專利名稱：抵抗瘧疾的疫苗組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的疫苗組合物和它在醫(yī)藥上的用途，特別是預防瘧疾感染中的用途。
瘧疾是世界范圍內的主要健康問題之一，每年有2到4百萬人死于該疾病。該疾病的一個最急性形式是由原生動物寄生蟲Plasmodiumfalciparum引起的，該寄生蟲導致大多數(shù)屬于瘧疾的死亡。
P.falciparum的生活周期是復雜的，需要兩個寄主，人和蚊才能完成。人的感染是由在感染的蚊子的唾液中的子孢子的接種啟動的。子孢子遷移到肝臟，在那里感染肝細胞，在肝細胞中通過紅細胞外細胞內期(exoerythrocytic intracellular stage)，分化進入裂殖性孢子期(merozoite stage)，裂殖性孢子感染紅血細胞(RBC)啟動無性血液期(asexual blood stage)中的循環(huán)復制。通過許多RBC中的裂殖性孢子分化進入有性時期的配子體完成周期，蚊子攝取配子體，在其中配子體在中央管經(jīng)過一系列時期的發(fā)育產生子孢子，子孢子遷移到唾液腺。
已經(jīng)鑒定P.falciparum的子孢子時期是瘧疾疫苗的潛在的靶物。已知子孢子的主要表面蛋白質是環(huán)子孢子蛋白質(CS蛋白質)。已經(jīng)克隆，表達和序列分析了來自品系7G8的這一蛋白質(Dame等人，科學225(1984)p593)。來自品系7G8的該蛋白質的特征是具有中央免疫顯性重復區(qū)，該區(qū)含有重復37次的四肽Asn-Ala-Asn-Pro，但其中散布了四個較少的重復序列Asn-Val-Asp-Pro。在其它品系中，主要的和較少的重復的數(shù)目以及它們相對的位置有變化。這一中央部分與N和C末端部分側接，N和C部分是由非重復的氨基酸序列組成的，命名為CS蛋白質的無重復部分。
已經(jīng)表明輻射過的子孢子能夠明顯地防衛(wèi)實驗性人瘧疾(Am.J.Trop.Med.Hyg.24:297-402,1975)。但是，從生產疫苗的觀點出發(fā)，生產的困難使輻射子孢子的用途不切合實際。
幾個小組已經(jīng)推薦了基于環(huán)子孢子蛋白質的亞基疫苗。這些疫苗中的幾個已經(jīng)經(jīng)過了臨床測試；一個是合成肽，其它是重組蛋白質(Ballou等人，柳葉刀i1277(1987)和Herrington等人，自然，328257(1987)。
這些疫苗成功地刺激了抗子孢子的應答。然而，應答強度令人失望，一些疫苗完全沒有產生應答。另外，在隨后的注射中缺乏抗體水平的“加強”和體外淋巴細胞增殖測試的結果表明大多數(shù)志愿者的T細胞沒有識別免疫顯性重復。但是，在各個研究中一個疫苗不能發(fā)展成寄生蟲血癥。
國際專利申請?zhí)?，WO93/10152(Smithkline Beecharn生物學)敘述和要求保護了基本含有CS蛋白質的所有C末端部分，四個或更多免疫顯性區(qū)串聯(lián)重復序列，和來自乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)的雜種分子蛋白質。優(yōu)選地，雜種分子蛋白含有至少含有160氨基酸的序列，該序列基本上與CS蛋白質的C末端部分同源。CS蛋白質可以沒有C末端的最后12個氨基酸。
特別是，其中敘述了含有P.falciparum的CS蛋白質的一部分的蛋白質，這部分基本上對應于按閱讀框架通過線性接頭與HBsAg的N末端融合的P.falciparum7G8的氨基酸210-398。接頭可以含有來自HBsAg的preS2的一部分。
WO93/10152中敘述的特殊實施方案是命名為RTS的雜種分子蛋白質。這一雜種分子含有°起源于釀酒酵母TDH3基因序列(在這一讀碼框架中核苷酸1-1058組成TDH3啟動子本身)的核苷酸1059到1061編碼的甲硫氨酸殘基。(Musti A.M．等人，基因1983,25:133-143)。
°起源于用于構建雜種分子基因的克隆過程產生的核苷酸序列(1062到1070)的三個氨基酸，Met Ala Pro。
°核苷酸1071到1637編碼的189個氨基酸的一段序列，代表了Plasmodium falciparum品系7G8的環(huán)子孢子蛋白質(CSP)的氨基酸210-398(Dame等人，出處同上)。
°用于構建雜種分子基因的克隆過程產生的核苷酸1638到1640編碼的氨基酸(Arg)。
°核苷酸1641到1652編碼的四個氨基酸Pro Val Thr Asn，代表了乙型肝炎病毒(adw血清型)preS2蛋白質(9)的四個羧基末端殘基。
°核苷酸1653到2330編碼的226個氨基酸的一段序列，指定是乙型肝炎病毒的S蛋白質(adw血清型)。
WO93/10152進一步敘述了在受體酵母品系中雜種分子蛋白質的表達，該品系在它的基因組中已經(jīng)攜帶了乙型肝炎S表達盒的幾個完整的拷貝。得到的品系合成兩個多肽，S和RTS(或其它本發(fā)明的雜種分子蛋白)，這兩個蛋白同時協(xié)同組裝進入混合(例如，RTS,S)的脂蛋白顆粒。這些顆粒，有利地在它們的表面存在雜種分子的CSP序列。
本發(fā)明的一個目的是利用與多種佐藥組合使用的，含有多種抗原的組合物免疫給予抵抗P.falciparum和/或P.vivax侵染的免疫性，該佐藥是TH1細胞應答的優(yōu)選刺激物。
因此，本發(fā)明提供用于本發(fā)明或治療瘧疾的疫苗組合物，含有結合佐藥的多種瘧疾起源的抗原，該佐藥是TH1細胞應答的優(yōu)選刺激物。
優(yōu)選地，至少一個抗原是上面定義的雜種分子蛋白，如RTS，更優(yōu)選地，形式是上面定義的混合顆粒，如RTS,S。
本發(fā)明的另一方面提供了用于本發(fā)明或治療瘧疾的疫苗組合物，含有多種瘧疾起源的抗原，特征是至少一個抗原是上面定義的雜種分子蛋白質，如RTS，更優(yōu)選地，形式是上面定義的混合顆粒，如RTS,S。
選擇各個疫苗劑量中存在的抗原的量為誘導免疫保護應答而沒有典型疫苗中明顯的，不利的副作用的量。這樣的量將根據(jù)使用的具體免疫原而不同。通常，可以期望每個劑量將總共含有1-1000微克蛋白質，優(yōu)選地1-200微克，最優(yōu)選地，10-100微克。對于特殊疫苗的最適量可以通過標準研究，包括觀察受試者的免疫應答來確定。在最初的接種后，優(yōu)選地，受試者在約4星期中接受一次加強，接著每6個月重復加強，只要感染的危險存在。
本發(fā)明的另一方面是治療對瘧原蟲感染敏感的病人的方法，包括給藥本文前面所述的有效量的疫苗。
能夠優(yōu)選地刺激TH1細胞應答的佐藥在國際專利申請?zhí)朩O94/00153和WO95/17209中有敘述。
特定的優(yōu)選佐藥含有QS21，起源于Quillaja Sapomaria Molina的樹皮的Hplc純化非毒性部分，和3-De-O?；瘑瘟姿嶂珹(3D-MPL)，可選擇地與水包油乳劑混合。
3De-O-?；瘑瘟姿嶂珹已知來自GB2220211(Ribi)。它是3De-O-?；瘑瘟姿嶂珹與4,5或6?；湹幕瘜W混合物，由Ribi免疫化學Montana制造。國際專利申請?zhí)?2/116556公開了3De-O-?；瘑瘟姿嶂珹的優(yōu)選形式。
QS21是來自南美Quillaja Saponaria Molina樹的樹皮的皂苷的Hplc純化的非毒性部分，它的生產方法公開在美國專利號5,057,540。
優(yōu)選的水包油乳劑含有可代謝的油，如鯊烯，α生育酚和吐溫80。另外，水包油乳劑可以含有span85和/或卵磷脂。
QS21:3D-MPL的比例通常是1∶10到10∶1；優(yōu)選地是1∶5到5∶1，通常基本上是1∶1。最適協(xié)同作用的優(yōu)選范圍是2.5∶1到1∶13D MPL:QS21。通常，用于人給藥的QS21和3D MPL在疫苗中存在的范圍是1微克-200微克，如1-100微克，優(yōu)選地10微克-50微克每劑量。通常，水包油將含有2到10％的鯊烯，2到10％的α生育酚和0.3到3％吐溫80。優(yōu)選地，鯊烯α生育酚的比例是相等或小于1，這提供了更穩(wěn)定的乳劑。Span85也可以以1％的水平存在，在一些情況中，本發(fā)明的疫苗進一步含有穩(wěn)定劑可能是有利的。
疫苗制劑通常在疫苗的新趨勢和發(fā)展，Voller等人編輯，Park大學出版社，巴爾的摩，馬里蘭，美國1978中有敘述。Fullerton，美國專利4,235,877敘述了脂質體中的膠囊化。例如，Likhite，美國專利4,372,945和Armor等人，美國專利4,474,757公開了蛋白質與大分子的共軛。
用于本發(fā)明的起源于瘧疾的抗原可以選自1．如上面定義的雜種分子蛋白，如RTS，更優(yōu)選地形式是如上面定義的混合顆粒，如RTS,S。
2．來自泰國的P.falciparum的克隆分離物的TRAP，已知是T/9/96，和與其具有80％同源性的蛋白質，和含有其片斷的免疫原性衍生物(在國際專利申請?zhí)枺琖O90/01496和WO91/11516(31限制于開發(fā))，和WO92/11868(US Navy)中有敘述)。
3．在國際專利號WO91/18922中敘述的16千道爾頓蛋白質，和與其具有至少80％同源性的蛋白質，和含有其片斷的免疫原性衍生物。
4．P.falciparum或P.vivax的頂端膜抗原-1(AMA-1)，和與其具有至少80％的同源性的蛋白質，和含有其片斷的免疫原性衍生物。
5．P.falciparum或P.vivax的環(huán)子孢子蛋白質(csp)，和與其具有至少80％的同源性的蛋白質，和含有其片斷的免疫原性衍生物。
6．P.falciparum和P.vivax的MSP-1(美國專利號4,837,016)，和與其具有至少80％的同源性的蛋白質，和含有其片斷的免疫原性衍生物。
7．其它紅細胞外期蛋白質和含有其片斷的免疫原性衍生物。
8．可選擇地，血液期蛋白質和含有其片斷的免疫原性衍生物。
術語“免疫原性衍生物”包括在對人體內給藥后，保留誘導對該蛋白質的免疫應答能力的該蛋白質的截短或其它衍生物的任何分子。這樣的其它衍生物可以通過附加，缺失，替代，或重排氨基酸或通過化學修飾制備。
該蛋白質的免疫原片斷可以通過表達適當?shù)幕蚱瑪嗷蛲ㄟ^肽合成，例如利用Merrifield合成(肽，第二卷，學術出版社，NY,3頁)制備，該蛋白質可以用于亞基疫苗的制備。
免疫原性衍生物可以是雜種分子，即含有其它序列的融合多肽，這些序列可以攜帶其它瘧原蟲免疫原，或其它非瘧原蟲免疫原的一個或多個表位?？蛇x擇地，本發(fā)明的免疫原性衍生物可以與載體多肽如乙型肝炎表面或核心抗原或另一個具有免疫刺激特性，如在佐藥的情況中，或者能夠增強對該蛋白質或其衍生物的免疫應答，或用于表達，純化或配制該蛋白質或其衍生物的載體融合。
用于本發(fā)明的蛋白質或其免疫原性衍生物可以化學地利用傳統(tǒng)的連接試劑如戊二醛與大分子共軛(Geerlings等人(1988)免疫方法雜志，106,239-244)。
下面的實施例說明了本發(fā)明實施例構建和表達重組TRAP如WO90/01496中所述制備。構建和表達RTS,S如WO93/10152中所述制備。
佐藥制造兩個佐藥制劑，每個含有下面的水包油乳劑成分。
SB26:5％鯊烯5％生育酚0.4％吐溫80；顆粒大小是500納米
SB62:5％鯊烯5％生育酚2.0％吐溫80；顆粒大小180納米乳劑SB62的制備(2倍濃度)將吐溫80溶解于磷酸緩沖鹽(PBS)給出PBS中2％的溶液。為了提供100毫升2倍濃度的乳劑，將5克DLα生育酚和5毫升鯊烯渦流完全混合。加入90毫升PBS/吐溫并完全混合。然后將得到的乳劑通過注射器，最后利用M110S微射流機器最后微流體化(microfluidised)。得到的油狀小滴的大小約180納米。
乳劑SB26的制備以類似的方式，利用0.4％吐溫80制備這一乳劑。
以類似的方式制備表中的其它乳劑。
在各100毫升的乳劑中加入兩種抗原(各10毫克抗原，相當于每劑量50微克)并混合。將這與100微克/毫升3D MPL和100微克/毫升QS21合并，得到最后配方。根據(jù)鹽含量和pH設定緩沖液。
表兩倍濃度載體
參考實施例RTS,S各種配方在國際專利中請?zhí)朩O93/10152中敘述了RTS,S，并配制用于balb/c小鼠的接種。每組中5個動物。7組動物接受了下面的配方組1RTS,SB62組2RTS,S QS21 3D-MPL組3RTS,S QS21 3D-MPL SB62組4RTS,S 3D-MPL Al(OH)3組5RTS,S Al(OH)3組6Plain組7負對照(RTS,S-5微克/劑量，3D-MPL5微克/劑量QS21 5微克/劑量接種動物，并在第一次免疫后15天，和在第二次免疫后的7天，和15天取血，測試抗HBSAg抗體亞型。利用QS21和3D-MPL一起配制的乳劑SB62，與SB62單個比較，能夠優(yōu)選地以協(xié)同作用的方式增強IgG2a抗體應答。
在小鼠中增強IgG2a抗體應答是佐藥系統(tǒng)刺激TH1型應答的能力的量度。
權利要求
1．用于本發(fā)明或治療瘧疾疫苗組合物，含有結合佐藥的多種瘧疾起源的抗原，該佐藥是TH1細胞應答的優(yōu)選刺激物。
2．根據(jù)權利要求1所述的疫苗組合物，其中佐藥包含MPL。
3．根據(jù)權利要求1或2所述的疫苗組合物，其中佐藥包含QS21。
4．根據(jù)前面的權利要求的任何一個所述的疫苗組合物，其中佐藥包含水包油乳劑。
5．根據(jù)前面的權利要求的任何一個所述的疫苗組合物，其中瘧疾抗原選自包括下面的物質的小組●本含有全部CS蛋白質的C末端部分，四個或更多免疫顯性區(qū)的串聯(lián)重復序列，和來自乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)的雜種分子；●來自泰國的P.falciparum的克隆分離物的TRAP，被稱為T/9/96，和與其至少有80％同源性的蛋白質，和含有其片斷的免疫原性衍生物；●國際專利申請?zhí)朩O91/18922中敘述的16千道爾頓蛋白質，和與其具有至少80％的同源性的蛋白質，和含有其片斷的免疫原性衍生物；●P.falciparum或P.vivax的頂端膜抗原-1(AMA-1)，和與其有至少80％的同源性的蛋白質，和含有其片斷的免疫原性衍生物；●P.falciparum或P.vivax的環(huán)子孢子蛋白質(csp)，和與其具有至少80％同源性的蛋白質，和含有其片斷的免疫原性衍生物；●P.falciparum或P.vivax的MSP-1(美國專利號4,837,016)，和與其具有至少80％同源性的蛋白質，和含有其片斷的免疫原性衍生物；●其它紅細胞外期蛋白質和含有其片斷的免疫原性衍生物；和●可選擇地，血液期蛋白質和含有其片斷的免疫原性衍生物。
6．根據(jù)前面的權利要求的任何一個所述的疫苗組合物在治療中的用途。
7．根據(jù)權利要求1到5的任何一個所述的疫苗組合物在制造用于治療或預防瘧疾的藥劑中的用途。
8．治療或預防瘧疾的方法，包括對需要的病人給藥權利要求1到5的任何一個所述的疫苗組合物的有效量。
全文摘要
用于本發(fā)明或治療瘧疾的疫苗組合物,含有與佐藥結合的多種瘧疾起源的抗原,該佐藥是TH1細胞應答的優(yōu)選的刺激物。
文檔編號A61P33/06GK1231613SQ97198360
公開日1999年10月13日 申請日期1997年7月31日 優(yōu)先權日1996年8月2日
發(fā)明者J·科亨 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司