專利名稱：包含死亡結(jié)構(gòu)域的受體－5的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及受體的腫瘤壞死因子家族的一個新成員。更具體說，提供了編碼包含人死亡結(jié)構(gòu)域的受體-5(或簡稱DR5)的分離核酸分子。還提供了DR5多肽、載體、宿主細(xì)胞和制備它們的重組方法。本發(fā)明還涉及鑒定DR5活性的激動劑和拮抗劑的篩選方法。
相關(guān)技術(shù)大量的生物活動(例如，對某種刺激的反應(yīng)和自然的生物學(xué)過程)受到各種因子(例如細(xì)胞因子)的控制。許多細(xì)胞因子通過帶動受體并產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)從而經(jīng)由受體發(fā)揮作用。
例如，腫瘤壞死因子(TNF)α和β即是通過TNF受體來調(diào)節(jié)大量生物過程，包括抵抗感染防御和感應(yīng)震驚和炎癥疾病的細(xì)胞因子。TNF分子屬于TNF-配體超家族，并且是與它們的受體或抗配體(即TNF受體超家族)共同起作用。迄今為止，已鑒定到TNF配體超家族的9個成員和TNF受體超家族的10個成員。
在這些配體中，包括TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，又稱為TNF-β)、LT-β(發(fā)現(xiàn)于復(fù)合異三聚體LT-α2-β中)、FasL、CD40L、CD27L、CD30L、4-IBBL、OX40L和神經(jīng)生長因子(NGF)。TNF受體超家族包括p55TNF受體、p75TNF受體、TNF受體相關(guān)蛋白質(zhì)、FAS抗原或APO-1、CD40、CD27、CD30、4-IBB、OX40、低親合力p75和NGF受體(Meager，A.，生物學(xué)22291-295(1994))。
TNF配體超家族的許多成員是由活化的T細(xì)胞表達(dá)的，這暗示它們是T細(xì)胞與其他類型細(xì)胞進行相互作用(這是細(xì)胞癌化和功能的基礎(chǔ))所必需的(Meager，A.，出處同前)。
對TNF受體家族幾個成員的基本功能相當(dāng)多的了解是從鑒定和制備消除了這些蛋白質(zhì)的表達(dá)的突變體中獲得的。例如，F(xiàn)AS抗原及其配體的突變導(dǎo)致淋巴增殖性疾病(Watanabe-Fukunaga，R.等，自然356314(1992))，這可能反映出程序化細(xì)胞死亡有缺陷。CD40配體的突變導(dǎo)致X-連鎖的免疫缺陷狀況，其特征在于胞漿中有高水平的免疫球蛋白M和低水平的免疫球蛋白G，表明T細(xì)胞依賴性的B細(xì)胞活化失效(Allen，R.C.等，科學(xué)259990(1993))。低親合力神經(jīng)生長因子受體的定向突變導(dǎo)致以外圍結(jié)構(gòu)感覺新生失效為特征的失調(diào)(Lee，K.F.等，細(xì)胞69737(1992))。
TNF和LT-α能與兩個TNF受體(55和75kd TNF受體)結(jié)合。TNF和LT-α通過它們的受體引發(fā)的許多生物效應(yīng)，包括移植腫瘤的出血性壞死、細(xì)胞毒性(在內(nèi)毒素休克、發(fā)炎、免疫調(diào)節(jié)、增殖和抗病毒反應(yīng)中的一種作用)以及對抗離子輻射的有害作用。TNF和LT-α參與多種疾病(包括內(nèi)毒素休克、腦瘧疾、腫瘤、自身免疫疾病、AIDS和移植體-宿主排斥)的發(fā)病機理(Beutler，B.和Von Huffel，C.，科學(xué)264667-668(1994))。p55受體的突變導(dǎo)致對微生物感染的易感性加強。
此外，曾報道過在TNFR1(p55)和Fas的近C-末端有一個大約80個氨基酸的結(jié)構(gòu)域，稱為“死亡結(jié)構(gòu)域”，它負(fù)責(zé)傳導(dǎo)程序化細(xì)胞死亡信號(Tartaglia等，細(xì)胞74845(1993))。
細(xì)胞凋亡，或程序化細(xì)胞死亡，是多細(xì)胞生物正常發(fā)育和系統(tǒng)平衡中必需的生理過程(H.Steller，科學(xué)2671445-1449(1995))。細(xì)胞凋亡的紊亂構(gòu)成幾種人類疾病(包括癌癥、神經(jīng)變性性疾病和獲得性免疫缺陷綜合癥)的發(fā)病機理(C.B.Thompson，科學(xué)2671456-1462(1995))。最近，更多的注意力集中在兩個細(xì)胞表面死亡受體(Fas/APO-1和TNFR-1)的信號傳導(dǎo)和生物功能上(J.L.Cleveland等，細(xì)胞81479-482(1995)；A.Fraser等，細(xì)胞85781-784(1996)；S.Nagata等，科學(xué)2671449-56(1995))。兩者都是TNF受體家族的成員，該家族還包括TNFR-2、低親合力NGFR、CD40和CD30等(C.A.Smith等，科學(xué)2481019-23(1990)；M.Tewari等，《分子和細(xì)胞生物學(xué)教程》，M.Purton，Heldin，Carl編(Chapman and Hall，London，1995))。該家族的成員是根據(jù)胞外結(jié)構(gòu)域中存在富含半胱氨酸的重復(fù)片段確定的，F(xiàn)as/APO-1和TNFR-1還有被恰當(dāng)?shù)孛麨樗劳鼋Y(jié)構(gòu)域的共同的胞內(nèi)同源區(qū)，它與果蠅(Drosophila)自殺基因reaper有較遠(yuǎn)的相關(guān)性(P.Golstein等，細(xì)胞81185-186(1995)；K.White等，科學(xué)264677-83(1994))。這個共有的死亡結(jié)構(gòu)域提示兩個受體可能與一組至今身份不明的相互關(guān)聯(lián)的信號傳導(dǎo)分子相互作用。Fas/APO-1的活化能補充含有死亡結(jié)構(gòu)域的接合體分子FADD/MORTl(A.M.Chinnaiyan等，細(xì)胞81505-12(1995)；M.P.Boldin等，生物學(xué)化學(xué)雜志2707795-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO145579-5588(1995))，后者隨之結(jié)合并且可能激活FLICE/MACHl(前凋亡蛋白酶ICE/CED-3家族的成員)(M.Muzio等，細(xì)胞85817-827(1996)；M.P.Boldin等，細(xì)胞85803-815(1996))。Fas/APO-1的中心作用是引發(fā)細(xì)胞死亡，而TNFR-1可以給一系列不同生物活動發(fā)出信號，其中許多是基于其激活NF-kB的能力(L.A.Tartaglia等，今日免疫學(xué)13151-3(1992))。與此相應(yīng)，TNFR-1能補充多價接合體分子TRADD，該分子與FADD一樣含有一個死亡結(jié)構(gòu)域(H.Hsu等，細(xì)胞81495-504(1995)；H.Hsu等，細(xì)胞84299-308(1996))。通過聯(lián)合包括FADD、TRAF2和RIP在內(nèi)的許多信號分子，TRADD能夠給出細(xì)胞凋亡和激活NF-kB的信號(H.Hsu等，細(xì)胞84299-308(1996)；H.Hsu等，免疫(Immunity)4387-396(1996))。
最近，發(fā)現(xiàn)了一種新的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的TNF配體。S.R.Wiley等(免疫3673-682(1995))將該分子命名為“TNF相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體”或簡稱“TRAIL”。該分子又被稱為“Apo-2配體”或“Apo-2L”(R.M.Pitt等，生物學(xué)化學(xué)雜志27112687-12690(1996)。在共同未決的美國臨時專利申請60/013,405中也公開了這種分子。為了方便，本文將該分子稱為TRAIL。
FAS配體的轉(zhuǎn)錄呈現(xiàn)出主要局限于被活化的T細(xì)胞，與它不同，在許多人體組織(例如脾、肺、前列腺、胸腺、卵巢、小腸、結(jié)腸、外周血淋巴細(xì)胞、胎盤、腎)中都檢測到顯著水平的TRAIL，并且一些細(xì)胞系組成性表達(dá)TRAIL。已經(jīng)證實TRAIL不依賴Fas配體而作用(Wiley等，出處同前)。還證實TRAIL在與Fas/Apo-1L引發(fā)死亡信號相似的時間范圍內(nèi)迅速激活細(xì)胞凋亡，但比TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡快得多(S.A.Marster等，現(xiàn)代生物學(xué)6750-752(1996))。TRAIL不能與TNFR-1、Fas或最近鑒定的DR3結(jié)合，這提示TRAIL可能是與一或多個獨特的受體相互作用。
已經(jīng)鑒定到TRAIL的幾種獨特的受體。共同未決的美國臨時專利申請60/035,722中公開了一種新的包含死亡結(jié)構(gòu)域的TRAIL受體-DR4。參見Pan等，科學(xué)276111-113(1997年4月)。共同未決的美國臨時專利申請60/035,496號表明該申請的對象-TR5受體與TRAIL結(jié)合。共同未決的美國臨時專利申請60/XXXXXX號基于TR10受體與DR4的序列同源性，預(yù)測它也能結(jié)合TRAIL。
TNF家族配體和TNF家族受體具有各種作用，并影響到哺乳動物系統(tǒng)的生物過程中的很多正?；虿徽９δ?。因此，十分需要鑒定和確定這些影響正常和病態(tài)下生物活性的受體和配體。具體說，需要分離和確定另外的結(jié)合TRAIL的新受體。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了分離的核酸分子，它們包含編碼

圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列或在1997年3月7日保藏的cDNA克隆(ATCCNO.97920)編碼的氨基酸序列的核酸序列。
本發(fā)明還提供包括本發(fā)明所述分離的核酸分子的重組載體，和含有重組載體的宿主細(xì)胞，以及這些載體和宿主細(xì)胞的制備方法，和用它們通過重組技術(shù)制備DR5多肽或肽的方法。
本發(fā)明另外提供了具有本文所述多核苷酸所編碼氨基酸序列的分離的DR5多肽。
本發(fā)明還提供了診斷方法(如定量的)和檢測DR5蛋白質(zhì)水平的診斷方法。因此，例如根據(jù)本發(fā)明用于檢測過表達(dá)DR5或其可溶性形式相比于正常對照組織樣品的過表達(dá)情況的診斷方法，可以用來檢測腫瘤的存在。
已知腫瘤壞死因子(TNF)家族配體是最多效的細(xì)胞因子之一，它們誘導(dǎo)許多細(xì)胞應(yīng)答，包括細(xì)胞毒性、抗病毒活性、免疫調(diào)節(jié)活性和對幾種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。對TNF家族配體的細(xì)胞應(yīng)答不僅包括正常生理應(yīng)答，還包括與細(xì)胞凋亡增加或細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)聯(lián)的疾病。細(xì)胞凋亡—程序化細(xì)胞死亡是一種參與清除免疫系統(tǒng)外周T淋巴細(xì)胞的生理機制，其調(diào)節(jié)障礙能導(dǎo)致許多不同的發(fā)病過程。與細(xì)胞存活增加或細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)的疾病包括癌癥、自身免疫失調(diào)、病毒感染、炎癥、移植體對抗宿主疾病、急性移植體排斥和慢性移植體排斥。與細(xì)胞凋亡增加相關(guān)的疾病包括AIDS、神經(jīng)變性性疾病、骨髓發(fā)育不良綜合癥、局部缺血性損傷、毒素誘導(dǎo)的肝臟疾病、敗血癥性休克、惡病質(zhì)和厭食。
因此，本發(fā)明還提供了一種用于增強TNF家族配體所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的方法，包括將有效量的能增強DR5介導(dǎo)的信號過程的激動劑給予表達(dá)DR5多肽的細(xì)胞。優(yōu)選地，增強DR5介導(dǎo)的信號過程來治療細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)下降的疾病。
另一方面，本發(fā)明針對一種用于抑制TNF家族配體所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的方法，包括將有效量的能降低DR5介導(dǎo)的信號過程的拮抗劑給予表達(dá)DR5多肽的細(xì)胞。優(yōu)選地，降低DR5介導(dǎo)的信號過程來治療細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)上升的疾病。
可以用本領(lǐng)域已知的TNF家族配體/受體細(xì)胞應(yīng)答實驗(包括下面將詳細(xì)描述的)來確定本發(fā)明所述的某種候選“激動劑”或“拮抗劑”是否能夠增強或抑制細(xì)胞凋亡。因此，另一方面，提供了一種用于確定某種候選的“激動劑”或“拮抗劑”是否能夠增強或抑制對TNF家族配體的細(xì)胞應(yīng)答的篩選方法。該方法包括將表達(dá)DR5多肽的細(xì)胞與候選的化合物及TNF家族配體接觸，檢測細(xì)胞應(yīng)答，并與標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞應(yīng)答(標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞應(yīng)答是在沒有候選化合物的情況下與配體進行接觸時檢測到的)進行比較，因此，比標(biāo)準(zhǔn)增加的細(xì)胞應(yīng)答表示該候選化合物是該配體/受體信號途徑的激動劑，而比標(biāo)準(zhǔn)降低的細(xì)胞應(yīng)答表示該候選化合物是該配體/受體信號途徑的拮抗劑。通過本發(fā)明，可以將表達(dá)DR5多肽的細(xì)胞與內(nèi)源或外源給予的TNF家族配體進行接觸。
附圖簡述圖1顯示DR5的核苷酸序列(SEQ ID NO1)以及推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。推測氨基酸1-51(加下劃線)組成信號肽(SEQ ID NO2中的大約-51到-1號氨基酸殘基)；氨基酸52-184組成胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO2中的大約1到133號氨基酸殘基)；氨基酸185-208(加下劃線)組成跨膜結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO2中的大約134到157號氨基酸殘基)；氨基酸209-411組成胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(SEQID NO2中的大約158到360號氨基酸殘基)，其中的氨基酸324-391號(斜體)組成死亡結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO2中大約273到340號氨基酸殘基)。
圖2顯示DR5(HLYBX88)、人腫瘤壞死因子受體1(h TNFR1)(SEQ ID NO3)、人Fas蛋白質(zhì)(SEQ ID NO4)以及含有死亡結(jié)構(gòu)域的受體3(SEQ ID NO5)的氨基酸序列之間相似的區(qū)域。比較是用Clustal方法通過DNA Star程序組中包含的Megalign程序進行的。
圖3顯示對DR5氨基酸序列的分析。顯示了α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域；親水性和疏水性；兩親性區(qū)域；柔性區(qū)域；抗原性指數(shù)和表面概率。在“抗原性指數(shù)-Jameson-Wolf”圖中，如圖1所示的氨基酸殘基大約62到110、約119到164、約224到271以及約275到370對應(yīng)于圖示的DR5蛋白質(zhì)的高抗原區(qū)域。圖1中的高抗原性片段分別對應(yīng)于SEQ ID NO2中的以下片段氨基酸殘基大約11到59、大約68到113、大約173到220以及大約224到319。
圖4顯示與圖1所示核苷酸序列(SEQ ID NO1)相關(guān)的兩種cDNA分子的核苷酸序列(HAPBU13R和HSBBU76R)。
圖5A的條形圖顯示在MCF7人乳癌細(xì)胞中DR5過表達(dá)所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。圖5B的條形圖顯示在人上皮樣癌(Hela)細(xì)胞中DR5過表達(dá)所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。圖5C的條形圖顯示DR5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被caspase抑制劑CrmA和z-VAD-fmk阻斷，但顯性失活的FADD未受影響。圖5D是顯示DR5和DR4一樣不與FADD和TRADD在體內(nèi)相互作用的免疫印跡。圖5E的條形圖顯示新鑒定的類FLICE分子-FLICE2的顯性失活形式有效地阻斷了DR5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而顯性失活的FLICE在FLICE2阻斷的條件下只有部分效果。還顯示TNFR-1有效地阻斷了細(xì)胞凋亡。
圖6A是顯示DR5-Fc(以及DR4和TRID)特異結(jié)合TRAIL，但不與相關(guān)的細(xì)胞毒性配體TNFα結(jié)合的免疫印跡。圖6A底部一組表明結(jié)合實驗中Fc融合體的加入量。圖6B的條形圖顯示DR5-Fc阻斷TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。圖6B所示的數(shù)據(jù)(均值±SD)是凋亡細(xì)胞核占計數(shù)的總細(xì)胞核的百分比(n＝4)。圖6C的條形圖顯示在TNFR1-Fc使TNFα殺傷完全消除的條件下，DR5-Fc對細(xì)胞凋亡(TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡)沒有影響。
優(yōu)選實施方案詳述本發(fā)明提供分離的核酸分子，其中包含編碼具有圖1(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的DR5多肽或多肽片段的多核苷酸。本發(fā)明所述DR5多肽與其它已知的含有死亡結(jié)構(gòu)域的TNFR家族受體(包括人TNFR-1、DR3和Fas)有序列同源性(圖2)。將cDNA克隆，如HLYBX88[1997年3月7日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301ParkLawn Drive，Rockville，Maryland20852)，保藏號97920]進行測序得到圖1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列。該保藏克隆包含在pSport1質(zhì)粒(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中。
核酸分子除非另外指明，本文中所有通過DNA分子測序確定的核苷酸序列都是用自動DNA測序儀(例如，購自Applied Biosystems，Inc.的Model 373)確定的，所有由文中確定的DNA分子所編碼的多肽的氨基酸序列是通過翻譯如上確定的DNA序列推測的。因此，正如本領(lǐng)域已知的對于任何通過自動化方法確定的DNA序列所知的那樣，任何文中確定的核苷酸序列都可能含有某些錯誤。自動化確定的核苷酸序列與被測序DNA分子的實際核苷酸序列通常至少大約90％相同，更通常至少大約95％到至少大約99.9％相同?？梢酝ㄟ^其它方法(包括本領(lǐng)域熟知的人工DNA測序方法)更精確地確定實際的核苷酸序列。本領(lǐng)域內(nèi)還知道，與實際序列相比，在確定出的核苷酸序列中存在單個插入或缺失將導(dǎo)致核苷酸序列翻譯的移碼，從而由確定出的核苷酸序列編碼的推測氨基酸序列會從插入或缺失位點開始與被測序DNA分子實際編碼的氨基酸序列完全不同。
利用本文提供的信息(如在SEQ ID NO1中展示的核酸序列)，可以用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選步驟(如用mRNA作為起始材料克隆cDNA的步驟)來得到本發(fā)明所述編碼DR5多肽的核酸分子。舉例來說，在以下組織的cDNA文庫中已鑒定到本發(fā)明所述核酸分子初級樹突細(xì)胞、內(nèi)皮組織、脾、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和人胸腺基質(zhì)細(xì)胞。
確定出的SEQ ID NO1的DR5 cDNA核苷酸序列含有一個開放讀碼框，它編碼一個大約411個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其起始密碼子在圖1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列的130-132位，還有一個大約51個氨基酸殘基的前導(dǎo)序列。在TNF受體家族的已知成員中，本發(fā)明所述DR5多肽與圖2所示的人TNFR1、FAS和DR3多肽有程度最高的同源性，在多個半胱氨酸富含結(jié)構(gòu)域中有顯著的序列同源性。DR5所顯示的與其他含死亡結(jié)構(gòu)域之受體的同源性有力地表明DR5也是一個含有死亡結(jié)構(gòu)域、有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的受體?，F(xiàn)在證明DR5也能結(jié)合TRAIL。
如文中表明，本發(fā)明還提供了成熟形式的本發(fā)明所述DR5蛋白。根據(jù)信號假說，哺乳動物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)帶有信號或分泌前導(dǎo)序列，它們在不斷延長的蛋白質(zhì)鏈一開始穿過粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向外運輸時，即被從成熟蛋白質(zhì)上切割下來。大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞、甚至某些昆蟲細(xì)胞以相同的特異性切割分泌蛋白質(zhì)。但是，在某些情況中，分泌蛋白質(zhì)的切割并不完全一致，這樣就得到蛋白質(zhì)的兩種或多種成熟形式。另外，早已知道分泌蛋白質(zhì)切割的特異性最終由完整蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定，這就是說是多肽氨基酸序列的內(nèi)在性質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供了編碼成熟DR5多肽的核苷酸序列，所述成熟多肽具有鑒定為ATCC NO.97920的宿主中所含cDNA克隆編碼的氨基酸序列，如圖1所示(SEQ ID NO2)?！熬哂蠥TCC 97920宿主中所含cDNA克隆編碼的氨基酸序列的成熟DR5蛋白質(zhì)”是指通過在哺乳動物細(xì)胞(例如如下所述的COS細(xì)胞)中表達(dá)保藏宿主中質(zhì)粒所含人DNA克隆序列所編碼的完整開放讀碼框而產(chǎn)生的成熟形式DR5蛋白質(zhì)。正如以下表明的，ATCC NO.97920所含cDNA克隆編碼的成熟DR5的氨基酸序列可能與或可能不與SEQ ID NO2(氨基酸大約1到360號)所示推測的“成熟”DR5蛋白質(zhì)不同，這取決于基于計算機分析推測出的切割位點的準(zhǔn)確性。
有一些方法可用于預(yù)測蛋白質(zhì)是否有分泌前導(dǎo)序列以及該前導(dǎo)序列的切割位點。例如，可以使用McGeoch(病毒研究3271-280(1985))和von Heinje(核酸研究144683-4690(1986))的方法。這兩種方法預(yù)測已知哺乳動物分泌蛋白質(zhì)的切割位點的準(zhǔn)確性在75-80％(von Heinje，出處同前)。但是，這兩種方法對給定的蛋白質(zhì)不是總能給出相同的預(yù)測切割位點。
在本申請案中，通過計算機程序(PSORT)分析本發(fā)明所述完整DR5多肽的預(yù)測氨基酸序列。參見K.Nakai和M.Kanehisa，基因組14897-911(1992)。PSORT是根據(jù)氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)的胞內(nèi)位置的專業(yè)系統(tǒng)。計算機預(yù)測位置的部分內(nèi)容是將McGeoch與von Heinje的方法結(jié)合起來，用PSORT程序進行的分析預(yù)測出切割位點在圖1氨基酸51和52之間(SEQ ID NO2中的-1和1位氨基酸之間)。之后，應(yīng)用von Heinje的簡化形式的(-1，-3)規(guī)則(von Heinje，出處同前)，進一步經(jīng)目測分析完整氨基酸序列。這樣預(yù)測到DR5蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列由圖1中加下劃線的氨基酸殘基大約1到51(對應(yīng)于SEQ ID NO2中的大約-51到1)組成，而預(yù)測的成熟DR5蛋白質(zhì)由圖1中的大約殘基52到411組成(對應(yīng)于SEQ ID NO2中的大約1到360)。
正如文中表明，本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式(例如mRNA)，或DNA形式，包括例如通過克隆得到的或合成制備的cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈的。單鏈DNA可以是編碼鏈(又稱為有義鏈)，或者可以是非編碼鏈(也稱作反義鏈)。
“分離的”核酸分子意指脫離其天然環(huán)境的核酸分子(DNA或RNA)。例如，為了本發(fā)明目的，包含于載體中的重組DNA分子被視為分離的。分離的DNA分子的其它例子包括保持在異源宿主細(xì)胞中的重組DNA分子或溶液中的(部分或基本)純化的DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明所述DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的分離核酸分子還包括合成制備的這種分子。
本發(fā)明所述分離的核酸分子包括包含SEQ ID NO1所示開放讀碼框(ORF)的DR5 DNA分子；包含成熟DR5蛋白的編碼序列的DNA分子；以及包含與上述DNA分子有較大差異、但由于遺傳密碼的簡并性而仍編碼DR5蛋白質(zhì)的序列的DNA分子。當(dāng)然，這些遺傳密碼是本領(lǐng)域公知的。因此，制備這種簡并性變體對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常規(guī)工作。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼DR5多肽的分離的核酸分子，所述DR5多肽具有1997年3月7日保藏為ATCC NO.97920的質(zhì)粒中所含有的cDNA克隆編碼的氨基酸序列。在另一個實施方案中，提供了編碼成熟DR5多肽或缺少N-端甲硫氨酸的全長DR5多肽的核酸分子。本發(fā)明進一步提供了具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列或上述保藏克隆中所含DR5 cDNA的核苷酸序列的分離核酸分子，或者具有上述任何一個序列的互補序列的核酸分子。這些分離分子，特別是DNA分子，可以用作通過染色體原位雜交進行基因作圖的探針，以及用于檢測(例如通過Northern印跡分析)DR5基因在人體組織中的表達(dá)。
本發(fā)明進一步針對本文所述分離的核酸分子的片段。具有保藏cDNA的核苷酸序列、SEQ ID NO1所示核苷酸序列或其互補鏈的分離核酸分子的片段，意指至少約15nt的DNA片段，更優(yōu)選至少20nt，還要優(yōu)選的是至少大約30nt，更要優(yōu)選的是至少大約40、50、100、150、200、250、300、400或500nt長的DNA片段。這些片段有許多用途，包括但不限于如本文討論的作為診斷探針和引物。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明，較大的DNA片段(500-1500nt長)也有用，對應(yīng)于大部分或全部保藏cDNA或SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的片段也一樣有用。例如至少長20nt的片段意指包括保藏cDNA的核苷酸序列中或SEQ IDNO1所示核苷酸序列中的20個或者更多個相連堿基的片段。
本發(fā)明優(yōu)選的核酸片段包括但不限于編碼下述的核酸分子包含DR5胞外結(jié)構(gòu)域(圖1中的氨基酸殘基大約52到184(SEQ ID NO2中的大約1到133))的多肽；包含DR5跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1中的氨基酸殘基大約185到208(SEQ ID NO2中的大約134到157))的多肽；包含DR5胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(圖1中的氨基酸殘基大約209到411(SEQID NO2中的大約158到360))的多肽；以及包含DR5死亡結(jié)構(gòu)域(圖1中的氨基酸殘基大約324到391(SEQ ID NO2中的大約273到340))的多肽。由于這些結(jié)構(gòu)域的位置已經(jīng)通過計算機繪圖進行了預(yù)測，普通技術(shù)人員會意識到，根據(jù)用于定義每個結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)，組成這些結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基會有輕微的差異(例如大約1到15個殘基)。
本發(fā)明優(yōu)選的核酸片段編碼缺少氨基端甲硫氨酸的編碼核苷酸(SEQ ID NO1中的核苷酸130-132)的全長DR5多肽，因為已知甲硫氨酸將被自然切割，這樣的序列可能在遺傳工程構(gòu)建DR5表達(dá)載體中有用。本發(fā)明還包括這類多核苷酸編碼的多肽。
本發(fā)明優(yōu)選的核酸片段還包括編碼DR5蛋白質(zhì)中攜表位之部分的核酸分子。具體說，本發(fā)明的這種核酸片段包括、但不限于編碼下列多肽的核酸分子包含圖1中的氨基酸殘基大約62到110(SEQ ID NO2中的大約11到59))的多肽；包含圖1中的氨基酸殘基大約119到164(SEQ ID NO2中的大約68到113))的多肽；包含圖1中的氨基酸殘基大約224到271(SEQ ID NO2中的大約173到220))的多肽；以及包含圖1中的氨基酸殘基大約275到370(SEQ ID NO2中的大約224到319))的多肽。發(fā)明人已經(jīng)確定出以上多肽片段是DR5蛋白質(zhì)的抗原區(qū)。用于確定DR5蛋白質(zhì)中其它攜表位之部分的方法在下面詳細(xì)描述。
另外，本發(fā)明提供了具有與SEQ ID NO1更大范圍部分相關(guān)的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列已從以下相關(guān)克隆HAPBU13R(SEQ ID NO6)和HSBBU76R(SEQ ID NO7)確定了。HAPBU13R和HSBBU76R的核苷酸序列如圖4所示。
另外，本發(fā)明包括含有SEQ ID NO1中從殘基284到1362、優(yōu)選從284到681中的至少大約30個核苷酸、優(yōu)選至少大約50個核苷酸的任何部分的多核苷酸。
另一方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，它含有在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與本發(fā)明上述核酸分子(例如，包含于ATCC NO.97920中的cDNA克隆)的一段多核苷酸可雜交的多核苷酸?！皣?yán)謹(jǐn)雜交條件”意指于42℃在溶液中保溫過夜，該溶液含有50％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20g/ml變性、剪切鮭精DNA；隨后于大約65℃在0.1×SSC中洗滌膜。
與多核苷酸的一部分可雜交的多核苷酸意指這樣一個多核苷酸(DNA或RNA)，它與至少大約15個核苷酸(nt)、更優(yōu)選至少大約20nt、更優(yōu)選至少大約30nt、還要優(yōu)選的是至少大約30-70或80-150nt、或者完整長度的參照多核苷酸可雜交?？扇缟纤鲇盟鼈冏髟\斷探針和引物，這將在下面詳細(xì)討論。
“至少(例如)20nt長的多核苷酸部分”意指來自參照多核苷酸(例如，保藏cDNA或SEQ ID NO1所示核苷酸序列)的核苷酸序列中的20或更多個相鄰核苷酸。
當(dāng)然，只與polyA序列(如圖1(SEQ ID NO1)所示的DR5 cDNA 3’末端poly(A))或者互補的T(或U)殘基片段可雜交的多核苷酸不包括在本發(fā)明中用于與本發(fā)明所述核酸部分雜交的多核苷酸中，因為這樣的多核苷酸能與任何含有poly(A)片段或其互補物(例如實際上任何雙鏈cDNA克隆)的核酸分子雜交。
如文中表明，本發(fā)明所述編碼DR5多肽的核酸分子可以包括，但不限于成熟多肽的編碼序列本身；成熟多肽的編碼序列和附加序列(如編碼前導(dǎo)序列或分泌序列的序列，例如編碼前-、或原-或前原-蛋白質(zhì)序列的序列)；帶有或不帶有上述附加編碼序列的成熟多肽編碼序列，它們帶有附加的非編碼序列，包括例如但不限于內(nèi)含子和非編碼5’和3’序列，例如參與轉(zhuǎn)錄、mRNA加工-包括例如剪切和多聚腺苷酸化信號-核糖體結(jié)合和mRNA穩(wěn)定的已轉(zhuǎn)錄的非翻譯序列；編碼附加氨基酸(例如能提供附加功能)的附加編碼序列。因此例如，可以將多肽與標(biāo)記序列(例如有助于純化融合多肽的肽)融合在一起。在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實施方案中，標(biāo)記序列是6-組氨酸肽，如pQE載體(Qiagen，Inc.)等中提供的標(biāo)記物，其中許多有商業(yè)產(chǎn)品。例如Gentz等(美國科學(xué)院學(xué)報86821-824(1989))描述的6-組氨酸能夠方便融合蛋白質(zhì)的純化?！癏A”標(biāo)記物是可用于純化過程的另一種肽，它對應(yīng)一種來源于流感血凝素蛋白質(zhì)的表位，Wilson等在細(xì)胞37767-778(1984)中已有描述。正如以下討論的，其他這類融合蛋白質(zhì)包括與Fc在N-或C-端融合的DR5受體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述核酸分子的變體，它們編碼DR5受體的部分、類似物或衍生物。變體可以是天然的，例如天然的等位基因變體?！暗任换蜃凅w”意指在生物染色體上占據(jù)一定位點的一個基因的幾種替代形式之一(基因II，Lewin，B.編，John Wiley&Sons，NewYork(1985))。非天然發(fā)生的變體可以用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)制備。
這種變體包括那些通過涉及一或多個核苷酸的核苷酸取代、缺失或添加而制備得到的。變體可以在編碼或非編碼區(qū)域或兩種區(qū)域中發(fā)生了改變。在編碼區(qū)的改變可以產(chǎn)生保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。其中特別優(yōu)選的是不改變DR5受體或其部分的特征和活性的沉默取代、添加和缺失。在這方面，還特別優(yōu)選保守性取代。
本發(fā)明另外的實施方案包括與下列核苷酸序列至少90％、更優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％相同的分離的核酸分子(a)編碼具有SEQ ID NO2中氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO2中氨基酸序列、但缺少氨基端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO2中大約1到360位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有ATCC NO.97920所含cDNA克隆編碼的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)編碼具有ATCCNO.97920所含cDNA克隆編碼的氨基酸序列的成熟DR5多肽的核苷酸序列；(f)編碼具有SEQ ID NO2中大約1到133位氨基酸序列的DR5胞外結(jié)構(gòu)域、或ATCC NO.97920所含cDNA編碼的DR5胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(g)編碼具有SEQ ID NO2中大約134到157位氨基酸序列的DR5跨膜結(jié)構(gòu)域、或ATCC NO.97920所含cDNA編碼的DR5跨膜結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(h)編碼具有SEQ ID NO2中大約158到360位氨基酸序列的DR5胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、或ATCC NO.97920所含cDNA編碼的DR5胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(i)編碼具有SEQ ID NO2中大約273到340位氨基酸序列的DR5死亡結(jié)構(gòu)域、或ATCC NO.97920所含cDNA編碼的DR5死亡結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；和(j)與上述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)任何一個核苷酸序列互補的核苷酸序列。
“與編碼DR5多肽的參照核苷酸序列有至少例如95％相同的核苷酸序列的多核苷酸”意指該多核苷酸在編碼DR5多肽的參照核苷酸序列中每100個核苷酸可能有不超過5個點突變，除此之外該多核苷酸的核苷酸序列與參照序列都相同。換句話說，要獲得核苷酸序列與參照核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，參照序列中不超過5％的核苷酸可以被缺失或用其他核苷酸取代，或者可以向參照序列中插入占參照序列核苷酸總數(shù)不超過5％的核苷酸。參照(查詢)序列可以是圖1(SEQ ID NO1)所示的完整DR5核苷酸序列或本文描述的任何多核苷酸片段。
事實上，任何具體核酸分子是否與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或保藏cDNA克隆的核苷酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同可以用已知的計算機程序(如Bestfit程序，WisconsinSequence Analysis Package，Version8 for Unix，GeneticsComputer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI53711)來常規(guī)確定。Bestfit使用了Smith和Waterman的局部同源算法(local homology algorithm)(應(yīng)用數(shù)學(xué)進展2482-489(1981))來尋找兩個序列間的最佳同源片段。當(dāng)使用Bestfit或其他序列比對程序來確定一個具體序列與本發(fā)明參照序列是否(例如)95％相同時，當(dāng)然要設(shè)置參數(shù)以便相對參照核苷酸序列的全長計算相同百分比，并且允許同源性的缺口高達(dá)參照序列內(nèi)核苷酸總數(shù)的5％。
在一個具體實施方案中，用基于Brutlag等人的算法的FASTDB計算機程序(Comp.App.Biosci.6237-245(1990))確定參照(查詢)序列(本發(fā)明所述序列)與目標(biāo)序列之間的相同程度(又稱為全序列比對)。優(yōu)選用于計算相同性百分比的FASTDB DNA序列比對中的參數(shù)為矩陣＝一元，k-tuple＝4，錯配罰分＝1，相連罰分＝30，序列隨機化分段長度＝0，Cutoff分＝1，間隙罰分＝5，間隙大小罰分＝0.05，窗口大?。?00或者等于序列的長度(對于更短的目標(biāo)核苷酸序列)。根據(jù)本實施方案，如果目標(biāo)序列由于5’或3’缺失、而非內(nèi)部缺失而比查詢序列短，考慮到計算相同性百分比時FASTDB程序不能解釋目標(biāo)序列5’或3’截短這一事實，就要對結(jié)果進行人工修正。對于相對查詢序列而在5’或3’末端被截短的目標(biāo)序列，通過計算位于目標(biāo)序列5’或3’的查詢序列中沒有匹配/比對的堿基數(shù)目占查詢序列總堿基數(shù)的百分比來進行修正。用FASTDB序列比對的結(jié)果確定核苷酸是否匹配/比對。隨后，從通過使用特定參數(shù)的上述FASTDB程序計算出的相同百分比中減去該百分比，得到最終的相同百分比評分。修正后的分?jǐn)?shù)用于本實施方案的目的。人為調(diào)整相同百分比評分時，只計算FASTDB比對顯示位于目標(biāo)序列5’和3’堿基之外的不與查詢序列匹配/比對的堿基。例如，將90個堿基的目標(biāo)序列與100個堿基的查詢序列比對來確定相同百分比。缺失發(fā)生在目標(biāo)序列的5’端，因此FASTDB比對顯示5’端前10個堿基沒有匹配/比對。10個未配對的堿基代表序列的10％(5’和3’末端沒有匹配的堿基數(shù)/查詢序列中的總堿基數(shù))，因此從通過FASTDB程序計算的相同百分比判分中減去10％。如果剩下的90個堿基很好地匹配了，則最終的相同百分比就是90％。在另一個實施例中，將一個90個堿基的目標(biāo)序列與一個100個堿基的查詢序列進行了比較。這次的缺失是內(nèi)部缺失，因此目標(biāo)序列的5’和3’沒有不與查詢序列匹配/比對的堿基。這種情況中，通過FASTDB計算的相同百分比未做人工修正。同樣，只有目標(biāo)序列5’和3’的不與查詢序列匹配/比對的堿基要做人工修正。為了該實施方案，未做其他人工修正。
本申請針對與SEQ ID NO1所示的核酸序列、保藏cDNA的核酸序列或它們的片段至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸分子，而不考慮它們是否編碼有DR5活性的多肽。這是因為即使一個具體的核酸分子不編碼有DR5活性的多肽，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也知道如何利用這個核酸分子，例如作為雜交探針或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物。本發(fā)明所述不編碼有DR5活性之多肽的核酸分子的用途包括(還有其他用途)(1)在cDNA文庫中分離DR5基因或其等位基因變體；(2)與中期染色體涂片原位雜交(例如“FISH”)以便給出DR5基因的準(zhǔn)確的染色體位置(如Verma等在《人類染色體基本技術(shù)指南》，Pergamon Press，New York(1988)中所描述)，和(3)用于檢測DR5mRNA在特定組織中的表達(dá)的Northern印跡分析。
但是，優(yōu)選具有與SEQ ID NO1所示的核酸序列、保藏cDNA的核酸序列或它們的片段至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列、并且確實編碼有DR5活性的多肽的核酸分子。“有DR5活性的多肽”意指在特定生物檢測中測量到具備與本發(fā)明所述DR5蛋白質(zhì)(全長蛋白質(zhì)，或者優(yōu)選成熟蛋白質(zhì))活性相似的、但不必相同的活性的多肽。例如，可以基本按照以前描述的細(xì)胞死亡實驗(A.M.Chinnaiyan等，細(xì)胞81505-12(1995)；M.P.Boldin等，生物學(xué)化學(xué)雜志2707795-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO145579-5588(1995)；A.M.Chinnaiyan等，生物學(xué)化學(xué)雜志2714961-4965(1996))來測量DR5蛋白質(zhì)的活性(如以下實施例5中闡述)。在MCF7細(xì)胞中，將編碼全長DR5或候選含有死亡結(jié)構(gòu)域的受體的質(zhì)粒與編碼綠色熒光蛋白的pLantern受體構(gòu)建體進行共轉(zhuǎn)染。通過DAPI染色評價，被DR5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞核會顯示出細(xì)胞凋亡的形態(tài)。與TNFR-1和Fas/APO-1(M.Muzie等，細(xì)胞85817-827(1996)；M.P.Boldin等，細(xì)胞85803-815(1996)；M.Tewari等，生物學(xué)化學(xué)雜志2703255-60(1995))相似，DR5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡優(yōu)先被類ICE蛋白酶的抑制劑CrmA和z-VAD-fmk阻斷。
當(dāng)然，由于遺傳密碼的簡并性，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員立即會認(rèn)識到，與SEQ ID NO1所示的核酸序列、保藏cDNA的核酸序列或它們的片段具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的許多核酸分子能編碼“有DR5蛋白質(zhì)活性”的多肽。事實上，由于這些核苷酸序列的簡并變體都編碼相同的多肽，因此在許多情況下，即使不進行前面描述的比較檢測，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員也是顯而易見的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還會認(rèn)識到，對于非簡并性變體的核酸分子，有相當(dāng)數(shù)量也編碼有DR5蛋白質(zhì)活性的多肽。這是因為技術(shù)人員充分意識到有些氨基酸取代不太可能或不可能顯著影響蛋白質(zhì)功能(例如，用另一個脂肪族氨基酸代替一個氨基酸)。
例如，在Bowie，J.U.等的“破解蛋白質(zhì)序列中的信息對氨基酸取代的耐受性”(科學(xué)2471306-1310(1990))一文中提供了關(guān)于如何制備表型沉默的氨基酸取代的指南，在文中作者表明蛋白質(zhì)驚人地耐受氨基酸取代。
多核苷酸檢測本發(fā)明還涉及利用DR5多核苷酸檢測互補多核苷酸的用途，例如作為診斷試劑。檢測與功能障礙相關(guān)聯(lián)的突變形式DR5能提供一種診斷工具，它能增加或確定對DR5或其可溶性形式低表達(dá)或過表達(dá)或表達(dá)改變所致疾病(例如，腫瘤或自身免疫疾病)的診斷或?qū)@類疾病的易感性。
可以通過多種技術(shù)在DNA水平上檢測攜帶DR5基因內(nèi)突變的個體。用于診斷的核酸可以得自患者的細(xì)胞，例如來自血液、尿、唾液、組織活檢標(biāo)本和解剖材料?？梢灾苯踊蛲ㄟ^在分析前用PCR進行酶法擴增將基因組DNA用于檢測(Saiki等，自然324163-166(1986))。還可以同樣的方式使用RNA或cDNA。作為一個例子，可以用與編碼DR5的核酸互補的PCR引物來鑒定和分析DR5的表達(dá)和突變。例如，通過擴增產(chǎn)物相比于正?；蛐偷拇笮∽兓蓹z測出缺失和插入。通過將擴增的DNA與放射標(biāo)記的DR5 RNA或者放射標(biāo)記的DR5反義DNA序列雜交，可以鑒定點突變。通過RNase A消化或溶解溫度的差異可以將匹配良好的序列與未匹配的雙鏈區(qū)分開。
還可以通過直接DNA測序揭示參照基因和帶有突變的基因之間的序列差異。另外，可以將克隆的DNA片段做為探針來檢測特異性DNA片段。適當(dāng)?shù)厥褂肞CR或另一種擴增方法可以大大增加這類方法的靈敏度。例如，將測序引物與雙鏈PCR產(chǎn)物或修飾PCR產(chǎn)生的單鏈模板分子一起使用。通過使用放射標(biāo)記核苷酸的常規(guī)步驟或使用熒光標(biāo)記物的自動測序步驟來確定序列。
通過檢測DNA片段在有或沒有變性劑的凝膠中電泳遷移率的改變可以實現(xiàn)基于DNA序列差異的基因檢測。小的序列缺失和插入可以通過高分辨率凝膠電泳目測。在變性甲酰胺梯度凝膠中，不同DNA片段的遷移將根據(jù)它們的特異溶解溫度或部分溶解溫度被阻滯在凝膠的不同位置，可以以此區(qū)分不同序列的DNA片段(參見，例如Myers等，科學(xué)2301242(1985))。
通過核酸酶保護實驗，例如RNase和S1保護法，或化學(xué)裂解方法(例如Cotton等，美國科學(xué)院學(xué)報854397-4401(1985))，可以揭示具體位置的序列變化。
因此，可以通過包括、但不限于雜交、RNase保護法、化學(xué)裂解、直接DNA測序或使用限制酶[例如，限制性酶切片段長度多態(tài)性(“RFLP”)和基因組DNA的Southern印跡]等方法來檢測特異DNA序列。
除了更常規(guī)的凝膠電泳和DNA測序，通過原位雜交分析也可以檢測突變。
載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明所述DNA分子的載體、用本發(fā)明所述載體基因工程化得到的宿主細(xì)胞以及通過重組技術(shù)制備本發(fā)明所述多肽。
可以通過基因工程操作使宿主細(xì)胞帶有核酸分子并表達(dá)本發(fā)明所述多肽。多核苷酸可以被單獨或與其它多核苷酸一起導(dǎo)入。這類其它多核苷酸可以被獨立導(dǎo)入、共導(dǎo)入或與本發(fā)明多核苷酸聯(lián)接導(dǎo)入。
按照本發(fā)明的這一方面，載體可以是例如質(zhì)粒載體、單或雙鏈?zhǔn)删w載體、單或雙鏈RNA或DNA病毒載體。可以通過已知的DNA和RNA向細(xì)胞中導(dǎo)入的技術(shù)，將這些載體以多核苷酸(優(yōu)選DNA)的形式導(dǎo)入細(xì)胞。病毒載體可以是可復(fù)制型或復(fù)制缺陷型的。在后一種情況中，病毒增殖通常只發(fā)生在互補型的宿主細(xì)胞中。
在某些方面優(yōu)選的載體是用于表達(dá)本發(fā)明所述多核苷酸和多肽的載體。通常，這些載體包含與待表達(dá)多核苷酸操縱性地連接、對于在宿主中的表達(dá)有效的順式作用調(diào)控區(qū)。合適的反式因子可以由宿主、互補載體提供，或載體本身在導(dǎo)入宿主時提供。
很多種表達(dá)載體可被用于表達(dá)本發(fā)明多肽。這些載體包括染色體型、附加型載體和病毒衍生的載體，例如來源于細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如桿狀病毒、乳多空病毒(如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)的載體，以及來源于它們的組合體的載體，如來源于質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體(如粘粒和噬菌粒)，它們均可用于本發(fā)明這一方面的表達(dá)。通常，任何適合維持、增殖或表達(dá)多核苷酸從而在宿主中表達(dá)多肽的質(zhì)粒都可以用于這方面的表達(dá)。
將表達(dá)載體中的DNA序列操縱性連接上合適的表達(dá)調(diào)控序列，包括例如指導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄的啟動子。這種啟動子的代表包括噬菌體λPL啟動子、大腸桿菌lac、trp、tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子(僅舉已知質(zhì)粒中的幾種)。一般來說，表達(dá)構(gòu)建體中應(yīng)含有轉(zhuǎn)錄、起始和終止位點，并且在轉(zhuǎn)錄區(qū)中有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。由該構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼區(qū)應(yīng)包括開頭的翻譯起始AUG和適當(dāng)置于待翻譯多肽末端的終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
另外，構(gòu)建體可以含有調(diào)節(jié)和引起表達(dá)的調(diào)控區(qū)。通常，這些區(qū)域通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄來起作用，例如阻遏蛋白結(jié)合位點和增強子等。
用于增殖和表達(dá)的載體通常包括選擇性標(biāo)記。這些標(biāo)記也適用于擴增，或者載體可以含有附加標(biāo)記以便達(dá)到這一目的。在這方面，優(yōu)選表達(dá)載體含有一或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供表型特征，便于挑選被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這些標(biāo)記包括，但不限于用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，和用于培養(yǎng)大腸桿菌和其它細(xì)菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因。
可以用多種已知技術(shù)，將含有文中其它地方描述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子和其它適當(dāng)調(diào)控序列的載體導(dǎo)入適合用來表達(dá)所需多肽的適當(dāng)宿主中。適當(dāng)宿主的代表性例子包括細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞)；真菌細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)；昆蟲細(xì)胞(如果蠅S2和灰翅夜蛾屬Sf9細(xì)胞)；動物細(xì)胞(如CHO、COS和Bowes黑素瘤細(xì)胞)和植物細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞的合適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。
在細(xì)菌中使用的優(yōu)選載體是Qiagen有售的pQE70、pQE60和pQE-9；Stratagene有售的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；和Pharmacia有售的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。優(yōu)選的真核載體是Stratagene有售的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；和Pharmacia有售的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。僅列舉這些載體代表許多市場銷售和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的載體。
挑選用于在宿主細(xì)胞中進行表達(dá)的適當(dāng)載體和啟動子是熟知的操作，用于表達(dá)載體構(gòu)建、將載體導(dǎo)入宿主并在宿主中進行表達(dá)的必要技術(shù)也是本領(lǐng)域的常規(guī)技能。
本發(fā)明還涉及上面討論的含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞)，或低等真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)?？梢赃x擇能夠調(diào)節(jié)插入基因序列的表達(dá)，或能以所需的特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主菌株?？梢杂锰囟ǖ恼T導(dǎo)物來提高從特定啟動子開始的表達(dá)，因此可以調(diào)控基因工程化多肽的表達(dá)。另外，不同宿主細(xì)胞有特征性和特異性的翻譯和翻譯后蛋白質(zhì)加工和修飾機制(例如，磷酸化、切割)?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系以保證按需要修飾和加工所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)。
可以通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法實現(xiàn)構(gòu)建體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入。這些方法在許多標(biāo)準(zhǔn)實驗指南(如Dayis等，1986)分子生物學(xué)基本方法)中有描述。
可以將多肽表達(dá)為修飾形式，如融合蛋白[包含通過肽鍵與(不同蛋白質(zhì)的)異源蛋白質(zhì)序列連接的多肽]，還可以包括分泌信號和附加的異源功能區(qū)?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的方法，通過將本發(fā)明所述多核苷酸與編碼預(yù)期氨基酸序列的所需核酸序列在合適的讀碼框中連接在一起，并用本領(lǐng)域已知方法表達(dá)融合蛋白產(chǎn)物來制備這種融合蛋白?？蛇x擇地，通過蛋白質(zhì)合成技術(shù)，例如用肽合成儀，可以制備這種融合蛋白質(zhì)。因此，例如，可以在多肽的N-末端加上附加氨基酸區(qū)，特別是帶電荷氨基酸，以提高它們在宿主細(xì)胞中、在純化或隨后的操作和保存期間的穩(wěn)定性和持續(xù)性。另外，可以給多肽加上一個區(qū)域以便協(xié)助純化。這些區(qū)域可以在多肽的最后制備之前去除。給多肽加上肽部分使其分泌或排泄、提高穩(wěn)定性和協(xié)助純化都是本領(lǐng)域中熟悉和常規(guī)的技術(shù)。優(yōu)選的融合蛋白質(zhì)包含可用于增強蛋白質(zhì)溶解性的來自免疫球蛋白的異源區(qū)域。例如，EP-A-O 464 533(加拿大對應(yīng)號2045869)公開過包含免疫球蛋白分子恒定區(qū)各部分和另一種人蛋白質(zhì)或其部分的融合蛋白質(zhì)。許多情況中，融合蛋白質(zhì)的Fc部分用于治療和診斷十分有利，能夠產(chǎn)生例如改善的藥物動力學(xué)特性(EP-A 0232 262)。另一方面，對于某些用途，希望在以描述的有益方式表達(dá)、檢測和純化融合蛋白質(zhì)后能刪除Fc部分。當(dāng)Fc部分防礙在治療和診斷中的使用，例如在將融合蛋白質(zhì)用作免疫抗原時，即是如此。在開發(fā)藥物時，例如，已將人蛋白質(zhì)(如hIL5-受體)與Fc部分融合在一起，以用于鑒定hIL5的拮抗劑的高容量篩選檢測中。參見，D.Bennett等，分子識別雜志852-58(1995)和K.Johanson等，生物學(xué)化學(xué)雜志2709459-9471(1995)。
可以通過包括，但不限于硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陽離子或陰離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親合層析、羥磷灰石層析和凝集素層析等的標(biāo)準(zhǔn)方法，將DR5多肽從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化出來。最優(yōu)選采用高效液相層析(“HPLC”)進行純化。當(dāng)多肽在分離和/或純化期間被變性時，可以采用用于蛋白質(zhì)重新折疊的公知技術(shù)來恢復(fù)其活性構(gòu)象。
本發(fā)明所述多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成步驟的產(chǎn)物以及通過重組技術(shù)從原核或真核宿主(包括例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)制備到的產(chǎn)物。根據(jù)重組制備過程中采用的宿主，本發(fā)明所述多肽可以是糖基化或非糖基化。另外，本發(fā)明所述多肽還可以包括起始的被修飾甲硫氨酸殘基，在某些情況中這是宿主介導(dǎo)過程的結(jié)果。
可以根據(jù)本發(fā)明，將DR5多核苷酸和多肽用于多種應(yīng)用，特別是那些利用DR5的化學(xué)和生物學(xué)特性的應(yīng)用。其中有治療腫瘤，抗寄生蟲、細(xì)菌和病毒，誘導(dǎo)T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和某些造血細(xì)胞增殖，治療再狹窄，移植體抗宿主疾病，調(diào)節(jié)抗病毒反應(yīng)，以及用激動劑刺激DR5后，預(yù)防某些自身免疫疾病。另外的應(yīng)用涉及診斷和治療細(xì)胞、組織和生物體紊亂。以下進一步討論本發(fā)明的這些方面。
DR5多肽和片段本發(fā)明還提供了具有保藏cDNA編碼的氨基酸序列或SEQ ID NO2中的氨基酸序列的分離DR5多肽、或包含以上多肽的一部分的多肽或肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，可以改變DR5的某些氨基酸序列而不顯著影響該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。如果在序列中設(shè)計這樣的差異，應(yīng)記住蛋白質(zhì)中有決定活性的關(guān)鍵區(qū)域。這些區(qū)域通常包含構(gòu)成配體結(jié)合位點或死亡結(jié)構(gòu)域、或者形成影響這些結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)的殘基。
因此，本發(fā)明還包括顯示出實質(zhì)性的DR5蛋白質(zhì)活性或包括DR5的區(qū)域(如以下討論的蛋白質(zhì)部分)的DR5蛋白質(zhì)變體。這些突變包括缺失、插入、翻轉(zhuǎn)、重復(fù)和類型取代。正如上面說明的，可以在Bowie，J.U.等，科學(xué)2471306-1310(1990)文中找到有關(guān)可能是表現(xiàn)型沉默的氨基酸變化的指導(dǎo)。
因此，SEQ ID NO2的多肽或保藏cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)其中的至少一或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基，更優(yōu)選至少1個但少于10個保守氨基酸殘基)取代，這些取代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的，或者(ii)其中的1或多個氨基酸殘基包括取代基團，或者(iii)其中的成熟多肽與另外一種化合物融合在一起，如提高多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加氨基酸與成熟多肽融合在一起，如IgG Fc融合區(qū)肽或前導(dǎo)或分泌序列或用于純化成熟多肽或前蛋白序列的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識到，參照本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物或類似物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
我們特別感興趣的是用另一個帶電荷、中性或負(fù)電荷的氨基酸取代帶電荷氨基酸。后者形成的蛋白質(zhì)所帶正電荷減少，從而可改善DR5蛋白質(zhì)的特性。十分希望能防止聚集。蛋白質(zhì)的聚集不僅導(dǎo)致失活，而且因為它們是免疫原性的，還會在制備藥物組合物時帶來問題(Pinckard等，臨床與實驗免疫學(xué)(Clin Exp.Immunol.)2331-340(1967)；Robbins等，糖尿病36838-845(1987)；Cleland等，治療性藥物載體系體評述(Crit.Rev.Therapeutic Drug CarrierSystems)10307-377(1993))。
氨基酸取代還可以改變與細(xì)胞表面受體結(jié)合的選擇性。Ostade等(自然361266-268(1993))描述了某些導(dǎo)致TNF-α選擇性結(jié)合兩種已知類型的TNF受體之一的突變。因此，本發(fā)明所述DR5受體可以包括來自自然突變或人工的1或多個氨基酸的取代、缺失或添加。
正如文中表明，優(yōu)選影響較小的變化，如不會顯著影響蛋白質(zhì)折疊或活性的保守氨基酸取代(見表1)。表1保守氨基酸取代芳香族氨基酸苯丙氨酸酪氨酸色氨酸疏水性氨基酸亮氨酸異亮氨酸纈氨酸極性氨基酸 谷氨酰胺天冬酰胺堿性氨基酸 精氨酸賴氨酸組氨酸酸性氨基酸 天冬氨酸谷氨酸小氨基酸 丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸甘氨酸可以通過本領(lǐng)域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學(xué)2441081-1085(1989))來鑒定本發(fā)明所述DR5蛋白質(zhì)中為功能所必需的氨基酸。后一種操作在分子的每個殘基處導(dǎo)入單個丙氨酸突變。然后檢測制得的突變分子的生物活性，如受體結(jié)合活性或者體外、體內(nèi)增殖活性。通過結(jié)構(gòu)分析，如結(jié)晶、核磁共振或光親合標(biāo)記(Smith等，分子生物學(xué)雜志224899-904(1992)和de Vos等，科學(xué)255306-312(1992))，也可以確定配體-受體結(jié)合的關(guān)鍵位點。
優(yōu)選以分離的形式提供本發(fā)明所述多肽。“分離的多肽”意指從其天然環(huán)境中取出的多肽。因此，本發(fā)明中，在重組宿主細(xì)胞中制備和/或包含著的多肽也視作分離的。“分離的多肽”還指已從重組宿主細(xì)胞中(部分或基本)純化的多肽。例如，可以通過Smith和Johnson(基因6731-40(1988))描述的一步法將重組制備的DR5多肽基本上地純化。
本發(fā)明所述多肽還包括保藏cDNA編碼的包括前導(dǎo)序列的多肽；保藏cDNA編碼的沒有前導(dǎo)序列的成熟多肽(即成熟蛋白質(zhì))；包含SEQID NO2中大約氨基酸-51到360的多肽；包含SEQ ID NO2中大約氨基酸-50到360的多肽；包含SEQ ID NO2中大約氨基酸1到360的多肽；包含胞外結(jié)構(gòu)域的多肽；包含跨膜結(jié)構(gòu)域的多肽；包含胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的多肽；包含胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域以及有全部或部分跨膜結(jié)構(gòu)域缺失的多肽；和包含死亡結(jié)構(gòu)域的多肽；還有與以上描述的多肽至少80％相同、優(yōu)選至少90％或95％相同，更優(yōu)選至少96％、97％、98％、99％相同的多肽；并且包括這些多肽中至少30個氨基酸、優(yōu)選至少50個氨基酸的部分。
具有與DR5多肽的參照氨基酸序列至少95％“相同”的氨基酸序列的多肽意指所述多肽在DR5多肽的參照氨基酸序列中每100個氨基酸中可以有不超過5個氨基酸改變，除此之外，該多肽的氨基酸序列與參照序列都相同。換句話說，要獲得具有與參照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，參照序列中不超過5％的氨基酸殘基可以被缺失或用其它氨基酸取代，或者可以向參照序列中插入占參照序列氨基酸殘基總數(shù)不超過5％的氨基酸殘基。參照序列的這些改變可以發(fā)生在參照氨基酸序列的氨基或羧基末端，或者兩個末端之間的任何位置，可以單個地或者以1或多個相連簇的形式分布在參照序列殘基中。
事實上，任何具體多肽與例如圖1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列、保藏cDNA克隆編碼的氨基酸序列或其片段是否至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同可以用已知的計算機程序(如Bestfit程序，Wisconsin Sequence Analysis Package，Version8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI53711)來確定。當(dāng)使用Bestfit或其它序列比對程序來確定一個具體序列與本發(fā)明參照序列是否(例如)95％相同時，當(dāng)然要設(shè)置參數(shù)以便相對參照氨基酸序列的全長計算相同百分比，并且允許有同源性的缺口占參照序列氨基酸總數(shù)的不超過5％。
在一個具體實施方案中，用FASTDB計算機程序基于Brutlag等人的算法(Comp.App.Biosci.6237-245(1990))確定參照(查詢)序列(本發(fā)明所述序列)與目標(biāo)序列之間的相同程度。優(yōu)選用于FASTDB氨基酸序列比對的參數(shù)矩陣＝PAM0，k-tuple＝2，錯配罰分＝1，相連罰分＝20，序列隨機化分段長度＝0，Cutoff分＝1，間隙罰分＝5，間隙大小罰分＝0.05，窗口大小＝500或者等于序列的長度(對于更短的目的氨基酸序列)。根據(jù)本實施方案，如果目標(biāo)序列由于N或C末端缺失而非內(nèi)部缺失而比查詢序列短，則考慮到計算全序列相同百分比時FASTDB程序不能解釋目標(biāo)序列N-或C-末端截短這一事實，就要對結(jié)果進行人工修正。對于在N-或C-末端被截短的目標(biāo)序列，要通過計算查詢序列中位于目標(biāo)序列N-或C-末端、沒有與相應(yīng)目的殘基匹配/比對的殘基數(shù)，占查詢序列總殘基數(shù)的百分比來修正相同百分比。用FASTDB序列比對的結(jié)果確定殘基是否匹配/比對。隨后從通過上述FASTDB程序使用特定參數(shù)計算出的相同百分比中減去該百分比，即得到最終的相同百分比評分。本實施方案中使用修正后的分?jǐn)?shù)。人工調(diào)整相同百分比分?jǐn)?shù)時，只計算位于目標(biāo)序列N-或C-末端、不與查詢序列匹配/比對的殘基。也就是說，只查詢位于目標(biāo)序列N-或C-末端最遠(yuǎn)端殘基外的殘基位置。例如，將90個氨基酸殘基的目標(biāo)序列與100個殘基的查詢序列比對來確定相同百分比。缺失發(fā)生在目標(biāo)序列的N-端，因此FASTDB比對顯示N-端前10個殘基沒有匹配/比對。10個未配對的殘基代表序列的10％(N-或C-末端沒有匹配的殘基數(shù)/查詢序列中的總殘基數(shù))，因此從通過FASTDB程序計算出的相同百分比判分中減去10％。如果剩下的90個堿基很好地匹配了，最終的相同百分比就是90％。在另一個例子中，將一個90個殘基的目標(biāo)序列與一個100個殘基的查詢序列進行了比較。這次的缺失是內(nèi)部缺失，因此目標(biāo)序列的N-或C-末端沒有不與查詢序列匹配/比對的殘基。這種情況中，不對通過FASTDB計算的相同百分比做人工修正。重申一次，只針對FASTDB比對中位于目標(biāo)序列的N-或C-末端、不與查詢序列匹配/比對的殘基做人工修正。用于該實施方案的，未做其他人工修正。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將本發(fā)明所述多肽做為SDS-PAGE凝膠或分子篩凝膠過濾柱的分子量標(biāo)記物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，DR5多肽是呈現(xiàn)3個主要結(jié)構(gòu)域的411個殘基的蛋白質(zhì)。首先，鑒定到配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于圖1中的大約52到184位殘基間(SEQ ID NO2中的氨基酸殘基大約1到133)。其次，鑒定到跨膜結(jié)構(gòu)域位于圖1中的大約185到208位殘基間(SEQ ID NO2中的氨基酸殘基大約134到157)。第三，鑒定到胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域位于圖1中的大約209到411位殘基間(SEQ ID NO2中的氨基酸殘基大約158到360)。重要的是，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括位于殘基大約324到391(SEQ ID NO2中的氨基酸殘基大約273到340)的死亡結(jié)構(gòu)域。圖1所示多肽的更優(yōu)選片段包括殘基大約52到411(SEQ ID NO2中的氨基酸殘基大約1到360)的成熟蛋白質(zhì)，和包含全部或部分胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域但缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性多肽。
本發(fā)明還提供了保藏cDNA克隆編碼的、包括前導(dǎo)序列的DR5多肽，和選自成熟蛋白質(zhì)、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、死亡結(jié)構(gòu)域以及它們的各種組合的DR5多肽片段。
另一方面，本發(fā)明提供了包含本文所述多肽攜表位之部分的肽或多肽。這個多肽部分的表位是本發(fā)明所述多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”定義為當(dāng)完整的蛋白質(zhì)是免疫原時，蛋白質(zhì)中引起抗體應(yīng)答的部分。另一方面，蛋白質(zhì)分子中能夠被抗體結(jié)合到上面的區(qū)域被定義為“抗原性表位”。蛋白質(zhì)的免疫原性表位的數(shù)量通常少于抗原性表位數(shù)。參見，例如Geysen等，美國科學(xué)院學(xué)報813998-4002(1983)。
對于選擇帶有抗原性表位的肽或多肽(即含有抗體能與之結(jié)合的蛋白質(zhì)分子區(qū)域的肽或多肽)，本領(lǐng)域都知道模擬部分蛋白質(zhì)序列的較短的合成肽通常能導(dǎo)致產(chǎn)生抗血清，該抗血清能與被部分模擬的蛋白質(zhì)反應(yīng)。參見，例如Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.，“與蛋白質(zhì)上預(yù)定位點反應(yīng)的抗體”科學(xué)219660-666(1983)。通常蛋白質(zhì)一級序列中即顯示出能激發(fā)蛋白質(zhì)反應(yīng)性血清的肽，可以通過一組簡單的化學(xué)規(guī)則來鑒定，并且既不被限定在完整蛋白質(zhì)的免疫顯性區(qū)域(即免疫原性表位)也不被限定在氨基或羧基末端。
本發(fā)明所述帶有抗原性表位的肽和多肽可用于制備與本發(fā)明所述多肽特異結(jié)合的抗體(包括單克隆抗體)。參見，例如Wilson等，細(xì)胞37767-778(1984)，于777頁。優(yōu)選本發(fā)明所述帶有抗原性表位的肽和多肽序列含有本發(fā)明所述多肽的氨基酸序列中包含的至少7個氨基酸、更優(yōu)選至少9個、最優(yōu)選至少大約15-30個氨基酸的序列。
可用于制備DR5特異性抗體的抗原性多肽或肽的非限制性例子包括包含圖1中氨基酸殘基大約62到110(SEQ ID NO2中的大約11到59)的多肽；包含圖1中氨基酸殘基大約119到164(SEQ ID NO2中的大約68到113)的多肽；包含圖1中氨基酸殘基大約224到271(SEQ ID NO2中的大約173到220)的多肽；包含圖1中氨基酸殘基大約275到370(SEQ ID NO2中的大約224到319)的多肽。正如以上表明的，發(fā)明人確定出上述多肽片段是DR5蛋白質(zhì)的抗原性區(qū)域。
可以通過常規(guī)手段制備本發(fā)明所述帶有表位的肽和多肽。(Hougthen，R.A.，“快速固相合成大量肽的一般方法單個氨基酸水平上的抗原一抗體相互作用特異性”，美國科學(xué)院學(xué)報825131-5135(1985))。這個“同時多重肽合成(SMPS)”過程在美國專利4631211中有比Hougthen等(1986)更詳細(xì)的描述。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員都能理解，本發(fā)明所述DR5多肽及其上述帶有表位的片段可以與免疫球蛋白(IgG)恒定區(qū)的某些部分組合在一起，產(chǎn)生嵌合多肽。這些融合蛋白質(zhì)能協(xié)助純化，并且體內(nèi)半衰期延長。例如，由人CD4多肽的前兩個結(jié)構(gòu)域和哺乳動物免疫球蛋白重鏈或輕鏈恒定區(qū)的各個結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白質(zhì)已表明了這一點(EPA394827；Traunecker等，自然33184-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫鍵連接的二聚體結(jié)構(gòu)的融合蛋白質(zhì)也會比單聚體DR5蛋白質(zhì)或單獨的蛋白質(zhì)片段更有效地結(jié)合或中和其它分子(Fountoulakis等，生物化學(xué)雜志2703958-3964(1995))。
多肽檢測本發(fā)明還涉及診斷方法，如用于檢測細(xì)胞和組織中DR5蛋白質(zhì)或其可溶性形式水平(包括確定正常和異常水平)的定量和診斷方法。因此，例如根據(jù)本發(fā)明的用于檢測DR5或其可溶性形式過表達(dá)的診斷方法，并與正常的對照組織樣品進行比較，可以用來檢測例如腫瘤的存在?？捎糜诖_定來源于某宿主的樣品中蛋白質(zhì)(如本發(fā)明的DR5蛋白)水平的檢測技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。這些檢測方法包括放射免疫實驗、競爭結(jié)合實驗、Western印跡實驗和ELISA實驗。
可以用本領(lǐng)域已知的任何方法檢測生物樣品中的DR5蛋白質(zhì)水平?！吧飿悠贰币庵溉魏螐膫€體、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物或者其它含有DR5受體蛋白質(zhì)或mRNA的來源得到的生物樣品。優(yōu)選用于檢測生物樣品中DR5蛋白質(zhì)水平的技術(shù)是基于抗體的技術(shù)。例如，可以用經(jīng)典的免疫組織學(xué)方法(Jalkanen等，細(xì)胞生物學(xué)雜志101976-985(1985)；Jalkanen等，細(xì)胞生物學(xué)雜志1053087-3096(1987))研究DR5蛋白質(zhì)在組織中的表達(dá)。可用于檢測DR5蛋白質(zhì)基因表達(dá)的基于抗體的其它方法包括免疫測定法，如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫實驗(RIA)。
合適的標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的，包括酶標(biāo)記物(如葡萄糖氧化酶)、放射性同位素(如碘125I、121I；碳14C；硫35S；氚3H；銦112In；锝99mTc)以及熒光標(biāo)記物(如熒光素和若丹明)和生物素。
治療方法已知腫瘤壞死因子(TNF)家族配體是最多效的細(xì)胞因子之一，能誘導(dǎo)許多細(xì)胞應(yīng)答，包括細(xì)胞毒性、抗病毒活性、免疫調(diào)節(jié)活性和幾種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Goeddel，D.V.等，“腫瘤壞死因子基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性”，Symp.Quant.Biol.51597-609(1986)，Cold SpringHarbor；Beutler，B.，和Cerami，A.生物化學(xué)年刊57505-518(1988)；Old，L.J.，科學(xué)美國人25859-75(1988)；Fiers，W.，F(xiàn)EBS快報285199-224(1991))。TNF家族配體通過與TNF家族受體(包括本發(fā)明所述DR5)結(jié)合而誘導(dǎo)這些不同的細(xì)胞應(yīng)答。表達(dá)DR5多肽并且我們相信能對DR5配體作出有力細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞包括初級樹突細(xì)胞、內(nèi)皮組織、脾、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和人胸腺基質(zhì)細(xì)胞?！皩NF家族配體的細(xì)胞應(yīng)答”意指任何由TNF家族配體誘導(dǎo)的細(xì)胞、細(xì)胞系、組織、組織培養(yǎng)物或患者的基因型、表型和/或形態(tài)變化。如文中表明，這些細(xì)胞應(yīng)答既包括對TNF家族配體的正常生理反應(yīng)，也包括與細(xì)胞凋亡增加或抑制相關(guān)聯(lián)的疾病。細(xì)胞凋亡(程序化細(xì)胞死亡)是一種參與清除免疫系統(tǒng)外周T淋巴細(xì)胞的生理機制，其調(diào)節(jié)障礙能導(dǎo)致許多種不同發(fā)病過程(Ameisen，J.C.，AIDS81197-1213(1994)；Krammer，P.H.等，免疫學(xué)新論(Curr.Opin.Immunol.)6279-289(1994))。
與細(xì)胞存活增加或細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)聯(lián)的疾病包括癌癥(如濾泡淋巴瘤，p53突變的癌，以及激素依賴性腫瘤如乳癌、前列腺癌、Kaposi’s肉瘤和卵巢癌)；自身免疫疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫相關(guān)的腎小球腎炎類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)；和病毒感染(如皰疹病毒、痘病毒和腺病毒)；炎癥；移植體抗宿主病、急性移植體排斥和慢性移植體排斥。與細(xì)胞凋亡增強相關(guān)聯(lián)的疾病包括AIDS；神經(jīng)變性性疾病(如Alzheimer’s病、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化、色素性視網(wǎng)膜炎、大腦變性)；骨髓發(fā)育不良綜合癥(如再生障礙性貧血)、局部缺血性損傷(如心肌梗塞、中風(fēng)和再充血損傷導(dǎo)致的損傷)、毒素誘導(dǎo)的肝臟疾病(如酒精引起的疾病)、敗血性休克、惡病質(zhì)和厭食。
因此，本發(fā)明的一個方面針對一種用于增強TNF家族配體所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的方法，包括將有效量的DR5配體、類似物或能增強DR5介導(dǎo)的信號過程的激動劑給予表達(dá)DR5多肽的細(xì)胞。優(yōu)選，增強DR5介導(dǎo)的信號過程來治療細(xì)胞凋亡或細(xì)胞因子和粘連分子表達(dá)呈現(xiàn)下降的疾病。激動劑可以包括可溶形式的DR5和抗DR5多肽的單克隆抗體。
另一方面，本發(fā)明針對一種用于抑制TNF家族配體所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的方法，包括將有效量的能降低DR5介導(dǎo)的信號過程的拮抗劑給予表達(dá)DR5多肽的細(xì)胞。優(yōu)選，降低DR5介導(dǎo)的信號過程來治療細(xì)胞凋亡或NFkB表達(dá)呈現(xiàn)上升的疾病。拮抗劑可以包括可溶形式的DR5和抗DR5多肽的單克隆抗體。
“激動劑”意指能增加或加強細(xì)胞凋亡的天然和合成化合物?！稗卓箘币庵改芤种萍?xì)胞凋亡的天然和合成化合物。本發(fā)明的某種候選“激動劑”和“拮抗劑”是否能夠增強或抑制細(xì)胞凋亡可以用本領(lǐng)域已知的TNF家族配體/受體細(xì)胞應(yīng)答檢測(包括下面將詳細(xì)描述的)來確定。
一種篩選步驟包括使用被轉(zhuǎn)染從而表達(dá)本發(fā)明所述受體的黑素細(xì)胞。PCT WO92/01810(1992年2月6日公開)中描述了這樣一種篩選技術(shù)。通過將編碼受體的黑素細(xì)胞與TNF家族配體和候選的拮抗劑(或激動劑)進行接觸，這個方法可以應(yīng)用于例如篩選抑制(或增強)本發(fā)明所述受體多肽活化的化合物。配體產(chǎn)生的信號的抑制或增強表明該化合物是配體/受體信號途徑的拮抗劑或激動劑。
其他的篩選技術(shù)包括在一個能測量受體活化導(dǎo)致的胞外pH改變的系統(tǒng)中使用表達(dá)受體的細(xì)胞(例如，轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞)。例如，將一種表達(dá)本發(fā)明所述受體多肽的細(xì)胞與化合物進行接觸，測量第二信使應(yīng)答(例如信號傳導(dǎo)或pH改變)，來確定化合物是否激活或抑制受體。
另一種篩選技術(shù)包括將編碼受體的RNA導(dǎo)入爪蟾卵母細(xì)胞從而瞬時表達(dá)受體。然后使受體卵母細(xì)胞與受體的配體和待篩選的化合物接觸，隨后檢測鈣離子信號的抑制或激活(在篩選認(rèn)為能抑制受體活化的化合物的情況中)。
另一種篩選技術(shù)包括在細(xì)胞中表達(dá)一個構(gòu)建體，該構(gòu)建體中受體被連接上了磷脂酶C或D。這些細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、胚腎細(xì)胞等?？梢园慈缟厦枋鐾ㄟ^檢測受體從磷脂酶信號的激活或者受體的激活被抑制來進行篩選。
另一個方法包括通過確定標(biāo)記配體與表面有受體的細(xì)胞之間的結(jié)合被抑制來篩選能抑制本發(fā)明所述受體多肽的活化的化合物(拮抗劑)。這個方法包括用編碼受體的DNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，以便細(xì)胞在其表面表達(dá)該受體，并將化合物在有標(biāo)記形式的已知配體的情況下與細(xì)胞接觸。可以例如利用放射性標(biāo)記配體，測量與受體結(jié)合的標(biāo)記配體的量(例如通過測量受體的放射活性)。如果確定出結(jié)合受體的標(biāo)記配體減少，表明化合物結(jié)合了受體，則標(biāo)記配體與受體的結(jié)合即被抑制了。
Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.(生物學(xué)化學(xué)雜志2674304-4307(1992))描述過其他用于篩選本發(fā)明所述激動劑和拮抗劑的方法。
因此，進一步提供了一種用于確定候選激動劑或拮抗劑是否能增強或抑制對TNF家族配體的細(xì)胞應(yīng)答的篩選方法。該方法包括將表達(dá)DR5多肽的細(xì)胞與候選的化合物及TNF家族配體接觸，檢測細(xì)胞應(yīng)答，并與標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞應(yīng)答(標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞應(yīng)答是在沒有候選化合物時與配體進行接觸檢測到的)進行比較，因此比標(biāo)準(zhǔn)增加的細(xì)胞應(yīng)答表示該候選化合物是配體/受體信號途徑的激動劑，而比標(biāo)準(zhǔn)降低的細(xì)胞應(yīng)答表示該候選化合物是配體/受體信號途徑的拮抗劑?！皺z測細(xì)胞應(yīng)答”意指定性或定量測量對候選化合物和/或TNF家族配體的細(xì)胞應(yīng)答(例如，確定或估計T細(xì)胞增殖或者氚胸苷標(biāo)記的增加或減少)。通過本發(fā)明，可以將表達(dá)DR5多肽的細(xì)胞與內(nèi)源或外源給予的TNF家族配體進行接觸。
根據(jù)本發(fā)明的激動劑包括天然和合成化合物如，例如TNF家族配體肽片段、轉(zhuǎn)化生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)(如谷氨酸、多巴胺、N-甲基-D-天冬氨酸)、腫瘤抑制因子(p53)、溶細(xì)胞性T細(xì)胞和抗代謝物。優(yōu)選的激動劑包括化療藥物，例如，順鉑、阿霉素、博來霉素、阿糖胞苷、氮芥、氨甲蝶呤和長春花新堿。其他包括乙醇和-淀粉樣肽(科學(xué)2671457-1458(1995))。另外優(yōu)選的激動劑包括抗DR5多肽或其片段的多克隆和單克隆抗體。Tartaglia，L.A.(美國科學(xué)院學(xué)報889292-9296(1991))以及Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.(生物學(xué)化學(xué)雜志267(7)4304-4307(1992))公開過這種針對TNF家族受體的激動劑抗體。還可參見PCT申請WO94/09137。
根據(jù)本發(fā)明的拮抗劑包括天然和合成化合物，例如，CD40配體、中性氨基酸、鋅、雌激素、雄激素、病毒基因(如腺病毒E1B、桿狀病毒p53和IAP、牛痘病毒crmA，非洲淋巴瘤病毒BHRF1、LMP-1、非洲豬熱病病毒LMW5-HL和皰疹病毒yl34.5)，鈣蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑和腫瘤促進因子(如PMA、苯巴比妥和α-六氯環(huán)己烷)。
其他的潛在拮抗劑包括反義分子?？梢岳梅戳x技術(shù)通過反義DNA或RNA或通過形成三螺旋來控制基因表達(dá)。例如Okano(神經(jīng)化學(xué)雜志56560(1991))；“用寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制子”(CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))討論過反義技術(shù)。例如Lee等(核酸研究63073(1979))；Cooney等(科學(xué)241456(1988))；和Dervan等(科學(xué)2511360(1991))討論過三螺旋形成。這些方法基于多核苷酸與互補DNA或RNA的結(jié)合。
例如，可以利用編碼本發(fā)明所述成熟多肽的多核苷酸的5’編碼區(qū)設(shè)計大約10到40個堿基對長的反義RNA寡核苷酸。設(shè)計DNA寡核苷酸，使它與參與轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域互補，從而阻止受體的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生。反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內(nèi)雜交，并阻斷mRNA分子翻譯成受體多肽。
在一個實施方案中，通過從外源序列轉(zhuǎn)錄而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明所述DR5反義核酸。例如，轉(zhuǎn)錄載體或載體部分從而產(chǎn)生本發(fā)明所述反義核酸(RNA)。這種載體應(yīng)當(dāng)含有編碼DR5反義核酸的序列。該載體可以保持附加體形式或整合至染色體中，只需它能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生期望的反義RNA即可?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)方法構(gòu)建該載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒或本領(lǐng)域已知的其它用于在脊椎動物細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的載體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何啟動子在脊椎動物(優(yōu)選人)細(xì)胞中表達(dá)編碼DR5的序列或其片段。這些啟動子可以是誘導(dǎo)型或組成型的。啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區(qū)(Bernoist和Chambon，自然29304-310(1981))、Rous肉瘤病毒3’長末端重復(fù)中含有的啟動子(Yamamoto等，細(xì)胞22787-797(1980))、皰疹胸苷啟動子(Wagner等，美國科學(xué)院學(xué)報781441-1445(1981))、金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列(Brinster等，自然29639-42(1982))等。
本發(fā)明所述反義核酸包含與DR5基因RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的至少一部分互補的序列。絕對的互補雖然是優(yōu)選的，但不是必要的。在本文中，“與RNA至少一部分互補”意味著序列有足夠的互補性，能與RNA雜交形成穩(wěn)定的雙螺旋；就雙鏈DR5反義核酸而言，可以檢驗雙螺旋DNA的單鏈，或分析三螺旋形成。雜交能力取決于互補程度和反義核酸的長度兩個因素。通常，雜交核酸越大，則可以含有更多的與DR5 RNA錯配的堿基，而仍形成穩(wěn)定的雙螺旋(或者某些情況中是三螺旋)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過利用標(biāo)準(zhǔn)步驟確定雜交復(fù)合體的熔點來確定錯配的容忍度。
根據(jù)本發(fā)明的潛在拮抗劑還包括催化性RNA，或者核酶(參見，例如PCT國際申請WO90/11364，1990年10月4日公開；Sarver等，科學(xué)2471222-1225(1990))。雖然可以用能在位點特異性識別序列處切割mRNA的核酶來破壞DR5 mRNA，但優(yōu)選使用錘頭核酶。錘頭核酶切割mRNA的位置由與目的mRNA形成互補堿基對的側(cè)翼區(qū)確定。唯一的要求是目標(biāo)mRNA有以下的雙堿基序列5’-UG-3’。構(gòu)建和制備錘頭核酶是本領(lǐng)域熟知的，Haseloff和Gerlach(自然334585-591(1988))有過更完全的描述。在DR5的核苷酸序列中有大量潛在的錘頭核酶切割位點(圖1)。優(yōu)選地，設(shè)計核酶以使切割識別位點靠近DR5 mRNA 5’端；即提高效率并減少非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在胞內(nèi)積累。編碼核酶的DNA構(gòu)建體可以采取與上述反義編碼DNA相同的方式導(dǎo)入細(xì)胞。與反義分子不同，核酶是催化性的，因此它只要求較低的胞內(nèi)濃度。
根據(jù)本發(fā)明，另外的拮抗劑包括可溶形式的DR5，即包括來自全長受體中胞外區(qū)域的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DR5片段。該可溶形式的受體可以是天然或合成的，它們通過與細(xì)胞表面的DR5競爭結(jié)合TNF家族配體來拮抗DR5介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。因此，包括配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶形式受體是能抑制TNF家族配體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的新型細(xì)胞因子。可以將它們表達(dá)為單體，但是優(yōu)選表達(dá)為二聚體或三聚體，因為二聚體或三聚體作為拮抗劑要優(yōu)于單體的可溶形式受體，例如IgGFc-TNF受體家族融合體。其他這類細(xì)胞因子是本領(lǐng)域已知的，包括能夠生理性地限制由Fas配體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的FasB(可溶形式的小鼠Fas受體)(Hughes，D.P.和Crispe，I.N.實驗醫(yī)學(xué)雜志1821395-1401(1995))。
文中使用的術(shù)語“抗體”(Ab)或“單克隆抗體”(mAb)意味著包括能與抗原結(jié)合的完整分子和其片段(例如Fab和F(ab’)2片段)。Fab、Fab’和F(ab’)2片段缺少完整抗體的Fc片段，從血液循環(huán)中清除更迅速，并且非特異性組織結(jié)合可能比完整抗體少(Wahl等，核酸醫(yī)學(xué)雜志(J.Nucl.Med.)24316-325(1983))。
可以使用本發(fā)明所述DR5免疫原，通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法來制備本發(fā)明的抗體。正如文中表明，這些DR5免疫原包括全長的DR5多肽(可以包括或不包括前導(dǎo)序列)和DR5多肽片段(如配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和死亡結(jié)構(gòu)域)。
本發(fā)明所述抗體可以用于本領(lǐng)域已知的涉及本發(fā)明所述多肽序列的定位和活性的方法中，例如用于這些多肽的顯像，測量它們在適當(dāng)生理樣品中的水平等。抗體還可以用于免疫分析，并作為DR5的激動劑和拮抗劑用于治療方法。
根據(jù)本發(fā)明，能與DR5結(jié)構(gòu)域結(jié)合的蛋白質(zhì)和其它化合物也是候選的激動劑和拮抗劑。可以用酵母雙雜交系統(tǒng)(Fields和Song，自然340245-246(1989))“捕獲”這些結(jié)合化合物。Roger Brent和他的同事描述過一種改進的酵母雙雜交系統(tǒng)(Gyuris，J.等，細(xì)胞75791-803(1993)；Zervos，A.S.等，細(xì)胞72223-232(1993))。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明使用酵母雙雜交系統(tǒng)，以捕獲與DR5配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或DR5胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的化合物。這些化合物是很好的候選的本發(fā)明所述激動劑和拮抗劑。
“TNF家族配體”意指天然的、重組的和合成的配體，這些配體能與TNF受體家族成員結(jié)合并且誘導(dǎo)配體/受體信號途徑。TNF配體家族成員包括，但不限于DR5配體、TRAIL、TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，又稱為TNF-β)、LT-β(在復(fù)異三聚體LT-α2-β中發(fā)現(xiàn)的)、FasL、CD40、CD27、CD30、4-IBB、OX40和神經(jīng)生長因子(NGF)。以下實施例6中描述了一種方法，可以通過它來確定DR5和其衍生物(包括它的片段)、類似物與TRAIL結(jié)合的能力。
下面將詳細(xì)討論本發(fā)明的代表性的醫(yī)療應(yīng)用。界定AIDS病的免疫缺陷癥狀是CD4+T-淋巴細(xì)胞數(shù)目減少和功能降低的次級表現(xiàn)。最近的報導(dǎo)估計CD4+T-淋巴細(xì)胞的每日損失量為3.5×107到2×109個細(xì)胞(Wei X.等，自然373117-122(1995))。大家相信，CD4+T細(xì)胞在感染HIV情況下?lián)p耗的一個原因是HIV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。的確，HIV誘導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞死亡不僅在體外，更重要的是在被感染個體中已得到了證明(Ameisen，J.C.，AIDS81197-1213(1994)；Finkel，T.H.和Banda，N.K.，免疫學(xué)新觀點6605-615(1995)；Muro-Cacho，C.A.等，免疫學(xué)雜志1545555-5566(1995))。另外，細(xì)胞凋亡和CD4+T-淋巴細(xì)胞損耗在不同的AIDS動物模型中均密切相關(guān)(Brunner，T.等，自然373441-444(1995)；Gougeon，M.L.等，AIDS病研究及人類逆轉(zhuǎn)錄病毒(AIDS Res.Hum.Retrowiruses)9553-563(1993))，而在病毒復(fù)制沒有導(dǎo)致AIDS的動物模型中觀察不到細(xì)胞凋亡(Gougeon，M.L.等，AIDS病研究及人類逆轉(zhuǎn)錄病毒9553-563(1993))。進一步的資料表明，在遇到TNF家族配體FasL后，來自感染HIV的個體的未被感染但已致敏或活化的T-淋巴細(xì)胞要經(jīng)受細(xì)胞凋亡。使用被HIV感染后最終死亡的單核細(xì)胞系，已證明，用HIV感染U937細(xì)胞會導(dǎo)致FasL重新表達(dá)并且FasL會介導(dǎo)HIV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(Badley，A.D.等，病毒學(xué)雜志70199-206(1996))。而且在未被感染的巨噬細(xì)胞中能檢測到TNF家族配體，該配體的表達(dá)在HIV感染后被正調(diào)節(jié)，導(dǎo)致選擇性殺傷未被感染的CD4 T-淋巴細(xì)胞(Badley，A.D.等，病毒學(xué)雜志70199-206(1996))。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于治療HIV+個體的方法，包括給予本發(fā)明所述拮抗劑來減少對CD4 T-淋巴細(xì)胞的選擇性殺傷。以下將詳細(xì)討論給藥方式和劑量。
在同種異體移植排斥中，受納動物的免疫系統(tǒng)最初未被致敏而發(fā)生應(yīng)答，因此，就多數(shù)情況而言，免疫系統(tǒng)僅被環(huán)境抗原致敏。來自相同種類其他成員的組織不是以例如與呈遞病毒和細(xì)菌相同的方式呈遞的。在同種異體移植排斥的情況中，將免疫抑制療法設(shè)計成防止免疫系統(tǒng)達(dá)到效應(yīng)子階段。而異種移植排斥的免疫狀況可能與疾病復(fù)發(fā)而非同種異體移植排斥更相似。在疾病復(fù)發(fā)的情況中，天然島細(xì)胞的破壞證明免疫系統(tǒng)已經(jīng)被激活。因此，疾病復(fù)發(fā)時，免疫系統(tǒng)已經(jīng)達(dá)到效應(yīng)子階段。本發(fā)明的激動劑能抑制對同種異體移植和異種移植的免疫應(yīng)答，這是因為被激活并分化成效應(yīng)子的淋巴細(xì)胞會表達(dá)DR5多肽，因此對能增強細(xì)胞凋亡的化合物是易感的。因此，本發(fā)明進一步提供了一種用于產(chǎn)生免疫特免組織的方法。
可以將DR5拮抗劑用于治療炎癥疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病、敗血病和腸炎。
另外，由于淋巴母細(xì)胞能表達(dá)DR5，因此可以用可溶性DR5激動劑或拮抗劑mAB治療這類癌癥。并且，可以用可溶性DR5或中和性mAB治療各種慢性和急性炎癥，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病、敗血病和腸炎。
給藥方式可以將文中描述的激動劑或拮抗劑在體外、離體或在體內(nèi)給予表達(dá)本發(fā)明所述受體的細(xì)胞。給藥“有效量”的激動劑或拮抗劑意指所給化合物(包括多肽)的量能有效地增強或抑制對TNF家族配體的細(xì)胞應(yīng)答。具體說，給藥“有效量”的激動劑或拮抗劑意指用量能有效地增強或抑制DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。當(dāng)然，在希望增強細(xì)胞凋亡的情況中，可以將本發(fā)明的激動劑與TNF家族配體共同給藥。每個普通技術(shù)人員都能理解，可以根據(jù)經(jīng)驗確定激動劑或拮抗劑的有效量，并且可以純品形式或藥學(xué)上可接受的鹽、酯或前體藥物形式應(yīng)用。可以將激動劑或拮抗劑與一或多種藥學(xué)上可接受賦形劑(即載體)結(jié)合起來以組合物形式給藥。
應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)對人類患者給藥時，應(yīng)由主治醫(yī)生在有效的醫(yī)療判斷范圍內(nèi)確定本發(fā)明所述化合物和組合物的每日總用量。對任何具體患者的具體治療有效劑量水平取決于本領(lǐng)域熟知的因素。
雖然前面強調(diào)過應(yīng)服從治療學(xué)判斷，但作為一般性的建議，腸胃外給藥的DR5多肽的總醫(yī)療有效量每次劑量應(yīng)在大約1μg/kg患者體重/天到10mg/kg/天。更優(yōu)選，激素劑量為至少0.01mg/kg/天，最優(yōu)選對于人類在大約0.01-1mg/kg/天。如果持續(xù)給藥，通常以大約1μg/kg/小時到50μg/kg/小時的給藥速率給予DR5激動劑或拮抗劑，這是通過每天注射1-4次或(例如用微泵)連續(xù)皮下輸注達(dá)到的。還可以采用靜脈內(nèi)袋裝溶液。
還可以患者特異的方式安排服藥，以便使激動劑或拮抗劑在血液中達(dá)到預(yù)定的濃度(如通過RIA技術(shù)確定)。因此可以調(diào)節(jié)患者服藥方式來得到規(guī)則的持續(xù)波谷血液水平(如通過RIA測量到的)，數(shù)量級在50到1000ng/ml，優(yōu)選150到500ng/ml。
提供了包含激動劑或拮抗劑(包括本發(fā)明所述DR5多核苷酸和多肽)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物，它們可以經(jīng)口、直腸、腸胃外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、表面(以藥粉、藥膏、滴液或經(jīng)皮貼片)、頰給藥，或以口或鼻噴霧劑的形式給藥。通過將激動劑和TNF家族配體共同給藥，重要的是這樣能夠通過使用較低劑量的配體和激動劑而減少臨床副作用。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)具體醫(yī)療應(yīng)用的緊急程度，可以在TNF家族配體之前、之后或同時將激動劑“共同給藥”?！八帉W(xué)上可接受的載體”意味著無毒的固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)的填充劑、稀釋劑、成膠囊材料或任何類型的制劑輔助材料。在一個具體實施方案中，“藥學(xué)上可接受的”意味著聯(lián)邦或州政府的管理局批準(zhǔn)了，或者美國藥典或其他普遍認(rèn)可的藥典中列出了可用于動物、更優(yōu)選用于人?！癛emington’s藥物科學(xué)”(E.W.Martin)提供了根據(jù)該實施方案的合適藥物載體的非限定性例子，包括無菌液體(如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的，如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等)。當(dāng)藥物組合物經(jīng)靜脈內(nèi)給藥時，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和右旋糖水和甘油溶液可用作液態(tài)載體，對可注射溶液更是如此。
文中所用的術(shù)語“腸胃外”是指包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注等給藥方式。
本發(fā)明所述用于腸胃外注射的藥物組合物可以包含藥學(xué)上可接受的無菌水或非水溶液、分散液、懸液或乳濁液，以及可以在使用前重配成無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。
除了可溶性DR5多肽之外，當(dāng)含有跨膜區(qū)的DR5多肽用緩沖液及去污劑(如CHAPS或NP-40)適當(dāng)?shù)厝芙鈺r，也可以使用。
染色體分析本發(fā)明所述核酸分子在染色體鑒定中也有應(yīng)用價值。這些序列特異地導(dǎo)靶到單個人染色體上的特定位置并與之雜交。根據(jù)本發(fā)明將DNA在染色體上作圖是在這些序列與基因相關(guān)疾病之間建立聯(lián)系的首要步驟。
在這方面的某些優(yōu)選實施方案中，用文中公開的cDNA和/或多核苷酸克隆DR5基因的基因組DNA?？梢杂枚喾N熟知技術(shù)，和文庫(通常市場有售)實現(xiàn)這一點。然后采用針對該目的的熟知技術(shù)用基因組DNA做原位染色體圖譜分析。
另外，可以利用由cDNA制備得到的PCR引物(優(yōu)選15-25bp)，將序列定位到染色體上。利用計算機分析該基因的3’非翻譯區(qū)，可以迅速地挑選出那些不跨越基因組DNA中一個以上外顯子的引物(這會使擴增過程復(fù)雜化)。然后用這些引物，對含有各人染色體的體細(xì)胞雜合體進行PCR篩選。
利用cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(“FISH”)，一步就可以提供精確的染色體位置。這項技術(shù)可以使用50或60bp那么短的cDNA。關(guān)于這項技術(shù)的綜述，參見Verma等，人類染色體基礎(chǔ)技術(shù)指南，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列已被定位在精確的染色體位置上，就可以將序列在染色體上的物理位置與基因圖譜資料聯(lián)系起來。這些資料可見于例如，V.McKusick，“人類中的孟德爾遺傳”(通過Johns HopkinsUniversity，Welch Medical Library聯(lián)機提供)。然后通過連鎖分析(物理位置上臨近的基因的共遺傳)，鑒定出定位在相同染色體區(qū)域的基因和疾病之間的關(guān)系。
接下來，需要確定染病和未染病個體間cDNA或基因組序列間的差異。如果在某些或全部染病個體中觀察到一個突變，而在任何正常個體中都沒有觀察到，那么該突變可能是致病原因。
以上概括地描述了本發(fā)明，參考以下實施例會更容易理解發(fā)明，提供這些實施例是用來闡述而非限定發(fā)明。
實施例1在大腸桿菌中的表達(dá)和純化用DR5蛋白質(zhì)氨基端序列和基因3’方向的載體序列的特異PCR寡核苷酸引物，擴增保藏cDNA克隆(ATCC編號97920)中編碼成熟DR5蛋白質(zhì)的DNA序列。分別在5’和3’序列加上含有協(xié)助克隆的限制位點的附加核苷酸。
用以下引物在大腸桿菌中表達(dá)DR5胞外結(jié)構(gòu)域5’引物的序列是5’-CGCCCATGGAGTCT GCTCTGATCAC-3’(SEQ ID NO8)并含有加下劃線的NcoI位點；3’引物的序列是5’-CGCAAGCTTTTAGCCTGATTCTTTGTGGAC-3’(SEQ ID NO9)并含有加下劃線的HindIII位點。
上述限制位點對細(xì)菌表達(dá)載體pQE60(Qiagen，Inc.9259 EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)(本實施例中用它進行細(xì)菌表達(dá))的限制酶位點而言是很方便的。pQE60編碼氨芐青霉素抗生素抗性(“Ampr”)，并含有細(xì)菌復(fù)制原點(“ori”)、IPTG誘導(dǎo)型啟動子和核糖體結(jié)合位點(“RBS”)。
用NcoI和HindIII消化擴增后的DR5 DNA和載體pQE60，然后將消化過的DNA連接起來。將DR5蛋白質(zhì)DNA插入限制性酶切過的pQE60載體，使得DR5蛋白質(zhì)編碼區(qū)置于載體中IPTG誘導(dǎo)型啟動子下游并與它可操縱性連接，同時與適當(dāng)安置以便進行DR5蛋白質(zhì)翻譯的起始AUG讀框一致。
采用標(biāo)準(zhǔn)操作，將連接體系轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。這些步驟在Sambrook等的分子克隆實驗指南(第二版；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))中有描述。用含有多拷貝質(zhì)粒pREP4(該質(zhì)粒表達(dá)lac抑制子，并賦予卡那霉素抗性“Kan”)的大腸桿菌菌株M15/rep4進行文中描述的說明性實施例。這個菌株只是許多適用于表達(dá)DR5蛋白質(zhì)的菌株之一，可從Qiagen(同前)買到。
利用它們在有氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上的生長能力鑒定出轉(zhuǎn)化子。從抗性克隆中分離出質(zhì)粒DNA，通過限制酶切分析、PCR和DNA測序證實鑒定到的克隆DNA。
使含有預(yù)期構(gòu)建體的克隆在補充有氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜生長(“O/N”)。用O/N培養(yǎng)物以大約1∶100到1∶250的稀釋度放大接種。使細(xì)胞生長至600nm的光密度(“OD600”)達(dá)到0.4到0.6，然后加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)至終濃度為1mM，以通過使lacI阻遏物失活來誘導(dǎo)從lac阻遏物敏感型啟動子開始轉(zhuǎn)錄。然后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3到4小時。
然后經(jīng)離心收獲細(xì)胞，并用標(biāo)準(zhǔn)方法破碎。用常規(guī)的收集技術(shù)從破碎的細(xì)胞中純化包涵體，并將蛋白質(zhì)從包涵體中溶解到8M脲中。含有被溶解蛋白質(zhì)的8M脲溶液流過在2×磷酸鹽緩沖液(“PBS”)的PD-10柱子，從而除去脲、更換緩沖液并使蛋白質(zhì)重新折疊。再通過層析步驟除去內(nèi)毒素使蛋白質(zhì)純化。然后，將蛋白質(zhì)無菌過濾。無菌過濾過的蛋白質(zhì)制品以95μ/ml濃度保存在2×PBS中。
實施例2在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)典型的哺乳動物表達(dá)載體含有啟動子元件(介導(dǎo)起始轉(zhuǎn)錄mRNA)、蛋白質(zhì)編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止以及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物腺苷酸化所需信號。附加元件包括增強子、Kozak序列和旁側(cè)是RNA剪切的供體和受體位點的間插序列。用來自SV40的早期和晚期啟動子、來自逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如RSV、HTLVI、HIVI)的長末端重復(fù)(LTRs)和來自巨細(xì)胞病毒(CMV)的早期啟動子可以實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄。但是，也可以使用細(xì)胞信號(例如人肌動蛋白啟動子)。適用于實現(xiàn)本發(fā)明的表達(dá)載體包括例如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)等載體?？梢允褂玫牟溉閯游锼拗骷?xì)胞包括人Hela293、H9和Jurkat細(xì)胞，小鼠NIH3T3和C127細(xì)胞，Cos1、Cos7和CV1，鵪鶉QC1-3細(xì)胞，小鼠L細(xì)胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
可選擇地，在含有整合到染色體中的基因的穩(wěn)定細(xì)胞系中可表達(dá)感興趣的基因。與選擇性標(biāo)記(如dhfr、gpt、新霉素和潮霉素)共轉(zhuǎn)染就可以鑒定和分離被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
還可以使被轉(zhuǎn)染基因擴增來大量表達(dá)它所編碼的蛋白質(zhì)。二氫葉酸還原酶(DHFR)標(biāo)記可用于培育攜帶有幾百甚至幾千個拷貝感興趣基因的細(xì)胞系。另一個有用的選擇標(biāo)記是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等，生物化學(xué)雜志227277-279(1991)；Bebbington等，生物/技術(shù)10169-175(1992))。利用這些標(biāo)記，在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞，并挑選出抗性最高的細(xì)胞。這些細(xì)胞系含有擴增的整合在染色體中的基因。經(jīng)常用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞來生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
表達(dá)載體pC1和pC4含有Rous肉瘤病毒的強啟動子(LTR)(Cullen等，分子和細(xì)胞生物學(xué)5438-447(1985年3月))加上CMV-增強子片段(Boshart等，細(xì)胞41521-530(1985))。多克隆位點(例如具有限制酶切位點BamHI、XbaI和Asp718)可以協(xié)助克隆感興趣基因。載體可另外含有3’內(nèi)含子、大鼠前胰島素原基因的多聚腺苷酸化信號和終止信號。
在CHO細(xì)胞中克隆和表達(dá)用載體pC4表達(dá)DR5多肽。質(zhì)粒pC4是質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC保藏號37146)的衍生質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有處于SV40早期啟動子控制下的小鼠DHFR基因。通過在補充有化療試劑氨甲蝶呤(MTX)的選擇培養(yǎng)基(alpha minus MEM，Life Technologies)上培養(yǎng)細(xì)胞，可以挑選出轉(zhuǎn)染了所述質(zhì)粒的缺乏二氫葉酸活性的中國倉鼠卵巢或其他細(xì)胞。許多文章(參見例如Alt，F(xiàn).W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.，和 Schimke，R.T.，生物學(xué)化學(xué)雜志2531357-1370(1978)；Hamlin，J.L.和Ma，C.，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(Biochem.et Biophys.Acta)1097107-143(1990)；Page，M.J.和Sydenham，M.A.1991，生物技術(shù)964-68(1991))中顯示抗氨甲蝶呤(MTX)的細(xì)胞中DHFR基因發(fā)生了擴增。DHFR基因擴增的結(jié)果是，生長在MTX濃度漸增的培養(yǎng)基中的細(xì)胞通過過度產(chǎn)生目的酶(DHFR)而逐漸發(fā)展出對藥物的抗性。如果給DHFR基因連接上第二個基因，這個基因通常會共擴增和過表達(dá)。本領(lǐng)域已經(jīng)知道，可以用這個方法培育攜帶1000個以上拷貝的擴增基因的細(xì)胞系。隨后，當(dāng)除去氨甲蝶呤時，就能獲得含有擴增基因整合到宿主細(xì)胞的一或多個染色體中的細(xì)胞系。
為了表達(dá)感興趣的基因，質(zhì)粒pC4含有Rous肉瘤病毒長末端重復(fù)(LTR)的強啟動子(Cullen等，分子和細(xì)胞生物學(xué)5438-447(1985年3月))，以及分離自人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因的增強子的一個片段(Boshart等，細(xì)胞41521-530(1985))。啟動子的下游是允許基因進行整合的以下單一限制酶切位點BamHI、XbaI和Asp718。在這些克隆位點之后，質(zhì)粒含有大鼠前胰島素原基因的3’內(nèi)含子和多聚腺苷酸化位點。也可以用其他高效啟動子作表達(dá)，例如人β-肌動蛋白啟動子、SV40早或晚期啟動子或來自其他逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如HIV和HTLVI)的長末端重復(fù)?？梢杂肅lontech的Tet-Off和Tet-On基因表達(dá)系統(tǒng)和類似的系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞中以受調(diào)控的方式表達(dá)DR5多肽(Gossen，M.，&Bujard，H.，美國科學(xué)院學(xué)報895547-5551(1992))。還可以將其他信號，例如來自人生長激素或球蛋白基因的信號，用于mRNA的多聚腺苷酸化。
如果共轉(zhuǎn)染一個選擇標(biāo)記(如gpt、G418或潮霉素)，還可以挑選出攜帶整合到染色體中的感興趣基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。開始時以使用一個以上的選擇標(biāo)記為好，例如G418加上氨甲蝶呤。
用限制酶BamHI消化質(zhì)粒pC4，然后用小牛腸磷酸酯酶通過本領(lǐng)域已知步驟使之去磷酸化。然后從1％的瓊脂糖凝膠上分離載體。
用對應(yīng)于基因期望部分5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物擴增編碼完整多肽的DNA序列。含有BamHI位點(加下劃線部分)、Kozak序列和AUG起始密碼子的5’引物序列如下5’-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3’(SEQ ID NO10)；3’引物含有加下劃線的Asp718位點，序列如下5’-CGCGGTACCTTAGGACATGGCAGAGTC-3’(SEQ ID NO11)。
用內(nèi)切核酸酶BamHI和Asp718消化擴增后的片段，然后在1％的瓊脂糖凝膠上純化。用T4 DNA連接酶將分離到的片段和去磷酸化的載體連接在一起。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101或XL-1 Blue細(xì)胞，利用例如限制酶切分析鑒定出含有已插入質(zhì)粒pC4中的片段的細(xì)菌。
用缺乏活性DHFR基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法(Felgner等，出處同前)，用0.5μg的質(zhì)粒pSVneo與5μg表達(dá)質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒pSV2-neo含有顯性選擇標(biāo)記—來自Tn5的neo基因(該基因編碼的酶賦予對一組抗生素(包括G418)的抗性)。將細(xì)胞接種在補充有1mg/ml G418的alpha minus MEM中。兩天后，將細(xì)胞胰蛋白酶解，并在補充有10、25或50ng/ml氨甲蝶呤加上1mg/ml G418的alpha minus MEM中接種在雜交瘤克隆平板(Greiner，Germany)中。大約10到14天后，將單克隆進行胰蛋白酶解，然后接種在使用不同濃度(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)氨甲蝶呤的6孔培養(yǎng)板上或10ml燒瓶中。將在最高濃度氨甲蝶呤上生長的克隆轉(zhuǎn)移到新的含有更高濃度(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)氨甲蝶呤的6孔培養(yǎng)板上。重復(fù)相同的步驟，直至獲得在100-200μM濃度生長的克隆。通過例如SDS-PAGE和Western印跡或反相HPLC分析，分析期望的基因產(chǎn)物的表達(dá)情況。
在COS細(xì)胞中克隆和表達(dá)通過將編碼DR5蛋白質(zhì)的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA克隆到表達(dá)載體pcDNAI/Amp或pcDNAIII(可從Invitrogen，Inc.購買)中，制備得到表達(dá)質(zhì)粒pDR5-HA。表達(dá)載體pcDNAI/amp含有(1)能在大腸桿菌和其他原核細(xì)胞中有效增殖的大腸桿菌復(fù)制原點；(2)用于挑選含有質(zhì)粒的原核細(xì)胞的氨芐青霉素抗性基因；(3)用于在真核細(xì)胞中增殖的SV40復(fù)制原點；(4)CMV啟動子、多接頭、SV40和多聚腺苷酸化信號，它們以一定方式排列，這樣，借助于多接頭中的限制性位點，可以將cDNA方便地置于CMV啟動子表達(dá)調(diào)控下，并與SV40內(nèi)含子和多聚腺苷酸化信號操縱性連接。將編碼DR5多肽胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段和讀框一致地融合在它的3’末端的HA標(biāo)記克隆到載體的多接頭區(qū)，以便由CMV啟動子指導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。HA標(biāo)記對應(yīng)一種來源于流感血凝素蛋白質(zhì)的表位(Wilson等，細(xì)胞37767(1984))。將HA標(biāo)記與目的蛋白質(zhì)融合就能用識別HA表位的抗體容易地檢測和純化重組蛋白質(zhì)。
質(zhì)粒構(gòu)建策略如下。用含有方便的限制位點的引物擴增保藏克隆中的DR5 cDNA，方法與前面所述用于構(gòu)建在大腸桿菌中表達(dá)DR5的載體的方法大致相同。為了協(xié)助檢測、純化和鑒定被表達(dá)的DR5，引物之一含有上述血凝素標(biāo)記(“HA標(biāo)記”)。
合適的引物包括本實施例中使用的以下引物。含有加下劃線的BamHI位點的5’引物有如下序列5’-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3′(SEQ ID NO10).含有加下劃線的Asp718限制序列的3’引物有如下序列5’-CGCGGTACCTTAGCCTGATTCTTTTGGAC-3′(SEQ ID NO12)。
用BamHI和Asp718消化PCR擴增的DNA片段和載體(pcDNAI/Amp)，然后連接。將連接體系轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株SURE(購自Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey PinesRoad，La Jolla，CA92037)中，然后將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物鋪氨芐青霉素平板，溫育平板使氨芐青霉素抗性克隆生長。從抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA，通過限制酶切分析或其他手段檢查是否存在編碼DR5多肽胞外結(jié)構(gòu)域的片段。
為了表達(dá)重組DR5，用上述表達(dá)載體，采用DEAE-DEXTRAN(例如，Sambrook等，分子克隆實驗指南；Cold Spting Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York(1988))轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。在載體表達(dá)DR5的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
采用例如Harlow等描述的方法(抗體實驗指南，第二版；ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1988))，通過放射標(biāo)記和免疫沉淀檢測DR5-HA融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。為了達(dá)到這個目的，轉(zhuǎn)染后過兩天，將細(xì)胞在含有35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時使之被標(biāo)記。如上面引用的Wilson等描述的方法收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞并用含有去污劑的RIPA緩沖液(150mMNaCl，、1％NP-40、0.1％SDS、0.5％DOC、50mM TRIS，pH7.5)裂解。用HA特異性的單克隆抗體從細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基中沉淀出蛋白質(zhì)。通過SDS-PAGE和放射自顯影分析沉淀下來的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞裂解物中可以看到預(yù)期大小的表達(dá)產(chǎn)物，而在陰性對照中沒有。
本實施例中用于表達(dá)的引物組與本實施例中用于CHO表達(dá)的pC4、用于COS表達(dá)的pcDNAI/Amp和在下一個實施例中用于桿狀病毒表達(dá)的pA2相容。因此，例如，可以將擴增用于CHO表達(dá)的完整DR5編碼片段連接到用于COS表達(dá)的pcDNAI/Amp中或者連接到用于桿狀病毒表達(dá)的pA2中。
實施例3在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中克隆和表達(dá)DR5的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域在本說明性實施例中，采用標(biāo)準(zhǔn)方法(如Summer等在“桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)步驟方法指南，Texas AgriculturalExperimental Station Bulletin No.1555(1987)”中描述的方法)，利用質(zhì)粒穿梭載體pA2，將編碼完整蛋白質(zhì)的克隆DNA(包括其自然聯(lián)接的信號序列)插入桿狀病毒中，來表達(dá)DR5蛋白質(zhì)。該表達(dá)載體含有苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(ACMNPV)的強多角體啟動子，其后跟有方便的限制位點。為了容易挑選重組病毒，質(zhì)粒含有來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因，該基因處于一個同向的弱果蠅啟動子控制下，其后跟有多角體基因的多聚腺苷酸化信號。插入基因兩側(cè)有病毒序列，以用于與野生型病毒DNA進行細(xì)胞介導(dǎo)的同源重組，從而產(chǎn)生表達(dá)克隆多核苷酸的活性病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，只要構(gòu)建體有合乎要求并適當(dāng)?shù)囟ㄎ坏霓D(zhuǎn)錄、翻譯、分泌等信號(如符合讀框的AUG和信號肽)，則可以用許多其他桿狀病毒載體，如pAc373、pVL941和pAcIMl代替pA2。例如Luckow等在病毒學(xué)17031-39(1989)中描述過這些載體。
用與該基因5’和3’序列相對應(yīng)的PCR寡核苷酸引物，擴增保藏克隆(ATCC No.97920)中編碼DR5蛋白質(zhì)可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA序列。DR55’引物有如下序列5’-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3’(SEQ ID NO10)，含有加下劃線的BamHI限制酶位點。按照以下描述插入表達(dá)載體后，編碼DR5的擴增片段的5’末端提供有效的切割信號肽。能在真核細(xì)胞中有效地起始翻譯的信號適當(dāng)?shù)匚挥跇?gòu)建體的載體部分。
DR5 3’引物有如下序列5′-CGCGGTACCTTAGCCT GATTCTTTGTGGAC-3’(SEQ ID NO12)，其中含有加下劃線的Asp718限制序列，該序列后面是與圖1的DR5核苷酸序列互補的核苷酸，再后是終止密碼子。
用商品試劑盒(“Geneclean，”BI0101 Inc.，La Jolla，Ca.)從1％的瓊脂糖凝膠上分離擴增片段。然后用BamHI和Asp718消化片段，再在1％的瓊脂糖凝膠上純化。該片段命名為“F1”。
用限制酶BamHI和Asp718消化質(zhì)粒，還可以選擇性地采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)步驟用小牛腸磷酸酯酶將其去磷酸化。然后用商品試劑盒(“Geneclean，”BIO101 Inc.，La Jolla，Ca.)從1％的瓊脂糖凝膠上分離DNA。文中將載體DNA稱為“V1”。
用T4 DNA連接酶將片段F1和去磷酸化的質(zhì)粒V1連接在一起。用連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞或其他合適的大腸桿菌宿主(如XL-1Blue(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA))，并鋪培養(yǎng)基平板。用PCR方法鑒定出包含帶有人DR5的質(zhì)粒的細(xì)菌，在本方法中一個引物是用于擴增基因，第二個引物來自載體內(nèi)部，這樣只有含有DR5基因片段的細(xì)菌克隆顯示出DNA的擴增。通過DNA測序證實克隆片段的序列。文中將該質(zhì)粒命名為pBac DR5。
采用Felgner等描述的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法(美國科學(xué)院學(xué)報847413-7417(1987))，將1.0μg的商品線性桿狀病毒DNA(“Baculo GoldTM桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)與5μg質(zhì)粒pBac DR5一起共轉(zhuǎn)染。在含有50μl無血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的微量平板的一個無菌孔內(nèi)混合1μg BaculoGoldTM桿狀病毒DNA和5μg質(zhì)粒pBacDR5。隨后，加入10μl Lipofectin及90μl Grace’s培養(yǎng)基，混勻并于室溫保溫15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染體系滴加給接種在35mm組織培養(yǎng)板(有1ml無血清Grace’s培養(yǎng)基)中的Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL 1711)上。將平板來回晃動以便混勻新加入的溶液。然后將平板于27℃保溫5小時。5小時后，從平板中吸去轉(zhuǎn)染溶液，并加入1ml補充了10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)液。將平板放回培養(yǎng)箱，于27℃繼續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清液，如前面引用的Summer和Smith所描述的方法進行噬斑實驗。使用有“Blue Gal”的瓊脂糖凝膠(LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg，MD)以便容易鑒定和分離到表達(dá)gal的克隆(產(chǎn)生蘭染噬斑)。(關(guān)于這類噬斑實驗的詳細(xì)描述還可以在Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD派送的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)使用說明9-10頁中找到)。適當(dāng)?shù)嘏囵B(yǎng)后，用微型取液器(如Eppendorf)的吸頭挑出染蘭噬斑。然后將含有重組病毒的瓊脂重懸于含200μl Grace’s培養(yǎng)液的微量離心管中，并用該含有重組桿狀病毒的懸液感染接種在35mm培養(yǎng)皿中的Sf9細(xì)胞。四天后，收獲這些培養(yǎng)皿的上清液，然后保存于4℃。重組病毒稱為V-DR5。
為了證實DR5基因的表達(dá)，讓Sf9細(xì)胞在補充有10％熱滅活FBS的Grace’s培養(yǎng)液中生長。用感染復(fù)數(shù)(“MOI”)約為2(大約1到3)的重組桿狀病毒V-DR5感染細(xì)胞。6小時后，吸去培養(yǎng)液，換入無甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900II培養(yǎng)基(可以購自Life TechnologiesInc.，Gaithersburg，MD)。如果希望蛋白質(zhì)被放射標(biāo)記，則42小時后，加入5μCi35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(可以從Amersham購買)。再將細(xì)胞培養(yǎng)16小時，然后離心收集。通過SDS-PAGE、隨后作自顯影(如果蛋白質(zhì)被放射標(biāo)記)分析上清液中的蛋白質(zhì)及胞內(nèi)蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^對純化蛋白質(zhì)的氨基端氨基酸序列進行微量測序確定成熟蛋白質(zhì)的氨基端序列，進而確定切割點和分泌信號肽的長度。
實施例4DR5基因表達(dá)的組織分布用上面引用的Sambrook等描述的方法，作Northern印跡來檢驗DR5基因在人組織中的表達(dá)。利用rediprimeTMDNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham Life Science)，按照生產(chǎn)商的說明，用32P標(biāo)記含有DR5蛋白質(zhì)的完整核苷酸序列的cDNA探針。標(biāo)記后，參照生產(chǎn)商的使用說明(編號PT1200-1)，用CHROMA SPIN-100TM柱子(ClontechLaboratories，Inc.)純化探針。然后用純化過的標(biāo)記探針來檢驗人體各組織中的DR5 mRNA。
使用ExpressHybTM雜交溶液(Clontech)，用標(biāo)記過的探針按照生產(chǎn)商的使用說明(PT1190-1)檢驗從Clontech(Palo Alto，CA)獲得的含有不同人組織(H)或人免疫系統(tǒng)組織(IM)的多組織Northern(MTN)印跡。雜交并洗滌后，固定印跡，于-70℃曝光過夜。按照標(biāo)準(zhǔn)步驟沖洗底片。在心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎、胰、脾、胸腺、前列腺、睪丸、子宮、小腸、結(jié)腸、外周血白細(xì)胞(PBL)、淋巴結(jié)、骨髓和胎兒的肝臟中都檢測到了DR5的表達(dá)。
還通過Northern印跡在以下癌癥細(xì)胞系中測試DR5的表達(dá)情況HL60(早幼粒細(xì)胞白血病)、Hela細(xì)胞S3、K562(慢性骨髓性白血病)、MOLT4(成淋巴細(xì)胞白血病)、Raji(伯基特淋巴瘤)、SW480(結(jié)腸直腸腺癌)、A549(肺癌)和G361(黑素瘤)，在所有被測細(xì)胞系中都檢測到了DR5的表達(dá)。
實施例5DR5在哺乳動物細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在哺乳動物細(xì)胞中過表達(dá)Fas/APO-1和TNFR-1可以模擬受體激活過程(M.Muzio等，細(xì)胞85817-827(1996)；M.P.Boldin等，細(xì)胞85803-815(1996))。因此，利用這個系統(tǒng)研究DR5在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的功能。本實施例證明，在MCF7人乳腺癌細(xì)胞和人上皮樣癌(Hela)細(xì)胞中過表達(dá)DR5都能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
實驗設(shè)計細(xì)胞死亡分析基本按照以前的描述(A.M.Chinnaiyan等，細(xì)胞81505-12(1995)；M.P.Boldin等，生物學(xué)化學(xué)雜志2707795-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO145579-5588(1995)；A.M.Chinnaiyan等，生物學(xué)化學(xué)雜志2714961-4965(1996))進行。簡要地說，將載體、DR5、DR5Δ(52-411)或TNFR-1與β-半乳糖苷酶報告構(gòu)建體一起共轉(zhuǎn)染MCF-7人乳腺癌克隆細(xì)胞系和Hela細(xì)胞。
按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染步驟(GIBCO-BRL)轉(zhuǎn)染MCF7和Hela細(xì)胞。采用CaPO4沉淀法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后過24小時，按以前描述的方法(A.M.Chinnaiyan等，細(xì)胞81505-12(1995)；M.P.Boldin等，生物學(xué)化學(xué)雜志2707795-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO145579-5588(1995))將細(xì)胞固定，并用X-Gal染色，顯微鏡檢。圖5中顯示的數(shù)據(jù)(平均值±SD)代表圓形凋亡細(xì)胞百分比作為總β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞的函數(shù)(n＝3)。在MCF7(圖5A)和Hela細(xì)胞(圖5B)中DR5過表達(dá)都誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
還用DR5表達(dá)構(gòu)建體在有z-VAD-fmk(20μl)(Enzyme SystemsProducts，Dublin，CA)的情況下轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，或者與三倍過量的CrmA(M.Tewari等，生物學(xué)化學(xué)雜志2703255-60(1995))或FADD-DN表達(dá)構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染，或用載體單獨轉(zhuǎn)染。圖5C顯示的數(shù)據(jù)表明，caspase抑制劑減弱了DR5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但顯性陰性FADD不能減弱。
正如圖5D所描述的，DR5在體內(nèi)不與FADD或TRADD相結(jié)合。采用磷酸鈣沉淀法，用提到的表達(dá)構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后(在40小時)，制備細(xì)胞裂解液，并用Flag M2抗體親合膠(IBI，Kodak)使它免疫沉淀，用FADD的多克隆抗體或偶聯(lián)了辣根過氧化酶(HRP)的myc抗體通過免疫印跡檢測是否存在FADD或myc標(biāo)記的TRADD(myc-TRADD)(Baker，S.J.等，原癌基因121(1996)；Chinnaiyan，A.M.等，科學(xué)274990(1996))。
如圖5E所描述，F(xiàn)LICE2-DN能阻斷DR5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。用DR5或TNFR-1表達(dá)構(gòu)建體和4倍過量的CrmA、FLICE-DN、FLICE 2-DN或僅用載體，在有β-半乳糖苷酶報告構(gòu)建體存在下共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。25-30小時后，將細(xì)胞染色并檢驗。
結(jié)果過表達(dá)DR5，在MCF7人乳腺癌細(xì)胞(圖5A)和人上皮樣癌(Hela)細(xì)胞(圖5B)中都誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。多數(shù)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示出正在凋亡的細(xì)胞特有的形態(tài)變化(Earnshaw，W.C.，現(xiàn)代生物學(xué)7337(1995))逐漸變圓、凝聚并與培養(yǎng)皿脫離。缺失死亡結(jié)構(gòu)域就消除了殺傷能力。與DR4相同，DR5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也被caspase抑制劑-CrmA和z-VAD-fmk阻斷，但顯性陰性FADD對它沒有影響(圖5C)。與此相符，DR5在體內(nèi)不與FADD和TRADD相互作用(圖5D)。新鑒定的類FLICE分子的顯性陰性形式FLICE2(Vincenz，C.等，生物學(xué)化學(xué)雜志2726578(1997))，能有效地阻斷DR5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而顯性陰性FLICE在它能有效阻斷TNFR-1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的條件下，只有部分效果(圖5E)?？傊@些證據(jù)提示DR5引發(fā)一個細(xì)胞凋亡的程序，其中包括FLICE2和下游caspase的活化，而與FADD無關(guān)。
實施例6DR5的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合細(xì)胞毒性配體-TRAIL并阻斷TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡正如上面討論過，TRAIL/Apo2L是一種細(xì)胞毒性配體，它屬于腫瘤壞死因子(TNF)配體家族，可誘導(dǎo)許多轉(zhuǎn)化細(xì)胞系發(fā)生迅速的細(xì)胞死亡，卻不誘導(dǎo)正常組織，盡管含有死亡結(jié)構(gòu)域的受體DR4在這兩種類型細(xì)胞中都有表達(dá)。本實施例表明本發(fā)明所述受體DR5也結(jié)合TRAIL。
由于DR5和DR4中富含半胱氨酸的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域方面的相似性，發(fā)明人推論DR5也應(yīng)與TRAIL結(jié)合。為了證實這一點，將DR5的可溶性胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人免疫球蛋白(IgG)的Fc部分融合在一起進行表達(dá)。
如圖6A所示，DR5-Fc特異結(jié)合TRAIL，而不結(jié)合相關(guān)的細(xì)胞毒性配體TNFα。在該實驗中，制備了Fc-DR5、DR4、TRID或TNFR1的胞外結(jié)構(gòu)域以及它們的相應(yīng)配體，并如Pan等(科學(xué)276111(1997))所述進行結(jié)合檢測。用蛋白G-Sepharose沉淀各個Fc融合體，并用抗Flag(Babco)或抗myc-HRP(BMB)通過免疫印跡檢測共沉淀的可溶性配體。圖6A底端的一組顯示結(jié)合檢測中Fc-融合體的加入量。
另外，DR5-Fc能阻斷TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力(圖6B)。在有等量的Fc-融合體或只有Fc時，用可溶性TRAIL(200ng/ml)處理MCF7細(xì)胞。6小時后，按照Pan等描述的方法固定細(xì)胞(出處同前)并檢驗。圖6B顯示的數(shù)據(jù)(均值±SD)是凋亡細(xì)胞核在計數(shù)的總細(xì)胞核中的百分比(n＝4)。
最后，在TNFR1-Fc能完全消除TNFα的殺傷能力的條件下，DR5-Fc對凋亡(TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡)沒有影響。在有等量的Fc-融合體或Fc自身時，用TNFα(40ng/ml；Genentech，Inc.)處理MCF7細(xì)胞。11-15小時后，將細(xì)胞核染色并檢驗。
新鑒定出DR5是TRAIL的受體，這進一步增加了TRAIL引發(fā)的信號傳導(dǎo)的生物學(xué)復(fù)雜性。
很顯然，可以用前面說明書和實施例以外的方式實現(xiàn)本發(fā)明。
根據(jù)以上的教導(dǎo)，對本發(fā)明的許多改進和變化仍在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
此處所有專利、專利申請和出版物全文引作參考文獻(xiàn)。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名Ni，JianGentz，ReinerYu，Guo-LiangSu，JeffreyRosen，Craig A.(ii)發(fā)明名稱包含死亡結(jié)構(gòu)域的受體5(iii)序列數(shù)12(iv)通訊地址(A)收件人Human Genome Sciences，Inc.
(B)街道9410 Key West Avenue(C)城市Rockyille(D)州MD(E)國家US(F)郵政編碼20850(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC可兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)目前的申請資料(A)申請?zhí)朥S(B)申請日(C)分類號(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 60/054,021(B)申請日29-JUL-1997(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 60/040,846(B)申請日17-MAR-1997(vii)代理人/代理資料(A)姓名Hoover，Kenley(B)登記號40,302(C)資料/文檔號PF366(ix)通訊資料(A)電話3013098504(B)傳真3013098439(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度1600個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞sig-peptide(信號肽)(B)位置130...283(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置130...1362(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat-peptide(成熟肽)(B)位置284...1362(xi)序列描述SEQ ID NO1CACGCGTCCG CGGGCGCGGC CGGAGAACCC CGCAATCTTT GCGCCCACAA AATACACCGA 60CGATGCCCGA TCTACTTTAA GGGCTGAAAC CCACGGGCCT GAGAGACTAT AAGAGCGTTC 120CCTACCGCC ATG GAA CAA CGG GGA CAG AAC GCC CCG GCC GCT TCG GGG 168Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly-51 -50 -45 -40GCC CGG AAA AGG CAC GGC CCA GGA CCC AGG GAG GCG CGG GGA GCC AGG216Ala Arg Lys Arg 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Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn210 215 220Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala225 230 235Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp240 245 250Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val255 260 265Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp270 275 280 285Asn Glu Ile Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr290 295 300Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala305 310 315Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu320 325 330Ala Lys Gln Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met335 340 345Tyr Leu Glu Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser350 355 360(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度455個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu1 5 10 15Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro20 25 30His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly 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GNGTTTGGGG ATGTNCATTG TGTTTGACAG 300CACTTTTTTN ATCCCTAATG TNAAATGCNT NATTTGATTG TGANTTGGGG GTNAACATTG 360GTNAAGGNTN CCCNTNTGAC ACAGTAGNTG GTNCCCGACT TANAATNGNN GAANANGATG 420NATNANGAAC CTTTTTTTGG GTGGGGGGGT NNCGGGGCAG TNNAANGNNG NCTCCCCAGG 480TTTGGNGTNG CAATNGNGGA ANNNTGG 507(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度226個堿基對(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7TTTTTTTTGT AGATGGATCT TACAATGTAG CCCAAATAAA TAAATAAAGC ATTTACATTA 60GGATAAAAAA GTGCTGTGAA AACAATGACA TCCCAAACCA AATCTCAAAG TACGCACAAA 120CGGAATGATC CAGACATTTC CATAGGTCCT TATTATCACA TTCAGCTTAT AAAATAATGC 180CAAGTGCAGT GAAAAGTTAC AGGATGTTCC ATCCACTGGG TGGATT226(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO8CGCCCATGGA GTCTGCTCTG ATCAC 25(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO9CGCAAGCTTT TAGCCTGATT CTTTGTGGAC 30(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO10CGCGGATCCG CCATCATGGA ACAACGGGGA CAGAAC36(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11CGCGGTACCT TAGGACATGG CAGAGTC 27(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO12CGCGGTACCT TAGCCTGATT CTTTGTGGAC 30
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，它包含具有與選自以下的序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼包含SEQ ID NO2中大約-51到360位氨基酸的多肽的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQ ID NO2中大約-50到360位氨基酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼包含SEQ ID NO2中大約1到360位氨基酸的多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有ATCC No.97920中所含cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)編碼具有ATCC No.97920中所含cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的成熟DR5多肽的核苷酸序列；(f)編碼DR5胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(g)編碼DR5跨膜結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(h)編碼DR5胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(i)編碼DR5死亡結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；和(j)與上述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)中的任何核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO1中的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有編碼具SEQ IDNO2中氨基酸序列的DR5多肽的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO1中的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO2中的氨基酸序列的成熟DR5多肽。
5.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有ATCC NO.97920中包含的cDNA克隆的完整核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有編碼DR5多肽的核苷酸序列，該DR5多肽具有ATCC NO.97920包含的cDNA克隆所編碼的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有編碼成熟DR5的核苷酸序列，該成熟DR5多肽具有ATCC NO.97920所含cDNA克隆所編碼的氨基酸序列。
8.一種分離的核酸分子，它包含一段多核苷酸序列，該多核苷酸序列與具有和權(quán)利要求1中(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下可雜交，其中所述發(fā)生雜交的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下不與具有僅由腺嘌呤核苷酸或者胸腺嘧啶核苷酸組成的核苷酸序列的多核苷酸雜交。
9.一種分離的核酸分子，它包含編碼DR5多肽中帶有表位之部分的氨基酸序列的多核苷酸，該DR5多肽具有權(quán)利要求1中(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9的分離的核酸分子，它編碼DR5多肽中攜表位之部分，所述部分選自包含SEQ ID NO2中大約11到59位氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO2中大約68到113位氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO2中大約173到220位氨基酸殘基的多肽；和包含SEQ ID NO2中大約224到319位氨基酸殘基的多肽。
11.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，該核酸分子編碼DR5胞外結(jié)構(gòu)域。
12.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，該核酸分子編碼DR5跨膜結(jié)構(gòu)域。
13.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，該核酸分子編碼DR5胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。
14.一種重組載體的制備方法，包括將權(quán)利要求1的分離的核酸分子插入載體。
15.由權(quán)利要求14所述方法制備的重組載體。
16.重組宿主細(xì)胞的制備方法，包括將權(quán)利要求1的分離的核酸分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)。
17.由權(quán)利要求16所述方法制備的重組宿主細(xì)胞。
18制備DR5多肽的重組方法，包括在能使所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求17的重組宿主細(xì)胞，并純化該多肽。
19.一種分離的DR5多肽，它包含與選自下面的序列至少95％相同的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2中氨基酸大約-51到360位；(b)SEQ ID NO2中氨基酸大約-50到360位；(c)SEQ ID NO2中氨基酸大約1到360位；(d)具有ATCC NO.97920所含cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的DR5多肽的氨基酸序列；(e)具有ATCC No.97920所含cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的成熟DR5多肽的氨基酸序列；(f)DR5胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(g)DR5跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(h)DR5胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(i)DR5死亡結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中任何一個多肽的帶有表位之部分的氨基酸序列。
20.一種分離的多肽，該多肽包含DR5蛋白質(zhì)的攜表位之部分，其中所述部分選自包含SEQ ID NO2中氨基酸殘基大約11到59位的多肽；包含SEQ ID NO2中氨基酸殘基大約68到113位的多肽；包含SEQ ID NO2中氨基酸殘基大約173到220位的多肽；包含SEQID NO2中氨基酸殘基大約224到319的多肽。
21.一種可與權(quán)利要求19所述DR5多肽特異性結(jié)合的分離的抗體。
22.一種分離的核酸分子，該核酸分子包含一段多核苷酸，該多核苷酸具有的一段序列與選自以下的序列至少95％相同(a)克隆HAPBU13R的核苷酸序列(SEQ ID NO6)(b)克隆HSBBU76R的核苷酸序列(SEQ ID NO7)(c)圖1所示序列(SEQ ID NO1)的一部分的核苷酸序列，該部分包含核苷酸284到1362中的至少50個連續(xù)核苷酸；和(d)與上述(a)、(b)或(c)中的任何一個核苷酸序列互補的核苷酸序列。
23.一種分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼DR5多肽的多核苷酸，其中所述多肽除了有至少一個保守氨基酸取代外，基本上具有選自以下的序列(a)編碼包含SEQ ID NO2中大約-51到360位氨基酸的多肽的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQ ID NO2中大約-50到360位氨基酸的多肽的核苷酸序列；(c)編碼包含SEQ ID NO2中大約1到360位氨基酸的多肽的核苷酸序列；(d)編碼具有ATCC NO.97920中所含cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)編碼具有ATCC NO.97920中所含cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的成熟DR5多肽的核苷酸序列；(f)編碼DR5胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(g)編碼DR5跨膜結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(h)編碼DR5胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；(i)編碼DR5受體的胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域并且全部或部分跨膜結(jié)構(gòu)域被缺失的核苷酸序列；(j)編碼DR5死亡結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；和(k)與上述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中任何核苷酸序列互補的核苷酸序列。
24.一種分離的DR5多肽，所述多肽除了含有至少一個保守性氨基酸取代外，基本上具有選自以下的序列(a)SEQ ID NO2中氨基酸大約-51到360位；(b)SEQ ID NO2中氨基酸大約-50到360位；(c)SEQ ID NO2中氨基酸大約1到360位；(d)具有ATCC NO.97920中所含cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的DR5多肽的氨基酸序列；(e)具有ATCC NO.97920中所含cDNA克隆所編碼的氨基酸序列的成熟DR5多肽的氨基酸序列；(f)DR5受體胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(g)DR5受體跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(h)DR5受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(i)DR5受體胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域并且全部或部分跨膜結(jié)構(gòu)域被缺失的氨基酸序列；(j)DR5受體死亡結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；和(k)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中任何一個多肽的攜表位之部分的氨基酸序列。
25.包含權(quán)利要求19所述多肽和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
26.包含權(quán)利要求21所述抗體和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
27.包含權(quán)利要求24所述多肽和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
28.包含權(quán)利要求19所述多肽與一種異源多肽融合在一起的融合蛋白質(zhì)。
29.權(quán)利要求8的分離的核酸，其中所述核酸編碼能被DR5多肽的抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)，該DR5多肽具有SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
30.重組載體的制備方法，包括將權(quán)利要求8的分離的核酸分子插入載體中。
31.由權(quán)利要求30所述方法制備的重組載體。
32.重組宿主細(xì)胞的制備方法，包括將權(quán)利要求8的分離的核酸分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。
33.由權(quán)利要求32所述方法制備的重組宿主細(xì)胞。
34.制備多肽的重組方法，包括在能使所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求33所述重組宿主細(xì)胞，和回收所述多肽。
全文摘要
本申請涉及新的包含死亡結(jié)構(gòu)域的受體－5(DR5)蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)是腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的成員,并表現(xiàn)為能結(jié)合TRAIL。具體說,提供了編碼人DR5蛋白質(zhì)的分離的核酸分子。還提供了DR5多肽以及用于制備這種多肽的載體、宿主細(xì)胞和重組方法。本發(fā)明還涉及鑒定DR5活性激動劑和拮抗劑的篩選方法。
文檔編號A61P25/28GK1275162SQ98804537
公開日2000年11月29日 申請日期1998年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月17日
發(fā)明者倪健, R·L·根茲, 余國良, J·Y·蘇, C·A·羅森 申請人:人類基因組科學(xué)公司