專利名稱：G－β－γ調(diào)控的磷脂酰肌醇－3'激酶的制作方法
1．導(dǎo)言本發(fā)明涉及新型的G-蛋白調(diào)控的磷酸肌醇3OH-激酶，該酶從造血譜系細(xì)胞中分離，其參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，本發(fā)明還涉及這些新型的酶在疾病的治療和診斷中的應(yīng)用。
2．發(fā)明背景磷酸肌醇3OH-激酶(PI3K)是一個酶類大家族，可以3-磷酸化至少一種胞內(nèi)磷酸肌醇。(Whitman等，1988，自然(Nature)332:644-646；Ayger等，1989，細(xì)胞(Cell)57:167-175)3-磷酸化的磷酸肌醇存在于所有高等真核細(xì)胞中。越來越多的證據(jù)表示出PI3K和此酶的一個脂類產(chǎn)物，磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(以下簡稱“PtdIns(3,4,5)P3”)，是新型的重要的細(xì)胞信號傳導(dǎo)中第二信使系統(tǒng)的一部分。這一新型的基于PtdIns(3,4,5)P3的信號系統(tǒng)的成分看來獨(dú)立于已表征的基于肌醇磷脂的信號途徑，在后者中磷酸肌醇酶C(phosphoinositidase C)(PIC)水解PtdIns(4,5)P2釋放結(jié)構(gòu)獨(dú)特的第二信使肌醇(1,4,5)-三磷酸(Ins(1,4,5)P3)和二酰甘油。
所選的胞外激動劑和生長因子將刺激胞內(nèi)PI3K的活性并導(dǎo)致快速且短暫的胞內(nèi)PtdIns(3,4,5)P3的累積。令人吃驚的是，多種不同類型的細(xì)胞表面受體的刺激，包括受體酪氨酸激酶、與src家族非受體性酪氨酸激酶結(jié)合的受體、細(xì)胞因子類生長因子及G蛋白偶聯(lián)受體，都將激活PI3K家族的成員(綜述見Stephens等，1993,Biochemica et Biophysica Acta,1179:27-75)。例如，酪氨酸激酶受體，其激活后導(dǎo)致PtdIns(3,4,5)P3的累積增加的有PDGF受體、EGF受體、FGF受體家族的成員、CSF-1受體、胰島素受體、IGF-1受體和NGF受體。刺激PtdIns(3,4,5)P3的累積增加的與src家族非受體性酪氨酸激酶結(jié)合的受體有Ⅱ-2受體、Ⅱ-3受體、mIgM受體、CD4受體、CD2受體和CD3/T細(xì)胞受體。另外，細(xì)胞因子Ⅱ-4受體和與G蛋白結(jié)合的凝血酶受體、ATP受體和fMLP受體，它們均刺激PI3K的活性，隨后導(dǎo)致PtdIns(3,4,5)P3的累積。這樣看來，PtdIns(3,4,5)P3在非常不同的信號途徑中作為第二信使。
PI3K的活性和PtdIns(3,4,5)P3的產(chǎn)生是產(chǎn)生這些多種多樣的受體的信號傳導(dǎo)的一個生理相關(guān)途徑這一命題，特別是從以下兩組不同的實驗證據(jù)中得到了支持一個實驗是真菌代謝物抑制PI3K活性，一個是觀察直接的蛋白連接。渥曼青霉素(一種真菌代謝物)通過以共價方式連接在PI3K的催化結(jié)構(gòu)域而不可逆地抑制其活性。渥曼青霉素對PI3K活性的抑制消除了隨后的因胞外因子產(chǎn)生的細(xì)胞反應(yīng)。例如，通過刺激PI3K并合成PtdIns(3,4,5)P3，嗜中性粒細(xì)胞應(yīng)答趨化因子fMet-Leu-Phe(fMLP)。PtdIns(3,4,5)P3的合成與在嗜中性粒細(xì)胞破壞入侵微生物過程中的呼吸爆發(fā)(respiratory burst)的激活相關(guān)。用渥曼青霉素處理嗜中性粒細(xì)胞避免了fMLP誘導(dǎo)的呼吸爆發(fā)反應(yīng)(Thelen等，1994,PNAS,USA 91:4960-4964)。確實，這些渥曼青霉素實驗以及其它實驗證據(jù)表明，在造血譜系細(xì)胞中，特別是嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及其它類型白細(xì)胞中PI3K的活性參與很多與急性和慢性炎癥相關(guān)的非記憶性免疫反應(yīng)。
這些PI3K酶與一些活化的受體酪氨酸激酶直接相互作用，并可被共同提純。純化后發(fā)現(xiàn)，與受體酪氨酸激酶相結(jié)合的PI3K包含一些170-200kD的異源二聚體(Otsu等，1991，細(xì)胞65:91-104,Pons等，1994，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)15:4453-4465,Inukai等，1996，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)271:5317-5320)，二聚體中包含一個催化亞基和一個銜接(或調(diào)控)亞基。
催化亞基的兩個不同的同源物，p110α和p110β，已描述并克隆?？膳c渥曼青霉素不可逆結(jié)合的該催化亞基，與一個高度相關(guān)的調(diào)控亞基小家族，p55α、p55PIK、p85α和p85β中的一個或其它成員緊密地結(jié)合，形成上述的170-200kD的異源二聚體。已知的這些調(diào)控亞基中包含很多蛋白質(zhì)與蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，包括兩個SH2結(jié)構(gòu)域(Cantley等，1991，細(xì)胞64:281-302)。
SH2結(jié)構(gòu)域的存在認(rèn)為負(fù)責(zé)P13K異源二聚體與受體酪氨酸激酶結(jié)合并刺激受體酪氨酸激酶的活化。這些活化的受體在局部共有序列中的關(guān)鍵的酪氨酸殘基上被在55-87kD的PI3K銜接亞基中發(fā)現(xiàn)的SH2結(jié)構(gòu)域磷酸化(Songyang等，1993，細(xì)胞72:767-778)。一旦PI3K異源二聚體結(jié)合，就直接激活P13K催化亞基，(盡管這一效應(yīng)在體外相對較小，Carpenter等，1993，生物化學(xué)雜志268:9478-9483，Backer等，1992,EMBO J.11:3469-3479)，并將胞質(zhì)PI3K轉(zhuǎn)移為它的磷脂底物的來源。這些因子的共同作用導(dǎo)致PtdIns(3,4,5)P3的大量涌現(xiàn)。很明顯，這些PI3K的同工型(p100α/p110β/p55α、p55PIK)看來結(jié)構(gòu)上適合在受體調(diào)控的酪氨酸激酶下游作為所用的信號傳導(dǎo)者，很象τ家族的PI-PLC受由體敏感的酪氨酸激酶調(diào)控的方式(Lee和Rhee,1995,Current Biol.7:193-189)。
利用異源三亞基聚合體GTP酶傳導(dǎo)其信號(例如，fMLP、PAF、ATP和凝血酶)的細(xì)胞表面受體的激活可導(dǎo)致PtdIns(3,4,5)P3的產(chǎn)生，但是PI3K的p110/p85亞家族看來并不參與這樣的PtdIns(3,4,5)P3的產(chǎn)生。這些類型的細(xì)胞表面受體已在造血源細(xì)胞(hematopoietic origin)中被描述，其活性參與了免疫系統(tǒng)的炎性反應(yīng)。近來的證據(jù)表示，色譜形不同的另一型渥曼青霉素敏感型PI3K存在于U937細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中，具有相近的相對分子量約220kD(Stephens等，1994，細(xì)胞77:83-93)。這種PI3K活性可以被Gβγ亞基，而不是Gα-GTP亞基特異性激活。一種相似的PI3K活性也已在一種骨肉瘤細(xì)胞系中描述(Morris等，1995，分子藥物(Mol.Pharm.)48:532-539)。血小板也包含Gβγ敏感型PI3K，但是還不清楚它是否是一個p85/p110PI3K家族成員(Thomason等，1994，生物化學(xué)雜志269:16525-16528)。似乎這一性質(zhì)知之甚少的Gβγ敏感型PI3K在對激動劑如ATP、fMLP等的應(yīng)答中很可能負(fù)責(zé)PtdIns(3,4,5)P3的產(chǎn)生。
Stoyanov等(1995)最近發(fā)表從人骨髓cDNA文庫中克隆并表達(dá)渥曼青霉素敏感的PtdIns(4,5)P2選擇性PI3K，稱為p110γ。p110γ以PCR的方法擴(kuò)增，其引物的設(shè)計是以潛在的PI3K的以及PtdIns4激酶的催化中心為靶位。它明顯區(qū)別于p110α和p110β，因為，比如說，缺少一個與p85銜接家族成員結(jié)合的氨基端結(jié)合結(jié)構(gòu)域?；趐110γ在體外對Gα-GTP和Gβγ亞基的敏感性和在骨髓來源的細(xì)胞中的表達(dá)，推測它在結(jié)合異源三聚體的GTP酶的受體的下游具有PI3K活性。然而，這一假說留下了幾個未解決的涉及更早的生物化學(xué)證據(jù)的問題，該證據(jù)指出，應(yīng)答Gβγ的PI3K不受Gα-GTP亞基刺激，并具有大得多的約220kD的分子量。
認(rèn)為Gβγ亞基對p110γ的作用是通過一種推定的NH2端血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源(PH)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的。然而，隨著對越來越多的Gβγ調(diào)控的效應(yīng)物的描述，很多證據(jù)表示PH結(jié)構(gòu)域并不代表被廣泛應(yīng)用的Gβγ結(jié)合結(jié)構(gòu)域。近來的工作，即，利用僅存在于被Gβγ活化的腺苷酸環(huán)化酶(AC2和AC4)中的結(jié)構(gòu)域的序列的一組相對小的肽，應(yīng)用這些肽特異性阻斷幾個效應(yīng)物受Gβγ的激活或抑制，提示可能會有證據(jù)確證Gβγ亞基包含一個廣泛應(yīng)用的效應(yīng)物活化結(jié)構(gòu)域。另外，與這一效應(yīng)物活化結(jié)構(gòu)域相互作用的不同效應(yīng)物上的區(qū)域顯示出很大的序列相似性。接下來，作為這些關(guān)于肽的研究重點(diǎn)的AC2上的結(jié)構(gòu)域中的一個基序(Gln-X-X-Glu-Arg)，在鉀離子通道和β-ARK上的一些區(qū)域出現(xiàn)，而這些區(qū)域已經(jīng)涉及Gβγ亞基的調(diào)控(Chen等，1995，科學(xué)(Science)268:1166-1169)。然而，這一基序并不在所有的已知由Gβγ亞基調(diào)控的蛋白中重現(xiàn)，所以迄今為止依靠序列分析還不能預(yù)測是否一種蛋白質(zhì)將受Gβγ亞基的調(diào)控。
PI3K活性由通過與G蛋白結(jié)合的受體傳導(dǎo)其信號的細(xì)胞激動劑激活，這一機(jī)理仍缺乏鑒定。需要指出的是絕大多數(shù)激活參與炎性反應(yīng)的嗜中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的激動劑將更傾向于結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體，而不是受體酪氨酸激酶。這樣，PI3K應(yīng)答這些類型的趨化因子而受調(diào)控的機(jī)理看來非常不同于依靠生長因子的通過酪氨酸激酶傳導(dǎo)信號的調(diào)控。本發(fā)明依靠鑒定、純化以及新型的特異類型的由三聚體G蛋白的βγ亞基激活的PI3K的克隆來解決這一問題。
3．發(fā)明概述本發(fā)明涉及編碼受三聚體G蛋白調(diào)控的PI3K的核苷酸的發(fā)現(xiàn)、鑒定、純化和克隆，PI3K是一種新型的蛋白，在與G蛋白結(jié)合的受體的激活下可產(chǎn)生第二信使PtdIns(3,4,5)P3的累積。這一新型的G蛋白調(diào)控的PI3K包含一個催化亞基p120，和一個調(diào)控亞基p101。p120催化亞基與PI3K的催化亞基p110α、p110β和p110γ具有部分氨基酸序列同源性。另一方面，p101是一個全新的蛋白質(zhì)，與其它以前的可獲得的序列沒有可鑒定的同源性。在不存在p101調(diào)控亞基的情況下，活化的G蛋白亞基誘導(dǎo)一個依靠p120催化亞基的溫和的催化活性的激活。然而，在p101亞基存在時，PI3K催化亞基的活性借助活化的G蛋白激活提高100倍以上。
編碼豬的p101和p120以及人的p101和p120的cDNA已經(jīng)被克隆并測序，并在此描述。豬的p101和p120cDNA分別編碼約877個氨基酸和約1102個氨基酸的蛋白質(zhì)(圖2和圖4)，而人的p101和p120的cDNA分別編碼約880個氨基酸和約1102個氨基酸的蛋白質(zhì)(

圖11和圖13)。盡管p120蛋白的氨基酸序列與其它那些已知的PI3K催化亞基同源，但在此描述的p120cDNA與編碼已知的PI3K催化亞基的cDNA有區(qū)別，特別是在，例如，羧基端(氨基酸殘基1075至1102)。
p101轉(zhuǎn)錄物主要存在于造血譜系的細(xì)胞中。p120以及其它PI3K催化亞基蛋白，看來有一個非常廣泛的組織和細(xì)胞類型分布。值得注意的是，三聚體G蛋白敏感的PI3K的活性僅存在于有限數(shù)量的造血譜系細(xì)胞中(例如，嗜中性粒細(xì)胞、血小板等)。這樣看來，應(yīng)答與三聚體G蛋白結(jié)合的受體刺激激活PI3K酶的能力主要取決于p101亞基的存在。
本發(fā)明包含下列核苷酸、表達(dá)該核苷酸的宿主細(xì)胞和該核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物(a)編碼哺乳動物p101和p120蛋白的核苷酸，包括豬p101和p120以及人p101和p120，以及p101和p120基因產(chǎn)物，包括豬和人的基因產(chǎn)物；(b)編碼與其功能結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的p101和p120的部分的核苷酸，以及如下核苷酸序列定義的多肽產(chǎn)物，包括但不限于編碼，例如，p101Gβγ相互作用結(jié)構(gòu)域，或催化亞基結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或來自豬p101的從約1延伸至160、80-120、161至263、264至414、415至565、566至706、707-832和/或833至877，或來自人p101的從約1延伸至160、80-120、161至263、264至416、417至567、568至709、710-835和/或836至880的p101核苷酸，和編碼p120膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域、或調(diào)控亞基結(jié)構(gòu)域、或從約173至302和310至315的氨基酸殘基的p120核苷酸；(c)編碼p101和p120突變體的核苷酸(其中，結(jié)構(gòu)域之一的所有或部分序列缺失或改變)，以及如下核苷酸序列定義的多肽產(chǎn)物，包括，但不局限于p101的突變體(其中編碼G蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，或催化亞基結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或從氨基酸殘基約1至160、80-120、161至263、264至414、415至565、566至706、707-832和/或833至877的核苷酸缺失)，和p120突變體(其中編碼膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或調(diào)控亞基結(jié)構(gòu)域，或從約173至302和310至315的氨基酸殘基的核苷酸缺失)；(d)編碼融合蛋白，包含p101蛋白或其結(jié)構(gòu)域之一(即，Gβγ相互作用結(jié)構(gòu)域，或催化亞基結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或從約1至160、80-120、161至263、264至414、415至565、566至706、707-832和/或833至877氨基酸殘基的所描述的結(jié)構(gòu)域)，或與另一多肽融合的p120蛋白或其結(jié)構(gòu)域之一(即，膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或調(diào)控亞基結(jié)構(gòu)域，或從約173至302和310至315的氨基酸殘基)的核苷酸。
本發(fā)明還包括G蛋白調(diào)控的PI3K的激動劑和拮抗劑，包括小分子、大分子、與天然p101蛋白競爭的p101蛋白突變體和抗體，以及可用于抑制p101基因表達(dá)(如，反義和核酶分子，和基因或調(diào)控序列替代構(gòu)建體)或增強(qiáng)p101基因表達(dá)(如，置于強(qiáng)啟動子系統(tǒng)控制下的p101基因的表達(dá)構(gòu)建體)的核苷酸序列，以及表達(dá)一種p101轉(zhuǎn)基因或不表達(dá)p101的“敲除”的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和動物。
另外，本發(fā)明還包含一些用于診斷性評價、分類和預(yù)測免疫系統(tǒng)疾病(包括炎癥)以及用于鑒定傾向于這些情況的被試驗者的方法和組合物。例如，本發(fā)明中的p101核酸分子可被用來作為診斷性雜交探針或作為用來對p101基因中的基因突變、等位變異和調(diào)控缺陷進(jìn)行鑒定的PCR分析的引物。本發(fā)明還提供用于在實際中應(yīng)用這些方法的診斷試劑盒。
此外，本發(fā)明還涉及一些方法，這些方法是關(guān)于p101基因和/或p120基因的產(chǎn)物在用于鑒定某些調(diào)節(jié)G蛋白調(diào)控的PI3K基因的表達(dá)和/或p101基因和/或p120基因產(chǎn)物的活性(即作為激動劑和拮抗劑)的用途。這樣的化合物可以用作控制免疫系統(tǒng)紊亂的試劑和，特別是，用作治療炎性紊亂例如關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺炎、哮喘、過敏、再灌注損傷、動脈粥狀硬化、阿爾茨海默病和癌癥的治療性試劑。
更進(jìn)一步，本發(fā)明包含一些用于治療炎性紊亂例如關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺炎、哮喘、過敏癥、再灌注損傷、動脈粥狀硬化、阿爾茨海默病和癌癥的方法和組合物。這些方法和組合物可以調(diào)節(jié)p101基因表達(dá)的水平和/或p101或p120基因產(chǎn)物活性的水平。
本發(fā)明部分地基于一個令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即在分離出來的嗜中性粒細(xì)胞中G蛋白刺激的PI3K活性的發(fā)現(xiàn)；基于包含一個p101亞基和一個p120亞基的該活性物質(zhì)即異源二聚體PI3K蛋白的純化和表征；基于從豬嗜中性粒細(xì)胞mRNA、人單核細(xì)胞mRNA和人白細(xì)胞mRNA制備的文庫中p101cDNA的鑒定和克??；基于從豬嗜中性粒細(xì)胞mRNA和人白細(xì)胞mRNA制備的文庫中p120cDNA的鑒定和克??；基于新型序列的表征；以及基于在昆蟲細(xì)胞、U937細(xì)胞和Cos-7細(xì)胞中的分離的重組表達(dá)的p101和p120蛋白的研究。3.1定義在此應(yīng)用的下列條目，無論用單數(shù)還是復(fù)數(shù)，均含有下面所示的含義G蛋白調(diào)控的PI3K指一種PI3K酶，其活性由活化的三聚體G蛋白(如Gβγ亞基和/或Gα-GTP亞基)刺激。
p101指G蛋白調(diào)控的PI3K的調(diào)控亞基，也稱為銜接亞基。p101包括與p101同源或結(jié)合于p120并在三聚體G蛋白的激活下刺激PI3K催化活性的分子。具有N-末端Glu標(biāo)記(特別是MEEEEFMPMPMEF)的p101融合蛋白在本文稱為(EE)101融合蛋白，而具有N-末端myc表位標(biāo)記的p101融合蛋白在本文稱為myc101融合蛋白。
p101核苷酸或編碼序列指編碼p101調(diào)控亞基蛋白、p101蛋白的多肽或肽片段或p101融合蛋白的核苷酸序列。p101核苷酸序列包含DNA，包括基因組DNA(如p101基因)或cDNA、或RNA。
p120指G蛋白調(diào)控的PI3K的催化亞基。p120蛋白的多肽或肽片段稱為p120多肽或p120肽。p120或p120多肽或肽片段與無關(guān)蛋白的融合在此稱為p120融合蛋白。(EE)120融合蛋白具有N末端Glu標(biāo)記的MEEEEFMPMEFSS。p120的功能等同物指一種在體內(nèi)或體外以高親合性結(jié)合于p101調(diào)控亞基的PI3K催化亞基蛋白。其它的p120的功能等同物是G蛋白調(diào)控的PI3K的同源催化亞基，如p117。
p120核苷酸或編碼序列指編碼p120催化亞基蛋白、p120蛋白的多肽或肽片段或p120融合蛋白的核苷酸序列。p120核苷酸序列包含DNA，包括基因組DNA(如p120基因)或cDNA或RNA。
4．圖的描述圖1A、1B、1C和1D.豬p101銜接亞基核苷酸序列。(SEQ IDNo:1)圖2．推導(dǎo)的豬p101氨基酸序列。(SEQ ID No:2)經(jīng)蛋白測序鑒定的胰蛋白酶(tryptic)肽下畫實線。
圖3A、3B和3C.豬p120催化亞基核苷酸序列。(SEQ ID No:3)圖4．推導(dǎo)的豬p120催化亞基序列。(SEQ ID No:4)經(jīng)蛋白質(zhì)測序鑒定的胰蛋白酶肽下畫實線。與已公開的p110γ的氨基酸序列不同的區(qū)域下畫虛線。
圖5．在嗜中性粒細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的Gβγ敏感的PI3K與p85/p110PI3K不同。從Q-sepharose色譜圖得到的每一收集流分等，或者進(jìn)行Western雜交并以αp85α或αp85β的單克隆抗體探查并以HRP連接的二抗檢出(圖5的上半部分)，或者與100nM的[3H]-17-羥基-渥曼青霉素溫育，以SDS-PAGE(6％丙烯酰胺并作熒光自顯影)解析(圖5的下半部分)。Gβγ敏感的PI3K活性洗脫在第20-24流分中。
圖6．經(jīng)過最后一步Mini Q柱純化之后的B峰包含Gβγ敏感的PI3K活性。對B峰活性的最后一步純化產(chǎn)物經(jīng)Mini Q柱分離后，在活化的Gβγ亞基(βγ)、酪氨酸磷酸化的肽(YP-肽)、渥曼青霉素和/或Gαi-GDP亞基(αi-GDP)存在與不存在下對其進(jìn)行了分析。
圖7．在Sf9細(xì)胞中重組表達(dá)的游離p120和p101/p120 PI3K的藥理學(xué)特性和調(diào)控特性。實驗包括以下內(nèi)容與不同試劑溫育的7nMp101/p120或36nM p120(終濃度)；10mM NaF和30μMAlCl3(A/F)；1μMGβγ亞基(βγ)；2μMGα-GDP；100nM渥曼青霉素(W)或50μM酪氨酸磷酸化的肽(PY)，實驗前15分鐘(0℃下)加入[γ32p]-ATP；定量摻入[32p]的[32p]-PtdIns(3,4,5)P3。所示數(shù)據(jù)為平均值(n=2)。
圖8.U937細(xì)胞中的p101與Gβγ激活的PI3K的活性相關(guān)。U937細(xì)胞瞬時地由編碼(EE)120或(EE)101的哺乳動物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，其由編碼myc101、myc120或無關(guān)的對照myc融合蛋白的哺乳動物表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，如文中所述。共用40μg載體DNA。共轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞裂解、預(yù)洗并與共價交聯(lián)有α-(EE)單克隆抗體的G蛋白sepharose免疫沉淀，在實施例中所詳述。所得免疫沉淀物經(jīng)洗滌并鑒定Gβγ激活的(1μM,終濃度)PI3K活性。來自用無關(guān)(EE)-標(biāo)記的蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的免疫沉淀中檢測出的PI3K活性，從所示數(shù)據(jù)中減去或不減去Gβγ(這些是分別為存在與不存在Gβγ時1896dpm和2862dpm的平均值)。以[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的平行的轉(zhuǎn)染顯示了[35S]-p101和[35S]-p120在免疫沉淀中的量，其當(dāng)共轉(zhuǎn)染時下降40％(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖9．體內(nèi)p101/p120受Gβγ的調(diào)控。Cos-7細(xì)胞由編碼Gβγ亞基(“β1γ2”)、p101(“101”)和/或p120(“120”)的哺乳動物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，如文中所述。經(jīng)48小時的瞬時表達(dá)，每個轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或者進(jìn)行Western雜交以檢測“相關(guān)蛋白”，或者對PtdIns(3,4,5)P3的累積(帶陰影的條框)進(jìn)行鑒定。對于Western雜交，樣品以α-(myc)單克隆抗體作探針對不同的(myc)標(biāo)記的蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量。給出的結(jié)論與所有4個關(guān)鍵載體存在時所得到的表達(dá)相關(guān)；(myc)-p120和(myc)-p101的絕對水平非常相似，均為10倍于(myc)-γ2的水平。平行批次的細(xì)胞以[32p]-Pi標(biāo)記；90分鐘后將脂類抽提、去?；⑶覍θ芙獾乃茴^部基團(tuán)進(jìn)行陰離子交換HPLC，由液體閃爍記數(shù)法定量。所示數(shù)據(jù)為平均值(n=2)+/-變化范圍。[32P]-PtdIns(3,4,5)P3的數(shù)據(jù)在無關(guān)DNA對照(972±41dpm)之上。
圖10A和10B．人p101銜接亞基核苷酸序列。(SEQ ID No:11)圖11．推導(dǎo)的人p101氨基酸序列。(SEQ ID No:12)圖12A和12B．人p120催化亞基核苷酸序列。(SEQ ID No:13)圖13．推導(dǎo)的人p120催化亞基序列。(SEQ ID No:14)5．發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種特定類型的由三聚體G-蛋白的βγ亞基激活的PI3K的鑒定、純化和克隆。在此首次進(jìn)行描述的p101是一種G-蛋白調(diào)控的PI3K的新型亞基。在此同作描述的是G-蛋白調(diào)控的PI3 K的催化亞基p120的鑒定、克隆和序列的修正。
PI3K是一種酶，它在3d位磷酸化磷脂酰肌醇以產(chǎn)生胞內(nèi)信號分子PtdIns(3,4,5)P3。盡管已顯示PI3K的活性在多種細(xì)胞類別中一經(jīng)酪氨酸激酶受體的刺激即被誘導(dǎo)，但是由與三聚體的G-蛋白結(jié)合的受體激活的PI3K活性僅在有限數(shù)量的造血譜系來源的細(xì)胞(例如血小板、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)中檢測出來。有趣的是，在這些細(xì)胞中PtdIns(3,4,5)P3的累積與很多參與急、慢性炎癥的免疫應(yīng)答有關(guān)。例如，嗜中性粒細(xì)胞特別是由應(yīng)答微生物感染所釋放的趨化因子fMLP所激活。這一激動劑結(jié)合到百日咳毒素敏感的G蛋白偶聯(lián)受體上并激活嗜中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，導(dǎo)致超氧化物的產(chǎn)生和細(xì)胞毒性。呼吸爆發(fā)反應(yīng)與一快速并瞬時的胞內(nèi)PI3K活性的增加相關(guān)。
對嗜中性粒細(xì)胞的研究表明，選擇性抑制PI3K的催化成分的渥曼青霉素導(dǎo)致超氧化物產(chǎn)生的停止。由于絕大多數(shù)激活這一呼吸爆發(fā)的激動劑結(jié)合于與G蛋白結(jié)合的受體，G蛋白調(diào)控的PI3K的活性代表一種主導(dǎo)性效應(yīng)物途徑的候選物，其抑制將減輕炎癥的破壞細(xì)胞的作用。然而，渥曼青霉素不是一個臨床上合適的這一途徑的抑制劑，因為渥曼青霉素抑制PI3K的所有催化活性，包括參與其它細(xì)胞途徑，如生長因子的活性。
在此報道的發(fā)現(xiàn)，即G-蛋白調(diào)控的PI3K由兩個亞基組成催化亞基(p110γ,p117或p120)和p101調(diào)控亞基。PI3K對可刺激Gβγ亞基從活化的三聚體G-蛋白釋放的細(xì)胞表面受體的反應(yīng)能力主要取決于p101調(diào)控亞基的存在。盡管催化亞基在體外有Gβγ亞基存在下也會表現(xiàn)出對PI3K活性一個小的刺激(約1.7倍)，但p101蛋白的加入將提高Gβγ對PI3K活性的刺激100倍。對p101的中和、去除或干擾p101結(jié)合于其結(jié)合伴侶，將使細(xì)胞失去應(yīng)答激活的Gβγ亞基產(chǎn)生大量增加的胞內(nèi)信號PtdIns(3,4,5)P3的能力。這樣看來，在骨髓來源的細(xì)胞中有限的p101亞基的分布是對這一應(yīng)答的細(xì)胞類型特異性的關(guān)鍵因素。此外，p101上沒有明顯的與其它任何已鑒定的序列的同源物。這一發(fā)現(xiàn)使p101和p101/p120復(fù)合物成為非特異性效應(yīng)最小的抑制、激活或調(diào)節(jié)G蛋白激活的PI3K的可選擇的靶位。
本發(fā)明還包括p101和p120的核苷酸、p101和p120的蛋白和肽以及抗p101和p120的抗體(比如，其能夠作為p101和p120的激動劑或拮抗劑)、抑制G蛋白激活的PI3K的活性或表達(dá)的拮抗劑或者一些激活G蛋白激活的PI3K的活性或增加其表達(dá)的激動劑，這些激動劑在動物比如人類中，治療造血譜系細(xì)胞激活紊亂，包括但不僅限于，與急、慢性炎癥相關(guān)的免疫應(yīng)答。例如，Gβγ激活的PI3K的拮抗劑可用于治療包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺炎、哮喘和其它肺部疾病、過敏、再灌注損傷、動脈粥狀硬化和其它心血管疾病、阿爾茨海默病和癌癥，在此僅列出一些炎性紊亂。另外，p101核苷酸和p101調(diào)控亞基，以及p120核苷酸和p120催化亞基，在鑒定有效的治療參與G蛋白激活的PI3K的造血譜系細(xì)胞激活紊亂的化合物時是很有用的。
進(jìn)一步，本發(fā)明包含p101和p120核苷酸、p101和p120蛋白和肽、以及在造血譜系細(xì)胞激活紊亂診斷中抗p101和p120抗體的用途。在一個病人中p101調(diào)控亞基或p120催化亞基的異常，或在G蛋白激活的PI3K信號傳導(dǎo)途徑中的異常的診斷，將同樣有助于制訂一個合適的療法或治療方案。
特別地，下面一段內(nèi)容描述的發(fā)明包含p101調(diào)控亞基、相應(yīng)于p101調(diào)控亞基功能結(jié)構(gòu)域的多肽或肽(例如，催化亞基結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或與激活的G蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域)、突變的截短的或缺失的p101調(diào)控亞基(例如，缺失了一個或多個功能結(jié)構(gòu)域或部分的p101調(diào)控亞基)、p101調(diào)控亞基融合蛋白(例如，p101調(diào)控亞基或p101調(diào)控亞基的一個功能結(jié)構(gòu)域，其融合于一個不相關(guān)的蛋白或肽，例如一種表位標(biāo)記，即myc表位)、編碼這些產(chǎn)物的核苷酸序列和可產(chǎn)生這些p101調(diào)控亞基產(chǎn)物的宿主細(xì)胞表達(dá)體系。
另外，本發(fā)明還包括p120催化亞基蛋白、多肽、p120亞基的功能結(jié)構(gòu)域(例如，催化結(jié)構(gòu)域)、突變的截短的或缺失的p120調(diào)控亞基蛋白、p120融合蛋白、編碼這些產(chǎn)物的核苷酸序列和可產(chǎn)生這些p120催化亞基產(chǎn)物的宿主細(xì)胞表達(dá)體系。
本發(fā)明還包括抗體和抗獨(dú)特型抗體(包括Fab片段)、G蛋白激活的PI3K的拮抗劑和激動劑以及抑制p101或p120基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄因子抑制劑、反義和核酶分子、或基因或調(diào)控序列替代構(gòu)建體)、或啟動p101調(diào)控亞基的表達(dá)(例如，一些表達(dá)構(gòu)建體，其中p101編碼序列與表達(dá)控制元件例如啟動子、啟動子/增強(qiáng)子等有效地結(jié)合)的化合物或核苷酸構(gòu)建體。本發(fā)明還涉及基因工程改造了的宿主細(xì)胞和動物，以表達(dá)人p101調(diào)控亞基(或其突變體)，或抑制或“敲除”動物內(nèi)源性p101調(diào)控亞基的表達(dá)。
進(jìn)一步，本發(fā)明特別地包含防止p101調(diào)控亞基與其結(jié)合伴侶的結(jié)合的拮抗劑，包括p120和其它PI3K催化亞基蛋白例如p117和p110γ，以及活化的三聚體G蛋白蛋白，包括Gβγ亞基。
p101調(diào)控亞基蛋白或肽、p101調(diào)控亞基融合蛋白、p101核苷酸序列、抗體、拮抗劑和激動劑可用于在免疫疾病診斷中突變的p101調(diào)控亞基或不適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)的p101調(diào)控亞基的檢測。p101和p120亞基蛋白或肽、p101和p120亞基融合蛋白、p101和p120核苷酸序列、宿主細(xì)胞表達(dá)體系、抗體、拮抗劑、激動劑和基因工程細(xì)胞和動物可用于篩選對這些免疫疾病的治療有效的藥物?；蚬こ趟拗骷?xì)胞和/或動物的應(yīng)用可以提供一個優(yōu)點(diǎn)，即這些系統(tǒng)不僅允許鑒定結(jié)合于p101調(diào)控亞基的化合物，而且允許鑒定作用于由活化的p101調(diào)控亞基傳導(dǎo)的信號的化合物，特別是胞內(nèi)信號分子PtdIns(3,4,5)P3的產(chǎn)生。
最后，p101調(diào)控亞基蛋白產(chǎn)物和融合蛋白產(chǎn)物、抗體和抗獨(dú)特型抗體(包括Fab片段)、拮抗劑或激動劑(包括調(diào)節(jié)可作用于p101調(diào)控亞基信號傳導(dǎo)途徑中作用于下游靶位的信號傳導(dǎo)的化合物)可用于上述疾病的治療。例如，編碼功能性p101調(diào)控亞基、突變的p101調(diào)控亞基、以及反義和核酶分子的核苷酸構(gòu)建體可用于“基因治療”，該“基因治療”涉及在造血譜系細(xì)胞激活紊亂的治療中p101調(diào)控亞基的表達(dá)和/或活性的調(diào)節(jié)。這樣，本發(fā)明也包括用于造血譜系細(xì)胞激活紊亂的治療的藥物制劑和方法。
本發(fā)明部分地基于，豬嗜中性粒細(xì)胞中新型PI3K酶這一令人驚訝的發(fā)現(xiàn)。與其它PI3K蛋白相似，這些酶3-磷酸化PtdIns、PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2底物，并且被100nM的渥曼青霉素完全抑制。然而，不同于以前描述過的PI3K p85/p101蛋白復(fù)合物，PI3K的活性在與Gβγ亞基一同溫育后被激活超過100倍。Gα-GDP亞基的加入可以抑制這一Gβγ的激活。更進(jìn)一步，PI3K活性不被磷酸化的酪氨酸肽激活。純化時，鑒定了兩種不同的異源二聚體蛋白復(fù)合物一種p117/p101復(fù)合物和一種p120/p101復(fù)合物。肽測序揭示p101蛋白在各復(fù)合物中是一樣的。p120和p117蛋白是同源的，除了氨基末端(見下面實施例)。之后基于肽的序列，應(yīng)用簡并性探針從豬嗜中性粒細(xì)胞mRNA合成的cDNA的表達(dá)文庫篩選豬p101和p120 cDNA。應(yīng)用從豬的cDNA序列得到的探針從人單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞cDNA文庫篩選人p101和p120的克隆。盡管豬和人亞基的序列分析揭示p120蛋白與以前克隆的PI3K催化亞基同源(雖然它們在遠(yuǎn)端羧基端有很大差異)，但p101蛋白與數(shù)據(jù)庫中的任何序列都不相關(guān)。
豬與人p101和p120同源物氨基酸序列比較揭示了在這兩個種間的高度保守性。這一在兩個哺乳動物種間高度的保守性暗示，哺乳動物種間可能普遍存在一個相似的程度的保守性。相同于豬的序列用于克隆人同源物的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用已公開的人和/或豬的序列以及在本說明書中描述的方法可從其它哺乳動物種類中克隆p101和p120同源物。
這里敘述的實驗，即在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)p101和/或p120融合蛋白，說明p101以1∶1的化學(xué)計算摩爾比緊密地與p120結(jié)合。能夠表現(xiàn)PI3K活性的游離的經(jīng)過純化的p120對Gα亞基和酪氨酸磷酸化的肽的存在不敏感，并且僅微弱地受Gβγ亞基刺激。然而，當(dāng)與p101結(jié)合后，p120的PI3K活性在Gβγ亞基存在下刺激增加100倍。當(dāng)p101單獨(dú)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)時，p101并不表現(xiàn)PI3K活性。
當(dāng)p101在人U937細(xì)胞中以標(biāo)記的融合蛋白的形式表達(dá)時，一個有趣的結(jié)果出現(xiàn)了。當(dāng)這個重組表達(dá)的豬p101通過融合蛋白標(biāo)記進(jìn)行免疫沉淀時，這些免疫沉淀物確實包含G蛋白調(diào)控的PI3K活性。p120與p101的共表達(dá)輕微地降低可沉降的PI3K的活性量。這些結(jié)果說明人U937細(xì)胞包含一種PI3K催化亞基，這一亞基能夠與p101調(diào)控亞基結(jié)合，并由其激活。這些結(jié)果表明除了高度保守的氨基酸序列，來自不同哺乳動物種類的同源物相互間在功能和結(jié)構(gòu)上很相似。
此外，用編碼p101、p120和/或Gβγ亞基構(gòu)建體在Cos-7細(xì)胞中進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，其在應(yīng)答活化的G蛋白時一般并不刺激PI3K活性。當(dāng)存在p101下共表達(dá)時，表達(dá)p120的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染僅以一種依賴Gβγ的方式產(chǎn)生胞內(nèi)PtdIns(3,4,5)P3水平的明顯提高。
本發(fā)明的各種方面在下面這一部分進(jìn)行更詳細(xì)的描述。5.1 p101和p120基因在圖1和2中分別列出豬p101調(diào)控亞基的cDNA序列(SEQ ID No:1)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID No:2)。一個相對普通的等位突變發(fā)生于開放閱讀框架中483位氨基酸殘基；一個絲氨酸可在此位被甘氨酸取代。
在圖10和11中分別列出人p101調(diào)控亞基的cDNA序列(SEQ IDNo:11)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID No:12)。
認(rèn)為編碼豬p101調(diào)控亞基開始的733個氨基酸(相應(yīng)于人亞基的前736氨基酸)的核苷酸序列足夠與催化亞基結(jié)合。然而，沒有另外145個羧基端氨基酸，此結(jié)合于p120的截短的p101不能應(yīng)答Gβγ亞基刺激PI3K活性。因此，認(rèn)為催化亞基相連的結(jié)構(gòu)域包含在前732氨基酸內(nèi)(對于人為735)，且733到877位羧基端氨基酸(對于人為736到880位)可能參與應(yīng)答Gβγ亞基。
豬p101的其它結(jié)構(gòu)域由以下氨基酸殘基描述，從約1到160、80到120、161到263、264到414、415到565、566到706、707到832和/或833到877。相應(yīng)的人p101結(jié)構(gòu)域由以下氨基酸殘基描述，從約1到160、80到120、161到263、264到416、417到567、568到709、710到835和/或836到880。編碼從約161到263氨基酸殘基的核苷酸序列定義一種血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源(“PH”)結(jié)構(gòu)域(PROSITE:PS50003)。PH結(jié)構(gòu)域可參與蛋白質(zhì)與Gβγ亞基的結(jié)合(Touhara等，1994，生物化學(xué)雜志269:10217)，以及與膜磷脂的結(jié)合(見Shaw,1996，生物鑒定(Bioessays),18:35-46)。如此，p101的PH結(jié)構(gòu)域可能參與這兩類事件。
編碼p101的1到160氨基酸的核苷酸序列可能負(fù)責(zé)結(jié)合p120催化亞基。分析p101蛋白此區(qū)域二級結(jié)構(gòu)時，可預(yù)見其有自身包含的交替的α-螺旋/β-折疊結(jié)構(gòu)。在此結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)現(xiàn)與“WW結(jié)構(gòu)域”的同源區(qū)(Staub等，1996，結(jié)構(gòu)4:495-499和TIBS 21:161-163)。此WW結(jié)構(gòu)域可能結(jié)合于在p120蛋白N端發(fā)現(xiàn)的富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域(殘基310到315)。如此，p101的WW結(jié)構(gòu)域可能參與介導(dǎo)調(diào)節(jié)亞基和催化亞基之間的相互作用。
分別在圖3和4中顯示豬p120 cDNA序列(SEQ ID No:3)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID No:4)。分別在圖12和13顯示人p120 cDNA序列(SEQ ID No:13)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID No:14)。隱義的凝血酶切割位點(diǎn)出現(xiàn)在開始的約40個氨基酸殘基后。缺乏這些約40個氨基端殘基的截短的p120蛋白仍能結(jié)合p101，但PI3K活性降低約20％到30％。換言之，具有SEQ ID No:4(豬p120推導(dǎo)的氨基酸序列)部分從約氨基酸殘基41延伸到殘基1102的氨基酸序列的蛋白質(zhì)保留了全長p120的功能?；谪i和人p120高度序列同源性，具有SEQ ID No:14(人p120推導(dǎo)的氨基酸序列)部分從約氨基酸殘基41延伸到殘基1102的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，也將保留全長p120的功能。盡管Stoyanov等(1995)報道p120蛋白質(zhì)與早先克隆的p110γ蛋白高度同源，但p120C末端在氨基酸殘基1075與報導(dǎo)的p110γ蛋白質(zhì)不同；因此，p120最后的28個氨基酸殘基在任一同源蛋白質(zhì)的報告中并未公布。如上所述，編碼包括p120殘基310到315的富脯氨酸區(qū)域的核苷酸可能參與p120與p101之間的相互作用。另外，編碼p120從約173到302氨基酸殘基的核苷酸定義了弱PH結(jié)構(gòu)域，它可能是關(guān)于膜結(jié)合和/或Gβγ與p101/p120復(fù)合物的相互作用的候選者。
實施例中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)，如下，證明p120 cDNA編碼Gβγ激活的PI3K的催化亞基。p101 cDNA編碼結(jié)合于p120亞基的新的調(diào)控亞基蛋白質(zhì)。此異源二聚體應(yīng)答于三聚體G蛋白連接受體的激活從而3-磷酸化PtdIns、PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2。
本發(fā)明的p101核苷酸序列包括(a)如圖1或10所示的DNA序列或包含于保藏號為97636的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的cDNA克隆pCMV3mycp101的DNA序列；(b)編碼如圖2或圖10所示氨基酸序列的核苷酸序列，或由保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp101編碼的p101調(diào)控亞基氨基酸序列的核苷酸序列；(c)在高度嚴(yán)格條件下雜交于如圖1或圖10所示DNA序列互補(bǔ)物的任何核苷酸序列或包含于保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp101中的任何核苷酸順序，例如，在0.5M NaHPO4,7％十二烷基硫酸鈉(SDS),1mm EDTA在65℃條件下與結(jié)合在膜上的DNA雜交，并在0.1×SSC/0.1％SDS在68℃下清洗，(Ausubel F.M.等，編1989，當(dāng)代分子生物學(xué)方法(Current Protocols in Molecular Biology),Vol.1,Green Publishing Associates,Inc.,和John Wiley&sons,Inc.,紐約，p.2.10.3)，以及編碼功能等同基因產(chǎn)物的任何核苷酸序列；以及(d)在以次高度嚴(yán)格條件下例如在中等嚴(yán)格條件下，如，0.2×SSC/0.1％SDS在42℃清洗(Ausubel等，1989，出處同前)雜交于編碼如圖1或圖10所示氨基酸序列的DNA序列的互補(bǔ)物的任何核苷酸序列，或包括于保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp101中，還仍然編碼功能等同p101基因產(chǎn)物的任何核苷酸序列。p101調(diào)控亞基功能等同物包括存在于其它物種的天然發(fā)生p101調(diào)控亞基，以及無論天然發(fā)生還是設(shè)計的保留至少p101一些功能活性(即和p120或p117催化亞基結(jié)合，應(yīng)答Gβγ亞基的催化活性的激活，和/或與Gβγ亞基相互作用)的突變p101調(diào)控亞基。本發(fā)明還包括從(a)到(d)序列的簡并性變異體。
本發(fā)明還包括雜交于前段中從(a)到(d)核苷酸序列并且因此是其互補(bǔ)物的核酸分子，優(yōu)選的是DNA分子。此雜交條件可能是如上所述的高度嚴(yán)格或次高度嚴(yán)格條件。在核酸分子是脫氧寡核苷酸(“寡聚物”)時的情況下，高度嚴(yán)格條件可以指例如在6×SSC/0.05％焦磷酸鈉在37℃(對于14-堿基寡聚物)、48℃(對于17-堿基寡聚物)、55℃(對于20-堿基寡聚物)和60℃(對于23-堿基寡聚物)下清洗。這些核酸分子可以編碼或作為p101反義分子，例如用于p101基因調(diào)控(在p101基因核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)中用于和/或作為反義引物)。關(guān)于p101基因調(diào)控，這些技術(shù)可用于調(diào)控例如炎性免疫應(yīng)答。進(jìn)一步，這些序列可被用作核酶和/或三螺旋序列的一部分，也可用于p101基因調(diào)控。再進(jìn)一步，這些分子可被用作診斷方法的組成部分，例如，通過負(fù)責(zé)引起一種炎性反應(yīng)的特定p101等位基因的存在可檢測到諸如關(guān)節(jié)炎。
除上述的p101核苷酸序列之外，通過本領(lǐng)域中眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)且無需過度的實驗，可以鑒定并且很易分離出來存在于相同物種中全長p101 cDNA或基因序列和/或存在于其它物種的p101基因同源物。于此所述實驗證據(jù)顯示p101蛋白質(zhì)在不同哺乳動物中是保守的。例如，用得自豬p101 cDNA序列的探針從單核細(xì)胞和白細(xì)胞庫中克隆人p101，并且發(fā)現(xiàn)推導(dǎo)的人和豬氨基酸序列高度保守。通過實驗證明了兩個同源物結(jié)構(gòu)和功能的相似性，該實驗顯示當(dāng)豬p101在U937細(xì)胞中表達(dá)時，豬p101與催化亞基的人同源物結(jié)合。另外，酪氨酸激酶調(diào)控的PI3K蛋白質(zhì)家族的成員，例如p110/p85 PI3K在不同哺乳動物中也保守。因此p101和p120同源物可從已知或懷疑含有三聚體G蛋白調(diào)控的PI3K的哺乳動物細(xì)胞，特別是造血源細(xì)胞以及更特別是血小板、單核細(xì)胞、白細(xì)胞、破骨細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中分離。
在相關(guān)物種中p101同源物的鑒定可用于以發(fā)現(xiàn)藥物為目的的與人更緊密相關(guān)的動物模型系統(tǒng)的開發(fā)。例如，得自目的生物體的嗜中性粒細(xì)胞mRNA合成的cDNAs表達(dá)文庫，可用得自該物種標(biāo)記的催化亞基例如p120、p117或p110γ催化亞基融合蛋白來篩選。另外，這些得自目的生物體的cDNA文庫或基因組DNA文庫可用在此描述為雜交或擴(kuò)增探針的核苷酸通過雜交進(jìn)行篩選。而且，在基因組內(nèi)其它基因座上編碼與p101基因產(chǎn)物一個或多個結(jié)構(gòu)域有廣泛同源性的蛋白質(zhì)的基因也可經(jīng)由相同技術(shù)鑒定。至于cDNA文庫，這些篩選技術(shù)可鑒定得自在相同或不同物種中可選擇的剪接轉(zhuǎn)錄物的克隆。
可使用多重濾膜通過濾膜雜交進(jìn)行篩選。標(biāo)記的探針包含如圖1和10分別所示的人或豬p101核苷酸序列中至少15-30個堿基對。當(dāng)cDNA文庫來源于不同于得到標(biāo)記序列的生物體類型的生物體時，所使用的雜交沖洗條件應(yīng)該是較低嚴(yán)格性的。關(guān)于用豬和/或人p101探針克隆哺乳動物p101同源物，可通過雜交，例如，可在Church緩沖液(7％SDS,250mM NaHPO4,2μMEDTA,1％BSA)中于65℃過夜進(jìn)行?？捎?×SSC,0.1％SDS，在65℃下清洗以及然后在0.1×SSC,0.1％SDS,在65℃的條件下進(jìn)行清洗。
低度嚴(yán)格條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的，并且依賴于文庫以及衍生標(biāo)記的序列的特定生物體而相應(yīng)地變化。關(guān)于這些條件的指南見，例如Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊，冷泉港出版社，N.Y.；以及Ausubel等，1989，當(dāng)代分子生物學(xué)方法，GreenPublishing Associates和Wiley Interscience,N.Y.。
另外，仍舊使用合適的嚴(yán)格條件，標(biāo)記的p101核苷酸探針可用于篩選來自目標(biāo)生物體的基因組文庫。人基因組克隆的鑒定和表征對設(shè)計診斷實驗和用于治療人類造血譜系細(xì)胞激活紊亂的治療臨床方案有幫助。例如，得自人基因內(nèi)含子/外顯子邊界鄰近區(qū)域的序列可用于設(shè)計能用于診斷的在檢測外顯子、內(nèi)含子、剪接位點(diǎn)(例如剪切接受體和/或供體位點(diǎn))等中突變的擴(kuò)增分析中的引物。
此外，p101基因同源物可通過使用基于在此公開的p101基因產(chǎn)物內(nèi)氨基酸序列設(shè)計的兩簡并性寡核苷酸引物庫進(jìn)行PCR從目的生物體的核酸中分離出來。反應(yīng)的模板可為得自mRNA反轉(zhuǎn)錄物的cDNA，此mRNA從例如，已知或懷疑表達(dá)p101等位基因的人類或非人類細(xì)胞系或細(xì)胞型如嗜中性粒細(xì)胞中制備。
PCR產(chǎn)物可被亞克隆和測序以確保所擴(kuò)增的序列代表p101基因序列。然后PCR片段可用于各種方法以分離全長cDNA克隆。例如，擴(kuò)增片段可被標(biāo)記并用于篩選cDNA文庫，諸如噬菌體cDNA文庫。此外，標(biāo)記的片段可用于經(jīng)由基因組文庫的篩選分離基因組克隆。
PCR技術(shù)還可用于分離全長cDNA序列。例如，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟可從合適細(xì)胞源(即已知或懷疑表達(dá)p101基因如，嗜中性粒細(xì)胞或白細(xì)胞的其它類型的細(xì)胞)中分離RNA。使用對引發(fā)第一條鏈合成的擴(kuò)增片段的最5’末端特異的寡核苷酸引物，可在RNA上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后得到的RNA/DNA雜合體使用標(biāo)準(zhǔn)末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)用鳥苷酸“加尾”，雜交體可用RNAase H消化并且使用ploy C引物引發(fā)第二條鏈合成。如此，擴(kuò)增片段的cDNA序列上游很容易被分離?？赡苡玫降目寺〔呗砸娎?，Sambrook等，1989，出處同前。
p101基因序列可額外地用于分離突變p101等位基因。這些突變等位基因可從已知或者推定有與造血譜系細(xì)胞激活紊亂癥狀，如炎癥有關(guān)的基因表型的個體中分離。然后突變等位基因及突變等位基因產(chǎn)物用于如下所述的治療和診斷系統(tǒng)中。額外地，這些p101基因序列可用于檢測影響造血譜系細(xì)胞激活的p101基因調(diào)控(例如啟動子或啟動子/增強(qiáng)子)缺陷。
例如可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的PCR技術(shù)分離突變p101基因的cDNA。在這種情況下，第一條cDNA鏈可通過將寡聚dT寡核苷酸雜交于分離自已知或懷疑推斷的帶有突變p101等位基因個體中的細(xì)胞的mRNA，并且用反轉(zhuǎn)錄酶延伸新鏈來合成。然后用特異性雜交于正?；?’末端的寡核苷酸來合成cDNA第二條鏈。使用這兩個引物，然后通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆進(jìn)合適載體并通過本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)進(jìn)行DNA序列分析。通過比較突變p101等位基因和正常p101等位基因的DNA序列，可確定負(fù)責(zé)突變p101基因產(chǎn)物功能缺失或改變的突變。
另外，可用得自懷疑或已知帶有突變p101等位基因個體的DNA構(gòu)建基因組文庫或使用得自已知或懷疑表達(dá)突變p101等位基因細(xì)胞型的RNA構(gòu)建cDNA文庫。由此，正常p101基因或其任何合適片段可被標(biāo)記并用作為在這些文庫中鑒定相應(yīng)突變p101等位基因的探針。然后純化含有突變p101基因序列的克隆并根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法進(jìn)行序列分析。
另外，使用從例如分離自懷疑或已知帶有此突變等位基因的個體中的已知或懷疑表達(dá)突變p101等位基因的細(xì)胞型的RNA合成的cDNA構(gòu)建表達(dá)文庫。用此法，推測的突變細(xì)胞型制造的基因產(chǎn)物可用標(biāo)準(zhǔn)抗體篩選技術(shù)連同抗正常p101基因產(chǎn)物的抗體(如以下5.3部分所述)表達(dá)和篩選(篩選技術(shù)見例如，Harlow,E.和Lane.編,1988，“抗體實驗室手冊”，冷泉港出版社，冷泉港)。另外，可通過應(yīng)用標(biāo)記的融合蛋白比如，(EE)120或myc120融合蛋白的篩選方法完成篩選。在p101突變導(dǎo)致功能改變的表達(dá)基因產(chǎn)物(例如，錯義或移碼突變的結(jié)果)產(chǎn)生的情況下，抗p101調(diào)控亞基抗體的多克隆系易于和突變p101調(diào)控亞基基因產(chǎn)物交叉反應(yīng)。經(jīng)由其和這些標(biāo)記的抗體反應(yīng)檢測的文庫克隆可被純化并根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法進(jìn)行序列分析。
本發(fā)明還包括編碼突變p101調(diào)控亞基、p101調(diào)控亞基的肽段、截短的p101調(diào)控亞基和p101調(diào)控亞基融合蛋白的核苷酸序列。這些包括但不限于編碼如下5.2部分所述突變p101調(diào)控亞基；與催化結(jié)合相關(guān)的多肽或肽，或p101調(diào)控亞基Gβγ亞基的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或這些結(jié)構(gòu)域的部分；其中一或兩個結(jié)構(gòu)域缺失的截短的p101調(diào)控亞基或截短的無功能p101調(diào)控亞基的核苷酸序列。編碼融合蛋白的核苷酸可包括但不限于全長p101調(diào)控亞基、截短的p101調(diào)控亞基或與不相關(guān)蛋白質(zhì)或肽融合的p101調(diào)控亞基肽片段，比如，協(xié)助純化或檢測所得融合蛋白的表位標(biāo)記；或可用作標(biāo)記物的酶、熒光蛋白、發(fā)光蛋白。
本發(fā)明還包括(a)含任何前述p101調(diào)控亞基編碼序列和/或它們的互補(bǔ)物(即反義)的DNA載體；(b)含任何與指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的調(diào)控元件序列有效地結(jié)合的前述p101調(diào)控亞基編碼序列的DNA表達(dá)載體；以及(c)含任何與指導(dǎo)編碼序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件有效地結(jié)合的前述p101調(diào)控亞基編碼序列的基因工程宿主細(xì)胞。在此使用的調(diào)控元件包括但不限于可誘導(dǎo)的和非可誘導(dǎo)的啟動子、增強(qiáng)子、操縱子和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的驅(qū)動和調(diào)控表達(dá)的元件。這些調(diào)控元件包括但不限于桿狀病毒啟動子、巨細(xì)胞病毒hCMV極早期基因啟動子、SV40腺病毒早期或晚期啟動子、1ac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、噬菌體A主要操縱子和啟動子區(qū)域、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶啟動子、酸性磷酸酶啟動子以及酵母α-交配因子啟動子。
最后，本發(fā)明還包括編碼p120亞基蛋白質(zhì)的核苷酸，這些蛋白質(zhì)包括新近描述的此催化亞基羧基端，p120亞基蛋白質(zhì)的缺失變異體，在高度嚴(yán)格條件下雜交于這些核苷酸并編碼功能等同物的120等位基因變異體的核苷酸，包括保藏號為97637的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp120(例如，突變等位基因或天然發(fā)生的等位基因，諸如在483位氨基酸殘基等位基因變異)，以及用如上所述本發(fā)明p101核苷酸的分離方法從不同生物體分離的p120核苷酸等同物。此外，本發(fā)明包括用于重組生產(chǎn)p120的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。5.2p101和p120蛋白質(zhì)和多肽可制備p101調(diào)控亞基和p120催化亞基，p101調(diào)控亞基和/或p101調(diào)控亞基融合蛋白以及p120催化亞基和/或p120催化亞基融合蛋白的多肽和肽片段、突變的、截短的或缺失的形式以用于多種用途，包括但不僅限于可作為診斷分析中的試劑的抗體的產(chǎn)生和其它參與造血譜系細(xì)胞激活調(diào)控的細(xì)胞基因產(chǎn)物的鑒定，這些基因產(chǎn)物可用作在篩選可用作治療造血譜系細(xì)胞激活紊亂的化合物的試劑以及用于與Gβγ激活的P13K相關(guān)的造血譜系細(xì)胞激活紊亂的藥物試劑的篩選。
圖2和11分別顯示了豬和人p101調(diào)控亞基蛋白質(zhì)的氨基酸序列。圖4和13分別顯示了豬和人p120催化亞基蛋白質(zhì)的氨基酸序列。圖4上的虛線強(qiáng)調(diào)p120與公開的PI3K催化亞基p110α,p110β和p110γ有分歧的區(qū)域。
p101調(diào)控亞基序列在與翻譯起始位點(diǎn)相一致的DNA序列中以蛋氨酸開始。豬和人p101調(diào)控亞基的預(yù)計分子量都為97KD。
本發(fā)明p101調(diào)控亞基氨基酸序列包括圖2(SEQ ID No:2)或圖4(SEQ ID No:12)所示氨基酸序列或由保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp101編碼的氨基酸序列。而且，本發(fā)明包括其它物種的p101調(diào)控亞基。事實上，由上述的p101核苷酸序列編碼的任何p101調(diào)控亞基蛋白都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明p120催化亞基氨基酸序列包括保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的cDNA克隆pCMV3mycp120。本發(fā)明還包括其它物種的p120催化亞基以及由在前面部分描述的p120核苷酸序列編碼的p120蛋白。
本發(fā)明還包括由上述核苷酸序列編碼的功能等同于p101調(diào)控亞基的蛋白質(zhì)，這是通過許多標(biāo)準(zhǔn)的任何一種評定包括但不限于結(jié)合催化亞基的能力，與催化亞基的結(jié)合親和力，應(yīng)答激活的三聚體G蛋白激活催化亞基的PI3K活性的能力，催化亞基結(jié)合以及應(yīng)答三聚體G蛋白激活引起的生物學(xué)效應(yīng)，例如信號傳導(dǎo)、細(xì)胞代謝改變(例如PtdIns(3,4,5)P3的產(chǎn)生)或在合適細(xì)胞型中存在(如中性粒細(xì)胞超氧化爆發(fā))時p101調(diào)控亞基等同物時表型改變。這些功能等同的p101調(diào)控亞基蛋白包括但不限于由上述的p101核苷酸序列編碼的氨基酸序列中氨基酸殘基的增加或取代(但卻導(dǎo)致沉默突變)所產(chǎn)生的功能等同的基因產(chǎn)物。氨基酸取代可在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或有關(guān)殘基兩性特性的相似性基礎(chǔ)上進(jìn)行。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。相似的，本發(fā)明還包括上述p120蛋白的功能等同物。
盡管可對p101 DNA進(jìn)行隨機(jī)突變(用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的隨機(jī)突變技術(shù))并且檢測所得的p101調(diào)控亞基突變體活性，可設(shè)計p101編碼序列的定點(diǎn)突變(使用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的定點(diǎn)突變技術(shù))以產(chǎn)生使功能增加，例如對催化亞基的更高的結(jié)合親和力，和/或更大的信號傳導(dǎo)能力；或功能降低，例如對催化亞基的較低的結(jié)合親和力，和/或減小的信號傳導(dǎo)能力的突變p101調(diào)控亞基。
例如，豬p101的氨基酸序列可以與人p101調(diào)控亞基的序列進(jìn)行比較?？稍O(shè)計p101調(diào)控亞基突變體以使物種間相同的區(qū)域得以保持而可變的殘基通過例如，氨基酸殘基的缺失、或插入、或一個或多個不同氨基酸殘基的取代被改變。可設(shè)計在可變位置的保守性改變以產(chǎn)生保留功能的p101調(diào)控亞基突變體；例如，催化亞基結(jié)合親和力或激活的G蛋白的傳導(dǎo)能力或二者均有。可以在這些可變位置設(shè)計非保守性變化以改變功能，例如催化亞基結(jié)合親和力或信號傳導(dǎo)能力，或兩者都有。另外，想要改變功能的地方，也可設(shè)計保守區(qū)域的缺失或非保守性改變。使用此處提到的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易檢測這些突變或缺失的p101調(diào)控亞基的這些改變。
可對p101編碼序列進(jìn)行其它突變以產(chǎn)生更適合于在所選宿主細(xì)胞中表達(dá)和放大等等的p101調(diào)控亞基。例如，每個氨基酸的三聯(lián)密碼子可以被修飾以形成更為接近宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制使用的偏好密碼子。
相應(yīng)于p101調(diào)控亞基(例如p120結(jié)合結(jié)構(gòu)域，G蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，或從約1到150、151到300、301到450、451到600、601到732(豬)或601到735(人)和733到877(豬)或736到881(人))的一個或多個結(jié)構(gòu)域(或一個結(jié)構(gòu)域的一部分)，截短的或缺失的p101調(diào)控亞基(例如，其中一個或多個以上結(jié)構(gòu)域的部分缺失的p101調(diào)控亞基)以及全長p101調(diào)控亞基，其中全長p101調(diào)控亞基、p101調(diào)控亞基肽或截短的p101調(diào)控亞基融合進(jìn)一種不相關(guān)蛋白的融合蛋白也都在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且可在本部分及以上部分公開的p101核苷酸和p101調(diào)控亞基氨基酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行設(shè)計。這些融合蛋白包括但不限于融合進(jìn)一種表位標(biāo)記(如在下面的實例中舉例說明)；或融合進(jìn)一種提供標(biāo)記功能的酶、熒光蛋白或發(fā)光蛋白。
盡管p101調(diào)控亞基多肽和肽可被化學(xué)合成(例如，見Creighton,1983，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原則(Proteins:Structures andMolecular Principles)，W.H.Freeman & Co.N.Y.)，得自p101調(diào)控亞基的大多數(shù)肽和全長p101調(diào)控亞基本身可使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)通過重組DNA技術(shù)有利地生產(chǎn)，以表達(dá)含p101基因序列和/或編碼序列的核酸。這些方法可用于構(gòu)建含上述p101核苷酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括例如，體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)基因重組。見例如Sambrook等，1989(出處同前)和Ausubel等，1989，(出處同前)中所述的技術(shù)。另外，能編碼p101核苷酸序列的RNA可使用比如合成儀化學(xué)合成。見如“寡核苷酸合成”，1984,Gait,M.J.編，IRL出版社，Oxford所述的技術(shù)，在此全文引入作為參考。
利用各種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來表達(dá)本發(fā)明的p101核苷酸序列。當(dāng)p101調(diào)控亞基肽或多肽是可溶性衍生物時，可從培養(yǎng)物回收肽或多肽，即在p101調(diào)控亞基肽或多肽不分泌的情況下從宿主細(xì)胞中回收以及在p101調(diào)控亞基肽或多肽可由細(xì)胞分泌情況下從培養(yǎng)基中回收。然而，如此構(gòu)建的宿主細(xì)胞本身可用于不僅保持p101調(diào)控亞基結(jié)構(gòu)和功能特性很重要，而且在例如藥物篩選分析中評估生物活性也很重要的情況中。
用于本發(fā)明之目的的表達(dá)體系包括但不限于微生物，諸如經(jīng)重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B.subtilis))，含p101核苷酸序列的質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體；經(jīng)含p101核苷酸序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，酵母屬(Saccharomyces)，畢赤酵母屬(Pichia)；經(jīng)含p101核苷酸序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞體系；經(jīng)重組病毒表達(dá)載體(例如菜花花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)或經(jīng)含p101核苷酸序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞體系；或包含得自哺乳動物細(xì)胞(例如金屬硫蛋白啟動子)或得自哺乳動物病毒(例如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)的啟動子的重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動物細(xì)胞體系(例如，COS、CHO、BHK、293、3T3、U937)。
在細(xì)菌體系中，依賴以p101基因產(chǎn)物表達(dá)為目的的用途有利地選擇許多表達(dá)載體。例如，大量生產(chǎn)此蛋白質(zhì)以產(chǎn)生p101調(diào)控亞基蛋白的藥物組合物或產(chǎn)生抗p101調(diào)控亞基蛋白抗體時，需要例如，指導(dǎo)易被純化的融合蛋白高水平表達(dá)的質(zhì)粒。這些載體包括但不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，1983,EMBO J.2:1791)，其中的p101編碼序列被單個地連接于載體lacZ編碼區(qū)域框架中以產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye&Inouye,1985，核酸研究(Nucleic Acids Res.)13:3101-3109；Van Heeke&Schuster,1989，生物化學(xué)雜志264:5503-5509)；等等。pGEX載體也可用來以谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白表達(dá)外源性多肽。如果插入的序列編碼相對較小的多肽(小于25KD)，這些融合蛋白一般可溶并且吸附入谷胱甘肽-瓊脂糖小珠后在游離谷胱甘肽存在下洗脫很易從裂解細(xì)胞中純化。設(shè)計pGEX載體以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位點(diǎn)以使克隆的目的基因產(chǎn)物可從GST部分釋放出來。另外，如果所得融合蛋白不溶并在宿主細(xì)胞中形成包涵體，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的技術(shù)純化包涵體并且溶解重組蛋白。
在昆蟲體系中，苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica)核多汗(polyhidrosis)病毒(AcNPV)可用作載體來表達(dá)外源基因(例如，見Smith等，1983，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)46:584；Smith,U.S.專利4,215,051)。在以下所述特定的實施方案中，Sf9昆蟲細(xì)胞被表達(dá)6×HIS標(biāo)記的p120構(gòu)建體或表達(dá)(EE)標(biāo)記的p101構(gòu)建體的桿狀病毒載體感染。
在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可使用許多基于病毒的表達(dá)體系。以下更詳細(xì)描述的特定實施方案中用CMV啟動子在U937細(xì)胞或Cos-7細(xì)胞中瞬時表達(dá)重組蛋白來表達(dá)標(biāo)記的p101或p120cDNA序列。另外，本領(lǐng)域中眾所周知的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)可用于在宿主細(xì)胞中插入重組表達(dá)構(gòu)建體。例如，在公開的PCT申請WO96/09400和WO94/29438中描述的轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。
在腺病毒用作表達(dá)載體的情況下，目的p101核苷酸序列可被連于一種腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物，例如，晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。然后通過體外或體內(nèi)重組將此嵌合基因插入腺病毒基因組。插入病毒基因組非必需區(qū)域(例如區(qū)域E1或E3)將導(dǎo)致有生存能力并能在所感染的宿主中表達(dá)p101基因產(chǎn)物的重組病毒(例如見Logan & Shenk,1984,美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:3655-3659)。插入的p101核苷酸序列的有效翻譯還需要特異起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子及鄰近序列。在完整的包括自身起始密碼子和鄰近序列的p101基因或cDNA插入合適的表達(dá)載體的情況下，不需要額外翻譯控制信號。然而，在僅僅插入p101編碼序列一部分的情況下，必須提供包括可以是ATG起始密碼子的外源性翻譯控制信號。而且，起始密碼子必須和所需要的編碼序列的閱讀框架方向相同以確保全部插入物的翻譯。這些外源性翻譯控制信號和起始密碼子可為各種來源，天然的和合成的。表達(dá)效率可被包括合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等等提高(見Bittner等，1987，酶學(xué)方法(Methods in Enzymol.)153:516-544)。
另外，要選擇調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以所需特殊方式修飾并加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。這些蛋白產(chǎn)物的修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對蛋白質(zhì)的功能很重要。不同宿主細(xì)胞有對蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的翻譯后加工及修飾的特征性和特異性的機(jī)制?？蛇x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保表達(dá)的外源蛋白正確的修飾和加工。為此目的，可使用有合適的加工初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。這種哺乳動物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38和U937細(xì)胞。
對于重組蛋白長期、高產(chǎn)量的生產(chǎn)優(yōu)選可以穩(wěn)定地表達(dá)。例如，可構(gòu)建穩(wěn)定地表達(dá)上述p101序列的細(xì)胞系。不使用含病毒來源的復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，宿主細(xì)胞可用合適表達(dá)控制元件(例如啟動子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多腺苷化位點(diǎn)等)控制的DNA及選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化。引入外源DNA后，允許構(gòu)建的細(xì)胞在加富培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)入選擇性培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記賦予選擇抗性并且允許細(xì)胞穩(wěn)定地將質(zhì)粒整合進(jìn)它們的染色體并且可生長和形成依次可被克隆和擴(kuò)展成細(xì)胞系的細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶。使用這種方法可有利地構(gòu)建表達(dá)p101基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。這些構(gòu)建的細(xì)胞系在篩選和評價影響p101基因產(chǎn)物內(nèi)源性活性的化合物上尤其有用。
可使用許多選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，細(xì)胞11:223)，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Azybalski,1962，美國國家科學(xué)院院報48:2026)以及腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，1980，細(xì)胞22:817)基因可分別用在tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞中。而且，抗代謝產(chǎn)物抗性可用作下列基因篩選的基礎(chǔ)dhfr，賦予氨甲喋呤抗性(Wigler等，1980，美國國家科學(xué)院院報77:3567；O’Hare等，1981，美國國家科學(xué)院院報78:1527)；gpt，賦予霉酚酸抗性(Mulligan & Berg,1981，美國國家科學(xué)院院報78:2072)；neo，賦予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等，1981，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)150:1)；以及hygro，賦予潮霉素抗性(Santerre等，1984，基因30:147)。
p101基因產(chǎn)物也可以在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)。任何種類的動物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、小型豬、山羊以及非人的靈長類例如狒狒、猴子、黑猩猩均可以用于產(chǎn)生p101轉(zhuǎn)基因動物。
本領(lǐng)域中任何已知技術(shù)均可用于向動物中引入p101轉(zhuǎn)基因以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的創(chuàng)立系。這些技術(shù)包括但不限于原核顯微注射(Hoppe.P.C.和Wagner,T.E.,1989，美國專利4,873,191)；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)入胚系(Van der Putten等，1985，美國國家科學(xué)院院報82:6148-6152)；在胚胎干細(xì)胞中基因打靶(Thompson等，1989，細(xì)胞56:313-321)；胚胎的電穿孔(Lo.1983，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol Cell.Biol.)3:1803-1814)；以及精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等，1989，細(xì)胞57:717-723)等。這些技術(shù)的綜述見于Gordon,1989，轉(zhuǎn)基因動物(Transgenic Animals),Intl.Rev.Cytol.115:171-229，此處全文引入作為參考。
本發(fā)明提供所有其細(xì)胞中帶有p101轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物，以及在其部分細(xì)胞而并非所有細(xì)胞中帶轉(zhuǎn)基因的動物，即，嵌合動物。轉(zhuǎn)基因可以以單個轉(zhuǎn)基因或多聯(lián)體例如頭對頭串連或頭對尾的方式被整合。根據(jù)例如Lasko等的教導(dǎo)(Lasko,M等，1992，美國國家科學(xué)院院報89:6232-6236)轉(zhuǎn)基因也可被選擇性地引入特異細(xì)胞型并在其中激活。這樣的細(xì)胞類型特異性激活所需的調(diào)控序列將取決于特定的目的細(xì)胞類型并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。當(dāng)期望將p101基因的轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)內(nèi)源性p101基因的染色體位點(diǎn)時，優(yōu)選基因打靶。簡言之，當(dāng)運(yùn)用此技術(shù)時，設(shè)計含與內(nèi)源性p101基因同源的一些核苷酸序列的載體以通過和染色體序列同源性重組而整合進(jìn)內(nèi)源性p101基因的核苷酸序列并打亂其功能。通過此法，內(nèi)源性p101基因的表達(dá)可被在內(nèi)源性基因中插入非功能序列而取消。轉(zhuǎn)基因也可被選擇性引入特定的細(xì)胞類型，這樣根據(jù)例如Gu等(Gu等，1994，科學(xué)265:103-106)的教導(dǎo)僅在該細(xì)胞類型中使內(nèi)源性p101基因失活。此種細(xì)胞類型特異性失活所需的調(diào)控序列將依賴于特定的目的細(xì)胞類型并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
一旦產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來分析重組p101基因的表達(dá)。通過Southern雜交分析或PCR技術(shù)完成初始篩選來分析動物組織以鑒定轉(zhuǎn)基因的整合是否發(fā)生。也可應(yīng)用包括但不限于得自動物細(xì)胞類型樣品的Northern雜交分析、原位雜交分析及RT-PCR來評價在轉(zhuǎn)基因動物組織中的轉(zhuǎn)基因mRNA的表達(dá)水平。表達(dá)p101基因的組織的樣品可用如下所述的特異于p101轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的抗體用免疫細(xì)胞化學(xué)方法評估。5.3抗p101和p120蛋白的抗體本發(fā)明還包含了特異性識別p101調(diào)控亞基一個或多個表位或p101調(diào)控亞基保守性變異體的表位或p101調(diào)控亞基肽片段的抗體。本發(fā)明還包含識別p120蛋白的一個或多個表位尤其是新型羧基端的抗體。這些抗體包含但不限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、人源化的或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體以及以上任一種的表位結(jié)合片段。
本發(fā)明的抗體可用于例如生物學(xué)樣品中的p101調(diào)控亞基或p120的檢測并且因此可用作診斷或預(yù)后技術(shù)的一部分，憑此，檢測病人的這些蛋白質(zhì)的量是否異常。這些抗體也可結(jié)合例如如下部分5.5所述的化合物篩選方案用以評價受試化合物對p101或p120基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或活性的影響。另外，這些抗體可結(jié)合如下5.6部分所述的基因治療技術(shù)來用于，例如在將他們引入病人之前，評價正常的和/或構(gòu)建的表達(dá)p101調(diào)控亞基表達(dá)的細(xì)胞。這些抗體還可額外地用作抑制異常p101調(diào)控亞基或p120活性的方法。這樣，這些抗體因此可用作炎性紊亂治療方法的一部分。
為生產(chǎn)抗體，通過注射p101調(diào)控亞基、p101調(diào)控亞基肽、截短的p101調(diào)控亞基多肽、p101調(diào)控亞基的功能等同物或p101調(diào)控亞基的突變體來免疫多種宿主動物。另外，通過注射p120催化亞基或p120亞基的肽段來免疫宿主動物。這些宿主動物包括但不限于兔、小鼠和大鼠，此處只舉出一些。使用多種佐劑以提高免疫學(xué)反應(yīng)，依賴于宿主的種類，包括但不限于弗氏佐劑(完全以及不完全)，礦物膠諸如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)諸如溶血卵磷脂，多聚醇，聚陰離子，肽，油性乳劑，匙孔血藍(lán)蛋白，二硝基苯酚以及可能有用的人佐劑諸如BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。多克隆抗體是得自免疫動物血清的抗體分子的異源性群體。
抗特定抗原抗體的同源性群體的單克隆抗體可通過提供在培養(yǎng)基中連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任一技術(shù)得到。這些包括但不限于Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(1975，自然256:495-497；以及美國專利第4,376,110號)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，1983，今日免疫學(xué)(Immunology today)4:72；Cole等，1983,80:2026-2030)以及EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy),Alan R.,Liss,Inc.,pp77-96)。這些抗體可能屬于任一類免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD以及它們的亞類。產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)高效價單克隆抗體的產(chǎn)生使其成為目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。
另外，可以使用通過剪接得自合適的抗原特異性的鼠抗體分子的基因以及得自合適的生物學(xué)活性的人抗體分子的基因以生產(chǎn)“嵌合抗體”所發(fā)展的技術(shù)(Morrison等，1984，美國國家科學(xué)院院報，81:6851-6855；Neuberger等，1984，自然，312:604-608；Takeda等，1985，自然，314:452-454)。嵌合抗體為一種分子，其中的不同部分來源于不同動物種屬諸如有得自豬單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的部分。
另外，可以修改描述的用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778；Bird,1988，科學(xué)242:423-426；Huston等，1988，美國國家科學(xué)院院報85:5879-5883；以及Ward等，1989，自然334:544-546)以生產(chǎn)抗p101基因產(chǎn)物的單鏈抗體。通過一種氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈，產(chǎn)生單鏈多肽可形成單鏈抗體。
用已知的技術(shù)可產(chǎn)生識別特異性表位的抗體片段。例如，這些片段包括但不限于由胃蛋白酶酶解抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段以及由還原F(ab’)2片段二硫橋產(chǎn)生的Fab片段。另外，構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse等，1989，科學(xué)，246:1275-1281)以允許快速及方便地鑒定帶有所需特異性的單克隆Fab片段。
使用本領(lǐng)域中周知的技術(shù)，抗p101調(diào)控亞基或p120催化亞基抗體可依次用于產(chǎn)生分別“模擬”p101調(diào)控亞基或p120亞基的抗獨(dú)特型抗體(見，例如，Greenspan&Bona,1993,FASEB J.7(5):437-444；和Nissinoff,1991，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)147(8):2429-2438)。例如，結(jié)合于p101調(diào)控亞基并且競爭性抑制催化亞基與p101調(diào)控亞基結(jié)合的抗體可用于產(chǎn)生“模擬”p101調(diào)控亞基并且因此結(jié)合和中和催化亞基的抗獨(dú)特型抗體。這些中和抗獨(dú)特型或這些抗獨(dú)特型的Fab片段的抗體可在治療方案中使用以中和催化亞基并且減輕炎癥。5.4造血細(xì)胞激活紊亂的診斷運(yùn)用多種方法診斷性和預(yù)后性評價造血譜系細(xì)胞激活紊亂，包括炎性紊亂以及對這些疾病傾向的病人的鑒定。
這些方法可以例如使用諸如上述的p101和p120核苷酸序列以及5.3部分中所述的p101調(diào)控亞基和p120抗體的試劑。特別的是，這些試劑可用于例如(1)檢測p101或p120基因突變的出現(xiàn)，或檢測與非造血譜系細(xì)胞激活紊亂狀態(tài)相關(guān)的p101或p120mRNA的過度或者低下表達(dá)；(2)檢測與非造血譜系細(xì)胞激活紊亂狀態(tài)相關(guān)的p101或p120基因產(chǎn)物的過度或者低下冗余(under-abundance)；以及(3)檢測由p101調(diào)控亞基和p120催化亞基介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑中的干擾或異常。
此處描述的方法可通過例如使用含至少一種特異性p101或p120核苷酸序列或此處描述的p101或p120調(diào)控亞基抗體試劑的預(yù)先包裝的診斷試劑盒來進(jìn)行，此試劑盒可很方便地用在例如臨床設(shè)備中以診斷呈現(xiàn)造血譜系細(xì)胞激活紊亂異常的病人。
為檢測p101或p120突變，可用任何有核細(xì)胞作為基因組核酸的起始來源。為檢測p101或p120基因表達(dá)或p101或p120基因產(chǎn)物，可運(yùn)用其中表達(dá)p101或p120基因的任一細(xì)胞類型或組織例如，嗜中性粒細(xì)胞。
基于核酸的檢測技術(shù)在以下5.4.1部分描述。肽檢測技術(shù)在以下5.4.2部分描述。5.4.1 p101基因和轉(zhuǎn)錄物的檢測可使用很多技術(shù)檢測p101或p120基因內(nèi)的突變?？捎萌魏斡泻思?xì)胞的核酸作為這些分析技術(shù)的起點(diǎn)，并且那些本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的標(biāo)準(zhǔn)核酸制備步驟進(jìn)行分離。
可在生物樣品的雜交或擴(kuò)增分析中使用DNA以檢測有關(guān)基因結(jié)構(gòu)的異常，包括點(diǎn)突變、插入、缺失和染色體重排。這些分析包括但不限于Southern分析，單鏈構(gòu)象多形態(tài)分析(SSCP)以及PCR分析。
檢測p101或p120基因特異性突變的這些診斷方法可包括例如在適宜于這些試劑和在p101或p120基因內(nèi)它們的互補(bǔ)序列特異性退火的條件下，用一種或多種核酸反應(yīng)物包括重組DNA分子、克隆的基因或其簡并性變異體接觸并培養(yǎng)得自樣品例如得自病人的樣品或其它合適的細(xì)胞來源的核酸包括上述的重組DNA分子、克隆的基因或它們的簡并性變異體。優(yōu)選的，這些核苷酸反應(yīng)物長度至少為15到30個核苷酸。溫育后，從核酸分子雜合體中除去所有未退火的核酸。然后檢測這種已雜交的核苷酸分子，如果有任何這樣的分子存在的話。使用這樣的檢測方案，得自目標(biāo)細(xì)胞類型或組織的核酸被固定于例如固態(tài)支持物(諸如膜或如微孔板或聚苯乙烯珠)上的塑料表面。在這種情況下，溫育后，很易除去上述類型的未退火的標(biāo)記的核苷酸反應(yīng)物。用本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成剩余的退火的標(biāo)記的p101或p120核酸反應(yīng)物的檢測。核酸反應(yīng)物所退火結(jié)合的p101或p120基因序列可與正?；蛐蛄蓄A(yù)期的退火模式作比較以確定是否存在基因突變。
用于在病人樣品或其它合適細(xì)胞來源中檢測p101或p120基因特異性核酸分子的替代診斷方法可包括它們的擴(kuò)增，例如通過PCR(實驗實施方案列于Mullis,K.B.,1987,U.S.專利4,683,202)，其后使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的技術(shù)檢測擴(kuò)增的分子。如果被擴(kuò)增的核酸僅含p101或p120基因的正?？截悾玫臄U(kuò)增序列可與預(yù)期的那些作比較以確定是否存在基因突變。
另外，使用眾所周知的基因分型技術(shù)以鑒定帶有p101或p120基因突變的個體。這些技術(shù)包括例如限制性片段長度多形體(RFLP)的使用，此多形體包括與使用的特異性限制酶識別位點(diǎn)之一中的序列變異。
通過檢測和測定p101或p120轉(zhuǎn)錄也可分析p101或p120基因表達(dá)的水平。例如，得自已知或懷疑表達(dá)p101或p120基因的細(xì)胞類型或組織諸如造血譜系細(xì)胞，尤其是骨髓細(xì)胞和血小板的RNA可運(yùn)用上述的雜交或PCR技術(shù)來分離和檢測。分離的細(xì)胞來源于細(xì)胞培養(yǎng)物或病人。取自培養(yǎng)物的細(xì)胞的分析是評價用作基于細(xì)胞的基因治療技術(shù)的一部分或檢測化合物對p101或p120基因表達(dá)的影響中的必需步驟。這些分析可揭示p101或p120基因表達(dá)模式的質(zhì)量和數(shù)量，包括p101或p120基因表達(dá)的激活或失活。5.4.2p101基因產(chǎn)物的檢測以上5.3部分描述的針對野生型或突變p101或p120基因產(chǎn)物或保守的變異體或其肽片段的抗體也可用作此處所述的造血譜系細(xì)胞激活紊亂的診斷和預(yù)后。這些診斷方法可用于檢測p101或p120基因表達(dá)水平的異?；蛴糜跈z測p101調(diào)控亞基的結(jié)構(gòu)和/或暫時的組織、細(xì)胞或亞細(xì)胞位置的異常，并且可在體內(nèi)或體外進(jìn)行例如在活檢組織上。
待分析的組織或細(xì)胞類型一般包括那些已知或懷疑含表達(dá)p101或p120基因的細(xì)胞，如滲入炎性組織的嗜中性粒細(xì)胞。此處運(yùn)用的蛋白分離方法可以是例如Harlow和Lane所述的那些方法(Harlow,E.和Lane,D.,1988.“抗體實驗室手冊”。冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)。此處全文引入作為參考。分離的細(xì)胞可來源于細(xì)胞培養(yǎng)物或病人。取自培養(yǎng)物的細(xì)胞分析在評價用作基于細(xì)胞的基因治療技術(shù)或者檢測化合物對p101或p120基因表達(dá)的影響的細(xì)胞中為必需步驟。
例如，用于本發(fā)明中的諸如以上5.3部分所述的抗體或抗體片段可用于在定性或定量檢測是否存在p101或p120基因產(chǎn)物或其保守的變異體或它們的肽片段。例如可通過應(yīng)用熒光標(biāo)記的抗體(見此部分以下)結(jié)合光學(xué)顯微鏡、細(xì)胞流式測量術(shù)或熒光測量檢測的免疫熒光技術(shù)來完成。
為原位檢測p101或p120基因產(chǎn)物或保守的變異體或其肽片段或為檢測催化亞基的結(jié)合(在標(biāo)記的催化亞基融合蛋白情況下)，本發(fā)明中有用的抗體(或它們的片段)或融合的或連接的蛋白可額外地在組織學(xué)上用于免疫熒光、免疫電子顯微鏡或非免疫分析。
從病人取得組織學(xué)樣品并且還應(yīng)用本發(fā)明標(biāo)記的抗體或融合蛋白完成原位檢測。優(yōu)選的通過在生物學(xué)樣品上覆蓋標(biāo)記的抗體(或片段)的方式應(yīng)用抗體(或片段)或融合蛋白。在這個方法使用過程中，不僅可以確定p101或p120基因產(chǎn)物或保守變異體或肽片段的存在也可確定它在所檢測的組織中的分布。使用本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以看出可改造多種組織學(xué)方法(諸如染色步驟)的任一種以實現(xiàn)樣品的原位檢測。
p101或p120基因產(chǎn)物或保守變異體或它們的肽片段的免疫分析和非免疫分析典型地包括溫育樣品，諸如生物學(xué)液體、組織提取物、新收集的細(xì)胞和在可檢出的能鑒定p101或p120基因產(chǎn)物或保守變異體或它們的肽片段的標(biāo)記的抗體存在下培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞裂解產(chǎn)物以及通過任何一種本領(lǐng)域周知的方法檢測結(jié)合的抗體。
生物學(xué)樣品可拿來接觸并固定于固態(tài)支持物或載體諸如硝酸纖維素膜或能固定細(xì)胞、細(xì)胞顆?；蚩扇苄缘鞍椎钠渌滔嘀С治锷稀Ｈ缓笥煤线m緩沖液清洗支持物，之后用可檢測到的標(biāo)記的p101調(diào)控亞基或p120亞基抗體或融合蛋白處理。用緩沖液第二次沖洗固相支持物以除去未結(jié)合的抗體或融合蛋白。然后用傳統(tǒng)方法檢測固相支持物上結(jié)合的標(biāo)記量。
“固相支持物或載體”意在包含任何能結(jié)合抗原或抗體的支持物。眾所周知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖以及磁鐵礦。用于本發(fā)明目的的載體特性可以是某些程度可溶或不溶。支持材料實際上可有任何可能的結(jié)構(gòu)形狀，只要偶聯(lián)的分子能和抗原或抗體結(jié)合。這樣，支持物的形狀可為圓球形如珠中、圓柱形，如試管內(nèi)表面或桿的外表面上。另外，表面可為平的例如片狀，試驗條狀等等。優(yōu)選的支持物包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道或能通過使用常規(guī)實驗確定許多其它適合結(jié)合抗體或抗原的載體。
根據(jù)眾所周知的方法確定給定的許多p101調(diào)控亞基或p120亞基抗體或融合蛋白的結(jié)合活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定通過常規(guī)實驗方法各自確定有效的和最佳分析條件。
就抗體而言，抗體被可檢測標(biāo)記的方法之一為將抗體和一種酶連接并用于酶免疫分析(EIA)(Voller，“酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)”1978，診斷水平2:1-7，微生物學(xué)聯(lián)合季刊出版物，Walkersville,MD)；Voller等，1978，臨床病理學(xué)雜志，31:507-520；Butler,1981，酶學(xué)方法，73:482-523；Maggio(編)1980，酶免疫分析，CRC出版社，BocaRaton,FL；Ishikawa等(編)1981，酶免疫分析，Kgaku Shoin，東京)。與抗體結(jié)合的酶將與合適的底物反應(yīng)，優(yōu)選的是產(chǎn)色底物，其反應(yīng)方式如產(chǎn)生通過例如色譜法、熒光法或通過可見方法可檢測的化學(xué)部分。用于可檢測性標(biāo)記抗體的酶包括但不限于蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酶、Δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶以及乙酰膽堿酯酶。通過應(yīng)用酶的產(chǎn)色底物的比色法完成檢測。也可通過與相似地制備的標(biāo)準(zhǔn)相比較的底物酶反應(yīng)程度的可見比較完成檢測。
使用各種其它任一免疫分析也可完成檢測。例如，通過放射性標(biāo)記抗體或抗體片段，可通過放射免疫分析檢測(RIA)(見，例如，Weintraub,B.放射免疫分析原理，放射性配體分析技術(shù)第七期訓(xùn)練班，內(nèi)分泌學(xué)會，1986，此處引入作為參考)p101調(diào)控亞基。放射性同位素可通過諸如使用γ-計數(shù)器或閃爍計或放射自顯影的方法檢測。
也可用熒光化合物標(biāo)記抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體暴露于合適波長的光時，因熒光可檢測抗體的存在。最經(jīng)常使用的熒光標(biāo)記化合物有異硫氰酸熒光素、若丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白以及熒光胺。
使用產(chǎn)熒光性金屬諸如152Eu或鑭系的其它金屬也可將抗體可檢測地標(biāo)記。使用諸如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金屬螯合基團(tuán)可將這些金屬連于抗體上。
還可通過將其偶聯(lián)于化學(xué)發(fā)光化合物上可檢測地標(biāo)記抗體。然后檢測化學(xué)反應(yīng)過程中存在產(chǎn)生的發(fā)光確定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體的存在。尤其有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實例有魯米諾、異魯米諾，theromatic吖啶鎓酯，咪唑，吖啶鎓鹽以及草酸酯。
相似地，生物發(fā)光化合物可用于標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光化合物是在生物體系中發(fā)現(xiàn)的一類化學(xué)發(fā)光物，其中催化性蛋白增加了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。通過檢測發(fā)光檢測生物發(fā)光蛋白質(zhì)的存在。重要的用于標(biāo)記的生物發(fā)光化合物有熒光素、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。5.5調(diào)節(jié)G-蛋白激活的PI3K的表達(dá)或活性的化合物的篩選實驗設(shè)計以下實驗用于鑒定下列化合物，與p101調(diào)控亞基或p120催化亞基相互作用(例如，結(jié)合)的化合物，與一些與p101調(diào)控亞基和/或p120催化亞基相互作用(例如，結(jié)合)的胞內(nèi)蛋白相互作用的化合物，干擾p101調(diào)控亞基與p120催化亞基或與其它參與G蛋白刺激的PI3K介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的胞內(nèi)蛋白的相互作用的化合物，和調(diào)節(jié)p101或p120基因活性(例如，調(diào)節(jié)p101或p120基因表達(dá)水平)或調(diào)節(jié)p101或p120的水平的化合物。另外可能用到可以鑒定結(jié)合于p101或p120基因調(diào)控序列(例如，啟動子序列)和鑒定調(diào)節(jié)p101或p120基因表達(dá)的化合物的實驗。見例如，Platt,K.A.,1994，生物化學(xué)雜志269:28558-28562，在此全文引入作為參考。
依照本發(fā)明篩選的化合物包括但不限于與p101調(diào)控亞基或p120催化亞基結(jié)合并且模擬天然配體激活活性(例如，激動劑)或者抑制天然配體激活活性(即，拮抗劑)的肽、抗體及其片段、前列腺素、脂質(zhì)、其它有機(jī)化合物(即，萜二醇，擬肽(peptidomimetics))；以及模擬p101調(diào)控亞基或p120催化亞基(或其一部分)并且結(jié)合以及“中和”天然配體的肽、抗體或其片段。
這樣的化合物包括但不限于肽，如可溶性肽；包括但不限于隨機(jī)肽文庫的成員(見例如，Lam,K.S.等，1991，自然354:82-84；Houshten,R.等，1991，自然354:84-86)，以及由D-和/或L-構(gòu)型氨基酸組成的來自組合化學(xué)的分子文庫肽、磷酸肽(包括，但不限于隨機(jī)或部分簡并性，指導(dǎo)磷酸肽文庫的成員；見例如，Songyang,Z.等，1993，細(xì)胞72:767-778)；抗體(包括但不限于多克隆、單克隆、人源化、抗獨(dú)特型、嵌合的或單鏈抗體，及FAb、F(ab′)2和FAb表達(dá)文庫片段及其表位結(jié)合片段)；以及小的有機(jī)或無機(jī)分子。
依據(jù)本發(fā)明篩選的其它化合物包括但不限于能進(jìn)入合適細(xì)胞(例如，嗜中性粒細(xì)胞)并且影響p101或p120基因或其它一些參與p101調(diào)控亞基信號傳導(dǎo)途徑(例如，通過與調(diào)控區(qū)域或參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用)的基因的表達(dá)的小有機(jī)分子；或影響p101調(diào)控亞基活性，例如通過抑制或增強(qiáng)p101與PI3K的催化亞基結(jié)合或p101與其它一些參與p101調(diào)控亞基信號傳導(dǎo)途徑的細(xì)胞內(nèi)因子諸如Gβγ結(jié)合的化合物。
計算機(jī)模擬和檢索技術(shù)允許鑒定化合物，或改善已鑒定的化合物，其中這些化合物能調(diào)節(jié)p101調(diào)控亞基或p120催化亞基表達(dá)或活性。鑒定這樣的化合物或組合物后，鑒定活性位點(diǎn)或區(qū)域。這樣的活性位點(diǎn)典型的是結(jié)合伴侶位點(diǎn)，諸如，p120催化亞基與p101調(diào)控亞基自身的相互作用結(jié)構(gòu)域。使用本領(lǐng)域中公知的方法包括，例如從肽的氨基酸序列，從核酸的核苷酸序列，或從帶有自然配體的相關(guān)化合物或組合物復(fù)合物的研究鑒定活性位點(diǎn)。在后一種情況下，可用化學(xué)或X-射線結(jié)晶法通過尋找因子上發(fā)現(xiàn)復(fù)合配體的地方發(fā)現(xiàn)活性位點(diǎn)。
其次，確定活性位點(diǎn)的三維幾何結(jié)構(gòu)。這可以通過已知的方法包括能確定完整分子結(jié)構(gòu)的X-射線結(jié)晶法。另一方面，可用固相或液相NMR確定一定的內(nèi)分子距離。可用確定結(jié)構(gòu)的任何其它實驗方法得到部分或完整的幾何結(jié)構(gòu)。可用天然的或人工的復(fù)合配體測定幾何結(jié)構(gòu)，這可提高確定的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。
如果確定了不完全的或不夠準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)，可使用基于數(shù)字模擬的計算機(jī)方法完成其結(jié)構(gòu)或提高其準(zhǔn)確性?？墒褂萌魏巫R別模型，包括特異于特定的生物多聚體諸如蛋白質(zhì)或核酸的參數(shù)化模型，基于計算分子運(yùn)動的分子動力學(xué)模型，基于熱集合的統(tǒng)計力學(xué)模型或組合模型。對于大多數(shù)模型種類需要代表組成原子和基團(tuán)之間力的標(biāo)準(zhǔn)分子力場，并且可從物理化學(xué)中已知的力場選擇。不完全的或不太準(zhǔn)確的實驗結(jié)構(gòu)可作為用這些模型方法得到完全和較準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)的約束。
最后，或通過實驗性地或通過模擬或通過組合確定活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)后，搜尋含有化合物以及有關(guān)它們分子結(jié)構(gòu)信息的數(shù)據(jù)庫鑒定候選的調(diào)節(jié)化合物。這樣的搜尋尋找有與所確定的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)相匹配的并且與所定義的活性位點(diǎn)的基團(tuán)相互作用的化合物。這樣的搜尋可以是人工的，但優(yōu)選計算機(jī)輔助的。從此研究發(fā)現(xiàn)的這些化合物為潛在的G蛋白激活的PI3K調(diào)節(jié)化合物。
另外，這些方法可用于鑒定從已知調(diào)控化合物或配體改進(jìn)的調(diào)控化合物。已知化合物的組分可被修飾并且使用應(yīng)用于新組合物的上述實驗和計算機(jī)模擬方法確定修改的結(jié)構(gòu)效應(yīng)。然后改變的結(jié)構(gòu)與化合物的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)相比較以確定是否發(fā)生改進(jìn)的相互配合或相互作用。在這種方法中諸如通過改變側(cè)基能很快評價組分中的系統(tǒng)性改變以得到提高特異性或活性的修飾過的調(diào)控配體。
對于鑒定基于p120催化亞基、p101調(diào)控亞基和相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子的活性位點(diǎn)的確定的調(diào)節(jié)化合物有用的進(jìn)一步實驗和計算機(jī)模擬方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
分子模擬系統(tǒng)的例子為CHARMm和QUANTA程序(Polygen公司，Waltham,MA)。CHARMm行使能量最小化和分子動力學(xué)功能。QUANTA進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)構(gòu)建、圖示模型及分析。QUANTA允許分子之間相互行為作用的相互作用構(gòu)建、修飾、可見化和分析。
許多文章綜述了與特定蛋白相互作用的藥物的計算機(jī)模擬，諸如Rotivinen等，1988,Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166；Ripka，新科學(xué)家(New Scientist)54-57(6月16,1988)；McKinaly和Rossmann,1989,Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29:111-122；Perry和Davies，藥物設(shè)計中的定量結(jié)構(gòu)活性關(guān)系(QSAR:Quantitative Stucture-ActivityRelationships in Drug Design)PP.189-193(Alzn R.Liss,Inc.1989)；Lewis和Dean,1989,Proc.R.Soc.Lond.236:125-140和141-162；以及關(guān)于核酸組分的模型受體，Askew等，1989，美國化學(xué)學(xué)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)111:1082-1090。篩選和圖示描述化學(xué)物質(zhì)的其它計算機(jī)程序可得自諸如BioDesign,Inc.(Pasadena,CA.),Allelix,Inc.(Mississauga,Ontario，加拿大)，以及Hypercube,Inc.(Cambridhe,Ontario)等公司。盡管這些最初是為應(yīng)用于針對特定蛋白的藥物，一旦DNA或RNA區(qū)域被鑒定，它們就可被改造以適合于設(shè)計針對此DNA或RNA區(qū)域的藥物。
盡管上述涉及到能改變結(jié)合的化合物的設(shè)計和產(chǎn)生，一種作為抑制劑或激動劑的化合物也能從已知化合物包括天然產(chǎn)物或合成化學(xué)物質(zhì)以及生物學(xué)活性物質(zhì)(包括蛋白質(zhì))的文庫中篩選。
通過諸如此處描述的那些分析鑒定的化合物可能用于例如詳盡闡述p101或p120基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能以及用于改善造血譜系細(xì)胞激活紊亂。下面5.54部分中討論了為檢測例如通過諸如5.5.1到5.5.1部分描述的那些技術(shù)鑒定的化合物的有效性的分析方法。5.5.1結(jié)合于p101調(diào)控亞基的化合物的體外篩選實驗設(shè)計體外系統(tǒng)以鑒定能與p101調(diào)控亞基或p120催化亞基相互作用(例如，結(jié)合)的化合物。被鑒定的化合物可用于例如調(diào)節(jié)野生型和/或突變型p101或p120基因產(chǎn)物活性；也可用于為鑒定破壞正常p101調(diào)控亞基/催化亞基相互作用的化合物的篩選；或用于鑒定它們自身破壞這樣的相互作用。
用于鑒定與p101調(diào)控亞基結(jié)合的化合物的實驗原理包含在足夠允許p101調(diào)控亞基與受試化合物相互作用和結(jié)合的條件和時間下制備兩種成分的反應(yīng)混合物，這樣在反應(yīng)混合物中形成可被去除和/或被檢測的復(fù)合物。所使用的p101調(diào)控亞基種類取決于篩選實驗的目的。例如，全長p101調(diào)控亞基，或含融合進(jìn)在實驗系統(tǒng)中(例如，所得的復(fù)合物的標(biāo)記、分離等等)提供便利的蛋白質(zhì)或多肽的p101調(diào)控亞基的融合蛋白均可用于尋找天然配體的激動劑。
可用各種方法進(jìn)行篩選實驗。例如，進(jìn)行這種鑒定的一種方法包含在固相上錨定p101調(diào)控亞基蛋白、多肽、肽或融合蛋白或受試底物并且檢測反應(yīng)末期錨定在固相上的p101調(diào)控亞基/受試化合物復(fù)合物。在這樣的方法的一種實施方案中，p101調(diào)控亞基反應(yīng)物可被錨定在固體表面上，并且未被錨定的受試化合物可被直接或間接標(biāo)記。在此方法的另一實施方案中，錨定在固相上的p101調(diào)控亞基蛋白與標(biāo)記的催化亞基諸如p120形成復(fù)合物。然后，即可進(jìn)行受試化合物破壞p101/p120復(fù)合物結(jié)合的能力的分析實驗。
在實踐中，微孔板可很方便地用作固相。可由非共價或共價吸附固定錨定的組分。用蛋白質(zhì)溶液簡單包被在固體表面并且干燥可完成非共價吸附。另外，對被固定的蛋白質(zhì)有特異性的固定化抗體，優(yōu)選單克隆抗體可用于將蛋白質(zhì)錨定在固體表面。固體表面可提前制備并貯存。
為了進(jìn)行鑒定，未固定的組分加到含有錨定組分的包被的表面。反應(yīng)結(jié)束后，在形成的任何復(fù)合物均可在固體表面保持固定的條件下去除未反應(yīng)組分(例如，通過清洗)。可用很多方法完成對錨定在固體表面的復(fù)合物的檢測。若未固定組分是預(yù)先標(biāo)記過的，固定在表面的標(biāo)記的檢出即提示形成了復(fù)合物。如未預(yù)標(biāo)記未固定組分，可用一種間接標(biāo)記的方法檢測錨定在表面上的復(fù)合物，例如，使用對未固定組分特異性的標(biāo)記過的抗體(抗體可依次用標(biāo)記的抗Ig抗體直接標(biāo)記或間接標(biāo)記)。
另外，可在液相中進(jìn)行反應(yīng)，從未反應(yīng)組分分離反應(yīng)產(chǎn)物并且檢測復(fù)合物；例如，使用針對p101調(diào)控亞基蛋白、多肽、肽或融合蛋白或催化亞基蛋白或融合蛋白、或受試化合物的一種固定化抗體錨定溶液中形成的任何復(fù)合物以及使用針對可能的復(fù)合物的其它組分的標(biāo)記抗體以檢測錨定的復(fù)合物。5.5.2與p101或p120蛋白質(zhì)相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白的鑒定合適檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的任何方法均被用于鑒定和p101調(diào)控亞基和/或p120催化亞基相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)方法中可使用的有共免疫沉淀、交聯(lián)以及通過梯度或色譜柱對細(xì)胞裂解物或得自細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)和裂解物中與p101調(diào)控亞基相互作用的待鑒定的蛋白質(zhì)及p101調(diào)控亞基蛋白質(zhì)的共純化。對于這些實驗，使用的p101調(diào)控亞基組分可為全長p101調(diào)控亞基或截短的肽。相似地，組分可為p120催化亞基或p101調(diào)控亞基和p120催化亞基的復(fù)合物。一旦被分離，這樣的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)可被鑒定并且結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)反過來用于鑒定與其相互作用的蛋白質(zhì)。例如，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)諸如通過Edman降解技術(shù)(見，例如，Creighton,1983，《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子機(jī)理》(“Proteins:Stuctures and Molecular Principles”)W.H.Freeman &Co.N.Y.,PP.34-39)確定與p101調(diào)控亞基、PI3K(p101/p120復(fù)合物)或p120催化亞基相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸序列的至少一部分。得到的氨基酸序列可用作用于篩選編碼這樣的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因序列的寡核苷酸混合物生產(chǎn)的指導(dǎo)。例如通過標(biāo)準(zhǔn)雜交或PCR技術(shù)完成篩選。產(chǎn)生寡核苷酸混合物和篩選的技術(shù)是眾所周知的(見，例如，Ausubel，出處同前，《PCR方法方法與應(yīng)用指南》(PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications),1990,Innis,M.Et等編.Academic出版社，Inc.,紐約)。
另外，可應(yīng)用同時鑒定編碼與p101調(diào)控亞基和/或p120催化亞基和/或PI3K相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因的方法。這些方法包括，例如，探查表達(dá)(probing expression)、文庫、以與眾所周知的λgt11文庫抗體探查技術(shù)相似的方式，使用標(biāo)記的p101調(diào)控亞基蛋白質(zhì)或p101調(diào)控亞基多肽、肽或融合蛋白，例如，p101調(diào)控亞基多肽或融合進(jìn)一種標(biāo)記(例如酶、熒光、發(fā)光蛋白質(zhì)或染料)的p101調(diào)控亞基結(jié)構(gòu)域，或Ig-Fc結(jié)構(gòu)域。
一種體內(nèi)檢測蛋白質(zhì)相互作用的方法，雙雜交系統(tǒng)在此詳盡描述，其僅僅為了說明而不意在限制。此系統(tǒng)的一個版本已被描述并且可從Clontech(Palo Alto,CA)購得。
簡而言之，使用這樣的系統(tǒng)，構(gòu)建編碼兩種雜合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒一種質(zhì)粒包括編碼融合進(jìn)編碼p101調(diào)控亞基、p101調(diào)控亞基多肽、肽或融合蛋白的p101核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄激活子蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸，另一種質(zhì)粒包括編碼融合進(jìn)一種cDNA的轉(zhuǎn)錄激活子蛋白的激活結(jié)構(gòu)域的核苷酸，此cDNA編碼已被重組進(jìn)此質(zhì)粒作為cDNA文庫一部分的未知蛋白質(zhì)。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合質(zhì)粒和cDNA文庫被轉(zhuǎn)化進(jìn)含有一種報告基因(例如，HBS或LacZ)的酵母啤酒酵母(Saccharomycescerevisae)中。該報告基因其調(diào)節(jié)區(qū)域含轉(zhuǎn)錄激活子的結(jié)合位點(diǎn)。任何一種雜合蛋白單獨(dú)不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄；DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜合體不能激活是因為它不提供激活功能；并且激活結(jié)構(gòu)域雜合體不能激活是因為它不能定位于激活子的結(jié)合位點(diǎn)。兩個雜合體蛋白質(zhì)的相互作用重新組成有功能的激活子蛋白質(zhì)并且導(dǎo)致報告基因的表達(dá)，這可以通過分析報告基因產(chǎn)物的實驗檢測。
雙雜交系統(tǒng)或相關(guān)方法學(xué)均可用于篩選激活結(jié)構(gòu)域文庫以得到與“誘餌”基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)。通過舉例而不意在限制的方式，P101調(diào)控亞基可用作誘餌基因產(chǎn)物?？偟幕蚪M或cDNA序列被融合進(jìn)編碼一種激活結(jié)構(gòu)域的DNA中。此文庫和編碼融合進(jìn)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的誘餌p101基因產(chǎn)物雜合體的質(zhì)粒被共轉(zhuǎn)化進(jìn)一種酵母報告株，并且從中篩選表達(dá)報告基因的那些轉(zhuǎn)化體。例如，不意在限制的，如圖1中描述的誘餌p101基因序列諸如p101(或p101的結(jié)構(gòu)域)的開放閱讀框可被克隆進(jìn)一種載體中，以使載體通過翻譯被融合進(jìn)編碼GAL4蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA中。純化這些克隆并且分離負(fù)責(zé)報告基因表達(dá)的文庫質(zhì)粒。然后用DNA測序鑒定文庫質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)。
使用本領(lǐng)域中常規(guī)運(yùn)用的方法建立細(xì)胞系的cDNA文庫，由此檢測與誘餌p101基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)。根據(jù)此處描述的特定系統(tǒng)，例如將cDNA片段插入載體以使它們通過翻譯被融合進(jìn)GAL4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。此文庫可與誘餌p101基因-GAL4融合質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)含有由帶GAL4激活序列的啟動子驅(qū)動的LacZ基因的酵母株。cDNA編碼的蛋白質(zhì)(其融合進(jìn)與誘餌p101基因產(chǎn)物相互作用的GAL4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。)重組成活性GAL4蛋白質(zhì)并且因此驅(qū)使HIS3基因的表達(dá)。可通過它們在含缺乏組氨酸的半固體瓊脂基質(zhì)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上生長檢測表達(dá)HIS的克隆。然后從這些菌株純化cDNA并使用本領(lǐng)域常規(guī)運(yùn)用的技術(shù)使cDNA用于產(chǎn)生和分離誘餌p101基因-相互作用蛋白。5.5.3干擾p101調(diào)控亞基/細(xì)胞內(nèi)大分子相互作用的化合物的鑒定為此討論的目的，與p101調(diào)控亞基相互作用的大分子被稱為“結(jié)合伴侶”。這些結(jié)合伴侶可能參與p101調(diào)控亞基信號傳導(dǎo)途徑，并且因此參與造血譜系細(xì)胞激活調(diào)控p101調(diào)控亞基的作用。已知的結(jié)合伴侶為PI3K激酶的催化亞基諸如p120、p117以及某些p110蛋白。其它結(jié)合伴侶可能為激活的三聚體G蛋白諸如Gβγ亞基和/或脂質(zhì)。因此，想要鑒定干擾或破壞這樣的結(jié)合伴侶與p101之間相互作用的化合物，其可用于調(diào)節(jié)p101調(diào)控亞基活性并因此控制與p101調(diào)控亞基活性相關(guān)的造血譜系細(xì)胞激活紊亂。
用于鑒定干擾p101調(diào)控亞基與其結(jié)合伴侶或伴侶之間相互作用的化合物的實驗系統(tǒng)的基本原理包含在足夠允許5.5.1和5.5.2部分中所述的p101調(diào)控亞基蛋白、多肽、肽或融合蛋白與結(jié)合伴侶相互作用并結(jié)合，形成復(fù)合物的條件和時間下，制備含這些蛋白和結(jié)合伴侶的反應(yīng)混合物。為了檢驗化合物的抑制活性，于存在或不存在受試化合物的情況下制備反應(yīng)混合物。受試化合物可最初包括在反應(yīng)混合物中或在加入p101調(diào)控亞基一部分及其結(jié)合伴侶之后的某個時刻被加入。溫育無受試化合物或有安慰劑的對照反應(yīng)混合物。然后檢測p101調(diào)控亞基部分和結(jié)合伴侶之間形成的任何復(fù)合物。對照反應(yīng)中而不是含受試化合物的反應(yīng)混合物中復(fù)合物的形成提示化合物干擾p101調(diào)控亞基蛋白與相互作用的結(jié)合伴侶之間的相互作用。另外，含受試化合物和正常p101調(diào)控亞基蛋白的反應(yīng)混合物內(nèi)復(fù)合物的形成也與含受試化合物和突變的p101調(diào)控亞基的反應(yīng)混合物內(nèi)復(fù)合物的形成相比較。在想要鑒定破壞突變的而不是正常的p101調(diào)控亞基相互作用的化合物時，此比較很重要。
干擾p101調(diào)控亞基與結(jié)合伴侶之間相互作用的化合物的鑒定可以異源性或同源性方式進(jìn)行。異源性鑒定包含將p101調(diào)控亞基一部分產(chǎn)物或結(jié)合伴侶錨定到固相上以及檢測反應(yīng)末期錨定在固相上的復(fù)合物。在同源性鑒定中，全部反應(yīng)在液相中進(jìn)行。任一種方法中，可改變反應(yīng)物加入的順序以得到關(guān)于受試化合物的不同信息。例如，通過競爭干擾相互作用的受試化合物可通過在受試物質(zhì)存在下進(jìn)行反應(yīng)來鑒定；即，通過在加p101調(diào)控亞基一部分和相互作用的結(jié)合伴侶之前或同時將受試物質(zhì)加入反應(yīng)混合物中。另一可選的方法是，破壞預(yù)先形成復(fù)合物的受試化合物，例如有較高結(jié)合常數(shù)可取代復(fù)合物成分之一的化合物，可通過形成復(fù)合物后將受試化合物加入反應(yīng)混合物中進(jìn)行檢測。以下簡短描述不同的格式。
異源性鑒定體系中，將p101調(diào)控亞基一部分或相互作用的結(jié)合伴侶錨定在固體表面上，同時直接或間接標(biāo)記未錨定的物種。實踐中，可很方便地使用微孔板。通過非共價或共價吸附固定錨定物種。簡單地在固體表面鋪p101或p120基因產(chǎn)物或結(jié)合伴侶的溶液并干燥可完成非共價吸附。另一可選的方法是，可用針對被固定物種的固定化抗體將物種固定在固體表面。提前制備表面并貯存。
為進(jìn)行鑒定，將固定化物種的伴侶暴露于有或無受試化合物的包被表面。反應(yīng)結(jié)束后，除去未反應(yīng)組分(例如，通過清洗)并且形成的任何復(fù)合物將保持固定在固體表面?？捎迷S多方法完成錨定在固體表面上化合物的檢測。對于預(yù)先標(biāo)記的未固定物種，檢測到固定在表面上標(biāo)記提示形成了復(fù)合物。對于沒有預(yù)先標(biāo)記的固定物種，可用間接標(biāo)記以檢測錨定在表面上的復(fù)合物；例如，使用對起初未固定物種特異的標(biāo)記抗體(用標(biāo)記的抗-Ig抗體依次直接標(biāo)記或間接標(biāo)記抗體)。依賴加入反應(yīng)組分的順序，可檢測抑制復(fù)合物形成或破壞預(yù)先形成復(fù)合物的受試化合物。
另一可選的方法是。在有或無受試化合物存在下在液相中進(jìn)行反應(yīng)，從未反應(yīng)組分中分離反應(yīng)產(chǎn)物，并且檢測復(fù)合物；例如，使用對錨定溶液中形成的任何復(fù)合物的結(jié)合組分之一有特異性的抗體，以及對檢測錨定的復(fù)合物的其它伴侶特異性的標(biāo)記抗體。再次，依賴將反應(yīng)物加入液相的順序，鑒定抑制復(fù)合物或破壞預(yù)先形成的復(fù)合物的受試化合物。
在本發(fā)明另一實施方案中，可使用同源性鑒定。此方法中，制備預(yù)先形成的p101調(diào)控亞基一部分與相互作用的結(jié)合伴侶的復(fù)合物，其中或p101調(diào)控亞基或其結(jié)合伴侶被標(biāo)記，但標(biāo)記產(chǎn)生的信號因復(fù)合物的形成被淬滅(見，例如，為免疫分析使用此方法的Rubenstein的美國專利號4,109,496)。與其競爭且置換得自預(yù)先形成的復(fù)合物的物種之一的受試物質(zhì)的加入將導(dǎo)致背景上信號的產(chǎn)生。以此方法，可鑒定破壞p101調(diào)控亞基/細(xì)胞內(nèi)結(jié)合伴侶相互作用的受試物質(zhì)。
在一特定的實施方案中，可制備p101調(diào)控亞基的融合蛋白用于固定。例如，使用融合質(zhì)粒如pGEX-5X-1將p101調(diào)控亞基或肽片段，(例如，相應(yīng)于CD)，融合進(jìn)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因，以此在得到的融合蛋白中維持其結(jié)合活性。使用本領(lǐng)域中以及以上5.3部分描述的常規(guī)使用方法純化相互作用的結(jié)合伴侶并用于產(chǎn)生單克隆抗體。例如通過本領(lǐng)域中常規(guī)使用的方法用放射性同位素125I標(biāo)記此抗體。在異源性鑒定中，例如GST-p101調(diào)控亞基融合蛋白可被錨定在谷胱甘肽-瓊脂糖珠上。然后以允許相互作用和結(jié)合發(fā)生的方式在有或無受試化合物時加入相互作用的結(jié)合伴侶。反應(yīng)階段的后期，清洗除去未結(jié)合的物質(zhì)，并且將標(biāo)記的單克隆抗體加入系統(tǒng)中并允許與復(fù)合物的組分結(jié)合。p101或p120基因產(chǎn)物與相互作用的結(jié)合伴侶之間的相互作用可通過測定保持與谷胱甘肽-瓊脂糖珠結(jié)合的放射性量而檢測。受試化合物對相互作用的成功抑制將導(dǎo)致測定的放射性降低。
另一可選的方法是，在無固態(tài)谷胱甘肽-瓊脂糖珠存在下，GST-p101調(diào)控亞基融合蛋白和相互作用的結(jié)合伴侶可在液體中一起混合。在允許的物種相互作用期間或在相互作用之后向其中加入受試化合物。然后將此混合物加入谷胱甘肽-瓊脂糖珠并且清洗除去未結(jié)合的物質(zhì)。再次通過加入標(biāo)記的抗體并測定結(jié)合于珠上的放射性檢測p101調(diào)控亞基/結(jié)合伴侶相互作用的抑制程度。
在本發(fā)明的另一實施方案中，使用相應(yīng)于p101調(diào)控亞基和/或相互作用或結(jié)合伴侶(在結(jié)合伴侶是蛋白質(zhì)的情況下)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽片段，而不是一種或兩種全長蛋白質(zhì)，可運(yùn)用這些相同技術(shù)。本領(lǐng)域中常規(guī)使用的任何一種方法均可用于鑒定和分離結(jié)合位點(diǎn)。這些方法包括但不限于編碼其中一種蛋白質(zhì)的基因的突變并且對共免疫沉淀分析中結(jié)合的破壞進(jìn)行篩選。然后選擇編碼復(fù)合物中第二物種的基因中的補(bǔ)償突變。編碼各自蛋白質(zhì)基因的序列分析揭示了相應(yīng)于參與相互作用的結(jié)合的蛋白質(zhì)區(qū)域的突變。另一可選的方法是，使用上述的方法將一種蛋白質(zhì)錨定到固體表面并且允許其與經(jīng)蛋白水解酶諸如胰蛋白酶處理過的標(biāo)記的結(jié)合伴侶相互作用和結(jié)合。清洗后，含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的標(biāo)記的肽保持與固態(tài)物質(zhì)結(jié)合，其可被分離以及通過氨基酸測序鑒定。而且，一旦得到編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)合伴侶的基因，可構(gòu)建短基因片段以表達(dá)隨后測定結(jié)合活性并且被純化或合成的蛋白質(zhì)的肽片段。
例如，而不意在限制，通過制造GST-p101調(diào)控亞基融合蛋白質(zhì)并允許其與谷胱甘肽瓊脂糖珠結(jié)合可將p101基因產(chǎn)物錨定于如上所述的固態(tài)物質(zhì)。用放射性同位素諸如35S標(biāo)記相互作用結(jié)合伴侶，并且用蛋白水解酶諸如胰蛋白酶切割。然后將切割產(chǎn)物加到錨定的GST-p101融合蛋白中并允許結(jié)合。清洗除去未結(jié)合的肽后，洗脫代表細(xì)胞內(nèi)結(jié)合伴侶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的標(biāo)記的結(jié)合物質(zhì)，用公知的方法純化并分析其氨基酸序列。合成生產(chǎn)如此鑒定的肽或使用重組DNA技術(shù)融合進(jìn)合適的蛋白中。5.5.4改善炎性紊亂的化合物的鑒定化合物，包括但不限于通過諸如以上5.5.1到5.5.3部分中描述的那些鑒定技術(shù)鑒定的化合物，可檢測其改善免疫系統(tǒng)紊亂癥狀包括炎癥的能力。上述的分析可鑒定影響p101調(diào)控亞基活性的化合物(例如，與p101調(diào)控亞基結(jié)合、抑制天然配體的結(jié)合，以及激活信號傳導(dǎo)(激動劑)或阻斷激活(拮抗劑)，以及與p101調(diào)控亞基的天然配體結(jié)合并中和配體活性的化合物)；或影響p101或p120基因活性的化合物(通過影響p101或p120基因表達(dá)，包括影響或干擾剪接事件以調(diào)節(jié)p101調(diào)控亞基全長或截短形式的分子表達(dá)的，例如，蛋白質(zhì)或小有機(jī)分子)。然而，應(yīng)該注意此處描述的鑒定也鑒定調(diào)節(jié)p101調(diào)控亞基信號傳導(dǎo)(例如，影響下游信號傳遞事件的化合物，諸如參加傳導(dǎo)通過與p101調(diào)控亞基結(jié)合的催化亞基產(chǎn)生的PtdIns(4,5)P3信號傳導(dǎo)的活性的抑制子或增強(qiáng)子)的化合物。影響p101或p120基因和/或p101或p120基因產(chǎn)物參與的p101調(diào)控亞基信號傳導(dǎo)途徑中另一步驟的化合物的鑒定和使用，因通過影響相同途徑可調(diào)節(jié)p101調(diào)控亞基對造血譜系細(xì)胞激活紊亂發(fā)展的影響均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的化合物可用作處理造血譜系細(xì)胞激活紊亂的治療方法的一部分。
本發(fā)明包含基于細(xì)胞的和基于動物模型的鑒定以鑒定顯示改善造血譜系細(xì)胞激活紊亂癥狀的能力的化合物。這樣的基于細(xì)胞的鑒定系統(tǒng)也可用作鑒定天然配體、催化亞基包括重組或合成產(chǎn)生的催化亞基和催化亞基突變體的標(biāo)準(zhǔn)。
基于細(xì)胞的系統(tǒng)可用于鑒定起改善造血譜系細(xì)胞激活紊亂癥狀作用的化合物。這樣的細(xì)胞系統(tǒng)包括，例如表達(dá)p101和/或p120基因的重組或非重組細(xì)胞諸如細(xì)胞系。例如可使用白細(xì)胞或衍生自白細(xì)胞的細(xì)胞系。另外，基因工程改造的以表達(dá)功能性的p101/p120 PI3K并且應(yīng)答由天然配體Gβγ亞基激活的表達(dá)宿主細(xì)胞(例如，COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、Sf9細(xì)胞)，例如通過測量化學(xué)或表型改變、另一宿主細(xì)胞基因的引入、細(xì)胞內(nèi)信使水平的改變(例如，PtdIns(3,4,5)P3，等)可被用作鑒定的終點(diǎn)。
在使用這樣的細(xì)胞系統(tǒng)中，在足夠濃度和足夠在暴露的細(xì)胞中引起這樣的造血譜系細(xì)胞激活紊亂癥狀的改善的時間下，可將細(xì)胞與懷疑有改善造血譜系細(xì)胞激活紊亂癥狀能力的化合物接觸。接觸后，分析細(xì)胞以測定p101或p120基因表達(dá)的改變，例如通過分析細(xì)胞裂解物的p101或p120mRNA轉(zhuǎn)錄物(例如，通過Northern分析)或細(xì)胞中表達(dá)的p101或p120蛋白；調(diào)控或調(diào)節(jié)p101或p120基因表達(dá)的化合物是治療的有價值的候選者。另一可選的方法是，檢查細(xì)胞以確定一或多種造血譜系細(xì)胞激活紊亂樣細(xì)胞表型是否已被改變以與更正常的或更野生型的表型或更可能產(chǎn)生較低發(fā)生率或嚴(yán)重性的紊亂癥狀的表型相似。更進(jìn)一步，鑒定p101調(diào)控亞基是其一部分的信號傳導(dǎo)途徑組分的表達(dá)和/或活性，或p101調(diào)控亞基信號傳導(dǎo)途徑本身的活性。
例如，細(xì)胞接觸化合物后，分析細(xì)胞裂解物中存在的第二信使PtdIns(3,4,5)P3水平的增高，與得自未接觸的對照細(xì)胞相比較。在這些鑒定系統(tǒng)中受試化合物抑制第二信使產(chǎn)生的能力表明受試化合物抑制通過p101調(diào)控亞基激活開始發(fā)起的信號傳導(dǎo)。用陰離子交換型HPLC可很容易的分析細(xì)胞裂解物。另一可選的方法是，以如此處全文引入作為參考的如Wymann等，1987，分析生物化學(xué)，165:371-378中所述通過監(jiān)測源自辣根過氧化酶催化的魯米諾氧化化學(xué)發(fā)光分析超氧化產(chǎn)生或O2的水平。最后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)鑒定完整細(xì)胞的細(xì)胞粘附性的改變。
另外，基于包括例如小鼠的動物的造血譜系細(xì)胞激活紊亂系統(tǒng)可用于鑒定能改善造血譜系細(xì)胞激活紊亂樣癥狀的化合物。這樣的動物模型可用作鑒定在治療這樣的紊亂中有效的藥物、藥劑、療法以及干預(yù)的檢驗系統(tǒng)。例如，將懷疑有改善造血譜系細(xì)胞激活紊亂癥狀的化合物以在所接觸的動物中足以顯示改善造血譜系細(xì)胞激活紊亂癥狀的濃度和時間接觸動物模型。通過評價與造血譜系細(xì)胞激活紊亂相關(guān)的紊亂諸如炎癥的逆轉(zhuǎn)來監(jiān)測動物對接觸的反應(yīng)。至于干預(yù)，任何逆轉(zhuǎn)造血譜系細(xì)胞激活紊亂樣癥狀的任一方面的治療可被看作人造血譜系細(xì)胞激活紊亂治療干預(yù)的候選者。通過得自如下討論的劑量-反應(yīng)曲線確定受試試劑的劑量。5.6與G蛋白激活的P13K的刺激相關(guān)的疾病，包括炎性紊亂的治療本發(fā)明還包含修飾造血譜系細(xì)胞激活和處理造血譜系細(xì)胞激活紊亂，包括炎性紊亂的方法和組合物。例如通過降低p101基因表達(dá)水平和/或p101調(diào)控亞基基因活性，和/或下調(diào)p101調(diào)控亞基途徑的活性(例如，通過干擾p101調(diào)控亞基與p120催化亞基之間的相互作用，或通過以下游信號傳遞為靶的事件)，白細(xì)胞對激活三聚體G蛋白偶聯(lián)受體的因子(諸如細(xì)胞因子)的反應(yīng)可被降低并且慢性炎性紊亂的癥狀可得到改善。相反的，通過增加p101調(diào)控亞基活性可增強(qiáng)白細(xì)胞對G蛋白偶聯(lián)受體的激活的反應(yīng)。例如，這樣的增強(qiáng)可用作促進(jìn)免疫系統(tǒng)對感染的反應(yīng)。5.6.1抑制p101銜接子的表達(dá)或p101銜接子的活性以降低G蛋白激活的PI3K活性并減輕炎癥中和催化亞基或抑制p101或p120基因的表達(dá)(或者轉(zhuǎn)錄或者翻譯)的任何方法可用以減輕炎性反應(yīng)。這樣的方法可用以治療炎性反應(yīng)紊亂諸如關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、膿毒性休克、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺炎、哮喘以及其它肺部疾病、過敏、再灌注損傷、動脈粥狀硬化以及其它心血管疾病、阿爾茨海默病和癌癥，此處僅例舉了一些炎性紊亂。
在一個實施方案中，設(shè)計免疫療法以降低內(nèi)源性p101或p120基因表達(dá)水平，例如，使用反義或核酶方法以抑制或阻止p101或p120 mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯；三螺旋方法以抑制p101或p120基因的轉(zhuǎn)錄；或靶向同源重組以使p101或p120基因或其內(nèi)源性啟動子失活或“敲除”。
反義方法包含與p101或p120調(diào)控亞基mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸(或者DNA或者RNA)的設(shè)計。反義寡核苷酸與互補(bǔ)的p101或p120mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合并阻止翻譯。盡管優(yōu)選，但不必絕對互補(bǔ)。如此處提及的與一種RNA的一部分“互補(bǔ)”的序列意味著有足夠互補(bǔ)能與RNA雜交形成一種穩(wěn)定雙螺旋的序列。在雙鏈反義核酸情況下，這樣可檢測雙螺旋DNA的一條單鏈，或鑒定三螺旋形成。雜交的能力取決于互補(bǔ)的程度和反義核酸長度。通常，雜交的核酸越長，它所含的與RNA堿基的錯配就越多并且仍可形成穩(wěn)定雙螺旋(或三螺旋，如情況可能)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過使用確定雜交復(fù)合物融點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)方法確保錯配在一個可接受的程度。
互補(bǔ)于信息5′端的寡核苷酸，例如，直到并包括AUG起始密碼子的5′翻譯序列應(yīng)該在抑制翻譯中最為有效。然而，最近表明互補(bǔ)于mRNA的3′非翻譯序列在抑制mRNA的翻譯中也有效。一般見Wagner,R.,1994，自然，372:333-335。這樣，互補(bǔ)于圖1和圖3所示p101或p120的5′或3′非翻譯、非編碼區(qū)的寡核苷酸可用于抑制內(nèi)源性p101或p120 mRNA的翻譯的反義方法。與mRNA的5′非翻譯區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸應(yīng)該包括AUG起始密碼子的互補(bǔ)物?；パa(bǔ)于mRNA編碼區(qū)域的反義寡核苷酸是較低效率的翻譯抑制劑但根據(jù)本發(fā)明仍可使用。無論設(shè)計雜交于p101調(diào)控亞基mRNA的5′、3′或編碼區(qū)域，反義核酸長度至少應(yīng)該為六個核苷酸，并且優(yōu)選從6到大約50個核苷酸長度的寡核苷酸。在特殊情況下，寡核苷酸至少為10個核苷酸，或至少17個核苷酸，或至少25個核苷酸或至少50個核苷酸。
不考慮靶序列的選擇，優(yōu)選首先進(jìn)行體外研究來定量反義寡核苷酸抑制基因表達(dá)的能力。這些研究優(yōu)選使用區(qū)別于反義基因抑制和寡核苷酸的非特異性生物學(xué)效應(yīng)的對照。這些研究也優(yōu)選比較靶RNA或蛋白質(zhì)與內(nèi)在對照RNA或蛋白質(zhì)的水平。另外，可預(yù)見使用反義寡核苷酸得到的結(jié)果與使用對照寡核苷酸得到的結(jié)果進(jìn)行比較。優(yōu)選與受試寡核苷酸長度大約相同的寡核苷酸且其與反義序列的差異不超過防止特異性地雜交于靶序列必需的程度。
寡核苷酸可為單鏈的或多鏈的DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或它們的修飾版本?？稍趬A基部分、糖部分或磷酸骨架處修飾寡核苷酸，以提高例如分子、雜交等的穩(wěn)定性。寡核苷酸可包括其它附屬基團(tuán)諸如肽(例如，用于體內(nèi)定位于宿主細(xì)胞受體)，或促進(jìn)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑(見，例如，Letsinger等，1989，美國國家科學(xué)院院報86:6553-6556；Lemaitre等，1987，美國國家科學(xué)院院84:648-652；PCT公開文本W(wǎng)O88/09810,1988.12.15出版)，或雜交引發(fā)的裂解試劑(見，例如，Krol等，1988，生物技術(shù)6:958-976)，或嵌入試劑(見，例如，Zon,1988，藥學(xué)研究5:539-549)。最后，寡核苷酸可與另一分子連接，例如，肽、雜交引發(fā)的交聯(lián)試劑、轉(zhuǎn)運(yùn)試劑、雜交引發(fā)的裂解試劑，等等。
反義寡核苷酸包含至少一個修飾過的堿基部分，其選自包括但不限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-?；奏?，5-羧羥甲基尿嘧啶，5-羧甲氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲氨甲基尿嘧啶，雙氫尿嘧啶，β-D-galactosyl queosine，肌苷，N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2,2-雙甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲氨甲基尿嘧啶，5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-mannosyl queosine，5′-甲氧羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯，尿嘧啶-5-羥乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，以及2,6-雙氨基嘌呤的基團(tuán)。
反義寡核苷酸也包含至少一種修飾過的糖部分其選自包括但不限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖以及己糖的基團(tuán)。
在另一實施方案中，反應(yīng)寡核苷酸包含至少一處修飾過的磷酸骨架選自硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，氨基硫代磷酸酯，氨基磷酸鹽，二氨基磷酸鹽，甲基膦酸鹽，烷基磷酸三酯，以及formacetal或其類似物的基團(tuán)。
在又一實施方案中，反義寡核苷酸是α-異頭寡核苷酸。α-異頭寡核苷酸與和通常β-單位相反的鏈之間平行走向的互補(bǔ)RNA形成特殊的雙鏈雜合體(Gautier等，1987，核酸研究，15:6625-6641)。此寡核苷酸為2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，核酸研究15:6131-6148)，或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等，1987,FEBS Lett.215:327-330)。
本發(fā)明的寡核苷酸可通過本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成，例如，通過使用自動DNA合成儀(諸如購于Biosearch,Appiled Biosystems，等)。作為例子，硫代磷酸酯寡核苷酸可通過Stein等，1988，核酸研究，16:3209的方法來合成。使用控制的微孔玻璃多聚支持物制備甲基磷酸寡核苷酸(Sarin等，1988，美國國家科學(xué)院院報85:7448-7451)。
雖然可使用與p101或p120編碼區(qū)域序列互補(bǔ)的反義核苷酸。但優(yōu)選那些與被轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)互補(bǔ)的。
將反義分子輸運(yùn)至在體內(nèi)表達(dá)p101調(diào)控亞基的細(xì)胞，例如，造血來源的細(xì)胞諸如血小板、嗜中性粒細(xì)胞以及其它白細(xì)胞。已發(fā)展了許多方法用于將反義DNA或RNA輸運(yùn)至細(xì)胞；例如，直接將反義分子注射進(jìn)組織或細(xì)胞衍生位點(diǎn)，或全身性施用被設(shè)計定向于所期望的細(xì)胞(例如，連接于肽或針對特異性結(jié)合的受體或表達(dá)在靶細(xì)胞表面抗原的抗體的反義分子)的修飾過的反義分子。
然而，通常很難達(dá)到有效抑制內(nèi)源性mRNA翻譯的反義分子的細(xì)胞內(nèi)濃度。因此，優(yōu)選的方法使用含置于強(qiáng)polⅢ或polⅡ啟動子控制下的反義寡核苷酸的重組DNA構(gòu)建體。使用這樣的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染病人的細(xì)胞將導(dǎo)致足夠量的單鏈RNA轉(zhuǎn)錄此RNA與內(nèi)源性p101或p120轉(zhuǎn)錄物形成互補(bǔ)堿基對并且因此阻止p101或p120 mRNA的翻譯。例如，將載體在體內(nèi)導(dǎo)入以使被細(xì)胞吸收并且指導(dǎo)反義RNA的轉(zhuǎn)錄。這樣的載體保持游離著或與染色體整合，只要它能被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生所要的反義RNA?？捎帽绢I(lǐng)域中重組DNA技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建這樣的載體。載體可為在哺乳動物細(xì)胞中用于復(fù)制和表達(dá)的質(zhì)粒、病毒、或本領(lǐng)域中已知的其它種類。編碼反義RNA序列的表達(dá)可通過本領(lǐng)域中已知的在哺乳動物優(yōu)選為人類細(xì)胞中起作用的任何啟動子。這樣的啟動子可為誘導(dǎo)型或組成型。這樣的啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區(qū)域(Bernoist和Chambon,1981，自然，290:304-310)，包含在勞氏肉瘤病毒3′長末端重復(fù)序列中的啟動子(Yamamoto等，1980，細(xì)胞22:787-797)，皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，美國國家科學(xué)院院報78:1441-1445)，金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列(Brinster等，1982，自然296:39-42)等等。任何類型的質(zhì)粒、粘粒、YAC或病毒載體均可用于制備可直接引入組織或細(xì)胞衍生位點(diǎn)內(nèi)例如，骨髓的重組DNA構(gòu)建體。另一可選的方法是，在以另一途徑完成給藥的情況下(例如，全身性地)可使用選擇性感染所要的組織或細(xì)胞類型的病毒載體(例如，感染造血譜系細(xì)胞的病毒)。
被設(shè)計催化性裂解p101或p120mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶分子也可用于阻止p101或p120mRNA的翻譯以及p101調(diào)控亞基的表達(dá)(見，例如，PCT國際公開文本W(wǎng)O90/11364,199010月4日公開；Sarver等，1990，科學(xué)247:1222-1225)。雖然可使用在識別序列特異的位點(diǎn)裂解mRNA的核酶破壞p101或p120 mRNA，優(yōu)選使用錘頭核酶。錘頭核酶在與靶mRNA形成互補(bǔ)堿基對的側(cè)翼區(qū)域支配的位置切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA有如下兩個堿基的序列5′-UG-3′。錘頭核酶的構(gòu)建和生產(chǎn)為本領(lǐng)域眾所周知并在Haseloff和Gerlach,1988，自然，334；585-591中有詳細(xì)描述。人類p101或p120cDNA核苷酸序列中有好幾百可能的錘頭核酶切割位點(diǎn)(圖3)。優(yōu)選的改造核酶以使切割識別位點(diǎn)位于p101或p120mRNA的5′端附近；即，提高效率并且使非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄物的細(xì)胞內(nèi)積累最小。
本發(fā)明的核酶也包括RNA核糖核酸內(nèi)切酶(此處往下“Cech-型核酶”)諸如嗜熱四膜蟲(已知如IVS，或L-19IVS RNA)中天然存在并且已被Thomas Cech及合作者(Zaug等，1984，科學(xué)，224:574-578；Zaug和Cech,1986，科學(xué)，231:470-475；Zaug等，1986，自然，324:429-433；大學(xué)專利公司公開的國際專利申請No.WO88/04300；Been和Cech,1986，細(xì)胞47:207-216)詳盡描述的那種。Cech-型核酶有與靶RNA序列雜交的八個堿基對活性位點(diǎn)，之后發(fā)生靶RNA的切割。本發(fā)明包含那些指向p101或p120中存在的八個堿基對活性位點(diǎn)序列的Cech-型核酶。
在反義方法中，核酶可由修飾過的寡核苷酸組成(例如，為改善的穩(wěn)定性，靶向性，等等)并且被輸送至體內(nèi)表達(dá)p101調(diào)控亞基的細(xì)胞，例如，嗜中性粒細(xì)胞。優(yōu)選的輸送方法包括在強(qiáng)組成型polⅢ或polⅡ啟動子控制下使用“編碼”核酶的DNA構(gòu)建體，以使被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生足以破壞內(nèi)源性p101或p120信息并抑制翻譯的核酶。因為不象反義分子，核酶是催化性的，為保證效率需較低的細(xì)胞內(nèi)濃度。
利用靶向同源性重組使p101或p120基因或其啟動子失活或“敲除”也可降低內(nèi)源性p101或p120基因表達(dá)(例如，見Smithies等，1985，自然317:230-234；Thomas & Capecchi,1987，細(xì)胞51:503-512；Thompson等，1989，細(xì)胞，5:313-321；此處全文引入作為參考)。例如，有或無選擇性標(biāo)記和/或負(fù)性選擇性標(biāo)記時使用側(cè)翼與內(nèi)源性p101或p120基因(p101或p120基因的編碼區(qū)域或調(diào)控區(qū)域)同源的DNA的突變的非功能性的p101調(diào)控亞基(或完全不相關(guān)的DNA序列)轉(zhuǎn)染體內(nèi)表達(dá)p101調(diào)控亞基的細(xì)胞。通過靶向同源重組DNA構(gòu)建體的插入導(dǎo)致p101或p120基因的失活。這樣的方法尤其適合于使用對ES(胚胎干)細(xì)胞作修飾產(chǎn)生帶失活p101調(diào)控亞基的動物后代的農(nóng)業(yè)領(lǐng)域(例如，見Thomas和Capecchi,1987以及Thompson 1989，出處同前)。然而，可修改此方法用于人體，只要運(yùn)用合適的病毒載體在體內(nèi)直接施用重組DNA構(gòu)建體或靶向體內(nèi)所期望的位點(diǎn)。
另一可選的方法是，通過定向于與p101或p120基因的調(diào)控區(qū)域(即，p101或p120啟動子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的脫氧核苷酸序列以形成阻止體內(nèi)靶細(xì)胞中p101或p120基因轉(zhuǎn)錄的三螺旋結(jié)構(gòu)，可降低內(nèi)源性p101或p120基因表達(dá)(一般見，Helene,C.,1991,Anticancer Drug Des.,6(6):569-84；Helene,C.等，1992,Ann.N.Y.Acad.Sci.,660；27-36；以及Maher,L.J.,1992，生物鑒定(Bioassays)14(12):807-15)。
在本發(fā)明另一實施方案中，使用“顯性失活(dorminant negative)”方法干擾PI3K的三聚G蛋白PI3K的活化可降低p101調(diào)控亞基的活性。至此，編碼缺陷型p101調(diào)控亞基的構(gòu)建體可用于基因治療方法中使合適的靶細(xì)胞中p101調(diào)控亞基的活性消失。例如，其中Gβγ相互作用結(jié)構(gòu)域缺失或突變的指導(dǎo)p101調(diào)控亞基的宿主細(xì)胞表達(dá)核苷酸序列可被引入造血細(xì)胞(通過上述的或體內(nèi)體外基因治療方法)。另外，僅編碼p101功能性結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列可用作天然p101/p120相互作用的抑制劑。另一可選的方法是，靶向同源重組可用于將這樣的缺失或突變引入受治療者骨髓中的內(nèi)源性p101或p120基因。構(gòu)建的細(xì)胞將表達(dá)非功能性受體(即，能結(jié)合催化亞基但不能刺激應(yīng)答G蛋白激活的催化活性的調(diào)節(jié)亞基)。這樣的構(gòu)建細(xì)胞，即嗜中性粒細(xì)胞或其它白細(xì)胞譜系，證明對于細(xì)胞外趨化因子的G蛋白偶聯(lián)受體的激活反應(yīng)消失，導(dǎo)致炎性表型減少。5.6.2恢復(fù)或提高p101調(diào)控亞基的表達(dá)或活性以促進(jìn)免疫系統(tǒng)激活關(guān)于正常p101或p120基因表達(dá)水平及/或p101調(diào)控亞基基因產(chǎn)物活性的提高，可用p101或p120核酸序列治療造血譜系細(xì)胞激活紊亂，包括免疫系統(tǒng)對趨化因子的反應(yīng)性降低。如果導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能失調(diào)的原因是缺陷的p101調(diào)控亞基，可采用例如基因置換治療的療法。具體而言，正常p101基因的單或多拷貝或指導(dǎo)表達(dá)具有正常功能的p101基因產(chǎn)物的p101基因的一部分，可利用載體注射入患者或動物體內(nèi)的適當(dāng)細(xì)胞中。載體包括但不僅限于腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒載體，還包括其它將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的粒子如脂質(zhì)體。
由于p101或p120基因在造血譜系細(xì)胞內(nèi)，包括嗜中性粒細(xì)胞和其它白細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這種基因置換治療的技術(shù)應(yīng)當(dāng)可以將p101或p120基因序列輸運(yùn)入患者的這些細(xì)胞類型中?；蛘?，可利用靶向同源重組來校正合適細(xì)胞類型中的例如，骨髓細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞和/或其它白細(xì)胞缺陷型內(nèi)源p101或p120基因。對于動物，靶向同源重組可用于校正ES細(xì)胞中的缺陷，以得到具有校正了的基因的后代。
最后，上述已鑒定的化合物可用于刺激免疫系統(tǒng)，這些復(fù)合物通過激活p101調(diào)控亞基刺激、增強(qiáng)或改變激活的p101調(diào)控亞基傳導(dǎo)的信號，例如，可通過激活p101調(diào)控亞基級聯(lián)中下游信號傳遞蛋白并因此避開缺陷的p101調(diào)控亞基。給藥的制劑和方式則依賴于該化合物的理化性質(zhì)。5.7藥物制備和給藥方法已鑒定可影響p101或p120基因表達(dá)或p101調(diào)控亞基活性的這些化合物，或影響p101與它的任何結(jié)合伴侶的相互作用(結(jié)合伴侶包括但不限于催化亞基)的上述化合物可以按治療有效劑量給予患者，以治療或改善造血譜系細(xì)胞激活紊亂，包括炎性反應(yīng)紊亂例如關(guān)節(jié)炎象風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺炎、哮喘和其它肺病、過敏、再灌注損傷、動脈粥狀硬化和其它心血管疾病、阿爾茨海默病以及癌癥。治療有效劑量是指化合物的量足以導(dǎo)致造血譜系細(xì)胞激活紊亂癥狀的改善。5.7.1有效劑量上述化合物的毒性和療效可以用細(xì)胞培養(yǎng)和實驗動物的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法檢測，例如，檢測LD50(使群體的50％死亡的劑量)和ED50(對群體的50％有效的劑量)。毒性和療效的劑量比例是治療指數(shù)，它可表示為比例LD50/ED50。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的化合物。雖然可以使用有毒副作用的化合物，但應(yīng)當(dāng)注意的是應(yīng)設(shè)計一個精細(xì)的輸運(yùn)體系，使該化合物定位到所要影響的組織的位點(diǎn)，以最大程度地減少對未感染細(xì)胞潛在的傷害，由此減少副作用。
從細(xì)胞培養(yǎng)鑒定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可以為人用劑量制定出范圍。該化合物的劑量優(yōu)選在包含極少或無毒性的ED50的血藥濃度范圍之內(nèi)。劑量可依據(jù)所采用的劑型和給藥途徑在此范圍內(nèi)浮動。對于本發(fā)明中的方法所用的任何化合物，治療有效劑量可以從細(xì)胞培養(yǎng)鑒定中進(jìn)行初步估計。調(diào)配用于動物模型的劑量以得到包括了細(xì)胞培養(yǎng)所確定的IC50(即，達(dá)到將癥狀半數(shù)抑制的所測化合物的濃度)的血漿濃度范圍。上述結(jié)果可用于更精確地確定用于人的劑量?？捎美绺咝б合嗌V的方法測定血漿中的濃度。5.7.2配方與使用用于符合本發(fā)明的藥物組合物可用一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑以傳統(tǒng)方式進(jìn)行調(diào)配。
因而，化合物和其藥學(xué)可接受的鹽以及溶劑化物可以通過吸入或吹入(通過口或鼻)給藥，或口服、面頰給藥，或腸胃外或直腸給藥。
對于口服給藥，藥物組合物可以采用例如片劑或膠囊的形式，用藥學(xué)可接受的賦形劑諸如結(jié)合劑(例如，預(yù)凝膠化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充物(例如乳糖，微晶體纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石粉或二氧化硅)；崩解劑(例如，土豆淀粉或淀粉羥乙酸鈉)；或濕化劑(例如，十二烷基硫酸鈉)通過常規(guī)方法制備?？捎帽绢I(lǐng)域中眾所周知的方法包被片劑。用于口服給藥的液體制劑可采用例如溶液、糖漿或懸浮液的形式，或者它們可為干性產(chǎn)物，使用前與水或其它合適載體配制。這樣的液體制劑可通過使用藥學(xué)可接受的添加劑諸如懸浮劑(例如，山梨糖醇糖漿，纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分餾植物油)；以及防腐劑(例如，甲基或丙基-對-羥基苯甲酸鹽或山梨酸)的常規(guī)方法制備。制劑也包含緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑以及合適的甜味劑。
合適地配制用于口服給藥的制劑以使活性化合物受控釋放。
用于面頰給藥組合物可采用以常規(guī)方法配制的片劑或錠劑。
對于吸入途徑給藥，用于根據(jù)本發(fā)明的化合物可很方便地以合適的推進(jìn)劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適氣體采用得自加壓包裝或噴灑器氣溶膠噴霧的形式進(jìn)行輸送。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供一閥門以運(yùn)送可確定的量來確定劑量單位。用在吸入劑或吹入劑中的例如明膠的片劑或藥筒可被配制成含化合物和合適粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
用于注射例如通過藥團(tuán)注射或連續(xù)注入的化合物可配制為用于胃腸外給藥的形式。用于注射的制劑可配制為以單位劑量形式，例如在安瓶管或多劑量容器中連同附加的防腐劑提供。組合物可采用諸如懸浮液、溶液或油性或水性載體中的乳液的形式，以及可含有調(diào)配劑諸如懸浮、穩(wěn)定和/或分散劑?；蛘撸钚猿煞挚蔀榉勰┬问?，使用前與合適的載體例如，無菌無致熱原水配成。
化合物也可配制成直腸組合物諸如栓劑或滯留灌腸劑，例如，含傳統(tǒng)栓劑基質(zhì)諸如可可脂或其它甘油酯。
除前述配方外，化合物也可配制成儲存制劑。這樣可通過植入(例如皮下或肌內(nèi))或通過肌肉注射給藥長效制劑。因此，例如，可用合適的多聚或疏水物質(zhì)(例如可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂、或微溶性衍生物例如微溶性鹽配制化合物。
如果需要，組合物可存在于含活性成分的一種或多種單位劑量形式的包裝或配藥設(shè)備中。包裝可包含例如金屬或塑料薄片，諸如發(fā)泡包裝。包裝或配藥設(shè)備應(yīng)配有用藥說明。
提供以下實施例以說明本發(fā)明并且?guī)椭绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員制造和使用它們。無論如何，此實施例并非為了限制關(guān)于這個特許專利所授予的公開或保護(hù)的范圍。
6．實施例豬Gβγ-活化的PI3K活性的純化和定性6.1材料與方法6.1.1 PI3K鑒定源于Sf9或豬嗜中性粒細(xì)胞胞漿的P13K純化的等分樣品用冰冷的0.12M NaCl,25mM HEPES,1mM EGTA,1mM DTT,1mg/ml BSA,1％甜菜堿，0.02％,w/v,Tween-20,pH7.4,0℃下稀釋到合適程度，然后以5μl等分樣品保存于冰上直至鑒定。如果P13K鑒定是在得自U937細(xì)胞的免疫沉淀物上進(jìn)行(見后續(xù)實施例)，則將在以上所述冰冷的緩沖液中將P13K固定在10μl包被的蛋白G Sepharose珠上。將30μl帶有或不帶有Gβγ和/或Gα(或GDP結(jié)合的或活化的)的磷脂混合物加入5μl流分中或10μl Sepharose珠中并且混合。冰浴10分鐘后，加入補(bǔ)加MgCl2至現(xiàn)存鑒定體積的終濃度為3.5mM的5-10μl最末一次沖洗緩沖液，并混勻。6分鐘后，加入含有[γ32p]-ATP(通常每次鑒定10μCi,Amersham,PB10168)和3.5mM MgCl2的5μl最末一次沖洗緩沖液(得到終體積50μl)，將試管內(nèi)容物混合并轉(zhuǎn)移到30℃水浴。15分鐘后以500μl氯仿∶甲醇∶水(29∶54∶13.1,v/v/v)終止反應(yīng)。隨后加入1μl 100mMATP,103μl2.4 HCl和434μl氯仿形成一種兩相′Folch′溶媒分配?；旌?、離心后，移去下層相并轉(zhuǎn)移到干凈的含有424μl新鮮‘上層相’(甲醇∶1M HCl∶氯仿；48∶47∶3,v/v/v)試管中。混合、離心后，下層相轉(zhuǎn)移到干凈試管中(在純化豬嗜中性粒細(xì)胞P13K過程中，[32P]-脂質(zhì)產(chǎn)物在這一步用蓋革記數(shù)器定量)，真空干燥，以TLC在PEI板上去酰化及解析(用0.6M HCl；PtdIn(3,4,5)P3的Rf值為0.47)(Stephens等，1994，細(xì)胞77:83-93)。在有些實驗中，干燥脂質(zhì)重溶于氯仿∶甲醇/2∶1,v/v)，加于浸過草酸鉀的TLC板并在氯仿∶丙酮∶甲醇∶乙酸∶水(40∶15∶13∶12∶8,v/v/v/v/v；Traynor-Kaplan等，1988)混合物中解析。
脂質(zhì)/G蛋白亞基混合物制備如下真空干燥PtdIn(4,5)P2(由Folch磷酸肌醇流分2次通過固化新霉素的色譜循環(huán)制備)和PtdEtn(Sigma)(鑒定中分別足以形成50μM和0.5mM的最終濃度)。在有些實驗中包括PtdIns4P(制備方法與PtdIns(4,5)P2相似)和/或PtdIns(Sigma)。干燥的脂質(zhì)在補(bǔ)加0.1％膽酸鈉的最終沖洗緩沖液(如上文)中超聲破碎(室溫下)。冰浴冷卻后，以部分已分散的脂質(zhì)原料與每次鑒定總共1μl的一種混合物混勻，該混合物包括Gβγ存儲緩沖液(1％膽酸鹽；50mM HEPES,pH7.5,4℃,0.1M NaCl；1mM DTT；0.5mM EDTA)，活性Gβγ，或得自3-7mg/ml原液的在存儲緩沖液中煮沸過的等量Gβγ。在有些實驗中，這1μl混合物成分包括Gα亞基或在Gβγ與Gα亞基(或GDP結(jié)合的或激活的，見下文)在冰上預(yù)先混合10分鐘情況下的存儲緩沖液。
通過與10mM NaF,30μM AlCl3(A/F)冰浴10分鐘激活Gα亞基(Gα:o,i,i2和i3的等摩爾比混合物，如文中所述進(jìn)行制備，并存儲在與Gβγ亞基相同的但不包括10μM GDP的緩沖液)；這些亞基被稀釋的分析液也含有A/F。a)蛋白質(zhì)純化直接將豬血(42批次)收集到21個容器中的抗凝劑中。在40分鐘的收集中血樣/抗凝劑與3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP,360KD)與等滲鹽液(4.2份血混合物0.8份PVP)混合。靜置35分鐘(25個容器中)后，紅細(xì)胞已充分沉降，可將上清虹吸出來并在1L的容器中離心(8分鐘，1000×g)?；厥占s28L這種初級上清液。沉淀的細(xì)胞重懸于Hank′s液使最終積累體積可放入兩個1L的離心瓶中。細(xì)胞經(jīng)離心沉淀(8分鐘，1000×g)。吸出上清，細(xì)胞團(tuán)塊加入70ml冰冷水進(jìn)行低滲壓沖擊(以裂解任何殘余的污染紅細(xì)胞)。混合20-30秒后，加入77 ml 10×Hank′s液(無鈣離子)。用Hank′s液沖洗后，將細(xì)胞收集到離心瓶中，沉淀并重懸于冰冷的500 ml 40 mM TRIS,pH7.5，4℃；0.12M NaCl；2.5mM MgCl2的溶液中。加入2-異丙基氟磷酸(終濃度0.5mM)置冰上5分鐘后,沉淀細(xì)胞(約80-90ml總體積)并重懸于300ml冰冷的40mM TRIS,pH7.5；0.1M NaCl；2.5mM MgCl2；1mM EGTA；0.2mM EDTA和抗蛋白酶Ⅰ中。超聲處理細(xì)胞懸液(Heat SystemsProbe公司超聲器，設(shè)定為9.25,4×15秒，每次爆破間混合一分鐘，所有操作在冰上進(jìn)行)后離心(2000×g,10分鐘)以沉淀未破碎細(xì)胞及細(xì)胞核(小于5％的細(xì)胞仍保持完整)。離心上清(100000×g,60分鐘，4℃)，輕輕倒出上清，合并后與EDTA、甜菜堿和DTT(終濃度分別為5mM、1％和1mM)混合，最后在液氮中冰凍及保存于-80℃。經(jīng)這一方式制備的胞漿組分很典型地蛋白濃度為8-9mg/ml(每次制備約2.5g蛋白)。一旦收集相當(dāng)于750L血液(18到42份制備，9×1012個細(xì)胞，40g蛋白質(zhì))的胞漿并凍存于-80℃，應(yīng)間隔5小時分三批融化。這一步之后所有步驟均應(yīng)在2-4℃進(jìn)行。
新鮮融化的胞漿中補(bǔ)加Tween-20(終濃度0.05％,w/v)，離心(20000×g,30分鐘，2℃)，過濾(5μm硝酸纖維素膜，直徑4.5cm,Whatman)后以緩沖液K(見下文)稀釋約2.5倍至最終導(dǎo)電率為200μS(4℃)，然后上樣于一根經(jīng)緩沖液K平衡的800ml(直徑5cm)Fast Flow Q Sepharose柱(用蠕動泵12.5ml/分鐘)。稀釋后胞漿總體積約15.5升。一旦加樣，以1升緩沖液K洗柱，再用4.5升含0.1-0.6M NaCl線性梯度的緩沖液K以8ml/分鐘流速洗脫。收集五十份1ml的流分。連續(xù)監(jiān)測(后續(xù)步驟也如此)柱洗脫物的導(dǎo)電率和吸光率(280nm)。緩沖液K包括如下成份40mM TRIS/HC1,1mM EGTA,0.2 mM EDTA,1％甜菜堿，0.05％w/v Tween 20,5mMβ-甘油磷酸，4℃時pH7.5，含抗蛋白酶、亮肽素(leupeptin)、苯丁抑制素、抑胃酶肽A和抑肽酶各4μg/ml及0.1mM PMSF(‘抗蛋白酶ⅠⅠ’)的15mMβ-巰基乙醇。這一溶液及其后者均經(jīng)0.2μm微孔過濾。
一旦相關(guān)流分經(jīng)P13K方法鑒定，將它們匯集后立即加樣(10ml/分鐘)于1.8L Sephadex-G25-fine柱(直徑5cm)，此柱已由18升緩沖液L預(yù)平衡(僅最后2升含抗蛋白酶Ⅱ)，(緩沖液L包括5mMβ-甘油磷酸，20mM KCl,0.05％w/vTween 20,1％甜菜堿，0.1mM EDTA,10mM磷酸鉀，4℃時pH7.0,15mMβ-巰基乙醇加抗蛋白酶Ⅱ)。Q Sepharose柱脫鹽的匯集物立即上樣(5ml/分鐘)于80ml羥基磷灰石(直徑2.6cm,Macropprep-ceramic,BioRad公司)，此柱已經(jīng)由1升緩沖液M(5mMβ-甘油磷酸，10mM磷酸鉀，4℃下pH7.0,0.05％w/vTween20,1％甜菜堿，15mMβ-巰基乙醇)以10ml/分鐘流速預(yù)平衡后，在上樣前立即加入100ml緩沖液N(包含補(bǔ)加了0.1mM EDTA和抗蛋白酶Ⅰ的緩沖液M)。上樣后，以100ml緩沖液N洗柱，再用100ml含0.05-0.35M磷酸鉀線性梯度的緩沖液N洗脫(4ml/分鐘)。收集25ml流分用于鑒定Gβγ-激活的PI3K活性。
合并相關(guān)流分(典型地終體積100ml)，以緩沖液O(導(dǎo)電率為250μS,4℃)稀釋并且上樣于肝素Sepharose HR柱(直徑1.6cm，已經(jīng)150ml緩沖液O以2ml/分鐘流速預(yù)平衡(見下文))。上樣后，以緩沖液O(30ml)洗柱，再以140ml含0.1-0.7M KCl線性梯度的緩沖液O洗脫(流速1ml/分鐘)，于5ml單位流分收集洗脫物。緩沖液O為20mM HEPES,1mM EGTA,0.2 EDTA,0.05％w/vTween 20,1.0％丁烷，1mMβ-甘油磷酸，pH7.2,4℃,15mMβ-巰基乙醇，加上抗蛋白酶Ⅱ。
自肝素Sepharose HR中洗脫下來Gbγ激活的PI3K活性存在于兩個峰中，稱為A和B峰。A和B峰產(chǎn)物均由組成同樣的柱子連續(xù)純化。A峰共15ml(0.4M KCl)并用緩沖液P(見下文)稀釋8倍(至最終導(dǎo)電率200μS,4℃)，B峰共15ml(0.6M KCl)并用緩沖液P稀釋10倍(至終導(dǎo)電率200μS,4℃)。稀釋后立即以1ml/分鐘速度上樣于預(yù)先用20ml緩沖液P平衡過的Mono Q5/5 HR柱。上樣后，以5ml緩沖液P洗柱。洗脫物收集于0.5ml單位流分中。緩沖液P包含10mM Tris,1mM EGTA,0.2 EDTA,0.05％w/vTween 20,1.0％甜菜堿，1mMβ-甘油磷酸，pH7.1,4℃,15mMβ-巰基乙醇，加上抗蛋白酶Ⅱ。
得自Mono Q(A)和(B)的相應(yīng)流分各自合并(兩者總體積均為3ml)，經(jīng)超濾器(以緩沖液P預(yù)沖洗，50 KD截留分子量)濃縮至0.8ml，離心(10,000×g,10分鐘，0℃)，然后直接上樣(0.25ml/分鐘)于預(yù)先用緩沖液Q(見下文，2升無抗蛋白酶Ⅱ，然后150ml加抗蛋白酶Ⅱ)平衡過的高效體積排阻色譜柱(V 72ml,Vt172ml)。在Vt以前收集1.5ml單位流分。緩沖液Q包含0.17M KCl,1.0％甜菜堿，0.05％w/vTween 20.,1mMβ-甘油磷酸，1mM EGTA,0.2mM EDTA,1.5mM磷酸鉀，40mM HEPES,4℃時pH6.9,15mMβ-巰基乙醇。
得自A和B的相關(guān)流分各自合并(兩者總體積均有6ml)用緩沖液R稀釋到24ml(終導(dǎo)電率250μS,4℃)，并上樣(0.8ml/分鐘)于一個丙烯酸基質(zhì)陽離子交換型HPLC柱(體積2.5ml,BioRad)，以25ml其中含KCl(0.1-0.6M線性梯度)的緩沖液R洗脫。洗脫物收集于1ml單位流分中。緩沖液R包含1.0％甜菜堿，0.05％ w/v Tween 20,1mM EGTA,0.2 EDTA,20 mM HEPES,4℃時pH6.8,15mMβ-巰基乙醇加上抗蛋白酶Ⅱ。
合并相關(guān)流分((A)3ml,(B)2ml)，用緩沖液S(終導(dǎo)電率180μS,4℃)稀釋7倍，然后上樣(0.15ml/分鐘)于Mini Q柱(0.24ml，工作于Parmacia Smart系統(tǒng))。此柱以1ml緩沖液S沖洗，并用含0.1-0.5M NaCl線性梯度的緩沖液S以0.1ml/分鐘流速洗脫。洗脫物收集于75μl單位流分中。緩沖液S包含1.0％甜菜堿，0.05％w/vTween 20,1mM EGTA,0.2mM EDTA,2 mMβ-甘油磷酸，10mM Tris,4℃時pH7.7,1mM DTT(無抗蛋白酶)。
整個純化過程中蛋白質(zhì)濃度按以下四種方式估計(a)利用蛋白結(jié)合染色(BioRad，這一方法僅用于裂解物、胞漿和Q Sepharose流分)；(b)通過積分280nm吸收峰區(qū)(這一方法可由染色結(jié)合鑒定校正)；(c)過濾器上的蛋白經(jīng)麗春紅S染色，并與相近固定化標(biāo)準(zhǔn)定義的組分的染色強(qiáng)度比較；以及(d)經(jīng)SDS-PAGE凝膠解析后的蛋白質(zhì)，用考馬斯R250染色，并與同一膠上已知濃度的蛋白組分比較。
PI3K的最終制備物(首步純化品)與100nM[3H]-17-羥基-渥曼青霉素(17.7 Ci mmol-1,Amersham，定制)溫育，經(jīng)SDS-PAGE解析，考馬斯蘭染色，并拍照。然后用熒光自顯影檢測[3H]。6.2結(jié)果經(jīng)離子交換色譜分析豬嗜中性粒細(xì)胞胞漿表明它包含有Gβγ激活的PI3K活性，與已在U937細(xì)胞及骨癌細(xì)胞中描述的有相似性質(zhì)。用[3H]-17-羥基-渥曼青霉素作為探針鑒定由表觀大小為117KD、120KD的蛋白雙聯(lián)體，此雙聯(lián)體洗脫于含有Gβγ激活的PI3K活性的流分中，而且其含量為由p110α和/或p110β結(jié)合的[3H]-17-羥基-渥曼青霉素水平的2-4％(見圖5)。進(jìn)一步純化此Gβγ激活的PI3K活性峰(所有圖、表詳述了經(jīng)最終測序的PI3K制品的純化過程)。在此過程中，它被分成的兩個峰(A和B)均表現(xiàn)出明顯的、內(nèi)在的、相關(guān)的220KD分子量。一旦基本純化，如考馬斯染色SDS-PAGE膠鑒定所示，就明確表現(xiàn)出兩種活性與兩種蛋白質(zhì)共同遷移(A)117KD蛋白(其特異性結(jié)合[3H]-17-羥基-渥曼青霉素并因此被推定為催化亞基)和101KD蛋白；以及(B)120KD蛋白(也結(jié)合[3H]-17-羥基-渥曼青霉素)和101KD蛋白。這一結(jié)果表明PI3K活性物在其天然狀態(tài)下是p117/p101和p120/p101異源二聚體。在其最終形式中，PI3K的A和B從嗜中性粒細(xì)胞裂解物中被純化約180,000倍和380,000倍(從血液中純化了1,000,000,000倍)且活性總回收率為5.5％。表1表明了每個步驟中蛋白質(zhì)和PI3K活性的回收率。
表1豬白細(xì)胞G蛋白Bγ亞基激活的PI3K的純化
與p85/p110家族成員對比，這種濃縮的程度與這些蛋白質(zhì)結(jié)合的[3H]-17-羥基-渥曼青霉素的量一致。因此所有這些蛋白認(rèn)為是低豐度的。
PI3K A和B的純化制品就其脂肪激酶活性而言沒有差異。兩種制品均(a)以Gα-GDP敏感方式被Gβγ亞基激活超過100倍；(b)可被100nM渥曼青霉素(鑒定中含5μM ATP)完全抑制；(c)在有或無Gβγs時對可激活p85/p110家族PI3K達(dá)5倍(見圖6)的酪氨酸磷酸化肽不敏感；(d)能3磷酸化PtdIns,PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2(這些產(chǎn)物可由依次去?；兔摳视秃笥肹3H]-內(nèi)標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行[32p]-標(biāo)記的水溶性產(chǎn)物的陰離子交換型HPLC分析來鑒定)。更進(jìn)一步，通過利用γ-磷酸化的ATP作為磷酸供體，PI3K的A和B純化制品表現(xiàn)出了后一底物最低的表觀Km值(A和B分別為8和10μM)(結(jié)果未發(fā)表)。7．實施例豬Gβγ-活化的PI3K A和B的肽的序列測定在此實施例中，以氨基酸測序分析兩種豬PI3K蛋白。自相當(dāng)于40g胞漿蛋白純化的PI3K A和B被Western雜交印記在硝酸纖維素膜上，經(jīng)麗春紅S染色，切下相應(yīng)于所有四種亞基的條帶，用胰酶處理后再進(jìn)行內(nèi)部氨基酸序列分析。7.1材料與方法肽生成與肽測序。用于測序的蛋白等分試樣用western雜交點(diǎn)于(用濕點(diǎn)樣器)硝酸纖維素膜(0.45μM孔徑BA 85,Schleicher和Schuell)上。轉(zhuǎn)移緩沖液包含192mM甘氨酸，25mM TRIS和10％v/v甲醇。在最終轉(zhuǎn)移單位安裝前，凝膠/濾膜三明治(-)邊上支撐的Whatman No.1濾紙以及凝膠(1mm厚)浸于(2-3分鐘)含0.0005％(w/v)SDS的轉(zhuǎn)移緩沖液。采用恒定35V(0.25-0.35安培，5℃)共轉(zhuǎn)移16小時。濾膜用含于1％乙酸中的0.1％麗春紅S染色1分鐘，然后在1％乙酸中脫色1分鐘。上樣于凝膠的約85-90％的蛋白可由濾膜回收。從硝酸纖維素膜中切出感興趣的條帶，按文獻(xiàn)(Tempst等，1990，電泳，11:537-552)經(jīng)修正(Liu等，1990)后進(jìn)行內(nèi)部氨基酸序列分析。簡述如下用0.5μg胰酶(Promega,Madison,WI)在25μl 100mMNH4HCO3中(補(bǔ)加1％兩性試劑3-16)于37℃進(jìn)行原位蛋白水解2小時。所獲得的肽混合物分別用0.1％β-巰基乙醇(BioRad,Richmond,CA)和0.3％4-乙烯基嘧啶(Aldnich,Milwankee,WI)還原及S-烷基化，并利用反相HPLC分步收集。也在一個相同大小的硝酸纖維素膜條上處理酶空白對照。
HPLC溶劑和系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可見文獻(xiàn)(Elicone等，1994)，除了使用2.1mm214 TP54 Vydac C4柱(Separations Group,Hesperia,CA)且?guī)в刑荻认疵?，流速?00μl/分鐘。含Try肽的鑒定可通過297nm和277nm處光吸收比的分析手工進(jìn)行，采用Applied Biosystems(Foster City,CA)100OS型二極陣列檢測儀(Erdjument-Bromage等，1994)進(jìn)行實時檢測。手工收集流分，在走柱期間將其置于冰上，然后于分析前置于-70℃保存。
分析純化的肽段采用自動Edman降解及矩陣輔助激光吸收離子飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀聯(lián)合進(jìn)行；這種聯(lián)合方法的細(xì)節(jié)，包括質(zhì)量輔助的化學(xué)后測序路徑，能在其它地方查到(Geromanos等，1994，蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)(Techniques in Protein Chemistry)V 143-150；Elicone等，1994，色譜雜志(J.Chromatogr.)676:121-137；Erdjument-Bromage等，1994，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Sci.)3:2435-2446)。保存后，在上樣于測序儀圓盤和質(zhì)譜儀屏極上之前，柱流分補(bǔ)加潔凈TPA(以達(dá)到終濃度10％)。質(zhì)量分析(2％等分樣品上)利用Voyager RP MALDI-TOF儀器(Vestec/PerSeptive,Framingham,MA)連同337nm輸出氮激光，1.3m飛行管和作為基質(zhì)的α-氰基-4-羥基桂度酸(購自Linear Sci.,Reno,NV的預(yù)制溶液)以線形模式進(jìn)行。采用30KV離子加速電壓(柵極電壓70％，指導(dǎo)線電壓為0.1％)和-2.0KV多重電壓。利用TDS 520 Tektronix(Beaverton,OR)數(shù)碼示波器，根據(jù)特異最大值的最佳偏轉(zhuǎn)來調(diào)節(jié)激光通量和獲取數(shù)量。利用GRAMS(Galactic,Salem,NH)數(shù)據(jù)分析軟件自飛行時間文件中可產(chǎn)生Mz(質(zhì)荷比)光譜。每個樣品按文獻(xiàn)(Genomanos等，1994)在有和無兩種校正物(APID和P8930，每個25飛摩爾)分析兩次?；瘜W(xué)測序(95％的樣本)采用477A型Applied Biosystems(AB)儀器進(jìn)行。逐步釋放的PTH-氨基酸用裝有PTH C18(2/1×220mm；顆粒大小5μm)柱(AB)的′在線′120A HPLC系統(tǒng)(AB)來鑒定。根據(jù)文獻(xiàn)(Erdjument-Bromage等，1994，蛋白質(zhì)科學(xué)，3:2435-2446；Tempst等，1994,Methods Companion Meth.Enzymol.6:284-261)儀器和步驟按飛摩爾級水平的帶硫海因(thihydantoin)氨基酸分析進(jìn)行了優(yōu)化。
肽平均異構(gòu)體質(zhì)量用ProComp 1.2版軟件(從P.C.Andrews博土，Michigan大學(xué)，Ann Arbor,MI處獲得)根據(jù)已知氨基酸殘基(包括推定的那些)加和而成。
根據(jù)PDGFβR中酪氨酸740和751附近序列在Babraham研究所利用顯微化學(xué)設(shè)備制備兩重酪氨酸磷酸化的肽(18個殘基)。7.2結(jié)果肽測序數(shù)據(jù)立即解決了關(guān)于這些蛋白之間關(guān)系的一些問題。來源于PI3K A和B的p101是相同的并且在開放閱讀框架的483位點(diǎn)鑒定出相對共同的等位基因變異體(注明在圖4)，即一個絲氨酸被甘氨酸代替。p117和p120表現(xiàn)出完全相同的胰蛋白酶HPLC峰形，并且除一個源于p117的氨基端封閉的肽外，從兩個物種已測序的所有明顯共有的肽段是相同的(見下文)。然后肽序列信息用于設(shè)計釣出編碼這些蛋白的核苷酸序列的探針。8．實施例編碼豬的p120和p101的cDNA的克隆以豬p120肽序列和豬p101肽序列為基礎(chǔ)的簡并性寡核苷酸探針用于篩選以寡聚dT為引物的擴(kuò)增的cDNA文庫(從豬嗜中性粒細(xì)胞poly-A選擇性RNA制成)。以下敘述編碼p101和p120蛋白的cDNA的克隆和表征。8.1材料與方法我們從4.2×109個豬嗜中性粒細(xì)胞中制備0.7mg總RNA(Chomczynsk& Sacchi,1987，分析生物化學(xué)(Anal.Biochemistry)162:156-159)。Stragene(San Diego,CA)使用此RNA產(chǎn)生Poly A選擇性mRNA，由此他們在λZAPⅡ中制備寡聚dT引物和隨機(jī)引物的cDNA文庫(分別約為5.4×106和3.2×106初級p.f.u.)。擴(kuò)增文庫由約2×106個原始重組子構(gòu)建而成，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法用于篩選p120和p101 cDNA。
利用基于得自p120肽序列的[32p]-標(biāo)記的寡聚物[CA(T/C)GA(T/C)TT(T/C)ACI CA(A/G)CA(A/G)GTI CA(A/G)GTI AT(T/C/A)GA(T/C)ATG](SEQ ID NO:5)來篩選得自以寡聚dT為引物的2.5×106個空斑?；谫|(zhì)粒和兩條測序過的DBA鏈如BluescriptTM分離鑒定了12個陽性克隆(在Babraham研究所采用ABI自動測序設(shè)備)。這些質(zhì)粒的插入序列代表帶有兩個定義編碼所有源于p117/p120胰酶消化物的全部肽序列的全長開放閱讀框架的一系列重疊的克隆(圖4)。
用[32p]-標(biāo)記的基于得自p101的肽序列的寡聚物[GCI TA(T/C)ATG GA(A/G)GA(T/C)ATI GA(A/G)GA](SEQ ID No:6)從寡聚dT引物文庫中篩選衍生0.9×106個空斑。對一個陽性克隆進(jìn)行了檢定、分離、測序。此克隆的5′端(D11)代表了胰酶水解肽段之一的一部分序列，因此鑒定它為一個部分克隆。利用源自D11的[32p]標(biāo)記的ClaⅠ限制性酶切片段進(jìn)一步從以寡聚dT引物文庫中篩選了0.6×105個空斑。鑒定了66個陽性克隆，分離了其中49個，對其中一些進(jìn)行部分測序。這些克隆代表一系列部分重疊克隆，它們均含有D11序列但都小于D11自身。再用得自D11的[32p]標(biāo)記的ApaⅠ限制性酶切片段從隨機(jī)引物文庫中篩選了3.5×106個空斑。檢定出98個陽性克隆。這些克隆再用基于PCR的方法，以針對BluescriptTM載體設(shè)計的引物(正向或反向引物)和內(nèi)部D11序列，對這些克隆進(jìn)行再篩選(在初級空斑分離物的階段)。這使我們能夠鑒定(不依賴于方向)最長的編碼p101序列的可能的N端延伸。分離及測序帶有最大PCR片段的三個克隆進(jìn)行。這些代表部分重疊的克隆與D11一起，確定了一個編碼源自p101胰酶消化物所有肽序列的全長開放閱讀框架(圖1和圖2)。8.2結(jié)果兩個克隆確定了一個編碼所有p117/p120胰酶消化肽的全長開放閱讀框架(見圖1-4)。在三個可能的起始蛋氨酸中，基于對氨基端封閉的p120衍生的多肽的測量分子量與由三個蛋氨酸中每個作為起始翻譯點(diǎn)所推出的氨基端肽的理論分子量之間的精確比較，確定中間的一個有活性(與Stoyanov等1995，科學(xué)269:690-693的假定相反)。這樣，p120的理論大小為126KD。比較由p117得到的氨基端封閉的肽與p120氨基端相關(guān)區(qū)域，表明兩者沒有精確重合(允許正常氨基端封閉)。這樣p117既不象是從p120蛋白水解性修飾或翻譯后修飾而成的，也不像由p120內(nèi)的第二翻譯起始點(diǎn)而得到的。但是編碼p117開放閱讀框架的cDNA還未分離出來。
用定義p120的蛋白和DNA序列在數(shù)據(jù)庫中尋找相似的結(jié)構(gòu)。鑒定與所有已被克隆的PI3K的相似性。然而，序列除種屬差異外，與p110γ幾乎一樣(Stoyanov等，1995)，我們得到的序列與Stoyanov等人的唯一顯著不同發(fā)現(xiàn)在遠(yuǎn)端COOH端中。僅根據(jù)一級結(jié)構(gòu)，還不能肯定p120中COOH端血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源性區(qū)域的鑒定。
通過利用來自豬嗜中性粒細(xì)胞的源于寡聚dT和隨機(jī)引物的cDNA文庫的幾個重疊片段，定義了一個編碼源于p101所有肽序列的全長開放閱讀框架。鑒定了一個源于p101的氨基端封閉的肽；它的大小精確等同于從所述開放閱讀框架預(yù)測起點(diǎn)所定義的前12個殘基的預(yù)計的氨基端乙酰化的形式的分子量。預(yù)測的相應(yīng)p101分子量是97kD。雖然在蛋白和DNA序列庫中尋找過相似結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)，但沒有發(fā)現(xiàn)有明顯相同的序列。9．實施例編碼人p120和p101的cDNA的克隆源于豬p101和p120 cDNA序列放射性標(biāo)記的PCR產(chǎn)物被成功地用于篩選人類cDNA文庫中的同源物。編碼人p101和p120 cDNA的克隆及表征敘述如下9.1人p101用相應(yīng)于豬p101 cDNA序列887-1287的放射性標(biāo)記PCR產(chǎn)物篩選人類單核細(xì)胞cDNA文庫(Clontech,Palo Alto,CA；mRNA來源U937細(xì)胞系，50ng/ml PMA處理3.5天)。含有人類cDNA文庫的λgtll噬菌體按Clontechλ文庫操作手冊所述鋪板，并轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜。結(jié)合于濾膜的DNA經(jīng)高壓消毒膜1分鐘而變性，之后濾膜在42℃預(yù)雜交液中進(jìn)行2小時預(yù)雜交，預(yù)雜交液包括50％甲醛、5×Denhardts、5×SSC、0.05mg/ml鮭魚精DNA、0.05M pH6.8的NaPO4、1mM焦磷酸鈉和1％SDS。放射性標(biāo)記的PCR探針經(jīng)煮沸5分鐘變性，在冰上冷卻15分鐘，然后以終濃度1百萬cpm/ml加入處于雜交緩沖液的濾膜上。雜交在持續(xù)攪動下于42℃過夜進(jìn)行。之后濾膜在室溫用2×SSC,1％SDS洗20分鐘，42℃下用2×SSC 1％SDS再洗20分鐘，最后在42℃下用0.2×SSC,1％SDS洗20分鐘。放射自顯影后，根據(jù)Clontech文庫手冊，采集陽性克隆本身及周圍區(qū)域，并將噬菌體洗脫到噬菌體稀釋緩沖液中，從而分離陽性克隆。噬菌體再以可以分離到單噬菌斑的密度重輔板，生長過夜，轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜。濾膜用與上述同樣的放射性PCR探針雜交，洗滌并進(jìn)行放射自顯影。挑選單個、純的陽性噬菌班，噬菌體洗脫入噬菌體稀釋緩沖液，然后重輔板產(chǎn)生一個平輔生長的菌苔?？瞻呒兓木Ρ幌疵撊胧删w緩沖液根據(jù)Clontech文庫操作手冊分離λ噬菌體DNA。
用限制性酶EcoRⅠ酶切純化的λDNA，在瓊脂糖凝膠上分離后，分離這些EcoRⅠ處理的DNA插入片段且重組進(jìn)EcoRⅠ線性化的Bluescript KS+。對這些含DNA插入片段的Bluescript質(zhì)粒進(jìn)行測序。各自分離的cDNA克隆中有五個包含與豬p101 cDNA 1137到位于3021處的終止密碼子間同源的序列。與豬p101序列相比，已分離的人克隆含有一個3′端544bp的非翻譯序列。
由于豬的序列在5′端富含GC，所以在寡聚dT引物文庫中發(fā)現(xiàn)一個全長克隆的可能性非常低。因此，為了增大發(fā)現(xiàn)富GC含5′端區(qū)之克隆的可能性，我們決定采用同為寡聚dT引物和隨機(jī)引物的引物文庫。運(yùn)用同樣的豬p101序列放射性標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和上述同樣方法，我們篩選了一個人白細(xì)胞5′端Stretch加cDNA文庫(Clontech,mRNA來源正常外周血白細(xì)胞)和幾個已分離的克隆，其中一個包含人p101序列的5′端。這一克隆包括大約編碼序列上游的300bp和編碼序列的前1612bp。將白細(xì)胞克隆5′端克隆(從起始密碼子上游77bp處的HindⅢ點(diǎn)到1262點(diǎn)處的SacⅠ點(diǎn))與單核細(xì)胞克隆(從SacⅠ點(diǎn)到3014點(diǎn)的XbaⅠ點(diǎn)，即終止密碼子下游305bp處)融合構(gòu)建成一個含人類p101序列全部編碼區(qū)域的全長cDNA的克隆。這一全長cDNA的序列已全部確定，其編碼的氨基酶序列也已推定。
由于這個全長克隆源于兩個不同文庫的不同克隆，所以確證了在白細(xì)胞文庫中p101克隆3′端的存在。利用不同的五套PCR引物，我們證明了克隆自單核細(xì)胞文庫的p101的3′端存在于單核細(xì)胞文庫和白細(xì)胞文庫中。9.2人p120豬p120的人類同源物經(jīng)過篩選一個白細(xì)胞cDNA文庫(Clontech,mRNA來源正常外周血白細(xì)胞)而克隆，實驗根據(jù)上述人p101的克隆方法，采用了豬序列中875至1315bp的一個放射性標(biāo)記的PCR片段。我們獨(dú)立分離出了兩個含人p120 5′端的克隆，它們相應(yīng)于Stephen等人報道的豬序列6至2414。人類序列在2408處有一個EcoRⅠ位點(diǎn)，由于cDNA文庫是以EcoRⅠ接頭構(gòu)建的，所以全長人類序列必包括于兩個分離的克隆，一個包括5′端EcoRⅠ片段，另一個包括3′端EcoRⅠ片段。因此用來自豬p120序列3′端(2801-3395bp)的放射性標(biāo)記的PCR片段在上述相同條件下對文庫進(jìn)行再篩選。我們獨(dú)立分離出兩個包含從位點(diǎn)2408(人類序列)到5128的polyA尾起始點(diǎn)序列的3′端的克隆。分離含有5′和3′端EcoRⅠ片段的兩個噬菌體的DNA插入片段，于EcoRⅠ位點(diǎn)處融合產(chǎn)成一個全長cDNA克隆(1至5128)，它包括全部人類p120同源物編碼區(qū)(84至3390)。已確定全長cDNA克隆的全部序列并推斷出編碼的氨基酸序列。10．實施例豬p120和p101在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)制備重組的克隆的桿狀病毒(rbv)，該病毒帶有氨基端6×HIS標(biāo)記的p120(pAcHLT p120)cDNA或氨基端(EE)-標(biāo)記的p101 cDNA((pAcO-G1)p101)，并用于在昆蟲(Sf9)細(xì)胞中驅(qū)動上述蛋白的產(chǎn)生。10.1材料與方法10.1.1表達(dá)載體的構(gòu)建利用N端PCR和適合的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將豬p120和p101開放閱讀框架改造成一種可插入多種表達(dá)載體的形式。在每種情形中，在N端標(biāo)記后的第一個編碼的氨基酸是起始蛋氨酸。p120cDNA3’非翻譯區(qū)全長利用，而p101cDNA的則在BamHⅠ位點(diǎn)(第192位核苷酸，圖1)截斷。用于在Sf9細(xì)胞中桿狀病毒驅(qū)動表達(dá)的載體是pAcHLT(它編碼其后為一凝血酶切點(diǎn)的N端‘6xHis-標(biāo)記’，Phanminogen；p120開放閱讀框架被插入XhoⅠ-EcoRⅠ位點(diǎn))和pAcO-G1(它編碼一個N端‘EE-標(biāo)記’，ONYX Pharmaceutials；p101開放閱讀框架被插入EcoRⅠ-NotⅠ位點(diǎn))。所有載體在使用前經(jīng)過N端測序。10.1.2 Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染和重組蛋白產(chǎn)生Sf9細(xì)胞在含11％HI-FBS的TNM FH的旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長，并使細(xì)胞數(shù)量維持在0.5至2×106個細(xì)胞/ml。建議采用帶有線性化baculo-gold DNA(Pharminogen)的InsectinTM(Invitrogen)脂質(zhì)體和相關(guān)的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞(Invitrogen)。所得重組桿狀病毒經(jīng)空斑純化和放大以產(chǎn)生高滴度的病毒貯液。pAcO-G1 p101病毒在27℃條件下感染吸附Sf9細(xì)胞2.2天；pAcHLT p120病毒可在27℃條件下在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中感染(通常地)1.9天。細(xì)胞收集于冰冷的0.41％KCl；2.66％蔗糖；20mM MgCl2；8mMNaH2PO4pH6.2,25℃溶液中；經(jīng)1mM二異丙基氟磷酸(冰上5分鐘)處理，并在收集溶液中沖洗一次。離心濃縮的分裝細(xì)胞在液氮中冷凍并保存于-80℃。10.1.3 Sf9來源的蛋白的純化豬p120用一種金屬離子鰲合柱(Talon,Clontech)純化。細(xì)胞沉集物以每1升感染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物50ml超聲緩沖液的比率融化，超聲緩沖液成分包括0.10M NaCl；50mM磷酸鉀，pH8.0,4℃；10mM Tris.HCl，pH8.0,4℃；1mm MgCl2和抗蛋白酶Ⅰ(見上文)，并用探針超聲破碎(冰上4×15秒破碎次)，并離心(120,000×g40分鐘，4℃)。移去上清且合并收集(管中上端云霧狀上清單獨(dú)分離；先用0.45μM濾器低蛋白結(jié)合力的濾膜過濾之后合并其余上清)。細(xì)胞漿流分中加入Tween-20和甜菜堿(分別為0.05％,w/v，和1％)后泵入已用平衡液(1.2ml樹脂每升原始Sf9感染物，線性流速20cm/小時)平衡的Talon柱，這一步以及以下步驟均在4℃進(jìn)行。柱隨后以如下諸液各20倍柱體積沖冼緩沖液A，50mM磷酸鈉，pH8.0,4℃；10mM Tris/HCl,pH8.0,4℃；0.15MNaCl；1％甜菜堿；0.05％,w/vTween-20；緩沖液B,1％,w/v,Triton X-100；0.15M NaCl；50mM磷酸鈉，pH8.0,4℃；10mM Tris,pH8.0,4℃；1％甜菜堿；0.05％,w/v,Tween-20；緩沖液C,0.15M NaCl；50mM磷酸鈉，pH7.1,4℃；1％甜菜堿；0.05％,w/v,Tween-20；緩沖液D,0.15M NaCl；30mM Tris,pH7.5,4℃；1％甜菜堿；0.02％,w/v,Tween-20 10％v/v，乙二醇；1mM MgCl2；然后加入8倍柱體積緩沖液E，其成份包括加入10mM咪唑的緩沖液D(pH7.5)。緩沖液E沖冼過程中，以2ml為單位進(jìn)行分部收集。最后，以前述所用流量的一半，用緩沖液F沖洗柱，其成份包括，加入70mM咪唑的緩沖液D(pH7.5；終濃度)。以1ml為單位進(jìn)行分部收集?；贏bs280nm蹤跡(連續(xù)記錄)依經(jīng)驗收集流分并立即加入1mM DTT和1mM EGTA(終濃度)。一般地，這個過程可在每升Sf9培養(yǎng)物中產(chǎn)生4mg p120。以這種方式制備的p120其純度一般大于90％。p120最終匯集物經(jīng)過一個裝有以緩沖液G平衡的15ml G-25超細(xì)柱去除鹽份。緩沖液G成份包括加入1mM DTT和1mM EGTA(終濃度)的緩沖液D。某些實驗中所用的p120空白也與制備正常p120完全平行地制備，其過程中只是細(xì)胞用野生型桿狀病毒感染或不感染起始細(xì)胞。源于這種空白制劑的最終流分也以一個“平行體積”收集，因為它實際上不含有蛋白。
p120的6×HIS標(biāo)記包含一個凝血酶切割識別基序。通過利用凝血酶的仔細(xì)滴定及用6％聚丙烯酰胺SDS-凝膠分析發(fā)現(xiàn)了兩個凝血酶位點(diǎn)，它們對凝血酶的敏感性相近，均在氨基端附近(因為有一種αCOOH-端抗體仍可將這種雙切p120免疫沉淀)。其中一個位點(diǎn)位于預(yù)期中所設(shè)計的標(biāo)記位置之內(nèi)，另一個位點(diǎn)約距氨基端40個殘基(此區(qū)域內(nèi)沒有凝血酶適合的識別序列)。在優(yōu)化的條件下(2U/ml，凝血酶；0.2mg/mlp120；4小時，4℃，含1mm EGTA,1mMMgCl2)可制備凝血酶切割的p120制劑，其中含15％未切割的p120,50％切于真正的氨基端凝血酶位點(diǎn)，35％有約額外40個殘基被切割。在這些實驗中，凝血酶的作用經(jīng)加入潛在的凝血酶抑制劑(sigma)來終止，該抑制劑為100nM N-乙?；鵇-Phe Pro-2-氨基-5胍基丁硼酸。貫穿這一工作的自始至終，部分切割的p120與完全未切割的p120的制劑是平行使用的。已經(jīng)明確的是(A)所有三種p120蛋白與p101的結(jié)合均有非常近似的親和力，(B)Gβγ對與p120混合物結(jié)合的p101的激活程度與它對與未切割的p120結(jié)合的p101的激活程度相近，(C)部分切割與未切割的p120在無p101時事實上對Gβγ亞基不敏感(雖然完全的凝血酶切割可使整個p120催化活性下降20-30％，并且由Gβγ增加1.7倍的表觀活性，在無p101的情況下增加2.5倍)。
豬(EE)-p101按以下方法從Sf9細(xì)胞冷凍沉淀物中純化。從2升感染的Sf9培養(yǎng)物中收集的細(xì)胞，按上述在50ml的0.12M NaCl；1mM MgCl2；25mM HEPES,pH7.4,4℃；1mM EGTA加抗蛋白酶Ⅰ中進(jìn)行超聲處理。離心后(120,000×g,,4℃,40分鐘)，移去上清(如上述)，加入1％w/vTriton X100,0.4％膽酸鈉，0.4M NaCl(終濃度)，與2ml與α-(myc)不相關(guān)單克隆抗體共價交聯(lián)的包裝蛋白G瓊脂糖(用平衡液沖洗)混合。在4℃混合30分鐘后，沉淀珠子取出上清并與1ml與α-(EE)單克隆抗體共價交聯(lián)的包裝蛋白G瓊脂糖(用平衡液沖洗)混合。4℃下混合2小時后，珠子用以下方式?jīng)_洗用于U937細(xì)胞α-(EE)免疫沉淀，除了(a)沖洗在20ml離心管中進(jìn)行，且(b)珠子最終以緩沖液H沖洗3次，其組成包括帶有1％,w/v,Triton X-100的緩沖液G。一些實驗中所用的‘p101空白’(p101C)的制劑如上文所述，可從野生型桿狀病毒感染或未感染的細(xì)胞制備。
用兩種類型的重組桿狀病毒共轉(zhuǎn)染sfq細(xì)胞在體內(nèi)形成的p101/p120異源二聚體用所述用于(EE)-p101的純化方法純化，除了免疫沉淀用緩沖液Ⅰ沖洗4次，緩沖液Ⅰ1％,w/v,Triton X-100；0.15M NaCl；20mMHEPES,pH7.4,4℃；1mM EGTA；用緩沖液J沖洗2次，其組成包括加入0.4M NaCl(終濃度)的緩沖液Ⅰ，然后以1個柱體積的緩沖液G中之150μg/ml(EE)肽洗脫前，用緩沖液G沖洗3次。這種(EE)肽，氨基端乙?；疎YMPTD，對α-(EE)單克隆抗體有很高的親合性。當(dāng)珠子與(EE)多肽在冰上共溫育40分鐘后，移取上清。洗脫蛋白的各等份進(jìn)行稀釋，并用于分析PI3K活性(見上文)或直接與SDS樣品緩沖液混合。
在體外重構(gòu)實驗中，在含有1％,w/v,Triton X-100(這時等同于緩沖液H)之緩沖液G中的p120制品與仍結(jié)合于蛋白G基質(zhì)的(EE)-p101(10:1蛋白摩爾比)混合，混合2小時(均在4℃)，然后如下文實施例中所述之體內(nèi)重構(gòu)的p101/120-PI3K純化的方法用(EE)-多肽進(jìn)行沖洗和洗脫。10.2結(jié)果應(yīng)用標(biāo)記的單步純化方式產(chǎn)生的純化蛋白制品可由考馬斯染色法鑒定，它們的表觀大小與預(yù)期相符。此外，兩者在Western雜交中通過特異性的COOH端定向以及由序列內(nèi)定向均能正確地識別抗多肽兔多克隆血清(未展示)，這提示了其真實性。
以上情況中，p120以1∶1摩爾化學(xué)計量緊密地結(jié)合于p101，無論(a)在體外，當(dāng)兩個蛋白均各自獨(dú)立純化后混合(p101仍與用于分離的蛋白G基質(zhì)結(jié)合)然后在用(EE)-肽洗脫前嚴(yán)格沖洗，或(b)在體內(nèi)，當(dāng)Sf9細(xì)胞用兩種構(gòu)型的rbv共感染且蛋白通過p101標(biāo)記純化(數(shù)據(jù)未展示)時。
游離的純化的p120是一個PtdIns(4,5)P2選擇的渥曼青霉素敏感的PI3K。Gβγ對游離p120PI3K活性有小的雙模式(bi-modal)影響。結(jié)合于GDP的Gα′so、i1、i2和i3的等摩爾混合物(終總濃度2μM)在氟化鋁的存在下，對游離p120PI3K活性沒有明顯影響(這是一種當(dāng)以1.5倍摩爾過量加入時能夠完全抑制Gβγ對PI3K作用的Gα制劑)。能夠活化p85/p110-PI3K家族成員的酪氨酸磷酸化的肽也對p120PI3K活性沒有可探測到的影響。當(dāng)結(jié)合于p101(體內(nèi)或體外)時，p120的PI3K活性可由Gβγ亞基激活增加100倍以上。酪氨酸磷酸化的肽和Gα-GDP/氟化鋁對Gβγ活化的，或基礎(chǔ)的，p101/p120PI3K活性沒有影響。在無Gβγ的條件下，p101/p120復(fù)合物中p120的特異性活性低于游離p120的特異性活性但在有Gβγ存在時可提高50倍以上(見圖7)。
在相同的、Gβγ刺激的實驗條件下比較豬嗜中性粒細(xì)胞來源的PI3K(B)和Sf9來源的p101/120異源二聚體的特異催化活性，表明來源于Sf9的物質(zhì)每毫克蛋白活性要高出2倍。這一結(jié)果與相近的從循環(huán)血嗜中性粒細(xì)胞制備的PI3K的年齡鑒定(‘a(chǎn)ge at assays’)實驗并不矛盾，該實驗通過4天純化步驟實現(xiàn)，并提示重組PI3K的主體是正確折疊的，并且任何重要的翻譯后修飾必是合適的。11．實施例豬p120和p101在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)構(gòu)建了一個可瞬時表達(dá)豬p101和p120的氨基端表位標(biāo)記的形式((myc)或(EE))的哺乳動物表達(dá)載體家族。本實施例描述了從哺乳動物細(xì)胞中純化的重組p101和p120融合蛋白的生產(chǎn)，接著分析了其性質(zhì)。11.1材料與方法11.1.1細(xì)胞培養(yǎng)U937細(xì)胞生長于含10％V/V熱滅活的(H1)-FBS的RPMI 1640中并且每2天稀釋4倍。Cos-7細(xì)胞生長于含10％HI-FBS的DMEM中。11.1.2表達(dá)載體的構(gòu)建利用N端PCR和恰當(dāng)?shù)南拗苾?nèi)切酶位點(diǎn)，將豬p120和p101開放閱讀框架處理成可插入多種表達(dá)載體的形式(在每種情形中在N-端標(biāo)記后之第一個氨酸酸編碼為起始蛋氨酸)。3’非翻譯的p120cDNA區(qū)域(resin)全長利用而p101cDNA的則在BamH Ⅰ位點(diǎn)(核苷酸位點(diǎn)192，圖1)截短。采用在哺乳細(xì)胞中巨細(xì)胞病毒驅(qū)動表達(dá)的載體(A)pCMV(EE)(編碼一個氨基端MEEEEFMPMPMEF(SEQ ID NO:7)或MEEEEFMPMEFSS(SEQⅠD NO:8)‘EE-標(biāo)記’分別用于p101或p120表達(dá))和(B)pCMV(myc)(編碼一個N端MEQKLISEEDLEF(SEQIDNO:9)或MEQKLISEEDLEFSS(SEQ ID NO:10)‘myc-標(biāo)記’分別用于p101或P102表達(dá))。在使用前所有載體均被氨基端測序。11.1.3 U937轉(zhuǎn)染步驟指數(shù)生長的U937細(xì)胞(12小時以前稀釋)于室溫，經(jīng)2次PBS沖洗，重懸于無菌電穿孔培養(yǎng)基(EM)中，該培養(yǎng)基包括30mM NaCl,0.12M KCl,8.1mM Na2HPO4,1.46mM KH2PO4和5mM MgCl2。環(huán)狀質(zhì)粒DNA加入含細(xì)胞的1×EM中，形成終體積0.5ml，包括1.4×107個細(xì)胞和40μg總DNA(一般采用40μg有相同啟動子和表達(dá)相近標(biāo)記但不含相關(guān)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒)，然后轉(zhuǎn)移到一個小杯中(0.4cm間隙，BioRad)。室溫靜置十五分鐘之后，進(jìn)行電穿孔(280v,960μF條件下，進(jìn)行一個脈沖，采用BioRad Gene脈沖儀，時間常數(shù)定為18毫秒)，然后放于冰上8分鐘，再以5ml含10％HI-FBS的RPMI稀釋。放置5分鐘以使死亡細(xì)胞聚集，細(xì)胞用補(bǔ)加青霉素和鏈霉素的含10％HI-FBS的35ml的RPMI稀釋，然后加入TPA和ZnCl2(均在U937細(xì)胞中對CMV啟動子的表達(dá)有放大作用)分別至終濃度5×10-8M和200μM。如果細(xì)胞要用[35S]-蛋氨酸(Translabel,ICN)標(biāo)記，則電穿孔后所用的RPMI中應(yīng)無蛋氨酸及亮氨酸，并含有2mM NaHCO3和25mM HEPES以及10％透析的HI-FBS并有細(xì)胞應(yīng)重懸于含20μCi/ml[35S]-蛋氨酸/亮氨酸(phsTPA和ZnCl2，如上)終體積10毫升的培養(yǎng)液中。12小時后，(無論有無[35S])細(xì)胞懸液與二異丙基氟磷酸混合(終濃度1mM)，放置五分鐘，然后離心收集，用PBS沖洗一次，裂解用于免疫沉淀。按如下方式對于來自U937細(xì)胞裂解產(chǎn)物的(EE)-表位標(biāo)記的蛋白進(jìn)行免疫沉淀。來自一次電穿孔的細(xì)胞裂解于1.25ml裂解緩沖液，其包括1％w/v Triton X-100,25mM HEPES,pH7.4,4℃；1mM EGTA,1mM MgCl2,0.15mM NaCl,0.1mM PMSF,10μg/ml亮肽素，10μg/ml抑酶肽，10μg/ml抗蛋白酶，10μg/ml抑胃酶肽A和10μg/ml甜菜堿(此后稱為抗蛋白酶Ⅰ)。離心裂解產(chǎn)物(12,000rpm,0℃,15分鐘)。所得上清取出并與4M NaCl(0.1ml),20％膽酸鈉(25μl)和共價偶聯(lián)于不相關(guān)的、異型配對的鼠單克隆抗體的蛋白G sepharose(40μl裝體積)混合(約5-10mg/ml sepharose)。上清顛倒混合20分鐘，沉淀珠子，上清轉(zhuǎn)移至另一個裝有共價偶聯(lián)于α-(EE)-鼠單克隆抗體的蛋白G sepharose珠子(10μl裝)的試管(約5-10mg/ml sepharose)。4℃下混合2小時之后，免疫沉淀物用1.0％,w/v,Triton X-100；0.4％膽酸鹽；0.004％SDS；0.4M NaCl；1mM EGTA；25mM HEPES,pH7.4，于0℃下洗5次；用0.5M LiCl,0.1M Tris,pH8.0,4℃下洗1次；用0.12M NaCl；1mM EGTA；25mM HEPES,pH7.4,0℃下沖洗2次。最后一次緩沖液補(bǔ)加1mM DTT(終沖洗緩沖液)。如果免疫沉淀物從[35S]-蛋氨酸標(biāo)記的細(xì)胞制備，最后一次沖洗可省略，珠子在SDS上樣緩沖液中煮沸。另外，樣品以下面所述進(jìn)行PI3K活性的鑒定。11.1.4 COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染指數(shù)生長的COS-7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染3小時前，用胰酶消化重鋪板成50-70％鋪滿。在轉(zhuǎn)染時再次胰酶消化，用10％FBS的DMEM稀釋，計數(shù)，以PBS洗兩次，并重懸于EM(每小瓶1×107個細(xì)胞)與環(huán)狀質(zhì)粒DNA混合(每小瓶40μg，組成為10μg EXV-(EE)-β1,10μg EXV-(myc)-τ2,10μgpCMV-(myc)-p120或10-40μg無關(guān)哺乳動物表達(dá)載體)，形成最終體積500μl，然后轉(zhuǎn)移到電穿孔小杯(0.4cm間隙，BioRad公司)。室溫10分鐘后對細(xì)胞行電穿孔(250V,960μF)，置冰上8分鐘，然后稀釋于含10％FBS的DMEM中，讓已凝結(jié)的細(xì)胞聚集，而當(dāng)細(xì)胞等分入60cm圓盤(每小瓶4個圓盤)時應(yīng)避免聚集。
48小時后，各自處理后的4個圓盤在HEPES緩沖的DMEM中沖洗，其中包括1mM NaHCO3和0.2％無脂肪酸的BSA。10小時后收集兩份重復(fù)圓盤用于Western雜交(以α-(myc)單克隆抗體為第一檢測試劑，α鼠-HRP為第二檢測系統(tǒng)，并用ECL和密度掃描定量測定)。這兩個圓盤用無磷酸鹽含1mM NaHCO30.2％無脂肪酸的BSA的DMEM沖洗，然后再與300μCi[32p]-Pi每圓盤(4ml)37℃下再溫育90分鐘。吸出培養(yǎng)基加入1ml冰冷的1M HCl。刮下并移取細(xì)胞，圓盤用1.33ml甲醇沖洗。HCl和甲醇沖洗物與2.66ml氯仿合并(形成一個′Folch′兩相溶媒分配)混合、離心。移取下層相并再與1.95ml含0.5m EDTA和1mM硫酸四丁基銨的新鮮上層相(見上文)混合?；旌稀㈦x心后，移取下層相，干燥，去乙?；⒅苽溆糜陉庪x子交換型HPLC(Stephen等，1991自然351:33-39，此處全文引入作為參考)。11.2結(jié)果當(dāng)在U937細(xì)胞內(nèi)瞬時表達(dá)時，(EE)-p101和(EE)-p120能夠約以等量從[35S]蛋氨酸標(biāo)記的細(xì)胞中特異性地免疫沉淀出來(對于蛋氨酸相對的compliment；分別為8∶25，數(shù)據(jù)未顯示)。嚴(yán)格沖洗的α-(EE)-p101免疫沉淀物包含有渥曼青霉素敏感的PtdIns(4,5)P2選擇性及Gβγ敏感的PI3K活性，而這一點(diǎn)在對照中，無論是用無關(guān)單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀或用一個編碼(EE)標(biāo)記的無關(guān)蛋白cDNA的表達(dá)產(chǎn)物，在用[35S]-蛋氨酸標(biāo)記評價時均沒有這一特性，其與(EE)-p101水平相近。
由Gβγτ產(chǎn)生的激活可由與2倍過量(摩爾數(shù))的Gα-GDP預(yù)溫育來阻斷。此外，在這些p101免疫沉淀物中的PI3K活性對Gα-GDP/氟化鋁不敏感。(myc)-p120與(EE)-p101共轉(zhuǎn)染不能提高在α-(EE)免疫沉淀物中特異性地恢復(fù)的活性。事實上它下降了，可能是由于(EE)-p101的表達(dá)在(myc)-p120表達(dá)載體存在時相對較低。相反，用(EE)-p120α-(EE)免疫沉淀物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無論在有無Gβγ時均幾乎不能檢測到PI3K活性。這些細(xì)胞中包含的[35S]蛋氨酸標(biāo)記的p120的摩爾量與來自(EE)-p101轉(zhuǎn)染細(xì)胞的α-(EE)免疫沉淀物中(EE)-p101的摩爾量相近。與(myc)-p101共轉(zhuǎn)染，除了(EE)-p120表達(dá)下降外(用[35S]蛋氨酸標(biāo)記評價)產(chǎn)生了一個實質(zhì)性增加，尤其是Gβγ激活的可恢復(fù)的PI3K的活性(見圖8)。這一數(shù)據(jù)提示U937細(xì)胞(人類)包含一個內(nèi)源性PI3K催化亞基，它可與瞬時表達(dá)的p101(豬)結(jié)合。當(dāng)結(jié)合p101(豬)后，內(nèi)源性催化亞基就表現(xiàn)出主要由Gβγ進(jìn)行調(diào)控，因為所有免疫沉淀物中的p120均與p101結(jié)合。
相反，從(EE)-p120轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中來的α-(EE)免疫沉淀物，大部分的p120與p101不結(jié)合，因此相對無活性(與有Gβγ存在時的結(jié)合于p101對比)。然而，在Gβγ存在條件下檢測PI3K活性時，通過與(myc)-p101共轉(zhuǎn)染明顯放大。對這些數(shù)據(jù)的另一種解釋---p120是“變性”的(雖可溶也可被免疫沉淀)除非在有p101條件下---不同于獨(dú)立的源于Sf9純化的蛋白所獲得的數(shù)據(jù)所顯示的。
為測試p101/p120在體內(nèi)是否能由Gβγ活化并產(chǎn)生Ptdlns(3,4,5)P3,我們在Cos-7細(xì)胞內(nèi)瞬時表達(dá)了(myc)-γ2、(EE)-β1、(myc)-p101和(myc)-p120的多種組合，并在轉(zhuǎn)染后48小時測定它們對細(xì)胞中[35P]-磷酸肌醇水平的影響(見圖9)。p120在有p101存在時以依賴β2γ2方式明顯增加PtdIns(3,4,5)P3和PtdIns(3,4)P2的產(chǎn)生。這一結(jié)果不能夠由引入的上述組合中不同的cDNA的相關(guān)表達(dá)中的變化來解釋(見圖9)。12．克隆的保藏以下微生物或克隆已于所示日期保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Rockville,Maryland并分配了保藏號碼克隆 ATCC保藏號保藏日期pCMV3mycp101976366/27/96pCMV3mycp120976376/27/96本發(fā)明不僅限于這里所述的僅僅意在對本發(fā)明各個方面加以單獨(dú)說明的特定的實施方案，功能上等同的方法和組分也包括在本發(fā)明的范圍中。確實，對本發(fā)明的各種修飾以及在此展示和描述的那些修飾，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員依上述的描述和附圖將是顯而易見的。這樣的修飾均會落入所附權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1．一種經(jīng)分離的核酸分子，其包括p101基因的核苷酸序列。
2．一種編碼p101調(diào)控亞基或其片段的經(jīng)分離的核酸分子，具有如下核苷酸序列a)編碼SEQ ID No:2，或編碼由保藏號為97636的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的pCMV3mycp101的cDNA克隆中所含的cDNA編碼的氨基酸序列；或b)在嚴(yán)格條件下可與(a)的核苷酸序列或其互補(bǔ)物雜交的序列。
3．一種編碼p101調(diào)控亞基或其片段的經(jīng)分離的核酸分子，具有如下核苷酸序列a)編碼SEQ ID No:12；或b)在嚴(yán)格條件下可與(a)的核苷酸序列或其互補(bǔ)物雜交的序列
4．一種根據(jù)權(quán)利要求2或3的經(jīng)分離的核酸分子，其中在中等嚴(yán)格條件下該核酸分子可與(a)的核苷酸序列或其互補(bǔ)物雜交，且其中該核酸分子編碼p101基因產(chǎn)物的功能等同物。
5．一種根據(jù)權(quán)利要求2或3的經(jīng)分離的核酸分子，其中在高度嚴(yán)格條件下該核酸分子可與(a)的核苷酸序列或其互補(bǔ)物雜交。
6．一種根據(jù)權(quán)利要求2或3的經(jīng)分離的核酸分子，其中該核酸分子編碼SEQ ID No:2，或編碼由保藏號為97636的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的pCMV3mycp101的cDNA克隆中所含的cDNA編碼的氨基酸序列。
7．一種根據(jù)權(quán)利要求2或3的經(jīng)分離的核酸分子，其中該核酸分子編碼SEQ ID No:12。
8．一種經(jīng)分離的核苷酸序列，其編碼相應(yīng)于p101調(diào)控亞基蛋白的催化亞基相互作用結(jié)構(gòu)域或Gβγ相互作用結(jié)構(gòu)域的多肽，或相應(yīng)于p101調(diào)控亞基蛋白的缺失突變體的多肽，其中此突變體的催化亞基相互作用結(jié)構(gòu)域或Gβγ相互作用結(jié)構(gòu)域被刪除。
9．一種經(jīng)分離的核苷酸序列，其編碼包含權(quán)利要求1至8中任一項中的與一種異源多肽融合的多肽的一種嵌合蛋白質(zhì)。
10．權(quán)利要求9的經(jīng)分離的核苷酸序列，其中異源多肽為一種Glu標(biāo)記或myc表位標(biāo)記。
11．一種包含權(quán)利要求1到10中任一項中的核苷酸序列的核苷酸載體。
12．一種表達(dá)載體，其包含與在宿主細(xì)胞中控制該核苷酸序列表達(dá)的一種核苷酸調(diào)控序列有效地結(jié)合的權(quán)利要求1至10中任一項中的核苷酸序列。
13．權(quán)利要求12的表達(dá)載體，其中所述調(diào)控序列選自巨細(xì)胞病毒hCMV極早期基因啟動子、SV40腺病毒早期或晚期啟動子、桿狀病毒啟動子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、λ噬菌體的主要操縱子和啟動子區(qū)域、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶啟動子、酸性磷酸酶啟動子和酵母α交配因子啟動子。
14．一種經(jīng)基因工程改造以含有權(quán)利要求1到13中任一項中的核苷酸序列的宿主細(xì)胞。
15．一種根據(jù)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞經(jīng)基因工程改造以含有與在宿主細(xì)胞中控制該核苷酸序列表達(dá)的一種核苷酸調(diào)控序列有效地結(jié)合的權(quán)利要求1到13中任一項中的核苷酸序列。
16．權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是Sf9細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、COS細(xì)胞或U937細(xì)胞。
17．一種經(jīng)基因工程改造的宿主細(xì)胞，其中天然p101基因序列或編碼權(quán)利要求1到13中任一項中的核苷酸序列的序列被破壞，以便抑制或阻礙天然p101基因產(chǎn)物的表達(dá)。
18．一種經(jīng)分離的G蛋白激活的PI3K，其包含一個p101調(diào)控亞基和一個p120催化亞基。
19．一種經(jīng)分離的p101調(diào)控亞基蛋白。
20．一種經(jīng)分離的p101調(diào)控亞基蛋白，其具有SEQ ID No:2的氨基酸序列，或由保藏號為97636的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的pCMV3mycp101的cDNA克隆中所含的cDNA編碼的氨基酸序列。
21．一種經(jīng)分離的p101調(diào)控亞基蛋白，其具有SEQ ID No:12的氨基酸序列。
22．一種多肽，其具有相應(yīng)于p101調(diào)控亞基蛋白的催化亞基相互作用結(jié)構(gòu)域或Gβγ相互作用結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，或p101調(diào)控亞基蛋白的缺失突變體的氨基酸序列，其中該突變體的催化亞基相互作用結(jié)構(gòu)域或Gβγ相互作用結(jié)構(gòu)域被刪除。
23．一種包含與一種異源多肽結(jié)合的權(quán)利要求19,20,21或22中的多肽的嵌合蛋白。
24．權(quán)利要求23的嵌合蛋白，其中所述異源多肽是一種Glu標(biāo)記或myc表位標(biāo)記。
25．一種與權(quán)利要求19、20、21或22的p101調(diào)控亞基蛋白免疫特異性結(jié)合的抗體。
26．一種診斷哺乳動物炎性應(yīng)答紊亂的方法，包含檢測哺乳動物基因組中所含的p101基因突變。
27．一種篩選治療炎性應(yīng)答紊亂的有效化合物的方法，包括用化合物接觸G蛋白激活的PI3K和脂膜，并鑒定磷酸向脂膜的遷移。
28．權(quán)利要求27的方法，其中G蛋白激活的PI3K包含p101、p120和Gβγ。
29．權(quán)利要求27的方法，其中脂膜含有PtdIns(4,5)P2。
30．權(quán)利要求27的方法，其中磷酸向脂膜的遷移是通過定量遷移到脂質(zhì)產(chǎn)物的32P標(biāo)記的磷酸來測定。
31．一種篩選治療炎性應(yīng)答紊亂的有效化合物的方法，包括用化合物接觸表達(dá)p101基因的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，檢測p101基因表達(dá)的變化，由所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)的p101基因產(chǎn)物活性的變化，第二信使PtdIns(3,4,5)P3產(chǎn)生的變化，細(xì)胞粘附性的變化，或O2產(chǎn)量的變化。
32．權(quán)利要求31的方法，其中通過測定p101基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物檢測p101基因的表達(dá)。
33．權(quán)利要求31的方法，其中通過測定p101調(diào)控亞基蛋白檢測p101基因的表達(dá)。
34．權(quán)利要求31的方法，其中通過陰離子交換型HPLC檢測宿主細(xì)胞中PtdIns(3,4,5)P3的水平。
35．一種治療哺乳動物炎性應(yīng)答紊亂的方法，包括向哺乳動物施用一定量的足以通過p101調(diào)控亞基抑制G蛋白激活的PI3K的活化的化合物。
36．權(quán)利要求35的方法，其中炎性應(yīng)答紊亂選自關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺炎、哮喘、過敏癥、再灌注損傷、動脈粥狀硬化、阿爾茨海默病和癌癥。
37．權(quán)利要求35的方法，其中該化合物被輸運(yùn)至造血源細(xì)胞。
38．權(quán)利要求35的方法，其中該化合物是與p101調(diào)控亞基結(jié)合的拮抗劑并抑制G蛋白介導(dǎo)的PI3K的活化。
39．權(quán)利要求35所述方法，其中該化合物阻斷了P13K的催化亞基與p101調(diào)控亞基的相互作用。
40．權(quán)利要求35的方法，其中該化合物是一種編碼信號傳遞缺陷的p101調(diào)控亞基或其片段的寡核苷酸構(gòu)建體，這種寡核苷酸構(gòu)建體被一個在體內(nèi)靶細(xì)胞中指導(dǎo)信號傳遞缺陷亞基或片段的表達(dá)的調(diào)控序列所控制。
41．權(quán)利要求35的方法，其中該寡核苷酸構(gòu)建體編碼信號傳遞缺陷的p101調(diào)控亞基缺失突變體，該突變體中Gβγ相互作用結(jié)構(gòu)域被刪除。
42．一種治療哺乳動物炎性應(yīng)答紊亂的方法，包括向哺乳動物施用一定量的足以在體內(nèi)抑制p101調(diào)控亞基表達(dá)的化合物。
43．權(quán)利要求42的方法，其中炎性應(yīng)答紊亂選自關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺炎、哮喘、過敏癥、再灌注損傷、動脈粥狀硬化、阿爾茨海默病和癌癥。
44．權(quán)利要求42的方法，其中該化合物被輸運(yùn)至造血源細(xì)胞。
45．權(quán)利要求42的方法，其中該化合物為抑制編碼p101調(diào)控亞基的mRNA轉(zhuǎn)錄物翻譯的一種反義寡核苷酸。
46．權(quán)利要求42的方法，其中該化合物是一種抑制編碼p101調(diào)控亞基的mRNA轉(zhuǎn)錄物翻譯的核酶。
47．權(quán)利要求42的方法，其中該化合物是一種與p101調(diào)控亞基基因的調(diào)控區(qū)形成一種三螺旋并抑制轉(zhuǎn)錄的寡核苷酸。
48．權(quán)利要求42的方法，其中該化合物是一種通過靶向同源重組滅活p101調(diào)控亞基基因或其調(diào)控區(qū)的重組DNA構(gòu)建體。
49．一種治療哺乳動物炎性應(yīng)答紊亂的方法，包括向哺乳動物施用一定量的足以上調(diào)哺乳動物中功能性p101調(diào)控亞基表達(dá)的化合物。
50．根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中該化合物被輸運(yùn)至造血細(xì)胞。
51．權(quán)利要求49的方法，其中該哺乳動物表達(dá)一種缺陷的p101調(diào)控亞基，且該化合物包含一種編碼由一個調(diào)控區(qū)控制的功能性p101調(diào)控亞基的核苷酸構(gòu)建體，該調(diào)控區(qū)在哺乳動物靶細(xì)胞中指導(dǎo)功能性受體的表達(dá)。
52．權(quán)利要求49的方法，其中哺乳動物表達(dá)一種突變的p101調(diào)控亞基，且該化合物包含一種編碼野生型p101調(diào)控亞基的核苷酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體通過靶向同源重組糾正內(nèi)源性突變。
53．一種包括p120基因核苷酸序列的經(jīng)分離的核酸分子。
54．一種編碼p120催化亞基或其片段的經(jīng)分離的核酸分子，具有如下核苷酸序列a)編碼SEQ ID No:4或編碼保藏號為97637的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的pCMV3mycp120的cDNA克隆中所含的cDNA編碼的氨基酸序列；或b)在嚴(yán)格條件下至少可與編碼p120蛋白最后28個氨基酸的(a)的核苷酸序列或其互補(bǔ)物雜交的序列。
55．一種編碼p120催化亞基或其片段的經(jīng)分離的核酸分子，具有如下核苷酸序列a)編碼SEQ ID No:14；或b)在嚴(yán)格條件下至少可與編碼p120蛋白最后28個氨基酸的(a)的核苷酸序列或其互補(bǔ)物雜交的序列。
56．一種根據(jù)權(quán)利要求54或55的經(jīng)分離的核酸分子，其中該核酸分子在高度嚴(yán)格條件下至少可與編碼p120蛋白最后28個氨基酸的(a)的核苷酸序列或其互補(bǔ)物雜交的序列。
57．一種根據(jù)權(quán)利要求54的經(jīng)分離的核酸分子，其中該核酸分子編碼SEQ ID No:4或編碼保藏號為97637的保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的pCMV3mycp120的cDNA克隆中所含的cDNA編碼的氨基酸序列。
58．一種根據(jù)權(quán)利要求55的經(jīng)分離的核酸分子，其中該核酸分子編碼SEQ ID No:14。
59．一種表達(dá)載體，其包含與在宿主細(xì)胞中控制該核苷酸序列表達(dá)的一種核苷酸調(diào)控序列有效地結(jié)合的權(quán)利要求53到58中的任一項中的核苷酸序列。
60．一種經(jīng)基因工程改造以含有權(quán)利要求53到58中的任一項中的核苷酸序列的宿主細(xì)胞。
61．一種經(jīng)基因工程改造以含有權(quán)利要求1到13以及權(quán)利要求53到58中的任一項中的核苷酸序列的宿主細(xì)胞。
62．權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是一種動物的一部分。
63．權(quán)利要求60的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是一種動物的一部分。
64．權(quán)利要求61的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是一種動物的一部分。
65．一種編碼p101調(diào)控亞基或其片段的經(jīng)分離的核酸分子，其含有選自編碼下列氨基酸序列的核苷酸序列，包括編碼1-160位氨基酸殘基的SEQ ID No:2，編碼161-263位氨基酸殘基的SEQ ID No:2，編碼1-732位氨基酸殘基的SEQ ID No:2，編碼733-877位氨基酸殘基的SEQ ID No:2；編碼1-160位氨基酸殘基的SEQ ID No:12，編碼161-263位氨基酸殘基的SEQ ID No:12，編碼1-735位氨基酸殘基的SEQ ID No:12和編碼736-880位氨基酸殘基的SEQ ID No:12。
66．一種編碼p120亞基或其片段的經(jīng)分離的核酸分子，其含有選自編碼下列氨基酸序列的核苷酸序列，包括編碼從約41延伸至1102位氨基酸殘基的SEQ ID No:4和編碼從約41延伸至1102位氨基酸殘基的SEQ ID No:14。
67．一種編碼p120亞基或其片段的經(jīng)分離的核酸分子，其含有選自編碼下列氨基酸序列的核苷酸序列，包括編碼173-302位氨基酸殘基的SEQ ID No:4，或編碼173-302位氨基酸殘基的SEQ ID No:14。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼受G蛋白調(diào)控的磷脂酰肌醇－3’激酶的核苷酸的發(fā)現(xiàn)、鑒定和表征。該激酶是一種異源二聚體酶,在與三聚體的G蛋白結(jié)合的受體的激活下產(chǎn)生胞內(nèi)信使,磷脂酰肌醇(3,4,5)－三磷酸。這一新型蛋白質(zhì)包括一個催化亞基p120,和一個調(diào)控亞基p101,它存在于造血源細(xì)胞中并參與導(dǎo)致炎癥的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。p101亞基的存在是活化的三聚體G蛋白存在下,激酶活性被強(qiáng)烈地激活的主要原因。本發(fā)明包括編碼p101和p120的核苷酸。宿主細(xì)胞表達(dá)體系、p101和p120蛋白、融合蛋白、多肽和肽、這些蛋白的抗體、表達(dá)p101或p120轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物、或不表達(dá)p101或p120基因的重組敲除細(xì)胞和動物、該酶的拮抗劑和激動劑、其它調(diào)節(jié)p101或p120基因表達(dá)或酶活性的可被用于診斷、藥物篩選、臨床試驗劑量測定、和/或用于炎性紊亂的治療的化合物。
文檔編號A61K38/00GK1306576SQ97197004
公開日2001年8月1日 申請日期1997年6月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月27日
發(fā)明者L·斯泰芬斯, P·T·豪肯斯, S·布拉塞爾曼 申請人:昂尼克斯藥物公司