專利名稱：人降鈣素類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有降低血清鈣離子濃度活性的新的肽，含有所說(shuō)的肽的藥物組合物以及該組合物在治療骨代謝和/或鈣代謝紊亂等相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
降鈣素(CT)是一種已知的具有降低血鈣活性的的肽類激素，并且是從哺乳動(dòng)物甲狀腺，或鳥(niǎo)和魚類等非哺乳類脊椎動(dòng)物的后腮體分泌的。根據(jù)其不同來(lái)源，降鈣素的氨基酸序列差異很大。天然來(lái)源的降鈣素，例如鰻魚、鮭魚、高等哺乳動(dòng)物和人來(lái)源的降鈣素都是具有酰胺化羧基末端，并且在第1和7位的半胱氨酸殘基之間具有一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵的，由32個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽。
在某些脊椎動(dòng)物體內(nèi)，成骨細(xì)胞的活性是受全身性激素間的復(fù)雜相互作用，以及局部生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的生成調(diào)節(jié)的。降鈣素通過(guò)與破骨細(xì)胞上的特異性降鈣素受體結(jié)合來(lái)抑制骨吸收，以降低由骨釋放到血清中的鈣量，維持成年動(dòng)物和人體內(nèi)的骨吸收與骨形成間生理平衡[The Calcitonin-Physiology and Pharmacology,Azriaed.,Karger,Basel,1989]。鑒于降鈣素的這種對(duì)骨吸收的抑制作用，人們?cè)噲D開(kāi)發(fā)并使用降鈣素作為治療骨質(zhì)疏松及其他以骨骼內(nèi)鈣質(zhì)降低為特征的疾病的藥物。CT同時(shí)還表現(xiàn)其他一些生理學(xué)活性，例如在熱板法疼痛實(shí)驗(yàn)中CT可延長(zhǎng)疼痛的潛伏期，具有抗感受傷害的能力。臨床應(yīng)用也表明CT對(duì)骨痛等具有鎮(zhèn)痛作用；此外，CT對(duì)內(nèi)分泌細(xì)胞的作用類似于生長(zhǎng)激素抑制因子，其能維持進(jìn)食后甲狀旁腺激素的分泌，并表現(xiàn)有抑制胃腸道激素的分泌和抗?jié)兊淖饔肹Copp,D.H.et al,是Clin.Invest.Med.17(3):268-277(1994)]。
目前已知的臨床應(yīng)用效果表明，鮭魚降鈣素(sCT)用于抑制骨吸收治療骨質(zhì)疏松明顯優(yōu)于人降鈣素(hCT)。這可能是由于鮭魚降鈣素具有較強(qiáng)的抗蛋白水解酶能力作用和較低的代謝清除率，并對(duì)骨細(xì)胞受體有更高的親和力[Marx et al.Science 178:998-1001,1972]。然而當(dāng)長(zhǎng)期使用鮭魚降鈣素時(shí)，有可能使宿主產(chǎn)生抗這種異源蛋白質(zhì)的抗體，從而限制了其臨床應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有下列結(jié)構(gòu)通式(1)的降鈣素類似物或其醫(yī)藥上可接受的鹽
其中R1代表選自Val,Ile,n-Leu,D-Leu,D-Val,D-Ile，鳥(niǎo)氨酸，γ-氨基丁酸中的1或2個(gè)疏水性氨基酸；R2和R3代表選自Leu,Val,Ile,n-Leu,D-Leu,D-Val,D-Ile中的任何一種氨基酸；hCT(13-32)代表人降鈣素一級(jí)結(jié)構(gòu)的第13至32位氨基酸；R4代表-NH2或-OH。
本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供一種提高了降血鈣活性和/或延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期，并降低了免疫原性的新的人降鈣素類似物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說(shuō)的降鈣素類似物與人降鈣素具有90％以上的同源性。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說(shuō)的降鈣素類似物是以肽的化學(xué)合成方法制備的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說(shuō)的降鈣素類似物是以重組DNA技術(shù)制備的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含上述降鈣素類似物的藥物組合物，其中所說(shuō)的藥物組合物含有作為基本活性成分的上述任何一種降鈣素類似物和一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述藥物組合物在降低包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的血清鈣，以及在制備用于治療骨代謝和鈣代謝相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所說(shuō)的生物活性肽選自下列肽
本發(fā)明的合成肽是天然人降鈣素氨基酸序列的修飾產(chǎn)物，旨在改變天然人降鈣素的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使其結(jié)構(gòu)更加緊密；改變肽鏈中的個(gè)別氨基酸，從而增加整個(gè)肽分子的親脂性和疏水性，并降低天然序列可能存在的免疫原性。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”，除了指人降鈣素本身所固有氨基酸外，還包括D-型氨基酸和非天然的、合成的氨基酸以及被修飾的氨基酸，如鳥(niǎo)氨酸、正亮氨酸及γ-氨基丁酸。
本發(fā)明提供提高了降血鈣活性和/或延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期并降低了免疫原性的，具有如上所示結(jié)構(gòu)通式的降鈣素類似物及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有上述人降鈣素類似物的藥物組合物，及其在預(yù)防和治療骨代謝和/或鈣代謝障礙相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
我們利用大鼠骨質(zhì)疏松模型所做的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與目前臨床上普遍使用的并具有強(qiáng)的降血鈣活性的鮭魚降鈣素相比，本發(fā)明的降鈣素亦具有類似的、提高了的降血鈣和促進(jìn)鈣離子在骨組織中沉積的活性。另外，本發(fā)明的降鈣素與天然存在的人降鈣素至少有90％以上的同源性，從而顯著降低了長(zhǎng)期使用后可能造成的免疫原性。再者，由于本發(fā)明的降鈣素類似物不僅保留了天然脊椎動(dòng)物來(lái)源的降鈣素分子中的二硫鍵，而且由于在肽序列中加入了一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈較大的天然的和/或非天然的疏水性氨基酸如Leu,Ile,D-Leu，從而提高了分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗蛋白酶解能力，延長(zhǎng)了其在體內(nèi)半衰期。
盡管目前對(duì)降鈣素的結(jié)構(gòu)與功能的確切關(guān)系尚不完全清楚，但普遍認(rèn)為各物種來(lái)源的，包括人來(lái)源的降鈣素的生物活性主要取決于該肽分子的氨基酸序列、與其受體的親和力、以及其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗蛋白水解的能力[Marx et al.Science 178:998-1001,1972]。Guttmann等人的研究結(jié)果顯示，幾乎降鈣素分子中的所有氨基酸殘基都與其生物活性直接相關(guān)。N端第1位和第7位兩個(gè)半胱氨酸間的分子內(nèi)二硫鍵和C末端的脯胺酰胺及兩末端間的相互聯(lián)系也是維持分子的生物活性必不可少的。例如，除去C末端的脯胺酰胺或C端幾個(gè)氨基酸殘基、或C末端的羧基化均可導(dǎo)致降鈣素活性的降低，甚至完全喪失。
研究結(jié)果表明，分子內(nèi)二硫鍵的存在對(duì)整個(gè)分子的生物學(xué)活性顯然具有完全不同的作用。切斷人降鈣素分子內(nèi)的二硫環(huán)，或者以化學(xué)修飾法改變第1和7位上的半胱氨酸，以形成不帶二硫鍵的降鈣素類似物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所得產(chǎn)物幾乎完全失去了降血鈣活性。但經(jīng)同樣方法修飾的鮭魚降鈣素(sCT)則仍保留有較強(qiáng)的活性。因此有理由推測(cè)，就降鈣素的生物活性來(lái)說(shuō)，起決定作用的因素是分子中的固有氨基酸序列及其特定結(jié)構(gòu)，而二硫環(huán)則可能只對(duì)CT構(gòu)象起到限制作用。hCT的構(gòu)象柔性較大，斷開(kāi)二硫環(huán)后構(gòu)象柔性更大，因此活性降低明顯；而sCT的構(gòu)象剛性較大，斷開(kāi)二硫環(huán)后對(duì)肽的總體結(jié)構(gòu)影響不大，相反還可能更有利于形成剛?cè)嵯酀?jì)的，有利于CT分子與其受體的結(jié)合構(gòu)象，因此其活性不僅沒(méi)有喪失，反而還有所提高[Epand，D.M.et al.J.Med.Chem.31:1595-1598,1988]。
顯然，與鮭魚降鈣素相比，人降鈣素的分子構(gòu)象具有更大的柔性。因此我們?cè)O(shè)想，如果用具有較大疏水性并且具有較小柔曲性的氨基酸取代hCT的個(gè)別固有氨基酸，或加入或插入具有相似結(jié)構(gòu)特征的氨基酸，便有可能在基本保留人降鈣素原有的氨基酸序列的前提下，適當(dāng)提高分子N端的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)及其剛性和穩(wěn)定性。從而將有可能獲得結(jié)構(gòu)上的剛?cè)峤Y(jié)合的，并提高了與受體之結(jié)合能力的，且氨基酸序列基本上與人降鈣素相同并具有更大降血鈣活性的生物活性肽。事實(shí)上Epand等人[Epand,R.M.et al.Biochemistry 25:1964-1968(1986)]的早期研究結(jié)果也已顯示，降鈣素總體肽鏈構(gòu)象的剛性柔性的適當(dāng)結(jié)合對(duì)其生物學(xué)活性可能起到主要作用。
基于上述考慮，本發(fā)明人探素性地合成了結(jié)構(gòu)通式(1)的新的肽，結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)通式(1)的肽表現(xiàn)有明顯高于天然人降鈣素的降血鈣活性和促進(jìn)骨組織中鈣沉積的活性，其活性接近于鮭魚降鈣素。有關(guān)生物學(xué)活性的方法及相應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)下文實(shí)施例3和4。
另外，由于本發(fā)明的肽具有與天然存在的人降鈣素序列基本相同的結(jié)構(gòu)，所以可望大大降低在使用鮭魚降鈣素情況下可能存在的免疫原性，從而將顯著提高本發(fā)明的降鈣素類似物的臨床應(yīng)用價(jià)值。
可使用常規(guī)肽化學(xué)合成技術(shù)，以固相法或液相方法合成本發(fā)明的降鈣素類似物，但較好是使用固相合成方法(例如參見(jiàn)Birr,C.,Aspect of the Merrifield PeptideSynthesis,Springer-Verlag,Heidelberg,1978；Stewart et al.,Solid PhasePeptide Synthesis,2nd.ed.,Pierce Chem.Co.,Rockford,Il,1984；Barany,G.and Merrifield R.B.in The Peptides,Vol.2；Gross,E.& Meienhoffer J.,eds.,Academic Press,New York,pp3-284,1979)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，首先按照已設(shè)計(jì)好的和給定的氨基酸序列，利用適當(dāng)?shù)幕罨瘎┖涂s合劑將經(jīng)適當(dāng)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的肽鏈C末端氨基酸殘基連接到固相載體上。根據(jù)連接的氨基酸的不同，可選擇使用各種不同的用于肽合成的固相載體，例如包括但不只限于二乙烯苯交聯(lián)的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺樹(shù)脂、Kiseselguhr聚酰胺、控制孔徑的玻璃纖維或小珠、纖維素、聚丙烯膜和丙烯酸包被的聚苯乙烯載體等。
可根據(jù)目的肽的序列特征選用適當(dāng)?shù)臉?shù)脂載體及合成系統(tǒng)。例如，可在Fmoc系統(tǒng)中使用對(duì)酸敏感的樹(shù)脂。為此，優(yōu)選的固相載體包括二乙烯苯交聯(lián)的聚丙烯樹(shù)脂，不同功能形式的這類樹(shù)脂包括氯甲基樹(shù)脂、羥甲基樹(shù)脂、對(duì)位乙酰氨甲基樹(shù)脂、二苯甲胺(BHA)樹(shù)脂、4-甲基二苯甲胺(MBHA)樹(shù)脂、4-(2′,-4′-二甲氧基苯基氨甲基)-苯氧基甲基樹(shù)脂、2,4-二甲氧基苯甲氨胺樹(shù)脂及(2,4-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰-MBHA樹(shù)脂(即Rink Amide MBHA樹(shù)脂)。因?yàn)?-氯代三苯甲基不需要強(qiáng)烈的酸水解，并且其可對(duì)抗Aib-Pro鍵的裂解，所以該樹(shù)脂被用作優(yōu)選的酸敏感性樹(shù)脂。本發(fā)明特別優(yōu)選的α-氨基酸的保護(hù)基團(tuán)是9-笏甲氧羰?；?Fmoc)保護(hù)基團(tuán)。
當(dāng)使用Fmoc系統(tǒng)進(jìn)行固相合成時(shí)，可適當(dāng)選用下列被保護(hù)的氨基酸殘基Fmoc-Cys(Trit),Fmoc-Asn,Fmoc-Ser(But),Fmoc-Leu,Fmoc-Thr(But),Fmoc-Val,Fmoc-Gly,Fmoc-Lys(Boc),Fmoc-Gln,Fmoc-Glu(OBut),Fmoc-His(Trit),Fmoc-Tyr(But),Fmoc-Arg(PMC)和Fmoc-Pro。當(dāng)使用Boc系統(tǒng)進(jìn)行固相合成時(shí)，可適當(dāng)選用下列被保護(hù)的氨基酸殘基Boc-Cys(4-Mzl),Boc-Lys(ClZ),Boc-His(Bom),Boc-Asp(OCHex),Boc-Thr(Bzl),Boc-Ser(Bzl),Boc-Pro,Boc-Trp(CHO)。
可使用肽化學(xué)合成領(lǐng)域內(nèi)已知的各種偶聯(lián)劑和偶聯(lián)方法偶聯(lián)各氨基酸殘基，例如可使用二異丙基碳二亞胺(DIC)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)進(jìn)行直接偶聯(lián)，或通過(guò)活性酯例如五氟苯酯，或使用Fmoc-氨基酸-羧酸酐?？梢允褂昧u基苯駢三氮唑(HOBt)或7-氮雜羥基苯駢三唑(HOAt)或用2-(1H-苯駢三唑-1-基)，1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)活化氨基酸。
可以用手工方法合成儀完成上述人降鈣素類似物多肽的合成，但為方便起見(jiàn)，最好使用可從市場(chǎng)上購(gòu)得的多肽自動(dòng)合成儀，例如由Applied Biosystems公司生產(chǎn)的ABI 430A型或ABI 431A型肽。在Fmoc合成系統(tǒng)中，首先將C端第一個(gè)氨基酸(C端Fmoc-Pro)裝在含Rink Amide MBHA樹(shù)脂的反應(yīng)器中，用20％六氫吡啶/二甲基甲酰胺(DMF)室溫處理30分鐘，以除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，并按照給定的氨基酸序列由C端逐個(gè)向N端延伸。其中用Fmoc保護(hù)各種氨基酸的α-氨基。各氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基分別為Cys用三苯甲基(Trt)保護(hù)；Ser和Thr用叔丁基(But)保護(hù)；Asp用叔丁基(But)保護(hù)；Lys用Boc保護(hù)；His用Trt保護(hù)。使用HOBt和DCC活化各氨基酸的羧端，并完成氨基酸分子間的縮合。
合成完成后，用含有或不含還原劑(如巰基乙醇)的三氟乙酸水溶液將合成的降鈣素類似物肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)并去除各保護(hù)基?？捎眠^(guò)濾法或乙醚沉淀法分離得到粗肽。將所得產(chǎn)物的溶液凍干后，用凝膠過(guò)濾或反相高壓液相層析法純化所需的肽。
在Boc保護(hù)系統(tǒng)的固相合成中，典型的是使用MBHA樹(shù)脂。不同的是用Boc保護(hù)各種氨基酸α-氨基。氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)分別是Cys用4-甲基芐基(4-Mzl)；Lys用氯芐氧羰(Cl-Z)保護(hù)ε-氨基；Asp用環(huán)己己烷(OCHex)保護(hù)γ-羧基；Thr和Ser均用芐基(Bzl)保護(hù)側(cè)鏈羥基；His用甲氧基(Bom)保護(hù)咪唑基。在去保護(hù)、中和、偶聯(lián)的循環(huán)中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保護(hù)基團(tuán)(Boc)并用二異丙基乙胺(DIEA)/二氯甲烷中和。肽鏈縮合完成后，用含對(duì)甲酚(5-10％)的氟化氫(HF)，在0℃下處理1-2小時(shí)，將肽鏈從樹(shù)脂上切下，同時(shí)除去所有保護(hù)基團(tuán)。以50％-80％乙酸(含少量巰基乙醇)抽提肽，并進(jìn)行多肽的氧化。凍干后進(jìn)一步用分子篩Sephadex G10或Tsk-40f分離純化，然后再經(jīng)高壓液相色譜C8柱純化，得到HPLC純的人降鈣素類似物肽。
可用已知方法將按上述方法以重組DNA技術(shù)制得的人降鈣素類似物肽制成其醫(yī)藥上可接受的鹽，特別是堿加成鹽。例如，可按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，用適當(dāng)?shù)膲A處理這些肽，制得酸性氨基酸的堿加成鹽。
如前所述，本發(fā)明的人降鈣素類似物具有顯著的降血鈣活性，其降低血清鈣含量的作用類似于目前臨床上普遍使用的鮭魚降鈣素。而且，與人降鈣素相比，本發(fā)明的人降鈣素類似物具有進(jìn)一步提高了的促進(jìn)血清鈣在骨組織中沉積，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，以及改善骨質(zhì)疏松的活性。由于本發(fā)明的降鈣素類似物與天然人降鈣素至少有90％以上的同源性，從而顯著地降低了長(zhǎng)期使用后可能造成的免疫原性。再者，由于本發(fā)明的降鈣素類似物不僅保留了脊椎動(dòng)物來(lái)源的降鈣素分子中的二硫鍵，而且由于在肽序列中加入了一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈較大的疏水氨基酸如Leu,Ile,D-Leu等天然或非天然氨基酸，從而明顯提高了分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和在體內(nèi)的半衰期。
基于這些優(yōu)點(diǎn)，可望將本發(fā)明的降鈣素類似物制成以該肽為基本活性成分的藥物組合物，用于治療和預(yù)防諸如骨質(zhì)疏松、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、骨軟化、變形性骨炎(Paget氏病)、特發(fā)性低鈣血癥及其他血清鈣吸收和利用障礙等相關(guān)性疾病或病理狀態(tài)。此外，本發(fā)明的降鈣素類似物亦可用于治療某些急性胰腺炎和胃腸道潰瘍，以及用作鎮(zhèn)痛劑，例如用于治療骨痛。
可按制藥領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，將本發(fā)明的人降鈣素類似物制成適合臨床上特定給藥方式的藥物組合物。例如可在本發(fā)明的降鈣素類似物中加入適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋劑，如水、生理鹽水、等滲葡萄糖溶液以制成可經(jīng)胃腸道以外途徑給藥的溶液劑、注射劑、乳劑、滴鼻劑、滴眼劑。也可加入淀粉、乳糖、滑石粉、蔗糖、葡萄糖或甘油、液體石蠟、脂質(zhì)體或明膠等賦形劑或載體，將本發(fā)明的降鈣素類似物制成可經(jīng)胃腸道途經(jīng)給藥的栓劑、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑或脂質(zhì)體包裹劑。這些制劑中除含有活性成分和適當(dāng)?shù)妮d體或賦形劑外，還可根據(jù)需要添加其他一些輔助成分，例如一種或多種稀釋劑、填充劑、乳化劑、防腐劑、表面活性劑、吸收促進(jìn)劑、緩沖劑、香味劑及著色劑。
基于上述這些優(yōu)點(diǎn)和下文實(shí)施例3和4中詳細(xì)舉例描述的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，預(yù)期可將本發(fā)明的人降鈣素類似物肽或其鹽或含有這些肽或其鹽的藥物組合物用于治療骨質(zhì)疏松、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、骨軟化、變形性骨炎、特發(fā)性低鈣血癥及其他骨吸收增強(qiáng)或新骨形成障礙等相關(guān)的疾病或病理狀態(tài)。此外，本發(fā)明的降鈣素類似物亦可用于抑制胃液分泌，治療急性胰腺炎和胃腸道功能紊亂，并可用作鎮(zhèn)痛劑，特別是用作骨痛治療劑。
本發(fā)明的藥物組合物的用量將取決于待治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、病人的體重、一般健康狀況、給藥途徑等多種因素。一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明藥物組合物的用量每天每公斤體重大約0.1至10國(guó)際單位(IU)，較好為0.5-5IU。
可通過(guò)各種常規(guī)給藥途徑使用本發(fā)明的藥物組合物，例如可經(jīng)胃腸道內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、直腸內(nèi)、眼內(nèi)等途徑給藥，但其中優(yōu)選的給藥途徑是肌肉內(nèi)注射、鼻噴霧或口服給藥。


圖1顯示骨質(zhì)疏松模型大鼠在投用給hCT類似物，sCT及生理鹽水3個(gè)月后，以骨密度掃描法測(cè)得的動(dòng)物腰椎和股骨脛的骨密度值。
圖2是用透射電鏡觀察到的投用生理鹽水3個(gè)月后大鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的處于退變相的骨細(xì)胞照片。
圖3是用透射電鏡觀察到的投用hCT類似物3個(gè)月后大鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的處于成骨相的骨細(xì)胞照片。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明實(shí)施例1使用Boc系統(tǒng)的制備實(shí)例(1)用Boc系統(tǒng)合成下列結(jié)構(gòu)(2)hCT肽類似物
將起始MBHA樹(shù)脂(1g,0.5mmol)裝于ABI430自動(dòng)多肽合成儀反應(yīng)器中，按下表所示步驟由C端向N端縮合各個(gè)被保護(hù)的氨基酸。每一步反應(yīng)完成后，經(jīng)氮?dú)庹龎鹤饔眠^(guò)濾從樹(shù)脂上除去各試劑。其中C端第一個(gè)被保護(hù)氨基酸Boc-Pro與樹(shù)脂的縮合反應(yīng)按下表中第5～14步驟進(jìn)行，其余氨基酸的縮合均按第1～14步驟進(jìn)行。
(2)肽鏈樹(shù)脂的氟化氫(HF)切割反應(yīng)將干燥的肽鏈樹(shù)脂(1g)和對(duì)甲酚(1ml)置于反應(yīng)器中。于容器外置干冰/乙醇冷浴冷卻，并收約集20ml液態(tài)HF，然后在冰浴下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，移去冰浴，于真空下蒸發(fā)除去HF。向反應(yīng)器內(nèi)加入無(wú)水乙酸乙酯(含少量巰基乙醇)將樹(shù)脂洗三次(每次30ml)，然后濾去試劑。用50％乙酸抽提粗肽2次(每次5ml)。合并所得濾液，用100ml去離子水稀釋后進(jìn)行冷凍干燥以去除溶劑。
(3)去保護(hù)的hCT類似物粗肽的氧化反應(yīng)稱取凍干的hCT類似物粗肽50mg，溶解于蒸餾水(pH6.0-7.5)中，至肽的終濃度為約為0.2～0.4mg/ml。緩慢攪拌并自然氧化24小時(shí)后，冷凍干燥所得樣品。
(4)hCT類似物粗肽的純化稱取上述氧化產(chǎn)物40mg，溶于1ml 1N乙酸中，將所得溶液過(guò)Sephadex G10柱(2.0×25cm),1N乙酸洗脫以脫鹽。收集全排峰后進(jìn)行冷凍干燥，得脫鹽粗品33mg。進(jìn)一步將所得脫鹽品過(guò)高壓液相反向?qū)游鲋鵅eckman Octyl C8,10mm×25cm。收集主峰，合并后真空除去乙腈，并冷凍干燥。純化后的樣品純度達(dá)95％以上，氨基酸組成分析及質(zhì)譜分析結(jié)果均符合理論值。
實(shí)施例2使用Fmoc系統(tǒng)的制備實(shí)例(1)用Fmoc系統(tǒng)合成有下示結(jié)構(gòu)(3)的人降鈣素類似物
將起始Rink Amide MBHA樹(shù)脂(1g,0.45mmol)裝于30ml小瓶?jī)?nèi)，并用DCM處理30分鐘。按下表所示步驟由C端向N端逐個(gè)縮合各被保護(hù)的氨基酸，每步反應(yīng)完成后，經(jīng)負(fù)壓作用過(guò)濾去除各試劑，并使之與肽樹(shù)脂分離。其中C端第一個(gè)被保護(hù)的氨基酸Fmoc-Pro與樹(shù)脂的縮合反應(yīng)按下表中步驟1～15進(jìn)行。其余氨基酸縮合均按步驟1～15進(jìn)行。
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每個(gè)氨基酸縮合反應(yīng)平均進(jìn)行約2小時(shí)。每進(jìn)入下一個(gè)氨基酸縮合循環(huán)前用茚三酮法測(cè)定游離氨基以確定縮合是否完全。按上述反應(yīng)步驟由C端氨基酸逐個(gè)向N端延伸肽鏈結(jié)束后得到目的肽鏈樹(shù)脂，將樹(shù)脂從反應(yīng)器中移出后進(jìn)行真空干燥。
(2)肽鏈樹(shù)脂的TFA切割反應(yīng)將干燥的肽樹(shù)脂(0.5g)和間甲苯酚(0.5ml)置反應(yīng)器中并在冰浴中預(yù)冷30分鐘。加入0.5ml水，9mlTFA在冰浴條件下攪拌反應(yīng)1小時(shí)。濾去反應(yīng)液，由少量TFA將殘余樹(shù)脂洗三次，再用DCM洗三次，然后合并濾液。真空抽氣蒸發(fā)除去DCM和TFA。待液體基本抽干成粘稠狀時(shí)，加入預(yù)冷的乙酸乙酯，迅速振搖后逐漸析出固體形式粗肽并離心沉淀之。
粗品進(jìn)一步的氧化和純化方法同實(shí)施例1中(3)和(4)。
實(shí)施例3人降鈣素類似物的生物學(xué)鑒定按照已建立的方法[Xue JZ,et al.Chinese Journal of Medical LaboratoryTechnology,1984,7(3):147]檢測(cè)本發(fā)明的人降鈣素類似物的降血鈣活性。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為體重約100g的Wistar大鼠。并將動(dòng)物隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(各10只)，并在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前隔夜饑餓18小時(shí)。將用實(shí)驗(yàn)組的人降鈣素類似物結(jié)構(gòu)(3)和用于對(duì)照組的鮭魚降鈣素(sCT)分別溶解于pH4.0的醋酸中，配成濃度范圍從0.01ug/ml至100ug/ml的溶液。按給藥劑量0.05ug/kg至1ug/kg經(jīng)腹腔注射給藥1小時(shí)后，眼眶取血并測(cè)定動(dòng)物的血鈣值。通過(guò)計(jì)算使大鼠血清鈣離子水平降低10％所用的降鈣素量(ug/kg)來(lái)估計(jì)本發(fā)明hCT類似物的降血鈣能力。下表顯示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物用藥后血清Ca2+濃度的變化。
實(shí)施例4本發(fā)明的人降鈣素類似物對(duì)骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物的治療作用(1)給平均體重250g的雄性大鼠(SD)，喂食半年低鈣食物(Ca:0.1％,P:0.6％)，并比較喂食低鈣食物前和喂食低鈣食物后的大鼠股骨脛處骨密度值和腰椎處骨密度值BMD(gms/cm2)。結(jié)果顯示低鈣飲食前和后的動(dòng)物骨密度值有顯著差異(P＜0.01)，故成功地建立了用于本實(shí)驗(yàn)的大鼠骨質(zhì)疏松模型。
(2)上述平均體重400g的骨質(zhì)疏松大鼠均喂食正常食物(Ca:1.1％,P:1.1％)，隨機(jī)分成三組(10只)，分別為注射生理鹽水組、注射hCT-1組和注射sCT組。其中hCT-1用量為每只大鼠0.1ug/kg,sCT用量為每只大鼠0.04ug/kg。進(jìn)行皮下隔天注射。90天后，比較各組大鼠股骨脛處骨密度值和腰椎處骨密度值BMD(gms/cm2)，分別記作R1和R2值(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥組骨密度均比對(duì)照組有顯著改善，且hCT-1組的骨密度值與sCT相近。透射電鏡觀察可見(jiàn)，生理鹽水對(duì)照組動(dòng)物的骨細(xì)胞多處于退變相，胞核固縮，核/漿比例大，出現(xiàn)較多空泡，胞質(zhì)減少，陷窩間絮狀物增多，陷窩壁有嗜鋨板層(圖2)。而hCT-1給藥組動(dòng)物的骨細(xì)胞則多處于成骨相細(xì)胞，胞質(zhì)豐富，核/漿比例小且陷窩間隙小(圖3)。
權(quán)利要求
1．本發(fā)明的人降鈣素類似物，其具有下列結(jié)構(gòu)通式的肽或其醫(yī)藥上可接受的鹽
其中R1代表選自Val,Ile,n-Leu,D-Leu,D-Val,D-Ile，鳥(niǎo)氨酸，γ-氨基丁酸中的1至2個(gè)疏水性氨基酸；R2,R3各自代表選自Leu,Val,Ile,n-Leu,D-Leu，D-Val或D-Ile的氨基酸；hCT(13-32)代表人降鈣素一級(jí)結(jié)構(gòu)的第13至32位氨基酸；R4代表-NH2或-OH末端。
2．根據(jù)權(quán)利要求書1的人降鈣素類似物，特征在于其與人降鈣素肽有90％以上的同源性。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的人降鈣素類似物，特征在于所說(shuō)的肽類似物是以固相或液相肽化學(xué)合成技術(shù)制得的。
4．根據(jù)權(quán)利要求書1或2的人降鈣素類似物，特征在于所說(shuō)的肽類似物是以重組DNA技術(shù)制得的。
5．由作為基本成分的根據(jù)權(quán)利要求書1至4中任何一項(xiàng)的人降鈣素類似物和一種或多種載體和/或賦形劑組成的藥物組合物。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物在制備用于治療骨代謝和/或鈣代謝劑障礙、骨痛及相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組新的人降鈣素類似物肽和其醫(yī)藥上可接受的鹽,含有這些肽類似物的藥物組合物,以及該藥物組合物在預(yù)防和治療骨代謝紊亂相關(guān)的疾病中的應(yīng)用。與人降鈣素相比,本發(fā)明的降鈣素類似物明顯提高了降血鈣活性和抑制骨吸收活性,并且明顯降低了其在人體內(nèi)可能產(chǎn)生的免疫原性。
文檔編號(hào)A61P19/00GK1235980SQ98110839
公開(kāi)日1999年11月24日 申請(qǐng)日期1998年5月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月15日
發(fā)明者崔大敷, 俞超, 吳祥甫, 李伯良 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所