專利名稱：人的皮特異受體基因的啟動子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人內(nèi)皮特異受體(endoglin)基因的啟動子，或其功能性組成成分，和其用于制藥的用途。
基因療法的一個重要難題是對插入細胞的效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制。在轉(zhuǎn)錄水平上，通過在效應(yīng)基因編碼序列的上游加入啟動子或增強子序列使得這一控制成為可能。
“啟動子序列”被理解成能與調(diào)節(jié)蛋白，即所謂的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的基因區(qū)段，所述轉(zhuǎn)錄因子的全體可激活下游效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。位于轉(zhuǎn)錄方向上的那些區(qū)域被稱為“下游”序列，而位于相反方向上的序列被稱為“上游”序列?！靶?yīng)基因”一般被理解成其基因產(chǎn)物在基因療法的意義上具有例如所需效應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因。
這種啟動子或增強子序列可以是非細胞特異性的，細胞特異性的，病毒特異性的，代謝特異性的或細胞周期特異性的。這些啟動子序列及其例如用于不同疾病的基因療法的用途的例子列于專利申請WO96／06940，WO96／06938，WO96／06941和WO96／06939。另外，這些專利申請?zhí)峁┝私M合這些啟動子序列，例如用于細胞特異性地和細胞周期特異性地控制效應(yīng)基因的技術(shù)和例子。
依據(jù)啟動子的選擇和組合，這些中的后者造成依賴這些啟動子的效應(yīng)基因更多或更少受限制的和／或更強或更弱的轉(zhuǎn)錄。
內(nèi)皮細胞是基因療法的一例有利的靶細胞，這一方面是由于對于注射至循環(huán)系統(tǒng)的基因構(gòu)建體而言內(nèi)皮細胞是直接可及的，另一方面是由于它們直接涉及多種疾病的發(fā)展和進程以及治愈過程，和／或直接與這些疾病的位點相鄰，所述疾病如腫瘤疾病，炎癥，變態(tài)反應(yīng)，自身免疫病，器官排斥反應(yīng)，和循環(huán)和凝固疾病。
通常，靶細胞特異性啟動子是在相關(guān)靶細胞中能特別強有力地或在很大程度上唯一被形成的那些蛋白質(zhì)的基因的啟動子。對于內(nèi)皮細胞而言，內(nèi)皮特異受體是這些蛋白質(zhì)的一個例子。
內(nèi)皮特異受體是TGF β的非信號轉(zhuǎn)移受體(Gougos et al．，J．Biol．Chem．265，8361(1990)，Cheifetz，J．Biol．Chem．267，19027(1992)，Moren et al．，BBRC 189，356(1992))。盡管它在正常的內(nèi)皮上以少量出現(xiàn)，在增殖的內(nèi)皮上表達的程度增高(Westphal et al．，J．Invest．Derm．100，27(1993)，Burrows et al．，Pharmac．Ther．65，155(1994))。有關(guān)啟動子的強度和細胞特異性沒有另外的信息可以得到。盡管內(nèi)皮特異受體基因在約四年前就已為人所知(Bellon et al．，(1993))，迄今為止仍不可能分離內(nèi)皮特異受體啟動子。
Bellon等人已描述了人內(nèi)皮特異受體的cDNA序列(Eur．J．，Immunol．23，2340(1993))，Ge等人已描述了鼠內(nèi)皮特異受體的cDNA序列(Gene 138，201(1994))。盡管可獲得內(nèi)皮特異受體基因部分5’非翻譯區(qū)域的序列信息，但是有關(guān)此區(qū)域的功能或有關(guān)啟動子區(qū)域知之甚少。
VEGF受體是另一種內(nèi)皮細胞特異性的蛋白質(zhì)。在這種情況下，它可被分成兩個受體(Plate et al．，Int．J．Cancer 59，520(1994))一個是VEGF受體1(flt-1)，(de Vries et al．，Science 255，989(1992))，它在其胞質(zhì)組成成分中含有fms-樣酪氨酸激酶，另一個是VEGF受體2(flk-1，KDR)，(Terman et al．，BBRC 187，1579(1992))，它在其胞質(zhì)組成成分中含有酪氨酸激酶。幾乎只在內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)了這兩種受體(Senger et al．，Cancer Metast．Rev．12，303(1993))。
其他內(nèi)皮細胞特異性受體酪氨酸激酶是tie-1或tie-2(Partanen et al．，Mol．Cell．Biol．12，1698(1992)，Schnürch und Risau，Development 119，957(1993)，Dumont et al．，Oncogene 7，1471(1992))，和B61受體(Eck受體)，(Bartley et al．，Nature 368，558(1994)，Pandey et al．，Science 268，567(1995)，van der Geer et al．，Ann．Rev．Cell．Biol．10，251(1994))。
其他內(nèi)皮細胞特異性蛋白質(zhì)是B61分子，它表示B61受體的配體(Holzman et al．，J．Am．Soc．Nephrol．4，466(1993)，Bartley et al．，Nature 368，558(1994))；內(nèi)皮肽，尤其是內(nèi)皮肽B(O’Reilly et al．，J．Cardiovasc．Pharm．22，18(1993)，Benatti et al．，J．Clin．Invest 91，1149(1993)，O’Reilly et al．，BBRC 193，834(1993))，其啟動子序列已由Benatti等人描述于J．Clin．Invest 91，1149(1993)中；內(nèi)皮肽1(Yanasigawa et al．，Nature 332，411(1988))，其啟動子序列已由Wilson等人描述于Mol．Cell．Biol．10，4654(1990)；內(nèi)皮肽受體，尤其是內(nèi)皮肽B受體(Webb et al．，Mol．Pharmacol．47，730(1995)，Haendler et al．，J．Cardiovasc．Pharm．20，1(1992))；甘露糖6-磷酸受體(Perales et al．，Eur．J．Biochem．226，225(1994))，其啟動子序列已由Ludwig等人(Gene 142，311(1994))，Oshima等人(J．Biol．Chem．263，2553(1988))和Pohlmann等人(PNAS USA 84，5575(1987))描述；和von Willebrand因子(vWF)，其啟動子序列已由Jahroudi和Lynch(Mol．Cell．Biol．14，999(1994))，F(xiàn)erreira等人(Biochem．J．293，641(1993))和Aird等人(PNAS USA 92，4567(1995))描述。
其他內(nèi)皮細胞特異性蛋白質(zhì)是由經(jīng)激活的內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的，以例如IL-1α和IL-1β形式存在的IL-1(Warner et al．，J．Immunol．139，1911(1987))，其啟動子序列已描述于Hangen et al．，Mol．Carcinog．2，68(1986)，Turner et al．，J．Immunol．143，3556(1989)，F(xiàn)enton et al．，J．Immunol．138，3972(1987)，Bensi et al．，Cell Growth Diff．1，491(1990)，Hiscott et al．，Mol． Cell．Biol．13，6231(1993)和Mori et al．，Blood 84，1688(1994)；IL-1受體，其啟動子序列已描述于Ye et al．，PNAS USA 90，2295(1993)；和血管細胞粘附分子(VCAM-1)，VCAM-1在內(nèi)皮細胞中的表達由脂多糖激活；TNF-α(Neish et al．，Mol． Cell．Biol．15，2558(1995))；IL-4(Iademarco et al．，J．Clin．Invest．95，264(1995))；和IL-5(Marni et al．，J．Clin．Invest．92，1866(1993))。VCAM-1的啟動子序列已描述于Neish et al．，Mol． Cell．Biol．15，2558(1995)，Ahmad et al．，J．Biol． Chem．270，8976(1995)，Neish et al．，J．Exp．Med．176，1583(1992)，Iademarco et al．，J．Biol．Chem．267，16323(1992)和Cybulsky et al．，PNAS USA 88，7859(1991)。
其他內(nèi)皮細胞特異性啟動子是合成的激活物序列，因為由轉(zhuǎn)錄因子的寡聚化結(jié)合位點組成的合成的激活物序列也可用作天然內(nèi)皮特異性啟動子的替代物，所述轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)皮細胞中優(yōu)先或選擇性地具有活性，例如轉(zhuǎn)錄因子GATA-2，它在內(nèi)皮肽-1基因中的結(jié)合位點是5’-TTATCT-3’(Lee et al．，Biol．Chem．266，16188(1991)，Dorfmann et al．，J．Biol．Chem．267，1279(1992)和Wilson et al．，Mol．Cell．Biol．10，4854(1990))；和腦特異性，內(nèi)皮葡萄糖-1-轉(zhuǎn)運蛋白，因為腦內(nèi)皮細胞可獨特地，非常強烈地表達此轉(zhuǎn)運蛋白以將D-葡萄糖跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)運至腦(Gerhart et al．，J．Neurosci．Res．22，464(1989))。Murakami等人已描述了啟動子序列(J．Biol．Chem．267，9300(1992))。
盡管這些啟動子對內(nèi)皮細胞具有相當大的特異性，但是這些啟動子中的一些僅有相對低的活性，例如von Willebrand因子基因或VEGF受體1(flk-1)基因的啟動子。而通過將這種“弱”啟動子與基本的啟動子(如SV40)或增強子組合即可增強“弱”啟動子的活性，這通常會引起相伴隨的特異性降低。
因此本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)既強烈又對內(nèi)皮具有特異性的啟動子。
目前已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮特異受體基因的啟動子特別地具有這些特性。
因此本發(fā)明涉及人內(nèi)皮特異受體基因的啟動子，或其功能性的組成成分和變體。已發(fā)現(xiàn)此啟動子最大可延伸至2415個堿基對(見表1，SEQ IDNO1)并優(yōu)選包含包括起始序列的核苷酸序列1-2378。
為了鑒定根據(jù)本發(fā)明的啟動子，在質(zhì)粒pGL3(Promega)中將內(nèi)皮特異受體基因的啟動子序列或其部分與報道基因(例如編碼熒光素酶的基因)相連接，用此構(gòu)建體轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞(ECV-304細胞系)和作比較用的頸癌細胞(HeLa細胞系)。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮特異受體啟動子比vWF啟動子強80倍，這很令人驚奇，因為如上所述vWF以內(nèi)皮特異性的方式表達，所以預(yù)期內(nèi)皮特異受體啟動子的強度會與vWF啟動子的相似。還發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮特異受體啟動子在內(nèi)皮細胞中的活性比在頸癌細胞中的約高30倍。這很令人驚奇，因為vWF啟動子，同樣為內(nèi)皮特異性的，它在內(nèi)皮細胞中的強度與在頸癌細胞中的相似。因此，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)皮特異受體啟動子在強度方面和內(nèi)皮特異性的方面都明顯超過了vWF基因啟動子。
另外還發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的啟動子的部分也顯示出強烈的內(nèi)皮細胞特異性的活性。
因此，以SV40啟動子的活性作為基準，在內(nèi)皮細胞中得到了下文所列的內(nèi)皮特異受體基因啟動子的5’-末端缺失的構(gòu)建體的下列相對活性核苷酸序列 相對活性SV40啟動子 1內(nèi)皮特異受體啟動子(表1，SEQ ID NO1)1-2415 11．5部分序列36-2415 10．2470-2415 13．0948-2415 10．01310-24152．01847-24153．32339-24150．2因此“啟動子的功能性組成成分”應(yīng)理解成具有啟動子活性的本發(fā)明啟動子的所有部分序列，尤其是從約1-約2378，從約36-約2378，從約470-約2378和從約948-約2378的部分序列，以及從約36-約2415，從約470-約2415和從約948-約2415的部分序列，優(yōu)選從約470-約2415和從約470-約2378的部分序列。具有啟動子活性的部分序列也例如從約1310-約2415和從約1310-約2378，和從約1847-約2415和從約1847-約2378延伸。
然而本發(fā)明并不局限于如SEQ ID NO1所示的啟動子和其功能性組成成分，還包括具有啟動子活性的變體。此特性的變體包括例如缺失，增加，插入和／或取代一個或多個堿基，優(yōu)選約1-約50，尤其是約1-約25，特別是約1-約5個堿基。使用例如所述的熒光素酶檢測法可容易地測定啟動子活性。
本發(fā)明還進一步涉及核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括
a)至少一個根據(jù)本發(fā)明的啟動子的核酸序列(組分a))和，適當時，b)至少一個效應(yīng)基因(組分b))，此效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄由組分a)激活。
組分a)優(yōu)選位于組分b)的上游。
本發(fā)明還涉及一種核酸構(gòu)建體，其中根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)皮特異受體基因的啟動子序列與另一個靶細胞特異性，病毒特異性，代謝特異性或細胞周期特異性的啟動子序列和至少一個效應(yīng)基因相組合，其中啟動子序列的組合控制了至少一個效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄的激活。
根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體優(yōu)選由DNA組成。術(shù)語“核酸構(gòu)建體”應(yīng)理解成由核酸組成并能在靶細胞中轉(zhuǎn)錄的人工結(jié)構(gòu)。優(yōu)選將它們插入載體中，例如插入象質(zhì)粒這樣的非病毒載體中，或病毒載體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可熟練制備非病毒載體和病毒載體。
本發(fā)明還涉及含有根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的細胞。
一般情況下，效應(yīng)基因的選擇取決于要用基因構(gòu)建體治療的疾病。
專利申請WO96／06940，WO96／06938，WO96／06941和WO96／06939中詳細描述了用于治療腫瘤疾病，白血病，自身免疫病，變態(tài)反應(yīng)，關(guān)節(jié)炎，炎癥，器官排斥，移植物抗宿主反應(yīng)，血凝固系統(tǒng)的疾病，心血管疾病，貧血，感染或?qū)NS的損害的這些效應(yīng)基因的例子。
例如，適合本發(fā)明的效應(yīng)基因編碼細胞因子，趨化因子，生長因子，細胞因子的受體，趨化因子的受體或生長因子的受體，以及細胞因子的拮抗劑，誘導(dǎo)細胞生長抑制、細胞毒性或細胞程序死亡的蛋白質(zhì)，抗體或抗體片斷，血管生成抑制劑，凝固因子，凝固抑制劑，纖溶蛋白，裂解藥物前體從而形成藥物的酶，對血循環(huán)發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)，或能引起免疫反應(yīng)的感染性病原體的抗原。
根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可進一步含有利用啟動子序列或內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)互相連接的兩個或多個相同或不同的效應(yīng)基因。這些構(gòu)建體的例子已在上述專利申請中給出。
根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可用于例如，僅內(nèi)皮細胞特異性地或內(nèi)皮細胞特異性地和以代謝特異性地方式，內(nèi)皮細胞特異性地和細胞周期特異性地和／或內(nèi)皮細胞特異性地和病毒特異性地表達基因，優(yōu)選基因可編碼藥理活性化合物或能裂解無活性藥物前體從而產(chǎn)生有活性藥物的酶。
優(yōu)選使用根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體制備用于治療上述疾病的藥物，藥物的制備一般包括將核酸構(gòu)建體克隆到適當?shù)妮d體中，然后例如施用給病人。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉根據(jù)本發(fā)明的啟動子和根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的其他應(yīng)用。
下文的實施例，以及表和圖欲更詳細地描述，而不是為了限制本發(fā)明。
表和圖的描述表1人內(nèi)皮特異受體啟動子的序列。堿基對1對應(yīng)于位于最遠的5’端的序列區(qū)。高度保守的Alu序列位于堿基對1360-1666區(qū)，而與公開的M．musculus cDNA的同源性開始于在3’區(qū)域的堿基對2300，與公開的H．sapiens cDNA的部分(5’非翻譯區(qū))的同源性開始于堿基對2379。


圖1人內(nèi)皮特異受體啟動子的克隆。A將通過PCR制備的人內(nèi)皮特異受體啟動子的片斷連接到載體pCR2．1(Invitrogen)的TA克隆位點。B用酶Mlul和Xhol從構(gòu)建體pCR2．1Endo上切下含有人內(nèi)皮特異受體啟動子的片斷并克隆到熒光素酶報道基因的載體pGL3(Promega)上。
圖2不同的內(nèi)皮細胞特異性啟動子的熒光素酶活性。將所有的啟動子克隆到pGL3中，以SV40基本啟動子為基礎(chǔ)使所有的值標準化。SV40不含增強子的SV40基本啟動子。pGL3Endo內(nèi)皮特異受體啟動子(見圖1B)。vWF+SV40增強子被上游SV40增強子增強的vonWillebrand因子的啟動子。flk-1VEGF受體flk-1的啟動子(-224／以ATG起始)。vWF不含另外的增強子的von Willebrand因子啟動子(-487／+247)。
圖3在內(nèi)皮細胞和非內(nèi)皮細胞中人內(nèi)皮特異受體啟動子的熒光素酶活性。構(gòu)建體與圖2相同。以SV40基本啟動子為基礎(chǔ)標準化，將內(nèi)皮特異受體啟動子在內(nèi)皮細胞系ECV304中的活性與其在HeLa頸癌細胞系中的活性相比較。在此試驗中，ECV304細胞中的活性比HeLa細胞中的活性約高29倍。
圖4內(nèi)皮特異受體啟動子上推斷的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。僅僅顯示了Alu序列和cDNA起點之間的區(qū)域。所有的結(jié)合位點都位于正(+)鏈上。實施例使用PromoterFinderTMDNA Walking試劑盒(Clontech)克隆啟動子。在兩輪PCR中，使用此試劑盒，借助于兩個基因特異性的引物，從人內(nèi)皮特異受體cDNA的5’非翻譯區(qū)擴增了位于公開序列的5’端的約2．4千堿基對的片斷，所述引物是E1GCTGGGCTGGAGTTGCTGTCCGAAGGATG(SEQ ID NO2)E2AATGGATGGCAGTGACAGCAGCAGTCCTG(SEQ ID NO3)PCR的條件如下所述1．PCR引物E1，94℃ 25秒，94℃ 25秒，63℃ 20秒，68℃ 4分鐘，39次循環(huán)，68℃ 4分鐘2．(嵌套)PCR引物E2，94℃ 25秒，94℃ 25秒，61℃ 20秒，68℃4分鐘，26次循環(huán)，68℃ 4分鐘聚合酶ExpandTMLong Template PCR系統(tǒng)(BoehringerMannheim)。
通過QIAquickTM自旋柱(Qiagen)純化PCR片斷并插入TA克隆載體(Original TA CloningTM試劑盒(Invitrogen))。測定此構(gòu)建體pCR2．1Endo(見圖1a)的序列，將經(jīng)克隆的區(qū)域鑒定為人內(nèi)皮特異受體基因的2415堿基對的5’區(qū)域(序列，見表1)。
將此載體中的經(jīng)克隆區(qū)域克隆到熒光素酶報道基因的載體，即pGL3(Promega)上，并如同構(gòu)建體pGL3Endo(見圖1b)那樣在HeLa和ECV304細胞中檢測其啟動子活性。
或者通過DEAE／葡聚糖法(由Sompayrac et al．，PNAS 78，7575(1981)而改進)，或者使用LipofectAMINETM(Gibco BRL)轉(zhuǎn)染細胞。SV40基本啟動子與pGL3Endo構(gòu)建體一起被轉(zhuǎn)染以作為標準；還轉(zhuǎn)染了具有或不具有SV40增強子的flk-1-(VEGF)(-225／以ATG起始)啟動子和von Willebrand因子(vWF)(-487／7+247)啟動子。含有SV40增強子的后一個vWF啟動子構(gòu)建體與眾不同，因為其活性顯著高于野生型啟動子，而其選擇性盡管有所降低，但仍然存在。將所有的構(gòu)建體克隆到pGL3中，按Herber等人(Oncogene 9，1295(1994))和Lucibello等人(EMBO J．14，132(1995))所述方法進行熒光素酶測定。
不同啟動子在ECV304細胞中的熒光素酶活性(圖2)表明內(nèi)皮特異受體基因5’區(qū)域的經(jīng)克隆片斷具有啟動子活性。與其他典型的內(nèi)皮細胞特異性的啟動子相比，此啟動子的活性非常高，比flk-1啟動子的活性高4倍，比vWF啟動子的活性高80多倍。甚至當vWF啟動子被SV40增強子序列增強時，pGL3Endo構(gòu)建體的活性仍然較高。這些數(shù)據(jù)證實了經(jīng)克隆的區(qū)域是人內(nèi)皮特異受體基因的啟動子。
圖3表示在ECV304細胞和HeLa頸癌細胞系中內(nèi)皮特異受體啟動子活性的比較。當以SV40基本啟動子為基礎(chǔ)標準化時，在ECV304細胞中的活性比在HeLa細胞中的高約29倍。這表明經(jīng)克隆的啟動子不僅在內(nèi)皮細胞中具有活性，而且對這些細胞具有選擇性。
圖4表示內(nèi)皮特異受體啟動子上推斷的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。一些高度同源性的潛在的結(jié)合位點位于保守的Alu序列和公開的cDNA之間的區(qū)域，所述位點可能負責(zé)啟動子的選擇性和活性并包括幾個保守的NF-KB結(jié)合位點。
表1(SEQ ID NO1)1 CGGGGGTTCC TCCTCTGTAA AGTGGAGGTA31 TAACGGTACC CACCTCCTGG GGTGGCTGTG61 AGGATTCAGA GCTGATAAGG TGAACGCCTA91 GGGCGGGCCC TGGTGCAGAG AGAGCGCTCA121 GCTCCTAGGG CTGGATTAAC TGTCCCTGGG151 GCACAGATCT CGGTCTGGGG CCTGTGGAAA181 CCTCAGAGCC ACCCCTGAAC CCCCACCGAG211 CCACCCTTTG CCTCGCAGTG CCCATGGCCT241 GTCTCCGAG GTTACAGGAA AAGGCAGAGG271 AGATGCCCTT CTCAGGGTGG CCCTCTGGGA301 GAGGACACTC TCCCTTGACC TCAAAGCCAC331 GCTTGGCTGC AAACTGGCCA GGCAGCCACA361 AGGCTGGGCA AGCAGAACGA TCCCTAATCC391 CCACCCAAAG AGCCACACCG ACCCTCCCAG421 CCGCTGTGAC AGCTCCTGCA GAGACAAACA451 CACGGCCTAC TCTTGTCACC CGGGCCGGCC481 AATAAGCACG GAGAGGCAAG GCCTCAGACC511 CTGGACAGAC ATCCTCCCTC CAGAGGCACC541 AGGGCCTCAG CCTTCTCCTC CCTCCCTGGG571 CCTCAATTTC TCCACCTGTG ACCCAGGGCA601 GGTGGATCCA GGGAGAAGAA CCTTCTGGCT631 CCATCTCACC ATGGGTCCTG CCAGCACACA661 CAAAGATTTG GCCTCTCAAA GCCTAGCTCT691 GCCAGCGTCC TTCTGCTCAA GAACTCTCCA721 TGACTCCCAG TGGCCCTAAG GACAAAGTCC751 TGGCATTTGA GGCCCTCCCA ATGCAGGGCC781 AGACTCTGCC TCTCCAGCTT CCTGTCCCCA811 CCACACCCCT GCTGGTCTCA CGGTGGTCCG841 ACTGTTTCCT GCTTCTGTGC CTTTGCTTAG871 TCTGGCACCC CTGCCTGGCA TGCTTTCCTC901 ACCCCTTCTT CTCCCCAATC CCAACTCACC931 CAGTCTTTCA AAGGGCAGGC CTAAATACCA961 GGCCCTCCAG GTGGCCCAGG ATTCCTTCTC991 TGAGCTTTCA TGGGCCTGGC CCTGGGTGCT1021 ACCTGTGAGT AGTCCCACGG TGGGTACATA1051 GTAGGTGCGC TTACTGTTCG CAGAATGAAC1081 ATGGGACAGT TTGGGGACTG TCACCCAGCT1111CAGGGAGCAC TGATGGGGAA GCATCTCCTG1141TATGTCCCAG GGCTCAGTGC TGTAGTGTCC1171TGACCCTCAG AAATCTCATA ATGGCTTGGT1201CAGGAAGGCA TCGTGCCCCA CTTTGCAAAC1231AGGGGGTGCT GAGAATTGAG GGGCCTTGTC1261CAAGGTCTCA TGGCTAGGAG CAAGCAGAAT1291CGGATTTGAA CCCAGGGCCA CGTGACTTCA1321GAAGTGCCAT TAAAGTCCCC ATAATTCGGA1351GCTGTCTTCT TTTTTTTTTT CTTTCTTTTT1381TTTGAGACCG AGCCTCACTC TGTCACCTAG1411GCCAGGAGTG CAGTGGTCTG ATCTCAGCTC1441ACTGCAACCT CCGCCTCCTA GGTTCAAGTG1471ATTCTCTAGC CTCAGCCTCC CAAGTAGCTG1501GGACTACAGG CGCACGTCAT CATGCCCAGC1531TAACTTTTGT ATTTTTAGTA GAGATGGGTT1561TTCACCATGT TGGTCAGGCT GGTCTCGAAC1591TCCTGACCTC AAGTGATCCG TCTGCCTCGG1621CCTCTCAAAG TGCTGGGATT ATAGGCTTGA1651GCCACTACAC TCGGCCTGGA GCTGTGTTTT1681GTCGGTGAAG GATTTTCCAC CCATGAAGGG1711GTCAGACGTG AAGCGTGTGG CCCTGGGCAG1741CTCCTCTGAG CCCAGAGACG CCAGCCCTAG1771CCGCCTTGCT GTGCCACTTT GGGACTTCCC1801TCCCTAGCCT GAGCTTCAGT TTTCCTGCCT1831GTTAGGCAGC CCCATGTCAA CTGCACTTAG1861TAGGCCGGGT TTGATGCCCG ACAAGACGTG1891AAGTGGTGGA GGTGGGCAGG ATCCCAGCGC1921TACCATCTTC TTGAACCAGT GATCTCAACA1951CATCGGATTT CTGTTTCCTC ATCTGCAAAA1981TGGGATCAGT GAGCTCAGGT GGGTCACAAA2011TTCTACAGGA ACTACTTTAG CCAAGCCCGG2041CCCCCTGAAA GTTCCCCTCG GTGGGCAGTT2071AGGGTGATTG TTTTCATCTG TGGGGCTCCC2101TGATGCGTCC CACCCACCAG CCTTGGAGAG2131GGTGGGATGG GAGGGTGGGG TGCTTGGGGA2161GACAAGCCTA GAGCCTGGGC CCTCCCACCC2191CACTGCCTCC CCCCATCCCA GGGCCCCCCA2221CCCAGTGACA AAGCCCGTGG CACTTCCTCT2251ACCCGGTTGG CAGGCGGCCT GGCCCAGCCC2281CTTCTCTAAG GAAGCGCATT TCCTGCCTCC2311CTGGGCCGGC CGGGCTGGAT GAGCCGGGAG2341CTCCCTGCTG CCGGTCATAC CACAGCCTTC2371ATCTGCGCCC TGGGGCCAGG ACTGCTGCTG2401TCACTGCCAT CCATT
權(quán)利要求
1．人內(nèi)皮特異受體基因的啟動子，含有表1所示序列或其功能性組成成分和變體。
2．如權(quán)利要求1所述的啟動子，其中功能性組成成分含有從約1-約2378，從約36-約2378，從約470-約2378，從約948-約2378，從約1310-約2378，從約1847-約2378，從約36-約2415，從約470-約2415，從約948-約2415，從約1310-約2415，或從約1847-約2415的序列。
3．核酸構(gòu)建體，含有至少一個如權(quán)利要求1或2所述的人內(nèi)皮特異受體基因的啟動子序列。
4．如權(quán)利要求3所述的核酸構(gòu)建體，另外含有一個效應(yīng)基因，人內(nèi)皮特異受體基因的啟動子序列即組分a)激活該效應(yīng)基因即組分b)的轉(zhuǎn)錄。
5．如權(quán)利要求4所述的核酸構(gòu)建體，其中人內(nèi)皮特異受體啟動子序列位于效應(yīng)基因的上游。
6．如權(quán)利要求3-5中任一個所述的核酸構(gòu)建體，其中人內(nèi)皮特異受體啟動子序列與至少一個另外的激活序列相組合，這種另外的激活序列選自由病毒特異性，代謝特異性，細胞特異性或細胞周期特異性的激活序列組成的組。
7．如權(quán)利要求3-6中任一個所述的核酸構(gòu)建體，其中核酸是DNA。
8．如權(quán)利要求3-7中任一個所述的核酸構(gòu)建體，它被插入載體。
9．如權(quán)利要求8所述的核酸構(gòu)建體，其中載體是質(zhì)粒載體或病毒載體。
10．如權(quán)利要求4-9中任一個所述的核酸構(gòu)建體，其中效應(yīng)基因是編碼活性化合物的基因，所述活性化合物選自由細胞因子，趨化因子，生長因子，細胞因子的受體，趨化因子的受體，生長因子的受體，以及細胞因子的拮抗劑，具有抗增殖或細胞生長抑制或細胞程序死亡效果的蛋白質(zhì)，抗體，抗體片斷，血管生成抑制劑，凝固因子，凝固抑制劑，纖溶蛋白，裂解藥物前體從而形成藥物的酶，對血循環(huán)有影響的蛋白質(zhì)，或能引起免疫反應(yīng)的感染性病原體的抗原組成的組。
11．如權(quán)利要求3-10中任一個所述的核酸構(gòu)建體，含有利用啟動子序列或內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)互相連接的幾個效應(yīng)基因。
12．含有如權(quán)利要求3-11中任一個所述的核酸構(gòu)建體的細胞。
13．如權(quán)利要求3-10中任一個所述的核酸構(gòu)建體或如權(quán)利要求12所述的細胞用于制備治病藥物的用途，所述疾病選自由腫瘤疾病，白血病，自身免疫病，變態(tài)反應(yīng)，關(guān)節(jié)炎，炎癥，器官排斥，移植物抗宿主反應(yīng)，血凝固疾病，心血管疾病，貧血，感染或CNS損害組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及人內(nèi)皮特異受體基因的啟動子,或其功能性的組成成分,以及它/它們用于制備藥物的用途。
文檔編號A61P31/00GK1203948SQ98106350
公開日1999年1月6日 申請日期1998年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月6日
發(fā)明者W·格勞里克, D·奈特爾貝克, H－H·賽德拉西克, R·默勒 申請人:赫徹斯特股份公司