰二氫卟酚e6，吩噁嗪尼羅藍(lán)衍生物，芪，芪衍生物以及4-(N-(2-羥乙基)-N-甲基)-氨基苯基)-4′-(6-羥基己基磺?；?芪(APSS)。
30．按照權(quán)利要求28的方法，其中所述至少一種光敏分子試劑包括至少一種生物源性的對(duì)該材料的該特定體積中的一種特定物質(zhì)特異的光敏分子試劑。
31．按照權(quán)利要求30的方法，其中所述至少一種生物源性光敏分子試劑包括選自下列成員的一個(gè)片段DNA,RNA，氨基酸，蛋白質(zhì)，抗體，配基，半抗原，糖受體或絡(luò)合劑，脂類受體或絡(luò)合劑，蛋白質(zhì)受體或絡(luò)合劑，螯合劑和被囊載體。
32．按照權(quán)利要求31的方法，其中所述至少一種生物源性光敏分子試劑還包括在受到足以促進(jìn)發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光照射時(shí)能被光激活的一個(gè)片段。
33．一種用于在一種材料的一個(gè)特定體積中產(chǎn)生至少一種被光激活的分子試劑的方法，這種方法包括用足以促進(jìn)包含于該材料的該特定體積中的至少一種光敏分子試劑發(fā)生光激發(fā)的光處理該材料的該特定體積，其中所述至少一種光敏分子試劑在該材料的該特定體積中變成一種被光激活的分子試劑。
34．按照權(quán)利要求33的方法，其中所述至少一種光敏分子試劑包括至少一種生物源性的對(duì)材料的該特定體積中的一種特定物質(zhì)特異的光敏分子試劑。
35．按照權(quán)利要求34的方法，其中所述至少一種生物源性光敏分子試劑包含選自下列成員的一個(gè)片段DNA,RNA，氨基酸，蛋白質(zhì)，抗體，配體，半抗原，糖受體或絡(luò)合劑，脂類受體或絡(luò)合劑，蛋白質(zhì)受體或絡(luò)合劑，螯合劑和被囊載體。
36．按照權(quán)利要求35的方法，其中所述至少一種生物源性光敏分子試劑還包括在受到足以促進(jìn)發(fā)生光激發(fā)的光照射時(shí)能被光激活的一個(gè)片段。
37．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述處理該植物或動(dòng)物組織的該特定體積的步驟包括將一束光聚焦在一定焦距范圍內(nèi)，以使光束的焦平面介于組織表面和一個(gè)基本上在組織表面之外的點(diǎn)之間的一個(gè)位置，由此所述處理植物或動(dòng)物組織的特定體積的步驟也能夠擴(kuò)展至深入到組織的深部。
38．權(quán)利要求37的方法，它還包括在光束存在時(shí)改變組織內(nèi)的焦距位置，以便沿著組織表面和基本上位于組織表面之外的位置之間的諸位置光激活該至少一種光敏分子試劑。
39．按照權(quán)利要求38的方法，其中所述第二個(gè)處理步驟包括控制激光器來(lái)產(chǎn)生脈沖重復(fù)頻率大約在75兆赫茲以上，脈沖寬度是次納秒的輸出脈沖。
40．按照權(quán)利要求39的方法，其中所述激光器產(chǎn)生的脈沖能量大約是20納焦耳。
41．按照利要求39的方法，它包括控制激光器來(lái)產(chǎn)生近紅外光。
42．按照權(quán)利要求41的方法，其中所述光激活包括對(duì)該至少一種光敏分子試劑進(jìn)行同時(shí)雙光子激發(fā)。
43．處理包含至少一種光敏分子試劑的植物或動(dòng)物組織的特定體積的設(shè)備，該設(shè)備包括準(zhǔn)直光束源，所述光具有基本上能有效穿透組織的頻率，能被用來(lái)促進(jìn)包含在該組織中的該分子試劑發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)(two-photonexcitation,TPE)；和用于將準(zhǔn)直光聚焦于一定焦距范圍內(nèi)的聚焦儀，該聚焦范圍是從該組織的表面到基本上遠(yuǎn)離其表面的深度，所述光源和聚焦儀相配合以促進(jìn)該分子試劑發(fā)生雙光子激發(fā)；其中焦點(diǎn)或焦平面能根據(jù)該光源進(jìn)行調(diào)整。
44．按照權(quán)利要求43的設(shè)備，其中所述光源產(chǎn)生脈沖重復(fù)頻率大約在75兆赫茲以上、脈沖寬度是次納秒的脈沖輸出。
45．按照權(quán)利要求44的設(shè)備，其中所述光源產(chǎn)生近紅外光。
46．按照權(quán)利要求45的設(shè)備，其中所述光源產(chǎn)生的脈沖能量在20納焦耳左右。
47．按照權(quán)利要求45的設(shè)備，其中所述光源包含一種激光器。
48．一種醫(yī)治特定體積的組織的方法，該方法包含以下步驟向組織中導(dǎo)入一種光敏分子試劑，所述試劑能被組織吸收和在組織中聚集，對(duì)于雙光子激發(fā)(TPE)敏感，當(dāng)它在被關(guān)注的特定組織中聚集之后，將光投射到組織中我們所感興趣的特定區(qū)域，包括基本上位于組織表面之下的區(qū)域，選用光的頻率和能量應(yīng)使它能夠穿透該組織，并且基本上僅在一個(gè)共焦區(qū)促進(jìn)雙光子激發(fā)；在所述組織的一定深度范圍內(nèi)控制共焦區(qū)的位置；和利用TPE，在該組織的所述深度范圍內(nèi)光激活該試劑，由此在共焦區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生被光激活的試劑。
49．按照權(quán)利要求48的方法，其中所述投射光的步驟包括利用一個(gè)在短脈沖寬度、高脈沖重復(fù)頻率上運(yùn)行的脈沖激光器產(chǎn)生近紅外光，和將該激光聚焦于該組織內(nèi)。
50．按照權(quán)利要求48的方法，其中所述控制位置的步驟包括改變共焦區(qū)相對(duì)于受檢組織的位置，或者改變受檢組織相對(duì)于一個(gè)固定的共聚區(qū)的位置。
51．實(shí)施光促醫(yī)療的設(shè)備，包括用于將受限光投射到欲治療的深部組織的表面或內(nèi)部的光源設(shè)備，選用的這種光在頻率和能量上應(yīng)能夠穿透至組織表面下，并且能夠基本上只在共焦區(qū)促進(jìn)發(fā)生TPE；和用于在待治療組織的一定深度范圍內(nèi)改變光的共焦區(qū)位置的設(shè)備，以便在應(yīng)用雙光子激發(fā)(TPE)時(shí)組織內(nèi)的分子試劑變得已被光激活。
52．按照權(quán)利要求51的設(shè)備其中所述光源設(shè)備包括產(chǎn)生準(zhǔn)直光束的設(shè)備；和其中所述光源設(shè)備包括將準(zhǔn)直光束聚焦于一個(gè)位于組織表面下的某個(gè)點(diǎn)的共焦區(qū)上的聚焦設(shè)備。
53．按照權(quán)利要求52的設(shè)備，其中用于產(chǎn)生準(zhǔn)直光束的設(shè)備包括在近紅外光譜內(nèi)運(yùn)作的脈沖激光器。
54．一種治療植物或動(dòng)物組織的特定體積的方法，該方法包括以下步驟(a)用至少一種光敏分子試劑處理所述植物或動(dòng)物組織，其中該植物或動(dòng)物組織的該特定體積中保留了至少一種光敏分子試劑中的至少一部分；和(b)用光處理該植物或動(dòng)物組織的該特定體積以促進(jìn)該植物或動(dòng)物組織的該特定體積中所保留的至少一種光敏分子試劑中的至少一種發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)，其中所述至少一種光敏分子試劑被激發(fā)至一種不穩(wěn)定的虛擬態(tài)，并且該至少一種被激發(fā)的光敏分子試劑在該植物或動(dòng)物組織的該特定體積轉(zhuǎn)變?yōu)楣饷粜缘摹?br> 55．按照權(quán)利要求54的方法，其中所述不穩(wěn)定的虛擬態(tài)低于一種可用更高頻輻射達(dá)到的狀態(tài)，這種輻射會(huì)破壞介于光源和該特定體積之間的組織。
56．一種治療包含至少一種光敏分子試劑的植物或動(dòng)物組織的特定體積的方法，該方法包括用光處理該特定體積以促進(jìn)所述至少一種分子試劑中的至少一種發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)，從而使至少一種被激發(fā)的分子試劑在該特定體積中的可控制的位置上變?yōu)橐驯还饧せ睢?br> 57．按照權(quán)利要求56的方法，其中所述至少一種被激發(fā)的分子試劑在所述特定體積中一個(gè)基本上位于組織表面之外的可控制的位置上變得已被光激活。
58．按照權(quán)利要求57的方法，它還包括在光束存在時(shí)改變組織內(nèi)所述光的焦距位置，由此光激活位于所述組織表面和基本上在所述組織表面之外的位置之間的可控制位置處的至少一種分子試劑。
59．按照權(quán)利要求56的方法，其中所述處理步驟包括將激光投射到所述特定體積中。
60．按照權(quán)利要求59的方法，其中所述處理步驟包括將脈沖激光投射到所述特定體積中。
61．按照權(quán)利要求60的方法，其中所述激光被脈沖調(diào)制以產(chǎn)生次納秒寬度的脈沖。
62．按照權(quán)利要求60的方法，其中所述激光產(chǎn)生頻率為大約1千赫～10千兆赫的脈沖。
63．按照權(quán)利要求62的方法，其中所述激光產(chǎn)生頻率在大約75兆赫以上的脈沖。
64．按照權(quán)利要求60的方法，其中所述脈沖激光的能量為10皮焦耳～50毫焦耳。
65．按照權(quán)利要求64的方法，其中所述激光脈沖的能量大約為20納焦耳。
67．按照權(quán)利要求56的方法，它包括運(yùn)行激光源來(lái)產(chǎn)生近紅外光。
68．一種治療患癌植物或動(dòng)物組織的特定體積的方法，該組織包含至少一種光敏分子試劑，該方法包括用光處理所述特定體積以促進(jìn)所述至少一種分子試劑中的至少一種發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)，以便所述至少一種被激發(fā)的分子試劑在該特定體積中一個(gè)可控制位置上變得已被光激活。
69．按照權(quán)利要求68的方法，其中所述至少一種被激發(fā)的分子試劑在所述特定體積中基本上位于組織表面之外的一個(gè)可控制位置變得已被光激活。
70．按照權(quán)利要求68的方法，它還包括在所述光存在時(shí)改變?cè)摴庠谠摻M織內(nèi)的焦距位置，以便沿著該組織表面和基本上位于該組織表面之外的一個(gè)位置之間的可控制位置上光激活所述至少一種分子試劑。
71．按照權(quán)利要求68的方法，其中所述處理步驟包括將激光投射到所述特定體積中。
72．按照權(quán)利要求71的方法，其中所述處理步驟包括將一脈沖激光投射到所述特定體積中。
73．按照權(quán)利要求72的方法，其中所述激光被脈沖調(diào)制以產(chǎn)生次納秒寬度的脈沖。
74．按照權(quán)利要求72的方法，其中所述激光產(chǎn)生頻率為大約1千赫～10千兆赫的脈沖。
75．按照權(quán)利要求74的方法，其中所述激光產(chǎn)生頻率在大約75兆赫以上的脈沖。
76．按照權(quán)利要求72的方法，其中所述激光脈沖的能量為大約10皮焦耳～50毫焦耳。
77．按照權(quán)利要求76的方法，其中所述激光脈沖的能量大約為20納焦耳。
78．按照權(quán)利要求68的方法，其中包括運(yùn)行光源以產(chǎn)生近紅外光。
79．一種用于醫(yī)治包含至少一種光敏分子試劑的組織的一個(gè)特定體積的方法，該方法包括以下步驟將光投射到該組織中感興趣的特定區(qū)域，包括基本上位于組織表面之下的區(qū)域，選用的該光線能夠穿透該組織，并且能夠基本上僅在一個(gè)共焦區(qū)內(nèi)促進(jìn)發(fā)生雙光子激發(fā)(TPE)；將該共焦區(qū)的位置控制在所述組織內(nèi)的一定深度范圍內(nèi)；和利用TPE，在該組織的所述深度范圍內(nèi)光激活所述至少一種分子試劑中的至少一種，由此基本上只在共焦區(qū)內(nèi)產(chǎn)生至少一種被光激活的試劑。
80．按照權(quán)利要求79的方法，其中所述投射步驟包括將激光投射到所述特定體積中。
81．按照權(quán)利要求80的方法，其中所述投射步驟包括將脈沖激光投射到所述特定體積中。
82．按照權(quán)利要求81的方法，其中運(yùn)行所述激光以產(chǎn)生次納秒寬度的脈沖。
83．按照權(quán)利要求81的方法，其中所述激光產(chǎn)生頻率為大約1千赫～10千兆赫的脈沖。
84．按照權(quán)利要求83的方法，其中所述激光產(chǎn)生頻率在大約75兆赫以上的脈沖。
85．按照權(quán)利要求81的方法，其中所述激光脈沖的能量為大約10皮焦耳～50毫焦耳。
86．按照權(quán)利要求85的方法，其中所述激光脈沖的能量大約為20納焦耳。
87．按照權(quán)利要求72的方法，它包括運(yùn)行激光源以產(chǎn)生近紅外光。
88．按照權(quán)利要求79的方法，其中所述方法在所述共焦區(qū)內(nèi)引發(fā)同時(shí)雙光子激發(fā)(TPE)。
89．按照權(quán)利要求79的方法，其中所述光激活步驟包括利用一個(gè)第一種光子的能量來(lái)激發(fā)該至少一種分子試劑中的至少一種至介于基態(tài)和激發(fā)電子態(tài)之間的不穩(wěn)定的虛擬態(tài)，再利用一個(gè)第二種光子的能量在該試劑躍遷到一個(gè)基本不同的激發(fā)態(tài)之前將其激發(fā)至激發(fā)電子態(tài)。
90．一種處理植物或動(dòng)物組織的特定體積的方法，該組織在該特定體積中包含至少一種光敏分子試劑，該方法包括用光照射組織的該特定體積以引發(fā)所述至少一種光敏分子試劑中的至少一種發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)(TPE)，其中所述位于雙光子激發(fā)一個(gè)位點(diǎn)的所述至少一種光敏分子試劑被激發(fā)至不穩(wěn)定的虛擬態(tài)，并且其中所述至少一種被激發(fā)的光敏分子試劑在該特定體積中已被光激活。
91．按照權(quán)利要求90的方法，它包括對(duì)基本上位于組織表面之下的植物或動(dòng)物組織的特定體積進(jìn)行處理。
92．按照權(quán)利要求91的方法，其中所述不穩(wěn)定的虛擬態(tài)基本上僅發(fā)生在所述特定體積中，盡管光通過(guò)介于所述表面和所述特定體積之間的其它組織部分。
93．按照權(quán)利要求92的方法，它還包括在該組織表面下的一定深度范圍內(nèi)改變發(fā)生雙光子激發(fā)的位置。
94．按照權(quán)利要求90的方法，其中所述光照射步驟包括將激光束投射到該特定體積中。
95．按照權(quán)利要求94的方法，其中所述光照射步驟包括將具有次納秒脈沖的脈沖激光束投射到該特定體積中。
96．按照權(quán)利要求95的方法，其中由所述脈沖激光束提供的單個(gè)光子所具備的能量不足以將該分子試劑直接從基態(tài)激發(fā)至激發(fā)電子態(tài)。
全文摘要
一種處理植物或動(dòng)物組織的特定體積的方法,包括以下步驟:用至少一種光敏分子試劑處理所述植物或動(dòng)物組織,其中該植物或動(dòng)物組織的該特定體積中保留了所述至少一種光敏分子試劑中的至少一部分,然后用足以促進(jìn)保留于該植物或動(dòng)物組織的該特定體積中的所述至少一種光敏分子試劑中的至少一種發(fā)生同時(shí)雙光子激發(fā)的光處理該植物或動(dòng)物組織的該特定體積,其中所述至少一種光敏分子試劑在該植物或動(dòng)物組織的該特定體積中變得有活性。還公開(kāi)了一種治療植物或動(dòng)物組織內(nèi)癌癥的方法,以及在材料的特定體積中產(chǎn)生至少一種被光激活的分子試劑的方法。
文檔編號(hào)A61B17/00GK1226148SQ97196827
公開(kāi)日1999年8月18日 申請(qǐng)日期1997年10月28日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月30日
發(fā)明者W·G·費(fèi)歇爾, E·A·沃徹特, H·C·德斯 申請(qǐng)人:福托金公司