專利名稱：螯合劑碘氯羥喹在制備用于治療早老性癡呆的藥物組合物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及螯合劑在制備用于治療早老性癡呆的藥物組合物中的用途。
早老性癡呆是主要在老年人中流行的一種慢性神經(jīng)變性性疾病。
早老性癡呆的臨床診斷是發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白沉淀在腦中出現(xiàn)并積累。淀粉樣蛋白主要發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)元的末端區(qū)域，為形態(tài)學(xué)上非均質(zhì)的沉淀，也稱作老年斑。老年斑的形成與疾病的癥狀和體征的表現(xiàn)有關(guān)，包括遺忘癥。當(dāng)老年斑形成以后，在神經(jīng)元體中產(chǎn)生神經(jīng)纖維纏結(jié)，神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成與遺忘癥以及癡呆的其他癥狀的惡化相關(guān)。
淀粉樣蛋白沉淀的主要成分是多肽，本文中稱之為Aβ(淀粉樣蛋白-β)。Aβ通常是腦脊液的可溶性成分，它在其中的濃度約為3-5nM。Aβ可以有39-43個(gè)氨基酸，一般是40個(gè)氨基酸，處于成熟型并可從叫做淀粉樣前體蛋白(APP)的細(xì)胞表面蛋白，作為蛋白水解分裂產(chǎn)物而得到(Kang等人，1987)。Aβ的正常功能目前尚未得知，但可能會(huì)形成跨細(xì)胞膜的陽(yáng)離子選擇性通道(Kawahara等人，1997)。
已表明合成的Aβ的沉淀反應(yīng)是由多種環(huán)境因素引起的，包括低pH，高鹽濃度，和金屬例如鋅、銅和汞的存在(Bush等人，1995)。據(jù)報(bào)道，Aβ本身專一并可飽和地與高親和結(jié)合力的(KD=107nM)鋅以1∶1(鋅∶Aβ)的摩爾比結(jié)合(Bush等人，1994a)。這種結(jié)合以鋅的生理學(xué)濃度進(jìn)行(Bush等人，1994b)。
有一種強(qiáng)有力的推測(cè)是，消除早老性癡呆患者體內(nèi)的淀粉樣蛋白沉淀將減輕早老性癡呆的癥狀。因此，已進(jìn)行了多種嘗試來(lái)制備清除淀粉樣蛋白沉淀的藥物。
WO93/10459公開(kāi)了通過(guò)給予鋅結(jié)合劑而治療早老性癡呆的方法。其中提到的優(yōu)選化合物是植酸，去鐵胺，枸櫞酸鈉，EDTA,1,2-二乙基-3-羥基-吡啶-4-酮，和1-羥乙基-3-羥基-2-甲基-吡啶-4-酮。
DE3932338公開(kāi)了螯合劑，如8-羥基-喹啉，在早老性癡呆的治療中的應(yīng)用。
US5373021公開(kāi)了雙硫侖及其鹽和類似物，它們可穿透血腦屏障。所公開(kāi)的化合物可用于減少尤其是早老性癡呆導(dǎo)致的神經(jīng)學(xué)損傷。
迄今所提出的用于治療早老性癡呆的已知化合物具有多個(gè)缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)已妨礙了它們的廣泛使用。例如，這些化合物中多數(shù)不能穿透血腦屏障，因此幾乎不能到達(dá)淀粉樣蛋白沉積的區(qū)域。雙硫侖可穿透血腦屏障，但缺點(diǎn)是它也是醇阻礙物。
研究最深入的螯合劑是EDTA。然而，EDTA對(duì)鋅和銅的螯合作用是非常弱的。另外，EDTA不能穿透血腦屏障并認(rèn)為其有相當(dāng)大的毒性。
本發(fā)明的目的是提供一種已知藥物化合物制備用于治療早老性癡呆的藥物組合物的新用途，所述新化合物具有穿透血腦屏障的能力，可有效地與重金屬結(jié)合成螯合物以防止淀粉樣蛋白聚集，并可再溶解淀粉樣蛋白沉淀。利用碘氯羥喹即可達(dá)到這一新用途目的。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“早老性癡呆的治療”是指早老性癡呆在其發(fā)展的任何階段的預(yù)防、控制和治療。
碘氯羥喹的化學(xué)名稱是5-氯-7-碘-8-羥基喹啉，它屬于羥基喹啉類。碘氯羥喹的已知用途是作為局部抗感染劑。特別是，碘氯羥喹已用于治療阿米巴病和傳染性腹瀉。碘氯羥喹在pH7-11的范圍內(nèi)幾乎不溶于水。在此范圍外可達(dá)到合適的濃度。
碘氯羥喹對(duì)Fe,Co,Ni和Zn的螯合能力是已知的(Kidani等人，1974，和Tateishi等人，1973)。利用質(zhì)量分光光度測(cè)定法測(cè)得碘氯羥喹相對(duì)Co(Ⅱ),Ni(Ⅱ),Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)的配位數(shù)是2，而對(duì)Fe(Ⅲ)的配位數(shù)是3。據(jù)說(shuō)，碘氯羥喹的注射制劑穿過(guò)了血腦屏障，當(dāng)以10-20mg/kg的劑量給藥時(shí)，其在腦中的殘留濃度在20μl/ml的數(shù)量級(jí)(Tateishi等人，1975，和Tamura,1975)。還發(fā)現(xiàn)碘氯羥喹的濃度在象海馬這樣直接受到早老性癡呆影響的腦部區(qū)域中是高的。
利用顯微放射自顯影技術(shù)，已表明碘氯羥喹能在猴子的海馬中形成鋅螯合物。該鋅(Ⅱ)螯合物主要發(fā)現(xiàn)于苔蘚纖維的末端軸-樹(shù)突觸小結(jié)中。當(dāng)將碘氯羥喹靜脈注射到神經(jīng)系統(tǒng)中時(shí)，未結(jié)合的碘氯羥喹有極其迅速的穿透能力，而幾乎沒(méi)有血腦屏障(Shiraki,1979)。
雖然已知碘氯羥喹有螯合及血腦屏障穿透能力，但并不能就此預(yù)言它也具有再溶解鋅沉淀的Aβ的能力。按照本發(fā)明，碘氯羥喹制備用于治療早老性癡呆的藥物組合物的新用途正是基于這一意想不到的發(fā)現(xiàn)。
目前，人們相信碘氯羥喹和Aβ競(jìng)爭(zhēng)性地螯合鋅和其他重金屬。碘氯羥喹被認(rèn)為是最強(qiáng)有力的螯合劑，因此將主要俘獲重金屬離子。于是，由于碘氯羥喹將俘獲鋅離子，則已沉淀的鋅-Aβ中的Aβ將再溶解到周圍的液體中。碘氯羥喹與鋅的配合物將穿透血腦屏障并從機(jī)體中清除。
由于碘氯羥喹是相當(dāng)強(qiáng)的螯合劑，它也可以與酶或輔基的金屬離子結(jié)合成螯合物。因此，可將其理想地用于將痕量金屬離子或輔基補(bǔ)充到用碘氯羥喹治療的病人體內(nèi)，特別是在建立長(zhǎng)期碘氯羥喹治療時(shí)使用。
維生素B12含有鈷。早先在日本患者中進(jìn)行的亞急性脊髓視神經(jīng)病(SMON)的研究中，以比推薦劑量更高的量長(zhǎng)期給予這些患者碘氯羥喹，結(jié)果顯示了長(zhǎng)期碘氯羥喹治療和維生素B12缺乏之間的聯(lián)系。在本申請(qǐng)中，通過(guò)體外和體內(nèi)研究證明了碘氯羥喹和B12之間的相互作用。因此，為了防止B12不足，在碘氯羥喹給藥的同時(shí)或之后給予維生素B12將是有益的。
碘氯羥喹可以任何合適的量，以任何合適的蓋侖制劑形式，并按照任何給藥方案給藥。
根據(jù)患者的病情，優(yōu)選的每日給藥量是10mg-750mg碘氯羥喹。一般的日劑量是100mg。另外，也可以每日分三次給予10mg-250mg，優(yōu)選100mg碘氯羥喹。日劑量高至750mg，持續(xù)給藥兩周，將不會(huì)有任何神經(jīng)毒性或其他副作用的危險(xiǎn)。
為了預(yù)防早老性癡呆的癥狀和體征的發(fā)生，或者為了延遲該疾病發(fā)展過(guò)程中的癥狀和體征，碘氯羥喹可以長(zhǎng)期，即多至10年，以10mg-100mg的日劑量給藥。
實(shí)際的給藥量將由監(jiān)管醫(yī)師根據(jù)多種因素來(lái)決定，例如所治療患者的年齡、病情、病史等。本文中顯示的結(jié)果表明碘氯羥喹的給藥量存在一個(gè)“窗口”，在此范圍內(nèi)可達(dá)到最佳溶解效果。這樣的窗口可由醫(yī)師利用常規(guī)試驗(yàn)來(lái)測(cè)定。
如果碘氯羥喹將長(zhǎng)期給藥，則它優(yōu)選周期性給藥。在第一期中，碘氯羥喹可以給藥例如1到3周，接著是清除期，它可用來(lái)修復(fù)碘氯羥喹的任何不希望的副作用。清除期可持續(xù)1到4周。在清除期期間，優(yōu)選給予B12和其他輔基和/或痕量金屬。清除期過(guò)后再重復(fù)第一期。長(zhǎng)期的周期性治療不僅將再溶解鋅-Aβ聚集物，而且可預(yù)防性抑制鋅-Aβ聚集物的形成。
碘氯羥喹的周期性給藥還可降低藥物的潛在毒性，這意味著這種治療可擴(kuò)展到疾病的整個(gè)發(fā)展期。
包含碘氯羥喹的藥物組合物可以是任何用于腸內(nèi)和腸胃外給藥的合適的蓋侖制劑，目的在于將足夠濃度的碘氯羥喹釋放到腦中。如果希望碘氯羥喹迅速在腦中達(dá)到高濃度，則優(yōu)選以靜脈注射方式給藥。由于口服給予藥物組合物是更方便的，因此如果迅速在腦內(nèi)達(dá)到高濃度不是那么重要的話，則可采用口服給藥方式。該藥物組合物也可經(jīng)皮給藥。
包含碘氯羥喹的藥物組合物還可包含其他活性成分。尤其是，該組合物可含有痕量金屬或輔基，如維生素B12，和/或其他任何可并行地用于治療早老性癡呆的治療劑，以改善或減輕早老性癡呆的癥狀和體征，或延遲早老性癡呆的任何癥狀或體征的發(fā)生。另一方面，其他活性成分也可作為分別的藥物組合物與包含碘氯羥喹的藥物組合物一起給藥。
按照本發(fā)明，碘氯羥喹的新用途包括1)用于已診斷為患有任何臨床階段的早老性癡呆的病人的治療，2)用于預(yù)防伴有早期或前驅(qū)癥狀和體征的患者發(fā)病，和/或3)延遲早老性癡呆的癥狀或體征的發(fā)生或發(fā)展或加重或惡化。
下面將利用實(shí)施例來(lái)闡述本發(fā)明，不過(guò)，這些實(shí)施例不應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)保護(hù)范圍的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1邊攪拌邊將5.3g碘氯羥喹懸浮于200ml正癸烷中。讓未溶解的物質(zhì)沉降。排除癸烷后將干燥的未溶解碘氯羥喹稱重，結(jié)果顯示癸烷中僅溶解了2％的碘氯羥喹。將100ml(淡黃色)上清液與100ml PBS pH7.4一起攪拌并使相分離。合并PBS(下層相)并過(guò)濾以除去隨著用有機(jī)溶劑萃取而在相分界面形成的殘余物。假定有2％的碘氯羥喹溶解于正癸烷中，并假定癸烷/碘氯羥喹的1∶1混合物與PBS的分配系數(shù)是1/1750，則碘氯羥喹在PBS中的濃度為800nM。
取得腦試樣，已確定該試樣的組織病理學(xué)診斷為早老性癡呆。一式兩份分別用最終PBS/碘氯羥喹提取物為100％,10％和1％以及只有PBS的3ml碘氯羥喹/PBS溶液將0.5g額葉新皮質(zhì)的試樣勻化。
將此勻漿以150,000×g的速度離心30分鐘，合并上清液并保存于冰上(級(jí)分“S”)。將沉淀進(jìn)行同樣的勻化和離心操作，并再次合并所得上清液(級(jí)分“P”)。
每種上清液各1ml用200μl冰冷的10％TCA處理以沉淀包括Aβ的總蛋白。所得沉淀用100％乙醇洗滌一次并再懸浮于100μl TBS(tris 20mM,NaCl 150mM pH7.4)中。
將7.5μl樣品(S或P)與等體積的含有4％SDS的tris-tricine樣品緩沖液一起煮沸5分鐘，并加載到Novex預(yù)制的10-20％tris-tricine凝膠上，接著Western轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上。利用mAb WO2檢測(cè)Aβ的信號(hào)(由Aβ的殘余物5-16產(chǎn)生)并利用ECL顯示出來(lái)。檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度為5-10pg。
為了驗(yàn)證TCA對(duì)Aβ的沉淀，將1μg合成Aβ1-40加入1ml含有10％BSA的PBS中，并按上述過(guò)程處理該溶液。在沉淀的顆粒狀物中檢測(cè)到了Aβ的信號(hào)，而在上清液中沒(méi)有檢測(cè)到。
結(jié)果顯示于

圖1中。
從圖1可推斷出，碘氯羥喹可有效地促進(jìn)所測(cè)試濃度下的Aβ的溶解。另外，發(fā)現(xiàn)最佳濃度是10％，這表明Aβ的聚集形式之一，可推測(cè)為二聚物，比其他形式更易溶于PBS。
圖1中僅顯示了一個(gè)試樣的數(shù)據(jù)，另19個(gè)試樣的數(shù)據(jù)均表明了相同的趨向，即碘氯羥喹可有效地促進(jìn)Aβ的溶解。實(shí)施例2在該實(shí)施例中對(duì)比碘氯羥喹和EDTA的螯合能力。
將10ng合成Aβ樣品置于微量滴定槽中，通過(guò)加入25μM ZnCl使其聚集。然后通過(guò)過(guò)濾將該聚集物轉(zhuǎn)移到0.2μm尼龍膜上。這些聚集物分別用200μl單獨(dú)的TBS、含有2μM EDTA的TBS、和含有2μM碘氯羥喹的TBS洗滌。將該膜固定，用抗-Aβ單克隆抗體6E10探測(cè)，并顯色以用來(lái)接觸ECL-膜。測(cè)量ECL-膜的透光度，并以100％單獨(dú)的TBS為基準(zhǔn)計(jì)算相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。EDTA的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度是66％，而碘氯羥喹的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度是49％。
結(jié)果表明，對(duì)于鋅沉淀的Aβ來(lái)說(shuō)，碘氯羥喹是更好的螯合劑。實(shí)施例3在該實(shí)施例中證明碘氯羥喹的再溶解作用。
制備Aβ在pH7.4的TBS中的2.5μM溶液。95％的Aβ保持溶解狀態(tài)。加入30μM鋅使溶解的Aβ沉淀，僅有43％仍保留在溶液中。隨后向鋅沉淀的Aβ中加入120μM碘氯羥喹，則使溶解的Aβ增加到70％。
結(jié)果表明碘氯羥喹可再溶解鋅沉淀的Aβ。實(shí)施例4在該實(shí)施例中利用NMR譜研究體外碘氯羥喹對(duì)維生素B12的影響。
由于碘氯羥喹在pH7-11的范圍內(nèi)幾乎不溶于水，因此該研究在pH13條件下進(jìn)行。制備三管樣品。第一管含有0.5ml 1mg碘氯羥喹，第二管含有0.5ml 1.4mg氰鈷胺(B12)，第三管含有0.5ml 0.5mg碘氯羥喹+0.7mg氰鈷胺(摩爾比3∶1)。
用DRX 400MHz分光光度計(jì)在20℃記錄1H NMR譜。第三管樣品的譜與第一和第二管樣品的譜對(duì)比的結(jié)果顯示，氰鈷胺的某些共振譜發(fā)生了位移，對(duì)碘氯羥喹的兩個(gè)共振譜也觀察到了相同的結(jié)果。結(jié)果提示了碘氯羥喹和氰鈷胺之間的相互作用。實(shí)施例5在該實(shí)施例中研究碘氯羥喹在體內(nèi)對(duì)維生素B12的影響。
六周齡的雄性小鼠用碘氯羥喹預(yù)先處理三天(50mg/kg/天)。將這些小鼠分為兩組，對(duì)照組和用[57Co]-氰鈷胺注射的組。注射48小時(shí)后將這些動(dòng)物處死，解剖出腦、肝和腎并用γ-計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，結(jié)果表示為千cpm/g組織(凈重)±SEM。下表1中列出了各組的放射性值表1
結(jié)果比較顯示，在腦和肝中的放射性累積量沒(méi)有明顯變化。在腎中維生素B12的量出現(xiàn)減少。由此可以得出碘氯羥喹對(duì)小鼠某些器官中的B12濃度有影響。
參考文獻(xiàn)Kang等人(1987)自然〔Nature〕325:733-736。
Kirschner等人(1987)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)〔Proe.Natl.Acad.Sci.〕267:6953-6957。
Kawahara M.；Arispe N.；Kuroda Y.；Rojas E.(1997)生物物理學(xué)雜志〔Biophysical Journal〕73/1,67-75。
Bush,A.I.,Moir,R.D.,Rosenkranz,K.M.，和Tanzi,R.E.(1995)科學(xué)〔Science〕268:1921-1923。
Bush,A.I.,Pettingell Jr.,W.H.,Paradis,M.D.，和Tanzi,R.E.(1994a)生物化學(xué)雜志〔J.Biol.Chem.〕269:12152-12158。
Bush,A.I.,Pettingell Jr.,W.H.,Multhaup,G.,Paradis,M.D.,Vonsattle,J.P.,Gusella,J.F.,Beyreuther,K.,Masters,C.L.，和Tanzi,R.E.(1994b)科學(xué)265:1464-1467。
Esler,W.P.,Stimson,E.R.,Jennings,J.M.,Ghilardi,J.R.,Mantyh,P.W.，和Maggio,J.E.(1996)神經(jīng)化學(xué)〔Neurochem.〕66:723-732。
Kidani Y等人，(1974)日本分析員〔Jap.Analyst〕23:1375-1378。
Tateishi J等人，(1973)日本精神病學(xué)與神經(jīng)病學(xué)〔Psychiat.Neurol.Jap.〕75:187-196。
Shirilogi H.等人，(1979)臨床神經(jīng)病學(xué)手冊(cè)〔Handbook ofClinical Neruology〕,North Holland出版公司，141-198。
Tamura Z,(1975)，日本醫(yī)藥科學(xué)及生物學(xué)雜志〔Jap.J.med.Sci.Biol.〕增刊28:69-77。
權(quán)利要求
1．碘氯羥喹在制備用于治療早老性癡呆的藥物組合物中的用途。
2．按照權(quán)利要求1的用途，其中碘氯羥喹以每日10-250mg的量，分1到3次給藥。
3．按照權(quán)利要求1或2的用途，其中痕量金屬和/或輔基與碘氯羥喹一起或隨之其后給藥。
4．按照權(quán)利要求3的用途，其中輔基是維生素B12。
5．按照上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的用途，其中包含碘氯羥喹的藥物組合物周期性給藥。
6．按照權(quán)利要求5的用途，其中包含碘氯羥喹的藥物組合物給藥1到3周后，接著1到4周的清除期。
7．按照權(quán)利要求6的用途，其中在清除期期間給予痕量金屬和/或輔基。
8．按照權(quán)利要求7的用途，其中輔基是維生素B12。
9．按照上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的用途，其中治療持續(xù)多至10年。
10．按照上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的用途，其中包含碘氯羥喹的藥物組合物被配制成用于口服給藥的形式。
11．按照權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的用途，其中的藥物組合物配制成用于胃腸外給藥的形式。
12．按照權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的用途，其中的藥物組合物配制成經(jīng)皮給藥的形式。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了螯合劑碘氯羥喹在制備用于治療早老性癡呆的藥物組合物中的用途。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1230115SQ97197919
公開(kāi)日1999年9月29日 申請(qǐng)日期1997年8月8日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月13日
發(fā)明者P·N·吉羅萊馬托斯 申請(qǐng)人:P·N·吉羅萊馬托斯股份有限公司