專利名稱：對映體富集的n－衍生的內(nèi)酰胺類化合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對映體富集的N-衍生的(1R，4S)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮類化合物的制備方法。
由EP 0434 450可知，abacavir是一種下列結(jié)構(gòu)式(I)的2-氨基嘌呤核苷類似物，具有抗人免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)的潛在活性。
現(xiàn)實需要合成大量abacavir以供臨床試驗。將來，一旦abacavir被國家藥品管理機構(gòu)批準，作為治療HIV感染的處方藥還需要大量的abacavir。
作為生產(chǎn)abacavir的重要一步，就是制備對映體純的取代的環(huán)戊烯環(huán)?，F(xiàn)有的公知方法均始于式(II)內(nèi)酰胺。
EP-A-0424064公開了一種方法，其中通過將環(huán)戊二烯與甲苯磺酰基氰化物反應制備外消旋內(nèi)酰胺(II)，其可以與內(nèi)酰胺酶反應，得到下列開環(huán)化合物(III)的單一一種順式對映體或者相對于其中一種對映體而言對映體富集的順式對映體的混合物，以及相對于一種或其它對映體而言對映體富集的未反應內(nèi)酰胺。
現(xiàn)在，我們已開發(fā)了一種高產(chǎn)率并且高效的由其外消旋體制備基本上對映體純的式(IV)中間體的方法。
其中P是活化基團和保護基我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，將帶有P基團的式(II)化合物中內(nèi)酰胺氮原子(如下列式(V))衍生化，可活化所述內(nèi)酰胺鍵以進行水解。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，比EP-A-0424064中所述酶更容易獲得的、并且在正常條件下表現(xiàn)出對如EP-A-0424064所述的式(II)內(nèi)酰胺無活性的酶，可以用于生產(chǎn)式(IV)化合物。
因此，本發(fā)明一方面，提供了一種通過用?；柑幚硭龌旌衔铮瑢τ丑w拆分N-保護的(±)2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(V)的外消旋混合物，以生成基本上對映體純的N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(IV)的方法。
其中P是活化基團和保護基本發(fā)明另一方面，提供了一種上述式(IV)(其中P是活化基團和保護基)基本上對映體純的N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備方法，其中將上述式(V)(其中P是活化基團和保護基)N-保護的(±)2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋混合物用酰基酶處理并按常規(guī)方法從所述反應混合物中分離出未反應的式(IV)對映體。
優(yōu)選的是，所述活化基團/保護基是?；蛉〈难豸驶鶊F。優(yōu)選的?；鶊F包括甲?；虻图夋溚轷；?烷基部分含有例如1-4個碳原子)，特別是乙?；?。優(yōu)選的取代的氧羰基基團可以是式ROC(O)-，其中R可以是烷基或芳烷基。優(yōu)選的烷基是叔丁基。芳烷基可能是芐基。
由于我們還發(fā)現(xiàn)，這些?；Ｗo的化合物基本上可在含水條件下進行脫保護，因此，優(yōu)選的是，所述反應可在有機溶劑和水的混合物中進行。優(yōu)選的是，使用水可混溶的有機溶劑，例如環(huán)醚如四氫呋喃或1，4-二氧雜環(huán)己烷。為了使脫保護減至最小程度，優(yōu)選的是使用小于70％的水，更優(yōu)選50％左右或者更低(體積比)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，最適宜的是約50∶50(v/v)四氫呋喃和水的混合物。
當如上使用時，所述反應可在單相中進行。但是，沒有理由認為使用有機溶劑形成的兩相系統(tǒng)會是不成功的，例如用芳香烴。
反應完成后，可用常規(guī)方法，例如溶劑萃取法，從所述反應混合物中分離出未反應物和式(IV)基本上對映體純的N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量可對映體選擇性水解所述內(nèi)酰胺鍵以生成所需異構(gòu)體的酶。我們現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了由桿菌屬衍生的酶，特別是體現(xiàn)在活性方面，例如枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin carlsberg)(ALTUS)以對映體過量73％由所述外消旋混合物(V)中生成N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮[(IV)，P＝叔丁氧羰基]。其他的酶包括桿菌屬蛋白酶、Neutrase、Novozyme 243、Alcalase和Savinase以及由ALTUS和NOVO市售獲得的酶。由其他來源獲得的具有對映體選擇性水解作用的酶也可以使用，例如豬肝酯酶(ALTUS)、豬胰脂酶(Biocatalysts)、Flavorpro-192(肽酶，Biocatalysts)、Flavorpro-373(谷氨酰胺酶，Biocatalysts)、Promod-TP(肽鏈內(nèi)切酶，Biocatalysts)、脂酶-CE(Humicolalanuginosa，Amano)、蛋白酶-M(曲霉屬，Amano)、曲酶生成酶-6(曲霉屬，Amano)、脂酶PGE(腓腸根和唾液腺，Amano)和曲霉屬?；?Sigma)。
特別是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在此優(yōu)選使用市售的酰胺酶Savinase(NOVO)表現(xiàn)出N-保護的(1S，4R)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的生物轉(zhuǎn)化率適于工業(yè)規(guī)模上應用。Savinase是一種經(jīng)嗜堿芽孢桿菌屬(alkalophilic species of Bacillus)浸入發(fā)酵制備的蛋白分解酶，它是一種絲氨酸型內(nèi)切蛋白酶。在我們所進行的試驗中，在通常使用的條件下，該酶沒有表現(xiàn)出任何能水解式(II)未?；膬?nèi)酰胺外消旋混合物的能力。
N-保護的(1S，4R)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的生物轉(zhuǎn)化較理想地是在pH 6-11，優(yōu)選7-9范圍內(nèi)進行。優(yōu)選使用的溫度范圍在20-50℃。最優(yōu)選的方法是在pH約為8和溫度約為30℃下進行。Savinase底物的比例范圍為1∶1-10∶1，例如2∶1-5∶1(w/w)將獲得完全、迅速的反應，對于所述酶的最佳比例可通過簡單試驗容易地測定。
其中P是叔丁氧羰基的式(V)起始化合物可由相應的未被保護的式(II)外消旋內(nèi)酰胺按照Taylor等人在Tet.Asymmetry，4，p.1117(1993)中所述相似方法制備。其中P是甲?；虻图夋溚轷；氖?V)化合物可由相應的未被保護的式(II)外消旋內(nèi)酰胺按照T.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesi s”，Wiley，NewYork，1981，pp.218-287和J.F.W.McOmie，“Protective Groupsin Organic Chemistry”，Plenam Press，New York，1973，pp.43-93所述方法或相似方法制備。
所述式(IV)化合物可容易地經(jīng)水解轉(zhuǎn)變成相應的N-保護的氨基酸。用能夠?qū)Ⅳ人徂D(zhuǎn)變成醇的試劑，例如氫化鋰鋁或硼烷，可將所述N-保護的氨基酸容易地轉(zhuǎn)變成相應的式(VI)氨基醇。
另外，按照例如Tet.Asymm，4，p.1117(1993)所述方法，式(IV)化合物可直接轉(zhuǎn)變成相應的式(VI)開環(huán)氨基醇。
下列實施例僅試圖闡明本發(fā)明，而對本發(fā)明保護范圍不起任何限定作用。
實施例1篩選幾種能對映體選擇性水解外消旋(±)3-氧代-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯[(V)，P＝叔丁氧羰基]內(nèi)酰胺鍵的水解酶。室溫下，在機械攪拌下的含有1mg/ml所述外消旋化合物在50％四氫呋喃50％磷酸鹽緩沖液(v/v)(50mM pH 7)中的溶液的玻璃瓶(4ml工作體積)中室溫下進行反應。加入每種酶，使最終濃度達到25mg/ml，這表明，酶與底物的比為25∶1(w∶w)，從篩選目的上講，這應當能檢測到任何可能的水解活性。將不含酶的燒瓶用作對照。定期地取出樣品并在進行hplc分析之前用水1∶2稀釋。
hplc條件柱Spherisorb C6(15×0.46cm)室溫1ml/min下平衡流動相30％(v/v)含0.1％(v/v)甲酸的乙腈檢測波長200nm。
檢測表明，在反應條件下，(±)3-氧代-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯的化學水解作用可忽略不計。Chiralyser(HPLC光學旋光檢測儀)測得旋光性為負號，表明幾種酶對映體選擇性地水解所述外消旋化合物，得到(-)(1R，4S)3-氧代-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯。選擇Savinase做進一步研究。將含有約50％所述原料的反應混合物經(jīng)手性hplc分析，殘余的內(nèi)酰胺顯示，其對映體過量96.3％。
另外，殘余底物具有合成abacavir的正確絕對構(gòu)型。
手性hplc柱Chiralcel OD-H(25×0.46cm)5℃0.5ml/min下平衡流動相2％(v/v)異丙醇/庚烷檢測波長205nm。
對比實施例1在50％四氫呋喃50％磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 7)中，以1mg/ml(4ml工作體積)用Savinase(由NOVO獲得)處理含有外消旋內(nèi)酰胺(±)2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)的溶液。將不含酶的燒瓶用作對照。定期地取出樣品并在進行hplc分析之前用水1∶2稀釋。
hplc條件柱Spherisorb C6(15×0.46cm)室溫1ml/min下平衡流動相4％(v/v)含0.1％(v/v)甲酸的乙腈檢測波長200nm。
室溫下培養(yǎng)4天后，無反應。
實施例230℃下，將Savinase(30g，NOVO)加入到含有10g外消旋(±)3-氧代-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯[(V)，P＝叔丁氧羰基]的50∶50(v/v)四氫呋喃/50mM磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)溶液中。所述反應用手性HPLC監(jiān)測至多2天。
反應完成后(轉(zhuǎn)化率約51％，(-)(1R，4S)3-氧代-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯的對映體過量＞99.8％)，將所述酶過濾，用碳酸氫鈉溶液將澄清溶液的pH升至9。然后，將其用3×200ml己烷萃取。合并的有機相用100ml碳酸氫鈉溶液反萃取，隨后用100ml鹽水洗滌。蒸發(fā)并干燥，得到可自由流動的白色固體(4.2g，理論上分離產(chǎn)率的84％)。NMR鑒定其為(-)(1R，4S)3-氧代-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯；手性HPLC測得對映體過量＞99.8％。
手性hplc柱Chiralcel OD-H(25×0.46cm)平衡，0.5ml/min流動相2％(v/v)異丙醇/庚烷監(jiān)測波長205nm溫度5℃。
實施例3將上述(-)(1R，4S)3-氧代-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸叔丁基酯(3.5g)的四氫呋喃(10ml)溶液加入到硼氫化鈉(1.27g)的甲醇(10ml)懸浮液中并將混合物于約20℃下攪拌約18小時。再加入一定量的四氫呋喃(10ml)和硼氫化鈉(1.27g)并再繼續(xù)攪拌約2小時。小心地加入2摩爾鹽酸(30ml)，隨后加入甲苯(20ml)。將兩層分層，水層進一步用甲苯(2×25ml)萃取，合并的有機萃取液用鹽水(20m1)洗滌，硫酸鈉干燥并蒸發(fā)，得到淺黃色膠狀(1R，4S)(4-羥甲基)-環(huán)戊-2-烯-1-基氨基甲酸叔丁基酯(3.23g)，手性hplc測得對映體過量為99.2％，光譜和色譜與真實樣品相同。
手性hplc柱Chiralcel OD(25×0.46cm)流速1.0ml/min流動相3％(v/v)異丙醇/庚烷檢測波長205nm溫度35℃。
實施例4對Savinase對映體選擇性水解外消旋順式-2-乙酰基-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的內(nèi)酰胺鍵的能力進行試驗。室溫下，在機械攪拌下的含有1mg/ml底物的50％四氫呋喃50％磷酸鹽緩沖液(v/v)(50mM，pH 7)溶液的玻璃瓶(4ml工作體積)中進行反應。通過加入Savinase使最終濃度達到25mg/ml開始反應。將不含酶的燒瓶用作對照。定期地取出樣品并在進行hplc分析之前用水1∶2稀釋。
hplc條件柱Spheri sorb C6(15×0.46cm)20℃1ml/min下平衡流動相5％(v/v)含0.1％(v/v)甲酸的乙腈檢測波長210nm。
手性hplc柱Chiralpak AD(25×0.46cm)20℃1ml/min下平衡流動相2％(v/v)乙醇/庚烷檢測波長215nm。
檢測表明，在無酶存在的情況下，所述底物在反應條件下的化學水解作用可忽略不計。但是，如果在反應混合物中省略四氫呋喃，則存在有明顯的底物的非酶水解作用。Chiralyser和手性hplc分析顯示旋光性為負號，表明Savinase可對映體選擇性地水解外消旋順式-2-乙?；?2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮化合物，得到(-)(1R，4S)2-乙?；?2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮。2天后，對含有約50％所述原料的反應混合物進行手性hplc分析，殘余的內(nèi)酰胺顯示，與真實樣品相比，其對映體過量＞99.8％，具有合成abacavir的正確絕對構(gòu)型。
權(quán)利要求
1.一種制備基本上對映體純的下列式(IV)N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的方法，
其中P是活化基團和保護基，其中將N-保護的(±)2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(V)的外消旋混合物用?；柑幚恚?br> 其中P是活化基團和保護基，并用常規(guī)方法從所述反應混合物中分離出未反應的式(IV)對映體。
2.一種對映體拆分N-保護的(±)2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(V)的外消旋混合物以生成基本上對映體純的N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(IV)的方法，
其中P是活化基團和保護基，該方法包括用?；柑幚硭龌旌衔?。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述方法，其中P是?；蜓豸驶鶊F。
4.權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中P是甲?；蚝?-4個碳原子的鏈烷?；?。
5.權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中P是烷氧羰基或芳烷氧羰基基團。
6.權(quán)利要求5所述方法，其中P是叔丁氧羰基或芐氧羰基基團。
7.上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述?；甘怯蓷U菌屬(Bacillus sp.)衍生的。
8.權(quán)利要求7所述方法，其中所述?；甘荢avinase。
9.上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述反應在有機溶劑和水的混合物中進行。
10.權(quán)利要求9所述方法，其中所述有機溶劑是水可混溶的有機溶劑并且使用體積少于70％水。
11.權(quán)利要求10所述方法，其中所述水可混溶的有機溶劑是四氫呋喃或1，4-二氧雜環(huán)己烷。
12.上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述反應在pH范圍為6-11和20-50℃溫度下進行。
13.權(quán)利要求12所述方法，其中所述反應在pH約為8和溫度約為30℃下進行。
14.上述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述方法，其中所述未反應的式(IV)N-保護的(1R，4S)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮經(jīng)溶劑萃取法分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過用桿菌屬衍生的酰基酶處理所述混合物,由其外消旋物制備基本上對映體純的式(Ⅳ)中間體(其中P是活化基團和保護基)的方法。
文檔編號A61K31/16GK1261405SQ98806479
公開日2000年7月26日 申請日期1998年8月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月22日
發(fā)明者M·J·道森, M·馬毛蒂安, C·J·瓦利斯 申請人:葛蘭素集團有限公司