專利名稱：：細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于癌癥治療和診斷的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(有時(shí)稱作細(xì)胞障礙性T淋巴細(xì)胞)(cytotoxicTlymphorytes以下略作CTL)以及誘導(dǎo)該CTL時(shí)有用的CTL誘導(dǎo)劑。
背景技術(shù)：
：CTL通過特異性T細(xì)胞受體(Tcellreceptor以下略作TCR)識別抗原肽與主要組織相容性抗原基因復(fù)合體(majorhistocompatibilitygenecomplex，以下略作MHC)編碼的主要組織相容性抗原MHCI(人的叫做人白細(xì)胞抗原(humanleukocyteantigen)I類抗原，以下略作HLA-I)分子結(jié)合所形成的復(fù)合體，從而可以損傷將該復(fù)合體呈遞到細(xì)胞表示的細(xì)胞。由于該CTL只能識別殺傷具有自身MHCI類分子的靶細(xì)胞，所以稱之為MHCI類分子限制性CTL。因此，如果這種細(xì)胞殺傷反應(yīng)成立的則需要1)存在具有特異TCR的CTL，以及2)呈遞給MHC-I類人分子被CTL所識別的抗原肽。為此，存在不僅能與MHC-I類抗原分子相結(jié)合，而且能形成被TCR所識別的復(fù)合體的抗原肽是必要的。也就是說，本說明書中的“抗原肽”是指這樣的抗原肽，它具有與MHC-I分子相結(jié)合并與之形成復(fù)合體的能力，同時(shí)該復(fù)合體具有被特異的CTL的TCR所識別的抗原性。另外，本說明書的“HLA限制性抗原肽”是指MHC-I類分子為HLA分子的抗原肽。本說明書中的“肽”不特殊限定于只由氨基酸組成的同質(zhì)肽，也包括包含有非氨基酸成分的異質(zhì)肽。氨基酸也不特別限定于天然型氨基酸，也可以是經(jīng)過化學(xué)修飾的氨基酸。此外，本說明書中的肽不限定于單體，也可為多聚體。該抗原肽的形成是，例如在哺乳類細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)合成的抗原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過處理，分解成小的抗原決定肽，然后該肽段與MHC-I類分子會(huì)合，呈遞到細(xì)胞表示。也就是說，在由多個(gè)亞單位構(gòu)成的蛋白酶體復(fù)合體中，蛋白質(zhì)被分解成由8～15個(gè)氨基酸組成的肽，其中的一些肽被TAP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。若這些肽能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的I/β2微球蛋白(microglobulin)的異二聚體結(jié)合，便以3分子復(fù)合體的形式形成穩(wěn)定和復(fù)合體，通過高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表示，表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原蛋白質(zhì)的腫瘤細(xì)胞，應(yīng)能將T淋巴細(xì)胞識別的MHC-I類分子限制性的抗原肽呈遞到腫瘤細(xì)胞表示。由T淋巴細(xì)胞識別的最初的腫瘤特異性抗原是由T.Boor等對叫做黑色素瘤抗原E(以下略作MAGE)的基因進(jìn)行克隆，鑒定出的(P.VanderBruggen)等，科學(xué)(Science)，第254卷，1643～1647頁(1991)〕。他們采用來源于黑色素瘤患者的CTL克隆以及CTL所識別的來源于同一患者的一系列黑色素瘤細(xì)胞株，應(yīng)用其中幾個(gè)對CTL具有抗性的免疫選擇株，通過表達(dá)克隆的方法分離了MAGE。也就是說，將用CTL識別的黑色素瘤細(xì)胞株制備的5kb的DNA片段導(dǎo)入原來不被CTL識別的細(xì)胞株，這些細(xì)胞株就可成為被上述CTL克隆識別的細(xì)胞株。該DNA片段編碼預(yù)測分子量為26,000的蛋白質(zhì)。編碼該蛋白質(zhì)的基因叫做MAGE-1，通過mRNA分析顯示，不僅在轉(zhuǎn)移性，而且來源于初期階段黑色素瘤的40％的細(xì)胞株表達(dá)MAGE-1。由該蛋白質(zhì)而來的抗原是HLA-A1限制性的，MAGE-1特異的CTL克隆識別與HLA-I類分子中的一種HLA-A1分子結(jié)合，由序列號7中的9個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的肽序列(EADPTGHSY)(C.Traversari)等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(JournalofExperimentalofMedicine)，第176卷，1453～1457頁(1992)〕。已知的腫瘤抗原有許多種，但現(xiàn)在已知被CD-8陽性CTL所識別的腫瘤抗原有以上述的MAGE-1為代表的已知有10種以上的MAGE家族gp100；酪氨酸激酶(tyrosinase)或癌胚抗原(Carcinoembryonicantigen；以下略作CEA)，HER2/neu等。CTL所識別的是來源于腫瘤抗原蛋白質(zhì)的肽，與HLA-I類分子以復(fù)合體的形式呈遞。HLA-I類分子主要有HLA-A、-B、-C，已知與它們結(jié)合而呈遞的抗原肽由9～10個(gè)氨基酸構(gòu)成，而且隨各種HLA分子的不同而存在不同的一定結(jié)構(gòu)上的特征。例如最熟知的與世界上出現(xiàn)幾率最多的HLA-A2.1分子結(jié)合的肽是由9～10個(gè)從N末端數(shù)第二個(gè)氨基酸為Leu，且C末端為Leu或Val的氨基酸構(gòu)成的肽。另外，已熟知以日本人為代表的亞洲人種多數(shù)為HLA-A24分子，與該分子結(jié)合的肽是由9～10個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽，從N末端開始其第2位的氨基酸為Tyr、Phe、Met、Trp中的任一個(gè)，且其C末端為Leu、Ile、Trp、Phe中的任一個(gè)〔(A.Kondo)等，免疫學(xué)雜志，(JournalofImmunology)，第155卷，第4307～4312頁(1995)〕。到目前為止作為腫瘤抗原已鑒定出的抗原肽有與HLA-A1相對應(yīng)的MAGE-1、MAGE-3；與HLA-A2.1相對應(yīng)的有MAGE-3、MART1、酪氨酸激酶、gp100、HER2/neu、CEA等；與HLA-Cw1相對應(yīng)的MAGE-3；與HLA-B44相對應(yīng)的MAGE-3等；與HLA-A24相對應(yīng)的酪氨酸激酶、β-連環(huán)蛋白(catenin)等。已鑒定出與CEA來源的抗原肽相關(guān)的，由序列號34所示的9個(gè)氨基酸序列所組成的肽為HLA-A2.1限制性的抗原肽〔國家癌癥研究所雜志(JournalofNationalCancerInstitute)，第87卷，第982～990頁(1993)〕。同樣鑒定出與HER2/neu來源的抗原肽相關(guān)的、由序列號35或36所示的9個(gè)氨基酸序列組成的肽為HLA-A2.1限制性的抗原肽〔實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，第181卷，第2109～2117頁(1995)，癌癥研究(CancerResearch)，第54卷，第1071～1076頁(1994)〕。其中大多數(shù)是首先建立識別腫瘤細(xì)胞的I類分子限制性的CTL細(xì)胞株，鑒定該CTL所識別的腫瘤抗原，然后應(yīng)用遺傳工程學(xué)方法找出腫瘤抗原蛋白質(zhì)中的最小單位，再根據(jù)與HLA-I類分子結(jié)合的基元序列相關(guān)的信息找出最小單位中的肽〔(Y.Kawatami)等，美美國國家科學(xué)院院刊(ProceedingsoftheNationalAcademyoftheSciencesoftheUnitedStatesofAmerica)，第91卷，第3515～3519頁(1994)〕。或者，首先以與上述HLA-I類分子結(jié)合的肽中共同的基元結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，找出腫瘤抗原蛋白質(zhì)中與HLA-I類分子結(jié)合的肽，然后應(yīng)用抗原呈遞細(xì)胞選擇出具有誘導(dǎo)CTL能力的肽后，最后通過能否誘導(dǎo)對腫瘤細(xì)胞具有殺傷性的CTL來確定抗原肽〔(E.Celis)等，美國國家科學(xué)院院刊，第91卷，第2105～2109頁(1994)；(B.Gaugler)等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，第179卷，第921～930頁(1994)〕。另一方面，HLA-I類分子可分為幾個(gè)亞型，其保有的亞型種類在人種間有很大的差異，世界上最多的為HLA-A2，約占白色人種的45％。因此，對HLA-A2限制性抗原肽的鑒定工作進(jìn)行得最多，在日本人中HLA-A2約占40％，但是對其亞型的研究發(fā)現(xiàn)，與白色人種相同的HLA-A*0201占20％，其余的多數(shù)為A*0206。與這些亞型結(jié)合的肽不同，主要研究的HLA-A2為HLA-A*0201。另一方面，日本人中HLA-A24占60％以上，與其它人種相比，HLA-A24在亞洲人種的比率較高。然而到目前為止，盡管已知該HLA-A24限制性的抗原肽作為腫瘤抗原表達(dá)的有上述的酪氨酸激酶，β-連環(huán)蛋白，但是對其進(jìn)行的分析研究非常落后。因此對亞洲人種，尤其是對日本人腫瘤細(xì)胞具有特異作用的CTL的分析也很落后，不能提供用于腫瘤治療的CTL。本發(fā)明的目的是提供該CTL。發(fā)明的公開本發(fā)明的第1方案是涉及識別將抗原肽與HLA-A24分子的復(fù)合體呈遞到細(xì)胞表示的細(xì)胞的CTL，而抗原肽選自序列號1～6任一序號中記載的氨基酸序列所代表的HLA-A24限制性的抗原肽以及其功能性衍生物。本發(fā)明的第2方案涉及以第1方案的CTL為有效成分的制癌劑。本發(fā)明的第3方案涉及第1方案中CTL的誘導(dǎo)方法。本發(fā)明的第4方案涉及CTL的誘導(dǎo)劑，它是以選自序列號1～6任一序號中的氨基酸序列所表示的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物中的至少一個(gè)抗原肽作有效成分。本發(fā)明的第5方案涉及以抗原肽作有效成分的制癌劑，而該抗原肽選自序列號1～6任一序號中的氨基酸序列所表示的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物。本發(fā)明的第6方案涉及將抗原肽與HLA-A24分子的復(fù)合體呈遞到細(xì)胞表示的抗原呈遞細(xì)胞，而抗原肽選自序列號1～6任一序號中的氨基酸序列所表示的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物。本說明書中作為將HLA-A24限制性抗原肽和HLA-A24分子的復(fù)合體呈遞到細(xì)胞表示的細(xì)胞，使用術(shù)語“靶細(xì)胞”和“抗原呈遞細(xì)胞”。本說明書中的“靶細(xì)胞”是被特異性識別該細(xì)胞的CTL所殺傷的細(xì)胞。另一方面，本說明書中的“抗原呈遞細(xì)胞”是指與MHC分子一起呈遞抗原，具有激活T淋巴細(xì)胞功能的細(xì)胞，特別是只要沒有預(yù)先說明，MHC分子為HLA-A24分子的細(xì)胞。另外，本說明書中的“具有抗原呈遞能力的細(xì)胞”指的是具有通過將存在于該細(xì)胞上的MHC分子與抗原肽形成復(fù)合體可成為抗原呈遞細(xì)胞的能力的細(xì)胞，特別只要無預(yù)先說明，MHC分子為HLA-A24分子的細(xì)胞。本發(fā)明的第7方案是涉及以第6方案的抗原呈遞細(xì)胞為有效成分的CTL的誘導(dǎo)劑。本發(fā)明的第8方案涉及以第6方案的抗原呈遞細(xì)胞為有效成分的制癌劑。本發(fā)明的第9方案涉及該CTL敏感性細(xì)胞的檢測方法，該方法以第1方案的CTL與待檢細(xì)胞接觸時(shí)所產(chǎn)生的變化為指標(biāo)。本說明書中的“待檢細(xì)胞”是由末梢血淋巴細(xì)胞、組織等體外摘取的樣品而來的人細(xì)胞或株細(xì)胞。另外，本說明書中的“敏感性細(xì)胞”是指以被CTL所識別引起細(xì)胞溶解或細(xì)胞因子游離的腫瘤細(xì)胞為代表的異常細(xì)胞。本發(fā)明的第10方案涉及該CTL敏感性細(xì)胞的檢測劑，其特征在于它包含以1中的CTL作有效成分。再者，本發(fā)明的第11方案涉及HLA分子的檢測方法，其特征在于在選自HLA限制性抗原肽及其功能性衍生物的至少一個(gè)抗原肽存在的條件下，讓可能識別該抗原肽與HLA分子親合體的CTL與被檢細(xì)胞接觸。本發(fā)明者們以含有腫瘤抗原MAGE-3蛋白質(zhì)中的HLA-A24結(jié)合基元序列的肽為中心，從大量的候補(bǔ)肽中探索抗原肽，結(jié)果表明，應(yīng)用由序列號1或2中的氨基酸序列組成的肽可從表達(dá)HLA-A24的健康人末梢血單核細(xì)胞誘導(dǎo)出對該腫瘤抗原的表達(dá)細(xì)胞具有選擇性殺傷作用的CTL。同樣，以含有各種腫瘤抗原蛋白質(zhì)中的HLA-A24結(jié)合基元序列的肽為中心，從候補(bǔ)肽中探索HLA-A24限制性抗原肽，結(jié)果表明，應(yīng)用存在于MAGE-1蛋白質(zhì)氨基酸序列中的由序列號3中的氨基酸序列構(gòu)成的肽，應(yīng)用存在于CEA蛋白質(zhì)氨基酸序列中的序列號4或5中代表的氨基酸序列構(gòu)成的肽，或應(yīng)用存在于HER2/neu蛋白質(zhì)氨基酸序列中的序列號6中的氨基酸序列構(gòu)成的肽，可從表達(dá)HLA-A24的健康人末梢血單核細(xì)胞誘導(dǎo)出對該腫瘤抗原的表達(dá)細(xì)胞具有選擇性殺傷作用的CTL，完成了本發(fā)明。附圖簡述圖1表示用抗原肽MA3-2刺激誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞殺傷作用。圖2表示用抗原肽MA3-4刺激誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞殺傷活性。圖3表示用抗原肽MA3-2刺激誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對各種癌細(xì)胞的特異性細(xì)胞殺傷活性。圖4表示用抗原肽MA3-4刺激誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對各種癌細(xì)胞的特異性細(xì)胞殺傷活性。圖5表示用抗原肽MA1-1刺激誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對各種靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞殺傷活性。本發(fā)明的最佳實(shí)施方案本發(fā)明的第1方案是識別能將抗原肽與HLA-A24分子的復(fù)合體呈遞到細(xì)胞表面的細(xì)胞的CTL，該抗原肽選自序列號1～6任一序號中記載的氨基酸序列所表示的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物，而該CTL能引起對靶細(xì)胞特異的細(xì)胞反應(yīng)或細(xì)胞因子釋放反應(yīng)。本說明書的CTL指識別呈遞到HLA-A24分子上的抗原肽的抗原性，具有殺傷活性的CTL，而不是由其它抗原性識別所限定的CTL。本說明書中的HLA-A24限制性抗原肽的功能性衍生物指具有與HLA-A24分子形成復(fù)合體的能力，同時(shí)所形成的復(fù)合體能被CTL所識別，而該CTL能識別序列號1～6任一序號中的氨基酸序列所表示的抗原肽與HLA-A24分子的復(fù)合體。例如，序列號1～6任一序號的氨基酸序列所表示的肽的氨基酸序列中有1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸缺失，被其它的氨基酸或衍生物置換氨基酸，和/或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸或衍生物氨基酸，或這些情況組合發(fā)生而形成的不同氨基酸序列，具有與HLA-A24分子形成復(fù)合體的能力，同時(shí)所形成的復(fù)合體能被CTL所識別的肽，也包含通過二硫鍵結(jié)合形成的肽的二聚體。功能性衍生物的氨基酸序列長度優(yōu)選9～10個(gè)，但并不特別限定于此。另外，本發(fā)明中所指的氨基酸衍生物，指各種氨基酸的N-酰化物，O-?；?，酯化物，酸性酰胺化合物，烷化物等。另外，只要與HLA-A24分子的復(fù)合體能被CTL所識別，抗原肽的N末端和游離的氨基可結(jié)合甲酰基、乙?；?、叔丁氧羰基(t-Boc)等。只要與HLA-A24分子的復(fù)合體能被CTL所識別，抗原肽的C末端和游離的羧基可結(jié)合甲基、乙基、叔丁基、苯甲基等。同樣，只要與HLA-A24分子的復(fù)合體能被CTL所識別，抗原肽中所包含的半胱氨酸的硫醇基可結(jié)合乙酰氨甲基、甲氧芐基等。應(yīng)用識別序列號1～6任一序號中的氨基酸序列所代表的抗原肽與HLA-A24分子所形成的復(fù)合體的CTL可鑒別出功能性衍生物，例如可用下述方法。第1種方法是，將作為功能性衍生物的候補(bǔ)物質(zhì)與表達(dá)HLA-A24的細(xì)胞混合，洗凈未與HLA-A24分子結(jié)合的候補(bǔ)物質(zhì)后，與CTL進(jìn)行反應(yīng)。若能觀察到對候補(bǔ)物質(zhì)的特異性反應(yīng)，細(xì)胞殺傷性反應(yīng)，細(xì)胞因子釋放反應(yīng)或增殖反應(yīng)，就可判斷為功能性衍生物。第2種方法是，向候補(bǔ)物質(zhì)中添加具有抗原呈遞能力的細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)，如抗原被細(xì)胞攝取，經(jīng)過加工，抗原肽與HLA分子的復(fù)合體呈遞到細(xì)胞表示所必需的時(shí)間，進(jìn)行反應(yīng)后，與CTL進(jìn)行反應(yīng)。若能觀察到候補(bǔ)物質(zhì)特異的細(xì)胞因子游離或增殖反應(yīng)，則判斷該物質(zhì)為功能性衍生物。第3種方法是，將編碼候補(bǔ)物質(zhì)氨基酸序列的核酸結(jié)合到載體上，該載體能夠?qū)㈦某蔬f給后述的具有抗原呈遞能力的細(xì)胞上的HLA-A24分子，將該重組載體轉(zhuǎn)化的抗原呈遞細(xì)胞與CTL進(jìn)行反應(yīng)。若能觀察到候補(bǔ)物質(zhì)特異的細(xì)胞因子游離或增殖反應(yīng)，則判斷該物質(zhì)為功能性衍生物。上述的功能性衍生物是，例如為了增強(qiáng)與HLA-A24分子的結(jié)合，序列號1～6任一序號中的氨基酸序列所代表的肽的氨基酸序列，從N末端開始的第2個(gè)氨基酸可置換或以與HLA-A24分子結(jié)合肽為特征的Tyr、Phe、Met、Trp中選擇的氨基酸，和/或C末端的氨基酸置換或從與HLA-A24分子結(jié)合肽為特征的Leu、Ile、Trp、Phe中選擇的氨基酸，這樣的肽中具有與HLA-A24分子相結(jié)合的能力，與HLA-A24分子所形成的復(fù)合體能被識別序列號1～6中的任一種肽與HLA-A24分子所形成的復(fù)合體的CTL所識別，這樣的肽可作為上述的功能性衍生物。另外也可是這樣的肽，序列號1～6任一項(xiàng)氨基酸序列中的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生置換后的氨基酸序列所代表的肽中，發(fā)生了置換的各種氨基酸或側(cè)鏈類似的氨基酸，或者氨基酸衍生物所形成的肽中，具有與HLA-A24分子結(jié)合的能力，且與HLA-A24分子形成的復(fù)合體能被本發(fā)明的CTL所識別的肽。與側(cè)鏈類似的氨基酸可列舉，如甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)，纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)、賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸等。例如，作為序列號4中所示的抗原肽的功能性衍生物，可列舉將N末端第6位的氨基酸(Val)置換成Ile的序列號24中氨基酸序列所代表的肽，將N末端第8位的氨基酸(Gly)置換成Ala的序列號46中氨基酸序列所代表的肽。另一方面，作為序列號5中所示抗原肽的功能性衍生物，可列舉N末端第6位的氨基酸(Val)分別置換成Ile、Met的序列號53、55中記載的氨基酸序列所代表的肽，或者是N末端第4位的氨基酸(Cys)置換成Cys的硫醇基與4，5-二羥基-2-環(huán)戊烷-1-酮(4，5-dihydroxy-2-cyclopenten-1-one，以下略作DHCP)發(fā)生反應(yīng)所得的生成物的序列號33中記載的肽。另外，N末端第4位的氨基酸也可是Cys的硫醇基與N-乙基馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide)、二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)、4-乙烯基吡啶(4-Vinylpyridine)進(jìn)行反應(yīng)而得的產(chǎn)物。另外，作為上述功能性衍生物，也可以是與側(cè)鏈不相類似的氨基酸的置換，例如，可以是序列號1～6任一序號記載的氨基酸序列所代表的肽的氨基酸序列中有1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸置換或其它的氨基酸或氨基酸衍生物，如置換成Ala的氨基酸序列所代表的肽中具有與HLA-A24分子結(jié)合的能力，與HLA-A24分子形成的復(fù)合體能被識別序列號1～6任一序號中記載的肽與HLA-A24分子復(fù)合體的CTL所識別的肽。例如，作為序列號4中所示抗原肽的功能性衍生物，可列舉序列號39、40、42～45、48任一序號中記載的氨基酸序列所代表的肽，作為序列號5中所示抗原肽的功能性衍生物，可列舉序列號26、27、30、32記載的氨基酸序列所代表的肽。另外，上面的肽中可置換成Ala的這一位置的氨基酸具有置換成與原本氨基酸不同的其它氨基酸，或氨基酸衍生物的可能性。例如，序列號5記載的氨基酸序列所代表的抗原肽的第4位氨基酸，可置換成Ala之外的其它除Asp、Gln等酸性氨基酸以外的氨基酸或氨基酸衍生物。例如，序列號51或52中記載的氨基酸序列所代表的用Ser或Gly置換的肽。另外，作為通過二硫鍵所形成的肽的二聚體，可以序列號5記載的氨基酸序列所代表的肽為例，它是借助于半胱氨酸的硫醇基而進(jìn)行二硫鍵的結(jié)合的。除上述之外還有，如由序列號1記載的氨基酸序列所構(gòu)成的肽的功能性衍生物也包含來自以MAGE-3為代表的MAGE家族蛋白質(zhì)的肽，它們能被用序列號1記載的氨基酸序列構(gòu)成的肽所誘導(dǎo)的CTL所識別。同樣由序列號2記載的氨基酸序列所構(gòu)成的肽的功能性衍生物與包含來自以MAGE-3為代表的MAGE家族蛋白質(zhì)的肽，而該肽能被用序列號2記載的氨基酸序列構(gòu)成的肽所誘導(dǎo)的CTL所識別。由序列號3記載的氨基酸序列所構(gòu)成的肽的功能性衍生物也包含能被用序列號3記載的氨基酸序列構(gòu)成的肽所誘導(dǎo)的CTL識別的，來自以MAGE-1為代表的MAGE家族蛋白質(zhì)的肽。由序列號4記載的氨基酸序列所構(gòu)成的肽的功能性衍生物可列舉能被序列號4記載的氨基酸序列構(gòu)成的肽所誘導(dǎo)的CTL識別的，來自CEA和非特異性交差反應(yīng)性抗原(non-specificcrossneactingantigen，NCA)的肽。序列號5中記載的氨基酸序列所代表的肽的功能性衍生物可列舉能被用序列號5中記載的氨基酸序列所代表的肽誘導(dǎo)的CTL所識別的、來自CEA及NCA的肽。以下，本說明書中將序列號1或2中表示的肽及其功能性衍生物統(tǒng)稱為MAGE-3抗原肽，將序列號3中表示的肽及其功能性衍生物統(tǒng)稱為MAGE-1抗原肽。同樣，將序列號4或5中表示的肽及其功能性衍生物統(tǒng)稱為CEA抗原肽，將序列號6中表示的肽及其功能性衍生物統(tǒng)稱為HER2/neu抗原肽。若無特殊說明，以下本說明書中所使用的“抗原肽”。表示從MAGE-3抗原肽、MAGE-1抗原肽，CEA抗原肽和/或HER2/neu抗原肽中任意選擇的肽。抗原肽及其衍生物可通過液相或固相氨基酸的偶聯(lián)應(yīng)用有機(jī)化學(xué)的方法進(jìn)行制備。另外，也可應(yīng)用用編碼抗原肽的氨基酸序列的核酸重組DNA的技術(shù)進(jìn)行制備。根據(jù)DNA重組技術(shù)得到的肽，在必要情況下，可應(yīng)用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)化學(xué)或生物化學(xué)方法進(jìn)行修飾。因?yàn)橛肕AGE-3抗原肽所誘導(dǎo)的CTL以及用MAGE-1抗原肽、CEA抗原肽和HER2/neu抗原肽所誘導(dǎo)的CTL分別對HLA-A24和MAGE-3共陽性的腫瘤細(xì)胞、HLA-A24和MAGE-1共陽性的腫瘤細(xì)胞、HLA-A24和CEA共陽性的腫瘤細(xì)胞以及HLA-A24和HER2/neu共陽性的腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，所以本發(fā)明的CTL可作為抗腫瘤的細(xì)胞藥物使用，或者用于該CTL敏感性細(xì)胞的檢測等。本發(fā)明的第2方案是涉及以第1方案的CTL作有效成分的制癌劑。該制癌劑是以將該CTL懸浮到醫(yī)藥允許的稀釋劑中的形式而提供的。這里所講的稀釋劑可以是，如保存該CTL所適宜的培養(yǎng)基、生理鹽水或磷酸鹽緩沖生理鹽水。一般培養(yǎng)基可列舉RPMI、AIM-V等。另外，為了達(dá)到穩(wěn)定的目的，該制癌劑中可添加醫(yī)藥上所允許的載體。這里所講的載體為人血清白蛋白等。該制癌劑中包含的第1方案的CTL量是每1種CTL104～108個(gè)/ml，優(yōu)選5×105～5×107個(gè)/ml。將上述制癌劑施用給人的時(shí)候可用注射器，每1個(gè)成人的施用量通常是CTL的數(shù)目為每1種CTL達(dá)106～1010個(gè)。不過上述的范圍只是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，并不限于此。另外，因?yàn)樽鳛橛行С煞值腃TL來自所施與的人，所以該制癌劑無毒性。盡管本發(fā)明的制癌劑施用給其腫瘤細(xì)胞表達(dá)有效成分CTL可識別的抗原肽的癌癥患者，例如，MAGE當(dāng)初是從黑色素瘤患者的惡性腫瘤細(xì)胞鑒定出的抗原，但其后證實(shí)黑色素瘤以外的癌癥患者約10～50％表達(dá)該抗原。表達(dá)MAGE-1、MAGE-2或MAGE-3的腫瘤細(xì)胞除黑色素瘤外，還有來自如肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、胃癌、食道癌、膀胱癌的腫瘤細(xì)胞〔(B.Gaugler)等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，第179卷，第921～930頁(1994)〕。因此，例如以用MAGE-3抗原肽誘導(dǎo)的本發(fā)明第1方案中的CTL作有效成分的制癌劑對治療腫瘤細(xì)胞為HLA-A24和MAGE-3共陽性的上述癌癥患者也有效。另外，在應(yīng)用上述制癌劑的時(shí)候盡管也可并用其它制癌劑，但最好不要并用具有免疫抑制作用的制癌劑。本發(fā)明的第3方案涉及第1方案中的CTL的誘導(dǎo)方法?？蓱?yīng)用選自序列號1～6任一序號記載的氨基酸序列所表示的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物中的至少一個(gè)抗原肽來誘導(dǎo)該CTL。在體外(invitro)誘導(dǎo)該CTL的時(shí)候，比如可應(yīng)用表達(dá)HLA-A24的生命體的體外摘取樣品進(jìn)行誘導(dǎo)。本說明書中所指的體外摘出樣品，除血液之外，還包含通過手術(shù)摘取的淋巴結(jié)、脾臟、其它各種臟器，這些樣品中所存在的淋巴細(xì)胞和浸潤性淋巴細(xì)胞非常適用。例如在應(yīng)用血液的時(shí)候，可通過給由HLA-A24陽性的人血液制備的末梢血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，以下略作PBMC)而得到的淋巴細(xì)胞反復(fù)地抗原刺激而誘導(dǎo)CTL?？乖碳な峭ㄟ^應(yīng)用抗原呈遞細(xì)胞而進(jìn)行的，例如用制備淋巴細(xì)胞的同一血液制備的具有抗原呈遞能力的細(xì)胞以HLA-A24分子復(fù)合體的形式將抗原肽呈遞到細(xì)胞表示的抗原呈遞細(xì)胞。再在抗CD3抗體的刺激下，或抗原肽存在下的各種刺激后，誘導(dǎo)出的CTL可增殖。例如，在IL-7存在的條件下，對從PBMC制備的1個(gè)淋巴細(xì)胞以0.01～1的比率混合抗原呈遞細(xì)胞，可誘導(dǎo)CTL。其它的方式是，在IL-7和鑰孔血藍(lán)蛋白(KeyholeLimpetHemoryanin，KLH)存在的條件下，向PBMC中加入抗原肽，在細(xì)胞培養(yǎng)液中，每1種抗原肽的量為1ng/ml～100μg/ml，優(yōu)選10ng/ml～1μg/ml，以此來誘導(dǎo)CTL。通過克隆化，可將所誘導(dǎo)的CTL作為具有穩(wěn)定的細(xì)胞殺傷性的淋巴細(xì)胞進(jìn)行維持。例如，向誘導(dǎo)的CTL中加入抗原、各種細(xì)胞因子、抗CD3抗體的刺激，CTL可進(jìn)行增殖。誘導(dǎo)的特異性CTL，對誘導(dǎo)CTL的抗原肽和放射性物質(zhì)等標(biāo)記的靶細(xì)胞的殺傷性，可通過放射能的攝取測定CTL增殖的抗原特異性增加或者從CTL和靶細(xì)胞游離出的抗原特異性GM-CSF、IFN-γ等細(xì)胞因子的量進(jìn)行檢測。另外也可通過使用熒光素等標(biāo)記的抗原肽或復(fù)合體進(jìn)行直接確認(rèn)。這種情況下，例如將CTL接觸與CTL特異性抗原相偶聯(lián)的第一熒光標(biāo)記物之后，再接觸與第2熒光標(biāo)記相偶聯(lián)的抗原肽-MHC復(fù)合體，然后通過用FACS(fluorescence-activatedcellsorting)分析雙重標(biāo)記細(xì)胞的存在來確認(rèn)CTL。另一方面，在體內(nèi)(inviro)誘導(dǎo)CTL的時(shí)候，例如可通過活體內(nèi)施用抗原呈遞細(xì)胞而進(jìn)行，而該抗原呈遞細(xì)胞能將抗原肽和HLA-A24分子以復(fù)合體的形式呈遞到細(xì)胞表面。施用給人的時(shí)候，每個(gè)成人的施用量通常為104～109個(gè)，也可應(yīng)用其它的方法，如通過將抗原肽與適當(dāng)?shù)淖魟┫嗷旌鲜┯媒o生物體，來誘導(dǎo)該抗原肽特異的CTL。佐劑可以是為①氟氏(Freund)完全佐劑，②氟氏不完全佐劑，③氫氧化鋁、明礬等無機(jī)物凝膠，④溶血卵磷脂、二甲基硬脂銨溴化物等表面活性劑，⑤硫酸右旋糖苷、多聚肌胞苷酸等多聚陰離子，⑥胞壁酸酰肽、促吞噬肽等肽，⑦Ribi公司的單磷酰脂(monophosphonyllipid；MPL)A等，但是佐劑并不僅限于此。除施用抗原劑和佐劑的混合物在生命體內(nèi)誘導(dǎo)CTL外，還可與MHCII類制約性輔助T細(xì)胞抗原肽混合施用。另外，為了能在生命體內(nèi)穩(wěn)定存在，可借助于適當(dāng)?shù)倪B接體將該抗原肽與高級脂肪酸和輔助性T細(xì)胞抗原肽共同結(jié)合而進(jìn)行施用。施用給人的時(shí)候，每1個(gè)成人的施用量是，抗原肽的濃度是每1種抗原肽的量為0.1μg/kg～10mg/kg，優(yōu)選1μg/kg～1mg/kg，更優(yōu)選的是1μg/kg～100μg/kg。為了用誘導(dǎo)CTL的抗原肽進(jìn)行刺激，也可應(yīng)用抗原肽和HLA-A24分子的復(fù)合體。這種情況下，HLA-A24分子不必要是天然的HLA-A24分子，基本上保存有與抗原肽結(jié)合特性的片斷即可。例如這些片段可以是通過天然HLA-A24分子的蛋白質(zhì)分解或重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備的。該復(fù)合體與β2-微球蛋白共存，進(jìn)一步講，與識別復(fù)合體的抗體共存可使之穩(wěn)定。本發(fā)明的第4方案涉及CTL的誘導(dǎo)劑，它以選自序列號1～6中任一序號記載的氨基酸序列所代表HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物的至少一個(gè)抗原肽作有效成分。CTL誘導(dǎo)劑的供給方式是抗原肽單獨(dú)或與其它分子(輔助性T細(xì)胞抗原肽和/或佐劑)的混合物懸浮到生理鹽水或磷酸緩沖生理鹽水中。該抗原肽也可作為與高級脂肪酸或輔助性T細(xì)胞抗原肽的共同結(jié)合體或與HLA-A24分子的復(fù)合體。該誘導(dǎo)劑中含有的抗原肽是每1種抗原肽占0.01～100重量百分比，優(yōu)選含0.1～95重量百分比。該CTL誘導(dǎo)劑可用做體外增殖本發(fā)明的CTL時(shí)培養(yǎng)基的添加物，以T淋巴細(xì)胞增殖活性，遲發(fā)型皮膚反應(yīng)為指標(biāo)的免疫應(yīng)答狀態(tài)的診斷等。例如作為培養(yǎng)基中的添加物使用時(shí)，其使用量是以培養(yǎng)基中的肽濃度達(dá)每1種抗原肽相當(dāng)于1ng/ml～100μg/ml，優(yōu)選10ng/ml～1μg/ml。本發(fā)明的第5方案涉及制癌劑，它是以選自序列號1～6中任一序號記載的氨基酸序列所代表的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物的抗原肽作有效成分的。該制癌劑的提供形式是1)單獨(dú)應(yīng)用抗原肽，2)抗原肽與醫(yī)藥上允許的載體和/或稀釋劑的混合物；或者3)必要時(shí)再向上述1)和2)中加入輔助劑。這里所講的載體可以是，如人血清白蛋白，而稀釋劑為，如磷酸緩沖液、蒸餾水、生理鹽水等。另外補(bǔ)助劑可列舉藥學(xué)上所允許的上述佐劑。該制癌劑施用給人的時(shí)候，可用注射器施用給人，也可用噴霧等方法通過粘膜經(jīng)皮吸收。該制癌劑中含有的抗原肽量為每1種抗原肽0.01～100重量％，優(yōu)選0.1～95重量％。每個(gè)成人的施用量為，作為肽濃度，每種抗原肽的濃度0.1μg/kg～10mg/kg，優(yōu)選1μg/kg～1mg/kg，更優(yōu)選1μg/kg～100μg/kg。另外，施用給人的時(shí)候，沒有觀察到該肽的毒性。使用該制癌劑的時(shí)候，也可與其它制癌劑并用，但不希望與具有免疫抑制作用的制癌劑并用。本發(fā)明的第6方案涉及將抗原肽與HLA-A24分子的復(fù)合體呈遞到其細(xì)胞表面的抗原呈遞細(xì)胞，而抗原肽選自序列號1～6任一序號記載的氨基酸序列所代表的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物。以下，本說明書中的“抗原呈遞細(xì)胞”在沒有特定說明的情況下，指的是呈遞了選自MAGE-3抗原肽、MAGE-1抗原肽、CEA抗原肽和/或HER2/neu抗原肽中至少一個(gè)抗原肽的抗原呈遞細(xì)胞。該抗原呈遞細(xì)胞可用于本發(fā)明的CTL的誘導(dǎo)。該抗原呈遞細(xì)胞可通過應(yīng)用具有抗原呈遞能力的細(xì)胞進(jìn)行制備。具有抗原呈遞能力的細(xì)胞可列舉，如能將抗原肽與HLA-A24分子的復(fù)合體呈遞到其細(xì)胞表面的以巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCdendriticcells)為代表的白細(xì)胞。因?yàn)镈C每個(gè)細(xì)胞的抗原呈遞量多，且對于抗原呈遞所必要的細(xì)胞表面分子〔CD80、CD86等共刺激信號(co-stimnlatorysignal)分子等〕的表達(dá)量也高，所以做為具有抗原呈遞能力的細(xì)胞特別適宜。上述具有抗原呈遞能力的細(xì)胞可從本說明書中體外摘取的樣品中制備。例如，DC可用下面的任一種方法進(jìn)行制備1)以幾個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記為基礎(chǔ)從PBMC中分離提純；2)用GM-CSF和IL-4從單核細(xì)胞來誘導(dǎo)3)用GM-CSF、TNF-α、SCF等細(xì)胞因子從CD34陽性細(xì)胞來誘導(dǎo)。能將抗原肽呈遞到具有抗原呈遞能力的細(xì)胞表面的方法可列舉，如將上述具有抗原呈遞能力的細(xì)胞與抗原肽中的至少一種混合后，必要時(shí)洗凈過剩量，將抗原肽負(fù)載到HLA-A24分子上。另外，對向上述制備具有抗原呈遞能力細(xì)胞的方法1)中所制備的細(xì)胞那樣已將與本發(fā)明無關(guān)的抗原肽呈遞到HLA-A24分子上的細(xì)胞，可在負(fù)載抗原肽以前進(jìn)行酸處理，除去HLA-A24分子上存在的不能誘導(dǎo)出本發(fā)明的CTL的肽。這種具有抗原呈遞能力的細(xì)胞除可負(fù)載單一的抗原肽外，每個(gè)細(xì)胞也可負(fù)載多種的抗原肽。另外，作為其它的方法，可列舉如對于B細(xì)胞和CD34陽性細(xì)胞，可通過應(yīng)用能呈遞上述抗原肽的表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化該細(xì)胞。這樣的載體可列舉通過重組DNA技術(shù)，將編碼至少一種呈遞到細(xì)胞表面的抗原肽的基因整合到pcDNA3、pMQMnes、pCEP4等商品化的質(zhì)粒中的表達(dá)用質(zhì)粒載體。再者，為了在細(xì)胞內(nèi)有效地接受蛋白酶的分解，可在該表達(dá)載體中呈遞到細(xì)胞表面的抗原肽的兩端添加編碼適當(dāng)氨基酸序列的基因。再者，也可適當(dāng)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體。優(yōu)選抗原細(xì)胞沒有增殖性。為了使細(xì)胞沒有增殖性，可用X線等放射線進(jìn)行照射或者用絲裂霉素(mitomycin)等試劑進(jìn)行處理。本發(fā)明的第7方案涉及CTL的誘導(dǎo)劑，該誘導(dǎo)劑以第6方案中的抗原呈遞細(xì)胞作有效成分。該誘導(dǎo)劑是以將該抗原呈遞細(xì)胞懸浮到保存細(xì)胞所適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、生理鹽水、或磷酸緩沖生理鹽水中的形式進(jìn)行供給的。培養(yǎng)基一般是RPMI、AIM-γ、X-VIVO10等培養(yǎng)基。另外為了使之穩(wěn)定，可向該培養(yǎng)基或緩沖液中加入血清白蛋白。該誘導(dǎo)劑中含有的抗原呈遞細(xì)胞為每種抗原呈遞細(xì)胞103～5×106個(gè)/ml，優(yōu)選104～106個(gè)/ml。除用做體外增殖本發(fā)明的CTL的培養(yǎng)基的添加物之外，該CTL的誘導(dǎo)劑還可用于以T淋巴細(xì)胞增殖活性為指標(biāo)的免疫應(yīng)答狀態(tài)的診斷。例如作為培養(yǎng)基中的添加物使用時(shí)，通常對于誘導(dǎo)CTL的淋巴細(xì)胞1以0.01～1的比率應(yīng)用。本發(fā)明的第8方案是含有以第6方案中的抗原呈遞細(xì)胞作有效成分的制癌劑。該制癌劑是以將該抗原呈遞細(xì)胞懸浮到醫(yī)藥上允許的稀釋劑中的形式來提供的。這里所講的稀釋劑為適于保存細(xì)胞的培養(yǎng)基、磷酸緩沖液、生理鹽水等。培養(yǎng)基一般為RPMI、AIM-γ、X-VIVO10等培養(yǎng)基。另外，該制癌劑中可加入醫(yī)藥上允許的載體以使之穩(wěn)定。這里所講的載體為人血清白蛋白。該制癌劑中含有的抗原呈遞細(xì)胞為，每1種抗原呈遞細(xì)胞105～108個(gè)/ml，優(yōu)選5×105～5×107個(gè)/ml。該制癌劑施用給人的時(shí)候可用注射器給予，或每個(gè)成人的施用量為，以抗原呈遞細(xì)胞的數(shù)目計(jì)，每1種抗原呈遞細(xì)胞通常為104～109個(gè)。上述范圍只是大致標(biāo)準(zhǔn)，并不局限于此。另外，由于有效成分抗原呈遞細(xì)胞來自所施用的人，所以該制癌劑無毒性。使用該制癌劑的時(shí)候可與其它制癌劑并用，但不希望與具有免疫抑制作用的制癌劑并用。本發(fā)明的第9方案涉及該CTL敏感性細(xì)胞的檢測方法，它是以讓第1方案中的CTL與待測細(xì)胞接觸時(shí)所產(chǎn)生的變化為指標(biāo)的。CTL與待檢細(xì)胞中的敏感細(xì)胞相接觸時(shí)所產(chǎn)生的變化可以是，如CTL對靶細(xì)胞的溶解、細(xì)胞因子游離或CTL增殖。靶細(xì)胞溶解的檢測可這樣進(jìn)行，如用放射性同位素和熒光素標(biāo)記待測細(xì)胞后，與CTL混合之時(shí)，通過測定被測細(xì)胞釋放出的放射性同位素量和熒光素量進(jìn)行。細(xì)胞因子釋放的檢測可通過測定從CTL或被測細(xì)胞釋放出的GM-CSF、TNF、IFN-γ等的量來進(jìn)行。另外CTL的增殖可通過細(xì)胞對3H-胸腺嘧啶核苷的攝取量的測定以及通過顯微鏡觀察CTL的細(xì)胞數(shù)目來進(jìn)行。通過這些變化可檢測出被檢細(xì)胞中所存在的HLA-A24和MAGE-3共陽性或HLA-A24和MAGE-3相關(guān)抗原共陽性的腫瘤細(xì)胞，HLA-A24和MAGE-1共陽性或HLA-A24和MAGE-1相關(guān)抗原共陽性的腫瘤細(xì)胞，HLA-A24和CEA共陽性或HLA-A24和CEA相關(guān)抗原共陽性的腫瘤細(xì)胞和/或HLA-A24和HER2/neu共陽性或HLA-A24和HER2/neu相關(guān)抗原共陽性的腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的第10方案涉及第1方案中CTL敏感性細(xì)胞的檢測劑，它含有以第1方案中的CTL作有效成分。該檢測劑是以將該CTL懸浮到保存該CTL適用的培養(yǎng)基、生理鹽水、或磷酸緩沖生理鹽水的形式提供的。培養(yǎng)基一般為RPMI、AIM-γ或X-VIVO10等。另外，可向該培養(yǎng)基或緩沖液中加入血清白蛋白等以使CTL穩(wěn)定。該檢測劑中含有第1方案中的CTL，每種CTL為104～108個(gè)/ml。該檢測劑除用以檢測被檢細(xì)胞中本發(fā)明的CTL的敏感性細(xì)胞外，還可鑒定被檢細(xì)胞所表達(dá)的HLA是否為HLA-A24，對HLA進(jìn)行分型。本發(fā)明的第11方案涉及HLA分子的檢測方法，其特征在于在至少一種選自HLA限制性抗原肽的抗原肽存在的條件下，讓識別該抗原肽與HLA分子復(fù)合體的CTL與被檢細(xì)胞相接觸。例如，可以以第1方案中的CTL與被檢細(xì)胞相接觸時(shí)所產(chǎn)生的變化為指標(biāo)來檢測被檢細(xì)胞表面上的HLA-A24分子。作為CTL與被檢細(xì)胞接觸時(shí)所產(chǎn)生的變化可列舉，如CTL對靶細(xì)胞的溶解、細(xì)胞因子的釋放或CTL的增殖。靶細(xì)胞溶解的檢測可這樣測定，如用放射性同位素和熒光素標(biāo)記被檢細(xì)胞后與CTL混合，通過測定此時(shí)被檢細(xì)胞釋放出的放射性同位素的量和熒光素量來進(jìn)行。細(xì)胞因子釋放的檢測可通過檢測從CTL或被檢細(xì)胞釋放出的GM-CSF、TNF、IFN-γ等的量來進(jìn)行。另外，CTL的增殖可通過細(xì)胞對3H-TdR攝取量的測定以及通過顯微鏡觀察CTL的細(xì)胞數(shù)目來進(jìn)行。通過上述測定值不僅可檢測出HLA-A24分子有無表達(dá)，而且能測定被檢細(xì)胞上HLA-A24分子的表達(dá)量。然而在被檢細(xì)胞是否表達(dá)MAGE-3、MAGE-1、CEA或HER2/neu不明確的情況下，可通過以下方法將HLA-A24分子檢測出來。該方法中，反應(yīng)液中共同存在被檢細(xì)胞和終濃度為0.01～50μg/ml的選自序列號1～6任一序號記載的氨基酸序列所構(gòu)成的抗原肽及其功能性衍生物的至少一個(gè)抗原肽，以及識別該抗原肽與HLA-A24分子的復(fù)合體的第1方案中的CTL，讓CTL與被檢細(xì)胞接觸即可。應(yīng)用本發(fā)明可檢測出腫瘤細(xì)胞的HLA-A24分子，而這是以往應(yīng)用抗HLA抗體必須借助補(bǔ)體活化過程來檢測HLA分子的檢測方法所檢測不出的。另外，本發(fā)明中使用的抗原肽并不特別限定于選自序列1-6中任一氨基酸序列所表示的肽及其功能性衍生物的HLA-A24限制性抗原肽，它可應(yīng)用各種HLA限制性抗原肽來檢測各種HLA分子，例如應(yīng)用HLA-A2限制性抗原肽也可檢測出HLA-A2分子。作為HLA-A2限制性抗原肽可以是，如來自序列號37中MAGE-3的肽，來自序列號38中流感基質(zhì)肽的肽。另外，HLA的各種類型中還存在亞型。例如，HLA-A可分成以A*0201，A*0206，A*0207為代表的10種以上的亞型。由于HLA限制性抗原肽在各亞型間也不同，所以在作為制癌劑利用CTL的時(shí)候，連HLA分子的亞型也要決定，這一點(diǎn)是很重要的。應(yīng)用抗HLA抗體來檢測HLA分子的方法(分型)對亞型的分型是不可能的，而本方法可以。例如，應(yīng)用具有序列號37中氨基酸序列的肽可誘導(dǎo)出A*0201限制性的CTL，將該CTL與該肽聯(lián)合應(yīng)用，可測定出被檢細(xì)胞HLA-A2分子的亞型。另外本方法具有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用從被檢細(xì)胞提取出的DNA，通過DNA分型法可檢測出細(xì)胞表面上實(shí)際表達(dá)的HLA分子。實(shí)施例以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體地說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1MAGE-3抗原肽特異性CTL的制備(1)本實(shí)施例中的CTL通過應(yīng)用金黃色葡萄球菌(StaphylococwsauneusCowan-1；SAC-1)的誘導(dǎo)方法來制備。(1)誘導(dǎo)CTL時(shí)應(yīng)用的肽的選擇及合成對于由314個(gè)氨基酸構(gòu)成的MAGE-3蛋白質(zhì)的氨基酸序列，以具有HLA-A24結(jié)合性基元構(gòu)造的序列(N末端第2位為Try、Phe、Trp、Met中的任一種氨基酸，C末端為Leu、Ile、Phe、Trp中的任一種氨基酸的肽)為中心。同時(shí)考慮其它位置的氨基酸種類進(jìn)行檢索。結(jié)果表明作為MAGE-3抗原肽的候補(bǔ)肽，存在如表1所示的7種肽。表1表1中序列號這一項(xiàng)中的序號表示顯示名肽的氨基酸序列的表的序列號。另外，MAGE-3中的位置這一項(xiàng)中的序號表示從MAGE-3蛋白質(zhì)的N末端開始的氨基酸數(shù)。名稱項(xiàng)中的符號表示本發(fā)明者們所命名的肽的名稱。可用肽合成儀(PSSM-8，島津生產(chǎn))通過固相Fmoc法來制備表1中所示的MA3-1～MA3-7七種肽。(2)PBMC的制備按照成分采血從保有HLA-A24的健康人中采血，收集白細(xì)胞部分后再按以下的分離方法來分離PBMC。也就是說，用RPMI1640培養(yǎng)基將所采血樣約稀釋2倍后，重懸到Ficoll-Paque分離液(Pharmacia公司)上，500×g室溫離心20分鐘。用吸管回收中間層的PBMC，洗凈后懸浮到由90％胎牛血清(FCS，ィンタゲン公司)和10％二甲基亞砜(Sigma公司)構(gòu)成的保存液中，保存在液氮中。(3)效應(yīng)細(xì)胞(effectorcell)的制備用下列方法制備用MA3-1、MA3-2、MA3-4、MA3-6、MA3-7中任一種肽單獨(dú)刺激所產(chǎn)生的5種效應(yīng)細(xì)胞。將(2)中制備的保存的PBMC復(fù)蘇后，以細(xì)胞濃度在4×106個(gè)/ml的濃度懸浮到5H-RPMI中。5H-RPMI為向RPMI1640培養(yǎng)基中添加了終濃度為5％(v/v)的人AB型血清(ァ-バィンサィェンス公司制)，終濃度為0.1mm的非必須氨基酸(GibcoBRL公司產(chǎn))、終濃度為1mM的丙酮酸鈉(GibcoBRL公司產(chǎn))、終濃度為4mM的L-谷氨酸胺(GibcoBRL公司產(chǎn))、終濃度為10μg/ml的硫酸慶大霉素(ァ-バィンサィェンス公司產(chǎn))的培養(yǎng)基。將25ml細(xì)胞懸浮液加入到結(jié)合了抗CD4抗體的T-150培養(yǎng)瓶)AISMicro(Ellector，ァプラィドィシュ-ンサィェンス公司制)中，室溫反應(yīng)1小時(shí)后，回收非粘附細(xì)胞，以2×106個(gè)/ml的濃度懸浮到5H-RPMI中。將該懸浮液分別與用MA3-1，MA3-2、MA3-4、MA3-6、MA3-7中任一種肽按照后面實(shí)施例8(1)中的方法制備的經(jīng)SAC-1處理的5種初次刺激用抗原呈遞細(xì)胞分別等量混合，加入終濃度為15ng/ml的IL-7(ジェンザィム公司產(chǎn))，24孔培養(yǎng)板中各孔注入2ml，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。第2天加入終濃度為10ng/ml的IL-10(R&D公司產(chǎn))。6天后半量棄去培養(yǎng)上清，加入等量的含20ng/mlIL-7的5H-RPMI。由培養(yǎng)3天后將細(xì)胞離心，回收，以細(xì)胞達(dá)2×106個(gè)/ml的濃度懸浮到5H-RPMI中。將該懸浮液以1ml/孔加入到含有用MA3-1、MA3-2、MA3-4、MA3-6、MA3-7中任一種肽按照后面實(shí)施例8(2)的方法制備的抗原呈遞細(xì)胞的培養(yǎng)板中，用同肽進(jìn)行再刺激。次日，加入終濃度為10ng/ml的IL-10，再每隔2日，半量棄除培養(yǎng)上清，加入等量含20IU/mlγIL-2(鹽野義制藥公司產(chǎn))的5H-RPMI，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。同樣的刺激再進(jìn)行3次后回收細(xì)胞，作為效應(yīng)細(xì)胞。(4)CTL靶細(xì)胞的制備用表達(dá)HLA-A24的EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞TISI(WSNO9042)作為測定細(xì)胞殺傷活性的靶細(xì)胞。首先在測定前一天，在單獨(dú)含有10μg/ml的(1)中制備的MA3-1、MA3-2、MA3-6、MA3-4、MA3-7中任一種肽的5種培養(yǎng)基(以下將在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)的TISI用TISI(+)表示)或不含有肽的培養(yǎng)基〔以下將在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)的TISI用TISI(-)表示〕中將TISI細(xì)胞培養(yǎng)一晚。測定當(dāng)天，將5種TISI(+)和TISI(-)細(xì)胞各5×106個(gè)分別加入到200μCi的Na251CrO4溶液中，37℃下混合1小時(shí)，其后用含有10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液洗凈，這樣制備出51Cr標(biāo)記的標(biāo)記性靶細(xì)胞。(5)CTL的細(xì)胞殺傷活性的測定用5H-RPMI將(3)中的效應(yīng)細(xì)胞稀釋為5×105～1×106個(gè)/ml后，以每孔100μl加入到96孔培養(yǎng)板的各孔中，然后加入含有(4)中制備的1×104個(gè)51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞和3×105個(gè)K562細(xì)胞的100μl細(xì)胞懸浮液。K562細(xì)胞用于去除混入的NK細(xì)胞的非特異性殺傷活性。將上述細(xì)胞懸浮液在400×g離心1分鐘后，于37℃的CO2培養(yǎng)箱中放置5小時(shí)。其后將各孔的培養(yǎng)上清吸取100μl，用γ計(jì)數(shù)器測定游離的51Cr的量。按下面的公式(數(shù)1)計(jì)算特異性細(xì)胞殺傷活性。特異性細(xì)胞殺傷活性(％)＝〔(各孔的測定值-最小釋放值)/(最大釋放值-量小釋放值)〕×100(數(shù)1)上式(數(shù)1)中，最小釋放值是指加入靶細(xì)胞和K562細(xì)胞的孔的51Cr量，是靶細(xì)胞的51Cr的自然釋放量。最大釋放值表示向靶細(xì)胞中加入表面活性劑TritonX-100，破壞細(xì)胞時(shí)51Cr的釋放量。結(jié)果如表2所示。表2表2中E/T表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比率。結(jié)果顯示用MA3-2誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對添加了MA3-2肽的TISI(+)細(xì)胞具有抗原特異性細(xì)胞殺傷活性。實(shí)施例2MAGE-3抗原肽特異性CTL的制備(2)本實(shí)施例中的CTL是通過應(yīng)用KLH的誘導(dǎo)方法來制備的。抗原肽使用實(shí)施例1的(1)中制備的MA3-1、MA3-2、MA3-4、MA3-6和MA3-7五種肽。(1)PBMC的制備從保有HLA-A24的健康人中采血，按照以下的分離方法分離PBMC。即，將所采血液懸浮到等量的RPMI1640培養(yǎng)液中，重懸到Ficoll-paque分離液上，500×g室溫離心25分鐘。用吸管回收中間層的PBMC，加入到15ml的離心管中，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌3次。然后以終濃度為4×106個(gè)/ml將細(xì)胞懸浮到5H-RPMI中。(2)效應(yīng)細(xì)胞的制備按照以下方法制備用MA3-1、MA3-2、MA3-4、MA3-6、MA3-7任一種肽個(gè)別刺激所產(chǎn)生的5種效應(yīng)細(xì)胞。將(1)中制備的PBMC與加入了20μg/ml肽的5H-RPMI等量混合后，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中放置2～3小時(shí)。向其中加入終濃度分別為5μg/ml、25ng/ml的KLH(カルビォケム公司產(chǎn))溶液和IL-7溶液，以2ml/孔將該細(xì)胞懸浮液加到24孔培養(yǎng)板的2孔中，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后，加入60μl含有1000IU/mlγIL-2的5H-RPMI(γIL-2的終濃度為30IU/ml)。培養(yǎng)1周后，離心回收細(xì)胞，以5×103個(gè)/ml的濃度將細(xì)胞懸浮到5H-RPMI中。將該懸浮液以1ml/孔加入到含有任何一種按照后面實(shí)施例8(4)中的方法，用MA3-1、MA3-2、MA3-4、MA3-6、MA3-7任一種肽制備的抗原呈遞細(xì)胞的5種培養(yǎng)板中，進(jìn)行再刺激。次日加入60μlγIL-2溶液(1000IU/ml)，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，同樣的再刺激再進(jìn)行4次后，回收細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。將用上述方法所得到的5種效應(yīng)細(xì)胞以4×106個(gè)/ml的濃度懸浮到5H-RPMI中。(3)CTL靶細(xì)胞的制備除應(yīng)用與實(shí)施例1(4)同樣制備的TISI(-)，5種TISI(+)細(xì)胞作標(biāo)記的靶細(xì)胞外，還應(yīng)用MAGE-3及HLA-A24共陽性的WiDr(大腸癌細(xì)胞株)、TEll(食道癌細(xì)胞株)、MRKnu1(乳腺癌細(xì)胞株)。還使用了MAGE-3陽性、HLA-A24陰性的癌細(xì)胞株KATO-III(胃癌細(xì)胞株)。WiDr、TEll、MRKnu1和KATO-III各5×106個(gè)細(xì)胞在200μCi的Na251CrO4溶液中，37℃下混合1小時(shí)，其后用含有10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌，由此進(jìn)行51Cr標(biāo)記。(4)CTL的細(xì)胞殺傷活性的測定用(2)中制備的效應(yīng)細(xì)胞和(3)中制備的靶細(xì)胞測定細(xì)胞的殺傷活性。用TISI(-)和TISI(+)細(xì)胞作靶細(xì)胞的時(shí)候，用與實(shí)施例1(5)相同的方法進(jìn)行測定。但效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的反應(yīng)時(shí)間為4.5小時(shí)。用其它4種標(biāo)記的癌細(xì)胞株作靶細(xì)胞的時(shí)候，向96孔培養(yǎng)板的各孔中以100μl/孔(4×105個(gè)/孔)分別加入上述(2)中的效應(yīng)細(xì)胞懸浮液，然后加入含5×103個(gè)51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞和1.5×105個(gè)K562細(xì)胞的100μl的細(xì)胞懸浮液。400×g離心1分鐘后，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中放置4.5個(gè)小時(shí)。其后吸取100μl各孔的培養(yǎng)液上清，用γ計(jì)數(shù)器來測定釋放的51Cr量。特異性細(xì)胞殺傷活性的計(jì)算與實(shí)施例1(5)相同。結(jié)果如表3所示。表3</tables>表3中E/T為效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比率，ND表示未進(jìn)行測定。由表，由MA3-2或MA3-4誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞在各種E/T情況下對TISI(-)和TISI(+)細(xì)胞的特異性殺傷活性曲線如圖1和圖2所示，在各種E/T條件下對WiDr、TEll、MRKnu1細(xì)胞的特異性殺傷活性曲線如圖3和圖4所示。圖1是應(yīng)用MA3-2所誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)果，圖2是應(yīng)用MA3-4所誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)果。另外四角符號(□)表示用TISI(+)細(xì)胞作靶細(xì)胞的結(jié)果，菱形(◇)表示用TISI(-)作靶細(xì)胞的結(jié)果。白圓(○)表示用MRKnu1作靶細(xì)胞的結(jié)果。圖3是應(yīng)用MA3-2所誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)果，圖4是應(yīng)用MA3-4所誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)果，菱形(◇)表示用TE-I1作靶細(xì)胞的結(jié)果。空心圓(○)表示用MRKnu1作靶細(xì)胞的結(jié)果。圖3及圖4中所示的細(xì)胞殺傷活性可被反應(yīng)系中共存的I類抗體(W6/32)所抑制。另外，由MA3～2或MA3-4所誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對MAGE-3陽性及HLA-A24陰性的癌細(xì)胞株KATO-III無細(xì)胞殺傷活性。由以上結(jié)果可知，由MA3-2、MA3-4肽所誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞具有抗原特異性的細(xì)胞殺傷作用，并且是對HLA-A24及MAGE-3共陽性癌細(xì)胞有細(xì)胞殺傷作用的CTL。實(shí)施例3MAGE-1抗原肽特異性CTL的制備本實(shí)施例中的CTL是應(yīng)用KLH誘導(dǎo)法來進(jìn)行制備的。(1)誘導(dǎo)CTL所用肽的篩選和合成與實(shí)施例1(1)同樣，對于由309個(gè)氨基酸構(gòu)成的MAGE-1蛋白質(zhì)的氨基酸序列〔分子免疫學(xué)(MolecularImmunology)，第31卷，第1423～1430頁(1994)〕，以具有HLA-A24結(jié)合性基元結(jié)構(gòu)的序列為中心，同時(shí)考慮其它位置的氨基酸種類進(jìn)行檢測，結(jié)果如表4所示，篩選了5種肽作為候補(bǔ)抗原肽。表4表4中的序列號這一項(xiàng)中的序號代表表示各肽的氨基酸序列的序列表的序列號。另外，MAGE-1中的位置這一項(xiàng)中的序號表示MAGE-1蛋白質(zhì)從N末端的氨基酸數(shù)。名稱這一項(xiàng)中的符號表示由本發(fā)明者們命名的肽的名稱。可用肽合成儀合成表4中所示的MA1-1～MA1-5的5種肽。(2)依照應(yīng)用KLH的誘導(dǎo)方法來制備MAGE-1抗原肽特異性CTL用與實(shí)施例2(2)同樣的方法，應(yīng)用按后面實(shí)施例8(4)中的方法，用實(shí)施例3(1)中制備的MA1-1、MA1-2、MA1-3、MA1-4、MA1-5中的任一種肽和MA1-1、MA1-2、MA1-3、MA1-4、MA1-5中的任一種肽制備的抗原呈遞細(xì)胞來制備效應(yīng)細(xì)胞，測定其對各種靶細(xì)胞的細(xì)胞殺傷活性。除應(yīng)用TISI(-)和用添加了MA1-1、MA1-2、MA1-3、MA1-4、MA1-5中任一種肽的培養(yǎng)基培養(yǎng)的5種TISI(+)作靶細(xì)胞外，還應(yīng)用了MAGE-1和HLA-A24共陽性的NUGC-3(胃癌細(xì)胞株)、TE-11、MAGE-1陽性和HLA-A24陰性的KATO-III、MAGE-1和HLA-A24共陽性的Raji(淋巴瘤)作靶細(xì)胞。由MA1-1所誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞在各種E/T條件下對各種靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞殺傷活性曲線如圖5所示。圖5中實(shí)心圓(●)表示用NUGC-3作靶細(xì)胞的結(jié)果，黑四角(■)表示用TEll，倒三角()表示用KATOIII，菱形(◇)表示用Raji，三角形(△)表示用TISI(-)作靶細(xì)胞的結(jié)果。再者，對用添加了MA1-1的培養(yǎng)基所得到的TISI(-)、圖5所示的NUGC-3細(xì)胞株以及TE-11細(xì)胞株的細(xì)胞殺傷活性，可被反應(yīng)系中共存的I類抗體所抑制。因此該結(jié)果表明，用MA1-1誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞是針對HLA-A24和MAGE-1共陽性的癌細(xì)胞株的CTL。實(shí)施例4CEA抗原肽特異性CTL的制備(1)與實(shí)施例1同樣，本實(shí)施例中通過應(yīng)用SAC-1的CTL的誘導(dǎo)方法來制備CTL。(1)誘導(dǎo)CTL所用肽的選擇和合成對于由464個(gè)氨基酸構(gòu)成的CEA蛋白質(zhì)的氨基酸，以其有HLA-A24結(jié)合性基元結(jié)構(gòu)的序列為中心，同時(shí)考慮其它位置的氨基酸的種類來進(jìn)行檢索。結(jié)果如表5所示，證明存在5種肽。表5</tables>表5中序列號項(xiàng)中的序號代表表示各肽的氨基酸序列的序列表的序列號。另外，CEA蛋白質(zhì)中的位置這一項(xiàng)中的序號表示由CEA蛋白質(zhì)中N末端開始的氨基酸數(shù)。名稱項(xiàng)中的代號表示由本發(fā)明人命名的肽的名稱。表5中所示的5種肽可用肽合成儀進(jìn)行合成。(2)效應(yīng)細(xì)胞的制備應(yīng)用與實(shí)施例1(2)同樣的方法制備的保存PBMC、按照后面實(shí)施例8(1)的方法用CE-1、CE-3、CE-4、CE-5中任一種肽制備的須SAC-1處理的初次刺激用抗原呈遞細(xì)胞以及含有任何一種用CE-1、CE-3、CE-4、CE-5中任一種肽按照后面實(shí)施例8(2)的方法制備的抗原呈遞細(xì)胞的5種培養(yǎng)板，用與實(shí)施例1(3)同樣的方法制備用CE-1、CE-3、CE-4、CE-5中任一種肽個(gè)別刺激的4種效應(yīng)細(xì)胞。(3)CTL靶細(xì)胞的制備可應(yīng)用與實(shí)施例1(4)同樣的方法，用添加了CE-1、CE-3、CE-4、CE-5中任一種肽的培養(yǎng)基培養(yǎng)所得的5種TISI(+)和胃癌細(xì)胞株KMN-45(HLA-A24及CEA陽性)，作為用于測定細(xì)胞殺傷活性的靶細(xì)胞。與實(shí)施例1(4)的方法相同，在測定細(xì)胞殺傷活性的當(dāng)天標(biāo)記上述各細(xì)胞。(4)CTL的細(xì)胞殺傷活性的測定應(yīng)用(2)中的效應(yīng)細(xì)胞和(3)中的靶細(xì)胞，按與實(shí)施例1(5)相同的方法計(jì)算出特異性細(xì)胞殺傷活性。結(jié)果如表6所示。表6<表6中E/T表示效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，用CE-3誘導(dǎo)所得的效應(yīng)細(xì)胞對添加了CE-3肽的培養(yǎng)基所培養(yǎng)的TISI(+)具有抗原肽特異性細(xì)胞殺傷活性，同時(shí)對MKN-45也有細(xì)胞殺傷活性。實(shí)施例5CEA抗原肽特異性CTL的制備(2)本實(shí)施例中的CTL是通過應(yīng)用抗原呈遞用的樹突狀細(xì)胞(DC)來進(jìn)行誘導(dǎo)而制備的。從健康人的PBMC誘導(dǎo)識別對于實(shí)施例4(1)中制備的CE-2和CE-3兩種肽的效應(yīng)細(xì)胞，測定其細(xì)胞殺傷活性。(1)效應(yīng)細(xì)胞的制備按下述方法制備用CE-2或CE-3任一種肽個(gè)別刺激的2種效應(yīng)細(xì)胞。將實(shí)施例1(2)中制備的PBMC融解后，以2×107個(gè)/ml的細(xì)胞濃度懸浮到4℃的含1％人AB型血清的PBS(以下略作1HPBS)中。每2×107個(gè)/ml的PBMC中，加入14μl的結(jié)合了用1HPBS洗滌后的抗CD8抗體的珠子(DynabeadsM450，ダィナル公司產(chǎn))，4℃下反應(yīng)1小時(shí)后，除去非粘附細(xì)胞。除去非粘附細(xì)胞后，相對于最初用的細(xì)胞數(shù)1×108個(gè)，懸浮到0.9ml的1H-PBS中，加入0.1ml的細(xì)胞解離用珠子(DETACHaBEAD，ダィナル公司產(chǎn))。室溫混合1小時(shí)后回收解離的細(xì)胞，用1H-PBS洗滌。將洗凈的細(xì)胞懸浮到5H-RPMI中，達(dá)到2×106個(gè)/ml，分別與按實(shí)施例8(3)的方法用CE-2或CE-3任一種肽制備的DC懸浮液等量混合。向該懸浮液中加入終濃度為10ng/ml的IL-7，每孔0.5ml，分別加入到48孔培養(yǎng)板中，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日加入50μl含100ng/mlIL-10的5H-RPMI。1周后除去各孔的培養(yǎng)上清，將細(xì)胞懸浮到0.5ml的5H-RPMI中。將該懸浮液加入到含有任何一種用CE-2或CE-3中任一種肽按實(shí)施例8(2)的方法制備的抗原呈遞細(xì)胞的培養(yǎng)板中，進(jìn)行再刺激。次日加入終濃度為10mg/ml的IL-10，再每隔2日，去除半量培養(yǎng)上清，加入等量含20IU/mlγIL-2的5H-RPMI，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。再進(jìn)行同樣的再刺激3次后，測定各孔中的效應(yīng)細(xì)胞對TISI(+)、TISI(-)的細(xì)胞殺傷活性，再單獨(dú)用抗CD3抗體或用作刺激抗原的肽使顯示細(xì)胞殺傷活性的效應(yīng)細(xì)胞增殖。將增殖的細(xì)胞懸浮到5H-RPMI中用下面(3)的方法測定細(xì)胞殺傷活性。(2)CTL靶細(xì)胞的制備與實(shí)施例4(3)同樣，制備TISI(-)和用添加了CE-2或CE-3的培養(yǎng)基培養(yǎng)的2種TISI(+)作為靶細(xì)胞。另外用100IU/ml的IPN-γ37℃處理MKN-4548小時(shí)。在測定細(xì)胞殺傷活性的當(dāng)天，按與實(shí)施例4(3)同樣的方法用51Cr標(biāo)記上述4種靶細(xì)胞。(3)CTL的細(xì)胞殺傷活性的測定應(yīng)用(1)中制備的效應(yīng)細(xì)胞和(2)中制備的標(biāo)記靶細(xì)胞，用與實(shí)施例1(5)同樣的方法測定細(xì)胞殺傷活性。結(jié)果如表7所示。表7表7中E/T表示效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的比例。結(jié)果表明，CE-2或CE-3任一種肽所誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對TISI(+)和MKN-45顯示抗原肽特異性的細(xì)胞殺傷活性，它是CEA特異性CTL。實(shí)施例6HER2/neu抗原肽特異性CTL的制備(1)本實(shí)施例中CTL的制備與實(shí)施例1同樣，應(yīng)用SAC-1進(jìn)行CTL的誘導(dǎo)。(1)誘導(dǎo)CTL所用肽的選擇及合成對于由1255個(gè)氨基酸構(gòu)成的HER2/neu蛋白質(zhì)的氨基酸序列，以具有HLA-A24結(jié)合性基元結(jié)構(gòu)的序列為中心，考慮其它位置的氨基酸種類進(jìn)行檢索。結(jié)果如表8所示，選擇了5種肽，用肽合成儀來合成了它們。表8</tables>表8中序列號這一項(xiàng)中的序號代表表示各肽的氨基酸序列的序列表的序列號。另外，HER2/neu蛋白質(zhì)中的位置項(xiàng)中的序號表示HER2/neu蛋白質(zhì)中從N末端開始的氨基酸數(shù)。名稱項(xiàng)中的代號表示本發(fā)明人命名的肽。(2)效應(yīng)細(xì)胞的制備按下述方法制備了用HE-1～HE-5中任一種肽個(gè)別刺激的5種效應(yīng)細(xì)胞。應(yīng)用實(shí)施例1(2)中制備的保存PBMC，用HE-1～HE-5中任一種肽按后面實(shí)施例8(1)中記載的方法制備的經(jīng)SAC-1處理的初次刺激用抗原呈遞細(xì)胞，以及含有任何一種用HE-1～HE-5任一種肽按后面實(shí)施例8(2)的方法制備的抗原呈遞細(xì)胞的5種培養(yǎng)板，用與實(shí)施例1(3)同樣的方法制備由HE-1～HE-5任一種肽刺激的效應(yīng)細(xì)胞。(3)CTL靶細(xì)胞的制備應(yīng)用與實(shí)施例1(4)同樣的方法，應(yīng)用含有HE-1～HE-5任一種肽的培養(yǎng)基所培養(yǎng)的5種TISI(+)及卵巢癌細(xì)胞株SKOV3(HLA-A3及HER2/neu陽性)及其HLA-A24轉(zhuǎn)化株SKOV-A24(HLA-A24及HER2/neu陽性)作為測定細(xì)胞殺傷活性的靶細(xì)胞。估測定細(xì)胞殺傷活性的當(dāng)天，按與實(shí)施例1(4)同樣的方法再用51Cr標(biāo)記上述細(xì)胞。(4)CTL的細(xì)胞殺傷活性的測定應(yīng)用(2)中的效應(yīng)細(xì)胞和(3)中的靶細(xì)胞，用與實(shí)施例1(5)同樣的方法計(jì)算特異性細(xì)胞殺傷活性。結(jié)果如表9所示。表9表9中E/T表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例。該結(jié)果顯示HE-1誘導(dǎo)出的效應(yīng)細(xì)胞對用添加了HE-1肽的培養(yǎng)基培養(yǎng)的TISI(+)具有抗原肽特異性的細(xì)胞殺傷作用。實(shí)施例7HER2/neu特異性CTL的制備(2)本實(shí)施例中的CTL是通過應(yīng)用抗原呈遞用的樹突狀細(xì)胞(DC)進(jìn)行誘導(dǎo)的方法來制備的。用健康人的PBMC誘導(dǎo)識別實(shí)施例6(1)中制備的HE-1肽的效應(yīng)細(xì)胞，測定細(xì)胞的殺傷活性。(1)效應(yīng)細(xì)胞的制備應(yīng)用實(shí)施例1(2)中制備的PBMC，用HE-1肽按后面實(shí)施例8(3)中的方法制備的DC，以及含有用HE-1肽按后面實(shí)施例8(2)中的方法制備的抗原呈遞細(xì)胞的培養(yǎng)板，按與實(shí)施例5(1)同樣的方法制備用HE-1肽刺激出的效應(yīng)細(xì)胞。(2)CTL靶細(xì)胞的制備與實(shí)施例6(3)同樣制備TISI(-)、用添加了HE-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)的TISI(+)作為靶細(xì)胞。用100U/ml的IFN-γ處理SKOV3和SKOV3-A24，37℃處理48小時(shí)。在測定細(xì)胞殺傷活性的當(dāng)天，按與實(shí)施例1(4)相同的方法用51Cr標(biāo)記上述4種靶細(xì)胞。(3)CTL的細(xì)胞殺傷活性的測定應(yīng)用(1)中制備的效應(yīng)細(xì)胞和(2)中制備的靶細(xì)胞，按與實(shí)施例1(5)同樣的方法測定細(xì)胞殺傷活性。結(jié)果如表10所示。表10表10中E/T表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示用HE-1肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對TISI(+)及SKOV3-A24具有抗原特異性細(xì)胞殺傷作用，這表明它是HER2/neu特異性CTL。實(shí)施例8非增殖性抗原呈遞細(xì)胞的制備(1)經(jīng)SAC-1處理的抗原呈遞細(xì)胞的制備將實(shí)施例1(2)中制備的保存PBMC融解后，懸浮到5H-RPMI中，使細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml。向細(xì)胞懸浮中加入終濃度為0.005％的SAC-I(Pansorbincells，カルビォケム公司產(chǎn))，終濃度為20μg/ml的免疫珠(兔抗人IgM，バィォラド公司產(chǎn))，再加入終濃度為20ng/ml的IL-4(ジェンザィム公司產(chǎn))，加入到6孔培養(yǎng)板中，5ml/孔，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。用含有終濃度為1％的牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水洗滌培養(yǎng)了4天的細(xì)胞，以1×107個(gè)/ml的濃度將細(xì)胞懸浮到含有1％BSA和3μg/mlβ2微球蛋白的檸檬酸緩沖液(pH3.0)中后，冰中處理2分鐘。然后用5倍細(xì)胞懸液體積的含有1％BSA、3μg/mlβ2微球蛋白和10μg/ml肽的磷酸緩沖液(pH7.5)洗滌細(xì)胞后，懸浮到含有1％BSA、3μg/mlβ2-微球蛋白和50ug/ml肽的磷酸緩沖液中，20℃下反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)后進(jìn)行X線照射(5500Rad)，以1×106個(gè)/ml的濃度將細(xì)胞懸浮到5H-RPMI中，作為初次刺激用的抗原呈遞細(xì)胞。(2)由粘附細(xì)胞制備抗原呈遞細(xì)胞將實(shí)施例1(2)中制備的PBMC融解后，用X線照射(5500Rad)。然后將懸浮到5H-PBMC細(xì)胞濃度達(dá)4×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液加到24孔培養(yǎng)板中，1ml/孔，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5小時(shí)。其后吸去難粘附細(xì)胞，再用RPMI1640洗滌各孔以除去非粘附細(xì)胞。然后各孔中加入0.5ml含有3μg/mlβ2微球蛋白和20μg/ml肽的5H-RPMI，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2小時(shí)后吸去上清，用5H-RPMI洗滌1次，各孔中殘余的細(xì)胞作為再刺激用的抗原呈遞細(xì)胞。(3)富含DC的抗原呈遞細(xì)胞的制備將實(shí)施例2(1)中制備的保存PBMC融解后，懸浮到5H-RPMI中，使細(xì)胞濃度達(dá)2×106個(gè)/ml，將10ml該細(xì)胞懸浮液加入到T-25培養(yǎng)瓶(ヲンケ公司產(chǎn))中。37℃下放置1.5小時(shí)后，去除非粘附細(xì)胞，向剩余的粘附細(xì)胞中加入10ml含有1000U/mlGM-CSF(ジェンザィム公司制)和2000U/mlIL-4(ジェンザィム公司制)的5H-RPMI，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)DC細(xì)胞。7日后回收浮游細(xì)胞。將粘附細(xì)胞回收到細(xì)胞解離緩沖液(GibcoBRL公司產(chǎn))中，用5H-RPMI洗滌后與浮游細(xì)胞結(jié)合。將回收細(xì)胞懸浮到含有40μg/ml肽，3μg/mlβ2微球蛋白，加入了1％人血清白蛋白的生理鹽水中，使細(xì)胞達(dá)3×106個(gè)/ml，在20℃的恒溫箱中反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)后用X線照射(5500Rad)，然后用加入了1％人血清白蛋白的生理鹽水稀釋，達(dá)到1×106個(gè)/ml，作為抗原呈遞細(xì)胞。(4)由全PBMC制備抗原呈遞細(xì)胞用絲裂霉素處理〔PBMC1×107個(gè)/ml的懸浮液中加入絲裂霉素C，使其終濃度成200μg/ml(ICNバィォメディカルズ公司產(chǎn))，放置30分鐘〕用與實(shí)施例2(1)同樣的方法制備的PBMC，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌3次后，與加入1的肽達(dá)20μg/ml的5H-RPMI等量混合，然后分加到24孔培養(yǎng)板中，1ml/孔，作為抗原呈遞細(xì)胞使用。實(shí)施例9CEA抗原肽功能性衍生物的制作(1)CE-2變異體及CE-3變異體的合成以實(shí)施例5(1)中合成的CE-2為基礎(chǔ)，如表11所示設(shè)計(jì)了12種變異體。表11序列號名稱24CE-20125CE-20239CE-20340CE-20441CE-20542CE-20643CE-20744CE-20845CE-20946CE-21047CE-21148CE-212同樣，如表12所示，以CE-3為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了17種變異體。表12序列號名稱26CE-30127CE-30228CE-30329CE-30430CE-30531CE-30632CE-30749CE-30850CE-30951CE-31052CE-31153CE-31254CE-31355CE-31456CE-31533CE-316CE-317用肽合成儀制備了表11和12中所示的CE-201～CE212和CE-301～CE-315的27種肽。表12中CE-316的制作是，向?qū)嵤├?(1)中制作的CE-3(2.85μmo1)中加入100μl的DHCP(寶酒造公司產(chǎn))水溶液(10mg/ml)，37℃反應(yīng)19小時(shí)后，用HPLC進(jìn)行純化。另外，CE-317是2分子的CE-3借助于序列號5所表示的CE-3的氨基酸序列中，N末端第4位的半胱氨酸的硫醇基，通過二硫鍵而結(jié)合成的CE-3的二聚體。本肽的制作是將CE-3以0.3mM的濃度溶解在0.02MNH4HCO3水溶液中，37℃下反應(yīng)24小時(shí)后用HPLC進(jìn)行純化。(2)CE-2或CE-3功能性衍生物的鑒定確認(rèn)了實(shí)施例4中獲得的識別CE-2或CE-3與HLA-A24分子的復(fù)合體的CTL是否識別表11及表12中所示的肽或肽的類似體與HLA-A24分子的復(fù)合體。首先確認(rèn)了用與實(shí)施例4(2)同樣的方法制備的識別CE-2的CTL是否對51Cr標(biāo)記的TISI(-)細(xì)胞以及用CE-201～CE-212肽中的任一種按實(shí)施例4(3)中的方法制備的12種51Cr標(biāo)記的TISI(+)細(xì)胞具有殺傷活性。結(jié)果顯示識別CE-2的CTL對用添加了CE-201、CE-203、CE-204、CE-206、CE-207、CE-208、CE-209、CE-210、CE-212的培養(yǎng)基所培養(yǎng)得到的51Cr標(biāo)記的TISI(+)細(xì)胞有顯著的細(xì)胞殺傷活性。而該CTL對51Cr標(biāo)記的TISI(-)細(xì)胞沒有細(xì)胞殺傷活性，由此說明CE-201、CE-203、CE-204、CE-206、CE-207、CE-208、CE-209、CE-210、CE-212為CE-2的功能性衍生物。以4個(gè)健康人的PBMC作研究對象，用與實(shí)施例4(2)中同樣的方法制備出4種識別CE-3而原材料不同的CTL，確認(rèn)其是否對51Cr標(biāo)記的TISI(-)細(xì)胞及用表12中所示的17種肽中的任一種按實(shí)施例4(3)的方法制備的17種51Cr標(biāo)記的TISI(+)細(xì)胞具有細(xì)胞殺傷作用。結(jié)果顯示識別CE-3的CTL對培養(yǎng)基中添加了CE-301、CE-302、CE-305、CE-307、CE-310、CE-311、CE-312、CE-314、CE-316、CE-317中任一種肽所培養(yǎng)出的10種51Cr標(biāo)記的TISI(+)有明顯的細(xì)胞殺傷活性，而該CTL對51Cr標(biāo)記的TISI(-)細(xì)胞無細(xì)胞殺傷活性，這表明CE-301、CE-302、CE-305、CE-307、CE-310、CE-311、CE-312、CE-314、CE-316、CE-317為CE-3的功能性衍生物。實(shí)施例10應(yīng)用CTL檢測HLA-A24分子以人的PBMC作被檢細(xì)胞來檢測用本發(fā)明的CTL能否檢測出HLA-A24分子。應(yīng)用以往方法中的抗HLA抗體判明所表達(dá)的HLA類型的8人，按與實(shí)施例1(2)同樣的方法，從這8人中制備PBMC，作為被檢細(xì)胞PBMC的8個(gè)待檢體。將各待檢體分為2組，一組分別懸浮到溶解的CE-3達(dá)10μg/ml的5H-RPMI中，作為添加CE-3的待檢組。而另一組分別懸浮到5H-RPMI中，作為未添加CE-3的待檢組。各組在37℃放置2小時(shí)后通過離心回收細(xì)胞，除去上清。通過該操作以去除CE-3添加組中過剩的CE-3。然后將上述16種細(xì)胞懸浮到5H-RPMI后，以各孔1×104個(gè)分加到96孔微孔培養(yǎng)板中。然后向各孔中加入實(shí)施例5中用CE-3得到的CTL3×104個(gè)，37℃CO2培養(yǎng)箱中放置22小時(shí)后，用Dnoset，Genzyme公司制，測定各孔上清中的IPN-γ量。結(jié)果證實(shí)，只在加入了從CE-3添加組中表達(dá)HLA-A24分子的人制備的5個(gè)PBMC待檢體的孔中有IPN-γ存在。由此表明應(yīng)用本發(fā)明的CTL可檢測出HLA-A24分子。另一方面，在CE-3添加組中觀測到IPN-γ存在的PBMC待檢體中，孔中加入的PBMC待檢體來自HLA-A24同源的人時(shí)其IPN-γ量為來自HLA-A24異源人的2倍左右。由此表明，應(yīng)用本發(fā)明的CTL可推算出HLA-A24的表達(dá)量。實(shí)施例11用CTL對HLA-A2分子的檢測和對HLA-A2亞型的鑒定應(yīng)用來自序列號37中氨基酸序列所表示的MAGE-3的HLA-A2限制性肽FLWGPRALV，用與實(shí)施例1(3)中同樣的方法，從保有HLA-A2(A*0201)的健康人的PBMC制備效應(yīng)細(xì)胞。在測定細(xì)胞殺傷活性的前一天用含有上述肽10μg/ml的培養(yǎng)基(.221(A2.1)(+))或不含肽的培養(yǎng)基(.221(A2.1)(-))培養(yǎng)作為靶細(xì)胞的HLA-A2細(xì)胞-.221(A2.1)細(xì)胞。測定當(dāng)天，51Cr標(biāo)記的.221(A2.1)(+)或.221(A2.1)(-)細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞混合，5小時(shí)后測定培養(yǎng)基中游離的51Cr量。結(jié)果表明，制備的效應(yīng)細(xì)胞是具有肽特異性殺傷活性的CTL。另外，.221(A2.1)(+)或.221(A2.1)(-)細(xì)胞與CTL混合1日后測定其上清中的IFN-γ時(shí)發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)細(xì)胞CTL可釋放肽特異性IFN-γ。擴(kuò)增該CTL后檢測其對各種HLA-A2細(xì)胞有無肽特異性IFN-γ的釋放作用。1)對成株細(xì)胞.221(A2.1)(HLA-A*0201)、CLA(HLA-A*0206)、FUN(HLA-A*0203)、p815(HLA-A*0202)的反應(yīng)性向上述各細(xì)胞中加入10μg/ml的肽FLWGPRALV，37℃培養(yǎng)4小時(shí)。洗去過剩的肽以后，以1×104個(gè)/0.1ml/孔加入到96孔微量板中，反應(yīng)20個(gè)小時(shí)。用未加肽的細(xì)胞作對照，同樣與CTL細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)。從反應(yīng)液中吸取上清，適當(dāng)稀釋后測定IFN-γ的含量。結(jié)果表明該CTL只對.221(A2.1)(HLA-A*0201)引起肽特異性IFN-γ的釋放。2)對人PBMC的反應(yīng)性向3個(gè)健康的自愿者的PBMC(A氏HLA-A*0207/A11；B氏A*0206/A24；C氏A*0201/A*0206)中加入達(dá)10μg/ml的肽FLWGPRALV，37℃培養(yǎng)2小時(shí)。洗去過剩的肽以后，以1×104個(gè)/0.1ml/孔加入到96孔微量板中，向其中加入CTL細(xì)胞1×104個(gè)/0.1ml/孔，反應(yīng)20小時(shí)。用未添加肽的細(xì)胞作對照，同樣與CTL進(jìn)行反應(yīng)，從反應(yīng)液吸取上清，適當(dāng)稀釋后測定IFN-γ的含量。結(jié)果表明，該CTL只對具有HLA-A*0201的C氏的PBMC能引起肽特異性IFN-γ游離。由以上1)、2)的結(jié)果，表明通過應(yīng)用HLA-A2限制性肽及用該肽從HLA-A*0201的PBMC誘導(dǎo)出的CTL不僅能對被檢細(xì)胞進(jìn)行DNA分型，甚至可鑒定HLA-A2的亞型。序列表獨(dú)立章節(jié)序列號33中氨基酸序列的第4位氨基酸為2-羥基-4(R，S)-L-半胱氨酸-S-基-2-環(huán)戊烯-1-酮。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的CTL對HLA-A24和MAGE-3共陽性、HLA-A24和MAGE-1共陽性、HLA-A24和CEA共陽性或HLA-A24和HER2/neu共陽性的腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，可用作用于癌癥治療的細(xì)胞藥物，另外可用于檢測體外摘取的樣品中有無HLA-A24和MAGE-3共陽性的腫瘤細(xì)胞、HLA-A24和MAGE-1共陽性、HLA-A24和CEA共陽性、或者HLA-A24及HER2/neu共陽性的腫瘤細(xì)胞，再者當(dāng)與抗原肽同時(shí)使用時(shí)可用于體外摘取的樣品中細(xì)胞的HLA分型。另外，本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞可用于該CTL的制備或用作制癌劑。再者，以本發(fā)明的抗原肽作有效成分的醫(yī)藥用復(fù)合物可用作CTL的誘導(dǎo)劑，或用作制癌劑。序列表<110>寶酒造株式會(huì)社<120>細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞<130>98-029-PCT<160>56<210>1<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>1IleMetProLysAlaGlyLeuLeuIle15<210>2<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>2ValAlaGluLeuValHisPheLeuLeu15<210>3<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>3AsnTyrLysHisCysPheProGluIle15<210>4<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>4GlnTyrSerTrpPheValAsnGlyThrPhe1510<210>5<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>5ThrTyrAlaCysPheValSerAsnLeu15<210>6<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>6ArgTrpGlyLeuLeuLeuAlaLeuLeu15<210>7<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>7GluAlaAspProThrGlyHisSerTyr15<210>8<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>8AsnTyrProLeuTrpSerGlnSerTyr15<210>9<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>9AsnTrpGlnTyrPhePheProValIle15<210>10<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>10AsnTrpGlnTyrPhePheProValIlePhe1510<210>11<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>11IlePheSerLysAlaSerSerSerLeu15<210>12<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>12IleMetProLysAlaGlyLeuLeuIleIle1510<210>13<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>13IleMetProLysThrGlyPheLeuIle15<210>14<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>14AsnTyrLysHisCysPheProGluIlePhe1510<210>15<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>15IleMetProLysThrGlyPheLeuIleIle1510<210>16<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>16SerTyrValLysValLeuGluTyrValIle1510<210>17<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>17IleTyrProAsnAlaSerLeuLeuIle15<210>18<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>18LeuTyrGlyProAspAlaProThrIle15<210>19<211>9<212>蛋白質(zhì)<213><400>19ValTyrAlaGluProProLysProPhe15<210>20<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>20ProTyrValSerArgLeuLeuGlyIle15<210>21<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>21ValTyrMetIleMetValLysCysTrp15<210>22<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>22AlaTyrSerLeuThrLeuGlnGlyLeu15<210>23<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>23SerTyrGlyValThrValTrpGluLeu15<210>24<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>24GlnTyrSerTrpPheIleAsnGlyThrPhe1510<210>25<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>25GlnTyrSerTrpLeuIleAsnGlyThrPhe1510<210>26<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>26AlaTyrAlaCysPheValSerAsnLeu15<210>27<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>27ThrTyrAlaAlaPheValSerAsnLeu15<210>28<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>28ThrTyrAlaCysAlaValSerAsnLeu15<210>29<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>29ThrTyrAlaCysPheAlaSerAsnLeu15<210>30<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>30ThrTyrAlaCysPheValAlaAsnLeu15<210>31<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>31ThrTyrAlaCysPheValSerAlaLeu15<210>32<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>32ThrTyrAlaCysPheValSerAsnAla15<210>33<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>4<223>Xaa是2-羥基-4(R，S)-L-半胱氨酸-S-基-2-環(huán)戊烯-1-酮<400>33ThrTyrAlaXaaPheValSerAsnLeu15<210>34<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>34TyrLeuSerGlyAlaAsnLeuAsnLeu15<210>35<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>35LysIlePheGlySerLeuAlaPheLeu15<210>36<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>36HisLeuTyrGlnGlyCysGlnValVal15<210>37<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>37PheLeuTrpGlyProArgAlaLeuVal15<210>38<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>流感病毒<400>38GlyIleLeuGlyPheValPheThrLeu15<210>39<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>39AlaTyrSerTrpPheValAsnGlyThrPhe1510<210>40<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>40GlnAlaSerTrpPheValAsnGlyThrPhe1510<210>41<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><22>變異體<400>41GlnTyrAlaTrpPheValAsnGlyThrPhe1510<210>42<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>42ClnTyrSerAlaPheValAsnGlyThrPhe1510<210>43<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>43GlnTyrSerTrpAlaValAsnGlyThrPhe1510<210>44<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>44GlnTyrSerTrpPheAlaAsnGlyThrPhe1510<210>45<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>45GlnTyrSerTrpPheValAlaGlyThrPhe1510<210>46<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>46GlnTyrSerTrpPheValAsnAlaThrPhe1510<210>47<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>47GlnTyr3erTrpPheValAsnGlyAlaPhe1510<210>48<211>10<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>48GlnTyrSerTrpPheValAsnGlyThrAla1510<210>49<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>49ThrTyrAlaAspPheValSerAsnLeu15<210>50<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>50ThrTyrAlaProPheValSerAsnLeu15<210>51<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>51ThrTyrAlaSerPheValSerAsnLeu15<210>52<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>52ThrTyrAlaGlyPheValSerAsnLeu15<210>53<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>53ThrTyrAlaCysPheIleSerAsnLeu15<210>54<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>54ThrTyrAlaCysPheAspSerAsnLeu15<210>55<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>55ThrTyrAlaCysPheMetSerAsnLeu15<210>56<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>變異體<400>56ThrTyrAlaCysPheLysSerAsnLeu1權(quán)利要求1.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，它能夠識別將選自序列號1～6任一序號的氨基酸序列所表示的人主要組織相容性抗原(HLA)-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物的至少一種抗原肽與HLA-A24分子的復(fù)合體呈遞到細(xì)胞表面的細(xì)胞。2.一種制癌劑，它含有權(quán)利要求1的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞作有效成分。3.權(quán)利要求1中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，其特征在于使用選自序列號1～6任一序號的氨基酸序列所表示的人主要組織相容性抗原(HLA)-A24限制性的抗原肽及其功能性衍生物的至少一種抗原肽。4.權(quán)利要求1中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，它包含以選自序列號1～6任一序號的氨基酸序列所表示的人主要組織相容性抗原(HLA)-A24限制性的抗原肽及其功能性衍生物的至少一種抗原肽作有效成分。5.一種制癌劑，它包含有以選自序列號1～6任一序號中的氨基酸序列所表示的人主要組織相容性抗原(HLA)-A24限制性的抗原肽及其功能性衍生物的至少一種抗原肽作有效成分。6.一種抗原呈遞細(xì)胞，它能將選自序列號1～6任一序號的氨基酸序列所代表的人主要組織相容性抗原(HLA)-A24限制性的抗原肽及其功能性衍生物中的至少一種抗原肽與HLA-A24分子形成的復(fù)合體呈遞到細(xì)胞表面。7.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，它含有以權(quán)利要求6中的抗原呈遞細(xì)胞作有效成分。8.一種制癌劑，它含有以權(quán)利要求6的抗原呈遞細(xì)胞作有效成分。9.對權(quán)利要求1中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的敏感之細(xì)胞的檢測方法，其特征在于，它以讓權(quán)利要求1的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞與被檢細(xì)胞接觸時(shí)所產(chǎn)生的變化為指標(biāo)。10.權(quán)利要求1中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的敏感性細(xì)胞的檢測劑，它含有以權(quán)利要求1的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞作有效成分。11.人主要組織相容性抗原(HLA)分子的檢測方法，其特征在于，在選自人主要組織相容性抗原(HLA)限制性抗原肽的至少一種抗原肽存在的條件下，讓識別該抗原肽與HLA分子的復(fù)合體的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞與被檢細(xì)胞相接觸。全文摘要識別能將抗原肽與HLA－A24分子的復(fù)合體呈遞到細(xì)胞表面的細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL),該抗原肽選自序列號1－6中任一序號的氨基酸序列所代表的人主要組織相容性抗原(HLA)－A24限制性抗原肽及其功能性衍生物中的至少一種;含有該CTL的制癌劑;該CTL的誘導(dǎo)方法;該CTL的誘導(dǎo)劑;含有至少一種選自該HLA－A24限制性抗原肽及其功能性衍生物的制癌劑;能將選自前面HLA－A24限制性抗原肽及其功能性衍生物的至少一種抗原肽與HLA－A24分子的復(fù)合體呈遞到細(xì)胞表面的抗原呈遞細(xì)胞;含有該抗原呈遞細(xì)胞的CTL的誘導(dǎo)劑;含有該抗原呈遞細(xì)胞的制癌劑;該CTL的敏感性細(xì)胞的檢測方法;含有該CTL的該CTL的敏感性細(xì)胞的檢測劑及其HLA分子的檢測方法。文檔編號A61K39/00GK1264423SQ98807329公開日2000年8月23日申請日期1998年7月13日優(yōu)先權(quán)日1997年7月15日發(fā)明者竹迫一任,糠谷育衛(wèi),安本雅純,巖崎朋子,出野美津子,秋吉毅,藤江達(dá)郎,田中文明,加藤郁之進(jìn)申請人:寶酒造株式會(huì)社