專利名稱：作為病毒載體的松鼠猴皰疹病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒操作的方法；所用的手段及其產(chǎn)物，該產(chǎn)物在基因治療方面具有具體的應(yīng)用、但也不排除其它的應(yīng)用。
由于近來在人類遺傳學方面的進步，目前許多疾病的基因治療在理論上已成為可能。通過送遞起主要作用的遺傳物質(zhì)，首要的目的為把細胞的表型從患病狀態(tài)轉(zhuǎn)化成正常狀態(tài)。從細胞培養(yǎng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)變到體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ?以及隨后轉(zhuǎn)化到臨床)的這種技術(shù)需要研究以可控制的方式進行有效的基因送遞的新方法。當在鑒別對疾病具有特異性的突變方面人類遺傳學正以很快的速度發(fā)展的同時，對基因送遞系統(tǒng)研究的相對缺乏就變得日益明顯。目前，可以選擇的有脂質(zhì)體、DNA聚集體或者以病毒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)。
脂質(zhì)體在DNA轉(zhuǎn)移方面的效率仍然很低(1)，在病毒顆粒與帶電物質(zhì)(比如聚賴氨酸)之間形成的DNA聚集體增強了DNA的攝取(2)、但要使制備標準化則是非常困難的。逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒載體在所述載體中插入的異源DNA的大小方面都有一些限制(3,4)，并且在實現(xiàn)長期異源基因表達方面都是不可靠的。逆轉(zhuǎn)錄病毒整合到宿主基因組中，但卻很難作為高滴度的原種進行生產(chǎn)，并且通過在逆轉(zhuǎn)錄過程中引入的錯誤內(nèi)在地存在著高的突變率。盡管腺病毒具有很寬的細胞嗜性，但腺病毒誘導細胞介導的免疫應(yīng)答，并且從長遠來看核酸在受感染的細胞中是不穩(wěn)定的(5)。
皰疹病毒代表著用于載體研究的很有前途的候選者，這在一部分是由于它們具有維持其在細胞中的基因組呈附加形式的能力，該形式受到阻斷而不進行復制。它們包裝異源DNA序列的能力可能＞50Kbp(6)，并且多數(shù)容易在體外進行操作。單純皰疹病毒衍生的載體可能具有一些與腺病毒同樣的問題，這是因為所述群體的大多數(shù)已經(jīng)具有了研究得非常充分的對所述病毒的免疫應(yīng)答。但是，能夠感染人細胞的其它非人的皰疹病毒不應(yīng)具有這些缺點。
松鼠猴皰疹病毒(herpesvirus saimiri)(HVS)為松鼠猴(Saimiri sciureus)的嗜淋巴細胞rhadinovirus(γ2皰疹病毒)。所述病毒可以按照常規(guī)從健康猴子的外周淋巴細胞中分離出來并且不會造成種中明顯的疾病?？梢詸z測到病毒的基因組在T細胞中呈附加的形式，并且基因組的轉(zhuǎn)錄似乎限制在呈非裂解(“潛伏”)狀態(tài)的三種基因當中。已經(jīng)測定了完整的病毒基因組的序列，并且該基因組與人Epstein-Barr病毒(EBV)之間共有許多相同的特征。遺傳組織由DNA的唯一特有的編碼區(qū)組成，其長度為112,930bp，兩側(cè)為數(shù)量可變的非編碼重復序列。所述病毒基因組有76個開放讀框，其中有60個與在其它皰疹病毒中發(fā)現(xiàn)的基因之間具有相似性(7)。剩余的基因與功能已知的人基因之間享有序列同源性(在蛋白的水平上)，其中包括補體控制蛋白、細胞表面抗原CD59、細胞周期蛋白D以及G蛋白偶聯(lián)的受體(8,9)。
在病毒不能(A和B)或是能夠(C)在某些其它猴子的種中致癌的基礎(chǔ)上，已經(jīng)將病毒劃分為性質(zhì)不同的稱作A、B和C的三種毒株。C毒株具有轉(zhuǎn)化人T細胞至在體外進行有限獨立生長的能力(10)。這種轉(zhuǎn)化細胞的能力是由于稱作STP(11)的基因造成的，該基因在毒株之間的蛋白序列中具有顯著的變異性，從而僅有來自C毒株的STP能夠轉(zhuǎn)化細胞(12)。對于病毒正常的裂解周期或是附加型維持而言STP并不重要，并且存在著病毒基因組的這一區(qū)域天然缺失的突變株；這些毒株是不致癌的。已經(jīng)構(gòu)建了缺乏這一基因的病毒株，它表達選擇性的藥物抗性標記(14)。人們已經(jīng)使用這些病毒來說明它們能夠感染很多種類型的人細胞、高效地轉(zhuǎn)移異源基因并且在缺少選擇性壓力的條件下維持長期的表達。盡管該病毒能夠感染人細胞，但卻沒有證據(jù)表明該病毒能對人造成任何疾病。因此，對于研制對人細胞不進行復制的安全載體而言，很可能該病毒代表著一個很好的起點。但是，人們對HVS如何復制、尤其是對轉(zhuǎn)錄控制和DNA復制而言缺乏基本的了解。
在迄今進行了測序的所有皰疹病毒中，HVS與EBV之間具有最大的同源性。但是，編碼區(qū)明顯要小。在這兩種病毒之間，不同的基因塊似乎密切相關(guān)，并且一般說來皰疹病毒的確是這樣。由于存在迄今尚未在任何其它的皰疹病毒中鑒定的某些基因，因此HVS有別于其它的皰疹病毒。通過缺失對在培養(yǎng)過程中的生長來說不是必需的基因或者通過缺失必需基因以及從輔助細胞系的反式(in trans)提供，迄今為止已經(jīng)使得在人類受試者中的每種病毒載體都不能適用。從進行了充分研究的皰疹病毒中外推可以使我們預測到某些HVS膜蛋白的缺失將會防止細胞-細胞的擴散(spread)。而且，控制必需轉(zhuǎn)錄開關(guān)[比如腺病毒中的E1A(17)以及單純皰疹病毒中的IE175(18)]的蛋白的失活將不可避免地使上述病毒不適當?shù)剡M行復制。因此，本申請的主要目的集中在構(gòu)建突變病毒上，所述的病毒不能激活早期和晚期的基因表達。靶基因為兩種轉(zhuǎn)錄控制蛋白，它們是ORF50和57的產(chǎn)物，并且可能對組織培養(yǎng)過程中的生長來說是必需的。
出版的數(shù)據(jù)(14)表明毒株11/S4衍生的病毒載體僅能在某些細胞系中限制性地生長。因此，應(yīng)當僅僅在支持病毒復制的細胞系中必需要缺失、阻斷或操作轉(zhuǎn)錄控制蛋白基因。但是，為了生產(chǎn)出人們可以大膽使用的針對基因送遞的病毒，人們可能希望生產(chǎn)出或者不能生產(chǎn)或者生產(chǎn)無功能性轉(zhuǎn)錄控制蛋白的病毒。
本申請的另一個主要目的為鑒別出對生長而言是非必需的基因、然后缺失這些基因的至少一個基因的至少一部分，以便促進異源的遺傳物質(zhì)插入上述病毒的基因組中。
目前存在一種針對與松鼠猴皰疹病毒重組而設(shè)計的質(zhì)粒，其中把質(zhì)粒設(shè)計為在預定的位置處將異源的遺傳物質(zhì)插入病毒基因組中，該位置為在DNA的唯一特有的編碼區(qū)與皰疹病毒DNA的非編碼重復序列之間的接點。但是，就可以被克隆到病毒基因組中而言，該質(zhì)粒相對是不可變通的。例如，幾乎不存在合適的限制位點，因而該質(zhì)粒不適于在商業(yè)上使用。因此，在本申請中我們的目的在于鑒別出對生長來說不是必需的基因，以便缺失所說基因中的至少一個基因的至少一部分，從而為插入大量的任意選擇的異源遺傳物質(zhì)提供人造的克隆位點。當打算向病毒基因組中插入大量的異源遺傳物質(zhì)時，顯而易見將會最為有利地進行所說的非必需基因的缺失以及隨后異源遺傳物質(zhì)的插入。
在本申請的另一方面，我們的目的在于提供松鼠猴皰疹病毒，所述的松鼠猴皰疹病毒已被操作以便缺失至少一個轉(zhuǎn)錄控制基因的至少一部分并且理想地還缺失至少一個編碼非必需生長蛋白的基因的至少一部分。我們支持這一方面，這是因為病毒基因組操作的數(shù)量越多，所操作的病毒的安全性就越高。考慮到這一事實，我們也支持松鼠猴皰疹病毒基因組的操作、以便造成STP基因部分或全部的缺失。即使在打算使用毒株A或B的情況下，我們也支持后一操作，這是因為我們考慮到上述操作可能會提高得到的操作的病毒的安全性。
從以上顯而易見需要提供一種合適的基因送遞系統(tǒng)以便可以進行遺傳物質(zhì)的胞內(nèi)送遞，其中安全地進行著所述的送遞并因而至少對靶細胞不產(chǎn)生任何細胞病理學的結(jié)果。
因此，本發(fā)明的第一個目的為提供一種安全并且可以控制的基因送遞系統(tǒng)。
而且，考慮到可能被送遞的遺傳物質(zhì)的數(shù)量，本發(fā)明的另一個目的為提供一種適于接納大量遺傳物質(zhì)(比如4Kbp以及多達20Kbp并且理想的是＞50Kbp的DNA序列)的基因送遞系統(tǒng)。
本發(fā)明更進一步的目的在于提供一種基因送遞系統(tǒng)，它可以使至少一種給定基因或其部分選擇性重組到基因送遞系統(tǒng)中、以便至少將所說的被選擇的基因或其部分送遞到靶細胞中。
本發(fā)明最寬的情況涉及提供不能激活早期和晚期基因表達的突變病毒。換句話說，本發(fā)明涉及提供一種不能在靶細胞、更優(yōu)選不能在人細胞中復制的病毒和/或提供適于接納相當大量的異源遺傳物質(zhì)的突變病毒。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面提供了一種松鼠猴皰疹病毒，該病毒在涉及病毒復制的基因中至少有一處突變，借此，突變阻止了在人類靶細胞中的復制。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所說的基因為轉(zhuǎn)錄控制蛋白基因ORF50和/或ORF57中的任意一種或兩種。
更為優(yōu)選的所說的突變包括所說的一種或兩種基因的部分或完全的缺失。
在本發(fā)明更進一步的實施方案中，所說的松鼠猴皰疹病毒為STP基因缺乏或者發(fā)生突變的毒株，從而該病毒不能轉(zhuǎn)化靶細胞并且因此不能產(chǎn)生致癌表型。
所說的病毒優(yōu)選進一步進行操作，以便缺失掉編碼非必需生長蛋白的至少一個基因的至少一部分。理想的所說的基因為ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51。
在本發(fā)明另一個更為優(yōu)選的實施方案中，給所說的病毒提供插入位點，其中可以把所選擇的異源物質(zhì)插入該位點。優(yōu)選操作病毒，從而插入發(fā)生在缺失位點之內(nèi)、附近或者遠離缺失位點處，其中在缺失位點上缺失了非必需生長蛋白基因的至少一部分；或者插入發(fā)生在至少一個非編碼重復序列之中或附近，并且更優(yōu)選發(fā)生在DNA唯一特有的編碼區(qū)和非編碼重復序列之間的接點處。仍然更為優(yōu)選的是，操作所說的病毒，從而僅有所說的非編碼重復序列中的一個序列存在于唯一特有的編碼區(qū)的一個或兩個末端處。
在插入發(fā)生在所說的缺失位點之中或附近的情況下，所說的缺失涉及一個或多個下列基因的部分或整個的缺失ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51。
根據(jù)本發(fā)明的再一個方面提供了一種在編碼非必需生長蛋白的至少一個基因中至少有一處突變的松鼠猴皰疹病毒。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，所說的基因為一個或多個的ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51。
更為優(yōu)選的是，所說的突變包括一個或多個所說基因的部分或完全的缺失。
在本發(fā)明一個更加優(yōu)選的實施方案中，所說的松鼠猴皰疹病毒為STP基因缺乏或者發(fā)生突變的毒株，以便所說的病毒不能轉(zhuǎn)化靶細胞并從而不能產(chǎn)生致癌表型。
優(yōu)選地進一步操作所說的病毒，以便缺失與病毒復制有關(guān)的至少一個基因的至少一部分。所說的基因理想的為ORF50和/或ORF57。
在本發(fā)明一個更為優(yōu)選的實施方案中，給所說的病毒提供可以使所選擇的異源物質(zhì)插入的插入位點。插入位點優(yōu)選位于一個或多個所說基因的所說缺失位點之中、附近或者遠離所說的缺失位點。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了一種松鼠猴皰疹病毒，該病毒或者在其中具有或者適于在其中插入靠近缺失位點的至少一個事先選擇的異源遺傳片段，所說的缺失位點表示編碼非必需生長蛋白的至少一個基因的部分或完全缺失的位點。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，還給所說的病毒提供在與病毒復制有關(guān)的基因中的突變，從而防止在將所說的病毒插入靶細胞之后病毒發(fā)生復制。
更為優(yōu)選的是，所說的病毒為STP基因缺乏或者發(fā)生突變的毒株，以便所說的病毒不能轉(zhuǎn)化靶細胞并從而不能產(chǎn)生致癌表型。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了一種松鼠猴皰疹病毒，該病毒在單個的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的接點處或者在其中具有或者適于在其中插入至少一個事先選擇的異源遺傳片段，而且已經(jīng)進一步操作了所說的病毒、以便在單個的編碼區(qū)的一端或兩端僅僅存在數(shù)量有所減少的非編碼重復序列，并且本發(fā)明還提供了在與病毒復制有關(guān)的基因中的突變、以便防止在將所說的病毒插入靶細胞之后病毒發(fā)生復制。
所說的非編碼重復序列的數(shù)量優(yōu)選為5個或者更少、并且理想的為1個。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了一種轉(zhuǎn)移載體，該載體能使異源遺傳片段插入松鼠猴皰疹病毒DNA中。
所說的插入優(yōu)選涉及前述插入方法中的任意一種或多種。在本發(fā)明這一方面的一個優(yōu)選實施方案中，所說的載體包括多個特有的限制位點，更優(yōu)選有三個單一限制位點。此外，所說的載體包括β-半乳糖苷酶基因，該基因優(yōu)選處于HCMV IE3啟動子的控制之下。所說的載體更優(yōu)選是從pRUNeo(16)得到的，并且理想的是prupoly。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了一種松鼠猴皰疹病毒，該病毒在與病毒復制有關(guān)的基因中至少有一處突變、而該突變可以防止病毒在靶細胞中的復制，并且該病毒在編碼非必需生長蛋白的基因中至少還有一處突變。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，所說的松鼠猴皰疹病毒在STP基因中還發(fā)生了突變。
所說的突變優(yōu)選包括所說基因的部分或者完全的缺失。
與病毒復制有關(guān)的所說的基因優(yōu)選還包括轉(zhuǎn)錄控制蛋白基因ORF50和/或ORF57的一種或兩種；并且所說的編碼非必需生長蛋白的基因為下列基因的一種或多種ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51。
從以上顯而易見本發(fā)明優(yōu)選的病毒包括遺傳突變的多種有利的組合，所說的組合可以使病毒不能或者能夠具有某種能力，從而使得該病毒安全并且可以控制。通過術(shù)語使之不能，我們是指防止病毒在靶細胞中復制；而通過術(shù)語使之能夠，我們是指接納相當大量的異源遺傳物質(zhì)插入的能力。更為理想的是，所說的有利的組合還提供了不能轉(zhuǎn)化靶細胞并因而不能產(chǎn)生致癌表型的病毒。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了一種至少包括松鼠猴皰疹病毒基因治療載體的一部分的靶細胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了一種用如前所述的松鼠猴皰疹病毒載體轉(zhuǎn)化的細胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了一種向靶細胞送遞所選擇的異源遺傳物質(zhì)的方法，該方法包括在有利于用所說病毒感染所說細胞的條件下至少將所說的靶細胞暴露到至少包括所說事先選擇的異源物質(zhì)的松鼠猴皰疹病毒中。
現(xiàn)在僅參考下面的物質(zhì)和方法、通過實施例來描述本發(fā)明的實施方案。病毒突變株的分離和特征確定所操作的病毒為毒株11的修飾形式，它不含ORF1(STP基因)。盡管我們通常選擇“野生型”毒株，但是載體將不可避免地必須以已使所述基因除去的病毒為基礎(chǔ)。修飾過的毒株可能會使必需基因缺失，并因而可以生成輔助細胞系(以后將進行詳述)。它們是通過用合適的HVS基因組克隆與pSV2Neo的共轉(zhuǎn)染來確立的，并且分離出的細胞克隆是G418抗性的。首先針對是否存在合適的基因序列通過PCR篩選這些細胞克隆，并且針對是否存在以反式提供的基因的RNA轉(zhuǎn)錄物通過RT-PCR來分析那些測試呈陽性的克隆。擴增合適的克隆并將其用來與病毒DNA和缺失構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。測試表達β-半乳糖苷酶(比如通過X-半乳糖的代謝測得的)的病毒在輔助細胞和正常的Vero細胞中、以及隨后在不同譜系的人細胞類型中復制的能力。出版的數(shù)據(jù)表明毒株11衍生的載體能夠在B細胞(Raji)和人胎成纖維細胞(HFF)起源的某些細胞系中限制性地生長。Raji細胞(EBV轉(zhuǎn)化的)并不足以代表正常的人細胞，因此我們評價了這些病毒在從取自健康志愿者的新鮮的成人外周血中分離的淋巴樣細胞以及在可以從商業(yè)來源得到的初級人胚胎成纖維細胞和上皮細胞中的生長特性。通過β-半乳糖苷酶的表達(感染和細胞-細胞擴散的證據(jù))、附加DNA的存在以及由RT-PCR檢測的“典型的”早期和晚期基因的表達來評價復制。通過在幾代細胞中測量能表達報道基因的細胞的百分數(shù)并且分析附加型病毒DNA的存在(19)來評價這些細胞中基因組的持久性。具有缺失基因的重組病毒的生產(chǎn)通過在4℃、30,000g下離心2小時來收獲胞外、細胞釋放型病毒。將半純化的病毒小片重新懸浮在10mM Tris/HCl、1mM EDTA(TE)pH8.0中。加入1％w∶v的SDS和100μg/ml的蛋白酶K。在50℃下溫育樣品16小時，然后用50∶50(w∶v)苯酚/氯仿混合物處理(提取5次)。除去水相，用0.2M的乙酸鈉調(diào)節(jié)到pH5.0，并加入3倍體積的純乙醇。從試管中收集DNA沉淀物、空氣干燥，然后重新溶解在體積適宜的TE緩沖液中。通過在分光光度計中、在254nm下樣品的吸光度來測量DNA濃縮物。使用DOTAP試劑將純化的病毒DNA與相應(yīng)的質(zhì)粒構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染到OMK(ATCC CRL1556)細胞中。24小時后除去培養(yǎng)基，并用含有2％熱失活的FCS的培養(yǎng)基替換之。然后觀察單細胞層，直至普遍的致細胞病變效應(yīng)的發(fā)展明顯為止。在這一階段，收獲細胞釋放型病毒并用于感染新的分會合的單層OMK細胞。24小時后用處于不含酚紅的DMEM/2％熱失活的FCS中的1％的瓊脂鋪層鋪在所述細胞上。48小時后，加入X-半乳糖至最終濃度為100μg/ml，以便鑒別出正在表達β半乳糖苷酶的病毒噬菌斑。然后挑選出藍色的噬菌斑，并使其進一步進行2個循環(huán)的噬菌斑純化，或者直至病毒的群體均一為止。然后使用PCR和Southern印跡來測試這些病毒正確進行同源重組的狀況。含有異源基因的重組病毒的生產(chǎn)將如上所述制得的純化的病毒DNA與含有合適的異源基因的質(zhì)粒載體(pJG101-105和/或pAW201,202,203,205,207或209)共轉(zhuǎn)染到OMK細胞中，其中所述的異源基因替換了β-半乳糖苷酶序列、從而重組到非必需或必需基因或基因間隔區(qū)中。選擇出不再表達β半乳糖苷酶的重組病毒，并以與如前所述的同樣的方式純化噬菌斑。在體外用HVS感染細胞通過低感染復數(shù)的OMK或Vero細胞生產(chǎn)出高滴度的病毒原種。在OMK或Vero細胞中確定細胞釋放型病毒的滴度，并在-70℃下儲存。通過在不同的感染復數(shù)下用β-半乳糖苷酶的表達病毒感染數(shù)目確定的細胞來評價以100％的效率感染任何特異性的細胞類型所需的病毒數(shù)量。通過在體積最小的培養(yǎng)基中加入病毒來感染貼壁細胞(adherent cell)，并且在37℃、輕微的攪拌下溫育細胞2小時。然后除去該培養(yǎng)基并用數(shù)量適當?shù)男迈r培養(yǎng)基替換。收獲非貼壁細胞、對細胞計數(shù)并且把介于106與107之間的細胞重新懸浮在濃度適當?shù)拿亢辽牟《局校詫崿F(xiàn)100％的感染效率。在輕微的攪拌下溫育2小時后，以與貼壁細胞所述同樣的方式來處理上述細胞。輔助細胞系的生產(chǎn)在自身或者在異源5’和3’控制序列的控制下，在合適的質(zhì)粒載體中克隆將要在穩(wěn)定的細胞系中表達的呈反式的病毒基因。該質(zhì)粒也可以含有選擇性標記，例如賦予了真核細胞對藥物G418的抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。另一方面，可以在單獨的質(zhì)粒上、并且再在異源真核控制序列(例如SV40早期啟動子和適宜的聚腺苷酸化信號)的控制下提供該基因。在所有的情況下，如此確立細胞系。將5×105個細胞(或者足以得到40-50％會合)、比如Vero或OMK平鋪在直徑為10cm的含有10ml DMEM/10％胎牛血清的組織培養(yǎng)皿上，并且在37℃下在空氣中含有5％CO2的增濕的氣氛中溫育12-18小時。在這一階段之后，使用如前所述的用于轉(zhuǎn)染病毒DNA的DOTAP試劑將2μg的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中。所述質(zhì)?？梢允呛泻线m的基因和選擇性標記基因的單個質(zhì)粒，或者可以是2μg的每種質(zhì)粒的混合物。然后在37℃下、在空氣中含有5％CO2的增濕的氣氛中再溫育細胞48小時。在這一階段中，通過除去培養(yǎng)基、用2×10ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，生命技術(shù)公司，cat no.20012)洗滌并用溶于PBS的2ml胰蛋白酶(0.25％w∶v)/EDTA(0.2％w∶v)處理，從塑料平皿中分離出目前會合的單細胞層。然后將新鮮的培養(yǎng)基加入細胞懸浮液中，計算出細胞的數(shù)目，并將其平鋪到96孔板中以便在有限稀釋下克隆或者在每個10cm的平皿中以104個細胞進行分配。培養(yǎng)基(DMEM/10％FCS)補充有濃度適當?shù)腉418，該濃度足以造成非轉(zhuǎn)染細胞100％的死亡。該濃度同時取決于細胞通道號和細胞類型。對處于通道150的Vero細胞而言，典型的濃度為800μg/ml。然后在前述的生長環(huán)境中替換細胞并且在一定的時間間隔內(nèi)觀察細胞的殺滅。取決于細胞死亡/生長速率，大約每隔3-4天更換培養(yǎng)基。在7-14天之后，細胞的單個克隆已經(jīng)長出，然后挑選出所述克隆，培養(yǎng)到合適的數(shù)目并且測定轉(zhuǎn)染的HVS基因的表達。這可以通過使用免疫熒光、Northern印跡或RT-PCR、使用本領(lǐng)域所熟知的方法來實現(xiàn)。評價病毒的安全性針對立即早期基因、早期基因和晚期基因的選擇、通過使用RT-PCR測量病毒基因的表達來評價修飾的病毒復制的能力。此外，溫育來自轉(zhuǎn)導細胞的組織培養(yǎng)上清液與指示OMK細胞，以便檢測出任何可能的感染病毒的釋放。3處插入的重組載體該策略生產(chǎn)出重組載體，從而使得在HVSLDNA的3’末端處可以插入異源基因。pSJNeo(來自R.Grassman)含有9.4kb的HVSDNA，而所述DNA含有H-L DNA接頭。把位于第一個H重復單位之中35bp處的SmaⅠ切割位點改變?yōu)镾alⅠ位點，從而可以插入neo基因。但是，該載體是一種大的、低拷貝載體，因此它不適于插入大的異源基因。選擇表達載體pSA91來制備新的重組載體。該載體以高拷貝數(shù)生產(chǎn)，并且含有hCMV IE啟動子以便推動基因的表達。為了生產(chǎn)出可以進行重組的有效的表達載體，從pSIneo中切掉HVS DNA序列，并使用接頭連接體將該序列插入位于5’端至啟動子之間的特有的NarⅠ位點。該載體命名為pJG101。ORF06缺失ORF06(位于bp12584和15967之間)編碼主導DNA結(jié)合蛋白，因此該基因的缺失使得病毒復制缺損。為了制備缺失了ORF06的重組盒，從pSS54中切除側(cè)翼DNA區(qū)，所述的pSS54含有HVS DNA的從11507至18013的區(qū)域(KpnlF片段)。切除掉Kpnl(11507)-Haell(12613)的1106bp的片段5’至ORF06編碼區(qū)以及SphⅠ(15258)-BglⅢ(16407)的1149bp的片段，并通過合成的寡聚體將它們連接在一起。如下所示，該寡聚體還含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制位點，從而可以插入異源基因。必須保持ORF06的3’末端的部分，這是因為它含有ORF07的啟動子。把連接的KpnⅠ-BgⅢ片段插入pBluescript KS克隆載體中，以便生成重組盒pJG102。
連接所述片段的寡聚體的序列為TGAATTCGGATCCGCATGCGCGACTTAAGCCTAGGCHaeⅢ EcoRⅠBamⅢSphⅠORF06的構(gòu)建以生成輔助細胞系為了生產(chǎn)出缺失了ORF06編碼區(qū)的HVS，必須提供反式的ORF06基因產(chǎn)物。這是通過生成穩(wěn)定的輔助細胞系來實現(xiàn)的。從pSS54中切除掉ORF06基因，作為HaeⅡ(12613)-PstⅠ(15998)片段。使用合成的寡聚體(如下所示)來精確地制備出ORF06編碼區(qū)的起點并且可以插入到表達載體pSVK3(Pharmacia)中。在將合成的寡聚體連接到ORF06的5’端之后，把EcoRⅠ-PsⅠ片段連接到pSVK3上以生成pJG103。這就推動了從SV40早期啟動子的表達，而另一種啟動子的使用也使得在輔助細胞系中的重組事件減小到最低限度。
寡聚體的序列為AATTCATGGCAACGAAGACAGCGCAACCTAGCGCGTACCGTTGCTTCTGTCGCGTTGGATEcoRⅠ ORF06 起點HaeⅡORF51的缺失ORF51編碼HVS的潛在的受體結(jié)合膜蛋白，因此該基因的缺失導致病毒不具有感染性。ORF51位于HVS基因組的72626和73432之間。為了生產(chǎn)出針對重組盒的ORF51側(cè)翼序列，從pKK104中切除掉BamHⅠ(71692)-HpaⅠ(72602)的910bp的片段5’至ORF51編碼區(qū)以及Bstl107I(73395)-PstⅠ(73998)的601bp的片段3’至ORF51，其中pKK104含有HVS EcoRⅠ D的63020至77574的片段，并且通過合成的寡聚體將它們連接在一起。這些寡聚體還含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制位點以便能夠插入異源基因，此外對ORF52來說需要保持polyA的序列。在連接后，將BamHⅠ-PstⅠ片段連接到克隆載體pSP73(Promega)上，以便生成重組盒pJG104。
合成的寡聚體的序列為AACGAATTCGGATCCTTAATAATAATGAGCTGTATTGCTTAAGCCTAGGAATTATTATTACTCGACATHpaⅠEcoRⅠBamHⅠORF52polyABstl107I構(gòu)建ORF51以生成輔助細胞系從pKK104中作為HpaⅠ(72602)-StuⅠ(73495)的806bp的片段切取ORF51基因，并將該片段克隆到SV40表達載體pSVK3中。將EcoRⅠ接頭連接到ORF51的5’和3’末端，以便促進該克隆的反應(yīng)。得到的ORF51表達載體命名為pJG105。ORF57的缺失ORF57編碼與HSV-1UL54具有同源性的轉(zhuǎn)錄激活物，其中的HSV-1UL54為一種必需的立即早期基因。為了生成含有完全缺失了ORF57的病毒，將靠近ORF57編碼區(qū)的區(qū)域擴增，以便可以與病毒DNA發(fā)生同源重組。已經(jīng)設(shè)計出的引物如下5’-d GGC GAA TTC GTC TAT AAC TGA CTG GGT TGCTG,5’-d GCC CTG CAG GCA GTT ACT CAC CAT AGC TTG AG,5’-dGCC CTG CAG CAA GTG TCC AAG CTC TAC TTG TGC,5’-d GGG GCATCC CTA TTG ATG TGC CAA GCA ATA GGG T,它們分別擴增了HVS的兩個區(qū)域、即77850至78260以及79530至80120，已經(jīng)把合適的限制位點插入引物中以協(xié)助克隆。使用上述片段以及事先已用EcoRⅠ和SphⅠ消化的pUC18進行三重連接，以生成pAW101。然后使用PstⅠ和SalⅠ使該質(zhì)粒線性化，并且在hCMV IE啟動子的控制下將該質(zhì)粒與lacZ基因相連以生成PdeltaORF57，而PdeltaORF57已被保藏在國家工業(yè)與海洋細菌有限收藏所(NCIMB)中，該保藏機構(gòu)位于23St Machan大道，Aberdeen,AB21RY；保藏號為40894。
為了生成輔助細胞系，使用PCR擴增含有ORF57的編碼區(qū)的片段，將該片段與T載體、pCRⅡ連接以生成pAW103。然后在HCMV IE啟動子的控制下，將其克隆到質(zhì)粒pBKCMV中以生成ORF57，其中pBKCMVORF57已被保藏在如上所述的NCIMB中，保藏號為40895。HVS插入失活的構(gòu)建體插入失活是防止基因起作用的一種不太優(yōu)選的方法，這是因為它依賴于在合適基因的編碼序列中指示物β-半乳糖苷酶基因的放入、而不除去開放讀框的任何部分。存在著重組事件發(fā)生的危險性，它導致β-半乳糖序列的缺失并且沒有連接能使所述基因再活化的開放讀框。
為了生成插入失活的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體，其中在I.E.CMV啟動子的控制下通過把lac Z基因插入ORF的5’編碼區(qū)來失活各個獨立的基因。然后通過質(zhì)粒和HVS病毒DNA的共轉(zhuǎn)染，將該失活的基因插入到病毒基因組中，以便得到重組病毒，然后通過噬菌斑純化所述病毒。質(zhì)粒的構(gòu)建ORF4/補體控制蛋白用BglⅡ和PstⅠ消化pJC81-KpnB，以便生成1152bp的含有ORF4的編碼區(qū)的片段。將該片段與pUC18相連、以生成pUCORF4。用BglⅡ使該質(zhì)粒線性化，用T4DNA聚合酶鈍化末端，并在IE CMV啟動子的控制下與含有l(wèi)ac Z基因的平端片段連接以生成pAW201。ORF14/小的IE基因用EcoRⅠ和PstⅠ消化pACYC184-EcoF，以便生成3189bp的含有ORF14的編碼區(qū)的片段。將該片段與pUC18相連、以生成pUCORF14。用KpnⅠ使該質(zhì)粒線性化，用T4DNA聚合酶鈍化末端，并在IE CMV啟動子的控制下與含有1ac Z基因的平端片段連接以生成pAW202。ORF 5/CD59同系物用SstⅠ和PstⅠ消化pACYC184-EcoF，以便生成2415bp的含有ORF15的編碼區(qū)的片段。將該片段與pUC18相連、以生成pUCORF15。用MunⅠ使該質(zhì)粒線性化，用T4DNA聚合酶鈍化末端，并在IE CMV啟動子的控制下與含有l(wèi)ac Z基因的平端片段連接以生成pAW203。ORF50/主要的轉(zhuǎn)錄激活劑用BglⅡ和PstⅠ消化pACYC184-EcoD，以便生成4149bp的含有ORF50的編碼區(qū)的片段。將該片段與pUC18相連、以生成pAW204。用PstⅠ消化該質(zhì)粒，并在IE CMV啟動子的控制下與含有l(wèi)acZ基因的DNA片段連接以生成PdeltaORF50，它已保藏在如上所述的NCIMB中、保藏號為40892。使用保藏在如上所述的NCIMB中、保藏號為40893的PUCPST來構(gòu)建輔助細胞系，其中PUCPST為含有同時包括了所述基因兩個外顯子的HVS DNA的PstⅠ片段的pUC18。ORF57/IE基因用BglⅡ使pACYC184-EcoJ線性化，用T4DNA聚合酶鈍化末端，并在IECMV啟動子的控制下與含有l(wèi)ac Z基因的平端片段連接以生成pAW206。
為了構(gòu)建輔助細胞系，使用下列引物通過PCR擴增ORF57的編碼序列5’-dCGC GGT ACC CACATG TCT ATA ATC GAC TGG GTT,5’-d CGG GGT ACC CTG AGT CATTAG TAG TAG CTC ATG.把該PCR片段連接到TA克隆載體pCRⅡ上并命名為pAW207。
ORF16/編程性細胞死亡抑制基因由于缺乏方便的限制位點，使用下列引物通過PCR擴增所述的編碼區(qū)5’-d GCC GAA TCC CAC AGT GCCAAG CTT GCC AGT T,5’-d CGC CTG CAG GGT GTA TAA CTG AGTGTT ACA GC,5’-d GGG CTG CAG GCT GTA CAC TCA GTT ATA CACC,5’d-CCC GCA TGC ACT TGA TCC AGG ACA TGC TTC.其中在5’編碼區(qū)中摻入了PstⅠ位點以便接下來可以進行克隆。將該PCR產(chǎn)物與pUC18相連、以便得到pAW208。用PstⅠ使該質(zhì)粒線性化，并且在IE CMV啟動子的控制下與lacZ基因連接以生成pAW2-09。用pAW208構(gòu)建輔助細胞。
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權(quán)利要求
1．一種松鼠猴皰疹病毒，該病毒在編碼病毒復制所需蛋白的至少一個基因中至少有一處突變，其中所說的突變防止了病毒在人細胞中的復制。
2．一種根據(jù)權(quán)利要求1的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的突變的基因為ORF50和/或ORF57。
3．一種根據(jù)前述任一權(quán)利要求的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的病毒在轉(zhuǎn)化基因、比如STP基因中還有突變。
4．一種根據(jù)前述任一權(quán)利要求的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的病毒在選自包括ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51的組中的至少一個基因中額外地進行了突變。
5．一種根據(jù)前述任一權(quán)利要求的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的突變?yōu)樗f基因的完全或者部分的缺失。
6．一種根據(jù)前述任一權(quán)利要求的松鼠猴皰疹病毒，其中給所說的病毒提供了用于插入異源遺傳物質(zhì)的插入位點。
7．一種根據(jù)權(quán)利要求6的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的位點位于至少一個非編碼重復序列之中或附近，并且優(yōu)選位于特有的編碼區(qū)和非編碼序列之間的接點處。
8．一種根據(jù)權(quán)利要求6或7的松鼠猴皰疹病毒，當取決于權(quán)利要求5時，其中在所說缺失的位點處提供所說的插入位點。
9．一種根據(jù)權(quán)利要求6的松鼠猴皰疹病毒，其中在選自包括ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51的組中的至少一個基因之中或附近提供插入位點。
10．一種松鼠猴皰疹病毒，該病毒在編碼非必需蛋白的至少一個基因中至少有一處突變。
11．一種根據(jù)權(quán)利要求10的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的基因至少為下列基因中的一種ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51。
12．一種根據(jù)權(quán)利要求10或11的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的突變?yōu)樗f基因的完全或者部分的缺失。
13．一種根據(jù)權(quán)利要求10-12的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的病毒在轉(zhuǎn)化基因、比如STP基因中還有突變。
14．一種根據(jù)權(quán)利要求10-13的松鼠猴皰疹病毒，其中進一步操作所說的病毒，從而突變和/或缺失編碼ORF50和/或ORF57的基因的至少一部分。
15．一種根據(jù)權(quán)利要求10-14的松鼠猴皰疹病毒，其中給所說的病毒提供可以將異源DNA插入其中的插入位點。
16．一種松鼠猴皰疹病毒，該病毒或者在其中具有或者適于在其中插入靠近缺失位點的至少一個事先選擇的異源DNA片段，所說的位點表示編碼非必需蛋白的至少一個基因的部分或完全缺失的位點。
17．一種根據(jù)權(quán)利要求16的松鼠猴皰疹病毒，其中額外地突變或者缺失所說病毒的編碼病毒復制所需蛋白的基因。
18．一種根據(jù)權(quán)利要求16或17的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的病毒在轉(zhuǎn)化基因、比如STP基因中還有突變。
19．一種松鼠猴皰疹病毒，該病毒在單個的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的接點處或者在其中具有或者適于在其中插入至少一個事先選擇的異源DNA片段；而且其中所說的病毒在單個編碼區(qū)的一端或兩端還包括數(shù)量有所減少的重復的非編碼序列；并且該病毒還包括在編碼與病毒復制有關(guān)的蛋白的至少一個基因中的至少一處突變。
20．一種根據(jù)權(quán)利要求19的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的非編碼重復序列的數(shù)量為5個或者更少、并且理想的為1個。
21．一種松鼠猴皰疹病毒，該病毒在編碼與病毒復制有關(guān)的蛋白的基因中至少有一處突變并且在編碼非必需蛋白的基因中也有突變。
22．一種根據(jù)權(quán)利要求21的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的病毒在轉(zhuǎn)化基因、比如STP基因中還有突變。
23．一種根據(jù)權(quán)利要求21或22的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的突變包括所說基因的部分或完全的缺失。
24．一種根據(jù)權(quán)利要求21-23的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的編碼與病毒復制有關(guān)的蛋白的基因包括ORF50或ORF57。
25．一種根據(jù)權(quán)利要求21-24的松鼠猴皰疹病毒，其中所說的編碼非必需蛋白的基因包括選自包括ORF4、ORF14、ORF15、ORF16、ORF51的組中的基因。
26．一種用于向靶細胞送遞所選擇的異源DNA的方法，該方法通過在有利于病毒感染的條件下，將所說的細胞暴露到至少包括事先選擇的異源DNA的松鼠猴皰疹病毒中。
全文摘要
本發(fā)明涉及已經(jīng)通過突變和/或缺失特異性的必需和非必需基因進行了遺傳修飾的松鼠猴皰疹病毒有關(guān)的方法。在病毒基因的復制中需要所述的必需基因,并且對病毒增殖而言也需要所說的必需基因。所說的非必需基因可以表示用于插入異源遺傳物質(zhì)、即治療基因的位點。
文檔編號A61K38/00GK1237209SQ9719957
公開日1999年12月1日 申請日期1997年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月4日
發(fā)明者D·M·梅雷蒂斯, A·F·馬克哈姆 申請人:利茲大學