專利名稱：多肽、蛋白和核酸的穩(wěn)定的藥用施用形式的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于藥用或診斷用的凍干組分，包括蛋白，肽，核酸或多糖。其中使用了輔劑從而使凍干物呈現(xiàn)不定形狀或部分不定形狀。
在過去的20年中，生物技術(shù)的進步使能夠大量獲得的生物分子的數(shù)量大大增加。這些生物分子在藥物治療中的應(yīng)用是尤為活躍的一個領(lǐng)域。例如，一些蛋白被用于調(diào)節(jié)獨特的細胞類型，核酸被用于調(diào)節(jié)基團表達，多糖被用于疫苗。由于冷凍保存的空間經(jīng)常是有限的，如果制備物能在室溫保存是在實踐中尤為有利的。
進而，對于溫度敏感的制備物需要在從冰箱中取出到藥用(如注射)之間的時間內(nèi)嚴格監(jiān)控，因為降解反應(yīng)可產(chǎn)生付產(chǎn)物，這會使其作用范圍產(chǎn)生不利變化。很難確保對制備物保存條件的連續(xù)監(jiān)測，這在普通的醫(yī)院里和對人的臨床研究中施用藥用制備物是尤難做到。
所有的生物分子都或多或少地能被水解。水解是天然代謝的一部分，并且，例如，對于防止高分子毒性物質(zhì)在體內(nèi)的積累是必須的。
進而，文獻中還描述了多種其它能不同程度地影響生物分子的降解反應(yīng)。對于肽或蛋白而言，這樣的降解反應(yīng)以聚集，變性，異構(gòu)化或氧化還原的形式發(fā)生。對于核酸而言則如脫氨作用或加入親核體導致核酸的降解。
對于，如，肽或蛋白的藥用或診斷用制備物的穩(wěn)定凍干物的制備，目前還沒有現(xiàn)成的方法可指導從多種可能的輔助物質(zhì)和添加劑選出可靠的輔助物質(zhì)以確保相應(yīng)的活性物質(zhì)形成穩(wěn)定的制劑。選自合適的輔助物質(zhì)以得到足夠穩(wěn)定的施用制劑，從而，如，保證充分和儲存穩(wěn)定性或延遲或防止前述的降解反應(yīng)，這種選擇通常是根據(jù)經(jīng)驗進行的。
已知許多蛋白的儲存穩(wěn)定性隨著水分的除去而提高。除去水分的合適的方法為凍干與真空干燥。然后這些技術(shù)過程的應(yīng)用也可能導致降解反應(yīng)物，如，在凍干中冰凍是必需的，然而許多蛋白對冰凍過程不夠穩(wěn)定。當生物多聚物的水溶液冷卻時，大部分水結(jié)晶而生物多聚物保持不定形狀態(tài)。這將導致生物多聚物的分子環(huán)境的改變，從而也造成生物多聚物的空間結(jié)構(gòu)或構(gòu)象發(fā)生變化。這可能另一方面通過，如，增加個別功能基團的反應(yīng)性或通過使相鄰的生物多聚物未折疊的鏈片段聚集從而消減降解反應(yīng)。并且，干燥時環(huán)繞蛋白質(zhì)的水層的除去可能導致蛋白鏈的化學反應(yīng)，如氧化，適當?shù)奶砑觿┛煞乐够驕p輕這些降解反應(yīng)的程度。
在凍干或真空干燥時，輔助物質(zhì)的一個重要功能是為生物多聚物提供一個穩(wěn)定的不定形環(huán)境，并在進一步冷卻時固化成玻璃態(tài)。這種轉(zhuǎn)化是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)以質(zhì)變的方式發(fā)生的，其特征為玻璃態(tài)溫度Tg′。分子的運動性以及反應(yīng)性在低于此溫度時大大降低。在非常適用于凍干的配方中，Tg′越高越好，并通常高于-40℃。不定形結(jié)構(gòu)的存在可以用，如差式熱量掃描法(DSC)，X-光衍射檢測或光學及電子顯微法檢測。
為了制造足夠穩(wěn)定的凍干施用藥劑，有必要選用在冰凍時不結(jié)晶或僅部分結(jié)晶的輔助物質(zhì)。這樣在冷干過程中保護生物分子的輔助物質(zhì)名為“冷凍保護劑”，在主干燥期冰晶體升華而在后干燥期結(jié)合在不定形相及分生物分子上的水被除去。后干燥期通常需要更強烈的條件(更高的溫度或更強的真空度)。Tg′隨著凍干物質(zhì)中的水分的減少而升高。為了減短干燥期的時間，凍干室中板溫度漸漸升高，但必須保持在Tg′以下。
在干燥期中，輔助物質(zhì)維持著包埋多聚物的玻璃態(tài)。并且，在后干燥期中水分子的除去導致了生物分子中形成氫鍵的自由價。這增加了生物分子的反應(yīng)性。加入適當?shù)钠鸱€(wěn)定作用的輔助物質(zhì)的目的是形成氫鍵從而為生物分子提供 水取代(Wasserersatz)環(huán)境。為此引入“冷凍保護劑“這個術(shù)語。
儲存中許可溫度的上限是由玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度Tg決定的，高于此溫度分子的運動性大大增加。這導致結(jié)晶過程(特征為結(jié)晶溫度Tk)或化學反應(yīng)。宏觀上這經(jīng)常導致所謂的凍干餅的塌垮(特征為塌垮溫度Tc)，這里由于輔助物質(zhì)的分子彼此結(jié)合并進而伴隨著輔助物質(zhì)基架的比表面積減小造成的。
凍干物中的水使Tg減??；在優(yōu)良的配方中，凍干后的殘留水量低于3％。然后水的含量在較長的儲存過程中可能有所增加。為了保留充分安全的余地，玻璃態(tài)凍干物的儲存溫度應(yīng)低于Tg最高20℃。
WO 93/00807描述了一種在凍干中起穩(wěn)定作用的雙成分系統(tǒng)，包含一種結(jié)晶保護劑(如聚乙二醇，PVP或淀粉/或一種凍干保護劑(如蔗糖，多羥基醇或氨基酸)用于在凍干中起穩(wěn)定作用。
眾所周知玻璃態(tài)形成的傾向隨著分子量的增加而增加。因此使用多聚物如PVP，蛋白(尤其是血清白蛋白)或多糖(Dextran)以形成穩(wěn)定的玻璃態(tài)基架。
然而，已知象血清白蛋白這樣的保護蛋白在注射后是不利的，因為它們能誘導抗體的形成，這不利于它們在非腸道施用制劑中的應(yīng)用。并且原材料不同的不同批次的保護蛋白引入了不確定性，因為這些差異會負面影響加工能力以及生產(chǎn)出的產(chǎn)品批次的質(zhì)量。
進而，用作輔助物質(zhì)的多糖在血液循環(huán)中可具有致熱原性效應(yīng)。多糖的另一缺點是它們經(jīng)常需要溶脹，在凍干物復(fù)原時很難快速形成清亮的溶液。并且，這種材料通常是由不同鏈長的組分組成的，不同批次之間更難保持一致。后一點對于合成的多聚物如PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。
從前生物分子凍干中用于形成玻璃態(tài)的小分子物質(zhì)幾乎全是多烴基復(fù)合物如糖類(蔗糖、海藻糖，葡萄糖)或糖醇(甘露醇)，然而，加入甘露醇只能形成亞穩(wěn)玻璃態(tài)，在儲存中會形成結(jié)晶。
還原糖如葡萄糖或麥芽糖可能導致基團反應(yīng)或氧化還原反應(yīng)并與氨基(如，蛋白中的，形成Amadori產(chǎn)物，并且美拉德反應(yīng)(MaillardReaction)可使制備物變成褐色。非還原糖或三糖可能水解從而一方面形成還原糖，另一方面可潛在地損壞輔助物質(zhì)基架的物理特性。已知糖醇如甘露醇能催化水解反應(yīng)，比如，在乙酸鹽存在的情況下。并且它們有結(jié)晶的傾向。盡管如此，甘露醇/基氨酸/(優(yōu)選地磷酸，去污劑)復(fù)合物經(jīng)常用作凍干蛋白的輔助物質(zhì)基質(zhì)(如，EP 0 597 101，WO89/09614)。
制備足夠干的糖制備物中的其它缺點或問題是干燥時間大量延長，這是由于所使用的生物材料的穩(wěn)定性決定了只可能輸入很少的熱量。過長的處理時間在商業(yè)上是不利的，并且增加了加工中的危險，如真空室的泄露，冷卻系統(tǒng)可能出故障，等等。
人們很驚奇地發(fā)現(xiàn)，某些輔助物質(zhì)的連用適合用于生物分子凍干中形成玻璃態(tài)。因此本發(fā)明是關(guān)于包含，以下成分的凍干制備物(a)選自蛋白，肽，核酸和碳水化合物組成的一類生物分子；(b)一種或多種堿性D-氨基酸或L-氨基酸；和
(c)一種或多種氨基二羧酸，羥基羧酸，羥基二羧酸，或雙羧基酸或生理上可耐受的鹽。其中此處的出現(xiàn)在凍干物質(zhì)的輔助物質(zhì)至少部分是不定形狀態(tài)。也可選擇加入一種或幾種中性氨基酸使之易于干燥并改善凍干餅的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
輔劑的選擇使得凍干物中的輔劑或者是完全不定形的或者是至少部分不定形的。與結(jié)晶成分相反，這樣的凍干物具有高于儲存溫度的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度(Tg)。輔劑的適當復(fù)合物為包含(A)組和(B)組中至少一種物質(zhì)的混合物，其中(A)是堿性D-氨基酸或L-氨基酸，而(B)是氨基二羧酸，尤其是酸性的D-氨基酸或L-氨基酸，氨基羧基酸，單羧基酸，雙羧基酸，或羥基二羧酸或生理可耐受的鹽。這樣的混合物適用于生物分子凍干中的玻璃態(tài)形成物質(zhì)。這樣的優(yōu)點是這樣制備的凍干物在很長的一段時期內(nèi)穩(wěn)定。所需的穩(wěn)定期的長短決定了所用的生物分子的穩(wěn)定性，優(yōu)選地至少為一年，具體而言是在冷凍溫度或室溫一至兩年。這可允許減少使用或完全避免使用上述較不穩(wěn)定的類別的物質(zhì)，從而生產(chǎn)藥用施用制備物時，使用上述類別的物質(zhì)帶來的缺點可很大程度地被避免。根據(jù)本發(fā)明制備凍干物的另一優(yōu)點是干燥時間大大縮短，尤其是在使用疏水氨基酸時少于30小時，優(yōu)選地少于24小時，尤其優(yōu)選地少于15小時。這意味著凍干過夜即可制備干燥物，而不是需要干燥幾天。
選擇包含堿性氨基酸以及調(diào)節(jié)pH所要求的抗衡離子，以便凍干過程中形成至少部分不定形的基架，上述基架具有大于50℃的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，優(yōu)選地大于65℃，尤為優(yōu)選地大于80℃，這樣即可得到藥用上穩(wěn)定的凍干物。冷凍的溶液的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度如果大于-40℃對于生產(chǎn)過程是有利的。
為了調(diào)節(jié)pH值，也可另外使用生理上可耐受的酸或堿及其鹽，合適的酸為無機或有機酸，如磷酸，醋酸等。優(yōu)選使用自由酸或堿以便凍干物中的鹽濃度盡可能低。對于一些蛋白和肽而言，如果磷酸的含量大于5mM在制備待凍干的溶液時會發(fā)現(xiàn)蛋白在磷酸精氨酸中聚集。當使用精氨酸檸檬酸(c＝10mM)時也會發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。令人驚奇的是，當使用單羧基本或雙羧基酸代替精氨酸的磷酸鹽作為抗衡離子時可減少聚集或很大程度上避免。使用氨基二羧酸(例如，酸性的D-氨基酸或L-氨基酸)或雙羧基酸時凍干物具有尤其穩(wěn)定的玻璃態(tài)。使用堿性氨基酸時，可選擇加入濃度小于5mM的磷酸以在pH 5-7之間微調(diào)值。
進而，根據(jù)本發(fā)明的施用形式還具有這樣的優(yōu)點。即玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度以及凍干餅的外觀進一步得以改善，這在另加入中性氨基酸時尤為顯著，縱然中性氨基酸部分結(jié)晶時也是如此。這種氨基酸的量可在很大范圍內(nèi)變動(輔劑總量的5-50％)。
根據(jù)本發(fā)明的施用形式的優(yōu)點在于室溫長時間保存時它們是穩(wěn)定的。這樣縱然在冷藏環(huán)節(jié)出現(xiàn)中斷時也能保證藥用制備物的安全使用。
本發(fā)明中的合適的添加劑或輔劑在一個優(yōu)選的實施例中是堿性，酸性與及至少一種中性氨基酸的復(fù)合物。這些復(fù)合物的成分在生理上是可高度耐受的，具有良好的凍干特性并改善凍干生物多聚物的熱穩(wěn)定性。并且用水溶解凍干物時能迅速得到清亮的溶液。
在本發(fā)明的意義上合適的堿性氨基酸是生理可耐受的，具有堿性側(cè)鏈的氨基酸，如組氨酸、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸，或瓜氨酸。相應(yīng)地，合適的中性氨基酸是生理上可耐受的，具有疏水性或親水性側(cè)鏈的氨基酸，如苯丙氨酸，甘氨酸，亮氨酸，或異亮氨酸，合適的酸為相應(yīng)的氨基二羧酸，羥基羧酸，羥基二羧酸，雙羧基酸，或它們的生理上可耐受的鹽，如天冬氨酸或谷氨酸。如果這些酸具有手性中心，可以使用消旋體或甚至光學活性衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的添加劑的量優(yōu)選地選擇使得凍干物中(c)組(氨基二羧酸，羥基羧酸，或雙羧基酸)與(a)組的D-或L-堿性氨基酸的重量比在0.1∶1到2∶1的范圍內(nèi)。從0.1∶1到1∶1的范圍，尤其是0.5∶1是尤為有利的。
在本發(fā)明的意義上，許多蛋白與多肽可考慮用作根據(jù)本發(fā)明的用于生產(chǎn)藥用施用形式的活性物質(zhì)，如免疫調(diào)節(jié)因子，淋巴因子，單核因子，細胞因子，酶，抗體，生長因子，生長抑制因子，血液蛋白，激素，疫苗，血液凝集因子和相應(yīng)的前體蛋白，以及它們的突變蛋白和片段。肽或蛋白的分子量在0.5～500KD，優(yōu)選地在2.0～200KD之間。例子如以下的蛋白或肽心鈉素或ANP(cf.WO.85/33768)，尿舒張肽(cf.WO 85/02850)，BNP(腦鈉尿肽)，耳素(Auriculin)，干擾素，集落刺激因子，白介素(IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4，等等)。巨噬細胞刺激因子，B細胞因子，尿激酶，纖溶酶原激活劑，TNF，NGF，促紅細胞生成素，EGF，hGH，BMP(骨形態(tài)發(fā)生因子)，降鈣素，胰島素或松弛素。
核酸如質(zhì)粒，DNA片段或RNA鏈也適于發(fā)明形式的施用。
根據(jù)本發(fā)明凍干的藥用施用形式特別適合于以液體形式通過非腸道途徑施用。
以下的實施例用于示明本發(fā)明，1并在隨后加以簡述。作為生物分子凍干的玻璃態(tài)形成劑，這些配方已被發(fā)現(xiàn)很大程度上提高玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，防止生物分子的聚集，改善凍干餅的外觀，并有利于凍干的生物分子的熱穩(wěn)定性，列出的配方表明，只有根據(jù)本發(fā)明的混合物能得到既定的效果，即它們能在一較短的凍干過程中得到全部或不定形結(jié)構(gòu)的蛋白制劑。
在隨后的例子中的濃度指的是凍干前的溶液的濃度。實施例1
溶液的pH值用磷酸調(diào)至pH 7.4。
2g L-精氨酸和1g L-天冬氨酸溶于50ml水中，用移液器往此溶液中加入35mg G-CSF(溶于30ml 10mM磷酸緩沖液中)并攪拌5分鐘，然后用移液器加入100μl吐溫80(10％的水溶液)并連續(xù)攪拌20分鐘。用磷酸將pH值調(diào)至7.4并定量至100ml。將溶液過濾通過濾膜(PVDF濾膜0.22μm)并分裝到玻璃瓶中，每瓶1ml。蓋了合適的塞子后凍干，干燥總共進行40小時。然后密封并儲存在不同的溫度直到分析。通過DSC發(fā)現(xiàn)凍干餅的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度為95℃。26個星期之后記錄了不同儲存條件的凍干物樣品的X-射線衍射譜。這些衍射譜表明縱然在60℃儲藏的樣品仍是不定形的。實施例2(對照實驗)
溶液用NaOH調(diào)至pH 7.42g纈氨酸和2g甘氨酸溶于50ml水中。用移液器加入100μl吐溫80(10％的水溶液)并繼續(xù)攪拌20分鐘。然后加入NaOH調(diào)pH值到pH 7.4。用移液器加入35mg G-CSF(溶于30ml 10mm的磷酸緩沖液中)并攪拌5分鐘。復(fù)檢pH值并定容至100ml。在裝入小瓶后如實施例1從該溶液制備凍干物。在制備之后立即用DSC檢測，沒有發(fā)現(xiàn)玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度。X-光衍射和電鏡觀察表明凍干餅完全是晶體。沒有檢測到不定形的或部分不定形的結(jié)構(gòu)。實施例3(對照實驗)
溶液用NaOH調(diào)pH值至7.4。1g纈氨酸和2g甘氨酸溶于70ml水中，加入100μl吐溫80(10％水溶液)并攪拌20分鐘。然后加入NaOH將pH值調(diào)至pH 7.0。用移液器往溶液中加入30mg(15kU)LDH(豬肌肉，溶于20ml 20mM的磷酸緩沖液中)并攪拌5分鐘。復(fù)檢pH值定容至100ml。裝入瓶中后按實施例1制備此溶液的凍干物。這種配方也完全結(jié)晶。沒有檢測到不定形的結(jié)構(gòu)。實施例4
用磷酸調(diào)溶液的pH值至7.4。
2g L-精氨酸，1g天冬氨酸和1g L-苯丙氨酸溶于70ml水中，加入100μl吐溫80(10％水溶液)并攪拌20分鐘，加入磷酸將pH值調(diào)至7.4。用移液器往溶液中加入50mg(15kU)LDH(豬肌肉，溶于30ml 100mM磷酸緩沖液中)并攪拌5分鐘。復(fù)檢pH值并定容至100ml。裝入瓶中后，如實施例1所描述的從上述溶液制備凍干物。分析顯示部分苯丙氨酸顯現(xiàn)晶體形式，即凍干餅是部分晶體，部分不定形的。晶體部分在儲存中保持穩(wěn)定。實施例5將樣品瓶在室溫(RT)儲存后利用RP-HPLC確定配方1和配方2中的未改變的G-CSF量
樣品瓶在室溫儲存(5或13個星期)之后利用兩個光學測試測定配方3和配方4的酶活。
實施例6凍干物的制備與實施例4類似，但精氨酸為相同摩爾量的其它堿性氨基酸代替。室溫儲存5個星期后測定了LDH的酶活
實施例7
溶液的pH值用酸調(diào)至6.3(見下文)2g L-精氨酸溶于50ml水中并加入酸將pH值調(diào)至6.3。加入1g異亮氨酸和1mg rhNGF并用水定容至100ml。將該溶液過濾通過膜(PVDF濾膜0.22μm)并分裝至玻璃瓶中每瓶1ml，蓋上合適的塞子后凍干，總干燥時間約為40小時。然后用PSC測量凍干物。結(jié)果<
>實施例8(對照實驗)
>溶液的pH值用磷酸調(diào)至6.0。
2g L-精氨酸溶于50ml水中并加入磷酸調(diào)pH至6.0。用移液器加入100mg尿舒張肽(溶于30ml水中)并攪拌10分鐘、60分鐘之后溶液變混濁并且蛋白絮凝。此后即中止實驗。實施例9(參照實驗)<
溶液的pH值用檸檬酸調(diào)至6.0。
2g L-精氨酸溶于50ml水中并加入檸檬酸調(diào)至pH值至6.0。用移液器加入100mg尿舒張肽(溶于30ml H2O)并攪拌10分鐘，兩小時后溶液混濁并且蛋白絮凝。此后實驗終止。實施例10根據(jù)實施例7的程序制備含有活性物質(zhì)尿舒張肽的凍干物，每瓶中含有如下組分a)配方19(對照實驗)1mg尿舒張肽10mg甘露醇醋酸調(diào)pH至6.3。
X-光衍射分析表明凍干物完全中晶體結(jié)構(gòu)，沒有可檢測到不定形或部分不定形的結(jié)構(gòu)。b)配方201mg 尿舒張肽20mg L-精氨酸10mg L-異亮氨酸天冬氨酸調(diào)pH至6.3。DSC測樣配方19沒有可檢測的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變，完全結(jié)晶。
配方20Tg＝85.1℃，部分不定形結(jié)構(gòu)。
配方10和配方20都在室溫存放一年。隨后的凝膠電泳表明配方19雙體＞1％，并可溶性聚集。
配方20100％單體。實施例11用實施例7中的程序制備凍干物，每瓶中含有以下成分a)配方21(對照實驗)1mg尿舒張肽50mg蔗糖10mg甘氨酸6mg聚乙二醇6000。b)配方221mg 尿舒張肽20mg L-精氨酸10mg L-異亮氨酸用天冬氨酸調(diào)pH值至6.3。b)配方234mg 尿舒張肽20mg L-核氨酸10mg L-異亮氨酸用天冬氨酸調(diào)pH至6.3d)配方241mg 尿舒張肽20mg L-精氨酸10mg L-異亮氨酸用天冬氨酸調(diào)pH至6.3b)配方25(對照實驗)1mg 尿舒張肽25mg 蔗糖20mg 甘氨酸在一次脅迫測試中，所有的配方21-25被儲存于不同的溫度下，然后用RP-FPLC測定成分
實施例10和11的結(jié)果表明根據(jù)本發(fā)明的配方比根據(jù)先前工藝中的基于蔗糖或蔗糖/PEG的配方能更好地穩(wěn)定肽以對抗溫度脅迫。在許多配方中使用的甘露醇也不能產(chǎn)生足夠穩(wěn)定的配方。
實施例8和9表明，在緩沖體系中經(jīng)常使用的酸導致一些肽的絮凝。這種現(xiàn)象在根據(jù)本發(fā)明的配方中所使用的酸(優(yōu)選地天冬氨酸與谷氨酸)中并未觀察到。實施例12用實施例7中的程序制備凍干物，每瓶中含有以下成分a)配方26(對照實驗)1mg尿舒張肽15mg 甘露酸2mgL-異亮氨酸10mg 脲0.5mg 多聚山梨酸酯用醋酸鈉緩沖液調(diào)pH值至6.8；完全結(jié)晶。b)配方271mg 尿舒張肽20mg L-精氨酸10mg D-異亮氨酸用D-天冬氨酸調(diào)pH值至6.8。c)配方281mg 尿舒張肽20mg L-精氨酸10mg L-異亮氨酸用L-天冬氨酸調(diào)pH值至6.8。d)配方29(對照實驗)1mg 尿舒張肽20mg L-蘇氨酸10mg D-異亮氨酸e)配方30(對照實驗)1mg 尿舒張肽15mg 聚乙二醇60005mg 苯丙氨酸在一次脅迫實驗中，這些配方儲存于不同的溫度中，然后用RP-HPLC確定主要降解產(chǎn)物的量。
在本發(fā)明的配方中，降解產(chǎn)物的量明顯地少。雖然配方29中形成了無定形的冷干餅，但不足以穩(wěn)定蛋白質(zhì)。實施例13用實施例7中的程序制備凍干物，每瓶中含有以下成分a)配方311mg尿舒張肽70mg蔗糖210mg L-苯丙氨酸b)配方321mg 尿舒張肽85mg 蔗糖c)配方331mg 尿舒張肽46mg 棉子糖10mg L-苯丙氨酸d)配方341mg 尿舒張肽20mg L-精氨酸5mg L-苯丙氨酸用L-天冬氨酸調(diào)pH值至6.3在一次脅迫實驗中，所有的配方31-34被儲存于不同的溫度下，然后用1ml水溶解凍干物，1小時后用濁度計(Hach型)測量重新溶解后的溶液的濁度。高于1.0的濁度被認是不可接受的。由于輔劑是易于溶解的，在幾種配方中觀察到的測定是由于肽的聚集引起的。結(jié)果
KS＝冷藏溫度-8℃RT＝室溫，20-22℃在熱脅迫后，只有根據(jù)本發(fā)明的配方?jīng)]有超過濁度閾值1.0。實施例14幾種配方中的尿舒張肽在如實施例11重配后用光散射測量儀(PMS)測量顆粒。結(jié)果(列出的是每種情況下的5個瓶子的平均值)
根據(jù)本發(fā)明的配方在升高溫度儲存后并沒有出現(xiàn)顆粒數(shù)的增加。實施例15含有蛋白rhNGF的凍干物用以下組分制備a)配方350.025mg rhNGF20mg L-精氨酸10mg L-天冬氨酸用乙酸調(diào)pH值至6.3。b)配方360.025mg rhNGF20mg L-精氨酸10mg L-天冬氨酸10mg L-異亮氨酸用乙酸調(diào)pH值至6.3。c)配方37(對照實驗)0.025mg rhNGF20mg L-精氨酸30mg 蔗糖用乙酸調(diào)pH值至6.3。d)配方38(對照實驗)0.025mg rhNGF20mg L-精氨酸30mg 棉子糖用乙酸調(diào)pH值至6.3。
與通常的程序相比，凍干時間大大縮短了從40-50個小時縮短到15個小時。然后在獨立的實驗中測定了凍干物中殘余的水分。結(jié)果配方354.7％/5.0％配方361.0％/0.9％配方375.9％/6.6％配方385.6％/5.6％本實施例表明，只有根據(jù)本發(fā)明的配方，特別是使用疏水氨基酸做為第三種成分的配方才可能縮短凍干時間。實施例16含蛋白質(zhì)rhNGF的凍干物用如下成分制備a)配方390.025mg rhNGF20mg L-精氨酸10mg β-丙氨酸10mg L-天冬氨酸用乙酸調(diào)pH值至6.3。b)配方400.025mg rhNGF20mg L-精氨酸8mg L-天冬氨酸10mg L-異亮氨酸用乙酸調(diào)pH值至8.7。c)配方410.025mg rhNGF20mg L-精氨酸12mg L-天冬氨酸10mg L-異亮氨酸用蘋果酸調(diào)pH值至4.5。
用實施例15中的程序進行凍干，然后測定殘余的水分。結(jié)果配方391.2％/1.4％配方401.6％/1.9％配方410.8％/0.9％
權(quán)利要求
1.凍干制備物包含a)選自蛋白、肽、核酸和碳水化合物的生物分子，b)一種或幾種堿性D-氨基酸或L-氨基酸和，c)一種或幾種氨基二羧酸，羥基羧酸，羥基二羧酸，或雙羧基酸。或它們的生理上可耐受的鹽，其中凍干物中的輔劑呈完全或部分的不定形形式。
2.權(quán)利要求1中的凍干制備物，其中(c)中所提及的添加劑與(b)中所提及的添加劑的重量比在0.01∶1到2∶1的范圍內(nèi)。
3.權(quán)利要求1-2中的一項中所提及的凍干制備物，其中作為輔劑的多聚物的量(分子量大于1000 Da的復(fù)合物)占總輔劑的10％以下。
4.權(quán)利要求1-3中的一項所提及的凍干制備物，其中作為輔劑的糖占總輔劑量的10％以下。
5.權(quán)利要求1-4中的一項中所提及的凍干制備物，其中它們具有大于50℃的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度。
6.權(quán)利要求1-5中所提及的凍干制備物，其中凍干之前的冷凍溶液的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度大于-40℃。
7.權(quán)利要求1-6中所提及的凍干制備物，其中氨基羧基酸是天冬氨酸或谷氨酸。
8.權(quán)利要求1-7中所提及的凍干制備物，其中它們另外含有一種或幾種具有疏水基團的氨基酸。
9.權(quán)利要求8中所提及的凍干制備物，包含有亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或苯丙氨酸，尤其是異亮氨酸或苯丙氨酸。
10.權(quán)利要求1-9中的一項中所提及的凍干制備物，其中用水重新溶解的溶液的pH值在約3-9之間。
11.在權(quán)利要求1-10中的一項中所提及的凍干制備物，其中生物分子與輔劑的質(zhì)量比小于1∶10。
12.在權(quán)利要求1-11中的一項所提及的凍干制備物，其中生物分子是源于心鈉素(ANP)家族的一種肽。
13.權(quán)利要求1-12中的一項中所提及的凍干制備物的制備過程，其中生物分子是溶于或懸浮于生理上可耐受的溶劑于并且加入a)一種或幾種堿性D-或L-氨基酸和b)至少一種或幾種氨基羧基酸或有機或無機酸然后凍干溶液。
14.權(quán)利要求13中要求的方法，其中凍干在一磷酸鹽含量少于5mm的水溶液中進行。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于生物分子的能穩(wěn)定儲存的凍干藥用制備物的,其中生物分子選自由蛋白,肽,核酸和碳水化合物組成的一組分子,并另加入一種或幾種堿性的D－或L－氨基酸,同時加入一種或幾種氨基二羧酸,羥基羧酸,或雙羧基酸或它們的生理上可耐受的鹽。凍干物中的輔劑為完全或部分不定形形式。
文檔編號A61K38/22GK1261271SQ98806448
公開日2000年7月26日 申請日期1998年4月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月18日
發(fā)明者W·雷德, M·馬特恩, G·溫特 申請人:羅赫診斷器材股份有限公司