專利名稱：重組腺伴隨病毒定向基因治療的方法
本項(xiàng)工作得到國(guó)家健康協(xié)會(huì)授予的DK47757號(hào)基金的支持。美國(guó)政府享有本發(fā)明部分權(quán)利。
背景技術(shù)：
腺伴隨病毒(AAV)是復(fù)制缺陷型細(xì)小病毒，其基因組長(zhǎng)約4.6kb，包括145個(gè)核苷酸的反向末端重復(fù)序列(ITR)。AAV的單鏈DNA基因組含有復(fù)制和形成毒粒的基因(rep和cap)。
當(dāng)該非病原性人病毒感染人細(xì)胞后，病毒基因組整合入染色體19中，導(dǎo)致細(xì)胞潛伏感染，不產(chǎn)生感染的病毒，也不復(fù)制，除非細(xì)胞同時(shí)被裂解性輔助病毒(如腺病毒或皰疹病毒)共感染。在被輔助病毒感染后，AAV原病毒得到挽救并被擴(kuò)增，從而產(chǎn)生了AAV和輔助病毒。
AAV具有獨(dú)特的特征，即它可作為有吸引力的載體用來(lái)將外源DNA傳遞到細(xì)胞中。許多實(shí)驗(yàn)小組已經(jīng)研究了AAV在治療疾病中的潛在應(yīng)用。
重組AAV(rAAV)的體外研究是令人失望的，因?yàn)槠滢D(zhuǎn)導(dǎo)頻率很低；在沒(méi)有污染性的野生型AAV或輔助腺病毒存在下使細(xì)胞與rAAV一起培育只伴隨很少的重組基因表達(dá)[D.Russell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:8915-8919(1994)；I.Alexander等，J.Virol.,68:8282-8287(1994)；D.Russell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:5719-5723(1995)；K.Fisher等，J.Virol.,70:520-532(1996)；和F.Ferrari等，J.Virol.,70:3227-3234(1996)]。而且，當(dāng)rep不存在時(shí)，整合的效果很低，并且不能定位于染色體19[S.Kumar等，J.Mol.Biol.,222:45-57(1991)]。當(dāng)腺病毒存在時(shí)，AAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著增強(qiáng)，因?yàn)閱捂渞AAV基因組被轉(zhuǎn)變成具有轉(zhuǎn)錄活性的非整合的、雙鏈中間產(chǎn)物[K.Fisher等，J.Virol.,70:520-532(1996)；和F.Ferrari等，J.Virol.,70:3227-3234(1996)]。腺病毒通過(guò)早期基因產(chǎn)物E4 ORF6的表達(dá)增強(qiáng)了rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)[K.Fisher等，J.Virol.,70:520-532(1996)；和F.Ferrari等，J.Virol.,70:3227-3234(1996)]。
現(xiàn)已在基因治療體內(nèi)模型中混入了rAAV起載體功能。最有希望的結(jié)果是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在該處的減數(shù)分裂后的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)[M.Kaplitt等，Nat.Genet.,8:148-154(1994)]。骨髓細(xì)胞與rAAV活體外培育會(huì)產(chǎn)生一些轉(zhuǎn)導(dǎo)，盡管在移植模型中沒(méi)有證明有穩(wěn)定而有效的造血移入[J.Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10183-10187(1994)；G.Podsakoff等，J.Virol.68:5656-5666(1994)；和C.Walsh等，J.Clin.Invest.,94:1440-1448(1994)]。
對(duì)氣道或血液給予rAAV會(huì)使基因分別轉(zhuǎn)入肺上皮細(xì)胞[K.Fisher等，J.Virol.,70:520-532(1996)；和T.Flotte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:10613-10617(1993)]和肝細(xì)胞[K.Fisher等，J.Virol.,70:520-532(1996)]中；然而，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平很低，除非有腺病毒存在[K.Fisher等，J.Virol.,70:520-532(1996)]。
所需的是改善rAAV-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種改善所選基因(該基因通過(guò)重組AAV傳遞給動(dòng)物)表達(dá)的方法。方法包括在沒(méi)有輔助病毒存在下，將包含所需轉(zhuǎn)基因的重組AAV載體導(dǎo)入肌細(xì)胞中。該載體可給予心肌、平滑肌或最好是骨骼肌。
在一個(gè)較佳的實(shí)例中，rAAV傳遞的轉(zhuǎn)基因編碼一種在治療上有用的可分泌和/或可擴(kuò)散的產(chǎn)物。在該實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物對(duì)距遞送部位一定距離的部位有治療效果。在另一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因編碼了需要傳遞給肌肉(例如用來(lái)治療肌肉營(yíng)養(yǎng)不良)的不可分泌的產(chǎn)物(如肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白多肽)。
本發(fā)明另一方面提供了一種治療動(dòng)物血友病的方法。方法包括對(duì)動(dòng)物肌肉給予重組的腺伴隨病毒，該病毒包含編碼因子Ⅸ的基因和調(diào)節(jié)該基因表達(dá)的序列。
本發(fā)明還有一個(gè)方面提供了治療動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化的方法。該方法包括給予動(dòng)物肌肉重組的腺伴隨病毒，該病毒包含編碼ApoE的基因和能表達(dá)所述基因的調(diào)控序列。
在本發(fā)明較佳實(shí)例的詳細(xì)描述中將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的其它方面與優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1示出了AAV.CMVLacZ(4883bp)的線型排列結(jié)構(gòu)。相關(guān)元件包括AAVITR(實(shí)心黑框)、CMV啟動(dòng)子(帶陰影線的箭頭)、SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號(hào)(空心框)和lacZ DNA(帶點(diǎn)方框)。另外還示出了用來(lái)檢測(cè)內(nèi)部BamHⅠ片段和全長(zhǎng)載體的cDNA探針的位置。
圖2A示出了AAV.CNVLacZ串聯(lián)體(concatomer)的線型排列。相關(guān)的標(biāo)記包括AAV ITR(帶陰影線的方框)、CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子(實(shí)心黑色箭頭)、SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號(hào)(空心方框)和lacZ cDNA(帶點(diǎn)方框)。圖中示出的AAV.CMVLacZ單體是在ITR處(標(biāo)記j處)按直接末端對(duì)末端的方式連接的。因此，在草圖中，在接頭處有兩個(gè)拷貝的AAV ITR。
圖2B示出了連接區(qū)域的放大視圖。相關(guān)標(biāo)記的說(shuō)明在上述圖3A中。水平箭頭表示用來(lái)擴(kuò)增橫跨原病毒接頭的PCR引物的位置和方向。引物005是有義鏈引物。引物013和017是反義鏈引物。
圖3示出了采用直接末端對(duì)末端串聯(lián)連接的單體AAV.CMVLacZ基因組后預(yù)計(jì)的PCR產(chǎn)物。接頭處(標(biāo)記J處)示出了兩個(gè)完整的ITR(有陰影線的方框)及其各自的“FLOP”和“FLIP”取向。另外還示出了CMV啟動(dòng)子(實(shí)心黑框)和聚腺苷酸化信號(hào)(空心方框)。pCRⅡ中PCR克隆部位側(cè)接EcoRⅠ位點(diǎn)(如圖所示)。圖中還示出了位于PCR產(chǎn)物中的三個(gè)SnaBⅠ位點(diǎn)。還示出了引物005和013。
圖4A與圖4B-4G一起描述了PCR產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是如圖4A所示的的頭接尾的AAV.CMVLacZ串聯(lián)體。圖4A顯示了采用直接末端對(duì)末端串聯(lián)連接的單體AAV.CMVLacZ基因組的預(yù)計(jì)PCR產(chǎn)物。接頭處(標(biāo)記j處)示出了兩個(gè)完整的ITR(有陰影的方框)及其各自的“FLOP”和“FLIP”取向。另外還示出了CMV啟動(dòng)子(實(shí)心黑框)和聚腺苷酸化信號(hào)(空心方框)。
圖4B表示克隆3的PCR產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
圖4C表示克隆8的PCR產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)?？寺?的大小與克隆3幾乎相等，但有不同的ITR接頭排列方式。
圖4D表示克隆5的PCR產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
圖4E表示克隆2的PCR產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
圖4F表示克隆6的PCR產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
圖4G表示克隆7的PCR產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
圖5A表示針對(duì)腺病毒抗原和lacZ的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的激活。這是對(duì)從實(shí)施例5組1收獲的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的分析。
圖5B表示針對(duì)腺病毒抗原和lacZ的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的激活。這是對(duì)從實(shí)施例5組2收獲的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的分析。
圖5C表示針對(duì)腺病毒抗原和lacZ的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的激活。這是對(duì)從實(shí)施例5組3收獲的淋巴細(xì)胞進(jìn)行的分析。
圖6A表示實(shí)施例5組1-4中在對(duì)包括β-半乳糖苷酶、純化AAV或腺病毒不同抗原應(yīng)答反應(yīng)中T淋巴細(xì)胞的激活情況。通過(guò)代表T細(xì)胞TH1亞組的IFN-γ的分泌來(lái)證明此種激活。
圖6B表示實(shí)施例5組1-4T淋巴細(xì)胞在對(duì)包括β-半乳糖苷酶、純化AAV或腺病毒的不同抗原的應(yīng)答反應(yīng)中的激活情況。通過(guò)表示T細(xì)胞TH2亞組的IL-10的分泌來(lái)證明此種激活。
圖7A表示酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的結(jié)果，其顯示了實(shí)施例5各組中抗β-半乳糖苷酶的抗體的發(fā)生。
圖7B表示酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的結(jié)果，其顯示了實(shí)施例5各組中抗5型腺病毒的抗體的發(fā)生。
圖8是在每個(gè)動(dòng)物(n=4)中IM注射2×1011rAAV-hF.Ⅸ載體基因組后，C57BL/6小鼠中的hF.Ⅸ血漿濃度隨時(shí)間變化的示意圖。
圖9表示給C57BL/6小鼠中IM注射rAAV-hF.Ⅸ后產(chǎn)生的抗入F.Ⅸ的循環(huán)抗體。用ELISA，以小鼠MAb抗hF.Ⅸ[Boehringer Mannheim]作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定在每個(gè)動(dòng)物中注射2×1011載體基因組(n=3)后血漿中抗hF.Ⅸ抗體濃度隨時(shí)間變化情況。每條線代表一只動(dòng)物。
圖10表示三只小鼠的hF.Ⅸ血漿濃度隨注射后時(shí)間的變化情況。每種記號(hào)表示不同的動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)中第四只動(dòng)物在注射后5周時(shí)進(jìn)行創(chuàng)傷性放血后死亡。
圖11表示四只Rag-1小鼠的hF.Ⅸ血漿濃度隨注射rAAV-hF.Ⅸ后時(shí)間的變化情況。每個(gè)標(biāo)記代表不同的動(dòng)物。
圖12表示轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的rAAV頭對(duì)尾串聯(lián)體示意圖。
圖13表示AV.CMVApoE的構(gòu)建過(guò)程。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種腺伴隨病毒介導(dǎo)的定向于肌肉的轉(zhuǎn)基因方法，該方法可在沒(méi)有輔助病毒或外源輔助分子存在下，高水平地、穩(wěn)定地表達(dá)轉(zhuǎn)基因。該方法特別涉及將攜帶所需轉(zhuǎn)基因的重組AAV導(dǎo)入肌細(xì)胞。將rAAV載體按照希望的那樣直接注射入心肌、骨骼肌或平滑肌中，而轉(zhuǎn)基因則編碼分泌的和/或可擴(kuò)散的治療產(chǎn)物(如多肽或RNA分子)。然而，本發(fā)明也可類似地用于(注射)給予編碼非分泌性、有治療用途產(chǎn)物的核酸。
特別是，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，肌內(nèi)注射不含輔助物的純化rAAV(即，基本上沒(méi)有被腺病毒或野生型AAV污染的rAAV)會(huì)導(dǎo)致肌纖維高效轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使轉(zhuǎn)基因表達(dá)穩(wěn)定和延長(zhǎng)?！安缓o助物”還指AAV中基本上沒(méi)有輔助病毒或其它外源輔助分子(即，并非肌細(xì)胞中天然所有的或正常存在的輔助分子)。這是在對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物沒(méi)有顯著的炎癥或免疫反應(yīng)下實(shí)現(xiàn)的，盡管產(chǎn)物可能是一種新抗原(neoantigen)。
用本發(fā)明方法獲得的轉(zhuǎn)基因表達(dá)穩(wěn)定性是特別顯著的。不希望受任何理論的束縛，據(jù)信該穩(wěn)定性是由于在沒(méi)有輔助病毒或其它外源輔助分子存在時(shí)，AAV原病毒DNA在肌細(xì)胞中與染色體整合效率非常低所致。一些觀察結(jié)果支持了這一假設(shè)。如下文實(shí)例中所述的，對(duì)Hirt抽提物進(jìn)行分析時(shí)沒(méi)能檢測(cè)到雙鏈附著體形式的病毒基因組。對(duì)細(xì)胞總DNA進(jìn)行Southern分析，結(jié)果表明，當(dāng)用AAV載體中有兩個(gè)斷裂位點(diǎn)的酶消化時(shí)有一條不連續(xù)的條帶，而當(dāng)用病毒基因組內(nèi)沒(méi)有位點(diǎn)的酶消化同-DNA時(shí)沒(méi)有不連續(xù)的條帶。
其它DNA分析側(cè)重于串聯(lián)體的形成及其結(jié)構(gòu)。以前對(duì)裂解性AAV感染的研究已經(jīng)表明，rAAV附著體的復(fù)制通過(guò)頭對(duì)頭或尾對(duì)尾串聯(lián)體進(jìn)行，而導(dǎo)致原病毒整合的潛伏感染是由頭對(duì)尾串列來(lái)實(shí)現(xiàn)的[K.I.Berns,Microbiol.Rev.,54:316-329(1990)；J.-D.Tratschin等，Mol.Cell.Biol.,5:3251-3260(1985)；N.Muzcyzska,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129(1993)；S.K.McLauglin等，J.Virol.,62:1963-1973(1988)]。本文列出的資料證明了用本發(fā)明的rAAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的肌細(xì)胞含有包括兩種ITR可變?nèi)笔У念^對(duì)尾串聯(lián)排列的串聯(lián)體，這與涉及rAAV原病毒整合的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是一致的。
對(duì)rAAV串聯(lián)體產(chǎn)生的接頭進(jìn)行序列分析表明兩種ITR的缺失相一致但可變化。熒光原位雜交(FISH)分析與20個(gè)胞核中約1個(gè)有單整合位點(diǎn)的結(jié)果相符，而Southern分析表明每個(gè)肌纖維的二倍體基因組平均有一個(gè)原病毒基因組。這些發(fā)現(xiàn)一起表明，串聯(lián)體平均最少包含10個(gè)原病毒基因組。
本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在給予治療性劑量的載體后沒(méi)有發(fā)炎(這令人感到驚奇)。例如，將lacZ AAV載體注射入C57BL/6小鼠沒(méi)有出現(xiàn)對(duì)大腸桿菌β-半乳糖苷酶的體液免疫應(yīng)答，盡管在lacZ腺病毒載體注入骨骼肌中后這些動(dòng)物中產(chǎn)生了活躍的抗-β-半乳糖苷酶抗體。因此，根據(jù)本發(fā)明方法用無(wú)輔助病毒AAV的載體時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因的免疫應(yīng)答得到控制。這與已有技術(shù)中的轉(zhuǎn)基因方法是截然相反的，這些轉(zhuǎn)基因方法例如是采用裸質(zhì)粒DNA的方法[J.A.Wolff等，Science,247:1465-1468(1990)]，或通常會(huì)引起對(duì)轉(zhuǎn)基因強(qiáng)烈免疫應(yīng)答的腺病毒介導(dǎo)的基因治療方法[]S.K.Tripathy等，Nat.Med.,2:545-550(1996)]。因此，本發(fā)明的方法明顯優(yōu)于其它基因遞送系統(tǒng)，特別是在治療需要反復(fù)給藥的慢性病方面。
Ⅰ．重組AAV本發(fā)明方法中采用了攜帶所選轉(zhuǎn)基因的AAV重組載體。除轉(zhuǎn)基因外，載體還含有控制轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞(如肌細(xì)胞)中表達(dá)的調(diào)控序列。
許多rAAV載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，因此本發(fā)明不局限于任何特定的rAAV載體。例如，適用的AAV載體及其制備方法在美國(guó)專利No.5,252,479；5,139,941；國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO94/13788和WO93/24641中有所描述。下面描述一種特別需要的載體。
A．AAV序列目前，一種較佳的rAAV缺失所有的病毒開(kāi)放讀框(ORF)而只保留了順式作用的5′和3′末端反向重復(fù)序列(ITR)[例如參見(jiàn)，B.J.Carter，在“Handbook ofParvoviruse”,P.Tijsser編輯，CRC Press,pp.155-168(1990)]。因此，缺失了編碼rep和cap多肽的序列。AAAV ITR約長(zhǎng)143bp。盡管載體宜采用包含基本全部ITR的5′和3′序列，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解，可以對(duì)這些序列作一定程度上的小修改。修改這些ITR序列并保留其生物功能的能力是本領(lǐng)域技術(shù)人員所具備的。例如參見(jiàn)Sambrook等“Molecular Cloning.A Laboratory Manual.”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)的課本。
AAV ITR序列可以從任何已知的AAV(包括目前確定人AAV類型)獲得。AAV類型的選擇不希望限制本發(fā)明。各類AAV(包括1-4型)可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，或請(qǐng)求各商業(yè)和工業(yè)來(lái)源提供。同樣，已知感染其它動(dòng)物的AAV也可用于本發(fā)明方法采用的載體中。在本發(fā)明提出的實(shí)施例中，為方便起見(jiàn)，采用的是AAV-2。具體地說(shuō)，AAV-2的5′和3′AAV ITR序列側(cè)接所選轉(zhuǎn)基因序列和相關(guān)的調(diào)控元件(如下所述)。
B．轉(zhuǎn)基因rAAV載體中含有的轉(zhuǎn)基因序列是異源于AAV序列的核酸序列，其能編碼感興趣的RNA或多肽。轉(zhuǎn)基因以允許轉(zhuǎn)基因在肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的方式與調(diào)控元件操作性連接。
轉(zhuǎn)基因序列的組成取決于所得載體的用途。例如，一類轉(zhuǎn)基因序列包括在表達(dá)時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)道基因。這種報(bào)道序列包括(但不局限于)大腸桿菌β-半乳糖苷酶(LacZ)cDNA、堿性磷酸酯酶基因和綠色熒光蛋白基因。當(dāng)這些序列與驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的調(diào)控元件相聯(lián)時(shí)，它們提供了通過(guò)常規(guī)手段(如紫外波長(zhǎng)吸收、可見(jiàn)的顏色變化等)可檢測(cè)的信號(hào)。這種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可用于細(xì)胞定量測(cè)定、細(xì)胞鑒定等方法中。
更佳的轉(zhuǎn)基因序列包括編碼所需基因產(chǎn)物的治療性基因。這些治療性核酸序列通常能編碼產(chǎn)物，該產(chǎn)物在體內(nèi)或活體外給予患者時(shí)能替代或校正遺傳或非遺傳基因缺陷或能治療后生(epigenetic)疾病。
本發(fā)明的方法(即將轉(zhuǎn)基因遞送到肌細(xì)胞中)特別適于與分泌治療性蛋白(如因子Ⅸ(用于治療血友病)、載脂蛋白(Apo)E(用于治療動(dòng)脈粥樣硬化))組合使用。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可選擇其它治療性基因產(chǎn)物(尤其是分泌的治療性基因產(chǎn)物)。基因編碼分泌的和/或可擴(kuò)散產(chǎn)物的例子包括(但不局限于)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素、分化因子等，例如β-干擾素(β-IFN)、促紅細(xì)胞生成素(epo)、胰島素、生長(zhǎng)激素(GH)和甲狀旁腺激素(PTH)。這些基因可用來(lái)治療各類疾病，包括多發(fā)性硬化和癌癥(β-IFN)、貧血(epo)、糖尿病(胰島素)、身材矮小(GH)和骨質(zhì)疏松(PTH)。本發(fā)明的方法也適于將基因編碼的非分泌性產(chǎn)物遞送到肌肉中。例如，預(yù)計(jì)本發(fā)明的方法可用來(lái)治療肌肉營(yíng)養(yǎng)，方法是通過(guò)本發(fā)明方法的rAAV來(lái)遞送營(yíng)養(yǎng)蛋白不良基因[例如參見(jiàn)，C.C.Lee等，Nuature,349:334-336(1991)]。轉(zhuǎn)基因的選擇并不能認(rèn)為是本發(fā)明的一個(gè)限制因素，因?yàn)檫@種選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力所及的。
C．載體中的調(diào)控元件除了AAV ITR序列和轉(zhuǎn)基因外，載體還包括驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)導(dǎo)的肌細(xì)胞中表達(dá)所必需的調(diào)控元件。因此，希望載體含有與轉(zhuǎn)基因操作性連接的所選的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(如果需要)，它們和轉(zhuǎn)基因均在載體的AAV ITR序列之間。
啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(如果需要)可根據(jù)常規(guī)方式來(lái)選擇，這并不局限于載體本身。有用的啟動(dòng)子可以是能控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的組成型啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)的(誘導(dǎo)型)啟動(dòng)子。例如，理想的啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子[例如參見(jiàn)，Boshart等，Cell,41:521-530(1985)]。其它理想的啟動(dòng)子包括(但不局限于)Rous肉瘤病毒LTR啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和誘導(dǎo)型小鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可選擇其它一些啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列。
希望載體還含有影響轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的核酸序列，包括提供轉(zhuǎn)錄物有效聚腺苷酸化所需信號(hào)的序列和具有功能性剪接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子。在本發(fā)明的典型載體中，采用的常見(jiàn)聚腺苷酸化序列從乳多空病毒SV-40獲得。聚腺苷酸化序列通常插在載體中的轉(zhuǎn)基因序列后和3′AAV ITR序列前。從SV-40還能獲得常見(jiàn)的內(nèi)含子序列，其稱為SV-40T內(nèi)含子序列。這些及其它控制或增強(qiáng)基因表達(dá)所需的元件的選擇是常規(guī)的，許多這樣的序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的[例如參見(jiàn)，Sam Brook等，及其中引用的參考文獻(xiàn)]。
為了便于本文的描述，轉(zhuǎn)基因、啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和其它調(diào)控元件的組合稱為“小基因(minigene)”。如上所述，小基因側(cè)接了5′和3′AAV ITR序列。在提供了本發(fā)明的教導(dǎo)后，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易設(shè)計(jì)這種小基因。
下面的實(shí)施例中給出了rAAV的一個(gè)例子(即AAV.CMVLacZ)以及其在本發(fā)明方法中的用途。如圖1所示，該示范的rAAV含有5′AAV ITR、CMV啟動(dòng)子、SV-40內(nèi)含子、LacZ轉(zhuǎn)基因、SV-40聚腺苷酸化序列和3′AAV ITR。然而，如上所述，本發(fā)明的方法不局限于任何具體rAAV的使用。
D．rAAV的制備根據(jù)以前已有出版和描述的材料，構(gòu)建用于本發(fā)明方法中的rAAV時(shí)采用的序列可以從商業(yè)或?qū)W術(shù)來(lái)源獲得。這些材料也可來(lái)自個(gè)別患者或用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并實(shí)踐采用的標(biāo)準(zhǔn)的重組分子克隆方法來(lái)制得和篩選得到。對(duì)用于生產(chǎn)rAAV載體的已有核酸序列的任何變化(包括序列缺失、插入和其它突變)也可用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)產(chǎn)生。
rAAV(包括AAV的序列、轉(zhuǎn)基因和其它載體元件)的裝配可采用常規(guī)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。一種特別希望的方法在K.J.Fisher等，J.Virol.,70:520-532(1996年1月)中有所描述，該部分內(nèi)容納入本文作參考。然而，其它合適的方法還包括cDNA克隆(如課本[Sambrook等，如上所述]中描述的方法)，用AAV基因組的重疊寡核苷酸序列，聚合酶鏈反應(yīng)以及其它任何能提供所需核苷酸序列的合適的方法。在合適的時(shí)候，可采用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染方法，以在輔助病毒(例如用CaPO4轉(zhuǎn)染方法的E1缺失的腺病毒)存在下增殖rAAV病毒，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易對(duì)此作出選擇?？捎糜诒景l(fā)明的其它常規(guī)方法包括AAV病毒基因組的同源重組、使病毒在瓊脂鋪層上長(zhǎng)成噬菌斑以及測(cè)定信號(hào)產(chǎn)生的方法等。
希望對(duì)產(chǎn)生的rAAV進(jìn)行純化以除去任何污染的腺病毒或野生型AAV。特別希望采用的純化方案在K.J.Fisher等，J.Virol.,70(1):520-532(1996年1月)中有所描述，該部分內(nèi)容納入本文作參考。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員也很容易選擇其它合適的純化方法。
Ⅱ．治療應(yīng)用一旦獲得含有所需轉(zhuǎn)基因的rAAV，可將載體直接給予動(dòng)物肌肉。本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在肌肉比其它部位更特別適于用作產(chǎn)生分泌性治療產(chǎn)物(如因子Ⅸ或載脂蛋白(Apo)E)的部位?；蛘?，本發(fā)明的方法可用來(lái)將非分泌性基因產(chǎn)物遞送到肌細(xì)胞中。
本發(fā)明的rAAV載體宜懸浮在生物相容溶液或藥學(xué)上可接受載體或遞送載體中來(lái)給予患者。一種合適的載體是無(wú)菌鹽水。為了這個(gè)目的，也可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的、已知可用作藥學(xué)上可接受的載體的其它水性或非水性等滲無(wú)菌注射液和水性或非水性無(wú)菌懸液。
本發(fā)明的rAAV載體應(yīng)給予足夠量，以使所選轉(zhuǎn)基因整合并表達(dá)，從而獲得治療效果，沒(méi)有不當(dāng)?shù)呢?fù)效應(yīng)，而有醫(yī)學(xué)上可接受的生理效應(yīng)，載體的劑量是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員能確定的。在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，rAAV直接注入心肌、骨骼肌或平滑肌中。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)理解，本發(fā)明的方法也可采用其它給藥方法(如靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射)，只要rAAV靶向肌細(xì)胞即可。
rAAV載體劑量主要取決于以下幾個(gè)因素例如有待治療的疾病、所選的轉(zhuǎn)基因、患者的年齡、體重和健康狀況，因此對(duì)于不同的患者會(huì)有不同的劑量。認(rèn)為本發(fā)明rAAV的治療有效量在1-50毫升鹽水溶液之間，每毫升該溶液含有約1×108至1×1011的本發(fā)明rAAV載體顆粒。希望每一劑量含有至少109的rAAV顆粒。更佳的人用劑量是大約1-20毫升有上述濃度鹽水溶液。通過(guò)生物試驗(yàn)可檢測(cè)所選轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平，以確定給藥的途徑、劑量或頻率。rAAV給藥可按需重復(fù)。
下文列出的實(shí)施例描述了制備載體和實(shí)施本發(fā)明方法的較佳方法。這些實(shí)施例只是用來(lái)作為示范，它們并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1-AAV.CMVLacZ的產(chǎn)生制得一重組AAV(rAAV)，其中rep和cap基因被小基因(AAV.CMVLacZ)代替，該小基因能在CMV啟動(dòng)子控制下表達(dá)大腸桿菌β-半乳糖苷酶。用psub201衍生獲得的順式作用質(zhì)粒pAAV.CMVLacZ制得AAV.CMVLacZ[R.Samulski等，J.Virol.,61(10):3096-3101(1987)]。簡(jiǎn)言之，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入已感染E1缺失的腺病毒的293細(xì)胞中[K.J.Fisher等，J,Virol.,70:520-532(1996)],AAV rep和cap功能由反式作用質(zhì)粒pAAV/Ad提供[R.Samulski等，J.Virol,,63:3822-3826(1989)]。如K.J.Fisher等，J,Virol.,70:520-532(1996)中所述的，滴定各批AAV.CMVLacZ載體產(chǎn)物的每毫升基因組拷貝數(shù)。
AAV.CMVLacZ基因組(4883bp)從5′到3′的結(jié)構(gòu)包括5′AAV ITR(bp-1-173)，通過(guò)以pAV2[SEQ ID NO:1的核苷酸365-538]為模板用PCR獲得[CA.Laughlin等，Gene,23:65-73(1983)]；CMV立即早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子[Boshart等，Cell,41:521-530(1985)；SEQ IDNO:1的核苷酸563-1157]，SV40內(nèi)含子(SEQ ID NO:1的核苷酸1178-1179)，大腸桿菌lacZ cDNA(SEQ ID NO:1中的核苷酸1356-4827)，SV40聚腺苷酸化信號(hào)(含有早期和晚期轉(zhuǎn)錄單位的斷裂/聚腺苷酸化信號(hào)的237BamHⅠ-BclⅠ限制性片段；SEQ ID NO:1中的核苷酸4839-5037)和
3′AAV ITR，從pAV2中獲得的SnaBⅠ-BglⅡ片段(SEQ ID NO:1中的核苷酸5053-5221)。
參看圖1，雙鏈載體序列中有兩個(gè)BamHⅠ位點(diǎn)。第一個(gè)位于SV40內(nèi)含子中bp875處，第二個(gè)位于lacZ DNA和SV40聚腺苷酸化信號(hào)間的bp4469處。因此用BamHⅠ消化雙鏈序列將釋放出長(zhǎng)3595bp的片段。圖中還示出了用來(lái)檢測(cè)內(nèi)部BamHⅠ片段及全長(zhǎng)載體的cDNA探針位置。
用標(biāo)準(zhǔn)方法純化rAAV.CMVLacZ病毒[例如參見(jiàn)，K.F.Kozarsky等，J.Biol.Chem.,269:13695-13702(1994)]。如下測(cè)試用于下列實(shí)施例的rAAV貯存物，以保證沒(méi)有復(fù)制競(jìng)爭(zhēng)性野生型AAV和輔助型E1-缺失的腺病毒。
將293細(xì)胞接種到槽式載玻片(chamber slide)上，并用野生型腺病毒、等份rAAV載體貯存物共感染。感染20小時(shí)后，固定細(xì)胞，用抗AAV衣殼蛋白的小鼠單克隆抗體(American Research Products)培育細(xì)胞。用偶聯(lián)FITC的第二抗體檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物。將陽(yáng)性信號(hào)記為一個(gè)感染性AAV單位。用等份rAAV載體貯存物感染293細(xì)胞，并對(duì)堿性磷酸酶報(bào)道物表達(dá)進(jìn)行染色，以測(cè)定污染的輔助型腺病毒。輔助型腺病毒是E1缺失型的，其含有在CMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下的人胎盤(pán)堿性磷酸酶cDNA。在高度純化的rAAV制備物中沒(méi)有檢測(cè)到有復(fù)制競(jìng)爭(zhēng)性的野生型AAV或輔助腺病毒。
實(shí)施例2-rAAV在體內(nèi)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌使rAAV與和不與E2a-缺失的腺病毒(目的是增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo))一起給藥。動(dòng)物試驗(yàn)得到Wistar Institute的Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)的批準(zhǔn)。
簡(jiǎn)言之，在腹膜內(nèi)注射氯胺酮(70mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)使5周齡雌性C57BL/6.小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)麻醉，然后將下肢切開(kāi)1cm。將25μl HEPES緩沖鹽水(HBS,pH7.8)中的rAAV.CMVLacZ(1×109載體基因組)，或在注射前補(bǔ)加了腺病毒E2a突變株d1802(5×1010A260顆粒，1×108pfu)[S.A.Rice和D.L.Klessing,J.Virol.,56:767-778(1985)]的rAAV.CMVLacZ經(jīng)Hamilton注射器注射入各腿脛骨前肌(tibialis anterior muscle)中。切口用4-0 Vicryl縫線縫合。為了分析轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，在注射后各時(shí)間點(diǎn)剖檢動(dòng)物，用手術(shù)刀切下注射過(guò)的肌肉。將組織放在一滴OTC包埋化合物(embedding compound)中，在液氮冷卻的異戊烷中速凍7秒，立即移入液氮中。分析每一時(shí)間點(diǎn)的組織提供最少6個(gè)注射部位(即，至少3個(gè)動(dòng)物的兩側(cè)的樣品)。
為了進(jìn)行組織化學(xué)分析，將冷凍的肌肉橫向分割成兩份相等的半份，從而產(chǎn)生組織截面。對(duì)兩個(gè)半份組織連續(xù)切片(切至6μm)。為了進(jìn)行X-gal組織化學(xué)分析，將切片固定在剛制備的0.5％戊二醛PBS溶液中，并如K.J.Fisher等，J.Virol.,70:520-532(1996)所述的那樣染色測(cè)定β-半乳糖苷酶活性。使切片在中性紅溶液中復(fù)染并封固。
當(dāng)用腺病毒作為rAAV的輔助病毒時(shí)，X-gal組織化學(xué)分析表明第17天有高水平的肌纖維轉(zhuǎn)導(dǎo)，并伴有顯著的炎癥。然而，令人吃驚的是，接受了沒(méi)有輔助腺病毒rAAV的動(dòng)物表現(xiàn)出了超過(guò)有腺病毒動(dòng)物所見(jiàn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。這些高水平可以持續(xù)180天而沒(méi)有明顯消退。
實(shí)施例3-高效的rAAV基因組整合物是截短的頭對(duì)尾串聯(lián)體為了分析穩(wěn)定化rAAV基因組的分子狀態(tài)，對(duì)如上所述經(jīng)注射小鼠中所得骨骼肌的DNA進(jìn)行Southern印跡分析?？紤]采用兩種模型rAAV基因組以附著體雙鏈基因組(如在裂解性感染時(shí)形成的那些)存在，或是類似潛伏感染的整合原病毒形式持續(xù)存在。
簡(jiǎn)言之，在選定的時(shí)間點(diǎn)上，從小鼠肌肉中分離獲得低分子量DNA(Hirt)(見(jiàn)下文A部分)和高分子量基因組DNA(見(jiàn)下文B部分)。將DNA樣品溶解在1％瓊脂糖凝膠上，通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond-N,Amersham)上。使印跡與從lacZcDNA中分離出的、用32P-dCTP隨機(jī)引物標(biāo)記的限制性片段雜交。
A．附著體雙鏈基因組的檢測(cè)為了檢測(cè)非整合形式的rAAV基因組，將其與對(duì)應(yīng)于圖1所示探針序列的32P-標(biāo)記的cDNA雜交，分析了轉(zhuǎn)導(dǎo)肌肉DNA的Hirt抽提物。Hirt DNA樣品(15μl，等價(jià)于15mg組織)是從注射后第8、17、30和64天收獲的肌肉中抽提出的。
在腺病毒存在下用rAAV感染的細(xì)胞系培養(yǎng)所得的DNA進(jìn)行分析。對(duì)該細(xì)胞系Hirt抽提物的分析表明，單鏈形式病毒和雙鏈形式病毒的單體均存在。然而，只用rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的肌肉Hirt抽提物表明第8天產(chǎn)生的單鏈基因組在第64天降低到不能被檢測(cè)水平。在Hirt抽提物中從未檢測(cè)到有雙鏈形式的rAAV，甚至在濾膜過(guò)度暴露(over-exposed)時(shí)。這暗示，單鏈rAAV基因組被有效地轉(zhuǎn)移到骨骼肌細(xì)胞中；但是，它沒(méi)有轉(zhuǎn)變成有轉(zhuǎn)錄活性的附著體形式。
B．整合的原病毒DNA的檢測(cè)和特性分析為了檢測(cè)整合的原病毒DNA，對(duì)注射后64天時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞中所得細(xì)胞總DNA進(jìn)行其它雜交研究。用BamHⅠ或HindⅢ(不切割原病毒DNA的限制性酶)消化基因組DNA(10μgm，等價(jià)于18μg組織)。如所預(yù)計(jì)的，HindⅢ消化在凝膠組分和與病毒特異性探針雜交后產(chǎn)生了一條帶。然而，當(dāng)用在原病毒內(nèi)兩處切割的BamHⅠ消化基因組DNA時(shí)，檢測(cè)到有3.6kb預(yù)計(jì)大小的不連續(xù)條帶，其豐度為每個(gè)二倍體宿主細(xì)胞基因組中大約有一個(gè)原病毒基因組。
用PCR分析鑒定整合的原病毒的結(jié)構(gòu)，以描述持續(xù)性的可能機(jī)理。以前對(duì)野生型和重組型AAV的研究已經(jīng)指出，在病毒生命周期的裂解階段和潛伏階段中，DNA的復(fù)制途徑是不同的。具體地講，在有輔助病毒存在時(shí)，AAV通過(guò)合成頭對(duì)頭或尾對(duì)尾串聯(lián)體的機(jī)制復(fù)制形成了二聚化的復(fù)制中間產(chǎn)物。這與潛伏感染時(shí)的相反，潛伏感染時(shí)整合的原病毒基因組的特點(diǎn)是以頭對(duì)尾基因組方式排列。
對(duì)骨骼肌細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行PCR分析，擴(kuò)增AAV基因組串聯(lián)體間的接頭。根據(jù)整合形式的rAAV通常是頭對(duì)尾串聯(lián)體的觀察結(jié)果，設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)整合rAAV的PCR方法。具體地講，合成寡核苷酸引物，使PCR選擇性地?cái)U(kuò)增橫跨AAV.CMVLacZ基因組兩個(gè)單體的頭對(duì)尾接頭。有義鏈引物005(5′-ATAAGCTGCAA TAAAC AAGT-3′；SEQ ID NO:4)對(duì)應(yīng)于SV40聚腺苷酸化信號(hào)區(qū)的bp4584-4603。反義鏈引物013(5′-CATGGT AATAG CGATG ACTA-3′；SEQ IDNO:2)對(duì)應(yīng)于CMV啟動(dòng)子的bp497-478，而反義鏈引物017(5′-GCTCT GCTTATATAG ACCTC-3′；SEQ ID NO:3)對(duì)應(yīng)于CMV啟動(dòng)子的bp700-680。如果ITR保持完整，則寡核苷酸005+013[SEQ ID NO:2]應(yīng)擴(kuò)增出797bp的片段，而寡核苷酸005和017[SEQ ID NO:3]應(yīng)擴(kuò)增出1000bp的引物。要著重強(qiáng)調(diào)的是，PCR產(chǎn)物的預(yù)計(jì)大小是以原病毒接頭含有兩個(gè)ITR拷貝的假設(shè)為根據(jù)的。因此，擴(kuò)增比兩個(gè)拷貝為小的接頭處產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的大小會(huì)相應(yīng)地較小。
PCR反應(yīng)采用100ng的基因組DNA模板和0.5μM的引物濃度。熱循環(huán)過(guò)程為94℃ 1分鐘、52℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘30秒，循環(huán)35次；第一次循環(huán)中的94℃變性步驟為2分鐘，而最后一次循環(huán)的72℃延伸步驟為10分鐘。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。
如上所述，從注射后第64天時(shí)的AAV.CMVLacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)肌肉中分離得到基因組DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。用注射了Hepes緩沖鹽水(HBS)的肌肉的基因組DNA作為陰性PCR對(duì)照。在采用應(yīng)跨越頭對(duì)頭或尾對(duì)尾接頭的引物時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到有擴(kuò)增產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，當(dāng)用寡核苷酸005和013以及005和017來(lái)分析AAV.CMVLacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)的肌細(xì)胞DNA時(shí)，檢測(cè)到一個(gè)斑點(diǎn)，這有與特異性頭對(duì)尾串聯(lián)體群相符(圖2A和2B)。
另外，用含整合AAV.CMVLacZ的細(xì)胞系的基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。用Southern印跡分析測(cè)定了這些克隆的原病毒結(jié)構(gòu)。鑒定出三個(gè)細(xì)胞系(10-3.AV5,10-3.AV6和10-3.AV18)，它們每一個(gè)都含有至少兩個(gè)整合的AAV.CMVLacZ以頭對(duì)尾方式排列的單體拷貝。根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小(用引物組005-013獲得720bp的產(chǎn)物，用引物組005-017獲得930bp的產(chǎn)物)，兩個(gè)克隆(10-3.AV5和10-3.AV6)類似地在接頭處含有1.5個(gè)拷貝的AAV ITR。另一個(gè)克隆10-3.AV18含有包括AAV ITR在內(nèi)的大量缺失，用引物組005-013產(chǎn)生了320bp的產(chǎn)物，而用引物組005-017產(chǎn)生了500bp的產(chǎn)物。另一個(gè)細(xì)胞系10-3.AV9含有整合AAV.CMVLacZ的一個(gè)單體拷貝(根據(jù)Southern印跡分析)，并且看來(lái)為PCR產(chǎn)物的缺失所證實(shí)。
因此，對(duì)選用來(lái)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的rAAV感染的細(xì)胞系DNA的分析結(jié)果顯示了小于完整頭對(duì)尾串聯(lián)體預(yù)計(jì)大小的清晰條帶。
D．結(jié)構(gòu)分析通過(guò)PCR反應(yīng)物(圖3)的亞克隆，然后進(jìn)行限制性分析(圖4A-4G)，對(duì)從骨骼肌DNA回收的原病毒接頭進(jìn)行詳細(xì)的結(jié)構(gòu)分析。具體地講，將上述所得BL.11肌細(xì)胞樣品的PCR產(chǎn)物直接連接到商業(yè)上可購(gòu)得的質(zhì)粒pCRⅡ中，其中插入物側(cè)接了EcoRⅠ位點(diǎn)。用連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化商業(yè)上可購(gòu)得的感受態(tài)細(xì)菌株TOP10F′。事實(shí)上，該步驟產(chǎn)生了PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒文庫(kù)。使該文庫(kù)平板培養(yǎng)，鋪板密度足以提供充分分離的菌落，覆上尼龍膜并與對(duì)應(yīng)于CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的32-P標(biāo)記過(guò)的片段雜交來(lái)進(jìn)行篩選。使推定的陽(yáng)性克隆在小規(guī)模培養(yǎng)(2毫升)中生長(zhǎng)過(guò)夜。
從小規(guī)模培養(yǎng)中抽提出6個(gè)典型克隆的質(zhì)粒DNA，然后用EcoRⅠ消化來(lái)釋放整個(gè)PCR產(chǎn)物，或用SnaBⅠ(作為診斷指示劑)消化。用SnaBⅠ消化應(yīng)釋放出跨越CMV啟動(dòng)子的306bp片段(SnaBⅠ476至SnaBⅠ782)。對(duì)應(yīng)于ITR接頭的第二片段(SnaBⅠ142至SnaBⅠ476)的釋放視形成串聯(lián)體時(shí)發(fā)生的重排而定，因此大小范圍為334bp(2個(gè)完整的ITR拷貝)至0bp(如果ITR缺失的話)。
將認(rèn)為含有1.5拷貝AAV ITR(10-3.AV5)的細(xì)胞系10-3.AV5的PCR產(chǎn)物也克隆到pCRⅡ中，并用指定的酶消化。該樣品作為診斷性SnaBⅠ消化的陽(yáng)性對(duì)照。用EcoRⅠ消化該樣品會(huì)正確地釋放出730bp的PCR片段和約長(zhǎng)500bp的次級(jí)雙聯(lián)體條帶。認(rèn)為該次級(jí)條帶是由于次級(jí)結(jié)構(gòu)在細(xì)菌復(fù)制時(shí)產(chǎn)生于AAV ITR的1.5拷貝中。用SnaBⅠ消化陽(yáng)性對(duì)照會(huì)從CMV啟動(dòng)子中釋放出診斷性的306bp片段和對(duì)應(yīng)于ITR接頭的250bp片段。
用EcoRⅠ和SnaBⅠ消化6個(gè)克隆的試驗(yàn)表明，在所有回收的接頭中均存在長(zhǎng)度不等的缺失，并在很大程度上局限于接頭處的ITR。序列分析進(jìn)一步表明，大多數(shù)缺失跨越了接頭處的兩部分ITR，但沒(méi)有涉及毗鄰的病毒DNA。
E．熒光原位雜交(FISH)分析在骨骼肌冷凍切片上進(jìn)行FISH分析，以確定原病毒DNA在注射過(guò)的組織中的分布。將治療或?qū)φ招∈蟮?-5mm的肌肉小塊包埋在OTC中，并在液氮冷卻的液態(tài)異戊烷中快速冷凍。將10μ厚的冷凍切片切到低溫顯微鏡上。安置、固定(Histochoice)并用已有描述的方法[E.Gussoni等，Nat.Biotech.,14:1012-1016(1996)]進(jìn)行原位雜交處理便于熒光分析。對(duì)毗連的切片進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性染色分析，以確定肌纖維束中的lacZ陽(yáng)性區(qū)域。
為了定量測(cè)定FISH信號(hào)，在裝有落射熒光的Nikon microphot FxA顯微鏡上檢查lacZ陽(yáng)性區(qū)域(通過(guò)染包分析毗連切片的β-半乳糖苷酶活性來(lái)確定)。在標(biāo)準(zhǔn)的相差模式下計(jì)數(shù)切片中l(wèi)acZ陽(yáng)性區(qū)域的單個(gè)肌纖維的總數(shù)。然后，在熒光顯微鏡下用合適的異硫氰酸若丹明濾色包(filter package)檢查同一區(qū)域。記錄顯示出點(diǎn)狀染色的肌細(xì)胞核數(shù)目。在相差模式下檢查每一陽(yáng)性的胞核，以確定它來(lái)自肌纖維。對(duì)于對(duì)照，以同樣方式檢查并定量測(cè)定lacZ陰性區(qū)域(同一切片中缺乏β-半乳糖苷酶活性的區(qū)域或模擬轉(zhuǎn)染的肌切片)。
對(duì)于聚焦顯微鏡，在裝有Krypton-argon激光器(TSC和Voxel View Silicon中央圖形工作站)的Leica聚焦激光顯微鏡(Leica Lasertechnik,GmbH)、上油浸物鏡(100X)下觀察切片。在若丹明通道下觀察圖象，隨后在微分干涉相差下觀察，以確認(rèn)熒光信號(hào)位于肌細(xì)胞核中。然后將微分相差和熒光圖象依次層疊在TCS中央工作站上，并轉(zhuǎn)移到Silicon圖形工作站中進(jìn)行圖象加工。保存加工后圖象并用Photoshop軟件打印。
或者，染色測(cè)定連續(xù)切片的β-半乳糖苷酶活性，以確定轉(zhuǎn)基因表達(dá)的肌纖維，并使切片與生物素化原病毒探針雜交，以確定原病毒基因組的分布位置。在一些表達(dá)β-半乳糖苷酶的肌纖維胞核中檢測(cè)到有不連續(xù)的熒光信號(hào)。對(duì)三個(gè)連續(xù)切片的調(diào)查結(jié)果顯示，1006個(gè)表達(dá)β-半乳糖苷酶的纖維細(xì)胞核中有53個(gè)有雜交，而377個(gè)不表達(dá)β-半乳糖苷酶的肌纖維細(xì)胞核中沒(méi)有一個(gè)有雜交。在未感染的動(dòng)物組織中沒(méi)有檢測(cè)到有雜交(數(shù)據(jù)未列出)。
用FISH檢測(cè)病毒基因組的能力為分析提供了另一種尺度。在表達(dá)β-半乳糖苷酶的肌纖維所含的所有細(xì)胞核的5％中檢測(cè)到有單個(gè)雜交點(diǎn)。由于該方法的靈敏度有限(尤其對(duì)小于12kb的靶序列)，這可能過(guò)低地估計(jì)了轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞核[B.J.Trask,Trends Genet.,7:149-154(1991)]。FISH分析的暗示是有趣的。每個(gè)二倍體成肌細(xì)胞基因組中有一個(gè)原病毒基因座存在(經(jīng)Southern測(cè)定測(cè)得)，以及證明5％核酸攜帶了AAV基因組的FISH結(jié)果，預(yù)示了串聯(lián)體平均至少包含10個(gè)原病毒基因組。這些研究顯示出的β-半乳糖苷酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)延伸超出了載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞核部位，說(shuō)明核區(qū)域至少延伸了10μm。這與以前的研究結(jié)果(記載了cytostolic蛋白有延伸的核區(qū)[H.M.Blau等，Adv.Exp.Med.&Biol.,280:167-172(1990)])是一致的。由于一些原因，肌纖維合胞體結(jié)構(gòu)內(nèi)延伸的轉(zhuǎn)基因表達(dá)核區(qū)對(duì)基因治療應(yīng)用是很重要的。在蛋白質(zhì)分布受膜屏障約束更少的合胞體內(nèi)，轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)形成的重組蛋白的凈產(chǎn)量(net yield)可能會(huì)更高。而且，在需要表達(dá)多倍重組蛋白(如有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的那些蛋白)的載體系統(tǒng)中，本系統(tǒng)也有優(yōu)點(diǎn)[J.R.Howe等，J.Biol.Chem.,270:14168-14174(1995)；V.M.Rivera等，Nat.Med.,2:1028-1032(1996)]。在肌肉中，由于重疊區(qū)域的延伸網(wǎng)絡(luò)，重組蛋白的共同表達(dá)不需要共同轉(zhuǎn)導(dǎo)到一個(gè)胞核中。
實(shí)施例4-當(dāng)用不含輔助病毒的rAAV將基因定向遞送到肌肉上時(shí)，轉(zhuǎn)基因引起的免疫應(yīng)答減到最小鑒于以前的研究證明肌纖維中出現(xiàn)了針對(duì)腺病毒載體表達(dá)的β-半乳糖苷酶的破壞性免疫應(yīng)答，因此在給予沒(méi)有輔助病毒的含lacZ的rAAV載體所實(shí)現(xiàn)的肌細(xì)胞內(nèi)lacZ表達(dá)穩(wěn)定性是令人驚奇的。通過(guò)Western分析測(cè)定抗β-半乳糖苷酶抗體的血清水平，進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因特異性免疫應(yīng)答。
從注射病毒30天后解剖的C57BL/6和ROSA-26小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)中取血并收集血清。ROSA-26是攜帶大腸桿菌β-半乳糖苷酶cDNA的轉(zhuǎn)基因系小鼠，在129小鼠背景中長(zhǎng)大而成。另外還從C57BL/6小鼠收獲血清，該小鼠接受了重組LacZ腺病毒(H5.010CMVlacz,5×108pfu，在25μl HBS中)或重組AAV.CMVLacZ(如上所述)的肌內(nèi)注射。兩個(gè)載體均從CMV驅(qū)動(dòng)的小基因中表達(dá)出大腸桿菌β-半乳糖苷酶。將純化的大腸桿菌(Sigma)β-半乳糖苷酶等份(5μg)溶解在10％ SDS聚丙烯酰胺凝膠(5mg/泳道)，并通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜(Hybond-ECL,Amersham)上。使印跡與blotto[5％無(wú)脂牛奶、50mMTris-HCl(pH8.0)、2mM CaCl和0.05％吐溫-20]室溫培育2小時(shí)，以阻斷可能存在的位點(diǎn)。切下各泳道與血清(以1∶200稀釋在blotto中)一起室溫培育1小時(shí)。加入山羊抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物，然后進(jìn)行ECL檢測(cè)(Amersham)，標(biāo)記出抗原-抗體復(fù)合物的位置。將切下的泳道重新裝配到聚酯膜上，然后加入ECL試劑和并進(jìn)行薄膜記錄。
將沒(méi)有腺病毒的H5.010CMVlacZ E1肌內(nèi)注射到C57BL/6小鼠骨骼肌中會(huì)導(dǎo)致血清中大量積累β-半乳糖苷酶抗體，而這在攜帶插入的lacZ基因的MHC-相同的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(對(duì)β-半乳糖苷酶有免疫耐受性)中不會(huì)發(fā)生。很明顯，在肌內(nèi)注射AAV.CMVLacZ后，C57BL/6和lacZ轉(zhuǎn)基因動(dòng)物均不產(chǎn)生抗β-半乳糖苷酶的抗體。
實(shí)施例5-肌細(xì)胞中腺病毒和AAV載體的對(duì)比研究研究重組AAV和腺病毒介導(dǎo)的定向于肌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移的生物學(xué)，結(jié)果表明腺病毒(而不是AAV)感染了抗原呈遞細(xì)胞(APC)，該細(xì)胞引起了瀑布式的免疫應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致破壞性的細(xì)胞內(nèi)和體液免疫力。
建立一個(gè)試驗(yàn)范例，以確定宿主對(duì)定向于骨骼肌的重組AAV和腺病毒基因轉(zhuǎn)移應(yīng)答反應(yīng)的具體差異。目的是為了描述這些載體系統(tǒng)在生物學(xué)上的差異，這些載體系統(tǒng)會(huì)在重組腺病毒載體(但不是AAV載體)表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物(即β-半乳糖苷酶)時(shí)，產(chǎn)生針對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的優(yōu)先免疫激活。
通常的方法是將表達(dá)lacZ的AAV注射到小鼠的右腿中。在上述實(shí)施例中已經(jīng)顯示出，這樣能提供有效而穩(wěn)定的基因表達(dá)。在其它試驗(yàn)組中，動(dòng)物接受rAAV以及載體和細(xì)胞進(jìn)行了各種組合，以明確針對(duì)腺病毒(Ad)的免疫反應(yīng)的成分，正是Ad導(dǎo)致破壞細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。然后評(píng)價(jià)這些實(shí)驗(yàn)操作對(duì)移入rAAV的肌纖維穩(wěn)定性的影響并測(cè)定其它免疫參數(shù)來(lái)確定這些實(shí)驗(yàn)操作的效果。通過(guò)評(píng)價(jià)AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的肌纖維中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的穩(wěn)定性和炎癥的發(fā)展，從而可檢測(cè)引起肌纖維中抗β-半乳糖苷酶免疫力的任何干擾因素。
如下所歸納的，為這個(gè)研究設(shè)計(jì)了四個(gè)實(shí)驗(yàn)組。用基本類似于上述實(shí)施例2的方法(即將病毒懸浮在磷酸緩沖鹽溶液中并直接注射入脛骨前肌中)將病毒注射入小鼠體內(nèi)。在解剖小鼠后，將肌肉組織快速冷凍在液氮冷卻的異戊烷中并切成6μm厚切片，同時(shí)收集血清樣品和引流出腹股溝淋巴結(jié)用于免疫試驗(yàn)。
從腹股溝淋巴結(jié)中收獲淋巴細(xì)胞，基本如下所述進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的6小時(shí)51鉻(Cr)-釋放試驗(yàn)，在V形底部的96孔板中200μl DMEM中采用不同的效應(yīng)物與靶細(xì)胞(C57SV,H-2b)的比值。在與效應(yīng)細(xì)胞混合前，靶細(xì)胞先用表達(dá)堿性磷酸酶的腺病毒(AdALP)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)了表達(dá)lacZ的逆轉(zhuǎn)錄病毒pLJ-lacZ感染，再用100μCi的51Cr標(biāo)記，每個(gè)孔采用5×103個(gè)細(xì)胞。在培育6小時(shí)后，在γ計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)100μl上清液等份。圖5A-5C中提供了1-3組的結(jié)果。
將冷凍切片(6μm)以甲醇固定并用抗-CD4和抗-CD8抗體染色。進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)測(cè)量分析，以確定每一切片中的CD8+細(xì)胞和CD4+細(xì)胞數(shù)。
細(xì)胞因子釋放測(cè)定基本上按照下文所述方式進(jìn)行。用β-半乳糖苷酶、純化的AAV或5型腺病毒再刺激淋巴細(xì)胞40小時(shí)。測(cè)定無(wú)細(xì)胞上清液(100μl)中IL-10和IFN-γ的分泌。72小時(shí)后用8小時(shí)3H-胸苷(0.50μCi/孔)脈沖測(cè)定增殖情況。圖6A和6B中提供了四組結(jié)果。
基本按下述步驟進(jìn)行中和抗體試驗(yàn)。56℃培育小鼠血清樣品30分鐘以滅活補(bǔ)體，然后從1∶20起以DEME作兩倍系列稀釋。將各個(gè)血清稀釋液(100μl)與β-半乳糖苷酶或5型腺病毒混合。37℃培育至少60分鐘后，在每一孔中加入100μl含20％FBS的DMEM。固定細(xì)胞并在以后的日子里染色測(cè)定β-半乳糖苷酶的表達(dá)。所有細(xì)胞均在沒(méi)有血清樣品時(shí)被染成藍(lán)色。圖6A和6B中提供了四組結(jié)果。
第1組小鼠的右腿接受了如實(shí)施例1所述制得的AAV.CMVLacZ，且沒(méi)有其它干擾因素。單用AAV.CMVLacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生了高水平的、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因(甚至在第28天都能見(jiàn)到)而無(wú)淋巴細(xì)胞滲入。沒(méi)有檢測(cè)到CD8 T細(xì)胞被激活(圖5)。也沒(méi)有檢測(cè)到抗原特異性的CD4+T細(xì)胞[即，病毒或β-半乳糖苷酶抗原(圖6A和6B)]。沒(méi)有產(chǎn)生抗β-半乳糖苷酶或腺病毒的抗體(圖7A和7B)。
第2組小鼠的右腿接受AAV.CMVLacZ，左腿接受表達(dá)lacZ的腺病毒(H5.010CMVlacZ)。該組的目的是為了確定針對(duì)Ad感染的肌纖維所免疫反應(yīng)是否是全身性的(通過(guò)其對(duì)AAV.CMVLacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一側(cè)腿的生物學(xué)影響來(lái)證明)。很明顯，腺病毒lacZ處理誘導(dǎo)了抗β-半乳糖苷酶的免疫應(yīng)答，致使AAV lacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)纖維被破壞。這并不令人驚奇，這與CD4和CD8 T細(xì)胞均滲入AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的腿中相關(guān)，且與針對(duì)腺病毒和β-半乳糖苷酶抗原的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞激活相關(guān)(圖8)。另外還觀察到針對(duì)AAV、Ad和β-半乳糖苷酶抗原的特異性的、激活的CD4T細(xì)胞，和對(duì)腺病毒和β-半乳糖苷酶的特異性抗體。
第3組動(dòng)物的右腿接受了AAV.CMVlacZ和Ad BglⅡ的混合物。Ad BglⅡ是不表達(dá)重組基因的E1缺失的腺病毒。該組的目的是為了確定在這種情況下腺病毒是否會(huì)提供引起抗AAV和lacZ免疫力的輔助效果。這沒(méi)有使轉(zhuǎn)基因表達(dá)喪失，但是針對(duì)病毒抗原(而不是β-半乳糖苷酶)的CD8 T細(xì)胞會(huì)有大量滲出，以及針對(duì)病毒抗原的CD4 T細(xì)胞被激活(圖6A-6B)。如所預(yù)計(jì)的，產(chǎn)生了抗腺病毒的抗體，但是沒(méi)有產(chǎn)生抗β-半乳糖苷酶的抗體(圖7A-7B)。
第4組動(dòng)物的右腿接受了AAV.CMVLacZ，用從天然動(dòng)物獲得的抗原呈遞細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移并用腺病毒進(jìn)行活體外感染。
在這些動(dòng)物中建立起了旺盛而有效的對(duì)β-半乳糖苷酶的免疫應(yīng)答(通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)損失和CD8與CD4細(xì)胞大量滲入而證實(shí))。在本實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)β-半乳糖苷酶的CD4 T細(xì)胞被激活(如圖6A-6B所示)，并產(chǎn)生了抗-β-半乳糖苷酶的抗體(如圖7A-7B所示)。
實(shí)施例6-將含有因子Ⅸ的純化的rAAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入骨骼肌細(xì)胞中，以治療上有用的水平表達(dá)F.Ⅸ，并且不會(huì)引起細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答。
本實(shí)施例中提供的數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的方法可以在有免疫能力的個(gè)體中和在缺乏對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的無(wú)免疫能力的個(gè)體中，提供延長(zhǎng)的治療性基因(F.Ⅸ)的表達(dá)。另外，在無(wú)免疫能力的動(dòng)物血清中所得的蛋白水平足以達(dá)到治療效果。因此，通過(guò)rAAV載體延長(zhǎng)無(wú)免疫能力患者(如患乙型血友病的患者)肌細(xì)胞內(nèi)的人F.Ⅸ表達(dá)，就可用來(lái)將F.Ⅸ遞送給患有該疾病的患者。
A．純化的rAAV的制備用于下文體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的rAAV載體攜帶了一個(gè)表達(dá)盒(序列)，該盒含有人F.ⅨcDNA，該cDNA包括受巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和和SV40轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)轉(zhuǎn)錄控制的內(nèi)含子Ⅰ的一部分。按照如下方式構(gòu)建含有側(cè)接AAVITR序列的表達(dá)盒和AAV蛋白編碼序列完全缺失的載體。
將F.Ⅸ順式質(zhì)粒(pAAV-FIX)和反式作用質(zhì)粒pAAV/Ad[A.W.Skulimowski和R.J.Samulski,Method.Mol.Genet.,7:7-12(1995)]共同轉(zhuǎn)染人胚胎腎(293)細(xì)胞(該細(xì)胞已經(jīng)如Fisher等，J.Virol.,70:520-532(1996)所述的感染了E1缺失的腺病毒)，產(chǎn)生重組AAV。pAAV-FIX從psub201[Skulimowski和Samulski，同上]獲得，其含有CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、包括1.4kb片段內(nèi)含子Ⅰ的人F.Ⅸ編碼序列[S.Kurachi等，J.Biol.Chem.,270:5276-5281(1995)]以及SV40聚腺苷酸化信號(hào)，它們側(cè)接了AAV ITR序列。AAV rep和cap基因功能由pAAV/Ad反式提供。缺失E1的腺病毒含有β-半乳糖苷酶(LacZ)或堿性磷酸酶(ALP)報(bào)道基因，以示蹤rAAV貯存物被該輔助病毒潛在污染。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后超聲破裂細(xì)胞，用四次CsCl密度梯度離心(如Fisher等所述，同上)純化釋放出的rAAV顆粒。
所得rAAV-F.IX顆粒的密度為1.37-1.40g/ml。通過(guò)狹線印跡雜交，采用對(duì)CMV啟動(dòng)子或內(nèi)含子Ⅰ序列有特異性的探針以及已知濃度的pAAV-F.Ⅸ質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定純化的rAAV-F.Ⅸ的滴度。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞，用對(duì)hF.Ⅸ特異性的ELISA測(cè)定感染后36小時(shí)時(shí)培養(yǎng)上清中的hF.Ⅸ濃度[J.Walter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3056-3061(1996)]，確認(rèn)rAAV-F.Ⅸ在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的能力。將rAAV-F.Ⅸ(1012-1013基因組/毫升)保藏在-79℃、HEPES緩沖鹽溶液中(pH7.8，包括5％甘油)。
當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)293細(xì)胞然后染色測(cè)定堿性磷酸酶或β-半乳糖苷酶(如Fisher等(同上)所述)時(shí)，發(fā)現(xiàn)純化的rAAV-F.Ⅸ通常沒(méi)有可檢測(cè)量的腺病毒污染。檢測(cè)到野生型AAV每109個(gè)rAAV-F.Ⅸ基因組有小于1個(gè)感染性單位。野生型AAV的測(cè)定方法如下將生長(zhǎng)在槽式載玻片上的293細(xì)胞以腺病毒和等份純化的rAAV-F.Ⅸ共同感染，在感染24小時(shí)后固定，以進(jìn)行免疫熒光染色。將抗AAV衣殼蛋白的小鼠單克隆抗體(American Research Products,Belmont,MA)作為第一抗體，稀釋度為1∶40的抗小鼠IgG(DAKO Corporation,Carpinteria,CA)作為第二抗體。
B．將rAAV引入骨骼肌中選用來(lái)肌內(nèi)注射rAAV的小鼠品種是C57BL/6(Charles Fiver Laboratories,Wilmington,MA)和B6、129、Ragl(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)。腹膜內(nèi)注射氯胺酮(70mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)使4-6周齡雌性小鼠麻醉，并在下肢縱向切開(kāi)長(zhǎng)1cm的切口。將AAV-F.Ⅸ(HEPES緩沖鹽溶液(pH7.8)中，每個(gè)動(dòng)物為2×1011或1×1010個(gè)載體基因組)用Hamilton注射器注射入每條腿的脛骨前肌(25μl)和股四頭肌中。用4-0 Vicryl縫線縫合切口。每隔7天從眶后纖維叢(retro-orbital plexus)中收集血樣到微量血細(xì)胞比容毛細(xì)管中，用ELISA測(cè)定血漿中的hF.Ⅸ(下文C部分)。對(duì)于免疫熒光染色測(cè)定(下文D部分)和DNA分析(下文F部分)，則是在選定的時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物并切下注射和未注射的肌肉組織。將組織放在OTC包埋化合物中，在液氮冷卻的異戊烷中快速冷凍7秒鐘，并立即轉(zhuǎn)移到液氮中。
C．用ELISA檢測(cè)人F.Ⅸ如Walter等所述的(同上)，用ELISA測(cè)定小鼠血漿中的人F.Ⅸ抗原。這種ELISA方法并不與小鼠F.Ⅸ交叉反應(yīng)。所有樣品作一式兩份測(cè)定。將肌肉浸在含亮抑酶肽(0.5mg/ml)的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中然后超聲破碎，從經(jīng)注射的小鼠肌肉制得蛋白抽提物。通過(guò)微量離心除去細(xì)胞碎片，用ELISA測(cè)定1∶10稀釋的蛋白抽提物中的hF.Ⅸ。用注射rAV.CMVLacZ的肌肉抽提物(見(jiàn)上述實(shí)施例1)作為陰性對(duì)照。用BIORAD試驗(yàn)(Bio-Rad,Hercules,CA)測(cè)定蛋白濃度。
D．免疫熒光染色為了進(jìn)行組織切片的免疫熒光染色，將肌肉組織的冷凍切片(6μm)固定在3％聚多甲醛(PBS,pH7.4)中15分鐘，PBS清洗5分鐘，在甲醇中培育10分鐘，用PBS洗三次，然后放在PBS/3％牛血清白蛋白(BSA)中封閉1小時(shí)。然后將切片與親和純化的、以PBS/1％BSA 1∶1000稀釋的山羊抗人F.Ⅸ抗體(AffintiyBiologicals)一起培育過(guò)夜。在PBS/1％BSA中洗滌三次(每次10分鐘)后，施加第二抗體(FITC-偶聯(lián)的兔抗山羊IgG,DAKO Corporation，以PBS/1％BSA 1∶200稀釋)90分鐘。再在PBS/1％BSA中洗滌三次后，用蒸餾水漂清切片，空氣干燥并用Fluoromount G封固介質(zhì)(Fisher Scientific)封固。所有培育步驟在室溫下進(jìn)行，除了與第一抗體培育外(4℃)。當(dāng)切片用兔抗人膠原Ⅳ(Chemicon,Temecula,CA)作為第一抗體(稀釋度為1∶500)，用FITC偶聯(lián)的抗兔IgG(DAKO Corporation)作為第二抗體進(jìn)行染色時(shí)，采用同樣的步驟。對(duì)于共同定位研究，同時(shí)采用與FITC偶聯(lián)的山羊抗-hF.Ⅸ抗體(Affinity Biologicals)以及抗-膠原Ⅳ抗體，用若丹明偶聯(lián)的抗兔IgG(Chemicon)來(lái)檢測(cè)膠原Ⅳ-抗體復(fù)合物。熒光顯微鏡檢采用NikonFXA顯微鏡。
E．測(cè)試抗hF.Ⅸ的循環(huán)抗體用ELISA測(cè)試經(jīng)肌內(nèi)注射AAV-F.Ⅸ的C57BL/6小鼠的血漿樣品中是否存在抗hF.Ⅸ抗體。用人F.Ⅸ(1μg/ml，以0.1M碳酸氫鈉配，pH9.2)包被微量滴定板。采用一式兩份的稀釋血漿樣品(1∶16)，用稀釋度為1∶2000的與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG(Zymed,San Francisco,CA)檢測(cè)抗hF.Ⅸ抗體。緩沖條件如Walter等(同上)所述。與稀釋至最終濃度為1μg/ml的單克隆小鼠抗-hF.Ⅸ(Boehringer Mannheim)的吸光值比較，估計(jì)抗hF.Ⅸ水平。如Dai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:1401-1405(1995)中所述，用Westen印跡法來(lái)證明抗hF.Ⅸ的存在，只是用與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG抗體(BoehringerMannheim)作為第二抗體，從而能用ECL試劑(Amersham)檢測(cè)hF.Ⅸ-抗體復(fù)合物。小鼠血漿的稀釋度為1∶500。
F．DNA分析如Sambrook等，Molecular Cloning:a Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY(1989)中關(guān)于哺乳動(dòng)物組織所述的，從注射過(guò)的肌肉組織中分離獲得基因組DNA。如本申請(qǐng)實(shí)施例3所述，進(jìn)行PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增rAAV串聯(lián)重復(fù)序列的頭對(duì)尾接頭。正向引物005[SEQ ID NO:4]退火SV40聚腺苷酸化信號(hào)(bp8014-8033)，反向引物013[SEQ ID NO:2]和017[SEQ ID NO:3]結(jié)合CMV啟動(dòng)子(bp4625-4606和4828-4809)。PCR反應(yīng)采用100ng基因組DNA(在包含1.5mM MgCl2的100μl的總反應(yīng)體積中)和0.5μM引物對(duì)005/013或005/017。在最初的變性步驟(94℃ 4分鐘)后，進(jìn)行如下過(guò)程的35次循環(huán)94℃變性1分鐘、52℃退火1分鐘、72℃延伸90秒(在最后一次循環(huán)中為10分鐘)。用T/A克隆試劑盒(Invitrogen,San Diego,CA)克隆PCR產(chǎn)物(用于DNA序列分析)。用32P-dCTP隨機(jī)引導(dǎo)的、對(duì)CMV啟動(dòng)子(用于PCR片段雜交)或存在于rAAV-F.Ⅸ中的hF.Ⅸ的內(nèi)含子Ⅰ(用于與基因組小鼠DNA雜交)有特異性的標(biāo)記探針進(jìn)行Southern印跡雜交。
G．hF.Ⅸ在有免疫能力的小鼠中的表達(dá)結(jié)果將rAAV-hF.Ⅸ肌內(nèi)注射到有免疫能力的C57BL/6小鼠中，在注射后1個(gè)月處死動(dòng)物。對(duì)經(jīng)注射肌肉(脛骨前肌和股四頭肌)的蛋白抽提物進(jìn)行ELISA測(cè)定，結(jié)果表明每毫克組織有1.8-2.1ng的hF.Ⅸ存在(每毫克蛋白有40-50ng hF.Ⅸ)。通過(guò)組織切片上的免疫熒光研究可以確認(rèn)肌肉組織中有hF.Ⅸ表達(dá)。
將rAAV-hF.Ⅸ肌內(nèi)注射入有免疫能力的C57BL/6小鼠體內(nèi)，并在注射后3個(gè)月時(shí)處死動(dòng)物。在未注射的肌肉中沒(méi)有檢測(cè)到因子Ⅸ。在注射了對(duì)照物(rAAV-lacZ)的肌肉中沒(méi)有檢測(cè)到因子Ⅸ。在注射后3個(gè)月的C57BL/6小兔肌纖維中檢測(cè)到有人F.Ⅸ表達(dá)(每個(gè)注射部位有3.3×1010載體基因組；放大倍數(shù)為200倍)。注意到F.Ⅸ不僅存在于肌纖維本身內(nèi)，而且在纖維間的間質(zhì)空間內(nèi)表現(xiàn)出積累。
令人感興趣的是，這種染色模式與用抗人膠原Ⅳ的多克隆抗體試驗(yàn)所見(jiàn)(間質(zhì)空間也被染色)是相同的。注射rAAV-hF.Ⅸ(每個(gè)注射部位有3.3×1010個(gè)基因組)1個(gè)月后肌肉可用人膠原Ⅳ的抗體來(lái)很好地染色。最近已經(jīng)鑒定出膠原Ⅳ是一種人F.Ⅸ的結(jié)合蛋白[W.-F.Cheung等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:11068-11073(1996)]。
有免疫能力的小鼠中的初步試驗(yàn)證明，盡管注射的肌肉中有高水平的基因轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定的hF.Ⅸ表達(dá)，但是不可能用ELISA檢測(cè)出循環(huán)中有顯著量的hF.Ⅸ。見(jiàn)圖8。其它實(shí)驗(yàn)證明，動(dòng)物產(chǎn)生了高滴度的抗循環(huán)性外源蛋白的抗體。例如，當(dāng)測(cè)試同一血漿樣品中抗人F.Ⅸ抗體時(shí)，在注射后第11天起可以在所有注射過(guò)的動(dòng)物體內(nèi)觀察到強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。見(jiàn)圖9。用Western印跡分析，發(fā)現(xiàn)在高水平的循環(huán)抗體持續(xù)存在于實(shí)驗(yàn)期間。
這一發(fā)現(xiàn)與我們以前報(bào)道的經(jīng)歷相反，以前的報(bào)道是通過(guò)不同的途徑(即靜脈內(nèi)注射)給予不同的載體(即表達(dá)hF.Ⅸ的腺病毒載體)產(chǎn)生了不同的免疫應(yīng)答(即不觸發(fā)抗hF.Ⅸ中和抗體的形成)[Walter等，同上]。
然而，誘導(dǎo)抗體形成所需的蛋白表達(dá)水平非常低。Western印跡試驗(yàn)在一定程度上不如ELISA敏感，但是其記載了抗體滴度在注射后第18天起開(kāi)始增加。因此，在有免疫能力的動(dòng)物體內(nèi)，在起始時(shí)間點(diǎn)時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到hF.Ⅸ表達(dá)是肌肉內(nèi)rAAV(尚未)表達(dá)的生物學(xué)結(jié)果，而隨后循環(huán)中沒(méi)有檢測(cè)到F.Ⅸ是由于抗外源蛋白抗體產(chǎn)生所致。然而，血清抗體應(yīng)答與針對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)細(xì)胞的胞毒性免疫應(yīng)答不相關(guān)。實(shí)際上，在上述任一組織切片上均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)炎癥和廣泛的組織損傷，在H&E染色分析的切片中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)未列出)。這與將攜帶轉(zhuǎn)基因的重組腺病毒注射入骨骼肌引起免疫應(yīng)答情況[Dai等，同上；Y.Yang等，Hum.Molec.Genet.,5:1703-1712(1996)；X.Xiao等，J.Virol.70:8098-8018(1996)]相反。
H．hF.Ⅸ在免疫缺陷型小鼠中的表達(dá)將AAV-F.Ⅸ遞送到Rag1小鼠(重組酶激活基因1中的突變?yōu)榧兒闲?的肌肉中。因此，這些小鼠在功能上等階于重度聯(lián)合免疫缺損(SCID)小鼠，并且不能產(chǎn)生成熟的B或T細(xì)胞。每個(gè)動(dòng)物中的劑量為2×1011個(gè)rAAV-hF.Ⅸ載體基因組導(dǎo)致小鼠血漿中穩(wěn)定地表達(dá)hF.Ⅸ。見(jiàn)圖10。在注射后第二周，可用ELISA首先檢測(cè)到人F.Ⅸ，并且此后逐漸增加。在注射后的5-7周，所有動(dòng)物中的血漿水平達(dá)到F.Ⅸ治療水平的穩(wěn)定階段，每毫升小鼠血漿中有200-350ng hF.Ⅸ.在實(shí)驗(yàn)期間(注射后4個(gè)月內(nèi))一直維持該水平。當(dāng)注射入總共1×1010rAAV-hF.Ⅸ載體基因組時(shí)，表達(dá)要低3-4倍，但是對(duì)于一些動(dòng)物仍達(dá)到了治療水平(大于100ng/ml)。見(jiàn)圖11。這些水平(表示血漿中正常循環(huán)水平的4-7％)是在治療范圍內(nèi)的，并表明本發(fā)明的方法對(duì)于治療血友病(一種與免疫缺陷有關(guān)的疾病)是可行的。
I．DNA分析結(jié)果從注射后6-8周的經(jīng)注射肌肉組織中分離出基因組DNA。通過(guò)EcoRⅤ消化，從載體構(gòu)建物中釋放出包括整個(gè)1.4kb內(nèi)含子Ⅰ序列的1.8kb片段，可以證明有導(dǎo)入的載體DNA存在。對(duì)內(nèi)含子Ⅰ有特異性的探針可與該片段雜交，但不與未經(jīng)注射動(dòng)物的小鼠DNA交叉雜交。未消化的DNA在高分子量DNA中顯示出雜交信號(hào)。另外，用來(lái)擴(kuò)增轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中重組AAV的頭對(duì)尾串聯(lián)體接頭序列的PCR引物(圖12)成功地?cái)U(kuò)增了從AAV-F.Ⅸ轉(zhuǎn)導(dǎo)的組織(免疫缺陷和有免疫能力的動(dòng)物的脛骨前肌和股四頭肌)中分離出的肌肉DNA的這個(gè)序列。PCR產(chǎn)物通過(guò)與對(duì)CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子有特異性的探針Southern印跡雜交來(lái)顯示。引物對(duì)005-013產(chǎn)生了1.0kb和更小的片段；引物對(duì)005-017擴(kuò)增得到了1.2kb和更小的片段。如預(yù)計(jì)的那樣，這些PCR反應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生有上述大小的清晰條帶，而是一系列如預(yù)計(jì)那樣最大的擴(kuò)增產(chǎn)物，因?yàn)檫@些串聯(lián)重復(fù)序列中存在不精確的AAV基因組連接[S.K.McLaughlin等，J.Virol.62:1963-1973(1988)]。不精確的連接是由于接頭部位的ITR序列有可變的缺失(經(jīng)克隆的PCR產(chǎn)物的DNA測(cè)序可以證實(shí)，數(shù)據(jù)未列出)。
J．PCR研究盡管病毒復(fù)制時(shí)AAV基因組會(huì)發(fā)生頭對(duì)頭和尾對(duì)尾的排列[K.I.Berns,Microbiol.Rev.,54:316-329(1990)]，但是在潛伏感染時(shí)頭對(duì)尾的排列更通常與整合入轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞染色體DNA中的AAV有關(guān)[S.K.McLaughlin等，J.Virol.,62:1963-1973(1988)；J.D.Tratschin等，Mol.Cell Biol.,5:3251-3260(1985)；N.Muzcyka,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129(1992)]。
注射rAAV的肌細(xì)胞未經(jīng)消化的DNA的Southern印跡數(shù)據(jù)表明，在注射后第6周從宿主細(xì)胞基因組DNA獲得的rAAV DNA以高分子量物質(zhì)形式存在。限制性的DNA所見(jiàn)的更高強(qiáng)度的信號(hào)可能是由于從大量基因組DNA中分離出片段時(shí)的解屏蔽效應(yīng)所致[X.Xiao等，J.Virol.,70:8089-8108(1996)]。這一發(fā)現(xiàn)(即存在高分子量DNA的雜交信號(hào))和PCR數(shù)據(jù)一樣，是與轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)發(fā)生的整合行為相符的。本段以及第Ⅰ段中所述的rAAV整合狀態(tài)同樣對(duì)轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性和延長(zhǎng)表達(dá)有貢獻(xiàn)。
實(shí)施例7．給予骨骼肌細(xì)胞rAAV來(lái)表達(dá)ApoE下列實(shí)施例描述了通過(guò)將本發(fā)明的rAAV載體引入骨骼肌中來(lái)延長(zhǎng)表達(dá)另一種治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物(載脂蛋白E(ApoE)，一種用于治療動(dòng)脈粥樣硬化的蛋白質(zhì))的表達(dá)。此外，破壞性CTL應(yīng)答的不存在允許了該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的延長(zhǎng)表達(dá)。
A．rAAV的構(gòu)建按照上述F.Ⅸ的類似方式構(gòu)建編碼分泌型蛋白人ApoE的重組AAV載體。通過(guò)XbaⅠ消化從質(zhì)粒pAlterApoE3(Dr.Rader′s Laboratory,University ofPennsylvania提供)上切下ApoE cDNA，切成平頭并克隆到NotⅠ消化的pCMVLacZ骨架中(見(jiàn)圖13的載體構(gòu)建框圖)。分離獲得pCMVLacZ中l(wèi)acZ基因的2062bp SmaⅠ/SacⅠ片段，并作為填充片段插入此新質(zhì)粒的SalⅠ位點(diǎn)。通過(guò)EcoRⅠ/HindⅢ消化分離獲得ApoE小基因盒(總長(zhǎng)4.3kb)，該小基因盒現(xiàn)在含有CMV啟動(dòng)子、ApoE cDNA SV40聚腺苷酸化序列和2062bp填充片段，然后將該小基因盒連接到XbaⅠ消化的pSub201骨架中。最終產(chǎn)物命名為pSubCMVApoE-2062RO，將其在按照上文rAAV.F.Ⅸ所述的步驟生產(chǎn)rAAV.ApoE時(shí)用作順式質(zhì)粒。
B．體外分析rAAV.ApoE表達(dá)的ApoE將84-31細(xì)胞接種入6孔板中，用2μl CsCl純化的rAAV.ApoE(在含2％胎牛血清的2毫升Dulbeccos Modified Eagles Medium中)感染細(xì)胞。將細(xì)胞37℃培育48小時(shí)。然后從孔中取出等份上清以Western印跡分析ApoE。結(jié)果表明，在用AAV.ApoE感染的84-31細(xì)胞上清液中有明顯可測(cè)的ApoE蛋白。
C．rAAV.ApoE在ApoE敲除小鼠體內(nèi)的表達(dá)將2.5-5×1010個(gè)顆粒的rAAV.ApoE注射入ApoE敲除小鼠兩側(cè)的脛骨前肌和股四頭肌中(每只小鼠共接受5×1010至5×1011個(gè)顆粒)。在注射后第28天和第120天，甚至在血漿抗ApoE抗體存在時(shí)都可用免疫熒光檢測(cè)到局部ApoE的延長(zhǎng)表達(dá)。
D．結(jié)論本實(shí)驗(yàn)證明了將載體rAAV-ApoE肌內(nèi)注射入ApoE敲除的小鼠中會(huì)導(dǎo)致肌纖維轉(zhuǎn)導(dǎo)和分泌大量重組蛋白到循環(huán)系統(tǒng)中。轉(zhuǎn)基因在沒(méi)有破壞性CTL免疫應(yīng)答存在下能延長(zhǎng)在肌纖維中的表達(dá)，即使分泌的蛋白會(huì)引起體液免疫。
實(shí)施例8-靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)麻醉一獼猴，將其前臂夾住，消毒，并在脛骨前肌上的皮膚作0.5cm的切口。確定筋膜，將rAV.CMVLacZ(實(shí)施例1所述)病毒懸液(175μl,102基因組/ml)注射入筋膜5-7mm深處。14天后，取出肌肉活組織檢查樣品，冷凍在OCT中，切片并以X-gal染色。用Leica Z500MC圖象處理和分析系統(tǒng)(有Nikon FXA顯微鏡接口)定量分析組織切片。X-gal組織化學(xué)結(jié)果顯示，在注射部位的大多數(shù)肌纖維中有高水平的β-半乳糖苷酶表達(dá)。在注射區(qū)的224mm2面積中有20％的纖維表達(dá)β-半乳糖苷酶。根據(jù)上述ApoE和F.Ⅸ的結(jié)果，在沒(méi)有胞毒性免疫應(yīng)答下，預(yù)計(jì)可以延長(zhǎng)表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可在小鼠以外的動(dòng)物(尤其是靈長(zhǎng)類動(dòng)物)體內(nèi)再現(xiàn)。
對(duì)本發(fā)明所作的許多改動(dòng)和變化均包括在上述說(shuō)明書(shū)，預(yù)計(jì)它們對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。認(rèn)為對(duì)本發(fā)明的方法所作的這些變化和改動(dòng)包括在本文所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Trustees of the University of PennsylvaniaWilson.James M.
Fisher.Krishna J.
(ⅱ)發(fā)明名稱重組腺伴隨病毒定向基因治療的方法(ⅲ)序列數(shù)目4(ⅳ)通信地址(A)收件人Howson and Howson(B)街道Spring House Corporate Cntr,PO Box 457(C)城市Spring House(D)州Pennsylvania(E)國(guó)家USA(F)郵編19477(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朩O(B)申請(qǐng)日(C)分類(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/708.188(B)申請(qǐng)日1996年9月6日(ⅶ)PRIOR APPLICATION DATA:
(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/729.061(B)申請(qǐng)日1996年10月10日(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Kodroff.Cathy A(B)登記號(hào)33.980(C)參考/案卷號(hào)GNVPN 019CIP2PCT
(ⅸ)通訊信息(A)電話215-540-9200(B)電傳215-540-5818(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10398堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GAATTCGCTA GCATCATCAA TAATATACCT TATTTTGGAT TGAAGCCAAT ATGATAATGA 60GGGGGTGGAG TTTGTGACGT GGCGCGGGGC GTGGGAACGG GGCGGGTGAC GTAGTAGTGT120GGCGGAAGTG TGATGTTGCA AGTGTGGCGG AACACATGTA AGCGACGGAT GTGGCAAAAG180TGACGTTTTT GGTGTGCGCC GGTGTACACA GGAAGTGACA ATTTTCGCGC GGTTTTAGGC240GGATGTTGTA GTAAATTTGG GCGTAACCGA GTAAGATTTG GCCATTTTCG CGGGAAAACT300GAATAAGAGG AAGTGAAATC TGAATAATTT TGTGTTACTC ATAGCGCGTA ATATTTGTCT360AGGGAGATCT GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG CCCGGGCGTC420GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA480ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TTGTAGTTAA TGATTAACCC GCCATGCTAC TTATCTACAA540TTCGAGCTTG CATGCCTGCA GGTCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA600CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA660ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GAGTATTTAC GGTAAACTGC CCACTTGGCA720GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG 780CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC 840TACGTATTAG TCATCGCTAT TACCATGGTG ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT 900GGATAGCGGT TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT 960TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC CGCCCCATTG 1020ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA TAAGCAGAGC TCGTTTAGTG 1080AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA CGCTGTTTTG ACCTCCATAG AAGACACCGG 1140GACCGATCCA GCCTCCGGAC TCTAGAGGAT CCGGTACTCG AGGAACTGAA AAACCAGAAA 1200GTTAACTGGT AAGTTTAGTC TTTTTGTCTT TTATTTCAGG TCCCGGATCC GGTGGTGGTG 1260CAAATCAAAG AACTGCTCCT CAGTGGATGT TGCCTTTACT TCTAGGCCTG TACGGAAGTG 1320TTACTTCTGC TCTAAAAGCT GCGGAATTGT ACCCGCGGCC GCAATTCCCG GGGATCGAAA 1380GAGCCTGCTA AAGCAAAAAA GAAGTCACCA TGTCGTTTAC TTTGACCAAC AAGAACGTGA 1440TTTTCGTTGC CGGTCTGGGA GGCATTGGTC TGGACACCAG CAAGGAGCTG CTCAAGCGCG 1500ATCCCGTCGT TTTACAACGT CGTGACTGGG AAAACCCTGG CGTTACCCAA CTTAATCGCC 1560TTGCAGCACA TCCCCCTTTC GCCAGCTGGC GTAATAGCGA 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(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4ATAAGCTGCA ATAAACAAGT 20
權(quán)利要求
1．重組腺伴隨病毒rAAV在生產(chǎn)用于減少對(duì)rAAV免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用，該重組腺伴隨病毒包含異源基因，該異源基因與控制其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的序列操作性連接，其中rAAV基本上不受輔助病毒的污染，并將其給予骨骼肌細(xì)胞。
2．重組腺伴隨病毒rAAV在生產(chǎn)用于延長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用，該重組腺伴隨病毒包含轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因與控制其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的序列操作性連接，其中rAAV基本上不受輔助病毒的污染，并將其給予骨骼肌細(xì)胞。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中轉(zhuǎn)基因是可分泌的蛋白。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中蛋白選自因子Ⅸ、ApoE、β-干擾素、胰島素、促紅細(xì)胞生成素、生長(zhǎng)激素和甲狀旁腺激素。
5．根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的應(yīng)用，其中rAAV從5′到3′由5′AAV反向末端重復(fù)序列ITR、異源啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)基因、聚腺苷酸化序列和3′AAV ITR組成。
6．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中轉(zhuǎn)基因是肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因。
7．一種在沒(méi)有抗細(xì)胞的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答存在下在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)轉(zhuǎn)基因的方法，該方法包括將重組腺伴隨病毒rAAV導(dǎo)入細(xì)胞中，所述rAAV包含一個(gè)轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因與控制其表達(dá)的序列操作性連接，其中rAAV基本上不受輔助病毒的污染，且其中轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中表達(dá)。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中轉(zhuǎn)基因是可分泌的蛋白。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中蛋白選自因子Ⅸ、ApoE、β-干擾素、胰島素、促紅細(xì)胞生成素、生長(zhǎng)激素和甲狀旁腺激素。
10．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中rAAV從5′到3′由5′AAV反向末端重復(fù)序列ITR、異源啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)基因、聚腺苷酸化序列和3′AAV ITR組成。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種延長(zhǎng)基因表達(dá)的方法,該方法減少了對(duì)用于哺乳動(dòng)物肌肉注射的帶有所需基因的重組腺伴隨病毒的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1233291SQ97198714
公開(kāi)日1999年10月27日 申請(qǐng)日期1997年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月6日
發(fā)明者J·M·威爾遜, K·J·費(fèi)希爾 申請(qǐng)人:賓西法尼亞大學(xué)托管會(huì)