專(zhuān)利名稱(chēng)：四氫呋喃類(lèi)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為醫(yī)藥有用的、具有抗癌作用等生理活性的新穎的四氫呋喃類(lèi)，進(jìn)而涉及該化合物的制備方法。
已有技術(shù)過(guò)去使用用于臨床治療的藥物有多種，例如烷基化劑、代謝阻滯劑、植物生物堿等抗癌劑、抗生物質(zhì)、免疫調(diào)節(jié)劑等等，但是這些藥物的治療方法尚不能說(shuō)已經(jīng)完成。
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明目的在于提供開(kāi)發(fā)具有抗癌作用等生理作用的、安全性高的新穎的化合物，該化合物的制備方法，以及含有該化合物的醫(yī)藥。解決課題的手段概括地講，本發(fā)明中第一發(fā)明涉及下式I表示的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸(2，5-dihydroxytetrahydro-2-furancarboxylic acid)或其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽。

本發(fā)明中第二發(fā)明涉及由式I表示的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸或其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽的制備方法，其特征在于包括對(duì)從下述(a)和(b)中選出的至少一種化合物的加熱處理工序(a)葡糖二酸或葡糖二酸衍生物(b)含有葡糖二酸和/或葡糖二酸衍生物的化合物。
本發(fā)明中第三發(fā)明涉及一種醫(yī)藥，其特征在于作為有效成份含有從式I表示的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸或其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽中選出的化合物。
在本發(fā)明中第三發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所說(shuō)的醫(yī)藥是抗癌劑。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明附

圖1是表示葡糖二酸的酸性熱處理產(chǎn)物吞噬誘導(dǎo)作用的曲線圖。
附圖2是表示D-葡糖二酸1，4-二內(nèi)酯熱處理產(chǎn)物吞噬誘導(dǎo)作用的曲線圖。
附圖3是2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸的質(zhì)譜圖。
附圖4是2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸的紫外吸收光譜圖。
附圖5是2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸的1H-核磁共振光譜圖。
附圖6是2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸的13C-核磁共振光譜圖。
發(fā)明的實(shí)施方式以下具體說(shuō)明本發(fā)明。
葡糖二酸(Glucaric acid)也叫糖二酸(Saccharic acid)，用分子式C6H10O8(分子量210.14)表示，是用硝酸等將D-葡萄糖及含有該糖的低聚糖和多糖類(lèi)氧化得到的二元羧酸，D-葡糖醛酸經(jīng)溴水氧化也能得到。此外，從橡膠樹(shù)(Ficus elastica)的膠乳中也能以鎂鹽形式萃取出來(lái)。葡糖二酸衍生物的實(shí)例有葡糖二酸單內(nèi)酯、葡糖二酸二內(nèi)酯、葡糖二酸酯、葡糖二酸酰胺、鹽類(lèi)等，熱處理生成式I表示的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸的全部物質(zhì)也包括在本發(fā)明之中。本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸在2-位和5-位上雖然包含兩個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子，但是本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸包含全部四種異構(gòu)體，即(2S，5S)體、(2S，5R)體、(2R，5S)體和(2R，5R)體。所說(shuō)的葡糖二酸內(nèi)酯，有1，4-單內(nèi)酯、3，6-單內(nèi)酯、1，4-3，6-雙內(nèi)酯，可以使用這些內(nèi)酯。
所說(shuō)的葡糖二酸酯，例如有甲酯、乙酯等，可以用葡糖二酸制備。酰胺化物也可以利用酰胺化法制備，也可以分別制備含有葡糖二酸衍生物的化合物，例如含有葡糖二酸內(nèi)酯的化合物、含有葡糖二酸酯的化合物、含有葡糖二酸酰胺的化合物。
本發(fā)明中所說(shuō)的葡糖二酸或葡糖二酸衍生物，以及所說(shuō)的含有葡糖二酸和/或葡糖二酸衍生物的化合物，只要在其熱處理產(chǎn)物中生成式I表示的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸即可，并無(wú)特別限定。
本發(fā)明中的熱處理方法，可以舉出將從葡糖二酸或葡糖二酸衍生物，以及含有葡糖二酸和/或葡糖二酸衍生物的化合物中選出的化合物，例如在酸性～中性條件下，于室溫～400℃熱處理數(shù)秒～數(shù)日，優(yōu)選在50～200℃熱處理數(shù)秒～24小時(shí)的方法。利用這種方法可以得到含有2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸的熱處理產(chǎn)物。
熱處理時(shí)pH和原料濃度，只要是處于熱處理能夠生成2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸的范圍內(nèi)就沒(méi)有特別限制，可以根據(jù)操作性和收率設(shè)定。
本發(fā)明的熱處理，可以采用濕法或干法，但是從本發(fā)明2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸的生成效率來(lái)看，優(yōu)選濕法加熱。所說(shuō)的濕法加熱，可以采用水蒸汽加熱、加壓水蒸汽加熱、加壓加熱等任何濕法加熱。所說(shuō)的干法加熱，可以采用干燥熱風(fēng)直接加熱法，以及經(jīng)隔壁用熱源加熱的間接加熱法等。所說(shuō)的直接加熱法有空氣流干熱法和噴霧干熱法等，而所說(shuō)的間接加熱法可以采用轉(zhuǎn)鼓干熱法等。
在熱處理產(chǎn)物中生成具有吞噬誘導(dǎo)作用、癌細(xì)胞增殖抑制作用、抗菌作用等性質(zhì)的物質(zhì)，可以根據(jù)要達(dá)到的目的，通過(guò)改變pH、時(shí)間、溫度、原料濃度等熱處理?xiàng)l件。制備含有所需物質(zhì)并具有吞噬誘導(dǎo)作用、癌細(xì)胞增殖抑制作用、抗菌作用等性質(zhì)的熱處理產(chǎn)物。
本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸或其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽，具有很強(qiáng)的癌細(xì)胞增殖抑制活性，可以以這種活性為指標(biāo)從熱處理產(chǎn)物中分離、精制2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸或其光學(xué)活性物質(zhì)。作為分離、精制的手段，可以采用化學(xué)法、物理法等公知的精制方法，將凝膠過(guò)濾法、分子量分餾膜分餾法、溶劑萃取法、分餾法、使用離子交換樹(shù)脂的各種色譜法等傳統(tǒng)公知的精制方法加以組合，可以分離、精制反應(yīng)生成物中的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸或其光學(xué)活性物質(zhì)。
例如，使葡糖二酸在121℃下反應(yīng)4小時(shí)，在反應(yīng)液中生成I表示的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸或其光學(xué)活性物質(zhì)，通過(guò)對(duì)含有這種衍生物的反應(yīng)生成物進(jìn)行反向柱色譜處理，可以分離、精制2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸或其光學(xué)活性物質(zhì)。
此外，通過(guò)使α-酮戊二酸半醛(α-ketoglutaratesemialdehyde)水解，也可以得到本發(fā)明的化合物。而α-酮戊二酸半醛是用公知方法[Journal of Bacteriology，116，1464～1354(1973)]得到的。
被分離的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸經(jīng)過(guò)光學(xué)離析，可以得到(-)2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸和(+)2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸。
所說(shuō)的光學(xué)活性物質(zhì)的分離，可以利用外消旋混合物的機(jī)械離析法、選擇性結(jié)晶法、非對(duì)映體鹽或包藏化合物的結(jié)晶離析法、酶或微生物動(dòng)力學(xué)離析法、色譜法等離析方法進(jìn)行。
利用色譜離析時(shí)，可以使用氣相色譜、液相色譜、薄層色譜法，對(duì)其中每種方法可以使用適當(dāng)?shù)氖中怨潭ㄏ唷?br> 利用液相色譜進(jìn)行離析時(shí)，可以采用使用手性固定相的方法、使用手性洗脫液的方法和以非對(duì)映體形式分離法等。
作為手性固定相，可以使用酰胺型固定相、尿素型固定相、配位體交換型固定相、多糖·多糖衍生物固定相、蛋白質(zhì)固定相、聚甲基丙烯酸酯固定相、聚甲基丙烯酰胺固定相等。
作為洗脫液，可以使用己烷類(lèi)、醇類(lèi)、水(緩沖液)等，并可以與上述固定相適當(dāng)組合使用。
對(duì)于本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸或其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽而言，醫(yī)藥上容許的鹽，例如可以舉出堿金屬鹽、堿土金屬鹽、有機(jī)鹽等鹽類(lèi)，可以用公知方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸或其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽，具有癌細(xì)胞增殖抑制作用、吞噬誘導(dǎo)作用、抗菌作用等藥理作用，將從本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)及其鹽中選出的化合物作為有效成份，可以制備用于預(yù)防或治療例如對(duì)癌癥、感染癥等的治療用醫(yī)藥。
也就是說(shuō)，本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸或其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽，對(duì)于例如人前骨髓性白血病細(xì)胞HL-60、人急性淋巴芽球性白血病細(xì)胞MOLT-3、肺癌細(xì)胞A-549、SV-40轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞WI-38VA13、肝癌細(xì)胞Hep G2、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT 116、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人結(jié)腸癌細(xì)胞Wi Dr、胃癌細(xì)胞AGS和骨髓瘤等癌細(xì)胞具有細(xì)胞增殖抑制作用，可以制備以從例如本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽中選出的化合物為有效成份的抗癌制劑。
將從發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽中選出的化合物作為有效成份，使之與公知的藥用載體組合，可以制備抗癌劑、吞噬作用誘導(dǎo)劑、抗菌劑等藥劑。藥劑，例如抗癌劑的制備，一般而言是將從2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽中選出的化合物，與藥學(xué)上允許的液態(tài)或固態(tài)載體混合，根據(jù)需要再加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑等，可以制成錠劑、粒劑、散劑、粉劑、膠囊劑等固體劑型，以及通常液劑、懸濁劑、乳劑等液體劑型。而且，在使用之前利用加入適當(dāng)載體的方法，可以制成能夠變成液體的干燥品。
藥用載體可以根據(jù)上述的給藥方式和劑型適當(dāng)選擇。經(jīng)口給藥的情況下可以采用淀粉、乳糖、白糖、甘露糖醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無(wú)機(jī)鹽等。而且在制備口服制劑時(shí)，還可以加入粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、流動(dòng)性促進(jìn)劑、調(diào)味劑、著色劑、香料等。
此外，非口服劑型的情況下，按照慣常方法將從本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽中選出的作為有效成份的化合物，溶解或懸浮在作為稀釋劑使用的注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等之中，必要時(shí)向其中加入殺菌劑、穩(wěn)定劑、等滲劑和止痛劑等。
本發(fā)明的制劑，按照與制劑形態(tài)相應(yīng)的適當(dāng)給藥途徑給藥。關(guān)于給藥方式并沒(méi)有特別限制，可以?xún)?nèi)用、外用和注射。注射劑，例如可以經(jīng)靜脈、肌肉、皮下和皮內(nèi)給藥等，外用劑包括栓劑。
抗癌劑的給藥量，根據(jù)其制劑形態(tài)、給藥方法、用藥目的以及用藥患者的年齡、體重、癥狀適當(dāng)確定，一般情況下(但不一定)制劑中所含的、從2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽中選出的化合物量，對(duì)于成人而言每日給藥量為0.1微克～200毫克。當(dāng)然，由于給藥量因種種條件而改變，所以既有少于上述給藥量的情況，也有必須超出上述給藥量的情況。本發(fā)明的藥劑，除了直接口服之外，還可以加入到任何飲食品中日常攝取。
本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽，能夠從葡糖二酸更有效地制備。這種2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽，除具有抗癌活性之外，還具有癌細(xì)胞分化誘導(dǎo)活性、吞噬誘導(dǎo)活性、抗菌活性等性質(zhì)，是有用的藥用化合物。
本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸也可以通過(guò)使α-酮戊二酸半醛水解反應(yīng)得到，所以以α-酮戊二酸半醛作為有效成份，給藥后α-酮戊二酸半醛可以轉(zhuǎn)變成2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸，因此含有這種α-酮戊二酸半醛的醫(yī)藥也包括在本發(fā)明的醫(yī)藥中。
本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽，具有抗癌作用、吞噬誘導(dǎo)作用等生理作用；含有、添加或稀釋本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽制成的食品或飲料，可以作為具有抗癌活性、吞噬誘導(dǎo)活性等生理活性的食品或飲料使用。
從葡糖二酸或葡糖二酸衍生物以及含有葡糖二酸或葡糖二酸衍生物的化合物中選出的至少一種化合物經(jīng)熱處理得到的熱處理產(chǎn)物，顯示吞噬誘導(dǎo)作用、癌細(xì)胞增殖抑制作用、抗菌作用等，以該熱處理產(chǎn)物為有效成份，將其與公知的藥用載體組合，可以制成抗癌劑等醫(yī)藥。
抗癌劑的給藥量，可以根據(jù)其制劑形態(tài)、給藥途徑、給藥目的以及用藥患者的年齡、體重和癥狀適當(dāng)確定；一般而言(但不一定)，制劑中所含的有效成份量，對(duì)于成人來(lái)說(shuō)每日相當(dāng)于1～1000毫克，優(yōu)選10～200毫克。當(dāng)然，由于給藥量因種種條件而改變，所以既有少于上述給藥量的情況，也有必須超出上述給藥量的情況。本發(fā)明的藥劑，除了直接口服之外，還可以加入到任何飲食品中日常攝取。
上述熱處理產(chǎn)物具有抗菌活性，可以作為抗菌劑或者作為提高食品或飲料保存性能的防腐劑使用。此外，將上述熱處理產(chǎn)物加入到食品或飲料中，可以用作食品或飲料的防腐方法。
在食品或飲料中添加上述熱處理產(chǎn)物的情況下，熱處理產(chǎn)物中所含抗菌劑的性狀可以是液態(tài)、糊狀、粉狀、片狀、粒狀等。若考慮到操作的簡(jiǎn)易性和與其他添加物混合使用的情況下，優(yōu)選將其制成干燥粉末狀、片狀和顆粒狀。作為干燥方法，可以按照通常的方法進(jìn)行，例如噴霧干燥、轉(zhuǎn)鼓干燥、柜式干燥、真空干燥和冷凍干燥等。
以上述熱處理產(chǎn)物為有效成份的抗菌劑或防腐劑，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法制備，制備時(shí)還可以添加制劑容許的適當(dāng)公知添加劑，例如賦形劑、穩(wěn)定劑、崩解劑、粘合劑、溶解助劑等。也可以與乙醇、甘氨酸、乙酸鈉、抗壞血酸、甘油脂肪酸酯、食鹽、EDTA等其他具有抗菌活性的物質(zhì)組合使用。
上述熱處理產(chǎn)物在食品或飲料中的添加量，因食品或飲料的種類(lèi)而異，可以根據(jù)使用目的來(lái)確定。
以上述熱處理產(chǎn)物為有效成份的抗菌劑使用方法，可以按照適用于食品或飲料的方法進(jìn)行。添加的方法并沒(méi)有特別限制，總之用任何方法都可以使食品或飲料含有上述熱處理產(chǎn)物。然而，在使用抗菌劑時(shí)，所謂添加是指使食品或飲料含有上述熱處理產(chǎn)物的任何方法。通常方法是在食品或飲料的制備過(guò)程中加入，但是也可以采用將食品在含有上述熱處理產(chǎn)物的溶液中浸漬一定時(shí)間的方法。而且也可以將在食品中添加的方法與浸漬方法并用。適于采用浸漬方法的食品是在水中性狀不破壞的食品，例如可以舉出例如魚(yú)糕、維也納香腸等魚(yú)、畜的肉末產(chǎn)品，熟面等面條類(lèi)、冷凍前的蝦、貝、魚(yú)類(lèi)等冷凍食品。
通過(guò)使用以上述熱處理產(chǎn)物為有效成份的抗菌劑作為防腐劑，能夠進(jìn)一步提高食品或飲料的保存性。而且，對(duì)于冷凍食品和冷凍甜食來(lái)說(shuō)，在冷凍前的加工工序中能夠抑制污染微生物的繁殖，可以獲得衛(wèi)生上的極佳結(jié)果。以上述熱處理產(chǎn)物為有效成份的抗菌劑，對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都具有效果，例如對(duì)于甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌的除菌，預(yù)防腸出血性大腸菌0-157等引起食物中毒的細(xì)菌感染也是極為應(yīng)有用的。
上述抗菌劑對(duì)于蟲(chóng)牙細(xì)菌和牙周病菌也具有抗菌活性，可以提供含有上述抗菌劑的口腔內(nèi)用劑?？谇粌?nèi)用劑的形態(tài)，可以制成液態(tài)、糊狀等公知形態(tài)?？谇粌?nèi)用劑的實(shí)例可以舉出潔齒劑。所說(shuō)的潔齒劑也可以呈液態(tài)、糊狀和粉末狀，能夠制成公知的潔齒劑形狀。對(duì)于潔齒劑中上述熱處理產(chǎn)物的含量沒(méi)有特別限制，可以處于對(duì)于蟲(chóng)牙細(xì)菌和牙周病菌的有效濃度下。在潔齒劑中可以添加公知的添加劑，例如溫潤(rùn)劑、表面活性劑、粘合劑、香料和甜味劑等。
通過(guò)使食品或飲料中含有上述熱處理產(chǎn)物，可以制備吞噬誘導(dǎo)性食品或飲料。含有上述熱處理產(chǎn)物的食品或飲料，因該熱處理產(chǎn)物具有各種生理活性、吞噬誘導(dǎo)作用、抗癌作用、抗菌作用等，所以是通過(guò)攝取這些物質(zhì)具有癌癥的預(yù)防和抑制效果的適于細(xì)胞異常增殖性疾病患者使用的康復(fù)食品或飲料，而且是維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，特別是對(duì)于保持腸胃健康來(lái)說(shuō)有用的食品或飲料。此外，因其抗菌作用，還是保存性極好的食品或飲料。因此，上述熱處理產(chǎn)物是極為有用的食品或飲料添加劑，特別是食品或飲料的防腐劑。
本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽，或上述熱處理產(chǎn)物，即使經(jīng)口給藥具有生理活性的有效劑量，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何毒性。
實(shí)施例以下列舉實(shí)施例進(jìn)一步具體說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限制。實(shí)施例中的％，是指重量％。實(shí)施例1(1)將D-糖二酸鉀(304-02，ナカライテスク株式會(huì)社制備)溶解在1N鹽酸中成10mg/ml，在121℃下加熱30分鐘，鹽酸酸性下調(diào)制熱處理產(chǎn)物。接著用氫氧化鈉將該鹽酸酸性下的熱處理產(chǎn)物調(diào)節(jié)到pH7.0，稀釋到5mg/ml后，按照以下方法測(cè)定了對(duì)于人前骨髓性白血病細(xì)胞HL-60的吞噬誘導(dǎo)活性。
在經(jīng)56℃30分鐘處理的含有10％胎牛血清(ギブコ株式會(huì)社制)的RPMI1640培養(yǎng)基(日水株式會(huì)社制)中，于37℃下培養(yǎng)HL-60(ATCCCCL-240)，然后將其懸浮在含有10％牛胎盤(pán)血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，使之濃度達(dá)到2.5×105個(gè)/4.5ml。
向4.5ml這種懸浮液中加入0.5ml上述鹽酸酸性下的熱處理產(chǎn)物，在37℃和5％二氧化碳存在下培養(yǎng)16小時(shí)。而且，為了對(duì)照使用公知的誘導(dǎo)吞噬作用的試劑0.05ml放線菌素D(シグマ株式會(huì)社制)水溶液和0.45ml生理食鹽水代替上述鹽酸酸性下的熱處理產(chǎn)物，進(jìn)行了同樣的培養(yǎng)。
在光學(xué)顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞，分別確認(rèn)了鹽酸酸性的熱處理產(chǎn)物和加入放線菌素D后的培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞核的凝縮、細(xì)胞的縮小、吞噬小體的形成和細(xì)胞增殖抑制作用。而在對(duì)照用的、加入了生理食鹽水、0.5M氯化鈉水溶液(與調(diào)節(jié)pH后稀釋的鹽酸酸性下的熱處理產(chǎn)物具有同樣鹽濃度)以及0.5ml葡糖二酸鉀未加熱的物質(zhì)的培養(yǎng)細(xì)胞中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這些現(xiàn)象。
(2)將D-糖二酸鉀溶解在10ml水中制成濃度達(dá)10mg/ml，pH為3.95。在121℃下加熱30分鐘。熱處理產(chǎn)物的pH為4.1。用氫氧化鈉將此鹽酸酸性下的熱處理產(chǎn)物調(diào)節(jié)到pH7.0后，按照實(shí)施例1-(1)的方法測(cè)定了對(duì)HL-60細(xì)胞的吞噬誘導(dǎo)活性、細(xì)胞增殖抑制活性，此樣品具有這兩種活性。
結(jié)果示于附圖1中。也就是說(shuō)，附圖1是在HL-60細(xì)胞培養(yǎng)液中添加糖二酸的酸性下熱處理產(chǎn)物達(dá)到1mg/ml時(shí)，表示培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)液中活細(xì)胞數(shù)目之間關(guān)系的曲線圖。圖中，橫軸表示培養(yǎng)時(shí)間(時(shí)間)，而縱軸表示培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)(×105個(gè)/5ml)。附圖1中，正方形白符號(hào)(□)和菱形白符號(hào)(◇)，分別表示未添加樣品(對(duì)照)和添加有糖二酸酸性下熱處理產(chǎn)物。
(3)將D-糖二酸1，4-內(nèi)酯一水合物(304-35，ナカライテスク株式會(huì)社制)溶解在1N鹽酸中制成濃度達(dá)10mg/ml，在121℃下加熱30分鐘，制備了鹽酸酸性下的熱處理產(chǎn)物。接著用氫氧化鈉將該鹽酸酸性的熱處理產(chǎn)物調(diào)節(jié)到pH7.0，并稀釋到5mg/ml，然后按照實(shí)施例1-(1)的方法測(cè)定對(duì)HL-60細(xì)胞的吞噬誘導(dǎo)活性和細(xì)胞增殖抑制活性，此樣品具有這兩種活性。而未加熱的D-糖二酸1，4-內(nèi)酯無(wú)此活性。
(4)將D-糖二酸1，4-內(nèi)酯一水合物(304-35，ナカライテスク株式會(huì)社制)溶解在水中制成濃度10mg/ml，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到pH7.0后，在121℃下加熱30分鐘。熱處理產(chǎn)物的pH4.3。用氫氧化鈉將此熱處理產(chǎn)物調(diào)節(jié)到pH7.0后，按照實(shí)施例1-(1)的方法測(cè)定對(duì)HL-60的吞噬誘導(dǎo)活性和細(xì)胞增殖抑制活性，此樣品具有這兩種活性。而未加熱的D-糖二酸1，4-內(nèi)酯無(wú)活性。
結(jié)果示于附圖2中。也就是說(shuō)，附圖2是在HL-60細(xì)胞培養(yǎng)液中添加糖二酸1，4-內(nèi)酯的熱處理產(chǎn)物達(dá)到1mg/ml時(shí)，表示培養(yǎng)時(shí)間與培養(yǎng)液中活細(xì)胞數(shù)目之間關(guān)系的曲線圖。圖中，橫軸表示培養(yǎng)時(shí)間(時(shí)間)，而縱軸表示培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)(×105個(gè)/5ml)。附圖2中，正方形白符號(hào)(□)和菱形白符號(hào)(◇)，分別表示未添加樣品(對(duì)照)和添加有糖二酸1，4-內(nèi)酯的熱處理產(chǎn)物。
(5)將D-糖二酸鉀溶解在水中制成10mg/ml和pH3.95。在121℃下將其加熱30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、和16小時(shí)。將各種加熱物和未加熱物的pH調(diào)節(jié)到7附近后，進(jìn)行0.22微米的過(guò)濾器滅菌，制備了測(cè)定吞噬誘導(dǎo)活性和細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)定用的樣品。將這些樣品稀釋2倍、5倍、10倍、20倍、50倍和100倍后，按照以下方法測(cè)定了對(duì)于人前骨髓性白血病細(xì)胞HL-60的細(xì)胞增殖抑制活性，對(duì)比活性的大小。
也就是說(shuō)，將各稀釋液或水各取10微升分別置于96孔微量點(diǎn)滴板的孔穴中。向其中加入100微升含有5000個(gè)HL-60細(xì)胞和10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在5％二氧化碳存在下，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。加入濃度為5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑嗡溴化物(MTT；シグマ株式會(huì)社制)的磷酸鹽緩沖食鹽水溶液，進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，用顯微鏡觀察了細(xì)胞的生育狀態(tài)。而且，優(yōu)選加入100微升含有0.04N鹽酸的2-丙醇后攪拌，在590nm下測(cè)定吸光度，以此作為細(xì)胞增殖程度(MTT法)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未加熱的D-糖二酸鉀溶液中沒(méi)有細(xì)胞增殖抑制活性，而分別經(jīng)過(guò)30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、16小時(shí)熱處理的D-糖二酸鉀熱處理溶液中，分別稀釋到2、2、5、10和20倍之前都具有細(xì)胞增殖抑制活性。在顯示細(xì)胞增殖抑制活性的樣品濃度下，發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞核的凝縮、細(xì)胞的縮小和吞噬小體的形成現(xiàn)象，因而證明了其吞噬誘導(dǎo)活性。
另一方面，在pH調(diào)節(jié)之前從各熱處理產(chǎn)物中取出一部分樣品濃縮至干，溶解在相當(dāng)于濃縮至干物質(zhì)容積1/20的50％的甲醇中。將這些濃縮物點(diǎn)滴在兩片薄層硅膠(硅膠160 F254，Merck公司制)上后，用展開(kāi)溶劑(醋酸正丁酯∶醋酸∶蒸餾水＝3∶1∶1)展開(kāi)。展開(kāi)終止后的一片薄層用短波紫外線照射，檢出樣品斑點(diǎn)。進(jìn)而用AgNO3-NH3溶液(0.1N AgNO3水溶液+5N NH3水溶液的等量混合物)噴霧，利用加熱檢出樣品斑點(diǎn)。用乙醇硫酸混合物(乙醇∶硫酸＝2∶1)在另一片薄層上噴霧，通過(guò)加熱檢出樣品斑點(diǎn)。
薄層硅膠色譜檢出的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間流逝而一起增加的斑點(diǎn)的RF值，處于0.13、0.06和0.03附近，此趨勢(shì)與MTT法分析的細(xì)胞增殖抑制活性的增加，具有平行關(guān)系。
(6)將D-糖二酸1，4-內(nèi)酯-水合物(ナカライテスク株式會(huì)社制)溶解在水中制成10mg/ml和pH2.5。在121℃下分別將其加熱30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、和16小時(shí)。將各加熱物和未加熱物的pH調(diào)節(jié)到7附近后，進(jìn)行0.22微米的過(guò)濾器滅菌，制備了測(cè)定細(xì)胞增殖抑制活性用樣品。將這些細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)定用樣品分別稀釋2倍、5倍、10倍、20倍、50倍和100倍后，按照實(shí)施例1-(5)的方法測(cè)定了對(duì)于HL-60細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制活性，對(duì)比活性大小。觀察到培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核凝縮、細(xì)胞縮小和吞噬小體的形成現(xiàn)象，進(jìn)而比較了吞噬誘導(dǎo)活性的強(qiáng)弱。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未加熱的D-糖二酸1，4-內(nèi)酯溶液中沒(méi)有細(xì)胞增殖抑制活性和吞噬誘導(dǎo)活性，而分別經(jīng)過(guò)30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、16小時(shí)熱處理的D-糖二酸1，4-內(nèi)酯熱處理溶液中，分別稀釋到1、2、5、10和50倍之前都具有細(xì)胞增殖抑制活性和吞噬誘導(dǎo)活性。
另一方面，在pH調(diào)節(jié)之前從各熱處理產(chǎn)物中取出一部分樣品濃縮至干，溶解在相當(dāng)于濃縮至干物質(zhì)容積1/20的50％的甲醇中。然后，按照實(shí)施例1-(5)記載的方法進(jìn)行薄層硅膠色譜處理。
薄層硅膠色譜檢出的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間流逝而一起增加的斑點(diǎn)的RF值，處于0.13、0.06和0.03附近，此趨勢(shì)與MTT法分析的細(xì)胞增殖抑制活性的增加，具有平行關(guān)系。
進(jìn)而，將1.5ml D-糖二酸1，4-內(nèi)酯熱處理物濃縮至干，將其再溶解在60微升50％甲醇中，然后取其中的50微升，與實(shí)施例1-(5)同樣用薄層硅膠色譜展開(kāi)。剪下此薄層硅膠之RF值處于0.13附近、0.13～0.06、0.06附近、0.03附近和原點(diǎn)附近的硅膠，分別將其用500微升50％甲醇萃取。將這些萃取液濃縮至干后，溶解在100微升滅菌的蒸餾水中，按照與實(shí)施例1-(5)同樣方法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制活性和吞噬誘導(dǎo)活性后發(fā)現(xiàn)，在原點(diǎn)至RF值0.13之間具有活性。
(7)將D-糖二酸1，4-內(nèi)酯一水合物(ナカライテスク株式會(huì)社制)溶解在水中制成10mg/ml和pH2.5。在121℃下分別將其加熱4小時(shí)和16小時(shí)。
將這些D-糖二酸1，4-內(nèi)酯的加熱物和未加熱物用API-III(サイエックス株式會(huì)社制)進(jìn)行負(fù)離子質(zhì)譜分析。結(jié)果查明，隨著加熱時(shí)間和吞噬誘導(dǎo)活性的增加，加熱物中分子量為130和148的物質(zhì)增加。實(shí)施例2(1)121℃下將1％的D-糖二酸1，4-內(nèi)酯一水合物加熱4小時(shí)，取其樣品100ml冷凍干燥，再溶解在2毫升水中。使用0.5微米Cosmonice過(guò)濾器(440-84，ナカライテスク株式會(huì)社制)將一部分此再溶解物過(guò)濾后，以0.1％三氟乙酸(349-01，ナカライテスク株式會(huì)社制)水溶液為移動(dòng)相，在每分鐘0.5毫升流速下，使用TSK凝膠ODS-80Ts(6mm×250mm；東ソ-株式會(huì)社制)進(jìn)行了HPLC分析，測(cè)定210nm處的吸光度后可以發(fā)現(xiàn)十個(gè)主峰，所以用同樣方法分取各主峰，進(jìn)行0.22微米過(guò)濾器滅菌，利用這種方法制備了癌細(xì)胞增殖抑制活性的樣品。將這些樣品分別稀釋1、2、4、8、16和32倍，按照實(shí)施例1-(5)的方法測(cè)定了對(duì)于人前骨髓白血病細(xì)菌HL-60的細(xì)胞增殖抑制活性以及吞噬誘導(dǎo)活性，并且比較了活性的強(qiáng)弱。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保留時(shí)間為5.6分鐘的主峰物質(zhì)具有活性，而保留時(shí)間5.6分鐘主峰的32倍稀釋物具有細(xì)胞增殖抑制活性和吞噬誘導(dǎo)活性。
(2)分取實(shí)施例2-(1)記載的保留時(shí)間5.6分鐘的主峰物質(zhì)，減壓濃縮至干，使用DX302質(zhì)譜儀(日本電子株式會(huì)社制)對(duì)此樣品進(jìn)行了質(zhì)譜分析。然后溶解在重水中，用核磁共振法(NMR)分析其結(jié)構(gòu)。核磁共振儀使用JNM-A500(日本電子株式會(huì)社制)。接著將其溶解在水中制成88微克/毫升，用UV-2500型分光光度計(jì)(島津制作所制)測(cè)定了紫外吸收光譜。試驗(yàn)結(jié)果如下。
此樣品的各種特性示于附圖3～6。即，附圖3～6是顯示本發(fā)明的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸各種特性的曲線圖。
附圖3表示質(zhì)譜[縱軸是相對(duì)強(qiáng)度(％)，橫軸是m/z]，附圖4表示紫外吸收光譜[縱軸是吸光度，橫軸是波長(zhǎng)(nm)]，附圖5表示1H-核磁共振譜[縱軸是信號(hào)強(qiáng)度，橫軸是化學(xué)位移量(ppm)]，附圖6表示13C-核磁共振譜[縱軸是信號(hào)強(qiáng)度，橫軸是化學(xué)位移量(ppm)]。FAB-MSm/z 131[M-H2O+H]+UVλmax末端吸收非對(duì)映體11H-NMRδ1.83(1H，m，4-H)，1.94(1H，m，3-H)，2.18(1H，m，4-H)，2，36(1H，m，3-H)，5.55(1H，d-d，J＝2.0，5.0Hz，5-H)13C-NMRδ32.1，34.3，100.5，103.3，174.4非對(duì)映體21H-NMRδ1.88(1H，m，4-H)，2.07(1H，m，3-H)，2.15(1H，m，4-H)，2.23(1H，m，3-H)，5.51(1H，d-d，J＝3.5，5.0Hz，5-H)13C-NMRδ32.7，35.5，101.1，103.5，174.7其中，在1H-NMR中以HOD的化學(xué)位移值為4.65ppm，13C-NMR中以二噁烷的化學(xué)位移值為67.4ppm。
從這些數(shù)值可以知道，本樣品是下式II表示的(2S，5S)-2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸及其對(duì)映體，以及下式III表示的(2S，5R)-2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸及其對(duì)映體之間的混合物。其中，對(duì)映體1和對(duì)映體2是式II表示的物質(zhì)、其對(duì)映體或其混合物，其他一些是式III表示的物質(zhì)、其對(duì)映體或其混合物。


實(shí)施例3用《細(xì)菌學(xué)雜志》，116卷，1464-1354頁(yè)(1973年)上提到的方法制備了α-酮戊二酸半醛，再利用水解反應(yīng)得到了2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸。實(shí)施例4(1)將D-糖二酸鉀溶解在蒸餾水中制成1％，在121℃下加熱4小時(shí)。使用這種糖二酸鉀的熱處理產(chǎn)物研究了抗菌活性。
在L-肉湯(含有1％胰胨、0.5％酵母提取物和0.5％氯化鈉，pH7.0)中將大腸稈菌HB101培養(yǎng)一夜。向在5毫升L-肉湯中加有50、500微升糖二酸鉀熱處理產(chǎn)物培養(yǎng)基，以及未加入熱處理產(chǎn)物的培養(yǎng)基中，接種5微升種培養(yǎng)液，在37℃下振動(dòng)培養(yǎng)，測(cè)定其生育情況。培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)和培養(yǎng)6.5小時(shí)后，用富士數(shù)字濁度計(jì)(富士工業(yè)株式會(huì)社出售，秋元電機(jī)制作所制備)在調(diào)節(jié)刻度為82.3的條件下，進(jìn)行測(cè)定，以從6.5小時(shí)后的數(shù)值扣除培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的數(shù)值作為生育狀態(tài)。結(jié)果示于表1之中，如表1中所示，糖二酸鉀的熱處理產(chǎn)物具有抗菌活性。表1

(2)將D-糖二酸-1，4-內(nèi)酯一水合物溶解在蒸餾水中制成1％，在121℃下加熱4小時(shí)。使用此D-糖二酸-1，4-內(nèi)酯的熱處理產(chǎn)物按照實(shí)施例4-(1)中記載的方法研究了抗菌活性。結(jié)果示于表2之中，如表2中所示，糖二酸-1，4-內(nèi)酯的熱處理產(chǎn)物具有抗菌活性。
表2

實(shí)施例5注射劑(1)制備了2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸的0.1％注射用蒸餾水溶液，將其無(wú)菌過(guò)濾，制備了注射劑。
(2)將實(shí)施例1-(2)記載的D-糖二酸熱處理產(chǎn)物的中和產(chǎn)物濃縮至干，溶解在蒸餾水中，制備了1％的溶液。將此溶液充填在冷凍干燥用安培瓶中，使其中一個(gè)安培瓶中的溶液含有相當(dāng)于10毫克上清餾份的干燥物，進(jìn)行冷凍干燥。另外向其中加入2毫升生理食鹽水作為溶解液。
使用實(shí)施例1-(4)中記載的D-糖二酸-1，4-內(nèi)酯的熱處理產(chǎn)物，按照同樣方法制備了注射劑。實(shí)施例6片劑按照以下配方配制了片劑D-糖二酸鉀的熱處理產(chǎn)物 10毫克玉米淀粉 65毫克羧甲基纖維素 20毫克聚乙烯基吡咯烷酮 3毫克硬脂酸鎂 2毫克一片含 100毫克使用了實(shí)施例1-(2)記載的D-糖二酸熱處理產(chǎn)物中和產(chǎn)物的冷凍干燥物。
發(fā)明的效果本發(fā)明提供了具有抗癌作用、癌細(xì)胞增殖抑制作用、吞噬誘導(dǎo)作用和抗菌作用等生理活性的，安全性高的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽，而且提供了含有所說(shuō)的化合物并具有生理活性功能的醫(yī)藥(特別是抗癌制劑)。
權(quán)利要求
1.一種2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽，其結(jié)構(gòu)式為
2.一種由通式I表示的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽的制備方法，其特征在于包括對(duì)于從以下(a)和(b)中選出的至少一種化合物進(jìn)行熱處理的工序(a)葡糖二酸或葡糖二酸衍生物，(b)含有葡糖二酸和/或葡糖二酸衍生物的化合物。
3.一種醫(yī)藥，其特征在于作為有效成份其中含有從通式I表示的2，5-二羥基四氫-2-呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽中選出的化合物。
4.按照權(quán)利要求3所述的醫(yī)藥，是一種抗癌制劑。
全文摘要
一種由下式(Ⅰ)表示的2,5－二羥基四氫－2－呋喃甲酸、其光學(xué)活性物質(zhì)或其鹽。
文檔編號(hào)A61K31/34GK1244197SQ98801958
公開(kāi)日2000年2月9日 申請(qǐng)日期1998年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月27日
發(fā)明者佐川裕章, 奧田真治, 村木信子, 小山信人, 豬飼勝重, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社