專(zhuān)利名稱(chēng)：純化的精子表面抗原、其單克隆抗體,以及它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種精子表面抗原、抗該抗原的一種單克隆抗體以及所述單克隆抗體和抗原的應(yīng)用。具體地說(shuō)，通過(guò)將該抗原用作免疫原，本發(fā)明提供了一種避孕用疫苗，以及可用于免疫測(cè)定中的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，該單克隆抗體可用作殺精子劑和診斷試劑。
相關(guān)工作背景有關(guān)較好避孕方法的開(kāi)發(fā)一直受到廣泛關(guān)注。一項(xiàng)已廣泛開(kāi)發(fā)的技術(shù)是使用殺精子劑，其實(shí)質(zhì)上是一種化學(xué)屏障，可阻止精子穿過(guò)子宮或卵細(xì)胞，或者抑制其活性，從而避免受精。得到極廣泛使用的一種殺精子劑是去污劑壬苯聚醇-9。多個(gè)報(bào)道表明，使用這種去污性殺精子劑，會(huì)提高婦女發(fā)生尿道感染和子宮頸陰道炎的機(jī)率。McGroarty等，泌尿?qū)W雜志，152(3):831-833(1994)。作為化學(xué)去污劑的另一種選擇，作者已提出，單克隆抗體在局部應(yīng)用中，如在局部殺精子劑的應(yīng)用中可能是一種比較安全的活性劑。參見(jiàn)如Cone等，美國(guó)生殖免疫學(xué)雜志，32:114-131(1994)。研究結(jié)果表明，除了可降低甚至消除不需要的免疫反應(yīng)外，人單克隆抗體應(yīng)能作為安全的殺精子劑，因?yàn)樗鼈兊膭┝亢蛻?yīng)用持續(xù)時(shí)間可很好控制，局部釋放可將全身性暴露降至最低，并且可以對(duì)單克隆抗體進(jìn)行選擇以利于安全性和有效性。因此，作為局部殺精子劑而遞送的精子活性單克隆抗體可導(dǎo)致期望的抗受精效果，且同時(shí)并不產(chǎn)生應(yīng)用去污劑殺精子劑時(shí)所伴生的負(fù)面副效應(yīng)。一般參見(jiàn)Alexander，科學(xué)美國(guó)，9月刊136-141(1995)。因此，本領(lǐng)域的一個(gè)目標(biāo)仍然是應(yīng)用單克隆抗體提供一種安全有效的殺精子劑。
已對(duì)大量的單克隆抗體作為潛在的精子反應(yīng)性試劑作了研究。其中得到研究的一種抗體是抗人精子單克隆抗體S19。這一單克隆抗體的建立參見(jiàn)Anderson等，生殖免疫學(xué)雜志，10:231-257(1987)。此抗體是通過(guò)用人精子勻漿物免疫小鼠而得到的。在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中發(fā)現(xiàn)此IgG1單克隆抗體與人精子發(fā)生很強(qiáng)的凝集反應(yīng)，隨后該單克隆抗體被遞交到世界衛(wèi)生組織-抗精子單克隆抗體主辦工作室進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。該抗人精子單克隆抗體S19很強(qiáng)地凝集人精子，抑制人精子和透明帶之間的緊密結(jié)合，阻斷精子穿過(guò)宮頸粘液。Anderson，出處同前；Cone，出處同前；Mahoney等，生殖免疫學(xué)雜志，19:269-285(1991)。在錄像帶中可看到該抗體對(duì)精子的強(qiáng)凝集作用。這些發(fā)現(xiàn)表明相關(guān)的S19抗原在受精過(guò)程中參與配子的相互作用，可能是導(dǎo)致免疫性不孕的自身抗體的靶，可作為開(kāi)發(fā)避孕用疫苗的一個(gè)候選者。
然而，不管是作為研究工具，還是作為避孕劑，S19抗體都并未得到進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)。迄今仍無(wú)S19抗體的保藏，它也未被“人源化”以降低免疫反應(yīng)的機(jī)率。該單克隆抗體未得到詳細(xì)的研究，迄今為止，它基本上仍是一個(gè)科學(xué)盲區(qū)。
還已知其它單克隆抗體和精子抗原。在美國(guó)專(zhuān)利5436137(Herr等)中討論了單克隆抗體MHS-10和與其結(jié)合的抗原SP-10(一種頂體內(nèi)抗原)，它是用于精子診斷和用作避孕用疫苗的用途的一個(gè)候選者，所述專(zhuān)利引入本文作為參考。然而，不同于SP-10抗原，與S19單克隆抗體結(jié)合的抗原-精子凝集抗原1(sperm agglutination antigen-1,SAGA-1)似乎位于人精子的整個(gè)表面。這一發(fā)現(xiàn)有力地暗示該單克隆抗體可結(jié)合并凝集于整個(gè)精子表面的多個(gè)位點(diǎn)。
應(yīng)用SP-10抗原的疫苗的開(kāi)發(fā)性工作正在進(jìn)行中。類(lèi)似地，世界上許多研究者正在分析開(kāi)發(fā)出基于精子抗原的避孕用疫苗的可能性。參見(jiàn)如Aitken等，英國(guó)醫(yī)學(xué)雜志，49:88-99(1993),Freemerman等，生物生殖，50:615-621(1994)和Herr，受精控制；pp431-452(第二版，1994)。在這一點(diǎn)上，有關(guān)人絨毛膜促性腺激素(hCG)用作婦女避孕用疫苗的工作仍在進(jìn)行中。Talwar，免疫學(xué)現(xiàn)代觀念(Current Opinion inImmunology),6:698-704(1994)和歐洲專(zhuān)利86304274.3。對(duì)此潛在疫苗正在進(jìn)行臨床疫苗試驗(yàn)，而hCG免疫原早已用作墮胎藥，也就是說(shuō)，接種該疫苗而引起的免疫響應(yīng)會(huì)導(dǎo)致早期胚胎或胎兒的流產(chǎn)。對(duì)許多人來(lái)說(shuō)，這可能是一種不能接受的避孕藥。
另外，已在靈長(zhǎng)類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型中對(duì)多種精子表面抗原進(jìn)行了研究。利用精子表面抗原如LDH-C4(O′Hern等，生物生殖，52:331-339(1995))、PH-20(Primakoff等，自然，335:543-546(1988))、RSA-1(O′Rand等，生殖免疫學(xué)雜志，25:89-102(1993))和fertilin(Ramarao等，分子生殖與發(fā)育，43:70-75(1995))等免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，導(dǎo)致了受精率降低。令人失望的是，在靈長(zhǎng)類(lèi)中，利用精子抗原所觀察到的最高有效率為約75％的受精抑制率，O′Hern等，出處同前。因此，迄今為止，仍未鑒定出一種有效的人精子抗原，在用作避孕用疫苗時(shí)其效力水平能與口服避孕藥相當(dāng)。因此，提供一種安全有效且受精抑制率較高(與口服避孕藥的效力水平在同一數(shù)量級(jí))的避孕用疫苗仍是本領(lǐng)域技術(shù)人員的一個(gè)課題。
此外，由于接種了避孕用疫苗的那些人有必要定期測(cè)定血清抗體以確定他們是否“安全”，因此最好是在測(cè)定中使用SAGA-1抗原作為目標(biāo)來(lái)測(cè)定接受該疫苗接種的人體內(nèi)的抗體濃度。
用于檢測(cè)與懷孕相關(guān)的激素(hCG和其它)的“公開(kāi)交易”(over thecounter)測(cè)定或診斷試劑盒在市場(chǎng)上已獲得巨大成功，相對(duì)于到診所進(jìn)行頗為尷尬、不便且昂貴的診治，這是另一種選擇或者說(shuō)是首要步驟。近年來(lái)，人們的注意力一直集中在對(duì)使用者精液中精子的存在與濃度的測(cè)定中。從受精咨詢(xún)以及強(qiáng)奸情形下的臨床診斷來(lái)看，或者是為了能夠測(cè)定是否已接受了輸精管切除術(shù)以及這一手術(shù)的效果，日益需求一種簡(jiǎn)便的測(cè)試試劑盒，利用這種試劑盒能在家中方便有效地進(jìn)行樣品中精子的檢測(cè)。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)流水號(hào)08/231,675中公開(kāi)了這樣一種測(cè)試試劑盒，其中使用了MHS-10單克隆抗體來(lái)檢測(cè)SP-10頂體內(nèi)精子抗原，該專(zhuān)利申請(qǐng)引入本文作為參考。除了MHS-10抗體外，S19抗體為用于人精子診斷提供了另一種有效結(jié)合。
發(fā)明簡(jiǎn)述通過(guò)使用“人源化”重組型單克隆S19抗體，純化可與其結(jié)合的相應(yīng)抗原-SAGA-1，并將其用作活性劑，可以達(dá)到上述目的。通過(guò)適當(dāng)載體而調(diào)動(dòng)的該單克隆抗體提供了一種有效的結(jié)合劑，即用作殺精子劑和人精子診斷劑。SAGA-1抗原是一種分布于精子整個(gè)表面的人精子糖蛋白，它提供了一種有效的免疫原，并且可在正進(jìn)行著疫苗治療的個(gè)體中用作測(cè)定避孕用抗體產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)。
為了提供一種有效的殺精子劑凝膠或乳劑，該單克隆體必須以存在于有效載體中的形式提供。可用于研究的一些載體有為抗原或抗體遞送而特別配制的非磷脂類(lèi)脂質(zhì)體等。一種商業(yè)形式目前可從Novavax,Inc.,Rockville,Maryland購(gòu)得，商標(biāo)為NOVASOMES。S19單克隆抗體有可能結(jié)合到這些帶正電荷的脂質(zhì)體的表面。也可制備其它精子凝集載體和組合物。
制備有效疫苗的首要步驟是純化SAGA-1抗原。摻入于藥學(xué)可接受載體中的該純化抗原可施用給期望進(jìn)行避孕用接種的患者。重復(fù)接種可導(dǎo)致產(chǎn)生抗精子的抗體，能高效結(jié)合精子。為了檢查抗體有效水平的情況，可利用該純化抗原作為試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)劑，以通過(guò)常規(guī)診斷方法，確定患者體內(nèi)是否存在抗體以及抗體存在量。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是S19單克隆抗體與SAGA-1反應(yīng)得到的Western印跡分析結(jié)果的照片。
圖2是SAGA-1的Triton-X-114相分配的SDS-PAGE免疫印跡結(jié)果的照片。
圖3是通過(guò)序列分析得到的S19單克隆抗體k輕鏈的核苷酸堿基序列。
圖4是結(jié)合于S19單克隆抗體免疫基質(zhì)柱的SAGA-1制備物的Western印跡分析結(jié)果的照片。
圖5是通過(guò)序列分析得到的S19單克隆抗體重鏈的核苷酸堿基序列。
發(fā)明詳述本文申請(qǐng)人的發(fā)明包括單克隆抗體S19；與它結(jié)合的抗原-SAGA-1；在適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受載體中使用所述單克隆抗體的殺精子劑；利用SAGA-1作為免疫原的避孕用疫苗；診斷測(cè)定和試劑盒，其中利用結(jié)合的S19作為診斷劑來(lái)確定精子濃度，利用SAGA-1作為標(biāo)準(zhǔn)試劑來(lái)確定接種疫苗而導(dǎo)致的抗體產(chǎn)生情況；以及相關(guān)的應(yīng)用。以上各方面在下文均有敘述。
盡管對(duì)所述抗體、所述蛋白質(zhì)以及它們的應(yīng)用的討論是單獨(dú)進(jìn)行的，但本發(fā)明是基于這樣一個(gè)共識(shí)，即SAGA-1蛋白廣泛分布于精子表面，能與S19單克隆抗體積極結(jié)合，而S19單克隆抗體可在受精過(guò)程的多個(gè)步驟明顯阻斷精子功能，包括抑制精子活力和配子間的相互作用。單克隆抗體S19如上所述，盡管以前一直未公開(kāi)獲得，但S19單克隆抗體一直是研究和現(xiàn)有出版物的主題。最初的S19抗體是通過(guò)用人精子勻漿物免疫小鼠而得到的。此抗人精子單克隆抗體能強(qiáng)烈凝集人精子，抑制人精子和透明帶之間的緊密結(jié)合，阻斷精子穿過(guò)宮頸粘液，并誘發(fā)精子的搖擺現(xiàn)象。
已按照布達(dá)佩斯條約條件，于1996年6月26日將所述S19單克隆抗體保藏于ATCC，保藏號(hào)為HB 12144。據(jù)申請(qǐng)人所知，這種保藏還是首次。
該S19單克隆抗體強(qiáng)列地凝集人精子的能力已在體外得到了證實(shí)。通過(guò)顯微錄像對(duì)凝集作用進(jìn)行分析。已制成一部錄像電影。凝集的證實(shí)每一實(shí)驗(yàn)中，稀釋人精液至終濃度為2×107個(gè)精子/毫升，按1∶10的比例稀釋腹水。在Eppendorf管中混合精子和腹水，然后置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上。用時(shí)間間隔照像術(shù)(time lapse photography)記錄S19腹水的結(jié)果。
在0時(shí)刻精子自由游動(dòng)，10分鐘后精子則完全被凝集了。使用空白腹水液作為對(duì)照。(0時(shí)刻是指將精子置于載玻片上并開(kāi)始照相的時(shí)間點(diǎn))。其中精子自由游動(dòng)?？擅黠@看到碎片和圓細(xì)胞。在10分鐘后對(duì)照中精子活力或凝集程度無(wú)明顯改變。
這些結(jié)果表明該S19單克隆抗體在整個(gè)精子表面的多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合、凝集人精子。所有精子均完全凝集說(shuō)明抗SAGA-1單克隆抗體可以作為精子功能的有效終止劑，因而也是受精的有效終止劑。殺精子劑的制備如上所述，文獻(xiàn)中理論上闡述了多種基于單克隆抗體的殺精子劑的開(kāi)發(fā)。適用的載體在Cone和Alexander(出處同前)中有記載。申請(qǐng)人已開(kāi)發(fā)出了一種可以凝集形式提供S19單克隆抗體的特定載體，其中使用了可從Novavax Inc.,Rockville,Maryland按商品名Novasomes購(gòu)得的脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。這些脂質(zhì)體經(jīng)特殊配制以用于抗原或抗體的遞送。含有天然S19單克隆抗體分子的Novasome可在殺精子劑凝膠中有效發(fā)揮殺精子劑功能，其中所述S19單克隆抗體分子結(jié)合于這些帶正電的非磷脂類(lèi)脂質(zhì)體表面。利用上述的精子凝集測(cè)定檢測(cè)Novasome制劑。1∶10稀釋度的S19-Novasome載體凝集精力的效率與1∶20稀釋度的S19腹水液相同。這些結(jié)果表明該S19單克隆抗體摻入到可商購(gòu)的遞送系統(tǒng)中時(shí)，其對(duì)精子功能的影響與存在于天然流體中一樣。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能得到其它遞送系統(tǒng)，這些系統(tǒng)中較為突出的有結(jié)合了脂類(lèi)的肽(參見(jiàn)如Deres等，自然，342:561-564(1989))和ISCOM(參見(jiàn)如Takahashi，自然，344:872-875)。過(guò)去已開(kāi)發(fā)了其它一些制劑，包括疏水性乳劑類(lèi)和皂苷類(lèi)，以用于特定肽的加工和成形，這些制劑也可用于本文所述的殺精子劑抗體。參見(jiàn)如Raychaudhuri等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，89:8308-8312(1992)和Newman等，免疫學(xué)雜志，148:2357-2362(1992)。同樣可使用其它載體，包括在膜上展示抗體，如由重組病毒表達(dá)的那些(即采用重組病毒方案，其中編碼如前所述抗體的DNA與一種結(jié)構(gòu)性膜蛋白一起在重組細(xì)胞內(nèi)表達(dá))。在可獲得的那些種類(lèi)中，除了前述的非磷脂類(lèi)脂質(zhì)體之外，普遍用于疫苗中以展示抗原的ISCOM也可提供理想的性質(zhì)。ISCOM形成類(lèi)成骨架一樣的膜結(jié)構(gòu)，在其內(nèi)或上面可展示抗體。以前已將ISCOM用于抗原的展示中，但它們是類(lèi)似地將抗體蛋白質(zhì)展示于一種暴露的、病毒樣結(jié)構(gòu)中。就此而言，已知可用于活性蛋白質(zhì)展示的其它載體，包括共聚物球狀體和病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)已知也能得到與免疫激發(fā)復(fù)合物(immune-stimulating complexes，或稱(chēng)ISCOMs)相似的結(jié)果。當(dāng)然，一種極其常規(guī)的系統(tǒng)，即抗體通過(guò)耦合劑結(jié)合于微球體表面，有可能適合與可接受的生產(chǎn)技術(shù)一起使用以制備適于這一途徑的凝膠和霜?jiǎng)?br> 因此，本申請(qǐng)人的殺精子劑的實(shí)質(zhì)是將含于合適載體內(nèi)的足夠濃度的S19單克隆抗體摻入合適的載體中以有效抑制(凝集或結(jié)合)精液中存在的所有精子。S19單克隆抗體的分離、鑒定和克隆培養(yǎng)能分泌S19的MHS-8雜交瘤細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以便利用Fast Track2.0試劑盒(Invitrogen)從1×107個(gè)細(xì)胞中制備RNA。利用去污劑裂解緩沖液和蛋白質(zhì)降解緩沖液，直接從細(xì)胞分離總RNA。然后利用改進(jìn)的Aviv和Leder方法分離poly(A)+RNA，其中mRNA結(jié)合于oligo-dT樹(shù)脂上。然后用低鹽緩沖液洗滌樹(shù)脂以除去外部總RNA，再?gòu)臉?shù)脂中洗脫出poly(A)+RNA。在260nm和280nm進(jìn)行分光光度分析，結(jié)果表明poly(A)+RNA的終濃度為1.84μg/μl。poly(A)+RNA的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增S19是一種二價(jià)抗體，可通過(guò)其交聯(lián)精子表面的抗原表位的能力而作為人精子凝集素起作用。為了使重組蛋白質(zhì)也保留這一功能，鑒定出了該抗體中可識(shí)別抗原表位的區(qū)域或者互補(bǔ)性決定區(qū)(complimentarydetermining regions,CDRs)。合成4種鼠寡核苷酸以用于IgG1特異性重鏈和輕(k)鏈亞基。設(shè)計(jì)的這些寡核苷酸能夠僅擴(kuò)增S19的可變區(qū)(大約開(kāi)始的360個(gè)堿基對(duì))，該區(qū)中含有CDR。這些寡核苷酸序列如下1．重鏈5′末端ACTAGTCGACATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG2．重鏈3′末端CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG3．輕鏈5′末端CCCCCCGGGGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCT4．輕鏈3′末端CCCCCCGGGGATGGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCG重鏈寡核苷酸得自Ig-Prime試劑盒(Novagen)，其中核苷酸的簡(jiǎn)寫(xiě)如下R=A或G,I=肌苷，K=G或T。用dH2O將所有寡核苷酸稀釋至終濃度為1.0μg/μl。
利用Promega的Access RT-PCR系統(tǒng)在一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行S19雜交瘤poly(A)+RNA的逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增。簡(jiǎn)言之，在一個(gè)0.5ml微量離心管中混合5μg的S19雜交瘤細(xì)胞的poly(A)+RNA，每一合適引物(重鏈中用引物1和2，輕鏈中用引物3和4)各1μg,10mM dNTP混合物1μl,5×AMV逆轉(zhuǎn)錄緩沖液10μl,25mM MgSO42μl,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl,Tfl聚合酶1μl，和無(wú)核酸酶的dH2O 30μl。反應(yīng)物于48℃保溫45分鐘，隨后于94℃保溫2分鐘。反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)為94℃30秒，60℃1分鐘，68℃2分鐘。最后一個(gè)循環(huán)后于68℃保溫7分鐘。在2％瓊脂糖凝膠上分析擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。泳道1是Stratagene的1kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2是輕鏈片段，泳道3是重鏈片段。正如預(yù)期，重鏈和輕鏈條帶與396bp的分子量標(biāo)準(zhǔn)的泳動(dòng)率大致相同，這是因?yàn)橛糜谳p鏈的引物擴(kuò)增開(kāi)始的384bp片段(360bp片段連同額外的限制性酶位點(diǎn))，而用于重鏈的引物擴(kuò)增的產(chǎn)物還有額外的60bp。將擴(kuò)增的S19抗體片段克隆到載體中從凝膠中切出圖1的重鏈和輕鏈條帶，用Ultrafree MC濾器(Millipore)進(jìn)行洗脫。隨后用Pfu聚合酶代替Tfl聚合酶，將純化的片段再擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。再次凝膠純化諸片段，將它們重懸于25μldH2O中。
用pCR-Script SK(+)系統(tǒng)(Stratagene)進(jìn)行克隆。該載體利用Pfu-c擴(kuò)增的PCR片段進(jìn)行鈍末端連接以將cDNA插入該載體中的Srf1限制性酶位點(diǎn)。Srf1是一種新的、切點(diǎn)比較稀少的限制性酶，它識(shí)別序列5′GCCCGGGC3′。為了確保重鏈和輕鏈片段不會(huì)被Srf1所消化，將1μl每一種cDNA與1μl Srf1酶，1μl10X反應(yīng)緩沖液和7μl dH2O混合，于37℃放置1小時(shí)。結(jié)果表明該酶不消化其中任何一個(gè)片段。
接著合并1μlpCR-Script載體，1μlpCR-Script 10X緩沖液，0.5μl 10mM rATP,5.5μl重鏈或輕鏈cDNA,1μlSrf1酶和1μlT4 DNA連接酶，從而進(jìn)行克隆。將反應(yīng)管置于室溫1小時(shí)，然后于65℃加熱10分鐘。
冰上融化Epicurean Coli XL1-Blue MRF′Kan超感受態(tài)細(xì)胞，將40μl小份細(xì)胞加到已預(yù)冷的15ml管中。然后向細(xì)胞中加入0.7μl的1.44M β-巰基乙醇，于冰上保溫10分鐘。取上述每一克隆反應(yīng)2μl加入到細(xì)胞中，繼續(xù)置于冰上30分鐘。然后在42℃浴中加熱該細(xì)胞和cDNA的混合物45秒，并轉(zhuǎn)移至冰上2分鐘。向其中加入0.45ml SOC培養(yǎng)基后，在37℃水浴中振蕩培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。再將細(xì)胞涂布于LB/氨芐青霉素/2,6-二甲氧基苯青霉素/X-gal/IPTG培養(yǎng)板上以篩選出抗生素抗性菌落，將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。選出每一克隆的陽(yáng)性菌落，將它們分別培養(yǎng)于5ml SOC培養(yǎng)物中以進(jìn)行質(zhì)粒純化。
用Qiagen-tip 20柱(Qiagen)純化質(zhì)粒。在10krpm離心該5ml細(xì)胞5分鐘。吸去多余培養(yǎng)基，將細(xì)胞團(tuán)重懸于0.3ml緩沖液P1中。加入緩沖液P2，將混合物于室溫下放置5分鐘，然后加入0.3ml冰冷的緩沖液P3，將混合物置于冰上10分鐘。在此靜置期間內(nèi)，用1ml QBT緩沖液平衡Qiagen柱。然后于10krpm離心細(xì)胞樣品15分鐘，移出上清液，將其上樣到Qiagen-tip 20柱中。上清液由于引力流動(dòng)而完全進(jìn)入柱樹(shù)脂中后，用4ml緩沖液QC洗滌諸柱，再用0.8ml緩沖液QF進(jìn)行洗脫。為了沉淀質(zhì)粒DNA，向柱洗出液中加入0.56ml異丙醇，將合并物在10krpm離心30分鐘。然后將所得的DNA沉淀塊重懸于25μl dH2O中。
為了確證純化質(zhì)粒中cDNA存在插入片段，用兩種限制酶消化每一克隆。用于消化的限制酶是NotⅠ和EcoRⅠ，它們分別在pCR-Script克隆載體的5′和3′末端具有限制位點(diǎn)。若存在插入片段，則用這些酶消化將會(huì)從宿主載體中切出該插入片段。將每一克隆的1.5μl DNA與0.75μlNotⅠ、0.75μl EcoRⅠ、1.5μl 10×緩沖液和10.5μl dH2O混合，于37℃保溫90分鐘。然后在2％瓊脂糖凝膠上對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行電泳，對(duì)含有插入片段的那些克隆進(jìn)行測(cè)序。重鏈和輕鏈克隆的序列分析用Fidelity試劑盒(Oncor)對(duì)上述陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。每一測(cè)序反應(yīng)含有5μl質(zhì)粒DNA,1μlT3引物(位于pCR-Script載體上的5′克隆位點(diǎn)的上游)和2μl dH2O。將混合物加熱到95℃5分鐘，稍微離心，再加入2μl退火緩沖液，將反應(yīng)物于37℃保溫15分鐘。然后通過(guò)加入3μl T4反應(yīng)緩沖液，1μl33P-α-ATP,2μl T4 DNA聚合酶和2μldH2O對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行標(biāo)記。這一混合物在40℃保溫15分鐘，然后加入6μl T4輔助混合物。從該標(biāo)記反應(yīng)中分別取出5.5μl加入到各含有2μlA、C、G、T終止混合物的4個(gè)管中，在40℃保溫5分鐘。通過(guò)加入5μl蛋白酶K溶液從而終止反應(yīng)，在上樣到6％丙烯酰胺測(cè)序凝膠上之前，將其加熱到95℃。凝膠在2000伏的電壓下電泳2小時(shí)，置于Whatman 3MM濾紙上真空干燥，室溫下對(duì)X-射線(xiàn)膠片曝光過(guò)夜。對(duì)膠片顯影后，在一燈箱上讀取凝膠上的序列。將推斷的克隆序列與已知的鼠IgG1序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)輕鏈克隆代表了一種異常的輕鏈，它是從雜交瘤sp2/0中擴(kuò)增而來(lái)的。分離重鏈序列，其堿基序列示于圖5。對(duì)cDNA進(jìn)行限制性酶消化以除去內(nèi)源性抗體為了從該異常的雜交瘤輕鏈中分離出S19 k輕鏈，重復(fù)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。分析該異常序列，在其中一個(gè)CDR內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)稀有的Van91I限制性位點(diǎn)(5′CCANNNNNTGG3′)。假設(shè)該S19輕鏈存在于從雜交瘤經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的cDNA混合物中，用Van91I(New England Biolabs)消化該混合物。該消化反應(yīng)物由1μl Van91I、3μlcDNA、1μl10X反應(yīng)緩沖液和5μl H2O組成。反應(yīng)物在37℃保溫過(guò)夜以確保消化完全。不能被該酶切開(kāi)的任何cDNA均應(yīng)是正確的S19 k輕鏈。
如圖2所示，在2％瓊脂糖凝膠上分析消化產(chǎn)物。(泳道1是Stratagene 1kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2是3μl未切割的cDNA，泳道3是消化反應(yīng)物)。泳道3中大部分反應(yīng)物已被消化成2個(gè)片段，但在396bp處有一淺帶，這代表未被切開(kāi)的推測(cè)的S19輕鏈。從凝膠中切出該帶，如上述純化，然后如前述用Pfu聚合酶經(jīng)40個(gè)循環(huán)的PCR進(jìn)行擴(kuò)增。如前述將該cDNA克隆到pCR-Script載體中，按照同樣的鋪板方法，選出6個(gè)陽(yáng)性菌落。同樣培養(yǎng)這些陽(yáng)性菌落，進(jìn)行質(zhì)粒純化和限制性消化以證實(shí)存在插入片段。k輕鏈的自動(dòng)測(cè)序在弗吉尼亞大學(xué)生物分子研究所，利用ABI Prism 377自動(dòng)DNA測(cè)序儀對(duì)所述新的輕鏈克隆進(jìn)行測(cè)序。對(duì)每一克隆，均在12μl的總體積內(nèi)合并100ng cDNA和3.2pmol T3引物，再輸送到該儀器中。在那兒，向同一反應(yīng)管內(nèi)加入四種染料標(biāo)記的雙脫氧核苷酸和Amplitaq聚合酶FS。將整個(gè)反應(yīng)物上樣到一個(gè)泳道，以在36cm的易于讀序的5.0％丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。用CCD攝像術(shù)通過(guò)激光掃描實(shí)時(shí)測(cè)定電泳的各個(gè)片段。由儀器上得到的測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的鼠k輕鏈非常吻合，正確的輕鏈堿基序列示于圖3中?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)，利用編碼抗體中S19的重鏈和輕鏈的cDNA序列制備重組型抗體，包括具有位點(diǎn)缺失和結(jié)構(gòu)域缺失和添加的抗體。SAGA-1蛋白我們保藏的S19單克隆抗體能有效結(jié)合和凝集人精子。已拍成照片的凝集測(cè)定的結(jié)果清楚表明結(jié)合和凝集發(fā)生在整個(gè)精子表面的多個(gè)位點(diǎn)。除了由S19單克隆抗體提供的有效殺精子劑之外，結(jié)合抗原SAGA-1也被明確顯示是有效的疫苗原(vaccinogen)。特別地，作為抗原/免疫原產(chǎn)生抗SAGA-1蛋白的抗體的能力應(yīng)能為婦女避免受精提供有效保障，即可提供避孕用疫苗?？蓪⑼豢乖米鳂?biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)試劑以檢查一種疫苗方法的有效性。因此，可通過(guò)常規(guī)測(cè)定方案，包括ELISA及Western和Southern印跡測(cè)定，定期測(cè)定接種疫苗的婦女，并且檢測(cè)體液樣品抗已知量的SAGA-1的能力。陽(yáng)性結(jié)合表明產(chǎn)生了可結(jié)合SAGA-1蛋白的抗體，因而可免于受精。利用SAGA-1作為標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)，并測(cè)定結(jié)合量，即可測(cè)出所產(chǎn)抗體的滴度或濃度。既然依據(jù)上述的凝集測(cè)定可建立起適當(dāng)?shù)牡味?，那么利用SAGA-1蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定反應(yīng)出已達(dá)適當(dāng)?shù)味?，就證實(shí)了已達(dá)到抗受精狀態(tài)，僅需在所需的不孕期間內(nèi)維持這種狀態(tài)即可。SAGA-1蛋白的鑒別通過(guò)Western印跡分析表明(圖1)，S19單克隆抗體識(shí)別SAGA為一系列低分子量糖蛋白。在1％SDS中制備已被洗滌的人精子的提取物，通過(guò)還原性SDS-PAGE對(duì)其進(jìn)行分離。該S19單克隆抗體可與一系列有所重疊的條帶反應(yīng)，這些條帶范圍在大約15～25kD(泳道3)。用10mM高碘酸處理(泳道6)，可去除S19與相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)性，而MHS-10單克隆抗體與SP-10蛋白質(zhì)的肽表位之間的反應(yīng)性并未受到影響(泳道2和5)。這一發(fā)現(xiàn)表明該S19單克隆抗體所識(shí)別的表位是一個(gè)糖類(lèi)部分(圖1；泳道1，酰胺黑染色；泳道2和5,MHS-10；泳道3和6,S19；泳道4和7，空載腹水；泳道2-4，未被高碘酸處理；泳道5-7，用高碘酸處理過(guò)的免疫印跡小膜片；M，用kD表示的分子量標(biāo)準(zhǔn)97.4,68,43,29,18.4,14.3)。此外，用蛋白酶K處理SDS精子提取物會(huì)破壞S19的免疫反應(yīng)性(結(jié)果未附)，這表明S19抗原很可能是一種糖蛋白?；阼b定出來(lái)的該S19糖蛋白具有強(qiáng)烈凝集人精子的能力，因而將它定名為精子凝集抗原-1(Sperm Agglutination Antigen-1,SAGA-1)。高度強(qiáng)化SAGA-1的方法
SAGA-1的溶解性特征表明它是一種疏水性的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)。在用高鹽(1M NaCl或0.6M KCl)和/或溫和的非離子型去污劑(0.1％NP-40或Triton X-100)制備的人精子提取物中檢測(cè)不到S19反應(yīng)性。這些結(jié)果表明利用經(jīng)典用于除去膜周邊蛋白質(zhì)的處理方法不能將SAGA-1抽提下來(lái)。
用Bordier(1981)所述的Triton X-114相分配方法，檢查SAGA-1以膜內(nèi)在蛋白質(zhì)形式存在的進(jìn)一步證據(jù)。非離子型去污劑，如TritonX-114，能通過(guò)取代正常的脂類(lèi)環(huán)境而溶解膜內(nèi)在蛋白質(zhì)。當(dāng)Triton X-114分散于水溶液中，濃度在其臨界的微膠粒濃度以上時(shí)，0℃下它形成小的微膠粒。疏水性的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)會(huì)摻入到這些微膠粒中，而親水性的蛋白質(zhì)仍保留在水環(huán)境內(nèi)。這樣的溶液加熱時(shí)，微膠粒會(huì)變大，從溶液中析出來(lái)，形成一層富含去污劑的相，該相可通過(guò)離心而與水溶液分開(kāi)。Bordier(1981)曾用此方法來(lái)證明絕大多數(shù)膜內(nèi)在蛋白質(zhì)分配于去污劑相，而親水性蛋白質(zhì)仍保留在水相。
為了研究SAGA-1的Triton X-114相分配，在1％Triton X-114，10mM Tris-HCl,pH7.4,150mM NaCl中，于4℃提取洗滌過(guò)的人精子，離心除去碎片。經(jīng)三輪相分配后，通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡分析等量的初始精子提取物、去污劑相和水相(圖2)。人精子/精巢特異性蛋白質(zhì)SP-10(一種周邊的頂體膜蛋白質(zhì))作為對(duì)照；在水相中檢測(cè)到了MHS-10單克隆抗體與SP-10的反應(yīng)性?？稍诔跏季犹崛∥锖腿ノ蹌┫嘀袡z測(cè)到S19反應(yīng)性，而在水相中檢測(cè)不到。這些結(jié)果表明S19單克隆抗體能與一種疏水性的膜內(nèi)在糖蛋白反應(yīng)。酰胺黑染色顯示，總精子蛋白質(zhì)中的大多數(shù)在水相中仍然可溶，而僅有少量蛋白質(zhì)分配于TritonX-114中。因此，在天然SAGA-1的純化中，Triton X-114相分配可用作起始步驟。必須替換去污劑以便純化去污劑Triton X-114的生物化學(xué)性質(zhì)不利于隨后的純化方法。在該去污劑的所需濃度下，Triton X-114將蛋白質(zhì)摻入到大的去污劑微膠粒中，該微膠粒會(huì)阻礙蛋白質(zhì)結(jié)合到親合基質(zhì)上。而且，Triton X-114不能在室溫下使用。因此，用-20℃的丙酮沉淀Triton X-114提取物中的蛋白質(zhì)，并將其重懸于0.5％的辛基葡糖苷，TBS[100mM Tris-HCl(pH7.4),150mM NaCl]中。辛基葡糖苷可在室溫下使用，其必需濃度不會(huì)抑制蛋白質(zhì)-免疫基質(zhì)間的相互作用。
將S19單克隆抗體通過(guò)二甲基庚二酰亞胺鹽(dimethylpimelimidate)二氫氯化物交聯(lián)到Protein G-Sepharose上，詳細(xì)過(guò)程如下所述。將這種免疫基質(zhì)和一個(gè)用于抗體特異性的負(fù)對(duì)照-缺乏交聯(lián)的單克隆抗體的Protein G-Sepharose玻珠與辛基糖苷提取物一起保溫。使用S19單克隆抗體，對(duì)結(jié)合的各級(jí)分進(jìn)行Western分析(圖4)。在辛基葡糖苷提取物和結(jié)合于免疫基質(zhì)的級(jí)分中檢測(cè)到了SAGA-1，但在從無(wú)抗體的Protein G-Sepharose玻珠中洗脫出來(lái)的級(jí)分內(nèi)未檢測(cè)到。這些結(jié)果表明SAGA-1特異地結(jié)合到該免疫基質(zhì)上。在銀染凝膠的每一泳道上觀察到的大約42kD的條帶已證明是凝膠上樣緩沖液中存在的污染物。(圖3；泳道1-3，銀染；泳道4-6,Western印跡；泳道1和4，與免疫基質(zhì)一起保溫的辛基葡糖苷提取物；泳道2和5，結(jié)合到Protein-G-S19免疫基質(zhì)上的蛋白質(zhì)級(jí)分；泳道3和6，結(jié)合到單純Protein-G-Sepharose玻珠的蛋白質(zhì)級(jí)分。從人精子中免疫親和純化SAGA-1的方案制備精子提取物使20-30份人精液在室溫液化，通過(guò)與用0.1MHepes(pH7.4)緩沖的Ham’s F-10培養(yǎng)基一起在400×g離心而洗滌兩遍，冷凍貯存?zhèn)溆谩?br> 相分離集中凍融過(guò)的細(xì)胞團(tuán)，于4℃在含有1.7％Triton X-114的TBS(10mM Tris-HCl[pH7.4],150mM NaCl)中提取，在13,000×g離心以除去碎片。在30℃加熱提取物3分鐘，于300×g離心3分鐘以分離去污劑相和水相。對(duì)每一相重分配兩次以確保完全分離。通過(guò)在100,000×g超速離心以除去不溶的碎片，從而澄清最后的去污劑相。用S19進(jìn)行免疫印跡分析應(yīng)能確證SAGA-1分配到去污劑相中。
丙酮沉淀并重懸于辛基葡糖苷中為了沉淀Triton X-114提取物中的蛋白質(zhì)，加入8體積的-20℃丙酮，混勻，在-20℃放置4小時(shí)至過(guò)夜。通過(guò)在3000×g離心收集沉淀物，棄去上清液，使沉淀塊風(fēng)干。將該沉淀塊重懸于體積兩倍于該Triton X-114提取物的初體積的0.5％辛基葡糖苷，TBS中。4℃下于100,000×g超速離心1小時(shí)以除去不溶性蛋白質(zhì)。取出上清液以用于親和層析中。
S19免疫基質(zhì)制備物從匯集的含有S19的腹水中通過(guò)用50％的硫酸銨進(jìn)行沉淀，從而部分純化免疫球蛋白。用50％硫酸銨洗滌沉淀兩次，將沉淀重懸于體積為腹水初體積1/10的PBS(20mM NaPO4；150mMNaCl,pH7.4)中。對(duì)PBS進(jìn)行透析以除去硫酸銨。利用BCA ReagentAssay試劑盒(Pierce化學(xué)公司)確定蛋白質(zhì)濃度。將經(jīng)硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)與PBS(pH7.4)中的Protein G-Sepharose玻珠(Pharmacia,Piscataway,NJ)在4℃共置過(guò)夜以使IgG結(jié)合上去。每毫升Protein G-Sepharose玻珠包含15mg經(jīng)硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)。將玻珠懸浮液倒入層析柱中，用PBS(pH8.2)洗滌，直至通過(guò)測(cè)定A280的紫外吸收在洗出液中不再能檢測(cè)到蛋白質(zhì)為止。用0.2M三乙醇胺(pH8.2)平衡該柱，將基質(zhì)重懸于20體積的20mM二甲基庚二酰亞胺鹽二氫氯化物，0.2M三乙醇胺(pH8.2)中，在室溫下放置45分鐘并溫和攪拌，以使結(jié)合的IgG共價(jià)交聯(lián)到諸Protein G玻珠上。為了終止該交聯(lián)反應(yīng)，離心玻珠(500×g離心3分鐘)，將玻珠重懸于等體積的20mM乙醇胺中，并在室溫下靜置該懸浮液5分鐘。將玻珠懸浮液倒入一個(gè)層析柱中。用0.2％的疊氮化鈉、PBS(pH8.2)平衡，置于4℃?zhèn)溆谩?br> 親和層析用0.5％的辛基葡糖苷，TBS平衡已制好的免疫親和柱。4℃下，在柱中以1.3ml/min的速率對(duì)含有疏水性的精子蛋白質(zhì)的該辛基葡糖苷溶液進(jìn)行再循環(huán)，一直持續(xù)16小時(shí)。用0.5％辛基葡糖苷，TBS洗滌該柱以除去未結(jié)合的物質(zhì)，通過(guò)UV吸收檢查洗滌液中的蛋白質(zhì)濃度。除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)后，用0.1M甘氨酸、0.15M NaCl(pH2.4)、0.1％SDS洗脫被結(jié)合的物質(zhì)。收集3ml各級(jí)分，用BCA Reagent Assay試劑盒和UV吸收檢查它們的蛋白質(zhì)濃度。合并含有蛋白質(zhì)的諸級(jí)分，用Amicon膜濾濃縮器進(jìn)行濃縮。
樣品純度分析在15％丙烯酰胺上進(jìn)行SDS-PAGE，從而對(duì)經(jīng)S19免疫親和層析柱純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，并進(jìn)行銀染或轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。與S19單克隆抗體一起共保溫，并隨后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡分析，從而測(cè)定免疫印跡對(duì)SAGA-1的反應(yīng)性。比較由銀染和由S19反應(yīng)性測(cè)得的分子量和蛋白質(zhì)條帶數(shù)，估計(jì)純度。疫苗本申請(qǐng)人的發(fā)明包括應(yīng)用SAGA-1，并且更具體地說(shuō)應(yīng)用可被單克隆抗體S19結(jié)合的任何一種蛋白質(zhì)作為免疫原的一種避孕用疫苗。SAGA-1免疫接種將在宿主內(nèi)產(chǎn)生抗體，這足以達(dá)到抑制受精的目的。疫苗本身的制備遵循傳統(tǒng)的模式。將該已純化的免疫原，最好是具有諸S19表位區(qū)的一種重組免疫原摻入到合適的藥用載體中。
可按照傳統(tǒng)方法，利用申請(qǐng)人的新型免疫原制備一種可接受的疫苗。Aitken,Freemerman和Herr等人(出處同前)所述的疫苗可很方便地用于SAGA-1蛋白，及其能被S19單克隆抗體結(jié)合的衍生物。具體地說(shuō)，應(yīng)用了由Primakoff(出處同前)和Primakoff等人，以及Primakoff(美國(guó)生殖免疫學(xué)雜志，31:208-210(1994))所開(kāi)發(fā)的PH-20蛋白的避孕用疫苗反應(yīng)了一種精子蛋白質(zhì)抗原可成功改造為合適載體中的疫苗免疫原。Primakoff和其他人所應(yīng)用的蛋白質(zhì)不幸地不能在靈長(zhǎng)類(lèi)中達(dá)到高程度的受精抑制(超過(guò)95％)，而SAGA-1蛋白的特性，特別是它完全分布于精子細(xì)胞的整個(gè)表面上，以及它與對(duì)它響應(yīng)的單克隆抗體之間相互作用的多種途徑，為在口服避孕藥的量級(jí)(即99％)上達(dá)到受精抑制效果提供了可能性。為了建立起適當(dāng)?shù)目贵w滴度，很有可能大多數(shù)的受測(cè)者(包括婦女)都需要按照一個(gè)方案，間隔時(shí)間較長(zhǎng)地進(jìn)行多次疫苗接種，以使得他們?cè)诿恳淮巫⑸浜蠖加袝r(shí)間來(lái)產(chǎn)生適當(dāng)?shù)目贵w滴度。大約每隔一個(gè)月注射一次，隨后利用SAGA-1蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定，以確定抗體滴度，在經(jīng)過(guò)大約三個(gè)月的時(shí)間后，應(yīng)當(dāng)是合適的，即能為可靠使用提供足夠的受精抑制。當(dāng)然，若診斷測(cè)定反映抗體滴度較低，使得不能提供近乎完全的受精抑制，則應(yīng)采用進(jìn)一步的接種程序，或進(jìn)行其它測(cè)定以找出造成抗體滴度較低的原因。
利用免疫原產(chǎn)生抗天然態(tài)抗原或重組抗原(二者均包括在所要求的本發(fā)明內(nèi))的抗體對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)本來(lái)就是常規(guī)的。本申請(qǐng)人新的發(fā)展延伸到獨(dú)特的SAGA-1蛋白的摻入和依靠上，該SAGA-1蛋白在本文得以首次完全鑒定。對(duì)劑量、載體、展示模式等的常規(guī)優(yōu)化并不構(gòu)成本發(fā)明本身的一個(gè)方面。不過(guò)，作為常規(guī)劑量，對(duì)一個(gè)個(gè)體的劑量值來(lái)說(shuō)，劑量范圍為0.5ml體積內(nèi)100μgSAGA-1蛋白到500μgSAGA-1蛋白應(yīng)是合適的。因?yàn)橛稍撘呙缃臃N程序產(chǎn)生的抗體將比其它特異的抗精子抗體更有效地凝集精子(這是由于前者能結(jié)合到精子更多的表面區(qū)域上)，所以能得到更強(qiáng)的疫苗效力。
如同大多數(shù)疫苗中常見(jiàn)的那樣，一種多價(jià)疫苗常常要比一種單價(jià)疫苗更為有效。正如前面已提到，除了SAGA-1之外，已知還有多種精子特異性抗原。雖然這些抗原各自不能達(dá)到高可信度的受精抑制，但它們可添加到一種基于SAGA-1的疫苗中，以進(jìn)一步提高可信度。具體地說(shuō)，SAGA-1和SP-10的組合作為多價(jià)疫苗的免疫原是理想的。既然研究表明抗這些蛋白質(zhì)的抗體很容易制備，因此有可能得到具有對(duì)兩種蛋白質(zhì)的合并結(jié)合能力，以及對(duì)可作為一種多價(jià)疫苗的免疫原成員而添加的本領(lǐng)域所知的其它蛋白質(zhì)的結(jié)合能力。然而，必不可少的是，SAGA-1蛋白，或S19抗體結(jié)合的任何變體蛋白質(zhì)應(yīng)是該疫苗的中心要素，因?yàn)榭惯@類(lèi)蛋白質(zhì)的抗體使結(jié)合機(jī)會(huì)大大增強(qiáng)，故而使受精抑制更加可信。診斷與S19單克隆抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)，包括SAGA-1蛋白，它們的性質(zhì)使得有可能進(jìn)行兩種不同類(lèi)型的診斷試驗(yàn)。開(kāi)始時(shí)，有必要檢查抗該疫苗免疫原-SAGA-1蛋白或其變體的抗體的發(fā)展情況。某些潛在候選者可能缺乏合適的免疫響應(yīng)系統(tǒng)，許多個(gè)體在響應(yīng)于任何免疫原而產(chǎn)生的抗體滴度或者免疫原施用的方案方面各不相同。利用SAGA-1蛋白作為抗原標(biāo)準(zhǔn)，就可以簡(jiǎn)便地證實(shí)適當(dāng)抗體滴度的發(fā)展。利用上面針對(duì)S19單克隆抗體而敘述的凝集測(cè)定，就可以很方便地確定為達(dá)到100％凝集所需的濃度。SAGA-1蛋白的這一濃度被適當(dāng)固定和給出后，被用來(lái)對(duì)取自患者的樣品進(jìn)行測(cè)定。達(dá)到100％結(jié)合表明已具有合適的抗體滴度。由于任何一種這樣的接種程序都必須在臨床的監(jiān)督下進(jìn)行，因此測(cè)定模式可以是常規(guī)的，即可利用ELISA、Western印跡分析或者其它已建立的領(lǐng)域內(nèi)形式。
此外，人們對(duì)使用簡(jiǎn)單、舒適的商業(yè)診斷劑即可公開(kāi)交易的診斷劑越來(lái)越感興趣。對(duì)這種類(lèi)型的診斷劑感興趣的原因，以及這類(lèi)診斷劑的多種用途被詳細(xì)陳述于1997年2月25日授予的美國(guó)專(zhuān)利5,605,803中，該專(zhuān)利引入本文作為參考。該專(zhuān)利中所公開(kāi)的診斷劑應(yīng)用了SP-10結(jié)合性抗體，MHS-10，或者具有ATCC中保藏號(hào)為No.HB10039的雜交瘤細(xì)胞系中所表達(dá)的那些抗體的結(jié)合特征的抗體。正如引入的該專(zhuān)利申請(qǐng)中所述的那樣，這種類(lèi)型的公開(kāi)交易診斷劑在法醫(yī)工作中能夠得到應(yīng)用，它們可用于確定正常精子細(xì)胞系的存在，在難于懷孕的那些人中，在已切除輸精管的男性中，和由男性與女性對(duì)已切除輸精管的男性進(jìn)行的測(cè)定中，以及對(duì)做過(guò)輸精管吻合術(shù)的男性進(jìn)行測(cè)定用以確定外科重連接的成功時(shí)，這種診斷劑都具有實(shí)質(zhì)價(jià)值。不管從哪條原因上說(shuō)，確定一種生物樣品-精液或來(lái)源于精液或男性生殖道的樣品中精子的存在都具有顯著的醫(yī)學(xué)重要性。具有S19 CDR響應(yīng)性表位的由S19單克隆抗體結(jié)合的抗原，SAGA-1蛋白和相應(yīng)的變體以及重組衍生物可應(yīng)用于諸如引入的1997年2月25日授予的美國(guó)專(zhuān)利5,605,803中所述的測(cè)定模式中。
因此，可以將S19抗體結(jié)合到固相上，用于捕獲SAGA-1蛋白。通過(guò)用另一種單克隆試劑或多克隆試劑，可識(shí)別SAGA-1抗原是否存在。參見(jiàn)如Shen等，美國(guó)生殖免疫學(xué)雜志，29:231-240(1993)。其它測(cè)定模式中可使用燈芯或量尺，以及抗體編碼的彩色玻珠。在所有這些變更方法中，最基本的試劑是S19單克隆抗體，或抗SAGA-1蛋白的類(lèi)似抗體。受測(cè)樣品中存在的任何一種蛋白質(zhì)被固定化的抗體所結(jié)合或捕獲。因此，在意欲檢查適當(dāng)抗體滴度發(fā)展情況的診斷中，可使用SAGA-1蛋白或類(lèi)似的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定試劑。在期望證實(shí)存在該抗原由此核實(shí)存在精子的“家用測(cè)定試劑盒”中，該試劑是對(duì)其有響應(yīng)的單克隆抗體。
本申請(qǐng)人以一般和特定術(shù)語(yǔ)公開(kāi)了本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易聯(lián)想到各種交更，除說(shuō)明書(shū)中明確指出外，諸實(shí)施例和特定實(shí)施方案并不是用來(lái)限制本發(fā)明。各種變更對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)未受創(chuàng)造研究訓(xùn)練的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是可以聯(lián)想得到的。具體地說(shuō)，除了下文示出的權(quán)利要求所界定的之外，濃度水平、施藥方案、重組操作以及種類(lèi)等對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯見(jiàn)的，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種單克隆抗體，它由保藏號(hào)ATCC HB 12144的雜交瘤保藏物所表達(dá)。
2．被權(quán)利要求1的單克隆抗體結(jié)合的一種精子表面糖蛋白的純化制劑。
3．一種避孕用疫苗，它含有在藥學(xué)可接受載體中的權(quán)利要求2的精子表面糖蛋白的一定量，當(dāng)該糖蛋白以該量施用于一只雌性哺乳動(dòng)物時(shí)能有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生抗該糖蛋白的抗體。
4．權(quán)利要求3的疫苗，其中所述糖蛋白存在的量足以使所述雌性哺乳動(dòng)物在完成接種方案后，能表現(xiàn)出足以提供至少95％的受精抑制的抗體滴度。
5．一種確定接受了權(quán)利要求3的疫苗的接種患者內(nèi)抗體滴度的方法，它包括混合來(lái)自所述接種患者的一個(gè)樣品與被結(jié)合的糖蛋白，所述糖蛋白是權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，檢測(cè)所述被結(jié)合的糖蛋白與所述樣品中存在的抗體之間的結(jié)合情況，其中該被結(jié)合的糖蛋白的量是已知的，并測(cè)定被結(jié)合的糖蛋白的結(jié)合程度，其中全部所述被結(jié)合的糖蛋白的完全結(jié)合表明所述樣品中的抗體滴度足以抑制所述患者體內(nèi)的受精。
6．一種殺精子劑，它含有于一種藥學(xué)可接受的載體內(nèi)的權(quán)利要求1的單克隆抗體作為活性劑。
7．權(quán)利要求6的殺精子劑，其中所述殺精子劑含有的單克隆抗體的濃度足以使所述殺精子劑的一個(gè)劑量可有效地結(jié)合一份精液中存在的所有精子細(xì)胞的100％。
8．權(quán)利要求7的殺精子劑，其中所述單克隆抗體存在于脂質(zhì)體的表面上。
9．權(quán)利要求8的殺精子劑，其中所述脂質(zhì)體是非磷脂類(lèi)的帶正電的脂質(zhì)體。
全文摘要
由保藏物HB12144，ATCC所表達(dá)的單克隆抗體(S19)能有效凝集一種精子表面糖蛋白－SAGA－1蛋白。該單克隆抗體可用作一種殺精子劑中的結(jié)合劑，在結(jié)合有潛能的精子方面具有高度有效性。鑒別為SAGA－1的結(jié)合蛋白質(zhì)是一種避孕用疫苗中的免疫原，也是在接種時(shí)確定抗體滴度的標(biāo)準(zhǔn)。該單克隆抗體也可用作診斷劑以確定多種樣品內(nèi)精子的存在和量。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1227497SQ97197175
公開(kāi)日1999年9月1日 申請(qǐng)日期1997年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月28日
發(fā)明者J·C·赫爾, A·B·狄克曼, E·諾頓, A·威斯特羅克－卡塞 申請(qǐng)人:弗吉尼亞大學(xué)專(zhuān)利基金會(huì)