專利名稱：編碼新胞子蟲二氫葉酸還原酶－胸苷酸合成酶的dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物健康領(lǐng)域，涉及疫苗組合物和疾病診斷方法。更具體地說，本發(fā)明涉及含有編碼新胞子蟲(Neospora)二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶(DHFR-TS)蛋白的核苷酸序列的多核苷酸分子，該多核苷酸分子在抗新胞子蟲病(neosporosis)的疫苗生產(chǎn)中是很有用的，并可用作診斷試劑。
新胞子蟲是動(dòng)物的一種病原性原生動(dòng)物寄生蟲，已發(fā)現(xiàn)它是導(dǎo)致哺乳動(dòng)物流產(chǎn)、新生兒死亡、先天性感染和腦炎疾病的主要原因(Dubey和Lindsay,1996，獸醫(yī)寄生蟲學(xué),67:1-59；Dubey和Lindsay,1993，今日寄生蟲學(xué)，9:452-458)。N.caninum(Neospora caninum)可感染狗，并可先天性地感染小狗，通常會導(dǎo)致癱瘓。已經(jīng)從天然感染的小狗內(nèi)分離出了N.caninum的速殖體(Lindsay和Dubey,1989，寄生蟲學(xué)雜志，75:163-165)。新胞子蟲是導(dǎo)致奶牛場中牛流產(chǎn)的主要原因。在山羊、綿羊和馬中也已有新胞子蟲相關(guān)性疾病即新胞子蟲病病例的報(bào)道。
盡管N.caninum表面上看起來與病原鼠弓形體(Toxoplasmagondii)類似，但N.caninum與鼠弓形體在抗原性和超微結(jié)構(gòu)方面都互不相同(Dubey和Lindsay,1993，文獻(xiàn)同上)。另外，從流產(chǎn)的牛胎兒腦中分離出的并在體外持續(xù)培養(yǎng)的新胞子蟲樣原生動(dòng)物寄生蟲與鼠弓形體和Hammondia hammondi在抗原性和超微結(jié)構(gòu)方面都存在明顯差異，而與N.caninum最為相似(Conrad等，1993，寄生蟲學(xué)，106:239-249)。而且，對核小亞基核糖體RNA基因的分析結(jié)果表明分離自牛和狗的新胞子蟲株系之間無核苷酸差異，但新胞子蟲和鼠弓形體之間存在一致的差異(Marsh等，1995，寄生蟲學(xué)雜志，81:530-535)。
已經(jīng)證實(shí)新胞子蟲牛分離物在牛流產(chǎn)和先天性疾病中具有黃化作用(Barr等，1994，獸醫(yī)診斷與研究雜志，6:207-215)。利用感染有N.caninum的近交BALB/c小鼠已建立了中樞神經(jīng)系統(tǒng)新胞子蟲病的嚙齒類動(dòng)物模型(Lindsay等，1995，寄生蟲學(xué)雜志，81:313-315)。另外，分別由Cole等，1995，寄生蟲學(xué)雜志，81:730-732，及Long等，1996，寄生蟲學(xué)雜志，82:608-611描述了用于研究遠(yuǎn)交和近交孕鼠中N.caninum的跨胎盤傳播的模型。而且，已證實(shí)N.caninum矮小山羊?qū)嶒?yàn)?zāi)Ｐ团c天然獲得的新胞子蟲誘導(dǎo)性牛流產(chǎn)非常相似(Lindsay等，1995，美國獸醫(yī)研究雜志，56:1176-1180)。
在原生動(dòng)物如鼠弓形體和新胞子蟲中，已知必需的代謝酶類二氫葉酸還原酶(DHFR)和胸苷酸合成酶(TS)位于同一蛋白質(zhì)分子內(nèi)兩個(gè)不同的酶促結(jié)構(gòu)域即“DHFR結(jié)構(gòu)域”和“TS結(jié)構(gòu)域”中。據(jù)報(bào)道，鼠弓形體中DHFR和TS結(jié)構(gòu)域由一個(gè)約70個(gè)氨基酸的連接區(qū)所隔離(Roos,1993，生物化學(xué)雜志，162:6269-6280)。至少在一種寄生蟲種類中已將此雙功能蛋白質(zhì)用作缺失靶點(diǎn)以產(chǎn)生弱毒株系而用于活體疫苗中。因此，Titus等，1995，美國國家科學(xué)院院報(bào)，92:10267-10271描述了通過同源重組對來源于原生動(dòng)物寄生蟲大型利什曼原蟲的DHFR-TS基因進(jìn)行定位缺失，以產(chǎn)生DHFR-TS-無效突變體細(xì)胞從而用于抗大型利什曼原蟲強(qiáng)致病株的疫苗中。
本發(fā)明提供了含有編碼新胞子蟲DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該新胞子蟲DHFR-TS蛋白含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No.209512)內(nèi)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，該分離的多核苷酸分子含有所說的新胞子蟲DHFR-TS基因的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含有新胞子蟲DHFR-TS基因的核苷酸序列的該分離的多核苷酸分子含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列，或與存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列。在另一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，所述編碼DHFR-TS蛋白的多核苷酸分子含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了與含有一定核苷酸序列的多核苷酸分子基本上同源的分離的多核苷酸分子，其中所說的核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的DHFR-TS基因從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列，或存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No.209512)的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸分子，其中所述新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或具有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了由任一種前述多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多核苷酸分子由編碼任一種前述新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段(如由DHFR-TS蛋白的DHFR結(jié)構(gòu)域或TS結(jié)構(gòu)域所組成的多肽)的核苷酸序列所組成。
除了任一種前述DHFR-TS相關(guān)性多核苷酸分子的核苷酸序列外，本發(fā)明的多核苷酸分子還含有或其組成可為N.caninum中DHFR-TS基因原位天然側(cè)翼的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示的旁側(cè)核苷酸序列或其部分。
本發(fā)明還提供了用于克隆和表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸分子的組合物和方法，包括諸如克隆載體、表達(dá)載體，以及含有所述載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有具N.caninum NC-1株系的DHFR-TS基因的核苷酸序列的多核苷酸分子的克隆載體，如命名為λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的λ噬菌體克隆載體。
本發(fā)明還提供了含有新胞子蟲DHFR-TS蛋白的氨基酸序列的部分或基本上純化好的蛋白質(zhì)。在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或含有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽。本發(fā)明還提供了任一種前述蛋白或多肽的肽片段(如由分離的新胞子蟲DHFR或TS結(jié)構(gòu)域所組成的多肽)。
本發(fā)明還提供了可抗新胞子蟲DHFR-TS蛋白或可抗所述蛋白質(zhì)的肽片段的抗體。
本發(fā)明還提供了含有任一種前述多核苷酸分子的遺傳構(gòu)建體，該多核苷酸分子比如是含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因的核苷酸序列或存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)中的核苷酸序列的多核苷酸分子；或者是由任一種所述核苷酸序列的基本部分的核苷酸序列所組成，但已被修飾而在其中具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失、插入和/或取代的多核苷酸分子，或是含有N.caninum中DHFR-TS原位天然側(cè)翼的一種或多種核苷酸序列的多核苷酸分子，從而一旦該多核苷酸分子插入于野生型DHFR-TS基因中或用于取代其中一部分時(shí)，所產(chǎn)生的修飾型DHFR-TS基因序列將編碼部分無效或完全無效的蛋白質(zhì)，或者根本不編碼或產(chǎn)生任何蛋白質(zhì)。這類遺傳構(gòu)建體可有效用于產(chǎn)生修飾型新胞子蟲細(xì)胞，這種細(xì)胞中DHFR-TS基因或其中一部分已被部分或全部失活，導(dǎo)致產(chǎn)生的細(xì)胞表現(xiàn)出dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型(本文此后總稱為dhfr--ts-表型)。
本發(fā)明還提供了經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞，其天然DHFR-TS基因或其中一部分已被部分或完全失活。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，由于新胞子蟲細(xì)胞與本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體之間發(fā)生了同源重組，導(dǎo)致DHFR-TS基因的破壞，從而使該細(xì)胞表現(xiàn)dhfr--ts-突變體表型。在保護(hù)哺乳動(dòng)物以抗新胞子蟲病的疫苗組合物中，這類經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞具有很大的用處。本發(fā)明還提供了所述經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞的制備方法。
本發(fā)明還提供了抗新胞子蟲病的疫苗，其中含有免疫有效量的本發(fā)明經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞，以及獸醫(yī)可接受性載體。本發(fā)明還提供了保護(hù)哺乳動(dòng)物以抗新胞子蟲病、以及任選地一種或多種會折磨哺乳動(dòng)物的其它疾病或病理狀態(tài)的聯(lián)合疫苗，這種聯(lián)合疫苗含有免疫有效量的第一組分、免疫有效量的第二組分以及獸醫(yī)可接受性載體，其中所說的第一組分含有本發(fā)明經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞，所說的第二組分可引發(fā)對折磨哺乳動(dòng)物的疾病或病理狀態(tài)的保護(hù)性反應(yīng)。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的疫苗的制備方法，包括聯(lián)合使用免疫有效量的本發(fā)明經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞和獸醫(yī)可接受性載體。本發(fā)明還提供了對哺乳動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種以抗新胞子蟲病的方法，包括對哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的疫苗。
本發(fā)明還提供了用于對哺乳動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種以抗新胞子蟲病的試劑盒，其中包括兩種容器第一種容器中具有含免疫有效量的本發(fā)明經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞的組合物，第二種容器中具有獸醫(yī)可接受性載體或稀釋劑。
編碼新胞子蟲DHFR-TS的多核苷酸分子本發(fā)明提供了(ⅰ)含有編碼新胞子蟲DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子，包括含有新胞子蟲DHFR-TS基因的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子；(ⅱ)與前述任一種多核苷酸分子基本上同源的分離的多核苷酸分子；(ⅲ)含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子；以及(ⅳ)由任一種前述多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子，包括由編碼任一種前述新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。
如本文所用，術(shù)語“基因”、“多核苷酸分子”、“核苷酸序列”、“編碼序列”和“編碼區(qū)”意指包括單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子。也如本文所用，術(shù)語“基因”、“編碼序列”和“編碼區(qū)”意指與適當(dāng)?shù)恼{(diào)控元件有效相連時(shí)，能在宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄并翻譯(DNA)成或翻譯(RNA)成下述多肽或肽的多核苷酸分子；新胞子蟲DHFR-TS蛋白，或與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽，或前述新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段。該多核苷酸分子可包括但不限于一種或多種原核序列、真核序列、cDNA序列、基因組DNA序列(外顯子或內(nèi)含子)，以及化學(xué)合成的DNA和RNA序列，或上述序列的任意組合。
本發(fā)明的分離的多核苷酸分子可具有來源于新胞子蟲任一種或株系的核苷酸序列，但優(yōu)選來源于新胞子蟲的病原性種類如N.caninum。可用于分離或衍生本發(fā)明的多核苷酸分子的N.caninum株系的一個(gè)非限制性實(shí)例是NC-1株系，該株系存在于宿主MARC-145猴腎細(xì)胞，以NO.CRL-12231保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),12301Parklawn Drive,Rockville,MD20852,USA。Dubey等，1988，美國獸醫(yī)醫(yī)學(xué)協(xié)會雜志(J.Am.Vet.Med.Assoc.)，193:1259-63中也記載了NC-1株系，該出版物引入本文作為參考?；蛘呖衫贸Ｒ?guī)分離技術(shù)如上述出版物中所記載的那些技術(shù)，從被感染動(dòng)物的器官、組織或體液中分離出可用于實(shí)施本發(fā)明的新胞子蟲病原性株系或品種。
本發(fā)明提供了含有編碼新胞子蟲DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該新胞子蟲DHFR-TS蛋白含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或含有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，該分離的多核苷酸分子含有新胞子蟲DHFR-TS基因的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該分離的多核苷酸分子含有N.caninum NC-1株系的DHFR-TS基因的核苷酸序列，該核苷酸序列含有SEQ ID NO:1中約第2405nt至約第8199nt的核苷酸序列，或含有與存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列。SEQ ID NO:1中，由約第2405nt至約第4664nt間的核苷酸序列編碼DHFR-TS基因推斷的DHFR結(jié)構(gòu)域，由約第4665nt至約第8199nt之間的核苷酸序列編碼DHFR-TS基因推斷的TS結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，編碼DHFR-TS蛋白的多核苷酸分子含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，其中由約第1nt至約第969nt編碼推斷的DHFR結(jié)構(gòu)域，由約第970nt至約第1836nt編碼推斷的TS結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明還提供了與含有下述核苷酸序列的多核苷酸分子基本上同源的分離的多核苷酸分子SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQID NO:2的核苷酸序列。術(shù)語“基本上同源”用于指DHFR-TS相關(guān)性多核苷酸分子時(shí)，是指具有下述核苷酸序列的多核苷酸分子(a)與下述核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)的核苷酸序列SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因或存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或由于遺傳密碼的簡并性而在核苷酸序列中發(fā)生了一個(gè)或多個(gè)沉默改變的SEQ ID NO:2的核苷酸序列；或是(b)在中度嚴(yán)格條件下即在65℃、于0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中對結(jié)合于濾膜上的DNA進(jìn)行雜交，在0.2×SSC/0.1％SDS中，42℃下洗滌(參見Ausubel等(編)，1989，分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，第1卷，Green PublishingAssociates,Inc.，和John Wiley & Sons,Inc.,New York，第2.10.3頁)的條件下，跟具有與下述核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補(bǔ)體可雜交、并可用于實(shí)施本發(fā)明的核苷酸序列SEQ IDNO:1中大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因或存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基本上同源的多核苷酸分子在高度嚴(yán)格條件下即在65℃下，0.5MNaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中對結(jié)合于濾膜上的DNA進(jìn)行雜交，在68℃下，0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel等，1989，出處同前)的條件下，跟具有與下述核苷酸序列編碼相同蛋白質(zhì)的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補(bǔ)體可雜交，并可用于實(shí)施本發(fā)明SEQ ID NO:1所示大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因或存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
如本文所用，多核苷酸分子“可用于實(shí)施本發(fā)明”是指如下文4.4所述，可將該多核苷酸分子用作診斷試劑以檢測來自新胞子蟲感染動(dòng)物的體液或組織樣品中新胞子蟲特異性多核苷酸的存在，或者可利用該多核苷酸分子構(gòu)建遺傳構(gòu)建體以有效用于制備本發(fā)明經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞。
本發(fā)明的基本上同源的多核苷酸分子不包括具有編碼鼠弓形體來源的DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的多核苷酸分子。
本發(fā)明還提供了含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸分子，所述新胞子蟲DHFR-TS具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或具有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。如本文所用，涉及多肽時(shí)，術(shù)語“基本上同源”是指具有下述氨基酸序列的多肽(a)與具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或具有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列優(yōu)選有至少約70％、更優(yōu)選有至少約80％、最優(yōu)選有至少約90％相同的氨基酸序列，并且該基本上同源的多肽可有效用于實(shí)施本發(fā)明；和/或(b)其內(nèi)存在于新胞子蟲DHFR-TS蛋白中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已由不同的氨基酸殘基保守取代的氨基酸序列，該多肽可有效用于實(shí)施本發(fā)明，所述新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或具有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。
保守氨基酸取代在本領(lǐng)域中是眾所周知的。比如，有理由預(yù)計(jì)，可利用具有相似電荷、大小或極性的氨基酸殘基保守地取代新胞子蟲DHFR-TS蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，所獲得的多肽在實(shí)施本發(fā)明時(shí)仍是有用的。設(shè)計(jì)這類取代的規(guī)則包括由Dayhof,M.D.,1978，國家生物醫(yī)學(xué)研究基金(Nat.Biomed.Res.Found.),Washington,D.C.，第5卷，Sup.3等所描述的那些規(guī)則。更具體地說，保守氨基酸取代是通常在其側(cè)鏈上相關(guān)的一個(gè)氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的那些取代。通常將遺傳編碼的氨基酸分為四組(1)酸性氨基酸——天冬氨酸，谷氨酸；(2)堿性氨基酸——賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸——丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不帶電的極性氨基酸——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。也可將苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸歸類為芳族氨基酸。在任一特定組內(nèi)發(fā)生的一個(gè)或多個(gè)替換，如由異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、由谷氨酸取代天冬氨酸、由絲氨酸取代蘇氨酸，或由結(jié)構(gòu)相關(guān)性氨基酸殘基取代任一種其它氨基酸殘基，通常不會顯著影響所得多肽在實(shí)施本發(fā)明過程中的有效性。
如本文所用，若蛋白質(zhì)或多肽可用于包括下述任意一種或多種用途，如可用于篩選特異地定向于新胞子蟲DHFR-TS蛋白的兩個(gè)酶促結(jié)構(gòu)域之一的抑制性試劑，或可用于產(chǎn)生抗完整蛋白或其內(nèi)兩個(gè)酶促結(jié)構(gòu)域之一的抗體，則將該蛋白質(zhì)或多肽視為“在實(shí)施本發(fā)明過程中是有用的”。
本發(fā)明還提供了由任一種前述多核苷酸分子的“基本部分”的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。如本文所用，任一種前述多核苷酸分子的“基本部分”意指一種多核苷酸分子，其組成少于特定的DHFR-TS相關(guān)性多核苷酸分子的完整核苷酸序列、但含有DHFR-TS相關(guān)性多核苷酸分子之核苷酸序列的至少約30％、更優(yōu)選至少約50％，并在實(shí)施本發(fā)明過程中有用處，如上述定義多核苷酸分子的有用處一樣。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多核苷酸分子具有的核苷酸序列編碼任一種前述新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段，如由DHFR-TS蛋白的DHFR結(jié)構(gòu)域或TS結(jié)構(gòu)域所組成的多肽。如本文所用，術(shù)語“肽片段”是指由新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的全部氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)亞序列所組成的多肽，這些亞序列在長度上短于全長分子，并且由此產(chǎn)生的肽片段在實(shí)施本發(fā)明過程中是有用處的，如上述定義多肽的有用處一樣。因此，若全長分子具有“n”個(gè)氨基酸殘基，那么其肽片段可以是小于全長序列的任一種多肽，包括具有n-1個(gè)氨基酸殘基的多肽，并且這類多肽在本發(fā)明實(shí)施過程中是有用處的。優(yōu)選本發(fā)明的肽片段長度至少大約10個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，該肽片段由新胞子蟲DHFR-TS蛋白的DHFR結(jié)構(gòu)域或TS結(jié)構(gòu)域所組成。
若肽片段由DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的一個(gè)以上亞序列所組成，則可優(yōu)化編碼該肽片段的多核苷酸分子以將全長蛋白或多肽中相應(yīng)的不連續(xù)亞序列歸于一處并使它們在肽片段中互相連續(xù)。另外，可優(yōu)化編碼肽片段的多核苷酸分子使含有肽片段的不同亞序列之間相對排列的次序與全長蛋白或多肽有所不同，或使所編碼的肽片段含有多拷貝的特定亞序列。例如，該多核苷酸分子可編碼多拷貝的DHFR結(jié)構(gòu)域或TS結(jié)構(gòu)域，選自其中的表位區(qū)，或其組合。
本發(fā)明除包括編碼大于天然蛋白的多肽包括長度達(dá)到大約2n的多肽的多核苷酸之外，還包括編碼全長(n)多肽的多核苷酸分子，該多肽中天然蛋白質(zhì)的亞序列已互相發(fā)生了重排。這類多肽可含有多拷貝的完整蛋白質(zhì)、單個(gè)結(jié)構(gòu)域、表位區(qū)或它們的某種組合。
除了任一種前述的DHFR-TS相關(guān)性多核苷酸分子的核苷酸序列外，本發(fā)明的多核苷酸分子還可含有或者組成為選自N.caninum的DHFR-TS基因原位天然旁側(cè)序列如SEQ ID NO:1所示的旁側(cè)核苷酸序列或其部分的一種或多種核苷酸序列。
本發(fā)明的多核苷酸分子的序列還為構(gòu)建寡核苷酸分子提供了必要的信息，所述寡核苷酸分子可在擴(kuò)增技術(shù)中用作引物或在差異疾病診斷中用作探針，根據(jù)本文的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可很方便地設(shè)計(jì)出來。優(yōu)選這類寡核苷酸長度至少約15個(gè)核苷酸。利用恰當(dāng)設(shè)計(jì)的寡核苷酸，通過應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可進(jìn)行擴(kuò)增。Innis等(編)，1995,PCR策略，Academic Press,Inc.,San Diego；和Erlich(編)，1992,PCR技術(shù)，牛津大學(xué)出版社，紐約等出版物中記載了聚合酶鏈反應(yīng)，這些出版物引入本文作為參考。進(jìn)行診斷時(shí)，可將本發(fā)明的寡核苷酸用于PCR擴(kuò)增中以檢測動(dòng)物組織或體液樣品中新胞子蟲特異性多核苷酸分子的存在，這類樣品的例子包括諸如腦組織、肺組織、胎盤組織、血液、腦脊髓液、粘液、尿液、羊水等。特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的存在可支持已發(fā)生新胞子蟲感染的診斷結(jié)果，而缺乏擴(kuò)增產(chǎn)物有可能表明未發(fā)生感染。通常對于PCR，可按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備含有恰當(dāng)設(shè)計(jì)的引物、含待擴(kuò)增的核苷酸序列的模板以及適當(dāng)?shù)腜CR酶和緩沖液的混合物，并進(jìn)行反應(yīng)以擴(kuò)增該模板的特異性新胞子蟲DHFR-TS多核苷酸分子或其部分。也可利用本領(lǐng)域已知的其它擴(kuò)增技術(shù)，如連接酶鏈反應(yīng)。
除非另外特別指出，以后凡涉及“多核苷酸分子”均指包括本發(fā)明的任一種前述多核苷酸分子，包括含有下述核苷酸序列的多核苷酸分子SEQ ID NO:1所示從大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因或存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列；與含有下述核苷酸序列的多核苷酸分子基本上同源的多核苷酸分子SEQ ID NO:1所示從大約第2405nt至大約第8199nt的DHFR-TS基因的核苷酸序列、或存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的DHFR-TS基因的核苷酸序列、或SEQ ID NO:2的核苷酸序列；含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子，其中所述新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或具有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列；以及由作為任一種前述多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子，包括由編碼任一種前述的新胞子蟲DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。
除非另外特別指出，以后凡涉及“DHFR-TS蛋白”、“蛋白質(zhì)”或“多肽”均指包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或具有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；與任一種前述蛋白質(zhì)基本上同源的多肽；以及任一種前述蛋白質(zhì)或多肽的肽片段。
對本發(fā)明的多核苷酸和寡核苷酸分子進(jìn)行生產(chǎn)和操作的方法在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，并可按照已知的遺傳技術(shù)進(jìn)行，這些技術(shù)記載于Maniatis等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，出處同前；Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Innis等，1995(出處同前)；以及Erlich,1992(出處同前)等出版物中，上述文獻(xiàn)引入本文作為參考。
重組表達(dá)體系克隆和表達(dá)載體本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明多核苷酸分子的重組型克隆和表達(dá)載體。在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明所提供的克隆載體是噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)，其含有具N.caninum NC-1株系的完整DHFR-TS基因的核苷酸序列的多核苷酸分子。
優(yōu)選將本發(fā)明的表達(dá)載體構(gòu)建成使該多核苷酸分子與轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的一種或多種調(diào)控元件有效相連。將表達(dá)載體用于表達(dá)體系如轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中，以生產(chǎn)重組型表達(dá)的DHFR-TS蛋白。
如本文所用，術(shù)語“調(diào)控元件”包括但不限于編碼下述元件的核苷酸序列誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱基因，以及本領(lǐng)域已知可參與啟動(dòng)和/或調(diào)控多核苷酸編碼序列表達(dá)的其它元件。如本文所用，若一種或多種調(diào)控元件可有效調(diào)控并提供DHFR-TS編碼序列的轉(zhuǎn)錄、或其mRNA的翻譯，或二者兼而有之時(shí)，該DHFR-TS編碼序列即是與所說的調(diào)控元件“有效相連”。
本領(lǐng)域熟知可用于構(gòu)建含有與適當(dāng)?shù)恼{(diào)控元件有效相連的特定編碼序列的表達(dá)載體的方法，可利用這些方法實(shí)施本發(fā)明。這些方法包括如Maniatis等，1989(出處同前)；Ausubel等，1989(出處同前)；以及Sambrook等，1989(出處同前)等所記載的體外重組技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。
本領(lǐng)域已知可用于表達(dá)本發(fā)明多核苷酸分子的編碼序列的多種表達(dá)載體，包括含有DHFR-TS編碼序列的重組型噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA和粘粒DNA以用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌或酵母，以及含有DHFR-TS編碼序列的重組型病毒表達(dá)載體如桿狀病毒以用于轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，或含有DHFR-TS編碼序列的腺病毒或痘苗病毒以用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，等等。
可被加工成含有本發(fā)明的多核苷酸分子的典型原核表達(dá)載體質(zhì)粒包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(Biorad Laboratories,Richmond,CA)，以及pPL和pKK223(Pharmacia,Piscataway,NJ)，等等。
可被加工成含有本發(fā)明多核苷酸分子的典型真核生物表達(dá)載體包括蛻皮激素誘導(dǎo)型哺乳動(dòng)物表達(dá)體系(Invitrogen,Carlsbad,CA)，基于巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子-增強(qiáng)子的體系(Promega,Madison,WI；Stratagene,LaJolla,CA；Invitrogen)；以及基于桿狀病毒的表達(dá)體系(Promega)，等等。
在強(qiáng)度和特異性方面，這些和其它載體的調(diào)控元件可以各不相同。取決于所使用的宿主/載體體系，可以使用任何一種合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。比如，當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系中進(jìn)行克隆時(shí)，可使用分離自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子如小鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子，或可使用分離自生長于這些細(xì)胞內(nèi)的病毒的啟動(dòng)子，如痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子或Moloney鼠肉瘤病毒長末端重復(fù)序列。也可利用通過重組DNA或合成技術(shù)所獲得的啟動(dòng)子以提供插入序列的轉(zhuǎn)錄。另外，在存在特定誘導(dǎo)物的情況下，來自某些啟動(dòng)子的表達(dá)可得到提高，比如鋅和鎘離子可提高金屬硫蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)。
轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)或啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括用于細(xì)菌的β-gal啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、TAC啟動(dòng)子、λ左向和右向啟動(dòng)子、trp和lac啟動(dòng)子、trp-lac融合啟動(dòng)子等；用于酵母的糖酵解酶啟動(dòng)子，如ADH-Ⅰ和ADH-Ⅱ啟動(dòng)子、GPK啟動(dòng)子、PGI啟動(dòng)子、TRP啟動(dòng)子等；用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的SV40早期和晚期啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子等。
為了足量翻譯插入的DHFR-TS編碼序列，還必需特定的起始信號。通常這些信號包括ATG起始密碼子和鄰接序列。當(dāng)將本發(fā)明的多核苷酸分子連同其自身的起始密碼子和鄰接序列一起插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中時(shí)，不再需要額外的翻譯控制信號。然而，在僅插入編碼序列的一部分的情形下，可能需要外源的翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可得自多種來源，既可以是天然的，也可以是合成的。另外，起始密碼子必須與DHFR-TS編碼區(qū)的讀框協(xié)調(diào)一致以確保整個(gè)插入片段讀框一致地翻譯。
可利用融合蛋白表達(dá)載體表達(dá)DHFR-TS融合蛋白?？衫靡鸭兓娜诤系鞍桩a(chǎn)生抗DHFR-TS蛋白的抗血清，研究DHFR-TS蛋白的生物化學(xué)特性，加工DHFR-TS融合蛋白使其具有不同的酶促活性，或協(xié)助進(jìn)行表達(dá)的DHFR-TS蛋白的鑒定或純化?？赡艿娜诤系鞍妆磉_(dá)載體包括但不限于插入了編碼下述多肽的序列的載體β-半乳糖苷酶和trpE融合體、麥芽糖結(jié)合性蛋白融合體、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合體和多組氨酸融合體(攜帶者區(qū))?？衫帽绢I(lǐng)域已知的方法構(gòu)建編碼這類DHFR-TS融合蛋白的表達(dá)載體。
如上所述，融合蛋白在協(xié)助進(jìn)行表達(dá)蛋白的純化方面是有用的。比如，利用直鏈淀粉樹脂可純化DHFR-TS-麥芽糖結(jié)合性蛋白融合體；利用谷胱甘肽-瓊脂糖玻璃珠可純化DHFR-TS-谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白；利用二價(jià)鎳樹脂可純化DHFR-TS-多組氨酸融合體?；蛘撸蓪⒖馆d體蛋白或肽的抗體用于融合蛋白的親和層析純化。例如，可將編碼單克隆抗體靶抗原決定基的核苷酸序列加工到表達(dá)載體中使其與調(diào)控元件有效相連，并且所處位置可使表達(dá)的表位與DHFR-TS蛋白相融合。例如，可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將編碼FLAGTM表位標(biāo)記(International BiotechnologiesInc.)這樣一個(gè)親水性標(biāo)記肽的核苷酸序列插入表達(dá)載體中的某個(gè)位點(diǎn)，比如DHFR-TS蛋白的羧基末端。然后利用可商購的抗FLAGTM的抗體，可對表達(dá)的DHFR-TS蛋白-FLAGTM表位融合產(chǎn)物進(jìn)行檢測和親和純化。
也可將表達(dá)載體加工成含有編碼特定蛋白酶切割位點(diǎn)的多接頭序列，以便可通過特定蛋白酶處理而將表達(dá)的DHFR-TS蛋白從載體區(qū)或融合“搭擋”中釋放出來。例如，融合蛋白載體中可包括編碼凝血酶或Xa因子切割位點(diǎn)等的DNA序列。
通過已知方法，可將位于DHFR-TS編碼區(qū)上游并與其讀框一致的信號序列加工到表達(dá)載體中以指導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和分泌。信號序列的非限制性實(shí)例包括來自α因子、免疫球蛋白、外膜蛋白、青霉素酶和T細(xì)胞受體等的那些信號序列。
為了協(xié)助篩選出已轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，可加工表達(dá)載體使其進(jìn)一步含有報(bào)道基因產(chǎn)物或其它選擇性標(biāo)記的編碼序列。如上述，優(yōu)選這類編碼序列與調(diào)控元件編碼序列有效相連。在本發(fā)明中有用的報(bào)道基因在本領(lǐng)域中是眾所周知的，它們包括編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白、熒火蟲熒光素酶以及人生長激素等的報(bào)道基因。編碼選擇性標(biāo)記的核苷酸序列在本領(lǐng)域中是眾所周知的，它們包括編碼賦予對抗生素或抗代謝物的抗性的基因產(chǎn)物或可提供營養(yǎng)缺陷型需要的基因產(chǎn)物的那些核苷酸序列。這類序列的例子包括編碼胸苷激酶活性，或?qū)Π奔奏┻?、氨芐青霉系、卡那霉素、氯霉素、zeocin、乙嘧啶(pyrimethamine)、氨基糖苷或潮霉素抗性的那些序列，等等。
宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化本發(fā)明提供了含有本發(fā)明多核苷酸分子或重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以及由此衍生的細(xì)胞系。在實(shí)施本發(fā)明過程中有用的宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，盡管優(yōu)選的是原核細(xì)胞。這類轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞包括但不限于微生物，如經(jīng)重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；或經(jīng)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；或動(dòng)物細(xì)胞，如經(jīng)重組病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞，或經(jīng)重組病毒表達(dá)載體(如腺病毒或痘苗病毒)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，等等。
可將細(xì)菌細(xì)胞用作宿主細(xì)胞。比如，可利用大腸桿菌菌株，如DH5α菌株，該菌株可從ATCC,Rockville,MD,USA(保藏號31343)或從Stratagene(La Jolla,CA)獲得。真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞如來自小鼠、倉鼠、牛、猴或人細(xì)胞系的細(xì)胞也可得到有效利用。可用于表達(dá)本發(fā)明重組蛋白質(zhì)的真核宿主細(xì)胞的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(如ATCC保藏號CCL-61)，NIH瑞士小鼠胚胎細(xì)胞NIH/3T3(如ATCC保藏號CRL-1658)，Madin-Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞(ATCC保藏號CCL-22)，以及胸苷激酶缺陷型細(xì)胞，如L-M(TK-)(ATCC保藏號CCL-1.3)和tk--ts13(ATCC保藏號CRL-1632)。
優(yōu)選將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到基本上均一的細(xì)胞培養(yǎng)物的一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞中。通常利用已知技術(shù)將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，如磷酸鈣沉淀、氯化鈣處理、顯微注射、電穿孔、通過與重組病毒接觸進(jìn)行的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合或微粒轟擊等方法?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法篩選轉(zhuǎn)化體，如通過篩選表達(dá)與重組表達(dá)載體相關(guān)的選擇性標(biāo)記(如抗生素抗性)的細(xì)胞等方法。
一旦已將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，則可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，比如Southern雜交分析、限制性酶分析、PCR分析包括逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(rt-PCR)，或通過免疫測定以檢測預(yù)期蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在等技術(shù)，證實(shí)本發(fā)明的多核苷酸分子的整合和維持情況(或者是在宿主細(xì)胞基因組中，或者是以附加體形式存在)?？赏ㄟ^至少四條常規(guī)途徑中的任一種鑒定含有和/或表達(dá)本發(fā)明多核苷酸分子的宿主細(xì)胞，這幾條途徑在本領(lǐng)域中是眾所周知的，它們包括(ⅰ)DNA-DNA、DNA-RNA、DNA-反義RNA雜交；(ⅱ)檢測“標(biāo)記”基因功能的存在；(ⅲ)通過測量宿主細(xì)胞中諸如DHFR-TS特異性mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)確定轉(zhuǎn)錄水平；或(ⅳ)比如通過免疫測定或通過檢測DHFR酶促活性如由NADPH氧化所催化的二氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，或檢測TS酶促活性如脫氧尿苷一磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀找涣姿岬确椒?，檢測成熟多肽產(chǎn)物的存在，如同本領(lǐng)域所知的那樣。
重組多肽的表達(dá)和純化一旦已將本發(fā)明的多核苷酸分子穩(wěn)定引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)，則克隆性地增殖該經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并在有助于最大量生產(chǎn)編碼的DHFR-TS蛋白的條件下培養(yǎng)由此獲得的細(xì)胞。這樣的條件通常包括培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞至高密度。若表達(dá)載體中含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則給予所需的適當(dāng)誘導(dǎo)條件以誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件的例子比如有溫度變動(dòng)、營養(yǎng)衰竭、加入義務(wù)誘導(dǎo)物(如碳水化合物的類似物，比如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、過量代謝副產(chǎn)物的累積等等。
若表達(dá)的DHFR-TS蛋白被保留于宿主細(xì)胞內(nèi)，則收集和裂解該細(xì)胞，并在本領(lǐng)域已知可將蛋白質(zhì)降解減到最小的提取條件下如4℃下，或在存在蛋白酶抑制劑時(shí)，或同時(shí)具備這兩個(gè)要求的條件下，從裂解物中純化該產(chǎn)物。若表達(dá)的DHFR-TS蛋白已從宿主細(xì)胞內(nèi)分泌出來了，則可簡單地收集已耗盡養(yǎng)分的培養(yǎng)基，并從中分離該蛋白質(zhì)。
適當(dāng)時(shí)，可利用標(biāo)準(zhǔn)方法，從細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)基中純化表達(dá)的DHFR-TS蛋白，這些方法包括但不限于下述方法中的一種或多種硫酸銨沉淀、大小分級分離、離子交換層析、HPLC、密度離心，以及親和層析。若表達(dá)的DHFR-TS蛋白表現(xiàn)出酶促活性，如具有由NADPH氧化所催化的將二氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸的能力(DHFR)，或具有將脫氧尿苷一磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀找涣姿岬哪芰?TS)，則如本領(lǐng)域所知，通過使用適當(dāng)?shù)臏y定法，可在純化過程中的每一步驟檢測制備物的純度提高程度。若表達(dá)的蛋白質(zhì)缺乏生物活性，則可基于諸如大小、或與特異于DHFR-TS蛋白的抗體的反應(yīng)性，或通過融合標(biāo)記的存在情況而對其進(jìn)行檢測。為了應(yīng)用于本發(fā)明實(shí)施過程中，該重組型表達(dá)的DHFR-TS蛋白可以是產(chǎn)生在培養(yǎng)物中或存在于細(xì)胞裂解物中的未純化狀態(tài)，或者已從其中部分地或基本上得到了純化。
因此本發(fā)明提供了一種制備DHFR-TS蛋白的方法，該方法包括在有利于DHFR-TS蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以及從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收DHFR-TS蛋白，所說的重組表達(dá)載體含有與一種或多種調(diào)控元件有效相連的本發(fā)明多核苷酸分子。
本發(fā)明還提供了含有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的分離的新胞子蟲DHFR-TS蛋白，或含有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；與這些蛋白質(zhì)基本上同源的多肽；以及前述蛋白質(zhì)或多肽的肽片段。比如，本發(fā)明的肽片段可以由新胞子蟲DHFR-TS蛋白的DHFR結(jié)構(gòu)域或TS結(jié)構(gòu)域所組成。新胞子蟲DHFR-TS蛋白的推定DHFR結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中約第1位氨基酸殘基至約第323位氨基酸殘基，推定TS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為約第324位氨基酸殘基至約第612位氨基酸殘基。
DHFR-TS蛋白的用途一旦已獲得足夠純的DHFR-TS蛋白，則可通過標(biāo)準(zhǔn)方法對其進(jìn)行表征，這些標(biāo)準(zhǔn)方法包括SDS-PAGE、大小排阻層析、氨基酸序列分析、生物活性等等。可利用親水性分析(參見如Hopp和Woods,1981，美國國家科學(xué)院院報(bào)，78:3824)或相似的軟件系統(tǒng)對DHFR-TS蛋白作進(jìn)一步表征，以鑒定出疏水區(qū)和親水區(qū)。可進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析以鑒定出DHFR-TS蛋白中表現(xiàn)特定二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域。通過各種生物物理方法，如X-射線結(jié)晶學(xué)(Engstrom,1974，生物化學(xué)與實(shí)驗(yàn)生物學(xué)(Biochem.Exp.BioL),11:7-13)、計(jì)算機(jī)模型分析(Fletterick和Zoller(編),1986，分子生物學(xué)現(xiàn)代通信，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)以及核磁共振(NMR)等，可確定和分析DHFR-TS蛋白與其任一種底物之間相互作用的位點(diǎn)?？衫糜缮鲜鲅芯康玫降男畔⒃O(shè)計(jì)出更為有效的缺失突變體和疫苗組合物，或者設(shè)計(jì)或篩選出可在體內(nèi)特異性阻斷新胞子蟲DHFR-TS蛋白的DHFR或TS結(jié)構(gòu)域的酶促活性的治療用或藥用化合物。
本發(fā)明分離的DHFR-TS蛋白，不管是重組型的或其它形式的，都可用于多種目的。比如，可利用該蛋白質(zhì)篩選出能特異性阻斷DHFR或TS結(jié)構(gòu)域的酶促活性的抑制劑。這樣的篩選方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。也可將本發(fā)明的DHFR-TS蛋白用作抗原以產(chǎn)生可與該蛋白質(zhì)特異性反應(yīng)的多克隆或單克隆抗體，正如下文所述?？蓪⑦@樣的抗體用作親和試劑，以純化天然或重組型DHFR-TS蛋白，或用作診斷試劑，以通過諸如ELISA或Western印跡測定等方法檢測動(dòng)物細(xì)胞、組織或體液樣品中新胞子蟲特異性DHFR-TS蛋白的存在。
可利用已知方法制備抗DHFR-TS蛋白的抗體?？衫迷摬糠只蚧旧霞兓玫目乖庖叨喾N宿主動(dòng)物，包括豬、牛、馬、兔、山羊、綿羊和小鼠。可利用諸如下述的佐劑以提高抗體產(chǎn)量。通過標(biāo)準(zhǔn)方法可從被免疫動(dòng)物的血清中獲取多克隆抗體，并測定其抗DHFR-TS蛋白的特異性?；蛘?，通過培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系，利用可提供抗體分子生成的任何一種技術(shù)，可制備抗DHFR-TS蛋白的單克隆抗體。這些技術(shù)包括但不限于最初由Kohler和Milstein(自然，1975,256:495-497)所記載的雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，1983，今日免疫學(xué)，4:72；Cote等，1983，美國國家科學(xué)院院報(bào)，80:2026-2030)，以及EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss,Inc.，第77-96頁)。可對記載為用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(參見如美國專利4,946,778)作適當(dāng)改進(jìn)使其適合用于生產(chǎn)DHFR-TS抗原特異性單鏈抗體。這些出版物引入本文作為參考。
本發(fā)明也包括含有DHFR-TS抗原特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，它們可通過已知技術(shù)產(chǎn)生。這樣的片段包括但不限于可通過胃蛋白酶消化完整抗體分子而產(chǎn)生的F(ab′)2片段，以及通過還原這些F(ab′)2片段的二硫橋而產(chǎn)生的Fab片段?；蛘?，可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse等，1989，科學(xué)，246:1275-1281)以便快速鑒定出具有所需的對DHFR-TS抗原特異性的Fab片段。
生產(chǎn)單克隆抗體和抗體片段的技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且還記載于Harlow和Lane,1988，抗體:實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，和J.W.Goding,1986，單克隆抗體原理和實(shí)踐，Academic Press,London等處，這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。
新胞子蟲DHFR-TS基因的定向突變遺傳構(gòu)建體基于本發(fā)明公開的多核苷酸分子，可制備出能用于失活新胞子蟲DHFR-TS基因的遺傳構(gòu)建體。聯(lián)合使用適當(dāng)設(shè)計(jì)的遺傳構(gòu)建體和目前已知的或即將開發(fā)的遺傳技術(shù)，可失活新胞子蟲DHFR-TS基因。比如，利用本發(fā)明的具有以下功能的遺傳構(gòu)建體，可失活新胞子蟲DHFR-TS基因(a)可缺失全部或部分DHFR-TS基因；或(b)可以一段不同的核苷酸序列置換DHFR-TS基因的一部分；或(c)可將一個(gè)或多個(gè)核苷酸、或者可能含有新胞子蟲或其它來源的核苷酸序列的寡核苷酸分子或多核苷酸分子插入DHFR-TS基因中。
若與DHFR-TS基因未被失活的同一株系新胞子蟲細(xì)胞相比，DHFR-TS基因的失活降低了攜有已失活的DHFR-TS基因的新胞子蟲細(xì)胞的病原性，并且攜有已失活的DHFR-TS基因的新胞子蟲細(xì)胞可用于疫苗組合物、特別是經(jīng)修飾的活疫苗中以誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物中抗新胞子蟲病的保護(hù)性反應(yīng)，則其內(nèi)DHFR-TS基因已經(jīng)失活的新胞子蟲細(xì)胞在實(shí)施本發(fā)明過程中是有用的。
在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，可利用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體，通過用突變的新胞子蟲DHFR-TS基因或其部分置換野生型DHFR-TS基因或其部分，從而失活野生型新胞子蟲DHFR-TS基因?？赏ㄟ^各種已知方法制備能用于這樣的遺傳構(gòu)建體中的突變新胞子蟲DHFR-TS基因序列，這些方法包括易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)，或盒式誘變等。例如，可應(yīng)用寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法，以確定的方式改變野生型新胞子蟲DHFR-TS基因的ORF序列，比如將移框或終止密碼子引入序列內(nèi)特定區(qū)域中。另一方面或者額外地，通過將一個(gè)或多個(gè)核苷酸、寡核苷酸分子或多核苷酸分子插入新胞子蟲DHFR-TS基因中，或以一個(gè)或多個(gè)核苷酸、寡核苷酸分子或多核苷酸分子置換新胞子蟲DHFR-TS基因的一部分，可制備出能用于本發(fā)明遺傳構(gòu)建體的突變核苷酸序列。這樣的寡核苷酸分子或多核苷酸分子可得自任何天然來源，或可以是合成的。插入序列可以是僅用于破壞新胞子蟲DHFR-TS基因的讀框，或還可以編碼異源基因產(chǎn)物如選擇標(biāo)記。也可利用隨機(jī)誘變法產(chǎn)生突變新胞子蟲DHFR-TS基因序列以用于本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體中?？衫萌魏我环N已知的或即將開發(fā)的技術(shù)完成隨機(jī)誘變，這樣的技術(shù)比如是將攜有新胞子蟲DHFR-TS基因的細(xì)胞暴露于紫外線照射或X-射線，或化學(xué)誘變劑如N-甲基-N′-亞硝基胍、乙基甲磺酸、亞硝酸或氮芥類，然后篩選出在其DHFR-TS基因內(nèi)攜有突變的細(xì)胞。有關(guān)誘變技術(shù)的綜述參見如Ausubel,1989，出處同前。
如上所述，用于生成在實(shí)施本發(fā)明過程中有用處的經(jīng)修飾的新胞子蟲細(xì)胞的突變可發(fā)生在新胞子蟲DHFR-TS基因內(nèi)的任何地方，包括ORF內(nèi)、啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)，或該基因或ORF旁側(cè)的任何其它序列內(nèi)。這樣的新胞子蟲細(xì)胞是突變體，其內(nèi)可能產(chǎn)生由新胞子蟲DHFR-TS基因所編碼的該蛋白質(zhì)的修飾形式，或者根本不產(chǎn)生這樣的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這樣的新胞子蟲細(xì)胞表現(xiàn)出dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型(以下總稱為dhfr--ts-表型)。此外，這樣的新胞子蟲細(xì)胞也可以是無效突變體、條件突變體或滲漏突變體。
或者本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可含有如選自SEQ ID NO:1所示的旁側(cè)序列之類的新胞子蟲DHFR-TS基因或ORF的原位天然旁側(cè)核苷酸序列，其中僅存在極少數(shù)或根本沒有該基因本身的編碼序列的核苷酸序列。這樣的遺傳構(gòu)建體可能在諸如缺失整個(gè)基因或ORF的工作中有用處。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體中含有可用于失活新胞子蟲DHFR-TS基因的多核苷酸分子，其中含有(a)具有與編碼N.caninum的DHFR-TS蛋白的核苷酸序列差不多相同、但其中還含有一個(gè)或多個(gè)失活突變的核苷酸序列的多核苷酸分子；或(b)由新胞子蟲DHFR-TS基因的ORF的天然原位旁側(cè)的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。一旦轉(zhuǎn)化至新胞子蟲株系的細(xì)胞中，該遺傳構(gòu)建體的多核苷酸分子能通過諸如同源重組等特異地定位到新胞子蟲DHFR-TS基因，由此替換該基因或其中一部分或者插入該基因中。此重組事件的發(fā)生導(dǎo)致本是新胞子蟲特定株系的天然的新胞子蟲DHFR-TS基因發(fā)生了失活。
在寄生性原生動(dòng)物中進(jìn)行同源基因替換的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并描述于Cruz和Beverly,1990，自然，348:171-173；Cruz等，1991，美國國家科學(xué)院院報(bào)，88:7170-7174；Donald和Roos,1994，分子生物化學(xué)和寄生蟲學(xué)，63:243-253；以及Titus等，1995，美國國家科學(xué)院院報(bào)，92:10267-10271等文獻(xiàn)中，所有這些文獻(xiàn)均引入本文作為參考。
為通過同源重組進(jìn)行定位基因突變，優(yōu)選該遺傳構(gòu)建體是含有上述突變的核苷酸序列的環(huán)狀或線性質(zhì)粒。在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，盡管長度更短的核苷酸也可能是有效的，但使用了突變序列中至少約200個(gè)核苷酸以將本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體特異地定位于新胞子蟲DHFR-TS基因，從而進(jìn)行同源重組。此外，該質(zhì)粒優(yōu)選包含編碼報(bào)道分子基因產(chǎn)物或其它選擇標(biāo)記的額外核苷酸序列，其構(gòu)建方式將使其可插入至新胞子蟲基因組中與天然新胞子蟲DHFR-TS基因的調(diào)控元件編碼序列有效相連。可用于實(shí)施本發(fā)明的報(bào)道基因在本領(lǐng)域中是眾所周知的，包括編碼CAT、綠色熒光蛋白和β-半乳糖苷酶等的那些報(bào)道基因。編碼選擇標(biāo)記的核苷酸序列在本領(lǐng)域中也是眾所周知的，包括編碼可賦予對抗生素或抗代謝物的抗性、或可提供營養(yǎng)缺陷型需要的基因產(chǎn)物的那些核苷酸序列。這樣的序列的例子包括編碼乙嘧啶抗性或新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(可賦予對氨基糖苷類的抗性)或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(可賦予對潮霉素的抗性)的那些序列。
可用于制備本發(fā)明遺傳構(gòu)建體的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，包括體外重組技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)遺傳重組等，這些方法描述于Maniatis等，1989(出處同前)；Ausubel等，1989(出處同前)；以及Sambrook等，1989(出處同前)等出版物中。
可將本發(fā)明遺傳構(gòu)建體與已知技術(shù)如電穿孔法聯(lián)用從而對新胞子蟲細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化體的篩選可利用標(biāo)準(zhǔn)方法，如通過篩選可表達(dá)與構(gòu)建體相關(guān)的選擇標(biāo)記的細(xì)胞。可通過遺傳分析如Southern印跡分析，或通過Northern分析檢測編碼DHFR-TS蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄物的缺乏，或通過新表型的出現(xiàn)如病原性降低，或通過如免疫分析確定的缺乏DHFR-TS蛋白的細(xì)胞的出現(xiàn)，或其中的一些組合方法而鑒定出已成功地完成了重組事件并且特定靶基因已被失活的轉(zhuǎn)化體。
可按照本發(fā)明進(jìn)行修飾的新胞子蟲細(xì)胞優(yōu)選是速殖體，但也可以是慢殖體或卵母細(xì)胞。盡管在新胞子蟲生命周期的某些階段的細(xì)胞是二倍體，但速殖體是單倍體。因此，由于速殖體僅需要一次成功的重組事件來破壞特定的新胞子蟲基因，故而優(yōu)選利用速殖體產(chǎn)生表現(xiàn)適當(dāng)突變體表型的經(jīng)修飾的新胞子蟲細(xì)胞?；蛘?，在新胞子蟲的二倍體細(xì)胞中，對各個(gè)基因來說都必須破壞兩個(gè)等位基因。這可以通過利用含有兩個(gè)不同的選擇標(biāo)記的遺傳構(gòu)建體依次導(dǎo)向第一個(gè)等位基因和第二個(gè)等位基因而完成。
在另一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，本發(fā)明遺傳構(gòu)建體還額外含有從新胞子蟲或可感染動(dòng)物的不同病原來源的不同基因或編碼區(qū)，該基因或編碼區(qū)編碼的抗原可用于在接種了本發(fā)明經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞的動(dòng)物中誘導(dǎo)分別的且截然不同的保護(hù)性免疫反應(yīng)?？蛇M(jìn)一步加工所說的額外基因或編碼區(qū)，使其含有信號序列，所說的信號序列可促使所編碼的抗原從該經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞中分泌出來，從而使該抗原可展示于接種動(dòng)物的免疫系統(tǒng)內(nèi)。
本發(fā)明因而提供了其內(nèi)DHFR-TS基因已被破壞的經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供了制備經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞的方法，該方法包括(a)用本發(fā)明遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化新胞子蟲細(xì)胞；(b)篩選出其內(nèi)DHFR-TS基因已被該遺傳構(gòu)建體破壞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(c)從步驟(b)的細(xì)胞中篩選出可用于疫苗中以保護(hù)哺乳動(dòng)物以抗新胞子蟲病的那些細(xì)胞。
培養(yǎng)新胞子蟲細(xì)胞通過按照本領(lǐng)域所描述的已知技術(shù)，利用速殖體感染任何受體細(xì)胞系、優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，可在體外培養(yǎng)和維持新胞子蟲細(xì)胞以用于本發(fā)明中?？捎糜谂囵B(yǎng)新胞子蟲的速殖體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括諸如人包皮成纖維細(xì)胞(Lindsay等1993，美國獸醫(yī)研究雜志，54:103-106)、牛心肺主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Marsh等，1995，出處同前)，牛單核細(xì)胞(Lindsay和Dubey,1989，出處同前)和猴腎細(xì)胞等。例如，可在Hs68人包皮成纖維細(xì)胞(ATCC No.CRL-1635)的單層中培養(yǎng)N.caninum的速殖體(Lindsay等，1993，出處同前)；可用于本發(fā)明的感染了N.caninumNC-1株系的速殖體的MARC145猴腎細(xì)胞被保藏于ATCC中(保藏號為ATCCNo.12231)?？深愃频貙β丑w進(jìn)行培養(yǎng)和操作。
可在本領(lǐng)域所記載的多種類型培養(yǎng)基的任何一種中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，維持已感染了新胞子蟲的細(xì)胞培養(yǎng)物。例如，可在補(bǔ)加了10％(V/V)熱滅活胎牛血清(FBS)或成年馬血清(ES)、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素以及50μg/ml鏈霉素的Dulbecco′s基本培養(yǎng)基(DMEM,Gibco Laboratories,N.Y.)中培養(yǎng)感染了N.caninum的速殖體的牛心肺主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定單層培養(yǎng)物(Conrad等，1993，出處同前)?？稍诤?％(V/V)FBS、1.0mM丙酮酸鈉、1×104U/ml青霉素、1×104μg/ml鏈霉素、5×10-2mM 2-硫基乙醇和0.3mg/ml L-谷氨酰胺的RPMI 1640(維持培養(yǎng)基)中維持Hs68人包皮成纖維細(xì)胞。可在相同的培養(yǎng)基中維持感染了新胞子蟲的Hs68人包皮成纖維細(xì)胞的單層培養(yǎng)物，但要求該培養(yǎng)基中FBS水平提高到10％(V/V)(生長培養(yǎng)基)。
通常在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件下比如37℃、5％CO2中維持感染了新胞子蟲的哺乳動(dòng)物細(xì)胞單層培養(yǎng)物。若培養(yǎng)物中70-90％的哺乳動(dòng)物細(xì)胞已被感染(這可以利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)顯微觀察而確定)，則通常將速殖體傳代到未感染的單層培養(yǎng)物中。通過利用任何一種標(biāo)準(zhǔn)方法裂解宿主細(xì)胞并通過諸如過濾或離心等方法收集速殖體，可以從被感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲速殖體。
可按照上述方法，在含有胸苷的培養(yǎng)基中，于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)本發(fā)明的已被修飾并表現(xiàn)出dhfr--ts-表型的新胞子蟲細(xì)胞。
抗新胞子蟲的疫苗本發(fā)明提供了抗新胞子蟲病的疫苗，其中含有免疫有效量的經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞如前述的dhfr--ts-無效突變體，以及獸醫(yī)可接受性載體。
本發(fā)明還提供了制備可保護(hù)哺乳動(dòng)物以抗新胞子蟲病的疫苗的方法，其中包括制備經(jīng)修飾的活細(xì)胞如上述制備的表現(xiàn)dhfr--ts-表型的那些細(xì)胞，并以適于哺乳動(dòng)物施用的形式將免疫有效量的經(jīng)修飾的活細(xì)胞與獸醫(yī)可接受性載體組合起來。
如本文所用，術(shù)語“免疫有效量”是指經(jīng)一次施用或分多次施用后，一種哺乳動(dòng)物的一個(gè)成員被施用的本發(fā)明經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞的量足以誘導(dǎo)抗新胞子蟲病的保護(hù)性反應(yīng)。
詞語“足以誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)”在此處廣泛使用，包括由于疫苗接種而在動(dòng)物中誘導(dǎo)或增強(qiáng)任一種基于免疫的反應(yīng)(包括抗體，或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，或兩種情況兼而有之)，這樣的反應(yīng)可保護(hù)被接種動(dòng)物以抗新胞子蟲病。此處所用的術(shù)語“保護(hù)性反應(yīng)”和“保護(hù)”不僅指與同一種類的未被接種的感染動(dòng)物相比，接種動(dòng)物內(nèi)可絕對避免新胞子蟲病或可絕對避免導(dǎo)致新胞子蟲病的病原的感染，還指其中這類病原感染的程度或速率有任何可測的降低，或該疾病的嚴(yán)重程度、或由于該抗原感染導(dǎo)致的任何癥狀或狀態(tài)方面存在任何可測的降低，包括諸如在一種或多種組織中損傷的形成速率和絕對數(shù)量方面有任何可測的降低，或在流產(chǎn)發(fā)生、從懷孕哺乳動(dòng)物到其胎兒或從哺乳動(dòng)物親本到其后代的感染傳播等方面都存在任何可測的降低。
疫苗可簡單地含有小份培養(yǎng)液，所說的培養(yǎng)液中含有經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞，該細(xì)胞或者游離存在于培養(yǎng)基中，或者存在于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，或者是它們的組合。這種疫苗可對哺乳動(dòng)物直接施用；或代之以含有聯(lián)合使用了選自本領(lǐng)域所知的適于施用途徑的那些載體中的一種獸醫(yī)可接受性載體的經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞。較好是疫苗組合物中經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞仍保留了至少一定程度活性。例如，可利用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、載體、穩(wěn)定劑、稀釋劑、保存劑和/或溶劑按照通用方法將本發(fā)明的疫苗組合物制成制劑，也可以制成制劑以便于持續(xù)性釋放。稀釋劑可以包括水、鹽溶液、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨醇和乳糖等。穩(wěn)定劑可包括白蛋白等。在經(jīng)修飾的活疫苗中特別有用的合適的其它疫苗賦形劑和添加劑對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的，或者是顯而易見的。參見如Remington的藥物科學(xué)，第18版，1990,Mack Publishing，該書引入本文作為參考文獻(xiàn)。
可用于本發(fā)明疫苗中的經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞優(yōu)選是速殖體，但也可以是慢殖體或卵母細(xì)胞，或它們的某種組合。
只要該疫苗組合物中經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞仍保持了至少一定程度的活性，則本發(fā)明疫苗中還可含有一種或多種額外的免疫調(diào)節(jié)組分如佐劑或細(xì)胞因子等。可用于本發(fā)明疫苗中的佐劑的非限制性例子有RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc.,Hamilton,MT)，明礬、礦物質(zhì)凝膠比如氫氧化鋁凝膠、水包油乳劑、油包水乳劑比如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA),QS-21(Cambridge Biotech Inc.,CambridgeMA)和SAF-M(Chiron,Emeryville CA)，AMPHIGEN佐劑，皂苷、QuilA或其它皂苷組分，單磷酸類酯A和Avridine脂胺佐劑。在本發(fā)明疫苗中有用的水包油乳劑的非限制性的幾個(gè)特殊例子包括改進(jìn)的SEAM62和SEAM 1/2配方。改進(jìn)的SEAM62是一種水包油乳劑，其中含有5％(V/V)角鯊烯(Sigma)，1％(V/V)SPAN85去污劑(ICI Surfactants),0.7％(V/V)TWEEN80去污劑(ICI Surfactants),2.5％(V/V)乙醇，200μg/ml QuilA,100μg/ml膽甾醇以及0.5％(V/V)卵磷酯。改進(jìn)的SEAM 1/2是一種水包油乳劑，其中含有5％(V/V)角鯊烯，1％(V/V)SPAN85去污劑，0.7％(V/V)TWEEN80去污劑，2.5％(V/V)乙醇，100μg/ml QuilA，以及50μg/ml膽甾醇。疫苗中可包含的其它免疫調(diào)節(jié)劑包括諸如一種或多種白細(xì)胞介素、干擾素或其它已知的細(xì)胞因子。可將疫苗冷凍貯存，施用前再融化。
只要疫苗組合物中經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞仍保留有至少一定程度的活性，則可任選地將本發(fā)明的疫苗配制成可使已經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞持續(xù)性釋放的形式。這種持續(xù)性釋放劑型的例子包括聯(lián)合使用經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞與生物適應(yīng)性聚合物的組合物，比如聚乳酸、乳酸乙醇酸共聚物(poly(Lactic-co-glycolic acid)、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、膠原蛋白等。藥物傳遞賦形劑中可降解性聚合物的結(jié)構(gòu)、選擇和使用在一些出版物中都有綜述，包括A.Domb等，1992，用于高等技術(shù)的聚合物，3:279-292，該文引入本文作為參考文獻(xiàn)。選擇和在藥物劑型中使用聚合物的其它規(guī)則可見于M.Chasin和R.Langer(編),1990，“生物降解性聚合物用作藥物傳遞系統(tǒng)”，藥物和醫(yī)藥科學(xué)一書第45卷，M.Dekker，紐約，該文也引入本文作為參考文獻(xiàn)。另一方面或額外地，只要疫苗組合物中經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞仍保持了至少一定程度的活性，則可微囊包裝經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞以提高施用和效力。微囊包裝抗原的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，包括如美國專利3137631、美國專利3959457、美國專利4205060、美國專利4606940、美國專利4744933、美國專利5132117以及國際申請公開號WO95/28227等所記載的技術(shù)，所有這些出版物均引入本文作為參考文獻(xiàn)。
只要疫苗組合物中經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞仍保持了至少一定程度的活性，也可使用脂質(zhì)體以促使本發(fā)明經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞持續(xù)性釋放。有關(guān)如何制備和使用脂質(zhì)體劑型的細(xì)節(jié)可見于美國專利4016100、美國專利4452747、美國專利4921706、美國專利4927637、美國專利4944948、美國專利5008050和美國專利5009956，所有這些均引入本文作為參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明還提供了一種聯(lián)合疫苗，以用于保護(hù)哺乳動(dòng)物以抗新胞子蟲病和任選地會折磨哺乳動(dòng)物的一種或多種其它疾病或病理狀態(tài)，該聯(lián)合疫苗含有免疫有效量的第一組分、免疫有效量的第二組分，以及獸醫(yī)可接受性載體，所說的第一組分含有經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞，第二組分能誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)以抗一些會折磨哺乳動(dòng)物的疾病或病理狀態(tài)。
如本領(lǐng)域所知，聯(lián)合疫苗的第二組分的選擇是基于其能夠誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)以抗新胞子蟲病或會折磨哺乳動(dòng)物物種成員的其它疾病或病理狀態(tài)。只要在所獲得的疫苗組合物中經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞仍保留有至少一定程度的活性，則已知可用于特定哺乳動(dòng)物物種的疫苗組合物中的任何一種免疫組合物均可用于該聯(lián)合疫苗的第二組分中。這樣的免疫組合物包括但不限于可提供抵抗病原的保護(hù)性反應(yīng)的那些組合物，所說的病原選自牛皰疹病毒(與“感染性的牛鼻氣管炎”同物異名)，牛呼吸道合胞病毒，牛病毒性腹瀉病毒，Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型副流感病毒，鉤端螺旋體、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、支原體、克雷伯氏菌、沙門氏菌、輪狀病毒、冠形病毒、狂犬病病毒、溶血巴斯德氏菌、多殺巴斯德氏菌、梭狀芽孢桿菌屬種類(Clostridia spp.),Tetanus toxoid，大腸桿菌，隱孢子蟲屬種類(Cryptosporidium spp.)，艾美球蟲屬種類，毛滴蟲屬種類，以及其它真核生物寄生蟲等等。
只要該疫苗組合物中所說的細(xì)胞仍保留有活性，則如上所述，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗還可含有一種或多種額外的免疫調(diào)節(jié)組分，包括諸如佐劑或細(xì)胞因子?？衫鋬鲑A存該聯(lián)合疫苗的抗原，在施用前再將其融化。
本發(fā)明還提供了保護(hù)哺乳動(dòng)物以抗新胞子蟲病的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用一種疫苗，該疫苗中含有免疫有效量的本發(fā)明經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞以及獸醫(yī)可接受性載體。優(yōu)選經(jīng)胃腸外方式施用該疫苗，如皮下注射或肌肉內(nèi)注射。然而，該疫苗的施用方式也可以是腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，或其它途徑，包括諸如通過口腔、鼻內(nèi)、直腸、陰道、眼內(nèi)等途徑，或這些途徑的組合，也可通過本領(lǐng)域已知的延遲釋放器械等。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得如何按照選用的途徑制備疫苗組合物。
可通過常規(guī)途徑確定有效劑量，即先使用低劑量經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞，然后提高劑量并測定效果。確定每只動(dòng)物的最佳劑量時(shí)，應(yīng)考慮各種因素。最基本的是該動(dòng)物的品種、大小、年齡和一般狀態(tài)，動(dòng)物內(nèi)是否存在其它藥物、該動(dòng)物接種疫苗所抗的具體新胞子蟲品種或株系的毒性，等等。最好是參考其它動(dòng)物的研究結(jié)果后再確定實(shí)際劑量。
也可依據(jù)上述因素選擇疫苗的接種方法。取決于一系列因素，包括諸如其它動(dòng)物中暴發(fā)新胞子蟲病的時(shí)間等，可在特定動(dòng)物一生中的任何時(shí)間施用本發(fā)明的疫苗。該疫苗可施用給處于斷奶年齡或更年幼的動(dòng)物，也可施用給更成熟的動(dòng)物，如作為繁殖前疫苗以抗與新胞子蟲相關(guān)的先天性疾病或流產(chǎn)。為達(dá)到有效保護(hù)，可能僅需要原始疫苗接種，或也可能需要一次或多次輔助性疫苗接種。檢測是否已獲得了適當(dāng)免疫保護(hù)的一種方法是在接種疫苗后測定動(dòng)物中的血清轉(zhuǎn)變和抗體滴度。最好由獸醫(yī)根據(jù)對所有相關(guān)因素(其中一些在前文已有敘述)的分析來確定接種疫苗的時(shí)間和輔助劑的數(shù)量(如果有的話)。
疫苗中經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞的量優(yōu)選為約1×103-1×108/ml，更優(yōu)選為約1×105-1×107/ml。適當(dāng)?shù)膭┝看笮榇蠹s0.5ml-10ml，更優(yōu)選為大約1ml-5ml。
在保護(hù)哺乳動(dòng)物以抗新胞子蟲病方面，本發(fā)明的疫苗有所用處。如本文所用，術(shù)語“哺乳動(dòng)物”是指可利用本發(fā)明疫苗得到保護(hù)而抗新胞子蟲病的任何一種哺乳動(dòng)物物種，包括狗、牛、山羊、綿羊和馬等等。該疫苗在懷孕和未懷孕哺乳動(dòng)物的保護(hù)中都有用處。
本發(fā)明還提供了用于對哺乳動(dòng)物接種疫苗以抗新胞子蟲病的試劑盒，所說的試劑盒中包含兩種容器，第一種容器中含有免疫有效量的本發(fā)明經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞，第二種容器中含有獸醫(yī)可接受性載體或稀釋劑?？梢岳鋬鲂问劫A存該試劑盒中經(jīng)修飾的活細(xì)胞，在施用前再使其融化。
下述實(shí)施例僅是舉例說明，并不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例新胞子蟲DHFR-TS基因的分離擴(kuò)增N.caninum的DHFR結(jié)構(gòu)域的外顯子1依據(jù)已公開的鼠弓形體DHFR-TS基因的序列(Roos,1993，生物化學(xué)雜志，268:6269-6280)，設(shè)計(jì)并合成特異于鼠弓形體DHFR-TS基因外顯子1 DNA序列5′和3′末端的長度為20個(gè)堿基的寡核苷酸引物。使用GNOMETM試劑盒(Bio 101,La Jolla,CA)，利用生產(chǎn)商提供的試劑和方法，制備N.caninum的NC-1株系的基因組DNA。PCR反應(yīng)中使用了0.5μg基因組DNA，引物Tgdhfrexon 1-5′(5′-ATGCAGAAACCGGTGTGTCT)(SEQ ID NO:4)和Tgdhfrexon1-3′(5′-AGGGAAGAGGAAACGACGAT)(SEQ ID NO:5)各120pmol,dATP、dGTP、dCTP和dTTP(Perkin-Elmer,Norwalk,CT)各2.5mM,PCR緩沖液(Perkin-Elmer)，以及AMPLITAQTMDNA聚合酶(Perkin-Elmer)1.5單位。PCR循環(huán)設(shè)置為94℃1分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1分鐘進(jìn)行29個(gè)循環(huán)。
由上述得到約0.3kb的PCR片段，未經(jīng)進(jìn)一步處理，利用T4 DNA連接酶將該片段克隆到pCRⅡ載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。通過雙脫氧鏈末端終止測序法對該克隆的0.3kb片段進(jìn)行測序，并已確定該序列與鼠弓形體相應(yīng)的DHFR-TS基因外顯子1的序列同源性大于85％。
新胞子蟲DHFR-TS基因的克隆和測序在噬菌體載體λDASHⅡ(Stratagene,La Jolla,CA.)中構(gòu)建N.caninum NC-1株系的基因組DNA文庫。用α-32p-dCTP放射性標(biāo)記上述的約0.3kb的片段，并通過噬菌斑雜交，對大約5×105個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行篩選以獲得對所說的標(biāo)記片段具有反應(yīng)性的克隆。經(jīng)三輪篩選以富集反應(yīng)性克隆后，鑒定出12個(gè)可與該約0.3kb的片段反應(yīng)的噬菌體克隆。
利用λDNA分離系統(tǒng)(Qiagen,Chatsworth,CA)，按照生產(chǎn)商提供的方法，從所說的12個(gè)陽性克隆中的3個(gè)內(nèi)制備噬菌體λ克隆的DNA。利用NotⅠ消化已定名為λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)(也被定名為4C13或λCY50)的這些λ噬菌體克隆之一的DNA，以釋放出11kb的DNA片段，并按照Sambrook等，1989(出處同前)所述的方法對該片段進(jìn)行亞克隆。利用下述寡核苷酸，對含有該11kb DNA片段的質(zhì)粒亞克隆的DNA進(jìn)行PCR，這些寡核苷酸是依據(jù)DHFR-TS序列而設(shè)計(jì)的，序列分別為5′-CCCCTCGTGGACCGGCTGAATA(SEQ ID NO:6)；5′-TCCGTG CGTGCCAAGAGACTG(SEQ ID NO:7)；5′-ATGGAGATGGCGATGGGAGGAC(SEQ ID NO:8)；5′-AGTATGTACACGAAGCCTCAAT(SEQ ID NO:9).在PCR反應(yīng)中以下述組合使用寡核苷酸SEQ ID NO:6與8,SEQ IDNO:6與9；SEQ ID NO:7與8；以及SEQ ID NO:7與9。經(jīng)PCR得到了特異性產(chǎn)物，表明該11kb片段內(nèi)存在新胞子蟲DHFR-TS基因。對含有該11kb片段的質(zhì)粒亞克隆進(jìn)一步的限制性分析表明在一個(gè)NotⅠ位點(diǎn)的1.5kb范圍內(nèi)存在一個(gè)不對稱的HindⅢ位點(diǎn)。然后利用雙脫氧鏈末端測序方法，通過引物步行技術(shù)，確定從一側(cè)的NotⅠ位點(diǎn)到另一側(cè)的HindⅢ位點(diǎn)(約9.6kb)間的DNA序列。利用計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)DNASTARTM(DNASTAR Inc.,Madison,WI)，對上述獲得的DNA序列進(jìn)行分析。
上述測序片段的長度為9603bp(SEQ ID NO:1)，其中含有來自N.caninum NC-1株系的完整DHFR-TS基因的序列。將此新胞子蟲DHFR-TS基因的核苷酸序列與已公開的鼠弓形體DHFR-TS基因序列相比較以推測外顯子與內(nèi)含子的位置，以及DHFR和TS結(jié)構(gòu)域的邊界。推測該新胞子蟲DHFR-TS基因含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，位置如下外顯子1——由2405之前至2724；外顯子2——由3212至3348；外顯子3——由3925至4262；外顯子4——由4491至4737；外顯子5——由5214至5307；外顯子6——由5678至5750；外顯子7——由6129至6270；外顯子8——由6685至6777；外顯子9——由7264至7574；以及外顯子10——由8116至8199以后。在內(nèi)含子-外顯子連接處存在一致的剪切信號。根據(jù)其與已公開的鼠弓形體DHFR-TS序列的結(jié)構(gòu)相似性，推測DHFR結(jié)構(gòu)域?yàn)閺拇蠹s第2405nt至大約第4664nt，推測TS結(jié)構(gòu)域?yàn)閺拇蠹s第4665nt至大約第8199nt。
推測的編碼來自N.caninum NC-1株系的DHFR-TS蛋白的開放閱讀框(ORF)長度為1839bp(SEQ ID NO:2)。編碼推測的DHFR結(jié)構(gòu)域的ORF是從大約第1nt至大約第969nt，編碼推測的TS結(jié)構(gòu)域的ORF是從大約第970nt至大約第1836nt。N.caninum NC-1株系的DHFR-TS蛋白推斷的氨基酸序列長度為612個(gè)氨基酸(SEQ ID NO:3)。含有推測的DHFR結(jié)構(gòu)域的推斷氨基酸序列為從大約第1位氨基酸殘基至大約第323位氨基酸殘基；含有推測的TS結(jié)構(gòu)域的推斷氨基酸序列為從大約第324位氨基酸殘基至大約第612位氨基酸殘基。序列分析表明，N.caninum推斷的氨基酸序列和推測的鼠弓形體DHFR-TS序列之間，在DHFR結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在73個(gè)氨基酸差異，在TS結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在15個(gè)氨基酸差異。
生物材料保藏于1997年12月3日將下述生物材料保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,20852，美國，并給予了下述保藏號噬菌體λNcIDHFRTS ATCC No.209512上面所舉例的所有專利、專利申請和出版物均全文引入本文作為參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明并不限于本文所描述的特定實(shí)施方案的范圍，這些實(shí)施方案僅用于舉例說明本發(fā)明的各個(gè)方面。任何功能等同的組合物和方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，根據(jù)前述的說明，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，除了本文所示和記載的那些外，本發(fā)明的各種改進(jìn)也是顯而易見的。這樣的改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>Krishnan,B.RajendraYoder,S.ChristineDurtschi,Becky A.<120>編碼新胞子蟲二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶的DNA<130>DHFR-TS<140><141><150>60/067,507<151>1997-12-04<160>序列數(shù)9<170>Patent In Ver.2.0-beta<210>SEQ ID NO:1信息<211>9603<212>DNA<213>Neospora caninum<220><221>基因<222>(2405)..(8199)<400>SEQ ID NO:1gcggccgccg gcacaatgcc gagggcagcg cagggaaaaa ccggtcgaag ctgcttcacg 60tgtctgaaaa tagagccagc gctactgtcg cttcaaagaa cgagacttcc gcgccacaaa 120tcggtagtga cggtggccgg aagcgaaaat tttacgacga gcagctgcca gtcggtgtgt 180accgtcacca gcagaagtat gtcgcgaact gggtagatcc gaaaacccgg agacaaatca 240aggtctgttt ccccatcgac gtgtgGggag actctcaagc tcgcaacatg gctgccgttg 300cgaggcgtga gcgctgcgtg gatgctgacg aggtggctgc tattttcaat cgtgaagagc 360gcaccaagac atcaggacgt catccgagtc cttcgaggga tgacagcaaa cagacagcgt 420ctttcaatag tgctgttagg atgccagcag tccagggtgt ggattcaaaa acggagacgc 480actcggctcc ggcgctcgaa agcgcgtaga gcctgaggcc acaccacttc tggttttcag 540agagggcgtc gcactcacaa tttttttcga cttctttccg cacactgggg ccgtgtgctc 600gaacactttt tacccgtgtg 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3180tttcgtcctt cccttgttca acggttgtca gcaaagaaga agacatcgcg gcggagaagc 3240ctctagtcga aggccagcaa cgcgtgcgag tctgcgattc actccccgca gccctgcgcc 3300ttgtggacga agagtacaga gagtctgttg accagattta tgttgtgggt aggtgtgcca 3360agagcggcac agattcctct ctcgctcaga agtgcctggc aactgatctg cggcacgcgc 3420cgcggatccc gatgcacatt gaggcttcgt gtacatactc cctgcgagct accagagggg 3480ctgagaatct ccagataagc gtatatttct atgtgtttat gcatagatat ttagaacagg 3540ctgaggagat gcggggaagg ctgacactga cggaatgcct tgccgcccac cagcagagga 3600aggcggatgg ggacaacggc atgcagcctg ggacagcggc tgattcacgc cgacagcgca 3660gcccccgacg tcggtgaagc gtctcgaccg ccttttttgg cgcgcctctc cgttccttct 3720ttcgcccacg gcttcgtttc tctccattcc cactgcgtgt tggagcccgt ccgtccagtc 3780tctctcagtt ctcttctttc ccttcagttg ctgtactctt ttcgccgtgc tccagttcct 3840tgcgttgtgg ccttttccgc tcttcctatt ggcgtctcgc atccattgcg ttttctcggg 3900tggtatccct ccgcctgcct tcaggaggag cggggctcta tgaggaagcc ctgtctctgg 3960gcgtggtgtc tcacctctac atcacccgcg tggcgcgtga ctttccatgc gacgttttct 4020ttcccgcttt ccccggagac tccattcttt caaacaagca ggcggcctcc gcgagtcagc 4080cttcggctgc tgcggaaccg gtgtttgttc cgttttgccc ccagctcggg agagagaaga 4140gcaatgaagc gtcgtaccga cccatcttta tttcaaagac ctactcggac aacggagtgc 4200cctacgactt tgtggttctt gaaaaaggga ggaaggctga cgcttgcagc gccacggaat 4260cggtaagtgg ctacggaggg gaaaagacga gagaaagagc gggcatccgg aacgagtgtc 4320gcgaggcgac gttccatgcg tatccaagag agagggaaga gggaacacgc agcttgaggg 4380gtaagctacg cgctcttttc ttttctccgt ggccgcggga gacgccgtaa agatggtgca 4440aggacgcgca cgggcgtttc gccgttttcg gtttctgtcc actcttccag tgcgagcttc 4500gcggcccttg gacctccacc ggagagacgt cgccagagac gaggcttccg tcttcctccg 4560cctcagccgt tgcccaggtg ttggcttgga tggccgacga agaccggaaa aaatgcgaga 4620agaaagaaat cattcgggca gtgcctcacg tccactttcg gggccacgaa gaattccagt 4680acctcgacct cattgccgat attatcaaca acggagcgac aatggacgac cgaacgggta 4740aacgcgacca cgggaaggca tcccgttcat gcggggctgt ctgctgagcc tcggttcctt 4800cttccgcgct gtgcggcttt cccctggggt ctttgcttct ctctgttcgc cgccttgcct 4860gccacatttt cccttcattt tttttctctg tctcccttgc tcttttgtcc taacgttcgt 4920actcgccttc gtctcgcagt ccacgcttca aaacagacgg gctaccgaaa cgtgttttcc 4980ctctgcacgg cctttttcac acgccgttgt cgcttgactc tcgctgacgc ggggtttgcc 5040gcttcctgga agaaagaagg cctttcctca tctgttcgcc cttttcgctg tttcacagaa 5100agacgagaga gattccgtct ccattttctc aattcgcgtt tcgtgcccca agcagatgtg 5160ccctgatctg gaggctcttc gccgctcccc ttctcccctg tcgctgcttt caggcgttgg 5220agtcatctcc aagttcggct gtaccatgcg gttctcgctg gataaggcct tccctctcct 5280caccacaaag cgtgtgttct ggaaagggta cggcgcccta cagaaatctg tatatattta 5340acaggcacat gtgtgcgtgt ctgacctgca cacgtgttca taaacgtgca cgcaattgta 5400tgtggctgcc gtggagtcgt ccacgaacag gaaatattca catgcatgca ctctacagac 5460gtgcctggac tgcttctcta ccttcgtttg tctgtttatt tgctttaatt tcgcccggtg 5520accgtcgcgc ctctgtctga ccgtgcattt gcttgcgtct catcgtagtg tgcgtatcga 5580agacgagaga gcatgtgacg ctgttgtcta tgccgagtac gagaagtccg cacgacggtc 5640gctgaacgat gttcttttcc gtgtgggttg ctctcagagt cctcgaggag ctgttgtggt 5700tcatccgcgg tgacacgaac gcgaatcacc tctctgaaaa gggcgtaaag gcaagtcttc 5760aagcaccgct gctctcgttc aggctcctcc gcagacttgg cgctttcctt cgcggcgtca 5820cccctccgag gcttcacgct tacattgagt gtacccgttt gtcttctaga ccgtctgctg 5880cgtttgcagg cccccgcgtg agtgtaggcc cttcatcgtt gagtgtggcc gtagctttgc 5940gcgacgaaga cagtcgatag gcctttcaga gcacgttcct tctgtctccc gttttccccg 6000tttttttccg tgtcttcctc tgacagcctc gcacggctca catcccctct gagccgggac 6060agggctcgcc taaggcagag taccacgctc cgtaacttcc ggcatgcgtt tctgggtttt 6120cgttttagat ctgggacaag aatgtgacaa gagagttcct tgattcacgc aatctttccc 6180accgagaggt cggagacatc ggcccgggtt acggcttcca gtggagacac ttcggcgcga 6240cctacaagga catgcacacg gactacactg gtatgtcccg gcgttctttg aggggggaag 6300ggaaagcagc cgaacccgcg aaacggcgct gatgcctgtt ctcgcttcgt gtgctggacc 6360gaccgttcca gccatatcgc aggtttcaat agccgccaca aacggagatg aaaatgcaag 6420gcgacgactc tgcgctcgcg cacaactggt gacagacgcc actccgtgtg gacgaattcg 6480gttgcaaact gccaagcgat gaaagggccg tcgggtggta actccgtgcc cgggcgcttg 6540cacacaaata cccgtgtgtg tgtgtgtgtg cgtatgttga tgcaaagata cccctacgtg 6600tgcatgtgta catacacgtg agaaattggt gcccgtcgtt gaaaaatgct cactcccatc 6660cctcctggcg ttgcccattt gcaggccagg gcgtagacca actgaagaag gtgatcaaca 6720tgctgagaac gaatccaaca gaccggcgca tgctcatgac cgcttggaac cctgcgggtg 6780agatctctgt cttcaatctc tcctttccag ataatacgtg catttcaact ggaagctctt 6840acacagccgt gtgcacaacg ggaagacgct gacacatacg tgttggtccc cccaacgtta 6900tcttccgtgc cgtatctgtg tggctgctcc tctaaggtta ttgcgccgtg gtgatgtctc 6960tcgtatctcg tctgtgcttt tcgctggatg cctctgtgcc tagacatctc aaagtgtccc 7020tcccgtgtgg ggtcccgcga aacacttgcc actggccttt tcgcctcttg ccgctgtcgt 7080ctgttcctcg ggattcccta ctcggggacc tgccggtttc agtgcctttc ctccgcgggt 7140gcttcttccc ccgtcctcgc gccttgtgtt tctttgccgt ggcgactgcg ccgccgtgca 7200tgctgctcac ttccccccgt gcgcgtgtgt tttgtcctcg ccgtctctct ctttcccgtt 7260cagcgctgga cgaaatggcg ttgccgcctt gccacttgct gtgtcagttc tacgtggaga 7320acgacagaga cttgtcttgc gtcatgtatc agcggtcctg cgacgttggc ctcggggtgc 7380cgttcaacat tgcgtcctat tcccttctga cgctcatggt tgcgcacgtc tgcaacctga 7440agccgaagga gttcattcac ttcatgggca acacgcacgt ctactcgaac cacgtcgagg 7500ccctgaagga gcagctgcgc agagaaccga gacctttccc catcgtgaac accctgaaca 7560aggaacgcat ccaggtgcga agcaactggg aaggaaacgg cacaacggac acgcaaacaa 7620gcagaagagg cgaaacggac gacggcagcc gaggccccgg ccactgcgag ccgagcgcag 7680acacgctgct tccagccggc ctatattcgg aaagaaaggg acagtgtcga agggagcaca 7740cgagacgcaa caacgaaaag gaaacgcgat gcgtcgcaga tcggctcacc tatgtggtgc 7800gcggtgcggc gcccagatgg cgcggctgca gcgctcgaag gaagactgtc tttgggtgcg 7860tgtgaacgtt tgtccctgac gcgcggctga cagaacatga gagggctttt ttctgtgttg 7920cacgctctcc ggatgcatct ctttctgtgc cacgggaagc aaagacgtgt gtgttccccg 7980ggaattcgga aaagacccga gcatccgctg ccggcgatgg ggggggaggg gccgggcatt 8040ggatgcctcc cgcctcgtct tgtcgacggc cccaaaaccc gtcagtgcca cgttgtttgt 8100gagtgtgttc gccaggaaat cgacgacttc accgccgagg atttcgaggt cgtgggctac 8160gtgccgcatg gacgaatcca gatggagatg gctgtttagt ggaaaaatct gaaatatata 8220tatatatata tatatatata tatatatagg ttcctggttt tgcaccgttt tttcttctcc 8280ctccgaaggc attggtgaga gagcggtgga tgcgagggcg ctgaggccaa ctcagcggct 8340gtttggtccc tcggggaagc aagaaacggg tttcgcttcg ccccgttgct ttccgaaaca 8400accttaccgc gtttcaaagt cttttctctt tgtcaatgag cgccactact ttgtgggagt 8460cacgaatgtg cgcgtatccg gccttgtatg gaggtgcggc tgccgcgctc gtcgccggaa 8520cgctggactg tctgttgctt tcggggcctc tggcgtgctg cggcgtgggc gggggagtgg 8580caggcgctac ccccccgtcg gtcctcggtg tgcttttgac tcttggcgag tgcgtgaaac 8640ctaaatctcg acttgtttcg ctcgataagc tgcacactga gcactgaaga gttccccgca 8700cattatgagg ccgcgcgctc tttcgcgcct ggcacacacg cctaacacag ggtagctgcc 8760tgataaactg cctatcgcca ccaagggagc tgcctagcca agttgtcggt ggacaaaagt 8820cctcacacgc cccgcagacc cggaagcaca cgtttcagag accaccggaa atgcatagtt 8880cttcgtgccc tcgtcgttaa atacgtttcc tgtctcgtct gctggttttt gcttcgtgcg 8940ttcgctcgcg ctaagatgtc tagaaacggt ggacgccgtt tgcggctctc tctgccgccc 9000ttccgctgtg acttttccga cctgacctca cgcgcgtgtt ccacgtgaga caaccggtcg 9060gcggccgagg caggagactt gcgagaaagg aaacaagtcg gatgcacgaa cgtacgtaac 9120cccgcctcca aagttccccg ctccaaagag gaacgcggcg aggcgactcc tccggcgttg 9180cctacctcgc ctccacgcct aaagaggact gcagtgggtc gacgctcccg tccgcattgt 9240aaaaaagggg aaacaagacg agattcacgt ggaagaacca gaaacaacac cgaagcgacg 9300ctgtcaatcc ccacgggcgc gcagccttct cccgaccgca ctccgccgca tgcaagagcc 9360ctcgagtgct cccccgcagc tggcctttcc ctgtcgcctt ggaagcagag tgaacacaaa 9420gagcagagac tagccagggc gaggaagcct cagaaaaact gacggcgagg aacggcagtc 9480cgccggaaac aggggaaggc agacggcgaa tccgccgccg aagagaggac aaaaagagaa 9540gaaaaaaggc aaccgcgtgc cgaaaactgg gtaacgggac gacaggcagg aggcataaag 9600ctt 9603<210>SEQ ID NO:2信息<211>1839<212>DNA<213>Neospora caninum<220><221>CDS<222>(1)..(1839)<400>SEQ ID NO:2atg cag aaa cca gtg tct ctt att gcc gcg atg acc ccc agg agg ggc48Met Gln Lys Pro Val Ser Leu Ile Ala Ala Met Thr Pro Arg Arg Gly1 5 10 15atc ggc gtc aac aac ggc ctg cca tgg ccc cac ttg gcc aca gat ttc96Ile Gly Val Asn Asn Gly Leu Pro Trp Pro His Leu Ala Thr Asp Phe20 25 30aaa cac ttt tct cgc gtg acg aaa acg acg gcc gac gaa gtc tct cgc 144Lys His Phe Ser Arg Val Thr Lys Thr Thr Ala Asp Glu Val Ser Arg35 40 45ctg aac gca tgg ctt ccg aaa aaa att gcc aag acg ggc gat tcg gga 192Leu Asn Ala Trp Leu Pro Lys Lys Ile Ala Lys Thr Gly Asp Ser Gly50 55 60ctt ccc tct ccc gcc ttc ggt gtc aac aga ttc aac gct gtt gtc atg 240Leu Pro Ser Pro Ala Phe Gly Val Asn Arg Phe Asn Ala Val Val Met65 70 75 80gga cga aaa acc tgg gag agc ttg ccg cta aaa ttt cgt ccc ctc gtg 288Gly Arg Lys Thr Trp Glu Ser Leu Pro Leu Lys Phe Arg Pro Leu Val85 90 95gac cgg ctg aat atc gtg gtt tcc tcc tcc ctc aaa gaa gaa gac atc 336Asp Arg Leu Asn Ile Val Val Ser Ser Ser Leu Lys Glu Glu Asp Ile100 105 110gcg gcg gag aag cct cra gtc gaa ggc cag caa cgc gtg cga gtc tgc 384Ala Ala Glu Lys Pro Leu Val Glu Gly Gln Gln Arg Val Arg Val Cys115 120 125gat tca ctc ccc gca gcc ctg cgc ctt gtg gac gaa gag tac aga gag 432Asp Ser Leu Pro Ala Ala Leu Arg Leu Val Asp Glu Glu Tyr Arg Glu130 135 140tct gtt gac cag att tat gtt gtg gga gga gcg ggg ctc tat gag gaa 480Set Val Asp Gln Ile Tyr Val Val Gly Gly Ala Gly Leu Tyr Glu Glu145 150 155 160gcc ctg tct ctg ggc gtg gtg tct cac ctc tac atc acc cgc gtg gcg 528Ala Leu Ser Leu Gly Val Val Ser His Leu Tyr Ile Thr Arg Val Ala165 170 175cgt gac ttt cca tgc gac gtt ttc ttt ccc gct ttc ccc gga gac tcc 576Arg Asp Phe Pro Cys Asp Val Phe Phe Pro Ala Phe Pro Gly Asp Ser180 185 190att ctt tca aac aag cag gcg gcc tcc gcg agt cag cct tcg gct gct 624Ile Leu Ser Asn Lys Gln Ala Ala Ser Ala Ser Gln Pro Ser Ala Ala195 200 205gcg gaa ccg gtg ttt gtt ccg ttt tgc ccc cag ctc ggg aga gag aag 672Ala Glu Pro Val Phe Val Pro Phe Cys Pro Gln Leu Gly Arg Glu Lys210 215 220agc aat gaa gcg tcg tac cga ccc atc ttt att tca aag acc tac tcg 720Ser Asn Glu Ala Ser Tyr Arg Pro Ile Phe Ile Ser Lys Thr Tyr Ser225 230 235 240gac aac gga gtg ccc tac gac ttt gtg gtt ctt gaa aaa ggg agg aag 768Asp Asn Gly Val Pro Tyr Asp Phe Val Val Leu Glu Lys Gly Arg Lys245 250 255gct gac gct tgc agc gcc acg gaa tcg tgc gag ctt cgc ggc cct tgg 816Ala Asp Ala Cys Ser Ala Thr Glu Ser Cys Glu Leu Arg Gly Pro Trp260 265 270acc tcc acc gga gag acg tcg cca gag acg agg ctt ccg tct tcc tcc 864Thr Ser Thr Gly Glu Thr Ser Pro Glu Thr Arg Leu Pro Ser Ser Ser275 280 285gcc tca gcc gtt gcc cag gtg ttg gct tgg atg gcc gac gaa gac cgg 912Ala Ser Ala Val Ala Gln Val Leu Ala Trp Met Ala Asp Glu Asp Arg290 295 300aaa aaa tgc gag aag aaa gaa atc att cgg gca gtg cct cac gtc cac 960Lys Lys Cys Glu Lys Lys Glu Ile Ile Arg Ala Val Pro His Val His305 310 315 320ttt cgg ggc cac gaa gaa ttc cag tac ctc gac ctc att gcc gat att1008Phe Arg Gly His Glu Glu Phe Gln Tyr Leu Asp Leu Ile Ala Asp Ile325 330 335atc aac aac gga gcg aca atg gac gac cga acg ggc gtt gga gtc atc1056Ile Asn Asn Gly Ala Thr Met Asp Asp Arg Thr Gly Val Gly Val Ile340 345 350tcc aag ttc ggc tgt acc atg cgg ttc tcg ctg gat aag gcc ttc cct1104Ser Lys Phe Gly Cys Thr Met Arg Phe Ser Leu Asp Lys Ala Phe Pro355 360 365ctc ctc acc aca aag cgt gtg ttc tgg aaa gga gtc ctc gag gag ctg1152Leu Leu Thr Thr Lys Arg Val Phe Trp Lys Gly Val Leu Glu Glu Leu370 375 380ttg tgg ttc atc cgc ggt gac acg aac gcg aat cac ctc tct gaa aag1200Leu Trp Phe Ile Arg Gly Asp Thr Asn Ala Asn His Leu Ser Glu Lys385 390 395 400ggc gta aag atc tgg gac aag aat gtg aca aga gag ttc ctt gat tca1248Gly Val Lys Ile Trp Asp Lys Asn Val Thr Arg Glu Phe Leu Asp Ser405 410 415cgc aat ctt tcc cac cga gag gtc gga gac atc ggc ccg ggt tac ggc1296Arg Asn Leu Ser His Arg Glu Val Gly Asp Ile Gly Pro Gly Tyr Gly420 425 430ttc cag tgg aga cac ttc ggc gcg acc tac aag gac atg cac acg gac1344Phe Gln Trp Arg His Phe Gly Ala Thr Tyr Lys Asp Met His Thr Asp435 440 445tac act ggt cag ggc gta gac caa ctg aag aag gtg atc aac atg ctg1392Tyr Thr Gly Gln Gly Val Asp Gln Leu Lys Lys Val Ile Asn Met Leu450 455 460aga acg aat cca aca gac cgg cgc atg ctc atg acc gct tgg aac cct1440Arg Thr Asn Pro Thr Asp Arg Arg Met Leu Met Thr Ala Trp Asn Pro465 470 475 480gcg gcg ctg gac gaa atg gcg ttg ccg cct tgc cac ttg ctg tgt cag1488Ala Ala Leu Asp Glu Met Ala Leu Pro Pro Cys His Leu Leu Cys Gln485 490 495ttc tac gtg gag aac gac aga gac ttg tct tgc gtc atg tat cag cgg1536Phe Tyr Val Glu Asn Asp Arg Asp Leu Set Cys Val Met Tyr Gln Arg500 505 510tcc tgc gac gtt ggc ctc ggg gtg ccg ttc aac att gcg tcc tat tcc 1584Ser Cys Asp Val Gly Leu Gly Val Pro Phe Asn Ile Ala Ser Tyr Ser515 520 525ctt ctg acg ctc atg gtt gcg cac gtc tgc aac ctg aag ccg aag gag 1632Leu Leu Thr Leu Met Val Ala His Val Cys Asn Leu Lys Pro Lys Glu530 535 540ttc att cac ttc atg ggc aac acg cac gtc tac tcg aac cac gtc gag 1680Phe Ile His Phe Met Gly Asn Thr His Val Tyr Ser Asn His Val Glu545 550 555 560gcc ctg aag gag cag ctg cgc aga gaa ccg aga cct ttc ccc atc gtg 1728Aia Leu Lys Glu Gln Leu Arg Arg Glu Pro Arg Pro Phe Pro Ile Val565 570 575aac atc ctg aac aag gaa cgc atc cag gaa atc gac gac ttc acc gcc 1776Asn Ile Leu Asn Lys Glu Arg Ile Gln Glu Ile Asp Asp Phe Thr Ala580 585 590gag gat ttc gag gtc gtg ggc tac gtg ccg cat gga cga atc cag atg 1824Glu Asp Phe Glu Val Val Gly Tyr Val Pro His Gly Arg Ile Gln Met595 600 605gag atg gct gtt tag 1839Glu Met Ala Val610<210>SEQ ID NO:3信息<211>612<212>PRT<213>Neospora caninum<400>SEQ ID NO:3Met Gln Lys Pro Val Ser Leu Ile Ala Ala Met Thr Pro Arg Arg Gly1 5 10 15Ile Gly Val Asn Asn Gly Leu Pro Trp Pro His Leu Ala Thr Asp Phe20 25 30Lys His Phe Ser Arg Val Thr Lys Thr Thr Ala Asp Glu Val Ser Arg35 40 45Leu Asn Ala Trp Leu Pro Lys Lys Ile Ala Lys Thr Gly Asp Ser Gly50 55 60Leu Pro Ser Pro Ala Phe Gly Val Asn Arg Phe Asn Ala Val Val Met65 70 75 80Gly Arg Lys Thr Trp Glu Ser Leu Pro Leu Lys Phe Arg Pro Leu Val85 90 95Asp Arg Leu Asn Ile Val Val Ser Ser Ser Leu Lys Glu Glu Asp Ile100 105 110Ala Ala Glu Lys Pro Leu Val Glu Gly Gln Gln Arg Val Arg Val Cys115 120 125Asp Ser Leu Pro Ala Ala Leu Arg Leu Val Asp Glu Glu Tyr Arg Glu130 135 140Ser Val Asp Gln Ile Tyr Val Val Gly Gly Ala Gly Leu Tyr Glu Glu145 150 155 160Ala Leu Ser Leu Gly Val Val Ser His Leu Tyr Ile Thr Arg Val Ala165 170 175Arg Asp Phe Pro Cys Asp Val Phe Phe Pro Aia Phe Pro Gly Asp Ser180 185 190Ile Leu Ser Asn Lys Gln Ala Ala Ser Ala Ser Gln Pro Ser Ala Ala195 200 205Ala Glu Pro Val Phe Val Pro Phe Cys Pro Gln Leu Gly Arg Glu Lys210 215 220Ser Asn Glu Ala Ser Tyr Arg Pro Ile Phe Ile Ser Lys Thr Tyr Ser225 230 235 240Asp Asn Gly Val Pro Tyr Asp Phe Val Val Leu Glu Lys Gly Arg Lys245 250 255Ala Asp Ala Cys Ser Ala Thr Glu Ser Cys Glu Leu Arg Gly Pro Trp260 265 270Thr Ser Thr Gly Glu Thr Ser Pro Glu Thr Arg Leu Pro Ser Ser Ser275 280 285Ala Ser Ala Val Ala Gln Val Leu Ala Trp Met Ala Asp Glu Asp Arg290 295 300Lys Lys Cys Glu Lys Lys Glu Ile Ile Arg Ala Val Pro His Val His305 310 315 320Phe Arg Gly His Glu Glu Phe Gln Tyr Leu Asp Leu Ile Ala Asp Ile325 330 335Ile Asn Asn Gly Ala Thr Met Asp Asp Arg Thr Gly Val Gly Val Ile340 345 350Ser Lys Phe Gly Cys Thr Met Arg Phe Ser Leu Asp Lys Ala Phe Pro355 360 365Leu Leu Thr Thr Lys Arg Val Phe Trp Lys Gly Val Leu Glu Glu Leu370 375 380Leu Trp Phe Ile Arg Gly Asp Thr Asn Ala Asn His Leu Ser Glu Lys385 390 395 400Gly Val Lys Ile Trp Asp Lys Asn Val Thr Arg Glu Phe Leu Asp Ser405 410 415Arg Asn Leu Ser His Arg Glu Val Gly Asp Ile Gly Pro Gly Tyr Gly420 425 430Phe Gln Trp Arg His Phe Gly Ala Thr Tyr Lys Asp Met His Thr Asp435 440 445Tyr Thr Gly Gln Gly Val Asp Gln Leu Lys Lys Val Ile Asn Met Leu450 455 460Arg Thr Asn Pro Thr Asp Arg Arg Met Leu Met Thr Ala Trp Asn Pro465 470 475 480Ala Ala Leu Asp Glu Met Ala Leu Pro Pro Cys His Leu Leu Cys Gln485 490 495Phe Tyr Val Glu Asn Asp Arg Asp Leu Ser Cys Val Met Tyr Gln Arg500 505 510Ser Cys Asp Val Gly Leu Gly Val Pro Phe Asn Ile Ala Ser Tyr Ser515 520 525Leu Leu Thr Leu Met Val Ala His Val Cys Asn Leu Lys Pro Lys Glu530 535 540Phe Ile His Phe Met Gly Asn Thr His Val Tyr Ser Asn His Val Glu545 550 555 560Ala Leu Lys Glu Gln Leu Arg Arg Glu Pro Arg Pro Phe Pro Ile Val565 570 575Asn Ile Leu Asn Lys Glu Arg Ile Gln Glu Ile Asp Asp Phe Thr Ala580 585 590Glu Asp Phe Glu Val Val Gly Tyr Val Pro His Gly Arg Ile Gln Met595 600 605Glu Met Ala Val610<210>SEQ ID NO:4信息<211>20<212>DNA<213>Neospora caninum<400>SEQ ID NO:4atgcagaaac cggtgtgtct20<210>SEQ ID NO:5信息<211>20<212>DNA<213>Neospora caninum<400>SEQ ID NO:5agggaagagg aaacgacgat 20<210>SEQ ID NO:6信息<211>22<212>DNA<213>Neospora caninum<400>SEQ ID NO:6cccctcgtgg accggctgaa ta22<210>SEQ ID NO:7信息<211>21<212>DNA<213>Neospora caninum<400>SEQ ID NO:7tccgtgcgtg ccaagagactg 21<210>SEQ ID NO:8信息<211>22<212>DNA<213>Neospora caninum<400>SEQ ID NO:8atggagatgg cgatgggagg sc22<210>SEQ ID NO:9信息<211>22<212>DNA<213>Neospora caninum<400>SEQ ID NO:9agtatgtaca cgaagcctca at2權(quán)利要求
1．一種分離的多核苷酸分子，其中含有編碼新胞子蟲DHFR-TS蛋白的核苷酸序列。
2．權(quán)利要求1的分離的多核苷酸分子，其中所說的DHFR-TS蛋白含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或含有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。
3．權(quán)利要求2的分離的多核苷酸分子，其中含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列，或與存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
4．與含有下述核苷酸序列的多核苷酸分子基本上同源的分離的多核苷酸分子(a)SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列；或(b)存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因的核苷酸序列；或(c)SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
5．含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子，所說的新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQID NO:3的氨基酸序列，或具有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。
6．由下述多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所組成的分離的多核苷酸分子(a)含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)含有存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因的核苷酸序列的多核苷酸分子；(c)含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的多核苷酸分子；(d)與(a)、(b)或(c)中的多核苷酸分子中的任何一種基本上同源的多核苷酸分子；或(e)含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的一種多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子，所說的新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQID NO:3的氨基酸序列，或具有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。
7．權(quán)利要求6的多核苷酸分子，其由編碼下述蛋白質(zhì)或多肽的肽片段的核苷酸序列所組成(a)由SEQ ID NO:3的氨基酸序列或存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列所組成的DHFR-TS蛋白；或(b)與一種新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽，所說的新胞子蟲DHFR-TS蛋白由SEQ ID NO:3的氨基酸序列或存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列所組成。
8．權(quán)利要求7的多核苷酸分子，其由編碼DHFR-TS蛋白的DHFR結(jié)構(gòu)域或TS結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列所組成。
9．含有N.caninum的DHFR-TS基因的原位旁側(cè)區(qū)的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列選自如SEQ ID NO:1所示的旁側(cè)核苷酸序列。
10．一種重組載體，其含有(a)含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)含有與存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸分子；(c)含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的多核苷酸分子；(d)與(a)、(b)或(c)中的多核苷酸分子中的任何一種基本上同源的多核苷酸分子；(e)含有編碼與新胞子蟲DHFR-TS蛋白基本上同源的一種多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子，所說的新胞子蟲DHFR-TS蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或具有由存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列；或者(f)由(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的多核苷酸分子中任何一種的基本部分的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。
11．權(quán)利要求10的重組載體，其中所說的多核苷酸分子含有SEQ IDNO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列。
12．按照權(quán)利要求11的重組載體，其是噬菌體λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)。
13．一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求10的重組載體。
14．一種基本上純化好的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或含有存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。
15．一種基本上已純化好的多肽，該多肽與權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)基本上同源。
16．權(quán)利要求14或15的蛋白質(zhì)的肽片段。
17．權(quán)利要求16的肽片段，其由分離的新胞子蟲DHFR或TS結(jié)構(gòu)域所組成。
18．一種可與新胞子蟲DHFR-TS蛋白特異性反應(yīng)的抗體，所說的新胞子蟲DHFR-TS蛋白含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或含有噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因所編碼的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。
19．可用于失活新胞子蟲DHFR-TS基因的遺傳構(gòu)建體，所說的遺傳構(gòu)建體包含(a)含有SEQ ID NO:1中從大約第2405nt至大約第8199nt的核苷酸序列或含有與存在于噬菌體λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)內(nèi)的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的多核苷酸分子；(c)與(a)或(b)中的任何一種多核苷酸分子基本上同源的多核苷酸分子；或者(d)由(a)、(b)或(c)中的任何一種多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子；但其中(a)、(b)、(c)或(d)的多核苷酸分子的核苷酸序列還含有一個(gè)或多個(gè)可失活新胞子蟲DHFR-TS基因或所說基因的一部分的突變；或者含有由新胞子蟲DHFR-TS基因開放閱讀框的原位旁側(cè)區(qū)的一種或多種核苷酸序列所組成的多核苷酸分子；從而使得用該遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化新胞子蟲細(xì)胞會導(dǎo)致新胞子蟲DHFR-TS基因或其一部分的失活。
20．權(quán)利要求19的遺傳構(gòu)建體，其中還含有選擇標(biāo)記。
21．權(quán)利要求19的遺傳構(gòu)建體，其在破壞DHFR-TS基因的DHFR結(jié)構(gòu)域或TS結(jié)構(gòu)域方面有用處。
22．經(jīng)權(quán)利要求19的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的新胞子蟲細(xì)胞。
23．權(quán)利要求22的新胞子蟲細(xì)胞，其表現(xiàn)出dhfr-或ts-或dhfr--ts-表型。
24．一種制備經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞的方法，其中包括用權(quán)利要求19的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化新胞子蟲細(xì)胞，并篩選出由于所說的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的表現(xiàn)dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
25．一種用于保護(hù)哺乳動(dòng)物以抗新胞子蟲病的疫苗，其中含有免疫有效量的表現(xiàn)dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型的經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞，以及獸醫(yī)可接受性載體。
26．權(quán)利要求25的疫苗，其中由于經(jīng)權(quán)利要求19的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，所述經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞表現(xiàn)出dhfr-或ts-或dhfr--ts突變體表型。
27．權(quán)利要求25的疫苗，其中還含有佐劑或細(xì)胞因子。
28．權(quán)利要求27的疫苗，其中所說的佐劑選自由下述組成之組RIBI佐劑系統(tǒng)，明礬，礦物質(zhì)凝膠，水包油乳劑，油包水乳劑，嵌段共聚物，QS-21,SAF-M,AMPHIGEN佐劑，皂苷，Quil A，單磷酸類脂A,Avridine脂胺佐劑，SEAM62和SEAM 1/2。
29．一種制備抗新胞子蟲病的疫苗的方法，其中包括聯(lián)合使用免疫有效量的經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞與獸醫(yī)可接受性載體，所說的經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞表現(xiàn)出dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型。
30．對哺乳動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種以抗新胞子蟲病的方法，其中包括給哺乳動(dòng)物施用免疫有效量的經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞，所說的經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞表現(xiàn)出dhfr-或ts-或dhfr--ts-的突變體表型。
31．用于保護(hù)哺乳動(dòng)物以抗新胞子蟲病以及任選地會折磨哺乳動(dòng)物的一種或多種其它疾病或病理狀態(tài)的聯(lián)合疫苗，該聯(lián)合疫苗中含有免疫有效量的第一組分、免疫有效量的第二組分以及獸醫(yī)可接受性載體，所說的第一組分中含有表現(xiàn)dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型的經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞，所說的第二組分能夠誘導(dǎo)抗其它會折磨哺乳動(dòng)物的疾病或病理狀態(tài)的保護(hù)性反應(yīng)。
32．權(quán)利要求31的聯(lián)合疫苗，其中所說的第二組分能夠誘導(dǎo)抵抗病原的保護(hù)性反應(yīng)，所說的病原選自由下述組成之組牛皰疹病毒，牛呼吸道合胞病毒，牛病毒性腹瀉病毒，Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型副流感病毒，鉤端螺旋體，彎曲桿菌，金黃色葡萄球菌，無乳鏈球菌，支原體，克雷伯氏菌，沙門氏菌，輪狀病毒，冠形病毒，狂犬病病毒，溶血巴斯德氏菌，多殺巴斯德氏菌，梭狀芽孢桿菌屬種類，Tetanus toxoid，大腸桿菌，隱孢子蟲屬種類，艾美球蟲屬種類，毛滴蟲屬種類。
33．用于對哺乳動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種以抗新胞子蟲病的試劑盒，其中含有兩種容器，第一種容器中具有免疫有效量的經(jīng)修飾的活新胞子蟲細(xì)胞，該細(xì)胞表現(xiàn)dhfr-或ts-或dhfr--ts-突變體表型，第二種容器中具有獸醫(yī)可接受性載體或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有編碼新胞子蟲DHFR－TS蛋白的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子,該多核苷酸分子在制備抗新胞于蟲病的經(jīng)修飾的活疫苗中有用處,并可用作診斷試劑。本發(fā)明還提供了克隆和表達(dá)載體,已被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,基本上已純化好的DHFR－TS蛋白和肽片段,可用于定位基因缺失的遺傳構(gòu)建體,以及疫苗組合物。
文檔編號A61P31/04GK1225945SQ9812298
公開日1999年8月18日 申請日期1998年12月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月4日
發(fā)明者B·R·克里斯南, B·A·德茨奇, S·C·友德 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司