專利名稱：用于胰島組織移植的cd154阻斷治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及抑制不需要的免疫反應(yīng)、具體地抑制逆適應(yīng)性T-淋巴細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本發(fā)明具體地涉及預(yù)防、治療、抑制或逆轉(zhuǎn)受體宿主中免疫系統(tǒng)驅(qū)動的對移植組織或移植器官的排斥。
背景技術(shù)：
遺傳上不同的個體之間的器官移植總是通過T細胞依賴性機制導(dǎo)致對該器官的免疫排斥，除非排斥過程通過施用抑制T細胞功能的藥物而受到抑制。數(shù)個美國專利公開了使用這樣的免疫抑制藥物來抑制排斥，包括U.S.Nos 5,104,858；5,008,246和5,068,323。其它常規(guī)藥劑描述于Suthanthiran等(1994)，331新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志365-367。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑和糖皮質(zhì)激素均在臨床上使用，并且都阻止T細胞介導(dǎo)的活化細胞因子、特別是IL-2的釋放。然而，用這些常規(guī)藥劑治療仍不完善。這2種類型均通過T細胞抗原受體(TCR)(T細胞抗原特異性的唯一介質(zhì))損害信號傳導(dǎo)來起作用，并且不加區(qū)別地作用于所有T細胞。此外，這些藥物的效應(yīng)不持久，使得治療的終止一般導(dǎo)致移植物丟失。因此，為了維持移植物存活、有功能的整合，移植受體必須承受長期、非特異性免疫移植的后果。這些后果包括增加的感染和惡性腫瘤的風險以及毒性，特別是對敏感器官或組織如腎臟、肝臟和胰腺的毒性。胰島細胞移植(ICT)可以導(dǎo)致糖尿病(DM)患者中高血糖的逆轉(zhuǎn)和血葡萄糖代謝調(diào)控的正?；?Ricordi，糖尿病綜述4356-369，1996；Scharp等，糖尿病39515-518，1990；Socci等，糖尿病學(xué)報28151-157，1991；Warnock等，糖尿病學(xué)3455-58，1991；Ricordi等，移植53407-414，1992；Gores等，柳葉刀34119-21，1993；Alejandro等，糖尿病461983-1989，1997)。即使沒有胰島素依賴性時，在帶有功能性胰島同種異體移植物(基準c-肽產(chǎn)量＞1.0ng/mL)的移植受體中施用減少劑量的外源胰島素導(dǎo)致很好的代謝調(diào)控和血紅蛋白Ale(HbAlc)的正?；?Ricordi，糖尿病綜述4356-369，1996；Scharp等，糖尿病39515-518，1990；Socci等，糖尿病學(xué)報28151-157，1991；Warnock等，糖尿病學(xué)3455-58，1991；Ricordi等，移植53407-414，1992；Gores等，柳葉刀34119-21，1993；Alejandro等，糖尿病461983-1989，1997)。未觀察到高血糖并且現(xiàn)已記錄到移植后6年多患有自身免疫糖尿病的受體中有功能的胰島同種異體移植物(Alejandro等，糖尿病461983-1989，1997)。盡管有這些重要進展，但是基于胰島細胞移植來控制DM的廣泛應(yīng)用受到需要對受體進行長期而普遍的免疫抑制的限制。此局限性不僅涉及與長期免疫抑制有關(guān)的危險，而且涉及目前所用的免疫抑制藥物的糖尿病效應(yīng)。
目前控制DM的治療的局限性激發(fā)了開發(fā)用于誘導(dǎo)供體特異性免疫學(xué)耐受性的療法的廣泛興趣以避免對移植受體進行終生免疫抑制的必要。數(shù)位研究人員使用各種嚙齒動物模式系統(tǒng)進行同種異體移植，獲得期望的初步結(jié)果。然而，當在大型動物臨床前模型(例如犬、非人靈長類動物)中測試時，發(fā)現(xiàn)嚙齒動物的結(jié)果不足以預(yù)測更接近地模擬人ICT的模型中的ICT結(jié)果。
因此，需要改進的或更有效的對移植受體包括人類的免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)治療。特別地，需要無須泛T細胞免疫抑制的治療法，即不使受體對惡性腫瘤或機會性感染易感的治療法。更應(yīng)指出的是，需要比現(xiàn)行治療試劑毒性更小的治療法。類似地，需要促進移植物持續(xù)有功能整合，即在治療過程結(jié)束后繼續(xù)維持整合的治療法。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供減輕逆適應(yīng)性T細胞反應(yīng)而不需要泛T細胞免疫抑制的免疫調(diào)節(jié)劑。另一目的是提供促進組織移植物、特別是胰島來源的組織移植物在受體宿主、特別是人類宿主中有功能整合的免疫調(diào)節(jié)劑。另一目的是提供抑制對移植組織、特別是移植的胰島或其它產(chǎn)生胰島素組織的免疫學(xué)排斥的免疫調(diào)節(jié)劑。進一步的目的是提供阻斷共刺激信號向活化T細胞傳遞的免疫調(diào)節(jié)劑。具體的目的是提供CD40CD154結(jié)合阻斷劑如CD154阻斷劑用于治療，尤其是用于減輕、延緩或逆轉(zhuǎn)對移植組織的免疫學(xué)排斥的治療。本發(fā)明更普遍的目的是通過提供允許非自身組織(例如同種異體或異種組織)有功能地整合入受體宿主的免疫調(diào)節(jié)組合物來增加組織移植，特別是產(chǎn)生胰島素的組織移植的實用性。進一步的普遍目的是防止、減輕、減弱或治療糖尿病(DM)。
本發(fā)明在于發(fā)現(xiàn)使用CD40CD154結(jié)合阻斷劑如CD154阻斷劑(無論單獨使用還是與其它治療試劑如免疫調(diào)節(jié)劑或耐受劑結(jié)合使用)可減弱、抑制、防止、延緩或逆轉(zhuǎn)受體宿主體內(nèi)對移植的產(chǎn)生胰島素組織的逆適應(yīng)性免疫系統(tǒng)排斥而無須廣泛抑制受體的免疫系統(tǒng)。
因此本發(fā)明提供對移植的產(chǎn)生胰島素組織的受體進行免疫調(diào)節(jié)治療的方法和組合物。第一種方法抑制移植受體對產(chǎn)生胰島素組織移植物的排斥。第二種方法延長組織移植物的存活。第三種方法逆轉(zhuǎn)對組織移植物的排斥。第四種方法保持組織移植物的功能。第五種方法恢復(fù)受損移植物的功能。第六種方法誘導(dǎo)對組織移植物的免疫耐受性。所有前面的方法包括用CD40CD154結(jié)合阻斷劑治療移植受體，CD40CD154結(jié)合阻斷劑是指任何阻斷CD40配體(即CD40L，也稱為CD154或5c8抗原，并且有時在本領(lǐng)域中稱為gp39)與其反受體或相關(guān)受體(本文為CD40)結(jié)合的試劑治療移植受體。優(yōu)選地，結(jié)合阻斷劑是CD154(CD40L)阻斷劑，即任何與CD154結(jié)合并阻止或干擾其與反受體(例如CD40)結(jié)合的試劑。CD154阻斷劑的實例是單克隆抗體(MAb)，具體地是在美國專利5,474,771中公開的具有5c8 MAb抗原特異性結(jié)合特征的單克隆抗體，在此引用該文獻作為參考。
前述的方法可以用所有類型的產(chǎn)生胰島素的組織移植物如分離的完整胰腺組織或胰島通過常規(guī)技術(shù)來實施。因此，本發(fā)明適用于移植受體(受體宿主)是哺乳動物、優(yōu)選地靈長類動物、最優(yōu)選地人類的情況。特別地，本發(fā)明適用于移植受體患葡萄糖代謝調(diào)控失調(diào)如DM或有此危險的情況。移植供體可以是與移植受體相同種系發(fā)生物種的非同源成員(即提供同種異體組織的同種異體供體)或者不同種系發(fā)生物種的成員(即提供異種組織的異種供體)。如果異種共同用作移植組織來源，優(yōu)選供體與受體宿主是相對MHC相容性的，例如狒狒或黑猩猩應(yīng)優(yōu)選為用于將組織移植給人類的供體。本發(fā)明可用于促進其它類型產(chǎn)生胰島素組織的移植，包括分離的成年或胎兒胰島β細胞或者培養(yǎng)的胰島β細胞的細胞群體(源自原始細胞培養(yǎng)物或無限繁殖化細胞系)。的確，本發(fā)明可用于促進任何可誘導(dǎo)或穩(wěn)定表達胰島素基因的細胞，如通過常規(guī)遺傳工程技術(shù)加工或制備的宿主細胞的移植。選擇性地，產(chǎn)生胰島素的組織可以通過免疫分離器與受體組織在物理上分開。
鑒于前面所述，應(yīng)該明白本發(fā)明提供恢復(fù)需要其的哺乳動物中葡萄糖代謝調(diào)控的方法。此方法包括將產(chǎn)生胰島素的組織移植給哺乳動物并且用CD40CD154結(jié)合阻斷劑、優(yōu)選地用CD154阻斷劑治療該哺乳動物。在優(yōu)選的實施方案中，CD154阻斷劑是具有MAb 5c8的抗原特異性結(jié)合特征的單克隆抗體。通過在人類DM的有關(guān)大型動物臨床前模型中測試證實的方法實例中，通過在ICT之前施用MAb，接著(優(yōu)選地)在ICT后2周內(nèi)(即移植產(chǎn)生胰島素的組織后)至少2次施用MAb來誘導(dǎo)移植。之后，根據(jù)需要，在ICT后(規(guī)定為4周)通過施用MAb一月來維持移植。此維持可根據(jù)需要或為了小心而重復(fù)進行。
選擇性地，移植可以通過同時用耐受劑(是指任何在免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制停止后維持移植的藥物)治療哺乳動物而得到增強。耐受劑的實例包括與組織移植物(在此與產(chǎn)生胰島素組織)相容的骨髓組織、骨髓衍生的細胞種群。優(yōu)選地，骨髓或細胞與產(chǎn)生胰島素組織的供體或來源同源。因此，耐受劑在移植受體內(nèi)的長期存活使得受體為免疫學(xué)嵌合性的，即供體特異性免疫學(xué)耐受性表現(xiàn)的狀態(tài)。骨髓衍生的細胞種群即CD34(+)造血細胞(干細胞)作為耐受劑是特別優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是具有CD40(-)細胞表面表型的干細胞種群。
在另一方面，本發(fā)明提供測定哺乳動物中葡萄糖代謝調(diào)控損傷的方法。此方法足夠敏感以揭示血葡萄糖代謝的亞臨床(例如隱蔽或無癥狀的)損傷，例如哺乳動物正處于患DM的危險中或排斥移植的產(chǎn)生胰島素組織的危險中或在其早期階段。該方法包括分析在哺乳動物攝食后至少1小時并且不到6小時(優(yōu)選地約2小時)時從該哺乳動物提取的含血樣品的葡萄糖含量。如果發(fā)現(xiàn)此攝食后(PPD)樣品的葡萄糖含量是150mg/dl或更高(即超過約150mg/dl)，則認為該哺乳動物有損傷的葡萄糖代謝。如果分析在連續(xù)天數(shù)提取的2種這樣的樣品并且2種樣品均顯示150mg/dl或更高的葡萄糖含量，則提高了此方法的可靠性。
附圖簡述本發(fā)明前述和其它目的、特征和優(yōu)勢以及本發(fā)明本身在與附圖一起閱讀時將從下面優(yōu)選實施方案的描述中得到更充分的理解，其中

圖1是繪制CD154阻斷劑治療的狒狒ICT受體的禁食血葡萄糖(FG)水平與手術(shù)后天數(shù)(POD)的函數(shù)的線性圖。
圖2是繪制CD154阻斷劑治療的彌猴ICT受體的FG水平與手術(shù)后天數(shù)(POD)的函數(shù)的線性圖。
圖3是比較示于圖2中彌猴受體FG水平與患DM并且接受常規(guī)胰島素替代治療人類患者FG水平比較的線性圖。
發(fā)明詳述T細胞活化和依賴其的免疫學(xué)過程既需要T細胞受體(TCR)介導(dǎo)的信號又需要同時傳送的共刺激信號。重要的共刺激信號通過CD40與抗原呈遞細胞的結(jié)合傳遞，例如B細胞通過T細胞上的CD40L(CD154)傳遞。人類CD40是成熟B細胞以及巨噬細胞和活化內(nèi)皮細胞上表達的50kD細胞表面蛋白。CD40屬于與編程性細胞死亡有關(guān)的一類受體，包括Fas/CD95和腫瘤壞死因子(TNF)α受體。人CD154(CD40L)是具有與瞬間表達的TNFα的同源性的32KD II型膜糖蛋白，主要在活化T細胞上瞬間表達。已經(jīng)證明CD40CD154結(jié)合是所有T細胞依賴性抗體反應(yīng)所必需的。特別地，CD40CD154結(jié)合提供抗編程性細胞死亡和/或淋巴因子刺激的信號。
在發(fā)現(xiàn)人類X-連鎖的hyper-IgM綜合癥(X-HIGM)是由功能性CD154的遺傳缺陷所導(dǎo)致的表型時，CD40CD154結(jié)合在促進T細胞依賴性生物學(xué)反應(yīng)方面的重要性得到更充分地理解?；颊呔哂姓；蚋逫gM水平，但不能產(chǎn)生IgG，IgA或IgE抗體，并且患有復(fù)發(fā)的、有時嚴重的細菌及寄生蟲感染以及有增加的淋巴瘤和腹部癌癥的得病幾率。類似表型在非人類動物中觀察到，其導(dǎo)致編碼CD154的基因成為零合基因(敲除動物)。CD154無效合子的B細胞可以在無CD40CD154結(jié)合時產(chǎn)生IgM，但不能進行同型轉(zhuǎn)換或在親和成熟后正常存活。在組織學(xué)上，淋巴結(jié)生發(fā)中心不能正常發(fā)育，并且記憶B細胞缺乏或發(fā)育不足。在功能上，這些缺陷導(dǎo)致次級(成熟)抗體反應(yīng)的嚴重減少或缺失。也觀察到細胞免疫性的缺陷，表現(xiàn)為增加的細菌和寄生蟲的感染幾率。許多細胞介導(dǎo)的缺陷可通過施用IL-12或IFN-γ加以逆轉(zhuǎn)。這些觀察結(jié)果證實了這樣的觀點，即正常的CD40CD154結(jié)合促進I型T-輔助細胞免疫學(xué)反應(yīng)的形成。
許多臨床前研究已經(jīng)證實能阻斷CD40CD154結(jié)合的試劑有作為免疫調(diào)節(jié)劑的前景。具體地，包括小型動物器官或組織移植模型的研究顯示CD40CD154阻斷劑促進同種異體移植物的存活。在所選的模型中，短暫施用干擾T細胞共刺激的試劑導(dǎo)致無限制移植接受的產(chǎn)生。特別地，CD40CD154結(jié)合的阻斷已得到理想結(jié)果，因為看來這種反受體對的接合在時序和層次上先于其它共刺激信號(Ranheim等，實驗醫(yī)學(xué)雜志177925-935，1993；Roy等，歐洲免疫學(xué)雜志25596-603，1995；Han等，免疫學(xué)雜志155556-567，1995；Shinde等，免疫學(xué)雜志1572764-2768，1996；Yang等，科學(xué)2731862-1864，1996；Grewal等，科學(xué)2731864-1867；Lederman等，免疫學(xué)雜志1493817-3826，1992)。CD40CD154結(jié)合的阻斷導(dǎo)致延長心臟(Larsen等，移植614-9，1996；Larsen等，自然381434-438，1996)、皮膚(Larsen等，自然381434-438，1996；Maekees等，移植64329-335，1997)和胰島同種異體移植物(Parker等，美國國家科學(xué)院院報929560-9564，1995；Rossini等，細胞移植549-52)在嚙齒動物中的存活以及同種異體腎臟在靈長類動物中的存活(Kirk等，美國國家科學(xué)院院報1948789-8794，1997)。也已證明延緩了非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中自身免疫糖尿病的發(fā)生(Balasa等，免疫學(xué)雜志1594620-4627，1997)。最近，有報道干擾CD40CD154結(jié)合防止了炎性細胞因子的產(chǎn)生(Dechanet等，免疫學(xué)雜志1595640-5647；Kiener等，免疫學(xué)雜志1554917-4925，1995)。
因此，CD40CD154阻斷可以提供強有力的治療以防止有缺陷性葡萄糖代謝如I型糖尿病的個體中胰島同種異體移植或異種移植的失敗。然而，正如上述，在嚙齒動物模式系統(tǒng)中的研究結(jié)果與大型動物包括人類的試驗或治療結(jié)果很少相關(guān)。
在此公開的是測定優(yōu)選的CD154阻斷劑即具有MAb 5c8抗原特異性結(jié)合特性的人化MAb(Lederman等，實驗醫(yī)學(xué)雜志175109在此引用作為參考01，1992)在胰島同種異體移植的大型動物臨床前模型中的效應(yīng)的研究結(jié)果。具體地，本模型包括對狒狒(Papio hamadryas)和其它非人靈長類動物的CD154阻斷單獨治療。從這些研究中獲得的結(jié)果強烈地顯示CD154阻斷單獨治療將促進產(chǎn)生胰島素的組織長期移植入人體，特別是患DM或類似的葡萄糖體內(nèi)平衡缺陷的患者中。
下面的討論描述并且舉例說明可以實施本發(fā)明以及提供證據(jù)原理研究結(jié)果的各種內(nèi)容和條件，包括本發(fā)明的特定實施方案。受體宿主本發(fā)明可用于治療或預(yù)防產(chǎn)生胰島素組織移植的任何哺乳動物受體或需要產(chǎn)生胰島素組織移植的任何哺乳動物。因此受體宿主(也稱為受體或宿主)患血糖代謝(葡萄糖體內(nèi)平衡)調(diào)控缺陷或正處于此危險中。例如，患者可以為高血糖或低血糖。本發(fā)明特別適用于糖尿病受體，特別是患糖尿病(DM)的受體。優(yōu)選地，受體是靈長類動物，更優(yōu)選地高等靈長類動物，最優(yōu)選地人類。在其它實施方案中，受體可以是需要組織移植的其它哺乳動物，特別是具有商業(yè)重要性的哺乳動物或?qū)櫸锘蚱渌袃r值動物如瀕危物種的成員。因此，受體宿主也包括但不限于綿羊、馬、牛、山羊、豬、狗、貓、兔、豚鼠、倉鼠、沙鼠、大鼠和小鼠。供體或移植組織本發(fā)明可以采用任何類型的產(chǎn)生胰島素組織移植或移植方法、特別是其中供體(移植)組織受受體宿主免疫系統(tǒng)影響或排斥或有失敗風險的方法。特別地，本發(fā)明可用于任何供體組織與受體組織是非組織相容性的(MHC相容性的)的情況。因此，除了自身或同源的供體組織，本發(fā)明可以用于同種異體或甚至異種供體組織。供體組織可以通過常規(guī)方法從志愿者或其它存活供體或尸體供體得到。優(yōu)選地，供體與受體宿主與可操作性一樣是組織相容性的。因此，當受體宿主是人時，優(yōu)選的是自體和同種異體供體。然而，供體組織可以從異源物種(在此情況，稱為異種移植)如非人靈長類動物(例如黑猩猩或狒狒)或者其它相對相容性的哺乳動物(例如豬)獲得。
在有些實施方案中，供體組織包括完整胰腺。在另一些實施方案中，供體組織包括供體胰腺的一部分、部分或活體解剖材料。供體胰腺可以從存活供體或適當尸體獲得。如果使用尸體供體，胰腺優(yōu)選地暴露于冷缺血性狀況不超過約8小時。在另一些實施方案中，供體組織包括產(chǎn)生胰島素細胞，特別是分離或懸浮的胰島或胰島細胞，包括從胎兒或成年供體取出或切除的細胞在原始培養(yǎng)物中保持的細胞或無限繁殖化細胞系。從完整胰腺制備供體胰島或胰島細胞懸浮液的適當方法是眾所周知的(參見，例如Ricordi等(1988)，37糖尿病413-420；Tzakis等(1990)，336柳葉刀402-405；Linetsky等(1997)，46糖尿病1120-1123)。適當?shù)囊认購幕旧蠠o血葡萄糖體內(nèi)平衡缺陷的供體獲得。產(chǎn)生胰島素細胞的其它來源包括選擇性地在初級培養(yǎng)物中擴增的胎兒胰島前體細胞。然而，可以使用任何適當?shù)募毎愋?，包括帶有編碼可表達胰島素基因的外源遺傳物質(zhì)的細胞。因此，本發(fā)明包括使用轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細胞，它們已經(jīng)過遺傳操作以組成性或可誘導(dǎo)地(例如在葡萄糖反應(yīng)性啟動子或增強子的控制之下)表達胰島素(或源自已經(jīng)過遺傳操作的祖細胞)。在其它實施方案中，本發(fā)明包括使用源自轉(zhuǎn)基因哺乳動物的胰腺或其它供體細胞類型，其中哺乳動物已經(jīng)過遺傳操作以在其所有身體組織或其部分組織中包含產(chǎn)生胰島素所必需的遺傳物質(zhì)。
將產(chǎn)生胰島素組織(供體組織)系統(tǒng)或局部導(dǎo)入受體宿主。例如，可以將分離、懸浮或分散的產(chǎn)生胰島素的細胞血管內(nèi)輸注或移植入所需的位點如骨髓腔、肝臟、腎小囊內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)。在有些實施方案中，細胞具有有絲分裂能力并且產(chǎn)生新的供體來源組織。在另一些實施方案中，細胞無有絲分裂能力但是在供體中保持存活并且產(chǎn)生或表達胰島素。在任何情況中，移植有效量的產(chǎn)生胰島素細胞或組織，即足以減輕(可檢測到減輕)受體的葡萄糖代謝缺陷(例如高血糖或低血糖)的量。最好，該量足以恢復(fù)受體維持葡萄糖體內(nèi)平衡的能力-即使受體不再依賴常規(guī)(例如注射或吸入)胰島素替代治療。
在有些實施方案中，產(chǎn)生胰島素組織通過免疫分離器在物理上與受體的周圍組織分開(隔開)。適當?shù)姆蛛x器保護產(chǎn)生胰島素組織免受大多數(shù)細胞和體液免疫效應(yīng)物，包括但不限于淋巴細胞、免疫球蛋白和補體的影響。因此，免疫分離器一般提供可半透屏障如具有足以阻止大于約50-100kD的分子擴散的孔徑大小的膜。該屏障分隔了其中放置產(chǎn)生胰島素組織的分離室并且保證沒有產(chǎn)生胰島素組織可能在物理上與屏障外細胞或組織接觸的位點。可以使用任何常規(guī)的儀器、包膜、膠囊或微膠囊，包括單層或雙層壁的海藻酸鹽微膠囊(例如在美國專利5,227,298中所述的，在此引用其內(nèi)容作為參考)。其它常規(guī)微膠囊(包括海藻酸鹽聚賴氨酸微膠囊、化學(xué)交聯(lián)的海藻酸鹽微膠囊以及由其它生物相容性聚合物組成的膠囊)形成結(jié)構(gòu)上合理的任何所需形狀或大小的免疫分離器(參見，例如Jaink等(1996)，61移植4，在此引用其內(nèi)容作為參考)。
在進一步的實施方案中，向受體宿主移植耐受劑如來源于其本身的骨髓或細胞。任何致耐受性組織或細胞類型可用作耐受劑，包括胰腺基質(zhì)細胞以及骨髓細胞。致耐受性細胞與產(chǎn)生胰島素組織是MHC相容性的并且優(yōu)選地從提供產(chǎn)生胰島素組織或與其同源的供體獲得。制備骨髓或其細胞種群的適當方法是眾所周知的(參見，例如Sharp等(1984)，69免疫學(xué)方法雜志187-195，F(xiàn)ontes等(1995)，細胞移植方法，Ricordi編，R.G.Landes出版公司，619-628頁)。優(yōu)選地，用CeprateSC干細胞濃縮系統(tǒng)(CellPro，Inc.，Bothell，WA；參見1997年6月1日修訂的CellPro研究人員手冊)或與其類似產(chǎn)品處理骨髓細胞以提供骨髓衍生的富含CD34(+)造血細胞的細胞種群。標準熒光-活化細胞分選(FACS)分析或免疫熒光染色顯示該CD34(+)細胞種群基本上無CD40(+)細胞，然而可能會觀察到一些模糊的CD40染色。由于CD34(+)細胞種群是動態(tài)干細胞種群，故認為低水平CD40(+)細胞的存在對應(yīng)于干細胞開始沿B細胞譜系分化的頻率。的確，初步FACS研究已經(jīng)確定在CD34(+)干細胞種群中只有CD40(+)細胞(一般表現(xiàn)不超過總數(shù)的約0.7％)也是CD19(+)。CD19為目前已知的最早B細胞譜系標記。因此，為了確保將真正的干細胞用作耐受劑，可通過常規(guī)負選擇方法(例如選擇性細胞裂解、細胞分選、淘選等)進一步除去CD34(+)細胞中的CD40(+)細胞。CD40CD154結(jié)合阻斷劑的實例用于實施本發(fā)明的治療化合物包括任何阻斷細胞表面CD40(例如位于B細胞上)與例如活化T細胞表面上表達的CD40L(CD154)相互作用的化合物。應(yīng)該特別注意的CD40CD154結(jié)合阻斷劑化合物如CD154阻斷劑包括單克隆抗體和多克隆抗體(MAbs)以及抗體衍生物如嵌合分子、人化分子、具有降低效應(yīng)物功能的分子、雙特異性分子和抗體的偶聯(lián)物。在優(yōu)選的實施方案中，抗體具有MAb 5c8抗原特異性結(jié)合特征，如美國專利5,474,771中所述，在此引用其公開內(nèi)容作為參考。在目前高度優(yōu)選的實施方案中，抗體是人化的5c8。其它已知的抗CD154的抗體包括抗體ImxM90、ImxM91和ImxM92(來自Immunex)、商業(yè)上可從Ancell得到的抗-CD40L mAb(克隆24-31，目錄號353-020，Bayport，MN)和商業(yè)上可從Genzyme得到的抗-CD40LmAb(Cambridge，MA，目錄號80-3703-01)。同樣商業(yè)上可以得到的有來自PharMingen的抗-CD40L mAb(San Diego，目錄號33580D)。許多其他抗-CD40L抗體也得到制備和鑒定(參見，例如Bristol-Myers Squibb的WO 96/23071，在此引用其說明書作為參考)。
本發(fā)明也包括使用其它類型的CD154阻斷劑如完整Fab片段、F(ab’)2化合物、VH區(qū)、FV區(qū)、單鏈抗體(參見，例如WO 96/23071)、多肽、多肽融合構(gòu)建體、CD40融合體(如CD40Ig，如在Hollenbaugh等，免疫學(xué)方法1881-7，1995中所述，在此引用作為參考)和小分子化合物如小的半肽化合物或非肽化合物，所有這些均能夠阻斷或阻止CD40CD154結(jié)合。設(shè)計、篩選和優(yōu)化小分子的方法在1996年6月21日提交的PCT/US96/10664中提供，在此引用其說明書作為參考。
各種形式的抗體也可用標準重組DNA技術(shù)加以制備(Winter和Milstein，自然349293-99，1991)。例如，可以構(gòu)建“嵌合”抗體，其中將來自動物抗體的抗原結(jié)合區(qū)與人恒定區(qū)連接(一種最初來自非人類哺乳動物的抗體，其中已使用重組DNA技術(shù)用來自人免疫球蛋白輕鏈或重鏈的相應(yīng)區(qū)域置換了其所有或部分重鏈鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū))(參見，例如Cabilly等，美國專利No.4,816,567；Morrison等，美國國家科學(xué)院院報816851-55，1984)。嵌合抗體用于人類治療或預(yù)防時降低由動物抗體引發(fā)的免疫原性反應(yīng)。
此外，可以合成重組的“人化”抗體。人化抗體是起初從非人類哺乳動物衍生的抗體，其中已使用重組DNA技術(shù)用來自人免疫球蛋白輕鏈或重鏈的相應(yīng)區(qū)域的氨基酸取代了抗原結(jié)合不需要的部分或所有氨基酸。即它們是主要包含人免疫球蛋白序列的嵌合體，其中插入了負責特異性抗原結(jié)合的區(qū)域(參見，例如PCT專利申請WO 94/04679)。用目的抗原免疫動物，分離相應(yīng)的抗體并去除負責特異性抗原結(jié)合的可變區(qū)序列部分。然后將動物來源的抗原結(jié)合區(qū)克隆入抗原結(jié)合區(qū)已刪除的人抗體基因適當位置。人化抗體最大限度地減少了異源(種間)序列在用于人類治療的抗體中的使用，并且很可能較少引發(fā)不想要的免疫反應(yīng)。也可類似地制備靈長類化抗體。
本發(fā)明的另一實施方案包括使用可以在非人動物如帶有一種或多種人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物中制備的人類抗體。這樣的動物可以用作用于制備雜交瘤的脾細胞的來源，如U.S.5,569,825中所述。
抗體片段和單價的抗體也可用于實施本發(fā)明。單價抗體包括與第二種重鏈的Fc(或主干)區(qū)域結(jié)合的重鏈/輕鏈二聚體。“Fab區(qū)”是指那些與包含重鏈Y分支部分的序列大致相同或相似或在整體上與輕鏈大致相同或相似并且已表明整體上(集合體)表現(xiàn)抗體活性的鏈部分。Fab蛋白包括一條重鏈和一條輕鏈的集合體(常稱為Fab’)以及對應(yīng)于抗體Y2個分支片段的四聚體(常稱為F(ab)2)，無論上述任何形式是共價或非共價集合體，只要集合體能選擇性與特定抗原或抗原家族反應(yīng)即可。
此外，可用標準重組DNA技術(shù)通過改變抗原結(jié)合位點附近的氨基酸殘基雜改變重組抗體與其抗原的結(jié)合親和性?？筛鶕?jù)分子模型通過誘變來增加人化抗體的抗原結(jié)合親和性(Queen等，美國國家科學(xué)院院報8610029-33，1989；PCT專利申請WO 94/04679)。根據(jù)靶組織類型或預(yù)想的特定治療方案增加或減小抗體對CD40L的親和性可能是有利的。這可用噬菌體展示技術(shù)來進行(參見，例如Winter等，免疫學(xué)年鑒12433-455，1994和Schier等，分子生物學(xué)雜志.25528-43，1996，在此引用作為參考)。例如，為了半預(yù)防性治療，用恒定水平的具有減小的對CD40L的親和性的抗體治療患者是有利的。同樣，具有增加的對CD40L的親和性的抗體對于短期治療可能是有利的。給藥途徑用于本發(fā)明的CD40CD154結(jié)合阻斷劑，包括CD154阻斷劑可以用醫(yī)學(xué)上可接受的任何方式給藥。根據(jù)具體情況，局部或系統(tǒng)給藥可能是理想的。優(yōu)選地，藥劑通過胃腸外途徑如通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、眼眶內(nèi)、心室內(nèi)、腹膜內(nèi)、被膜下、顱內(nèi)、脊髓內(nèi)或鼻內(nèi)注射、輸注或吸入給藥。藥劑也可通過在供體組織移植之前或之后將輸入泵或者可生物相容或可生物降解的緩釋移植物植入受體宿主來給藥。選擇性地，本發(fā)明的某些化合物或其制品可適于口腔或腸道給藥。本發(fā)明還有一些化合物將適于體表給藥。
在進一步的實施方案中，通過施用編碼阻斷劑的載體或其它可表達的遺傳物質(zhì)將CD40CD154結(jié)合阻斷劑間接提供給受體。將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入受體的細胞或組織并在其中表達，由此在原位產(chǎn)生阻斷劑。例如，適當?shù)暮怂針?gòu)建體將包含編碼一種或多種MAb 5c8免疫球蛋白(Ig)鏈的序列，如U.S.專利5,574,771中公開的。其它適當?shù)臉?gòu)建體將包含編碼嵌合或人化版本的MAb 5c8 Ig鏈或其抗原結(jié)合片段。其它適當構(gòu)建體將包含編碼部分或全部其它CD154特異性MAb的序列。將構(gòu)建體系統(tǒng)或局部地運送到例如鄰近表達胰島素組織移植部位的位點。
選擇性地，將編碼阻斷劑的載體或其它遺傳物質(zhì)導(dǎo)入適當?shù)姆蛛x細胞種群中以制備產(chǎn)生阻斷劑的宿主細胞。然后將這些宿主細胞局部或系統(tǒng)地移植或輸注給受體以提供CD40CD154結(jié)合阻斷劑的原位產(chǎn)生。適當宿主細胞包括培養(yǎng)細胞如永生化細胞以及從受體獲得的細胞(例如外周血或淋巴結(jié)細胞如天然殺傷(NK)細胞)。
一般地，將本發(fā)明的化合物施用給受體宿主。然而，化合物也可施用給供體或供體組織。例如，本發(fā)明的化合物可包含在整合入受體宿主之前保存或運輸供體組織的灌流或防腐液中。制劑一般來說，將用于實施本發(fā)明的化合物懸浮、溶解或分散于藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑中。得到的治療組合物對受體的體內(nèi)平衡，特別是電解液平衡沒有負面影響。因此，載體實例包括正常的生理鹽水(0.15MNaCl，pH7.0到7.4)。其它可接受的載體在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知并且描述于例如雷明頓藥物科學(xué)，Gennaro編，Mack出版公司，1990。可接受的載體可包括可生物相容的、惰性或可生物吸附的鹽、緩沖劑、寡糖或多糖、聚合物、粘性增強劑、防腐劑等。
配制用于實施本發(fā)明的任何CD40CD154結(jié)合阻斷劑如CD154阻斷劑以運送藥學(xué)上有效的或治療上有效的量或劑量，即足以對受體產(chǎn)生可檢測到的、優(yōu)選醫(yī)學(xué)上有利的效應(yīng)的量。醫(yī)學(xué)上有利的效應(yīng)將包括防止、延緩或減輕受體醫(yī)療狀態(tài)的惡化或可檢測到地改進其醫(yī)療狀態(tài)。例如，可通過常規(guī)測定血尿素氮或肌酸酐的濃度或尿液體積或溶質(zhì)含量或相關(guān)溶質(zhì)從血液向尿液清除的速度來監(jiān)測腎同種異體或異種移植物的功能和健康。類似地，可通過常規(guī)測定血液或尿液的葡萄糖、葡萄糖代謝物或胰島素的濃度或例如在常規(guī)葡萄糖耐受測試中測定對葡萄糖攻擊的胰島素反應(yīng)來監(jiān)測產(chǎn)生胰島素的同種異體移植物或異體移植物的糖調(diào)節(jié)功能和健康。因此，本發(fā)明治療化合物如CD154阻斷劑的有效量是可檢測到地降低受體對胰島素替代治療的依賴的任何量。更具體地，有效量是導(dǎo)致供體產(chǎn)生胰島素組織部分或基本上完全移入(接受并且發(fā)揮作用)的量。治療劑量和頻率用于完成本發(fā)明任何特定化合物給藥的劑量和頻率在組織移植領(lǐng)域普通醫(yī)生如移植外科醫(yī)生的技術(shù)和臨床判斷能力之內(nèi)?；緞┝亢褪┯梅桨竿ㄟ^臨床前和臨床試驗加以確定，試驗包括廣泛但常規(guī)的研究以測定所需化合物的有效、例如最佳給藥參數(shù)。即使在完成這些建議之后，臨床醫(yī)生通常將根據(jù)各種因素如受體年齡、醫(yī)療狀態(tài)、體重、性別和與其它藥物的共同治療針對不同受體宿主改變這些劑量。測定用于抑制移植排斥的每種CD40CD154結(jié)合阻斷劑的有效劑量和給藥方案是藥物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員的日常事務(wù)。給藥量和療程應(yīng)該足以在受體健康狀態(tài)的一個或多個指標中產(chǎn)生臨床上有利的改變。療程和劑量方案的實例列于這里包括的證據(jù)-原理研究中?；旧希景l(fā)明包括以誘導(dǎo)接受的方案施用CD40CD154結(jié)合阻斷劑(以人化MAb 5c8，hu5c8為例)，如果為了謹慎可接著實施維持接受的方案。
為了舉例說明抗CD40L化合物的劑量因素，給出下面關(guān)于抗CD40L mAb施用策略的實例。給藥量可容易地針對其它類型的抗CD40L化合物加以調(diào)整。一般地，應(yīng)該考慮約0.05-50mg/kg病人體重的單一劑量，1-20mg/kg范圍的劑量最常用。對于急性治療如在移植之前或移植過程中或者針對移植排斥開始的任何跡象時，有效的抗體劑量范圍是約1mg/kg體重到約20mg/kg體重，每天施用并維持約1到5天時間，優(yōu)選地通過大劑量靜脈注射。相同的劑量和給藥方案可以用于維持藥量方案的負荷期，維持期包括靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)施用約0.1mg/kg體重到約20mg/kg體重范圍內(nèi)的抗體，在任何情況下的治療時間為每周到3月間隔。慢性治療也可通過維持方案進行，其中抗體以約0.1mg/kg體重到約20mg/kg體重的范圍通過靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑施用，劑量間隔從約1周變化到約3個月。此外，慢性治療可以通過間歇大劑量靜脈內(nèi)方案來實施，其中施用約1.0mg/kg體重到約100mg/kg體重的抗體，順序治療的間隔為1到6個月。除了間歇大劑量靜脈內(nèi)方案之外，所有給藥方案也可通過口腔、肺、鼻或皮下途徑。
如果需要，可以通過連續(xù)或與常規(guī)抗排斥治療劑或藥物如皮質(zhì)醇或免疫抑制劑聯(lián)合使用來增加抗體的有效性。選擇性地，抗體可以與常規(guī)藥物偶聯(lián)。這可以有利地允許常規(guī)藥劑以少于常規(guī)劑量的量施用，例如當該藥劑作為單一治療施用時少于常規(guī)劑量的約50％。因此，應(yīng)該避免了許多與該藥劑有關(guān)的副作用發(fā)生。
根據(jù)本發(fā)明所述的對移植排斥的結(jié)合治療包括一起使用抗CD40L抗體與靶向B細胞的藥劑如抗CD19、抗CD28或抗CD20抗體(未偶聯(lián)或放射標記的)、IL-14拮抗劑、LJP394(LaJolla藥物受體阻斷劑)、IR-1116(Takeda小分子)和抗Ig獨特型的單克隆抗體。選擇性地，這些組合可能包括T細胞/B細胞靶向藥劑如CTLA4Ig、IL-2拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-6拮抗劑、受體拮抗劑、抗CD80/CD86的單克隆抗體、TNF、LFA1/ICAM拮抗劑、VLA4/VCAM拮抗劑、brequinar和IL-2毒素偶聯(lián)物(例如DAB)、脫氫可的松、抗CD3 MAb(OKT3)、mycophenolate mofetil(MMF)、環(huán)磷酰胺以及其它免疫抑制如鈣調(diào)磷酸酶信號阻斷劑，包括但不限于tacrolimus(FK506)。這些組合也可包括T細胞靶向藥劑如CD4拮抗劑、CD2拮抗劑和IL-12。
為了維持移植物的整合或者在抑制移植排斥急性事件之后的時期內(nèi)，如果必要，單獨或與常規(guī)抗排斥藥劑結(jié)合施用維持劑量的抗CD40L抗體。隨后，可以降低給藥的劑量或頻率或同時降低這二者。在無移植排斥體癥出現(xiàn)時，治療可以停止，但注意監(jiān)測移植排斥的體癥。在其它情況下，根據(jù)普通醫(yī)生的判定，例如可以以4周或更長間隔施行不定期治療。然而，根據(jù)疾病癥狀的任何復(fù)發(fā)，受體宿主可能需要長期的間歇治療。用于評估CD40CD154阻斷劑治療方案的臨床前模式系統(tǒng)用于測試CD40CD154阻斷化合物(例如，抗-CD40L化合物或CD154阻斷劑，如具有MAb 5c8特異性的MAb)效率的優(yōu)選模式系統(tǒng)實例是在先相關(guān)美國臨時S.N.60/050,267(06/20/97)中公開的靈長類動物(狒狒和/或彌猴)胰島同種異體移植模型，在此引用其內(nèi)容作為參考。已經(jīng)證明這些靈長類動物模型是免疫調(diào)節(jié)精確的測試方法它們對同種異體移植物功能中即使微小的變化都十分敏感或?qū)κ荏w損傷愈合和免疫系統(tǒng)功能的副作用十分敏感。此外，這些模型與人類腎臟移植有明顯的生物學(xué)相似性。具體地說，編碼MHC蛋白的基因在人類和用作模型基礎(chǔ)的靈長類動物之間高度保守，并且靈長類動物對血管化器官的排斥與臨床環(huán)境中見到的情形十分相似。胰腺切除術(shù)誘導(dǎo)糖尿病的狒狒ICT模型供體-受體對的鑒定將取自來自Mannheimer公司(Homestead，F(xiàn)L)的10只待用受體(狒狒，Papio hamadryas，雄性和雌性，1-2歲，約4.0kg)的外周血單核細胞(PMBC)用作一維混合淋巴細胞培養(yǎng)物(MLC)中針對來自11只雄性供體(大于2歲，購自Texas的Southwest Foundation)的PMBC的應(yīng)答者。狒狒MLC通過標準化的人類MLC方法進行。至于低背景和高特異性反應(yīng)性，與含有狒狒或胎牛血清的培養(yǎng)基相比，使用補加人類血清的培養(yǎng)基得到更好的結(jié)果。供體足夠大，即從1個供體獲取足夠的胰島和骨髓以允許移植給2個受體。與觀察到的適度MLC反應(yīng)相反，當將來自Mannheimer動物的PMBC用作MLC應(yīng)答者和刺激者時，這些動物之間的MLC反應(yīng)活性很高，所有待用受體針對刺激者產(chǎn)生≥10.0的刺激指數(shù)(S.I.)(供體，背景＜200-300記數(shù)/每分鐘，cpm)。試圖挑選對指定供體具有類似MLC反應(yīng)活性的2只受體，并且挑選具有不同程度同種異體反應(yīng)性的供體-受體對。認為＞10的MLC S.I是強反應(yīng)性并選為可接受的最小不匹配性；作為比較，當來自Mannheimer的動物用作供體和受體時，MLC S.I通常不到5。胰島/骨髓的制備和施用用Liberase(0.47mg/ml膠原酶溶液，得自Boehring-Mannheim，Indianapolis，IN)通過對人胰島分離自動方法(Ricordi等，糖尿病37，413-420，1988；Selvaggi等，移植方法291967-1968，1997)的微小修改在ICT前一天(即在-1研究日)從胰腺分離胰島。胰腺冷卻缺血時間平均0.5±0.1小時。將胰島富集于3層不連續(xù)的Euroficoll梯度(1.108，1.096，1.037)中，其中經(jīng)消化的胰腺組織鋪于1.108底層。使用細胞分離器(COBE 299 1，COBE，Lakewood，CO)離心該梯度(Robertson，Chadwick，Contrator，James，London糖尿病學(xué)報3093-98，1993)。按如下測定獲得的胰島的數(shù)目、體積與純度將最終的胰島制品懸浮于250ml RPMI 1640溶液中，將三份100μl的樣品雙硫腙染色(Latif等，移植45827-830，1988)并且記數(shù)以分析總胰島產(chǎn)量，并且將數(shù)據(jù)進行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換以測定具有150pm平均直徑的胰島(胰島等價物，IEQ)總數(shù)(Ricordi等，Acta Diabetol.Lat.27185-195，1990)。
對于增強耐受性的研究，從胰腺供體獲取椎體并且基本上根據(jù)對人椎體的處理方法的常規(guī)改進來處理以得到供體骨髓細胞(DBMC)。對于供體骨髓的受體，在ICT后在第5天和第2天進行輸注。每kg受體體重施用共109個有核細胞的劑量。動物的約束對于化學(xué)約束，將鹽酸開他敏注射入臀肌中(10mg/kg體重)。通過以5mg/kg劑量施用鹽酸開他敏而實現(xiàn)鎮(zhèn)靜狀態(tài)的延長。如果動物對捏腳趾刺激有反應(yīng)，就再施用額外的開他敏。因為以前的研究已經(jīng)表明開他敏降低對葡萄糖的一期胰島素反應(yīng)(FPIR)，所以在所有代謝測試中的開他敏劑量維持盡可能低(Lehmann等，靈長類動物醫(yī)學(xué)雜志.26312-321，1997)。維持超過30分鐘時間的滿意安靜狀態(tài)的總劑量為35±2mg/kg。在通過開他敏鎮(zhèn)靜的同時將動物身體固定。用betadine和酒精輪流洗擦來準備手術(shù)和血管穿透位點。將留置導(dǎo)管置于靜脈內(nèi)并且加以固定。胰腺切除術(shù)和ICT在ICT的那一天(0研究日)，離心胰島制品并且將沉淀重新懸浮于補充的CMRL 1066中，然后在22℃培養(yǎng)過夜。移植前，離心該制品并且將沉淀重新懸浮于20ml含有2.5％供體血清和200IU肝素的RPMI 1640溶液中。移植前立即測定IEQ的數(shù)目。完整胰腺切除按照已經(jīng)成熟的外科技術(shù)進行。完成完整胰腺切除后，將20G血管導(dǎo)管插入一根門靜脈的腸系膜血管分支中，并且通過在10分鐘內(nèi)重力輸注胰島制品來實現(xiàn)ICT。免疫抑制和術(shù)后看護選擇FK506(tacrolimus)作為免疫抑制劑，因為該藥劑目前用于人類ICT。FK506施用在ICT之前5天開始。將0.1mg/kg/天的劑量肌內(nèi)施用給受體狒狒。每日監(jiān)測藥物水平并且調(diào)整劑量以維持約15ng/ml低水平。在研究日-1、3和10時以10或20 mg/kg劑量施用人化抗-CD154(源自MAb 5c8，Lederman等，實驗醫(yī)學(xué)雜志1751091-1101，1992)，并且通過ELISA測定5c8和抗-5c8的血清水平。
手術(shù)后第1天(研究日1或POD1)，對狒狒進行靜脈內(nèi)流體給藥。隨后以每天含有60g碳水化合物的食物喂養(yǎng)動物，包括45g猴餅干(補加viokase)和15g水果。根據(jù)以抗-CD154處理的頭2只動物的經(jīng)驗，以后的狒狒在胰島移植后14-20天時期以小劑量皮下胰島素(每天約0.5U/kg體重)治療以防止胰島“衰竭”，由此成功移植必需的條件得到優(yōu)化。監(jiān)測通過足后跟穿刺和用Glucometer Elite測試血來監(jiān)測禁食和攝食后的血葡萄糖(分別為FG和PPG)，并且至少每周一次，采集血液樣品以獲得血漿以便用Beckman葡萄糖分析儀進行FG水平的測定。一般也提取血液樣品以證實異常高的讀數(shù)。在抗-CD154研究中，每次MAb劑量之前(-1天之前以及正好在抗體給藥之前3和5天)從所有動物抽取血液樣品并且此后每周抽取。在移植后約3個月時，測試減少至隔周進行。將血液樣品用于對外周血鑒定表型以分析淋巴細胞亞型和測定CBC和化學(xué)、5c8和抗-5c8水平、胰島素和C肽水平以及嵌合現(xiàn)象。周期性取血用于重新測定MLC對供體和第3組抗原的反應(yīng)性。分析血漿胰島素通過兩種方法進行測定(Linco Research，Inc.，St.Charles，MO)。測定低限為20pmol/l并且平均分析內(nèi)系數(shù)變化為6％。分析血漿中的C-肽，其測定低限為6％并且分析內(nèi)系數(shù)變化為6％。用葡萄糖分析儀(Beckman Instruments，Palo Atto，CA)測定血漿葡萄糖。用EliteGlucometer(Bayer，Elkhard，IN)測定毛細血管全血葡萄糖水平。通過將稀釋血清中的胰島素濃度與胰島素標準曲線比較來證明對狒狒胰島素分析的有效性。用雙抗體分析(DPC，Los Angeles，CA)測定胰高血糖素。以前已通過系列稀釋證明了這些商業(yè)試劑盒的有效性(Goodner等，糖尿病38925-931，1989)。靜脈內(nèi)葡萄糖耐受性測試(IVGTT)以前已經(jīng)證明體內(nèi)胰島細胞功能測試能得到β細胞量改變的準確反映(McCulloch等，糖尿病40673-679，1991)。按照前述(Lehmann等，靈長類動物醫(yī)學(xué)雜志26312-321，1997)在禁食過夜16到18小時后進行靜脈內(nèi)葡萄糖耐受性測定。簡言之，在-10、-5和0分鐘收集血液樣品。然后以0.5g葡萄糖/kg體重將50％葡萄糖溶液在超過20秒的時間內(nèi)注射入隱靜脈。在注射后1、3、5、7、10、15、20、25、30分鐘從對側(cè)股動脈中收集1.5ml樣品。因此，在40分鐘時間內(nèi)抽取共12個血液樣品。將這些樣品吸入含有0.05ml 15％流體EDTA和0.2ml抑肽酶(500K.I.U.抑酶肽/ml血液)的玻璃管中，置于冰上，并且在10分鐘內(nèi)離心。然后將血漿冷凍于-80℃并隨后分析葡萄糖、免疫反應(yīng)性胰島素和胰高血糖素。統(tǒng)計分析和計算結(jié)果表示為平均值±SEM。葡萄糖消失常數(shù)(Kg)根據(jù)IVGTT計算為10到30分鐘之間loge(ln)血漿葡萄糖的下降斜率。對葡萄糖的急性胰島素反應(yīng)(AIRG)計算為IV葡萄糖注射后1到10分鐘之間胰島素曲線下增加的面積(AUC)。根據(jù)梯形法則減去從1到30分鐘的基值來計算增加的反應(yīng)(AUC葡萄糖，AUC胰島素)，數(shù)據(jù)用Statistica for Windows軟件(5.0版，1997，Statsoft，Inc.，Tulsa，OK，USA)加以分析。結(jié)果CD154阻斷治療延長胰島同種異體移植物的存活和功能所有狒狒在移植后立即變得血糖量正常。如下表1中所示，在無免疫抑制或CD154阻斷治療時，同種異體胰島的ICT在第8天時導(dǎo)致排斥。常規(guī)用FK506(單獨或與全骨髓或干細胞篩選出的骨髓聯(lián)合使用)的免疫抑制未能改善胰島的存活，其中動物分別在10、8和10天發(fā)生排斥。與之明顯相反，用抗-CD154(5C8)MAb治療的5只狒狒中的4只得到胰島同種異體移植物存活的延長，大大超過了對照或FK506治療的動物存活。此研究結(jié)果也在圖1中以線性圖表示，該圖將禁食血葡萄糖(FG)作為POD功能的函數(shù)作圖。此結(jié)果第一次證明CD154阻斷治療延長了胰腺切除誘導(dǎo)的糖尿病非人類靈長類動物模型中胰島同種異體移植物的接受時間。顯然，這些結(jié)果也證實了抗-CD154治療逆轉(zhuǎn)急性排斥的能力。CD154阻斷治療可以與骨髓細胞移植結(jié)合應(yīng)用3只狒狒在POD 5和11接受全骨髓(n＝2)或干細胞選擇的骨髓(經(jīng)過Ceprate柱，Cellpro，BothelL，WA篩選)(n＝1)的延遲輸注。對這些狒狒給以5C8誘導(dǎo)治療(20mg/kg，-1、3和10天)，然后在POD 28開始進行每月維持治療。一只動物表現(xiàn)十分良好，直到POD 241仍然沒有排斥。對在POD 112出現(xiàn)排斥的第2只動物進行排斥治療并且維持到POD 162。對在70天排斥的第3只動物進行治療并且維持到POD 124。CD154阻斷治療對移植物功能包括葡萄糖代謝調(diào)控的影響在對照動物中重復(fù)IVGTT表明一期胰島素分泌(FPIS)的良好可重復(fù)性。特別地，在79天施行無痛死亡的動物中進行的一次葡萄糖耐受性測試(IPGTT)和免疫組織化學(xué)分析顯示出肝臟中有功能的移植組織，在肝外位點無殘余胰島素產(chǎn)生。在該研究中的其它動物中發(fā)現(xiàn)有功能性胰島同種異體移植物，其中移植物存活在＞125到＞220天之間。胰腺切除術(shù)和胰島移植后4到16周重復(fù)的IVGTT在所有動物中表現(xiàn)幾乎相同的Kg值，高達術(shù)后8周。在注射時以hu5c8治療的狒狒中，Kg值的確在此后下降。在以維持劑量的hu5c8治療的狒狒中觀察到穩(wěn)定值。通過FPIS估計的胰島數(shù)目隨著每次排斥在一段時間內(nèi)減少。相反，對處于hu5c8維持治療的動物在胰島移植后的FPIS(隨后多達16周)得到很好保持。也研究了2只對照動物。在一些IVGTT中，技術(shù)問題促使較以前研究施用更多開他敏，這導(dǎo)致降低的Kg值和FPIR。然而，給以標準劑量的開他明后，這些指數(shù)恢復(fù)正常。
在本發(fā)明研究過程中發(fā)現(xiàn)移植排斥在FG上升之前可通過分析2小時PPG來加以測定。在組織學(xué)上，胰島移植排斥定義為2次連續(xù)FG大于250mg/dl。因此，無論是用CD154阻斷劑或常規(guī)抗排斥藥劑，抗排斥治療的應(yīng)用可以在排斥過程足夠早地應(yīng)用以允許挽救代謝上存活的移植組織。為了通過hu5c8挽救受排斥的移植物，重復(fù)用于誘導(dǎo)移植接受的相同劑量方案。狒狒研究的結(jié)論前面的研究證明hu5c8促進胰島的移植，允許同種異體胰島的長期存活，并且對胰島素分泌或整體胰島素敏感性無不利影響。此外，這些研究第1次確定移植可以維持，并且用CD154阻斷治療逆轉(zhuǎn)大型動物模型中的胰島排斥癥狀是可能的。因此，在此所述的治療方案可以導(dǎo)致在大型動物中以ICT前的水平保持胰島素分泌和整體胰島素敏感性。
表1.用抗-CD154延長非人靈長類動物同種異體移植物的存活
a)接受減少劑量的5c8b)動物34R；在POD 79宰殺，具有部分功能，在POD 58經(jīng)歷了排斥事件，排斥事件成功地得到逆轉(zhuǎn)c)動物12R；在POD 302宰殺，具有部分功能，在POD 59開始經(jīng)歷了6次得到成功治療的排斥事件d)動物29R；在POD 300宰殺，完全排斥，經(jīng)歷了1次排斥事件e)動物14R；在POD 301宰殺，具有部分功能，在POD 31開始經(jīng)歷了4次得到成功治療的排斥事件f)在POD 130宰殺，完全排斥g)在POD 253宰殺，具有部分功能h)下面討論i)由于部分的腸道阻塞，在POD 16胰島素獨立性消失胰腺切除術(shù)誘導(dǎo)糖尿病的彌猴ICT模型除非特別說明，所有方法基本與上述狒狒模型研究相同。動物方法
2-7歲的SPF彌猴可容易地從COVANCE(Alice，TX)或MannheimerFoundation，Inc.(Homestead，F(xiàn)L)或類似商家獲得。買入時，檢查所有猴子以測定其基本健康、身體狀況和心理狀態(tài)。所有外科步驟在無菌條件下進行。手術(shù)前讓動物禁食12-18小時，并且將用肌內(nèi)開他敏(10mg/kg)和阿托品(0.04mg/kg)對其進行預(yù)麻醉。一旦動物安靜下來，立即安裝氣管內(nèi)插管和靜脈內(nèi)導(dǎo)管。氣管內(nèi)插管用于保護氣道并提供緊急藥物的方便入口。用異氟烷(isoflurane)和氧氣的組合物麻醉動物。在整個ICT操作過程中以10ml/kg/小時速率通過導(dǎo)管輸注注射用正常鹽溶液。
進行中縫切開以達到腹部器官。對于供體和受體動物，進行完全胰腺切除術(shù)并保留十二指腸。通過常規(guī)方法從供體胰腺分離胰島用于隨后移植入切除胰腺的糖尿病猴子內(nèi)。在麻醉狀態(tài)下對供體放血后，借助Striker Saw沿腹部切口取出椎體。立即處理該骨頭以取出骨髓。在有些受體中，用帶有濾膜的y型血液裝置將骨髓細胞經(jīng)頭靜脈輸注入受體中。
受體動物的胰腺切除術(shù)后，在腸系膜靜脈的上或下分支中插入導(dǎo)管并且借助重力驅(qū)動將胰島輸注入肝臟中。之后，按照常規(guī)手術(shù)技術(shù)縫合手術(shù)切口。手術(shù)結(jié)束時，將動物置于僅有氧氣中并且當動物充分復(fù)蘇而能夠控制氣道時取出氣管內(nèi)插管。ICT后，將受體置于ICU籠內(nèi)并且進行觀察直至它們在臨床上達到穩(wěn)定。手術(shù)后給以抗生素(Baytril)(肌內(nèi)5mg/kg，q24小時，5天)。必要時使用Bupomorphine(肌內(nèi)0.05mg/kg)作為鎮(zhèn)痛劑。
手術(shù)后使猴子禁食并且在PODlp.o.給以給他力(gatorade)。在POD2，它們開始每日2次軟飲食，包括香蕉和(用水)軟化的含有viokase的高蛋白猴食品(I份香蕉加4片餅干)。正常飲食在POD3恢復(fù)(6-8片餅干加水果，含有viokase，每日2次)。每只動物單獨喂養(yǎng)以避免攝食過程中的競爭。人工喂養(yǎng)病猴以改善其基本健康和營養(yǎng)。重病動物將單獨治療直到它們恢復(fù)健康。經(jīng)檢查為將死或不可治療的猴子通過經(jīng)靜脈內(nèi)導(dǎo)管快速注射氯化鉀而殺死。檢測用于葡萄糖和胰島素監(jiān)測、免疫監(jiān)測等的采血在任何時間不超過體重的1％或者在1個月內(nèi)不超過體重的7％。通過用柳葉刀刺破足后跟獲得一小滴血放在葡萄糖測定紙條上測定禁食血葡萄糖(FG)水平。在某些情況下，例如葡萄糖看來高時(＞200mg/dl)，進行靜脈穿刺以得到血漿樣品用于在Beckman葡萄糖分析儀上進行分析。也在移植之前或移植間隙提取血樣以分析受體的抗供體免疫反應(yīng)性。按照上述在移植前以及之后4-6周內(nèi)進行靜脈內(nèi)葡萄糖耐受性測試(IVGTT)。結(jié)果CD154阻斷治療延長了糖尿病彌猴和狒狒中胰島同種異體移植物的存活和功能如上表1中所示，本研究證明hu5c8單獨治療延長了第2種非人類靈長類動物中胰島同種異體移植物的接受時間。此研究在研究日-1、0、3和10使用hu5c8給藥的誘導(dǎo)接受方案。為了維持血清的hu5c8水平，接下去是每月的維持接受方案。這些結(jié)果(也在圖2中列出)令人吃驚有功能的胰島同種異體移植物得到維持而無排斥癥狀發(fā)生。此發(fā)現(xiàn)結(jié)果的顯著性通過比較圖3中列出的數(shù)據(jù)而得到加強，圖3中除了彌猴研究動物，還顯示了患DM并且目前正在接受強化胰島素替代治療的病人(稱為LAURA)的FG圖。LAURA在14個月年齡時診斷患有DM，并且在研究時為6歲并且每日接受2到3次胰島素注射。等價物本發(fā)明可以體現(xiàn)在其它特定形式中而不背離本發(fā)明精神或基本特征。因此，應(yīng)當認為前述實施方案是在此公開的本發(fā)明所有方面的舉例說明而不是對其進行限定。因此本發(fā)明的范圍通過附屬的權(quán)利要求而不是前面的描述來說明，并且認為在這些權(quán)利要求含義和相同范圍內(nèi)的所有改變也應(yīng)當包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抑制移植受體對產(chǎn)生胰島素組織移植物排斥的方法，包括給移植受體施用有效量CD40CD154結(jié)合阻斷劑的步驟。
2.一種延長移植受體中移植的產(chǎn)生胰島素組織存活的方法，包括給移植受體施用有效量CD40CD154結(jié)合阻斷劑的步驟。
3.一種逆轉(zhuǎn)移植受體對移植的產(chǎn)生胰島素組織排斥的方法，包括給移植受體施用有效量CD40CD154結(jié)合阻斷劑的步驟。
4.一種保持移植受體中移植的產(chǎn)生胰島素組織功能的方法，包括給移植受體施用有效量CD40CD154結(jié)合阻斷劑的步驟。
5.一種恢復(fù)移植受體中受損的產(chǎn)生胰島素組織功能的方法，包括給移植受體施用有效量CD40CD154結(jié)合阻斷劑的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中CD40CD154結(jié)合阻斷劑是CD154(CD40L)阻斷劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中CD154阻斷劑是單克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中單克隆抗體具有ATCC保藏號HB10916產(chǎn)生的5c8抗體的抗原特異性結(jié)合特征。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中產(chǎn)生胰島素的組織是完整的胰腺組織或分離的胰島。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中產(chǎn)生胰島素的組織是細胞種群，包括分離的成年胰島β細胞、分離的胎兒胰島β細胞、培養(yǎng)的胰島素β細胞或無限增殖化的胰島β細胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中產(chǎn)生胰島素的組織是細胞種群，其包括可穩(wěn)定或可誘導(dǎo)表達胰島素基因的宿主細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中產(chǎn)生胰島素的組織通過免疫分離器在物理上與受體組織分開。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中免疫分離器包括分隔放置產(chǎn)生胰島素組織的分離室的半透屏障。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中免疫分離器是膠囊或微膠囊。
15.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中產(chǎn)生胰島素組織對于移植受體是同種異體的。
16.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中產(chǎn)生胰島素組織對于移植受體是異種的。
17.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中移植受體是人類。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中移植受體患葡萄糖代謝調(diào)控損傷。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中移植受體患糖尿病。
20.一種恢復(fù)需要的哺乳動物中葡萄糖代謝調(diào)控的方法，包括以下步驟a)將有效量產(chǎn)生胰島素組織移植給哺乳動物；并且b)給該哺乳動物施用有效量CD40CD154結(jié)合阻斷劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中CD40CD154結(jié)合阻斷劑是具有ATCC保藏號HB 10916產(chǎn)生的5c8抗體的抗原特異性結(jié)合特征的單克隆抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中單克隆抗體在組織移植前施用。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，包括在組織移植后2周時間內(nèi)重復(fù)施用該單克隆抗體至少2次的額外步驟。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，包括在組織移植后重復(fù)施用該單克隆抗體至少一月的進一步額外步驟。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，包括在組織移植后至少2個月開始每月重復(fù)施用該單克隆抗體的進一步額外步驟。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，包括以下額外步驟c)給該哺乳動物輸注有效量耐受劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中耐受劑是與產(chǎn)生胰島素組織MHC相容的骨髓組織。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中耐受劑是與產(chǎn)生胰島素組織同源的骨髓組織。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中骨髓組織是完整的骨髓。
30.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中骨髓組織是CD34(+)造血細胞種群。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中CD34(+)造血細胞是CD40(-)。
32.一種測定哺乳動物中葡萄糖代謝調(diào)控損傷的方法，包括以下步驟a)在哺乳動物攝食后至少一小時并且不到6小時時從該動物提取第一批含血樣品；b)分析第一批樣品中血的葡萄糖含量；并且c)測定第一批樣品的葡萄糖含量是否超過約150mg/dl。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中樣品在該哺乳動物攝食后約2小時提取。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，包括以下額外步驟d)在提取第一批樣品后至少約24小時并且在該哺乳動物攝食后至少一小時并且不到6小時時從該動物提取第二批含血樣品；e)分析第二批樣品中血的葡萄糖含量；并且f)測定第二批樣品的葡萄糖含量是否也超過約150mg/dl。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中第二批樣品在該哺乳動物攝食后約2小時提取。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中哺乳動物患血液葡萄糖代謝的亞臨床損傷。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中哺乳動物有患糖尿病的危險。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中哺乳動物是同種異體或異種產(chǎn)生胰島素組織的受體。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中哺乳動物是人類。
全文摘要
本發(fā)明提供抑制移植受體對產(chǎn)生胰島素組織排斥的組合物和方法以及延長移植存活或功能、逆轉(zhuǎn)移植排斥或恢復(fù)損傷移植物功能和誘導(dǎo)對移植的產(chǎn)生胰島素組織的免疫耐受性的方法和組合物。本發(fā)明方法和組合物適于治療或預(yù)防血葡萄糖自身穩(wěn)定代謝調(diào)控中的缺陷,包括表現(xiàn)為糖尿病(DM)的缺陷。
文檔編號A61P37/06GK1261286SQ98806441
公開日2000年7月26日 申請日期1998年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月20日
發(fā)明者N·S·凱尼昂, C·瑞科迪, D·W·索馬斯, L·布克利 申請人:拜奧根有限公司, 邁阿密大學(xué)