專利名稱：一種抗腫瘤生物制品及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制品，具體涉及一種抗腫瘤生物制品及其制備方法。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
腫瘤，特別是癌癥，是人類的大敵，每年都會奪去成千上萬人的生命。
癌癥的治療，是世界醫(yī)學(xué)的難題，因為腫瘤的病因復(fù)雜，種類多，機(jī)理又太難全面認(rèn)知，并因人類的個體差異，人種，地理，飲食，環(huán)境，遺傳及基因等影響，增加了癌腫治療的難度。通常早期腫瘤采用手術(shù)治療，輔以放療，化療等，有令人難以忍受的痛苦，而往往效果不理想，因為手術(shù)雖可切除病灶，但腫瘤生成的條件沒有改變，原因沒有消除，所以一般預(yù)后不佳，癌腫病人的死亡率還是很高的。
長期以來，人們致力于探索癌腫的發(fā)病機(jī)理。已可確認(rèn)的是，癌癥并不傳染，人體癌細(xì)胞僅僅是人體正常細(xì)胞的一種變異，正常情況下，癌細(xì)胞存在于幾乎每一個人的體內(nèi)。絕大多數(shù)的人并沒有得癌癥，那是因為人體正常的免疫系統(tǒng)制約了癌細(xì)胞的發(fā)展與轉(zhuǎn)化。只有那些免疫功能減弱，抵抗力受損時，癌腫沖破了機(jī)體原有的免疫防衛(wèi)屏障，才會得癌腫。由此可見，癌腫之所以得以形成與發(fā)展，與人體的免疫功能有著直接而且是根本的關(guān)系。因此，保持并加強(qiáng)人體免疫功能，特別是加強(qiáng)對腫瘤有特異免疫功能的細(xì)胞因子，才是腫瘤防治的積極，主動，而且是基本的有效方法。
在腫瘤治療方法上，曾經(jīng)采取過一種切取自身腫瘤組織，制成疫苗，再注射到自身機(jī)體中，即“細(xì)胞回輸法”。目的是企圖以本人的腫瘤抗原來刺激人體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異免疫細(xì)胞因子，增強(qiáng)自身免疫力。但效果并不很理想，因為得了癌腫的病人，其免疫系統(tǒng)已極度衰竭，不足以產(chǎn)生免疫反應(yīng)達(dá)到預(yù)期的目的。因此，以人體腫瘤為抗原，借助有強(qiáng)壯體魄的動物作為“生物反應(yīng)器”，作為病人的“替身”，刺激其免疫系統(tǒng)，使其產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，大量生產(chǎn)出能對抗這種特異抗原的抗體，反過來補(bǔ)充人體，才是完善“細(xì)胞回輸法”的根本出路。這種方法有很強(qiáng)的特異性，病人能獲得良好的治療，特別是手術(shù)后防治病人的抗復(fù)發(fā)與根治。
國際上，免疫食品，特別是免疫牛奶的研究已經(jīng)多年的探索與實踐。國內(nèi)971168466專利的免疫牛奶，是以人體甲肝，乙肝病毒，幽門螺旋桿菌(HP)疫苗去免疫奶牛，以取得抗甲肝，抗乙肝，抗HP的免疫牛奶，事實證明，這種免疫牛奶確有保健作用，特別是抗HP的免疫牛奶，投放市場后大量病例證明，對養(yǎng)胃護(hù)胃確有療效。
歐洲專利EPO 330521，EPO 143345，EPO 046909，EPO 395120，美國專利WO 93/25232等曾先后公告了一系列抗各種病菌的免疫牛奶，如抗葡萄球菌，沙門氏菌，鏈球菌，棒狀桿菌，放線桿菌，布魯氏菌，志賀氏桿菌，支原菌，芽孢梭菌等，對各種炎癥，高血壓，心血管病，肺部疾病，腸道疾病，狐臭，蛀牙，等有療效。然而，至今為止尚沒有人嘗試提出以人體腫瘤作抗原，對腫瘤組織表面抗原進(jìn)行異構(gòu)后，再去免疫動物，來制造具有特殊識別能力的抗腫瘤生物制品。
本發(fā)明的目的，是提供一種抗腫瘤生物制品。其特征為該制品是直接以人體腫瘤組織，對其表面抗原的蛋白質(zhì)進(jìn)行異構(gòu)，改變表面抗原的立體構(gòu)像，制作人體腫瘤特異抗原。對動物進(jìn)行免疫，借助有強(qiáng)壯體魄的動物作為“生物反應(yīng)器”，刺激其免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，大量生產(chǎn)出能對抗這種特異抗原的抗體，采用被免疫動物的免疫反應(yīng)高峰期的血制品或奶制品，生產(chǎn)具有特異性的免疫球蛋白和抗腫瘤細(xì)胞因子。
本發(fā)明的另一個目的，是提供上述抗腫瘤生物制品制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案主要包括如下步驟一、制作人體腫瘤組織特異抗原用建株的人體腫瘤組織，或腫瘤病人活檢時取下的少量腫瘤組織，進(jìn)行組織培養(yǎng)，或直接用手術(shù)后切除的腫瘤組織，剔除其中央壞死部分，取其外圍組織。收集其細(xì)胞培養(yǎng)物，以機(jī)械方法粉碎瘤塊，獲取其完整腫瘤細(xì)胞。也可取其腫瘤細(xì)胞表面膜蛋白抗原，以反復(fù)深凍法或超聲粉碎法進(jìn)行細(xì)胞破碎，以梯度離心法分離有效成份，用物理方法對其表面抗原的蛋白質(zhì)進(jìn)行異構(gòu)，改變表面抗原的立體構(gòu)像，制作人體腫瘤組織特異抗原。
二、以人體腫瘤特異抗原對動物進(jìn)行免疫A、對動物的選擇，可以是雄性，也可以是雌性(將來取其乳制品)，被選的動物身體健康，體魄強(qiáng)壯，對免疫有敏感的反應(yīng)力。
B、人體腫瘤組織特異抗原進(jìn)行復(fù)合，制作復(fù)合疫苗，同時擴(kuò)展分子量，將幾種抗原聚合成大分子顆粒，激發(fā)巨噬細(xì)胞吞噬，增強(qiáng)免疫作用。然后以“復(fù)合疫苗-多次免疫疫苗注射法”對動物進(jìn)行免疫。
C、對動物進(jìn)行基礎(chǔ)免疫。對復(fù)合疫苗加進(jìn)完全佐劑，以油性的佐劑研磨水性的抗原，實現(xiàn)油包水，佐劑本身也是免疫誘出劑，以此方法對奶牛進(jìn)行基礎(chǔ)免疫學(xué)處理，此階段約30-60天。如此階段基礎(chǔ)免疫后的效價檢測始終不理想，則認(rèn)定此動物的個體差異，對免疫反應(yīng)不敏感，只能淘汰。然后對有正常免疫反應(yīng)的動物繼續(xù)進(jìn)行免疫，可以逐步轉(zhuǎn)入單一腫瘤抗原的正常免疫。
三、對動物免疫的免疫反應(yīng)高峰期的測定對動物免疫進(jìn)入正常免疫后，一般采用7-15天為一周期?？梢詼y定一個周期的免疫效價，制作效價曲線，找出高峰期。檢測可以采用酶標(biāo)法(ELISA)，檢測其免疫效價OD值也可采用流式細(xì)胞檢測儀(CELL SORTOR)，比較其巨噬細(xì)胞，NK，TK，IL-2等細(xì)胞的增減狀態(tài)；以及其它方法進(jìn)行檢測。
四、制備被免疫動物的免疫反應(yīng)高峰期產(chǎn)品確定了動物的免疫反應(yīng)高峰期，可以在反復(fù)免疫反應(yīng)高峰期采用定期放血，取其血清，以現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)分離其有效成份，制成輸液制品或口服制品；也可以在免疫反應(yīng)高峰期采用定期取奶方式，根據(jù)需要按比例直接稀釋制成口服產(chǎn)品。
使用抗腫瘤生物制品的方法在病人進(jìn)行治療的初期，應(yīng)采用高效價的制品對病人進(jìn)行治療。在病情基本穩(wěn)定后，根據(jù)醫(yī)囑，應(yīng)逐步采用增加稀釋比例，降低效價，最終在效價與同類食品效價之比穩(wěn)定在1.2-1.5左右，可供病人長期使用。達(dá)到既增加人體免疫功能，鞏固治療效果，又不至于導(dǎo)致反饋抑制人體正常機(jī)理，使人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生依賴性，反而降低人體防病抗病能力。
本發(fā)明的抗腫瘤生物制品有明顯的抗腫瘤作用以Balb/C小白鼠(中英合資LB公司提供)分三組，每組10只，A組普通飲食，B組服食普通牛奶，C組服食免疫高峰期的抗腫瘤免疫牛奶并注射免疫血清。5天后三組同樣條件接種7721癌細(xì)胞約106只。接種期三組飲食與條件照舊。二周后三組同時解剖，發(fā)現(xiàn)A，B組無一例外均生長癌腫，C組中有二只基本沒有腫瘤，三只僅有輕微癌變，三只生長癌腫，但大小較A，B組小1/3-1/5左右，只有二只與A，B組結(jié)果相似。
以市售1640培養(yǎng)液各加進(jìn)5-10％正常牛血清與免疫高峰期的牛血清。然后同等條件培養(yǎng)SMMC-7721建株癌細(xì)胞(上海第二軍醫(yī)大學(xué)提供)，可發(fā)現(xiàn)正常牛血清中癌細(xì)胞正常分裂成長，而免疫高峰期牛血清中癌細(xì)胞對數(shù)生長曲線明顯減緩本發(fā)明的抗腫瘤生物制品與一般免疫制劑，如胎盤球蛋白，人血白蛋白等不同，本制品因為是天然生成的，不是以化學(xué)方法或人工方法合成或添加的，因此是相當(dāng)安全的，其有效成份完整地受到牛奶中其它成份保護(hù)，能禁受胃酸與胃蛋白酶的分解，安全經(jīng)過胃部，在腸部被人體吸收，達(dá)到增強(qiáng)人體免疫功能的作用。
本發(fā)明以人體的腫瘤組織制作抗原，以動物作替身，設(shè)定動物的免疫系統(tǒng)為“生物反應(yīng)器”，利用動物的強(qiáng)壯體魄與強(qiáng)大的免疫功能，生產(chǎn)的特殊免疫球蛋白與活性細(xì)胞因子，有很強(qiáng)的特異性，能有效地鎖定腫瘤的起動基因，直接消除了腫瘤生成的病灶，根本改變了腫瘤發(fā)展的條件。是一種積極，主動，有效的方法，特別是對手術(shù)后抗復(fù)發(fā)的腫瘤病人，療效比其它方法更為顯著。
本發(fā)明方法簡便，成本低廉，能為一般患者接受，容易普及推廣。
本發(fā)明可以是以喝牛奶的方式實現(xiàn)，沒有毒副作用，而且富有營養(yǎng)，能增強(qiáng)體質(zhì)，保證了病人順利恢復(fù)。
實施例(肝癌病人)在無菌條件下完成下列步驟，以制備腫瘤抗原。
取下肝癌病人手術(shù)后的腫瘤組織，用剪刀去除壞死組織，用生理鹽水洗干凈。
在200目的慮網(wǎng)上，用剪刀將腫瘤組織剪碎，在反復(fù)剪碎的過程中，不斷以少量生理鹽水淋洗，收集腫瘤細(xì)胞。
將收集到的腫瘤細(xì)胞以1000RPM離心，棄上清液。
冰浴，以超聲破壁，8000RPM離心，取上清液。
以紫外分光光度計檢測蛋白含量，用以下公式計算濃度C(mg/ml)＝1.45×OD280-0.47×OD260加入等量甘油分裝，置-20℃?zhèn)溆谩?br> 以200-300Ug腫瘤抗原，加適量水楊酸，鎂鹽，于羊毛脂石臘油中研磨，制成復(fù)合疫苗完全佐劑。
于被免疫奶牛之頸部頸錐兩邊分3-4點皮下注射復(fù)合疫苗完全佐劑，隔十天再進(jìn)行一次，進(jìn)行3次后休息45天左右，進(jìn)入正常免疫階段，直接以腫瘤疫苗100-200Ug注射。每十天一次。
第二次正常免疫后，在一周期內(nèi)進(jìn)行峰值檢測，可發(fā)現(xiàn)峰值期出現(xiàn)在第八，九，十天，總共約為三天。如不出現(xiàn)峰值期，則只好淘汰此牛。
峰值期以酶標(biāo)法檢測，可見明顯的顯色反應(yīng)。以流式細(xì)胞檢測儀檢測，可發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞，HK，TK等細(xì)胞數(shù)量明顯增加。
以市售1640培養(yǎng)液各加進(jìn)5-10％正常牛血清與免疫高峰期的牛血清。然后同等條件培養(yǎng)SMMC-7721建株癌細(xì)胞(上海第二軍醫(yī)大學(xué)提供)，可發(fā)現(xiàn)正常牛血清中癌細(xì)胞正常分裂成長，而免疫高峰期牛血清中癌細(xì)胞對數(shù)生長曲線明顯減緩以Balb/C小白鼠(中英合資LB公司提供)分三組，每組10只，A組普通飲食，B組服食普通牛奶，C組服食免疫高峰期的抗腫瘤免疫牛奶并注射免疫血清。5天后三組同樣條件接種7721癌細(xì)胞約10只。接種期三組飲食與條件照舊。二周后三組同時解剖，發(fā)現(xiàn)A、B組無一例外均生長癌種，C組中有二只基本沒有腫瘤，三只僅有輕微癌變，三只生長癌腫，但大小較A、B組小1/3-1/5左右，只有二只與A、B組結(jié)果相似。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤生物制品，其特征在于該制品是以人體腫瘤組織制作的抗原，對動物進(jìn)行免疫，利用被免疫動物的免疫反應(yīng)高峰期的血制品或奶制品，生產(chǎn)具有特異性的免疫球蛋白和抗腫瘤細(xì)胞因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤生物制品的制備方法，其特征在于該制備方法包括下列步驟一、制作人體腫瘤組織特異抗原用建株的人體腫瘤組織，或腫瘤病人活檢時取下的少量腫瘤組織，進(jìn)行組織培養(yǎng)，或直接用手術(shù)后切除的腫瘤組織，剔除其中央壞死部分，取其外圍組織，收集其細(xì)胞培養(yǎng)物，以機(jī)械方法粉碎瘤塊，獲取其完整腫瘤細(xì)胞，也可取其腫瘤細(xì)胞表面膜蛋白抗原，以反復(fù)深凍法或超聲粉碎法進(jìn)行細(xì)胞破碎，以梯度離心法分離有效成份，用物理方法對其表面抗原的蛋白質(zhì)進(jìn)行異構(gòu)，改變表面抗原的立體構(gòu)像，制作人體腫瘤組織特異抗原；二、以人體腫瘤特異抗原對動物進(jìn)行免疫A、對動物的選擇，可以是雄性，也可以是雌性(將來取其乳制品)，被選的動物身體健康，體魄強(qiáng)壯，對免疫有敏感的反應(yīng)力；B、人體腫瘤組織特異抗原進(jìn)行復(fù)合，制作復(fù)合疫苗，然后以“復(fù)合疫苗-多次免疫疫苗注射法”對動物進(jìn)行免疫C、對動物進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，對復(fù)合疫苗加進(jìn)完全佐劑，以油性的佐劑研磨水性的抗原，實現(xiàn)油包水，以此方法對奶牛進(jìn)行基礎(chǔ)免疫學(xué)處理，此階段約30-60天，然后對有正常免疫反應(yīng)的動物繼續(xù)進(jìn)行免疫，可以逐步轉(zhuǎn)入單一腫瘤抗原的正常免疫；三、對動物免疫的免疫反應(yīng)高峰期的測定對動物免疫進(jìn)入正常免疫后，一般采用7-15天為一周期?？梢詼y定一個周期的免疫效價，制作效價曲線，找出高峰期。檢測可以采用酶標(biāo)法(ELISA)，檢測其免疫效價OD值；也可采用流式細(xì)胞檢測儀(CELL SORTOR)，比較其巨噬細(xì)胞，NK，TK，IL-2等細(xì)胞的增減狀態(tài)；以及其它方法進(jìn)行檢測；四、制備被免疫動物的免疫反應(yīng)高峰期產(chǎn)品確定了動物的免疫反應(yīng)高峰期，可以在反復(fù)免疫的反應(yīng)高峰期采用定期放血，取其血清，再分離其有效成份，制成輸液制品或口服制品；也可以在免疫反應(yīng)高峰期采用定期取奶方式，根據(jù)需要按比例稀釋制成口服產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤生物制品的制備方法，其特征在于所用的被免疫動物為牛，羊，馬，駱駝及靈長類動物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤生物制品,該制品是以人體腫瘤組織制作的抗原,對動物進(jìn)行免疫,激發(fā)其強(qiáng)大的免疫反應(yīng),利用動物的強(qiáng)壯體魄,為病人生產(chǎn)具有特殊識別能力的免疫球蛋白和抗腫瘤細(xì)胞因子。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明產(chǎn)品特異性強(qiáng),療效顯著,對腫瘤防治有積極主動作用,且成本較低,副作用較小。
文檔編號A61K45/00GK1261541SQ9812288
公開日2000年8月2日 申請日期1998年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月29日
發(fā)明者黃河, 李徵, 孫培南 申請人:黃河