專利名稱：通過膈下內吸收途徑使用的抗螺桿菌疫苗組合物,以及粘膜/非腸道聯(lián)用免疫方法
技術領域：
本發(fā)明的目的是使用疫苗制備物在哺乳動物中特效誘導針對感染粘膜的病原有機體保護性免疫反應，具體地說是螺桿菌屬(Helicobacter)細菌。
螺桿菌是細菌的一個屬，其特征為革蘭氏染色陰性的螺旋狀細菌。其中幾個種位于哺乳動物的胃腸道。其中尤其值得一提的是幽門螺桿菌(H.pylori)，H.heilmanii，H.filis和鼬鼠螺桿菌(H.mustelae)。H.pylori是最經常與人類的感染相關的，但在一些罕見的病例中也可能分離到H.heilmanii和H.felis。螺桿菌類型的一種細菌，Gastrospirillumhominis在人類中也有報道。
螺桿菌對成年人口的感染率在發(fā)達國家為50％，而在發(fā)展中國家接近100％。這表明其為全世界范圍的主要感染源。
目前為止，在人類中僅在腹部的粘膜表面，特別是在十二指腸潰瘍和胃部的火山型傷口附近，發(fā)現(xiàn)H.pylori。這種細菌被認為是竇胃炎(antral gastritis)的原初致病因子并且是發(fā)展的潰瘍所需的輔助因子之一。并且，胃癌的發(fā)生可能和H.pylori的作用相關。
因此發(fā)展防止或治療螺桿菌感染的疫苗是非常合乎需要的。
目前，幾種螺桿菌的蛋白已被提出做為疫苗抗原的候選。并且通常建議使用的接種疫苗的方法包括將抗原送達胃粘膜水平，即免疫應答發(fā)生的預期位點，為了達到這些目的，選擇了口腔(oral)的方式。
同樣為了這一目的，即在胃部水平上引導免疫應答，最近提出將抗原送達胃粘膜以外的粘膜，如鼻腔或直腸粘膜，的粘膜位點，例子見(WO 96/31235)。淋巴細胞被所謂的誘導粘膜區(qū)的抗原激活后能選擇性地遷移和循環(huán)以到達所謂的效應粘膜區(qū)產生免疫應答。
這些方法的變例包括在通過鼻腔途徑施用抗原之前通過內吸收途徑進行第一次免疫。
對于通過粘膜途徑施用的抗原(經常為細菌裂解物或純化的蛋白)常常和適當?shù)淖魟┤缁魜y毒素(CT)或來自E.coli的熱不穩(wěn)定毒素(LT)聯(lián)用。
當使用粘膜途徑時，觀察到的體液與應答的類型主要為IgA型。這事實表明發(fā)生了區(qū)域免疫應答。
一些作者很早就考慮過，在保護性效果和強IgA型應答之間有很好的相關性(Czinn et.al.Vacinne(1993)11637)。其他人給出了更保守的意見(Bogstedt et.al.，Clin.Exp.Immunol.(1996)105202)。盡管目前為止這一問題還沒有真正的定論，對于大多數(shù)作者而言誘導特定的IgA型抗體似乎是合乎需要的。
通常而言，IgA的產生意味著II型T輔助淋巴細胞產生應答(Th2應答)。
事實上，一種特定抗原對T輔助淋巴細胞的激活可能得到不同亞群的T輔助細胞，這些亞群的特征是不同的細胞因子合成類型。
具體而言，Th1細胞選擇性地產生白介素-2(IL-2)和干擾素-γ(TFN-γ)，而Th2細胞優(yōu)先分泌IL-4，IL-5和IL-10。由于它們在產生細胞因子上的分化，這兩種類型的T輔助細胞扮演兩種不同的角色Th1細胞促進細胞介導的免疫，如炎癥類型的應答；而Th2細胞促進IgA，IgE和一些IgG亞型類型的應答。已知由小鼠Th1細胞產生的細胞因子能促進抗體應答，具體地說，IFN-γ誘導IgG2a應答。這樣，根據先前技術中的各種研究來看，特征為IgA的出現(xiàn)的Th2應答對于保護效應如果不是充分的也是必要的。
讓人驚奇的是，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)Th2應答縱然是無害的，還必需誘導高效的Th1應答。事實上，現(xiàn)在實驗結果表明Th1應答比Th2應答更易于與保護效應相關。
與最初的探索相反(D’Elios et al.，J.Immunol.(1997)158962)，本申請揭示在免疫時間內誘導炎癥型的Th1應答的重要性，沒有它則不能觀察到保護效應。
因此，本發(fā)明的目的是(i)衍生于感染哺乳動物的胃十二指腸粘膜的微生物，如從螺桿菌的免疫原性物質在生產用于誘導抗上述微生物，如螺桿菌的Th1-型免疫應答的藥用組合物中的應用，這種組合物用以治療或防止哺乳動物中的感染，如螺桿菌感染；(ii)一種方法，該方法用于治療或防止由有能力感染哺乳動物胃十二指腸粘膜的微生物促進的感染，如螺桿菌的感染。根據這種方法對哺乳動物一次或多次施用來源于上述微生物，如來源于螺桿菌的免疫原性物質，從而誘導抗，例如，螺桿菌的免疫應答。
通過比較，例如，在鼠中誘導出的抗螺桿菌的IgG2a和IgG1的水平(分別為Th1應答和Th2應答發(fā)生的指示)可估計Th1應答相對Th2應答的水平，從而可為本發(fā)明的目的示明有效的Th1應答的誘導。事實上，所探索的Th1應答通常伴隨著Th2應答。但是，通常認為相對于Th1應答而言Th2應答不會明顯占主要地位。假如檢測IgG2a和IgG1兩種亞型的手段具有相同的敏感性，具體而言，抗IgG2a和抗IgG1抗體具有相同的敏感性，在小鼠中誘導IgG2a和IgG1的水平可傳統(tǒng)地使用ELISA檢測。
具體用于測試IgG2a和IgG1的量的方法與以下描述的相同或相似。聚碳酸酯的ELISA板的孔用100μl螺桿菌，如H.pylori，的細菌抽提物(約10μg/ml，溶于碳酸緩沖液)包被。ELISA板在37℃溫育2hrs然后4℃過夜。用含0.05％ Tween 20的緩沖液(PBS/Tween緩沖液)洗板。每孔用250μl含1％牛血清白蛋白的PBS飽和，以防止抗體的非特異性吸附。在37℃溫育1hrs后，用PBS/Tween緩沖液洗板。在小鼠施用誘導抗螺桿菌Th1型免疫應答的組分后數(shù)天從小鼠采集血清，用PBS/Tween緩沖液稀釋成濃度序列。每孔加入100μl稀釋液。板在37℃保溫90分鐘，洗板，然后按照標準程序測量。例如，用氧化物酶標記的羊抗鼠IgG2a或IgG1抗體。加入此抗體后在37℃繼續(xù)溫育90分鐘。洗板后加入適當?shù)牡孜锓磻?，如標記酶為過氧化物酶時底物為O-雙鹽酸苯二胺(O-phenyl-diamine dihydrochloride)。反應通過測定分光光度法吸收的比色法測量?？寡宓腎gG2a滴定度或IgG1滴定度相當于在490nm的光吸收為1.5時的樣品的稀釋倍數(shù)。
為本發(fā)明的目的誘導有效Th1應答的標志為小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比大于1/100，1/50或1/20，最好是大于1/10，優(yōu)選地大于1/3，最優(yōu)選地大于1/2，5或10。當該比率為1左右時，Th1/Th2應答被認為是混合的或平衡的。當該比率等于或大于5，Th1應答被認為是占優(yōu)勢的。
在小鼠中產生Th1(或Th2)應答是對在人中產生Th1(或Th2)應答的預測。盡管在小鼠中測量應答類型會更容易一些，在人中也是可以做到的。這可以通過一方面測量Th1應答特異的細胞因子的水平，另一方面測量對隨后誘導的Th2應答特異的細胞因子的水平。Th1應答和Th2應答相對彼此的水平可以在對兩種應答特異的細胞因子水平的基礎上(見上文)比如，在IFN-γ/IL-4比率的基礎上直接測量。
作為替代，如果使用了上文描述的測試方法，可以預計反應IgG2a的量ELISA滴定度應大于或等于10,000，優(yōu)選地等于或大于100,000，特別優(yōu)選地，應等于或大于1,000,000；這意味著Th1應答很明顯。
藥用組合物或該方法所針對的哺乳動物最好是靈長類，優(yōu)選地為人類。
通過調整一系因素，如，施用的途徑，可以誘導抗螺桿菌的Th1應答。事實表明，使用內吸收途徑或非腸道途徑可以得到與使用粘膜途徑時相似的或更強的保護作用。
相應地，本發(fā)明的目的具體地為(i)衍生于螺桿菌的免疫原性物質在藥用組合物制備中的應用，該藥用組合物用于在哺乳動物，尤其是靈長類動物，中的膈下的一部分通過內吸收途徑或非腸道途徑施用該藥用組合物，從而治療或防止螺桿菌感染。
(ii)用于在哺乳動物中防止或治療螺桿菌感染的一種方法，根據該方法，在上述哺乳動物中通過內吸收途徑或非腸道途徑一次或多次施用至少一種免疫原性物質。
與該方法相關，為了誘導所需的免疫應答，免疫原性物質通過內吸收途徑或非腸道途徑的施用最好重復一次或幾次，優(yōu)選地，至少兩次與該方法相關，得到保護效果的一種優(yōu)選方法具體而言是這樣的，根據它免疫原性物質是完全通過內吸收途徑或非腸道途徑(嚴格內吸收途徑)施用的?！耙环N免疫原性物質的施用是通過嚴格內吸收途徑進行的方法”是這樣定義的一種不使用內吸收途徑以外的施用途徑的方法。比如，通過內吸收途徑和粘膜途徑施用免疫原性物質的方法就與以上給出的定義不符合。換言之，“一種免疫原性物質的施用是通過嚴格內吸收途徑進行的方法”應理解為該方法的免疫原性物質的施用只通過內吸收途徑，并排除使用任何其它途徑，尤其是粘膜途徑。
依然與該方法相關，通過內吸收途徑或非腸道途徑施用有利地是在哺乳動物的膈膜以下的部分進行的。
源自螺桿菌的免疫源性制劑最好選自滅活的螺桿菌細菌，螺桿菌的細胞裂解物或純化后的源自螺桿菌的肽或多肽制備物。免疫原性物質也可以是多聚核苷酸分子，尤其是一個編碼源自螺桿菌的肽或多肽，并且該DNA被置于對它在哺乳動物細胞中表達所必須的元件的控制之中；或者替代地，另一包括編碼源自螺桿菌的肽或多肽的病毒疫苗載體，并且該載體處于對它在哺乳動物細胞細胞中表所必須的元件的控制之中。
為了本發(fā)明的目的，可以根據精通本工藝的人士所熟知的傳統(tǒng)方法制備滅活細菌。細胞裂解物的制備也是類似的適合于預防目的或治療目的的滅活細菌或細胞裂解物的劑量可由精通本工藝的人士確定并且依賴于幾個因素，如疫苗的具體對象，如具體對象的年齡，抗原自身特性，施用的途徑與方式，是否使用佐劑以及佐劑的類型等等，這些影響因素可由精通本工藝的人士確定。通常而言，適當?shù)膭┝繛榧s50μg至約1mg裂解物。
源自螺桿菌的肽或多肽可純化自螺桿菌或者通過遺傳工程的方法得到或者替代地通過化學合成的方法得到。對于肽而言后一過程是有利的。“肽”是少于50個氨基酸左右的任何氨基酸鏈。更大時使用術語“多肽”，“多肽”與術語“蛋白質”可以互換使用。對本發(fā)明的目的有用的肽或多肽可與天然狀態(tài)中存在的相同或相似。它的相似性在于它能誘導同一類型的免疫應答，但它包括某些結構變化，比如，突變，加入脂性質的殘基或者，作為替代，它可以是一融合形式的多肽或肽。
對預防目的或治療目的合適的肽或多肽的劑量可由精通本工藝的人士確定并且依賴于一些因素，如疫苗的施用具體對象，如具體對象的年齡，抗原本身的特征，施用的方式和途徑，使用或不使用佐劑以及佐劑的類型，這些因素可由精通本工藝的人士確定。通常而言，合適的劑量為10μg至1mg，優(yōu)選地為100μg。
DNA分子最好為不能復制并且基本上不能整合到哺乳動物基因組中的質粒。上述的編碼序列被置于使其能在哺乳動物細胞中表達的啟動子的控制之中。這種啟動子可以是普適性的或者是對一種組織特異的。在普適性病毒中值得一提的巨細胞病毒早期啟動子(在US.Patent.no.4,168,068中有描述)和勞氏肉瘤病毒啟動子(Norton和Coftin在Molec.Cell.Biol.(1985)5281中有描述)。橋粒蛋白啟動子(Liet al.Gene(1989)78244443；Li & Paulin，J.Biol.Chem.(1993)26810403)是一種選擇性啟動子，可在肌細胞中和皮膚細胞中表達。對肌肉細胞特異的啟動子可為，如，肌球蛋白基因或肌營養(yǎng)不良蛋白基因的啟動子。可用于本發(fā)明目的的質粒載體在WO 94/21797和Hartikka et.alHuman Gene Therapy(1996)71205中有所描述。
用于本發(fā)明的目的的一種有用的藥用組合物，核苷酸分子，比如，DNA分子，可以按配方或其它方法配制。配方的選擇可以有很大的變化。上述DNA可以簡單地用帶載體或不帶載體的生理上可接受的溶液稀釋。當使用后者時，上述溶液可以是等滲的或為高滲的，并可具有低離子強度，比如，這些條件可由蔗糖溶液，如20％的蔗糖溶液來滿足。
作為替代，多聚核苷酸可以和促進進入細胞的試劑聯(lián)用。這可以是(i)改變細胞通透性的化學試劑如bupivacaine(見WO 94/16737)，或(ii)與多聚核苷酸結合并作為載體促進多聚核苷酸的運輸?shù)脑噭┤缍嗑圪嚢彼峄蚨喟?，如精胺的衍生物如亞精?見WO 93/18759)。也可以是融合肽，如GALA或短桿菌肽S(見WO 93/19768)或者替代地，源自病毒融合蛋白的肽。
這也可以是陰離子脂類或陽離子脂類。很長時間以來就已知陰離子脂類或中性脂類可以用作運輸物質，比如，以脂質體的形式，運送大量復合物，包括多聚核苷酸。對這些脂質體，它們的成分以及制備它們的過程可以在，如LiposomesA Practical Approach，RPS NEWEd.IRL Press(1990)這本書中找到。
陽離子脂類也已知可用于并被廣泛用于多聚核苷酸的運送。值得一提的例子是LipofectinTM，也名為DOTMA(氯化N-〔1-(2，3-雙油氧基)-丙基〕-N，N，N-三甲基氨，N-〔1-(2，3-dioleyloxy)propyl〕-N，N，N-trimethylammonium chloride)，DOTAP(1，2-雙(油氧基)-3-(三甲基-銨)丙烷，1，2-bis(oleyloxy)-3-(trimethyl-ammonio propane)，DDAB(溴化二甲基雙十八烷基銨，dimethyldioctadecylammonium bromide)，DOGS(雙十八烷基氨基甘氨?；罚琩ioctadecylamidoglycyl spermine)，和膽固醇衍生物，如DC-膽(3-β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨甲?；?膽甾醇(DC-chol(3-beta-(N-(N′，N′-dimethylaminoethane)carbamoyl)cholesterol)。對這些脂類的描述可見EP187，703，WO90/11092，U.S.Patent No.5,527,928。陽離子脂類優(yōu)選地和中性脂類如DOPE(雙油酰磷脂乙醇胺，dioleyphosphatidylethanolamine)，如，WO 90/11092中所描述。
金微?；蜴u鋼微粒也可作為運送劑，如WO 91/359，WO 93/17706中所描述和如Tang.，et，al.，Nature(1992)356152中所描述。這些具體的例子中，多聚核苷酸在氯化鈣和精胺存在的情況下被沉淀到微粒上。然后使用無針設備通過高速氣流打入皮膚中或表皮中，如U.S.Patent Nos.4,945,050和5,015,580以及WO 94/24243中所描述。
使用于接種一具體對象的DNA的量依賴于一些因素，如，用于表達抗原的啟動子的強度，表達產物的免疫原性，作為施用對象的哺乳動物的狀態(tài)(如體重，年齡，和大體的健康狀況)，施用的方式，配方的類型等。具體情況表明通過肌肉內途徑施用比通過使用無針設備以及內途徑需要更大量的DNA。通常而言，在人類成人中用于預防目的或治療目的的合適劑量為從約1μg到5mg，優(yōu)選地從約10μg到約1mg，更優(yōu)選地為從25μg到約500μg。
上述的免疫原性物質中包括病毒載體。具體而言腺病毒和原病毒也包括在源自病毒的載體中，US.Paten No.4,920,209描述了一種源自腺病毒的載體的例子以及一種構建能用表達編碼對本發(fā)明的目的有用的肽或多肽的DNA分子的載體的方法?？捎糜谙嗨朴猛镜脑《緸椋?，牛痘病毒以及黃雀菌素原病毒(canarypox virus)。它們分別在U.S.Patenets Nos.4,722,848和5,364,773中有所描述(也見，如，Tartaglia et.al.Virology(1992)188217和Taylor et，al.Vaccine(1995)13539)。能表達對本發(fā)明的目的有用的肽或多肽的原病毒可通過同源重組得到，如Kieny et.al.Nature(1984)312163中所描述，這樣使編碼肽或多肽的片段被置于適于其在哺乳動物中表達的條件下。也可用細菌載體如膽汁的Calmette-Guerin桿菌。
通常而言，用于預防或治療目的病毒載體的劑量為約1×104至約1×1011，有利地從約1×107至約10×1010，優(yōu)選地從約1×107至約1×109噬斑形成單位每千克。
源自螺桿菌的免疫原性物質可以是任何源自螺桿菌如H.pylori的多肽。具體而言，這可以是位于胞質中的多肽，內膜或外膜的多肽，或分泌到外部基質的多肽。多種源自螺桿菌的多肽在文獻中已有描述，或者是關于從克隆的或鑒定的基因中推測出的氨基酸序列，或者是關于從天然環(huán)境中分離的純化步驟。作為指南，以下文獻尤其值得一提WO94/26901和96/34624(HspA)，WO 94/09023(cagA)，WO 96/38475(HpaA)，WO 93/181150(細胞毒素)，WO 95/27506和Hazell et al.，J.Gen.Microbiol.(1991)13757(過氧化氫酶)，F(xiàn)R 2724936(人乳鐵蛋白的膜受體)，WO 96/41880(AlpA)，EP752473(FibA)和O′Toole et al.，J.Bact.(1991)173505(TsaA)。其它多肽在WO 96/40893，WO 96/33274，WO 96/25430和WO 96/33220中也有描述。在能促進抗螺桿菌的免疫應答上，對本發(fā)明的目的有用的多肽和這里作為參考文獻引用的之一相同或相似。為了滿足最后的條件，免疫原性物質也可以是源自作為參考文獻引用的多肽的一段肽段。
最好使用螺桿菌脲酶的UreA或UreB亞基中的一個多肽(WO90/4030)。優(yōu)選地，兩者都被使用，可以是以結合成脫輔基脲酶的形式或者替代地以多聚體形式(見WO 96/33732)。
類似地，用于本發(fā)明目的的疫苗載體或DNA分子包括能編碼以上描述的任何多肽或肽的序列。
DNA分子，優(yōu)選地病毒疫苗載體，也可以在適于在哺乳動物細胞中表達的元件的控制下包括編碼細胞因子如淋巴因子，例如白介素-2或白介素-12的一段序列。作為這種選擇的一種替代方式也包括在包含-DNA分子或載體的對本發(fā)明的目的有用的藥用組合物中加入另一分子，或加入編碼細胞因子的載體。
對本發(fā)明的目的有用的藥用組合物可包含單一的免疫原性物質或幾種免疫原性物質。比如，一種有利的組分可包括UreA和UreB，(比如，以脫輔基酶的形式)，并同時包括選自以上提及的一種或多種其它多肽。類似地，當涉及一種DNA分子或一種疫苗載體時，上述組分可包含幾種，每種編碼一特定的多肽，或者包含編碼幾種肽或多肽的單一的DNA分子或疫苗載體。
并且，對本發(fā)明的目的有用的藥用組合物可以含有免疫原性物質自身以外的復合物，這些復合物的性質在一定程度上決定于免疫原性物質，滅活細菌，細胞裂解物，肽，或多肽，DNA分子或疫苗載體的性質。這樣，如上所述，當涉及DNA分子時，藥用組合物也可包括各種配伍物質。通過內吸收途徑或非腸道途徑施用時，藥用組合物還可包括恰當?shù)淖魟?，例如，鋁化合物，如氫氧化鋁，磷酸鋁，羥基磷酸鋁。通常，失活的細菌不需要佐劑。對DNA分子也是這樣的。另一方面，當免疫原性物質是細菌裂解物或純化的肽或多肽時，佐劑的存在是優(yōu)選的。最后，當免疫原性物質為疫苗載體時，最好避免使用佐劑以使針對載體本身的免疫應答保持最小。
除了鋁化合物以外，在本工藝中還存在大量適用于通過內吸收途徑或非腸道途徑施用的佐劑，精通本工藝的人士可以從中選擇最適于他們需要的佐劑，特別是可以促進Th1應答或Th1+Th2型平衡應答的復合物。作為指南，尤其值得一提的是脂質體，ISCOMS，微球，蛋白chochleates，由非離子表面活性劑組成的微團，陽離子兩親性在分散物，油/水乳劑，胞壁酰二肽(MDP)當其衍生物如葡糖基胞壁酰二肽(GMDP)，蘇氨?；?MDP，murametide和胞壁棕櫚酸甘油酯，以及QuilA和其亞組分，以及各種其它化合物如單磷酰-脂A(MPLA)，細胞如E.coli，Salmonella minnesota，Salmonella typhimurium或Shigella flexneri，的胞壁的主要脂多糖；gama-葡淀粉，calcitriol，loxoribine。
對本發(fā)明的目的有用的脂質體可特別從對pH敏感的脂質體中選出，如由混合膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS)以及二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成的脂質體；含有以融合性著稱的陽離子脂類如3-β(N-(N，N′-二甲基氨基乙烷)氨甲酰基)膽固醇(DC-chol)及其類似物(在U.S.Patent No 5,283,185和WO 96/14831中有所描述)，溴化二甲基雙十八烷基銨(DDAB)和EP91645及EP206031中描述的BAY，例如Bay R1005(N-(2-脫氧-2-L-亮氨?；?β-D-吡喃型葡糖基)-N-8-癸基十二烷基胺醋酸酯等的脂質體；以及含有MTP-PE，MDP(muramidyldipeptide)的親脂性衍生物的脂質體。這些脂質體可用作佐劑加入到引用的所有的免疫原性物質中。
對本發(fā)明的目的有用的ESCOMS可具體選自這些復合物QuilA或QS-21結合使用的膽固醇以及，供選地，結合使用如磷脂酰膽堿這樣的磷脂。這些對于配制含脂的抗原是尤為有利的。
對本發(fā)明的目的有用的微球具體地可由如polylactide-co-glycolide(PLAGA)，藻酸鹽，脫乙酰殼多糖，polyphosphazene以及許多其它多聚物形成。
對本發(fā)明的目的有用的protein chochleates可選自具體由膽固醇以及，供選地，磷脂如磷脂酰膽堿形成的。這些對于配制含脂的抗原尤其有利。
對本發(fā)明的目的有用的由非離子表面活性劑組成的微團可具體由1-單-棕櫚?；?甘油，膽固醇，和dicetylphosphate混合物形成，它們是傳統(tǒng)脂質體的替代物并可用于配制所有引用的免疫原性物質。
對本發(fā)明的目的有用的油/水乳劑可具體選自MF59(Biocine-Chiron)，SAF1(Syntex)和montanides ISA51和ISA720(Seppic)。
對本發(fā)明的目的有用的佐劑可以是源自南美洲的樹QuillajaSaponarla Molena的樹皮的一個組分；例如一種通過HPLC色譜純化得到的一個組分，QS-21，如US.Patent No.5,057,540中所描述。由于QS-21可能具有一些毒性，將其與脂質，尤其是基于固醇的脂質體，一起使用也許是有利的，如WO 96/33739中所描述。
最后，佐劑效果也可通過在對本發(fā)明的目的有用的肽或多肽中加入脂類而得到。這樣的肽或多肽通過共價鍵和能促進誘導Th1-型免疫應答的脂或含脂化合物連接以形成含脂的脂肽或多肽綴合物，這可以通過精通本工藝的人士所熟知的幾種方法達到。例如，可以使用EP 431327中描述的化合物如N-棕櫚?；?S-2，3-(二棕櫚?；趸?丙基牛胱氨酰絲氨?；z氨酸)(N-palmitoyl-S-2，3-(bispalmitoyoxyl)propylcysteinylseryl serine(Pam3CSS))，它通過已知的方式與肽或多肽的N-末端結合。
根據本發(fā)明的方法或應用的治療或預防效果可以根據標準方法評定，例如通過測量免疫應答的誘導或測量治療性免疫或保護性免疫的測量。上述測量可以通過，例如，鼠/H.felis模型以及Lee et al.，Eur.J.Gastroenterology & Hepatology(1995)7303或Lee et al.，J.Infect.Dis.(1995)172161中描述的程序進行。精通本工藝的人士將意識到在鼠模型中H.felis可由另一螺桿菌的種替代。比如，源自H.pylori的免疫原性物質的效果最好使用適用于鼠的H.pylori菌株。效果可通過與對照組比較胃部組織的感染程度(通過測量脲酶活性，細菌量或者胃炎的狀況)而確定。與對照組相比感染減輕時則治療效果或保護效果存在。
對本發(fā)明的目的有用的藥用組合物可通過傳統(tǒng)方式制造。具體而言，其可以用可藥用的稀釋液或載體配制，例如用水或鹽溶液。通常而言，可以根據施用的方式與路徑以及根據藥療實踐選用稀釋液或載體。這在此領域的一本標準參考書，Remington’s PharmacenticalSciences，中有描述。
根據本發(fā)明的方法以及對此目的有用的組分可用于治療或預防，i.a.，螺桿菌的感染并從而治療或防止和這些感染相關的胃十二指腸疾病，包括急性，慢性或萎縮性胃炎，以及消化性潰瘍，例如胃或十二指腸潰瘍。
使用的內吸收途徑可以是非腸道途徑，可以選用靜脈內途徑，肌肉內途徑，皮內途徑或表皮內途徑以及皮下途徑；然而后四種途徑比靜脈內途徑更受歡迎。特別建議使用肌肉內途徑和皮下途徑。在所有的情況下，對藥用組合物的使用可在位于一個個體的膈下的施用位點進行。例如腰部背側即為一個適合的施用位點。
為了得到保護效果或治療效果，由施用，例如，通過膈下內吸收途徑，對本發(fā)明的目的有用的藥用組合物組成的施用操作可重復一次或幾次，在每次施用之間保留一定的時間間隔；時間間隔的范圍在一周或一個月。對時間間隔的精確確定是在精通本工藝的人士的能力之內并根據各種因素，如免疫原性物質的特性，具體對象的年齡等等，而變化。在此具體例子中，施用途徑是嚴格內吸收途徑類型。通過非限制性說明的方法，這里將提及一種接種方案，它包括在腰部背側區(qū)域通過皮下途徑三次施用脫輔基脲酶，每次施用之間的間隔為2至4個星期。
根據一替代方式，可以設想以嚴格內吸收施用方式操作，但在構成接種程序的步驟中使用不同的免疫原性物質。通過非限制說明的方法，這里將提及一種嚴格內吸收途徑的接種方案，包括三步第一次施用(激發(fā))包括施用編碼，例如UreAt UreB的POX載體，接著兩次連綿施用(促進)脫輔基脲酶。
因此，通常而言，本發(fā)明的目標為一種用于治療或防止螺桿菌感染的藥用組合物，其包括連續(xù)施用，幾種產品，每種產品被配制成適于在膈下內吸收途徑施用，并且每種產品包含一種源自螺桿菌的免疫原性物質，上述免疫原性物質分別獨立地選自滅活螺桿菌細菌制備物，螺桿菌細胞裂解物，肽純化形式的來自螺桿菌的多肽，包含編碼源自螺桿菌的肽或多肽的序列并置于其表達所必需的元件的控制之下的DNA分子。上述藥用組合物優(yōu)選地這樣提供第一個產品包含肽或多肽，第二個產品包含DNA分子或疫苗載體，DNA分子或疫苗的編碼序列編碼第一產品中包含的肽或多肽。
最后，一種替代的接種程序包括幾種時間上錯開的施用，例如，在一個星期或一個月的時間間隔之內(由精通本工藝的人士決定)，上述程序包括通過膈下內吸收途徑的第一次施用以及通過鼻腔內途徑之外的粘膜途徑的第二次施用，例如通過眼睛，口腔。例如，口腔途徑或胃途徑或肺途徑或腸途徑或直腸途徑或陰道途徑或尿道途徑。通過非限制性說明的方法，這里將提及一種接種程序，它包括通過膈下內吸收途徑施用DNA分子或疫苗載體，然后通過胃途徑施用多肽。上述DNA分子或疫苗載體優(yōu)選地編碼通過胃途徑施用的多肽。
因此，通常而言本發(fā)明的目標為一種用于治療或防止螺桿菌感染的藥用組合物，它包含用于連續(xù)施用的幾種產品，其中一種產品被配制成適于通過膈下內吸收途徑施用，另一種產品被配制成適于通過鼻腔內途徑以外的途徑施用。每一種產品含有一種源自螺桿菌的免疫原性物質，上述免疫原性物質分別獨立地選自滅活螺桿菌細菌制備物，螺桿菌細胞裂解物，肽，純化形式的來自螺桿菌的多肽，包含編碼源自螺桿菌的肽或多肽的序列并置于其表達所必需的元件的控制之下的DNA分子，以及包含編碼源自螺桿菌的肽或多肽的序列并且置于其表達所必需的元件的控制之下的疫苗載體。上述藥用組合物優(yōu)選地這樣提供第一個產品包含肽或多肽，第二個產品包含DNA分子或疫苗載體，DNA分子或疫苗載體的編碼序列編碼第一種產品中的肽或多肽。
用于通過粘膜途徑施用的疫苗載體可以選自以上描述的那些。并且，可以選自細菌載體如Shigella，Salmonella，Vibrio cholerae，Lactobacillus和Streptococcns。
可用作活疫苗載體的Vibrio cholerae的無毒突變株在，例如，Mekalanos et al.Nature(1983)306551和U.S.Patent.No.4,882,278中(突變株中編碼兩個等位基因ctxA的大部分區(qū)域已被缺失，從而不能產生有功能的毒素)，和WO 94/1533(通過缺失得到的缺少有功能的ctxA和attRS1序列的突變)中有所描述。如WO 94/19482中所描述，這些菌株可通過遺傳工程改造表達外源抗原。
遺傳工程改造或其它改造的用于重組表達外源抗原的Salmonellatyphimurium的減毒菌株以及它們作為疫苗的應用在Nakayama et.al.，BioTechnology(1988)6693和WO 92/11361中有所描述。
其它用作疫苗載體的細菌在High et al.EMBO(1992)111991和Sizemore et al.，Science(1995) 270299(Shigella &flexneri)；Medaglini et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)926868(Streptococcus gordonii)；和Flynn J.L.Cell.Mol.Biol.(1994)40(Suppl.I)31，WO 88/6626，WO 90/0594，WO 91/13157，WO 92/1796和WO 92/21376(Calmetre-Guerin bacillus)中有描述。
在細菌載體中，編碼源自螺桿菌的肽或多肽的DNA序列可以被插入到細菌基因組中或替代地保持自由狀態(tài)，由質粒攜帶。顯然，該序列被置于對其在細菌載體中表達所必需的元件的控制之下。
這些用于通過粘膜途徑施用的細菌載體可和合適的佐劑聯(lián)用。這樣的佐劑可選自細菌毒素，例如霍亂毒素(CT)，E.coli的熱不穩(wěn)定毒素(LT)，clostridium difficile毒素，以及百日咳毒素(PT)，或者是源自這些毒素的復合物，亞基，類毒素，突變型。例如，可能使用純化的天然霍亂毒素的B亞基(CTB)。如果這些毒素的片段，同源物，衍生物及融合物保留其佐劑活性的話也同樣適用。優(yōu)選地，選用毒性減小的突變型。這些突變型在，例如WO 95/17211(CT Arg-7-Lys突變)，WO 96/6627(LT Arg-192-Gly突變)，和WO 95/34333(PTArg-9-Lys和Glu-129-Gly突變)中有所描述。其它具有以下突變中至少一種的LT突變型也可使用Ser-63-Lys，Ala-69-Gly，Glu-110-Asp和Glu-112-Asp。
其它化合物，如MPLA，PLGA，DC-chol和QS-21也可在粘膜途徑中用作佐劑。
本發(fā)明還包括治療或防止螺桿菌例如(H.pylori)感染的免疫方法，涉及粘膜(例如口腔，鼻腔內，胃內，肺內，腸內，直腸內，眼，陰道或尿道)施用，接著是非腸道(例如肌肉內，皮下，皮內，粘膜內，靜脈內或腹膜內)施用。在這些方法的一個例子中，先進行粘膜施用以激發(fā)對一種抗原的免疫應答，然后進行非腸道施用以加強對該抗原的免疫應答。這些方法的其它例子包括交替使用非腸道施用與粘膜施用。例如，可以使用以下方式肌肉內施用，胃內加鼻腔內聯(lián)合施用，精通本工藝者很容易確定使用的抗原，配方，佐劑，施用方式，特定的粘膜途徑與非腸道途徑，以及劑量。這些方法中調整這些參數(shù)以適于應用的具體例子上文已給出。
在上文的描述中，提及的基本上是螺桿菌感染以及通過阻止和預防的手段與其作斗爭的方法。上文所聲明的原理和方法在細節(jié)上做必要的修正后能被應用到任何其它感染位置為胃，十二指腸或小腸的微生物的感染上。
并且聲明，所有在本申請中引用或發(fā)表的文件作為參考被結合于其中。
下文參照


本發(fā)明。
圖1與實施例1相關，示明對唾液腺中(Fig1A)和胃中(Fig1B)的局部應答的研究。上述局部應答是通過ELISPOT的方法評估的。上述ELISPOT方法是指通過皮下途徑(SC)在腰下左后部〔a和c〕或頸部〔b和d〕10天(一次)施用脲酶并隨后通過鼻腔內途徑(N)和胃內途徑(IG)在第28天〔a和b〕或在第28天和第56天〔c和d〕促進應答之后測量誘導出的抗脲酶IgA，用斑點數(shù)/106細胞表示(Fig1A)或表現(xiàn)出2IgA斑點/鼠的產生應答的人鼠數(shù)表示(FiglB)。
圖2與實施例1相關，示明接觸致病性感染物后的脲酶活性水平。上述活性是在殺死小鼠4小時后測量的。上述小鼠分別在第0天第28天和第56天已通過胃內途徑〔(a)和(c)〕或腰下佐后側部分皮下途徑(b)接受過三次滅活細菌。在實驗(c)中細菌制備物中還加入10μg霍亂毒素。實驗(d)和(e)分別為陽性與陰性對照。
圖3相應于實施例1，示明接受致病性感染物后的脲酶活性水平。上述脲酶活性是在殺死小鼠4小時后測量的。上述小鼠分別在第0天，第28天和第56天接受了三次(a)包在大約80％ DC-chol中的脲酶制劑，施用于腰部背側的肌肉中；或(b)含有霍亂毒素佐劑的脲酶制劑，通過胃內途徑施用，實驗(c)與(d)分別為陽性與陰性對照。
圖4相應于實施例1，示明接觸致病性感染物后的脲酶活性水平。上述脲酶活性是在殺死小鼠后4小時測量的。上述小鼠分別在第0天，第28天和第56天接受了三次(a)含有霍亂毒素佐劑的脲酶制劑，通過胃內途徑施用或(b)含有QS-21佐劑的脲酶制劑，通過腰下左后側的皮下途徑施用。實驗(c)和(d)分別為陽性與陰性對照。
圖5示明進行實施例2中的免疫程序后猴子血清中誘導出的免疫球蛋白的量，用ELISA滴定度表示。組成了含有4只猴子的一個對照組以及三個測試組，每個測試組含有8只猴子，每個測試組分成為兩個含有4只猴子的分組，一個分組只接受滅活的H.pylori制劑(1，2和3)，另一分組接受滅活的H.pylori制劑和重組的脲酶(1u，2u和3u)。組1和組1u的施用程序為〔鼻腔加胃內，4次〕；組2和組2u的施用程序為〔肌肉內，4次〕；組3和組3u相應于施用程序〔鼻腔加胃內；肌肉內；鼻腔加胃內，肌肉內〕。ELISA滴定度測量三次第0天為第一次(白帶)，第42天第二次(陰影帶)，第78天第三次(黑帶)。
圖6A和6B示明4小時后用Jatrox實驗(Procter & Gamble)測量的脲酶活性(Fig6A)以及感染H.pylori后進行A-H治療的小鼠的細菌載量〔ALT加脲酶，口腔；BQS-21加脲酶，頸部非腸道途徑；CQS-21加脲酶，腰部非腸道途徑；D單獨的QS-21，腰部區(qū)域皮下途徑；EBay R1005加脲酶，頸部非腸道途徑；FBayR1005加脲酶，腰部區(qū)域非腸道途徑；G單獨Bay R1005，腰部區(qū)域皮下途徑(對照)；H鹽，腰部區(qū)域皮下途徑(陽性對照)〕I代表陰性對照。
圖7示明小鼠進行粘膜激發(fā)/非腸道加強方案，使用脲酶免疫誘導對H.pylori致病物感染最有效的保護的結果。小鼠或者口腔25μg脲酶加5μg LT或非腸道途徑施用含或不含100μg礬佐劑的10μg脲酶。如圖所示小鼠先口腔施用脲酶加LT，三個星期后通過非腸道途徑或口腔途徑施用兩次促進劑量。最后一次免疫后兩個星期小鼠接觸H.pylori致病物，并在接觸兩個月后安樂死。尸體剖檢時徑向切下三分之一的胃，勻漿，并培養(yǎng)H.pylori。
圖8示明恒河猴與H.pylori致病物接觸時脲酶免疫的效果。猴子通過非腸道途徑(100μg脲酶加1mg血清或800μg Bay)或通過粘膜引發(fā)(口腔4mg脲酶加100μg LT)非腸道促進(脲酶加血清)方案免疫。上述第二種免疫方法中前三次每三星期一次并在第一次引發(fā)后的第20個星期施用第四次。在最后一次促進施用后猴子，與致病感染物接觸。接觸后十個星期實行安樂死，從每只動物的胃部收集十孔活組織并培養(yǎng)以確定H.pylori菌落情況。以上每個符號代表每只猴子的10只培養(yǎng)的平均CFU。線代表治療組的CFU中間值。
圖9示明與H.pylori致病感染物接觸后免疫與未免疫的恒河猴的胃炎值。
猴子三星期后用4mg脲酶加100μg LT口腔激發(fā)免疫。第一次激發(fā)施用后20個星期進行兩次非腸道施用。猴子在最后一次促進施用后與致病感染物接觸。猴子在接觸后10個星期實行安樂死，在胃體，竇和胃體的竇連接處取2cm2的樣品用10％的緩沖福爾馬林固定，包埋在石蠟中并且用H&E染色。通過對染色部分的顯微檢查給出特征為淋巴細胞，漿細胞和多形核細胞浸潤的胃炎的胃炎值。
圖10示明與H.pylori致病感染物接觸后免疫與非免疫的恒河猴的上皮變化。接觸三個星期后猴子用4mg脲酶加100μg LT口腔激發(fā)免疫。接著每三個星期一次100μg脲酶加1mg血清共兩次。在第一次激發(fā)免疫后的20個星期施用一次脲酶加礬。10個星期后猴子安樂死，從胃體，竇，胃體的竇連接處取2cm2的樣品，用10％的緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋并H & E染色。上皮變化，定義為組織變形，萎縮或/和組織增生，可通過對染色樣品的顯微檢查評定，以上的每個符號代表每只猴的三個區(qū)域的平均胃炎值。實施例1小鼠中的免疫研究1A-材料與方法小鼠6-8星期大的雌鼠由Janvier(法國)提供，在整個實驗中使用無菌材料；鼠籠用“isocaps”保護；小鼠用過濾處理的水與輻射處理的食物喂養(yǎng)。施用程序在每個實驗中，小鼠接受三次相同的產品；每次間隔28天(0，28，56天)。產品的施用是通過鼻腔途徑(對醒著的老鼠多達50μl)，通過口腔途徑(300μl于0.2M NaHCO3中，用胃飼管)，或通過皮下途徑(300μl，頸部皮下或腰部左側的皮下)。在一些情況下，未麻醉小鼠的腰部背側肌肉進行肌內接種(50μl)。通過鼻腔，皮下或肌內途徑施用10μg脲酶，或通過口腔途徑施用40μg。對于滅活的細菌制備物，通過皮下途徑或口腔途徑施用400μg細胞?？乖妥魟┤鏦O 96/31235中的實施例5所描述，H.pylori的脫輔基脲酶可在E.coli中被表達與純化。在本文的其余部分，脫輔基脲酶被簡稱為脲酶。
滅活的H.pylori細菌(WC)制備物是這樣制備的一瓶凍存的細菌ATCC 43579在75cm2的燒瓶(Costar)中用兩相介質稀釋。該介質包含固體成分(10ml Colubia瓊脂(BioMerieux加6％綿羊血)(BioMerieux))和液體成分(3ml TSB，BioMerieux)。燒瓶放在含有微需氧菌(BioMerieux)的袋子(generbag)中，輕緩搖動37℃溫育48小時。然后分析培養(yǎng)物(遷移性，脲酶，過氧化氫酶，氧化酶產物)并3,000rpm 4℃離心20分鐘(或者收集幾個燒瓶后再離心)。沉淀重懸浮于含1％福爾馬林(37％福爾馬林，Sigma)的PBS(BioMerieux)中。調整體積使終濃度達到2mg/ml(離心之前在600nmO.D.為1的1ml相當于377μg蛋白)。該產物4℃輕輕地混合4小時，用PBS洗3次，最終的溶液被濃縮至100μg蛋白/50μl。分裝后的樣品保存于-70℃。
含有脲酶的DC-chol脂質體如下制備。首先，為了得到一層干的含有100mg DC-chol(R-Gene Therapeantics)和100mg DOPC(二油酰磷脂酰膽堿)(Avanti Polar Lipids)的膜薄膜，這些產品以粉狀混合后溶于5ml氯仿中。溶液用旋轉蒸發(fā)儀在真空下?lián)]發(fā)。這樣得到的容器壁上的脂質體至少在高真空度下干燥了4個小時。與此平行20mg凍干的脲酶和100mg蔗糖稀釋于13.33ml的20mM Hepes緩沖液pH7.2中。10ml這樣的溶液(含1.5mg脲酶和0.75％蔗糖)過濾通過0.22μM的Millex濾器然后用于重新水化脂膜。該懸浮液攪拌4小時后擠出(10次通過0.2μM多聚碳酸酯膜)或微流化(microfluidized)(在500kPa的壓力下10次通過Microfluidics CoY10 microfluidizer)。這樣即可得到脂質體懸液。內包的脲酶為10％到60％。將蔗糖濃度調到5％后(每10ml加入425mg蔗糖)將懸液凍干。使用前，凍干粉用一定體積的水或緩沖液溶解后用不連續(xù)蔗糖密度梯度(0，30％，60％)純化，以得到內包的脲酶總脲酶的70％以上的制備物。
在粘膜中用作佐劑的霍亂毒素的量為10μg/劑脲酶或細菌制劑。
用作佐劑的QS-21(Cambridge Bioscience；Aquila)的量為15μg/劑脲酶。攻擊在第二次促進后兩個星期，小鼠通過胃飼管加入300μl適于小鼠的一株H.pylori，菌株ORV 2002，的懸液(1×107活菌懸于200μl PBS；OD550吸收為0.5)。沒有接受抗原而作為對照的一組也同樣被攻擊。對攻擊的分析接觸后四個星期，該鼠被拉斷頸椎而被殺死。胃部被取出以測量脲酶活性與作組織學分析。脲酶活性在4至24小時后(OD550nm)用Jatrox實驗測試(Procter & Gamble)24小時后仍為陰性的小鼠被標明。用ELISPOT測量局部抗體應答(唾液腺與胃)ELISPOT實驗根據Mega et al.J.Immunol.(1992)1482030進行。酶標板用50μg/ml的H.pylori蛋白抽提物包被。
為了檢測胃部的抗體應答水平，我們對方法做如下改進胃的一半用切人組織的自動設備(McIllwain Laboratories，Gilford，UK)切成1mm2的小塊，然后用中性蛋白酶(2mg/ml，Bocehringer Mannheim)消化。上述中性蛋白酶溶于改進的Joklil溶液中(加入了10％馬血清(Gibco)，谷氨酰胺和抗生素)。在37℃輕輕消化4次每次半個小時。這樣消化的細胞在每一步之后用70μm的濾膜(Falcon)過濾，然后用補充了5％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640(Gibco)洗3次，并在覆蓋著硝酸纖維素膜(Millipore)的板上用相同的溶液保溫至少4個小時(100μl每孔，4孔)，大約每半個胃可得到1至3×105個細胞(體積大的細胞及巨噬細胞不算在內)。
生物素標記的IgA和鏈霉親和素-生物素標記的過氧化物酶復合物來自Amersham。斑點在加入底物AEC(Sigma)后顯現(xiàn)出來，并且板一干就在顯微鏡下記數(shù)(16倍或40倍放大)。四個孔中的IgA斑點的平均值可由此計算出并表示為斑點數(shù)/106細胞。ELISA分析應答
ELISA分析根據標準程序進行(生物素標記的偶聯(lián)物及鏈霉親和素-過氧化物酶購自Amersham，OPD(O-phenyl-diaminedihydrochloride)底物來自Sigma)。酶標板用溶于碳酸緩沖液的H.pylori抽提物(5μg/ml)包埋。在每個實驗中使用了抗H.pylori的鼠對照血清。滴定度相應于在490nm的OD值為1.5時的稀釋倍數(shù)之倒數(shù)。1B-結果結果由上文所述的圖1至4以及下文的陳述示明圖1示的使用皮下途徑時，如果施用部位為鼠的后部，即腰后區(qū)域，時，在唾液腺和胃部的區(qū)域應答的結果會提高很多。
在說明圖2至圖4之前，應當注意到，這些圖示明的結果是來自含佐劑的抗原，并且是通過胃內途徑施用的。此實驗被稱為標準參考實驗因為之前工藝中CT/IG聯(lián)用得到的結果是目前最好的。
圖2比較了不帶佐劑的滅活細菌制劑通過胃內途徑施用和通過皮下途徑施用的結果。它清楚地表明，在腰下區(qū)域通過皮下途徑施用時可得到好很多的結果。進而，通過皮下途徑施用后的結果與標準參考實驗相同或略好些，在標準參考實驗中與霍亂毒素佐劑聯(lián)用通過胃內途徑施用。
進而，參照圖2中的實驗(a)到(e)中脲酶活性的結果。上述結果是在殺死小鼠4個小時以后得到。圖2表明，在小鼠死后24個小時脲酶活性仍然為陰性小鼠數(shù)分別為(a)0/8，(b)4/8，(c)4/8，(d)0/8，(e)10/10。這和前段中的結論一致，即實驗(b)的結果與標準參考實驗中得到的結果相似。
圖3表明包入DC-chol脂質體的脲酶制劑并通過腰下區(qū)域皮下途徑施用得到的結果與標準參考實驗一樣好。
進而，參照圖3中的實驗(a)到(d)中脲酶活性的結果。上述結果是在殺死小鼠4小時后得到的。圖3表明在小鼠死后24個小時脲酶活性仍為陰性的小鼠數(shù)分別為(a)5/10，(b)4/10，(c)0/10，(d)10/10。這與前段中的結論是一致的，即實驗(a)得到的結果與標準參考實驗的結果相似。
圖4與QS-21佐劑聯(lián)用的脲酶制劑通過腰下區(qū)域皮下途徑施用得到的結果與標準參考實驗的一樣好。
進而，參照圖4中的實驗(a)到(d)中的脲酶活性的結果。上述結果是在殺死小鼠4小時后得到的，圖4表明在小鼠死后24個小時脲酶活性仍為陰性的小鼠數(shù)分別為(a)1/8，(b)5/8，(c)0/8，(d)10/10。這與前段的結論一致，即實驗(b)得到的結果與標準參考實驗相似。
下表給出了上文的實驗中誘導出的IgA，IgG1和IgG2a的量。上述實驗的結果在圖2到圖4已經以脲酶活性以及死后4到24小時內脲酶活性的OD小于0.1的小鼠數(shù)的形式給出。IgA，IgG1以及IgG2a的量用ELISA滴定度的方式給出。
實施例2猴子中的免疫實驗2A-材料與方法猴子本實驗中使用了28只2歲的猴子(Maeaca fascicularis)(Mauritus)。在進行以下的各種免疫程序之前，活組織檢查表明它們中大部分都長期感染了類似Gastrospirillum hominis(GHLO)或H.heilmanii的微生物。施用程序由于幾乎所有的這些猴子都感染了GHLOs決定測試不同的程序在治療中的效果。總結如下表
特別指出，肌肉內施用途徑是在腰部背側的肌肉中進行的?？乖妥魟┯捎贕POLs與H.pylori之間有交叉反應，選擇單獨使用滅活的H.pylori細菌如實施例1A中所述或根據實施例1A中所參考的文獻制備的重組脲酶聯(lián)用。
E.coli的熱不穩(wěn)定素素(LT)(Sigma)或霍亂毒素的B亞基(CTB)(Pasteur Merieux serums & vaccins)被用作粘膜途徑的佐劑而DC-chol被用作非腸道途徑的佐劑。DC-chol粉末簡單地用抗原制備物重新水化。
使用的劑量如下表
活組織檢查，脲酶測試和細菌學/組織學研究每只猴在免疫前或免疫后(第三次促進施用后一個月)進行活組織檢查。利用活組織檢查進行脲酶測試和組織學研究。
脲酶活性通過Jatrox試劑盒(Procter & Gamble)測定。活性水性如下文進行估計第3級，粉紅色在10分鐘內出現(xiàn)；第2級，粉紅色在加入試劑后10分鐘至30分鐘之間出現(xiàn)；第1級，粉紅色在30分鐘至4個小時間出現(xiàn)；第0級，4小時后無粉紅色或很弱。
組織學研究使用的是福爾馬林固定的活組織樣品。細菌量這樣定量無細菌(0)；少量螺桿菌型的細菌(0.5)；較多細菌(1)；相當多細菌(2)；很多細菌(3)。一級之間的區(qū)別(比如從1到2)相當于多5倍的細菌。用ELISA測試分析應答ELISA測試如實施例1A中所描述。2-B 結果下表是關于免疫前后的細菌量，是用兩種實驗測試的(i)通過測量脲酶活性和(ii)通過實行組織學研究。與此相關的結果在第3欄至第6欄中示出。最后三欄表明各組(對照組，組1，2或3)在免疫前后細菌量變化的情況(→)表示的是根據兩種測試細菌量均不變化的猴子；(↑)和(↓)分別表明在至少一種測試中細菌量減少或增加，而另一種測試顯示細菌量不變。當兩次測試的結果顯示相似的變化時，向上或向下的箭頭為兩個。

因此，本發(fā)明通過嚴格粘膜途徑免疫程序的組的結果和陰性對照組基本相同。另一方面，通過肌內途徑和粘膜內途徑混合程序免疫或者通過嚴格肌肉內途徑免疫的組可觀察到細菌量顯著減少。這強調了免疫條件尤其是免疫次數(shù)；因此，建議使用在膈下區(qū)域應用非腸道途徑的免疫程序，以得到保護性效果。
這些結果應極正確地與圖3中的血清中抗體水平的結果聯(lián)系在一起。該圖表明通過嚴格粘膜途徑的免疫方案得到的結果與陰性對照組(1和1u)的結果非常相似。另一方面，通過混合粘膜與肌肉內途徑(2和2u)的免疫方案以及，更好的，通過嚴格肌肉內途徑的方案(3和3u)使誘導出比對照組強很多的抗體水平成為可能。
這樣，強血清應答可能與保護性效果相關，而相反弱應答與缺乏保護性效果相關。
可能得到既定效果(強血清應答以及保護性效果)的免疫條件包括使用膈下區(qū)域的非腸道途徑或使用Th1佐劑。實施例3治療小鼠的H.pylori感染為了治療小鼠模型中的H.pylori感染，我們比較了通過皮下途徑(SC)和通過粘膜途徑免疫的效果。
OF1小鼠用106個菌落形成單位(cfu)的H.pylori OR2001菌株感染。一個月以后，為了確認感染已經很好地建立了，每100只小鼠隨機殺死10只并測試四分之一個整胃的脲酶活性。由于所有的結果都是陽性的，小鼠被免疫(10只每組)，每次間隔3星期。上述免疫是這樣進行的或者皮下施用10μg佐劑以15μg QS-21(Aquila)或400μgBay R1005佐劑(Bayer)的脲酶；或者用40μg混有1μg LT的脲酶口腔施用。對于兩個用非腸道途徑施用的佐劑或者在頸部施用以到達身體上部的淋巴節(jié)或者在腰部施用，以到達身體下部的淋巴節(jié)。10只小鼠不感染也不免疫，作為陰性對照，而陽性對照的小鼠則在皮下(腰部區(qū)域)接受鹽溶液QS-21，或Bay佐劑。
免疫一個月之后，所有的老鼠都被殺死并取出胃，通過測定脲酶活性(每組10只中的10只都被分析)和定量培養(yǎng)(10只中的5只被分析)而確定細菌定居的程度。圖6A(脲酶測試)和6B(培養(yǎng))示明，在腰部區(qū)域的皮下用脲酶佐以QS-21免疫的小鼠感染基本上已消失(45只中的4只在定量培養(yǎng)實驗中為陰性。與未免疫的小鼠相比，在頸部皮下佐以QS-21免疫的小鼠以及口腔接受脲酶加LT的小鼠的感染減小10到100倍。Bay佐劑誘導出相同的減小，在腰部區(qū)域免疫的小鼠中尤其顯著。
在同樣的這些小鼠中進行的組織病學實驗并未顯示比對照更大面積的胃炎。
在我們先前的預防性研究中觀察到(實施例1)，受保護的小鼠的血清中兩種抗體亞型IgG1和IgG2的水平很高，這代表了Th2/Th1均衡應答。進而，在腰部區(qū)域皮下免疫的小鼠具有最高水平的IgA，這顯示粘膜應答。
這些結果表明，定位的內吸收免疫能治療小鼠的獲得性H.pylori感染，并且使用佐劑誘導Th1/Th2均衡的粘膜應答對于達到該目標是有利的。實施例4引起小鼠的抗H.pylori感染的脲酶免疫中的粘膜激發(fā)/非腸道加強策略用粘膜激發(fā)/非腸道加強策略體免疫Swiss Wabster小鼠?？谇皇┯脝我粍┝康?5μg重組H.pylori脲酶(脲酶)和5μg Escherichia coli熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)作為激發(fā)。三個星期以后小鼠通過非腸道途徑施用兩劑100μg脲酶加100μg明礬加強。劑與劑之間間隔3個星期。與未免疫的對照相比，通過這種激發(fā)/加強策略免疫的小鼠H.pylori菌落形成單位中值(CFUs)減小2000倍(圖7)。這種策略的免疫比3劑粘膜疫苗免疫更有效。三劑粘膜免疫可使菌落減少1000倍。單一激發(fā)劑量的口腔施用的脲酶加LT只使H.pylori CFUs中值減小10倍，面非腸道施用不含佐劑的脲酶的加強只使CFUs中值減小2倍。
這種免疫方案被用于免疫恒河猴使之抵抗用H.pylori進行的攻擊。實施例5恒河猴，H.pylori血清學陰性，經四倍療法(quadruple therapy)治療并通過對胃部活組織樣品的培養(yǎng)與活組織檢查確定無H.pylori感染。19只猴子被隨機分成4組4只接受假免疫，5只接受重組H.pylori脲酶(脲酶)疫苗，上述疫苗通過肌肉內途徑以礬(氫氧化鋁，Rehydragel)為佐劑施用，5只通過口腔途徑，以Escherichia coli熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)做為佐劑，接受脲酶疫苗作為激發(fā)劑量，隨后是兩次通過非腸道途徑，以礬為佐劑，施用脲酶疫苗，5只猴子通過肌肉內途徑以Bay為佐劑接受脲酶疫苗。前三次接種每次三個星期，第四次在第20星期施用。
最后一次接種后一個星期，猴子用H.pylori攻擊。猴子在接觸后10個星期被殺死，尸體時，在胃部10處(1處賁門，2處胃體，3處胃體-胃竇連接處，3處胃竇，1處幽門)取樣，即5mm直徑打孔取出的活組織樣用于細菌培養(yǎng)。在胃的5個區(qū)域取出其它樣品用作組織病理學研究。
盡管由于實驗目的的攻擊，所有的猴子都感染了H.pylori，但是經脲酶加LT粘膜激發(fā)并隨后3次脲酶加礬非腸道加強而免疫的小鼠與假免疫的對照小鼠相比，菌落數(shù)在統(tǒng)計學上有明顯減少(p＝0.05，Wilcoxon檢驗)(圖8)，假免疫的對照組的CFU中值為1.3×104(從1.5×103到1.8×105CFU)，與之相比，通過粘膜激發(fā)/非腸道促進方案接受疫苗的猴子的CFU中值減少了20倍以上(5.8×102CFU，從1.0×102到6.7×102CFU)。
接受粘膜激發(fā)/非腸道加強方案的脲酶疫苗的組的猴子在感染H.pylori致病物質有類似的胃炎(圖9)和上皮變化(圖10)，沒有證據表明接種增強了胃炎或上皮惡化。
與接受粘膜激發(fā)/非腸道加強方案的猴子相反，通過非腸道途徑施用脲酶加Bay免疫的猴子在菌落上與假免疫的對照相比并無差別(p＝1.00)而用脲酶加礬免疫的猴子顯示部分效果(p＝0.33)(圖8)由于胃部樣品被其它細菌嚴重污染，接受脲酶加Bay這一組的一只猴子沒有培養(yǎng)的數(shù)據。
這些結果顯示，使用脲酶加LT激發(fā)并隨后用脲酶加礬加強的方案免疫對于在非人靈長類中防止H.pylori感染是有效的。選擇這種方案是基于以下原理的免疫系統(tǒng)必須被激發(fā)以對粘膜感染產生應答，即利用適當?shù)淖魟┻M行粘膜免疫。然而，一旦建立了恰當?shù)拿庖邞鹬螅鼈鹘y(tǒng)的佐劑，如礬，可被用于非腸道免疫以加強應答。這種方案不僅比單純體的粘膜方案更有效，而且它用的抗原比較少。因為非腸道抗原的劑量(100μg脲酶)可以比粘膜劑量(4mg)少很多。
其它實施例包括在隨后的權利要求書中。
權利要求
1.源自螺桿菌的免疫原性物質在制備藥物組合物中的應用，該藥物組合物用于誘導針對螺桿菌的T輔助細胞1(Th1)型免疫應答從而防止或治療螺桿菌在哺乳動物中的感染的應用。
2.根據權利要求1中的應用，其中Th1-型免疫應答特征為(i)小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比率大于或等于1∶100，或者為(ii)小鼠中IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比率大于或等于1∶100。
3.根據權利要求2的應用，其中Th1-型免疫應答特征為(i)小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比率大于或等于1∶10，或者(ii)小鼠中IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比率大于或等于1∶10。
4.根據權利要求3的應用，其中Th1-型的免疫應答的特征為(i)小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比率大于或等于1∶2，或者為(ii)小鼠中IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比率大于或等于1∶2。
5.源自螺桿菌的免疫原性物質在制備藥物組合物中的應用，該藥物組合物用于治療或防止螺桿菌感染，上述組合物是用于在哺乳動物，尤其是靈長類動物，的位于膈下區(qū)域的一部分上通過內吸收途徑施用的。
6.根據權利要求5的應用，其中的組分通過膈下內吸收途徑施用時能誘導Th1-型免疫應答。
7.根據權利要求5或6的應用，其中的Th1-型免疫應答的特征為(i)IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比大于或等于1∶100，或者為(ii)IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比大于或等于1∶100。
8.根據權利要求7的應用，其中Th1-型免疫應答的特征為(i)小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比大于或等于1∶10，或者為(ii)小鼠中IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比大于或等于1∶10。
9.根據權利要求8的應用，其中Th1-型的免疫應答的特征為(i)小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比大于或等于1∶2，或者為(ii)小鼠中IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比大于或等于1∶2。
10.根據權利要求1到9中的一項的應用，其中源自螺桿菌的免疫原性物質選自滅活的螺桿菌細菌，螺桿菌細胞裂解物，肽，源自螺桿菌的純化形式的多肽，含有編碼源自螺桿菌的肽或多肽的一段序列并且置于對其表達必需的控制元件的控制之下的DNA分子，和含有編碼源自螺桿菌的肽或多肽的一段序列并置于對其表達必需的控制元件的控制之下的疫苗載體。
11.根據權利要求10的應用，其中源自螺桿菌的免疫原性物質為螺桿菌的脲酶的UreB或UreA亞基。
12.根據權利要求10的應用，其中源自螺桿菌的免疫原性物質為包含有編碼螺桿菌脲酶的UreB或UreA亞基的一段序列的DNA分子或疫苗載體。
13.根據權利要求10、11或12的應用，其中免疫原性物質源自Helicobacter pylori。
14.根據權利要求5到13中之一的應用，其中藥用組合物是被用于通過嚴格內吸收途徑施用的。
15.根據權利要求5到14中之一的應用，其中藥用組合物是被用于通過選自皮下途徑，肌肉內途徑和皮內途徑中之一的內吸收途徑施用的。
16.根據權利要求5到14中之一的應用，其中的藥用組合物是被通過粘膜途徑施用，接著通過非腸道途徑施用。
17.根據權利要求16的應用，其中的藥用組合物是被用于通過非腸道途徑，接著通過粘膜途徑，接著通過非腸道途徑，接著通過粘膜途徑施用的。
18.根據權利要求5到17中之一的應用，其中的藥用組合物是被用于施用在上述哺乳動物的腰部背側的。
19.根據權利要求5到18中之一的應用，其中藥用組合物是被用于在同一療程中通過內吸收途徑施用兩次或三次，以防止或治療螺桿菌感染。
20.根據權利要求5到18中之一的應用，其中免疫原性物質選自滅活的螺桿菌細菌，螺桿菌細胞裂解物，源自螺桿菌的純化的多肽并且和至少一種能促進誘導Th1-型免疫應答的復合物聯(lián)用。
21.根據權利要求20的應用，其中能促進誘導Th1-型免疫應答的復合物選自脂質體，微球，QS-21，DC-chol和Bay R1005。
22.根據權利要求20的應用，其中能夠促進Th1-型免疫應答的誘導的化合物選自QS-21，DC-chol和Bay R1005。
23.根據權利要求22的應用，其中免疫原性物質和至少兩種能促進誘導Th1-型免疫應答的誘導的復合物聯(lián)用，第一種復合物選自脂質體，微球，第二種復合物選自QS-21，DC-chol和它們的對等物。
24.根據權利要求20的應用，其中的免疫原性物質是肽或多肽，它們通過共價鍵連接到至少一種能促進誘導Th1-型免疫應答的脂，從而形成脂肽或含脂的多肽綴合物。
25.用于防止或治療哺乳動物螺桿菌感染的方法，上述方法依次包括以下步驟在對上述哺乳動物粘膜施用源自螺桿菌的免疫原性物質；然后對上述哺乳動物非腸道施用上述源自螺桿菌的免疫原性物質。
26.權利要求25中的方法，其中粘膜施用進行一次以上。
27.權利要求25中的方法，其中非腸道施用進行一次以上。
28.權利要求25中的方法，其中進行粘膜施用是用于激發(fā)針對上述源自螺桿菌的免疫原性物質的免疫應答，進行非腸道施用是用于加強針對上述源自螺桿菌的免疫原性物質的。
29.權利要求25或28中的方法，其中的粘膜施用是口腔施用(oraladministration)。
30.權利要求25或28中的方法，其中的非腸道施用是肌肉內施用或皮下施用。
31.權利要求25中的方法，其中源自螺桿菌的免疫原性物質選自滅活螺桿菌細菌制備物，螺桿菌細胞裂解物，肽，源自螺桿菌的純化的多肽，包含有編碼源自螺桿菌的肽或多肽的一段序列并且處于對其表達必需的元件的控制之下的DNA分子，和包含有編碼源自螺桿菌的肽或多肽的一段序列并且處于對其表達必需的元件的控制之下疫苗載體。
32.權利要求31中的方法，其中源自螺桿菌的免疫原性物質為螺桿菌脲酶的UreB或UreA亞基。
33.權利要求31中的方法，其中源自螺桿菌的免疫原性物質是包含編碼螺桿菌脲酶的UreB或UreA亞基的序列的DNA分子或疫苗載體。
34.權利要求31、32或33中的方法，其中免疫原性物質是源自Helicobacter pylori的。
35.權利要求25中的方法，其中粘膜佐劑選自Escherichia coli熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)，霍亂毒素(CT)，Clostridium difficile毒素，百日咳毒素(PT)以及它們的復合物，亞基，類毒素，源自它們的突變體，上述佐劑與粘膜施用免疫原性物質共同施用。
36.權利要求25中的方法，其中的非腸道佐劑選自由礬，QS-21，DC-chol和Bay組成的一組佐劑，上述佐劑與非腸道施用的免疫原性物質共同施用。
全文摘要
本發(fā)明的目標是使用源自螺桿菌的免疫原性物質制備用于誘導抗螺桿菌的T輔助細胞1(Th1)型免疫應答以防止或治療哺乳動物的螺桿菌感染的藥用組合物。這具體是通過例如,在哺乳動物的膈下區(qū)域通過內吸收途徑或非腸道途徑施用藥用組合物實現(xiàn)的。本發(fā)明還包括用于治療或防止螺桿菌感染的粘膜/非腸道免疫方法。
文檔編號A61P31/04GK1254292SQ98804722
公開日2000年5月24日 申請日期1998年4月30日 優(yōu)先權日1997年4月30日
發(fā)明者B·居伊, J·哈恩斯勒, C·K·李, R·A·維爾特津, T·P·莫納斯 申請人:梅里厄奧拉瓦克斯公司