專利名稱：處理白細(xì)胞的方法、白細(xì)胞組合物及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及不能增殖但保留功能的細(xì)胞組合物，以及這些組合物的制備方法和應(yīng)用。更特別地，本發(fā)明涉及制備用于轉(zhuǎn)輸?shù)脑鲋骋种瓢准?xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
施行骨髓移植(BMT)治療多種惡性及非惡性血液病，包括白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、貧血和免疫缺陷病，如重度聯(lián)合免疫缺陷(SCTD)、維-奧二氏綜合征和再生障礙性貧血。
白血病是造血組織的惡性腫瘤。這些腫瘤可分為兩種主要的類型慢性和急性。急性白血病的特征在于未分化的細(xì)胞群體(例如，急性淋巴細(xì)胞性白血病(或“ALL”)和急性骨髓性白血病(或“AML”))，而慢性白血病通常顯示更成熟的形態(tài)學(xué)(例如，慢性髓細(xì)胞性白血病(或“CML”)和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(或“CLL”))。美國(guó)1995年有大約25700例新的白血病病例，其中約4500例是CML。1996年美國(guó)診斷出大約7000例新的CML病例，其中約30％最終接受異體BMT(白血病協(xié)會(huì)白血病協(xié)會(huì)站點(diǎn)，1997)。預(yù)計(jì)約50％的BMT患者遭受白血病的復(fù)發(fā)。
白血病治療的一般目的在于抑制異常形態(tài)的增殖，并恢復(fù)骨髓中的“正常”血細(xì)胞生成。治療方案可包括化學(xué)治療、放射治療和骨髓移植的組合。在“屬”同種異體骨髓移植(異體BMT)方案中，首先給予白血病患者重度骨髓抑制劑量的化學(xué)放射治療。該治療階段用來(lái)根除所有白血病細(xì)胞及其先祖。抑制病理性造血生理學(xué)后，將功能上無(wú)作用的骨髓替換為同種異體無(wú)病的干細(xì)胞。在最佳條件下，移植的骨髓利于正常多克隆造血增殖的恢復(fù)。疾病控制的改善也依賴于移植物對(duì)白血病細(xì)胞的免疫介導(dǎo)的反應(yīng)，稱為移植物抗白血病(GVL)效應(yīng)。
骨髓不是造血祖細(xì)胞的唯一來(lái)源。外周血和臍血也可作為干細(xì)胞的來(lái)源。參見(jiàn)McCullough，新一代血液成分，輸血(Transfusion)35374(1995)。可系統(tǒng)施用營(yíng)養(yǎng)因子(如粒細(xì)胞-集落刺激因子)，來(lái)提高外周血干細(xì)胞的增殖，從而產(chǎn)生骨髓的替代品，用于收獲造血祖細(xì)胞。
遺憾地，成功BMT的主要障礙是移植物抗宿主疾病(GVHD)、感染和原發(fā)疾病的復(fù)發(fā)。GVHD和感染引起移植后前100天中10-30％的發(fā)病率和死亡率(《基礎(chǔ)與臨床免疫學(xué)》(Basic and ClinicalImmunology)，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(編)，Appleton & Lange，Norwalk CT，1994)。如果BMT失敗，殘余腫瘤細(xì)胞的無(wú)限制增殖可導(dǎo)致“復(fù)發(fā)”。參見(jiàn)Slavin等人，“用免疫活性淋巴細(xì)胞及其活化細(xì)胞因子對(duì)最小殘余疾病的免疫治療”，癌癥研究(Cancer Investigation)，10221(1992)。過(guò)去在這種情況下的醫(yī)學(xué)治療選擇非常有限。例如，第二次骨髓移植和/或細(xì)胞毒性藥物的廣泛應(yīng)用與極低的存活率相關(guān)。
然而，由對(duì)移植生物學(xué)的更充分的理解得出一種治療策略。對(duì)有或無(wú)T細(xì)胞排除下的BMT的研究顯示，對(duì)于能用于CML患者最小殘余疾病或“全面”復(fù)發(fā)的治療的抗白血病治療而言，T細(xì)胞是重要的?；谶@種理解，骨髓移植后用供體白細(xì)胞輸入(DLI)對(duì)白血病患者的治療成為一種公認(rèn)的治療。參見(jiàn)Kolb等人，血液(Blood)762462(1990)；Lim，S H.等人，美國(guó)血液學(xué)雜志(Am.J.Hem.)5461-67，1997；Giralt，S.A.等人，腫瘤學(xué)現(xiàn)代觀點(diǎn)(Cur.Op.Onc.)889-95，1996。白細(xì)胞的轉(zhuǎn)輸也已被用作骨髓移植失敗后的過(guò)繼免疫治療，來(lái)誘導(dǎo)永久的緩解。參見(jiàn)，J.Mccullough，新一代血液成分，輸血，35374(1995)。DLI對(duì)于CML的治療特別有效，但也可用于AML、ALL和CLL的治療。DLI也已用于脊髓發(fā)育不良(MDS)、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病和多發(fā)性骨髓瘤的治療。輸入的細(xì)胞似乎引起對(duì)受體惡性細(xì)胞的免疫應(yīng)答。根據(jù)對(duì)bcr-abl重排(費(fèi)城染色體)的PCR分析，大約70％的復(fù)發(fā)為慢性期的CML患者在DLI后達(dá)到持久的細(xì)胞遺傳免除，并成為殘余疾病陰性的(Drobyski，W.R.等人，血液822310-2318，1993)。
然而，該方法具有危險(xiǎn)，因?yàn)榛颊咧械?0％發(fā)生GVHD，56％發(fā)生骨髓發(fā)育不良。這是治療失敗的兩個(gè)主要原因，導(dǎo)致可達(dá)20％的反應(yīng)患者的死亡(Champlin，R.等人，血液學(xué)學(xué)報(bào)(Act.Haemat.)95157-163，1996)。GVHD由轉(zhuǎn)輸?shù)腂MT或DLI中存在的供體T淋巴細(xì)胞引起，增殖并定居于宿主組織。一旦增殖，供體T細(xì)胞即攻擊宿主組織，引起病理癥狀。
DLI后疾病的根除被認(rèn)為是由于移植物對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，即GVL效應(yīng)(Barrett，J.等人，腫瘤學(xué)現(xiàn)代觀點(diǎn)，889-95，1996)。GVL效應(yīng)的機(jī)理尚未完全搞清。它是由來(lái)源于供體的T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)門細(xì)胞排除的BMT導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)的更高發(fā)病率。免疫應(yīng)答是發(fā)生該效應(yīng)所必需的，與同種異體BMT相比，同源BMT后更高的復(fù)發(fā)率在實(shí)驗(yàn)中證明了這一點(diǎn)(Duell，T.，國(guó)際醫(yī)學(xué)年報(bào)(Ann.Int.Med.)126184-192，1997)。在日本，人群的高均一性導(dǎo)致無(wú)效的DLI治療，因?yàn)殡S機(jī)供體和宿主不是充分同種異體的(Takahashi，K.等人，柳葉刀(Lancet)343700-702，1994)。
臨床結(jié)果表明，GVL效應(yīng)可與致病性GVHD區(qū)分。用T細(xì)胞排除的同種異體BMT治療的患者比用BMT和標(biāo)準(zhǔn)GVHD預(yù)防治療的患者顯示更高的復(fù)發(fā)率，甚至當(dāng)控制GVHD發(fā)病率數(shù)時(shí)仍如此(Horowitz，M.M.等人，血液75555-562，1990)。也有許多報(bào)道的病例，觀察到CML的免除而沒(méi)有GVHD的發(fā)病(Duell，T.，國(guó)際醫(yī)學(xué)年報(bào)126184-192，1997)。在動(dòng)物模型中，GVHD與GVL的區(qū)分是可實(shí)現(xiàn)的(參見(jiàn)，例如，Johnson，B.D.等人，骨髓移植(Bone Marrow Transplant.)11329-336，1993；Glass，B.等人，英國(guó)血液學(xué)雜志(Br.J.Hem.)93412-420，1996；Johnson，B.D.等人，血液853302-3312，1995)。
為了避免急性GVHD，用幾種技術(shù)清除在BMT中存在的供體T淋巴細(xì)胞或成熟淋巴細(xì)胞。然而，當(dāng)前沒(méi)有有效的骨髓處理來(lái)完全避免GVHD，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下GVL效應(yīng)被減弱，導(dǎo)致更高的復(fù)發(fā)率(Kantarjian，H.M.等人，血液873069-3081，1996)。人及動(dòng)物模型的某些實(shí)驗(yàn)方法包括，T細(xì)胞亞群的排除，UVB照射(Greenfeld，J.I.等人，外科研究雜志(J.Sur.Res.)60137-141，1996)，或T細(xì)胞排除隨后再加入一定量的T細(xì)胞，滴定一定量T細(xì)胞的GVHD的缺乏(Drobyski，W.R.等人，血液，822310-2318，1993)。一種策略中，用一種“自殺基因”轉(zhuǎn)染供體T細(xì)胞，該基因是提供對(duì)藥物丙氧鳥(niǎo)苷的敏感性的皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因。如果觀察到GVHD癥狀，則給予患者丙氧鳥(niǎo)苷以在體內(nèi)消除T細(xì)胞，直到癥狀消退(Bordignon，C.等人，人類基因治療(Hum.Gen.Ther.)6813-819，1995；Bonini C.等人，科學(xué)(Science)2761719-1724，1997)。另一種“自殺基因”法應(yīng)用編碼凋亡信號(hào)傳遞蛋白(Ariad Pharmaceuticals)的FAS基因。在FAS系統(tǒng)中，用一種二聚劑如FK1012誘導(dǎo)FAS產(chǎn)生，殺傷表達(dá)該基因的供體細(xì)胞。
“自殺基因”法盡管從治療殘余癌癥后消除不需要的T細(xì)胞的觀點(diǎn)來(lái)看也許是有吸引力的，但也有許多明顯的缺點(diǎn)。首先，用GVHD癥狀作為開(kāi)始藥物治療的信號(hào)。因此，GVHD應(yīng)能開(kāi)始并必須可關(guān)閉。其次，用來(lái)消除T細(xì)胞的藥物必須全身施用，從而使整個(gè)身體與藥物接觸達(dá)到使GVHD受控所必需的一定時(shí)間。丙氧鳥(niǎo)苷具有毒性副作用，HSV-tk蛋白是免疫原性的。此外，因?yàn)樾枰Ｗo(hù)患者免于GVHD的嚴(yán)重形式，所以免疫抑制預(yù)防仍是絕對(duì)必要的。同樣，在某些慢性GVHD例子中，證明丙氧鳥(niǎo)苷的施用不是完全有效的(Bonini C.等人，科學(xué)2761719-1724，1997)。這或許是由于該方法的防止誤解的說(shuō)明，即只有增殖的細(xì)胞是丙氧鳥(niǎo)苷敏感的。此外，甚至增殖的細(xì)胞也能通過(guò)鄰近HSV-tk細(xì)胞附近存在的正常細(xì)胞提供的酶輔助而逃脫丙氧鳥(niǎo)苷的作用(Good Samaritan效應(yīng))。
對(duì)于FAS系統(tǒng)，缺點(diǎn)包括合成的困難以及誘導(dǎo)FAS產(chǎn)生的二聚劑的不溶性。二聚劑與宿主中FKBP蛋白的結(jié)合可限制可用的藥物。
此外，與基因治療有關(guān)的技術(shù)及實(shí)踐考慮使得難以實(shí)行和控制技術(shù)的應(yīng)用。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的產(chǎn)生被低效率所困擾，這使當(dāng)出現(xiàn)GVHD跡象時(shí)，被處理細(xì)胞群體的均一性以及完全殺傷細(xì)胞的能力成為問(wèn)題。細(xì)胞必須能增殖數(shù)周時(shí)間，這意味著在收獲細(xì)胞與轉(zhuǎn)染細(xì)胞可用于輸注的時(shí)間之間有一個(gè)延遲。最后，并且也是最重要地，輸入人體中的細(xì)胞可能含有修飾的遺傳物質(zhì)，它有可能對(duì)宿主長(zhǎng)期具有有害作用。
電離輻射(γ-輻射或X-輻射)或UV線(UVCλ＝200-280nm；UVBλ＝280-320nm；UVAλ＝320-400nm)已被用來(lái)處理血液制品來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞中的DNA損傷。當(dāng)前公認(rèn)的用于輸血相關(guān)的GVHD預(yù)防的方法是γ-輻射處理(2500 cGy)。用于防止TA-GVHD的γ-輻射的臨床劑量導(dǎo)致活T細(xì)胞減少105-106倍。然而，γ-輻射和電離輻射對(duì)于核酸通常不是特異的。由于其高能量，γ-輻射和UVC也攻擊蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞成分，引起明顯的非特異性損傷(Deeg，H.J.等人，血細(xì)胞(Blood Cells)18151-162，1992)。為了防止GVHD，用UVB消除大鼠淋巴細(xì)胞的增殖而保留BM祖細(xì)胞和原始造血干細(xì)胞的生存力用于植入。在4000J/cm2的UVB處理劑量時(shí)，CTL活性降低但仍存在(Gowing，H.等人，血液871635-1643，1996)。然而，UVB輻射也導(dǎo)致明顯的細(xì)胞損傷，特別是當(dāng)使用寬發(fā)射光譜的燈時(shí)(Gowing，H.等人，血液871635-1643，1996；Pamphilon，A.A.等人，血液772072-2078，1991)。已經(jīng)報(bào)道了導(dǎo)致較低細(xì)胞生存力和免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的表面分子化學(xué)修飾和膜破裂，這或許是由于UVB誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和脂類尤其不飽和鍵的化學(xué)改變的能力。這些限制是由于UVB不是只對(duì)核酸有選擇性，而是修飾吸收280-320nm的任何化學(xué)基團(tuán)這一事實(shí)。
用于人白細(xì)胞處理、在光敏劑8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP)存在下的UVA輻射顯示，在體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)中抑制外周血白細(xì)胞的刺激能力和增殖(Kraemer，K.H.等人，皮膚病學(xué)研究雜志(J.Inv.Derm.)77235-239，1981；Kraemer，K.H.等人，皮膚病學(xué)研究雜志7680-87，1981)。然而，如這些報(bào)道中所述，UVA加補(bǔ)骨脂素處理導(dǎo)致表面抗原表達(dá)、細(xì)胞因子合成(IL-1、IL-6、IL-8和INF)和細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制(Gruner，S.等人，組織抗原(Tiss.Ant.)27147-154，1986；Neuner，P.等人，光化學(xué)與光生物學(xué)(Photochem.Photobiol.)59182-188，1994)。因此，以前的研究中所述的光化學(xué)處理(PCT)條件，盡管抑制增殖并減少非特異的細(xì)胞損傷，但也滅活T細(xì)胞的免疫功能；這些處理?xiàng)l件不可能為了轉(zhuǎn)輸目的，產(chǎn)生有效提供任何免疫保護(hù)或誘導(dǎo)GVL效應(yīng)的細(xì)胞。最后，對(duì)脾和髓細(xì)胞的UVA加8-MOP處理已成功地用于鼠模型中GVHD的降低(Ullrich，S.E.，皮膚病學(xué)研究雜志96303-308，1991)。如同以前所有報(bào)道一樣，該研究只針對(duì)供體白細(xì)胞的GVHD方面，而不為白細(xì)胞提供免疫保護(hù)或GVL功能。
顯然，存在對(duì)新方法的需要，來(lái)抑制同種異體組織相容性障礙間的GVHD誘導(dǎo)，而不需要與藥物的系統(tǒng)接觸。這種方法可對(duì)無(wú)免疫應(yīng)答的個(gè)體提供某種免疫保護(hù)，和/或允許對(duì)殘余癌的殺傷，但應(yīng)能防止輸入細(xì)胞在宿主中的增殖。
在此描述并要求專利保護(hù)的本發(fā)明，通過(guò)提供制備不誘導(dǎo)GVHD但保留白細(xì)胞功能的白細(xì)胞的方法，針對(duì)并克服了與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的這些和其它問(wèn)題。通過(guò)以下的詳細(xì)描述，本發(fā)明的方法所具有的這種及其它優(yōu)點(diǎn)將是顯然的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種有效方法，用于處理同種異體供體的白細(xì)胞，從而產(chǎn)生不能增殖但保留生存力和有效促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的免疫功能的白細(xì)胞。由于經(jīng)處理的白細(xì)胞不能增殖，所以當(dāng)引入同種異體宿主時(shí)它們不能誘導(dǎo)GVHD(在同源或自體輸血時(shí)，GVHD不是問(wèn)題)，因此，它們能理想地用于對(duì)于多種臨床適應(yīng)癥尤其癌癥的治療的DLI中，以及為無(wú)免疫應(yīng)答的哺乳動(dòng)物提供免疫功能。
本發(fā)明的多個(gè)方面包括下列方面一種分離的細(xì)胞群體，其含有一種白細(xì)胞群體，其中該白細(xì)胞群體的一部分是不增殖的，使得該細(xì)胞群體不能在同種異體宿主中引發(fā)移植物抗宿主疾病(GVHD)；并且該白細(xì)胞群體的一部分保留免疫學(xué)活性，包括促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的能力。優(yōu)選地，該群體中至少90％的白細(xì)胞是不增殖的。
前述實(shí)施方案的白細(xì)胞群體的特征進(jìn)一步在于1)優(yōu)選地包含T細(xì)胞、NK細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞；2)經(jīng)適當(dāng)刺激后能合成和/或分泌細(xì)胞因子，如IL-2、IFN-γ、IL-10和GM-CSF；3)能表達(dá)特征為T細(xì)胞激活和免疫功能的表面標(biāo)記，諸如尤其是CD4、CD8、CD16和CD56；以及4)與未處理的白細(xì)胞群體相比，顯示提高的殺傷功能與增殖功能的比值。
本發(fā)明的白細(xì)胞群體總體上不能增殖，但保留免疫學(xué)活性。該白細(xì)胞群體尤其將有下列活性1.促進(jìn)疾病細(xì)胞、受感染細(xì)胞或病原體的破壞。
2.有利于第二種細(xì)胞群體的植入。第二個(gè)細(xì)胞群體可以是一種細(xì)胞懸液或有組織的細(xì)胞集合，如一塊組織或器官。這些細(xì)胞可包括例如造血細(xì)胞、髓細(xì)胞、白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
3.促進(jìn)免疫重建。
4.免疫治療。
5.混合嵌合狀態(tài)(mixed chimerism)的治療。
6.促進(jìn)移植物抗白血病(GVL)效應(yīng)。
在一種實(shí)施方案中，該白細(xì)胞群體對(duì)于促進(jìn)癌細(xì)胞的破壞是有效的。優(yōu)選地，癌細(xì)胞選自慢性骨髓性白血病(CML)細(xì)胞、慢性髓單核細(xì)胞性白血病(CmML)細(xì)胞、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)細(xì)胞、急性骨髓性白血病(AML)細(xì)胞、急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞、何杰金氏淋巴瘤細(xì)胞和非何杰氏淋巴瘤細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，癌細(xì)胞為慢性骨髓性白血病(CML)細(xì)胞或多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
在另一種實(shí)施方案中，該白細(xì)胞群體能有效地促進(jìn)疾病細(xì)胞的破壞，其中疾病細(xì)胞是一種受感染的細(xì)胞。受感染細(xì)胞包括被病毒感染的細(xì)胞。優(yōu)選地，感染細(xì)胞的病毒選自巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)和卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒。
在第三種實(shí)施方案中，該白細(xì)胞群體對(duì)于促進(jìn)病原體的破壞是有效的。病原體包括細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)。
在另一種實(shí)施方案中，該白細(xì)胞群體對(duì)于促進(jìn)第二種細(xì)胞群體的植入是有效的。用于植入的細(xì)胞可以是，例如，造血細(xì)胞、髓細(xì)胞、白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。另外，植入的第二種細(xì)胞群體可包括實(shí)體器官或其一部分。
本發(fā)明也提供用多種方法篩選的上述白細(xì)胞群體的亞群。該亞群包括淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞；并能通過(guò)基于例如表面標(biāo)記表達(dá)的陽(yáng)性和陰性選擇而獲得這些亞群。優(yōu)選的表面標(biāo)記包括CD8、CD4、CD16和CD56。從全血中篩選白細(xì)胞群體亞群的方法包括白細(xì)胞電泳(leukophresis)和紅細(xì)胞去除。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了應(yīng)用上述細(xì)胞群體的多種治療方法，包括供體白細(xì)胞輸注、白細(xì)胞回加、免疫重建、過(guò)繼免疫治療、混合嵌合狀態(tài)的治療以及增強(qiáng)第二種移植細(xì)胞群體植入的方法。對(duì)于增強(qiáng)第二種移植細(xì)胞群體植入的方法，能在第二種細(xì)胞群體移植之前、移植同時(shí)或之后將本發(fā)明的細(xì)胞群體引入宿主中。
本發(fā)明也提供了制備經(jīng)處理的白細(xì)胞群體的方法，其中該白細(xì)胞群體總體上是不增殖的，并且不能在同種異體宿主中引起移植物抗宿主疾病(GVHD)，該方法包括下列步驟i)提供一種含有白細(xì)胞群體的樣品；和ii)使該樣品與能與核酸形式共價(jià)鍵的化合物以一定量結(jié)合，使得該化合物能在每108個(gè)白細(xì)胞基因組DNA堿基對(duì)中形成約1-104個(gè)加合物，從而抑制增殖但保留免疫學(xué)活性，包括白細(xì)胞群體促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的能力。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，該化合物以足以在每108個(gè)白細(xì)胞基因組DNA堿基對(duì)中形成約5-103個(gè)加合物的量存在。優(yōu)選地，該方法導(dǎo)致經(jīng)處理的白細(xì)胞群體內(nèi)至少90％的T細(xì)胞增殖被抑制。
優(yōu)選地，能與核酸形成共價(jià)鍵的化合物進(jìn)一步包含一種能與核酸非共價(jià)結(jié)合的核酸結(jié)合部分。
在一種實(shí)施方案中，該化合物包含核酸結(jié)合部分；能與核酸反應(yīng)形成共價(jià)鍵的部分；以及共價(jià)連接核酸結(jié)合部分與效應(yīng)物部分的一種脆性連接體。優(yōu)選地，核酸結(jié)合部分是一種芳族嵌入物而效應(yīng)物部分是一種芥子基(mustard)。
在制備經(jīng)處理的白細(xì)胞群體的方法的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，能與核酸形成共價(jià)鍵的化合物含有一種可光活化部分，其在電磁刺激后能與核酸形成共價(jià)鍵。當(dāng)使用具有可光活化部分的化合物即可光活化化合物時(shí)，該方法進(jìn)一步包括下列步驟使與該化合物混合的白細(xì)胞樣品暴露于光線下，以光活化可光活化部分，從而導(dǎo)致可光活化部分與白細(xì)胞基因組DNA形成共價(jià)鍵。
在前述方法的一種實(shí)施方案中，具有可光活化部分的化合物選自呋喃香豆素、放線菌素、蒽環(huán)酮、氨茴霉素、苯并二吡喃酮、芴、芴酮、單星脂肪藍(lán)、norphillin A、有機(jī)染料；菲啶、吩噻嗪硫鎓鹽、吩嗪、吩噻嗪、疊氮基苯、喹啉和噻噸酮、吖啶和橢圓玫瑰樹(shù)堿。優(yōu)選的呋喃香豆素是補(bǔ)骨脂素。優(yōu)選的補(bǔ)骨脂素包括PAP、8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP)、4’-氨甲基4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(AMT)、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素和三氧雜啉(trioxalene)4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。
當(dāng)用來(lái)處理白細(xì)胞的化合物是補(bǔ)骨脂素時(shí)，該補(bǔ)骨脂素優(yōu)選地以10-4-150μM的濃度存在，并使白細(xì)胞樣品暴露于波長(zhǎng)為200-450nm、優(yōu)選地320-400nm的紫外線下。優(yōu)選地，以10-3-100J/cm2的劑量提供紫外線。白細(xì)胞樣品將暴露于紫外線下1秒到60分鐘的一段時(shí)間。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)以上實(shí)施方案制備經(jīng)處理的白細(xì)胞群體的方法，使用通式
的補(bǔ)骨脂素(此處被稱為S-59)及其鹽。S-59將以10-4-150μM、更優(yōu)選地10-3-150μM的濃度使用。使與S-59混合的白細(xì)胞樣品暴露于波長(zhǎng)為200-450nm、優(yōu)選地320-400nm的紫外線下。優(yōu)選地將與S-59混合的白細(xì)胞樣品暴露于劑量為10-3-100J/cm2、更優(yōu)選地3J/cm2的紫外線下。為了光活化S-59，優(yōu)選地將白細(xì)胞樣品暴露于紫外線下1秒到60分鐘、優(yōu)選地1分鐘的一段時(shí)間。優(yōu)選地以每毫升10-109個(gè)細(xì)胞、更優(yōu)選地每毫升102-108個(gè)細(xì)胞、最優(yōu)選地每毫升2×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞密度提供白細(xì)胞樣品。
提供根據(jù)前述方法產(chǎn)生的白細(xì)胞群體，包括特別用S-59處理的白細(xì)胞群體。
本發(fā)明的再另一方面為促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的方法，包括將用上述方法產(chǎn)生的白細(xì)胞群體與含有疾病細(xì)胞或病原體的同種異體細(xì)胞群體相混合。該方法能在體外或體內(nèi)進(jìn)行。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)供體白細(xì)胞向宿主中的輸入使白細(xì)胞群體與哺乳動(dòng)物宿主的同種異體細(xì)胞群體在體內(nèi)混合。優(yōu)選地，對(duì)患有BMT后白血病或多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)的哺乳動(dòng)物宿主實(shí)施供體白細(xì)胞輸注。
在促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的方法的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，疾病細(xì)胞是癌細(xì)胞。包括來(lái)源于下列癌癥的癌細(xì)胞慢性骨髓性白血病(CML)細(xì)胞、慢性骨髓單核細(xì)胞性白血病(CmML)細(xì)胞、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)細(xì)胞、急性骨髓性白血病(AML)細(xì)胞、急性淋巴母細(xì)胞性白血病(AML)細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞，何杰金氏淋巴瘤細(xì)胞和非何杰金氏淋巴瘤細(xì)胞。在一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是慢性骨髓性白血病細(xì)胞或多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
另一類優(yōu)選癌細(xì)胞是選自乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、睪丸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞、頭癌細(xì)胞和頸癌細(xì)胞的癌細(xì)胞。
在促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的方法的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，疾病細(xì)胞是一種受感染細(xì)胞。優(yōu)選的受感染細(xì)胞包括被一種病毒如巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)或卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染的細(xì)胞。
在促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的上述方法的又另一種實(shí)施方案中，用對(duì)疾病細(xì)胞或病原體特異的一種或多種抗原表位刺激白細(xì)胞群體，來(lái)擴(kuò)大對(duì)抗原特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的數(shù)量。刺激或抗原特異的T細(xì)胞擴(kuò)增能在體內(nèi)、離體或在體外進(jìn)行。進(jìn)行體內(nèi)刺激的方法是在從供體中分離白細(xì)胞群體之前，用對(duì)疾病細(xì)胞或病原體特異的抗原接種白細(xì)胞供體。在疾病為CML的情況中，優(yōu)選地用CML細(xì)胞的bcr-abl抗原刺激白細(xì)胞群體。在多發(fā)性骨髓瘤的情況中，能用患者骨髓瘤細(xì)胞的獨(dú)特型抗原接種白細(xì)胞供體。
在促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的前述方法的又另一種實(shí)施方案中，用一種促分裂原刺激白細(xì)胞群體。優(yōu)選地用一種促有絲分裂組合物如豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)加離子霉素或植物凝集素在體外進(jìn)行刺激。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示用不同濃度的S-59(正方形)、AMT(三角形)和8-MOP(圓形)光化學(xué)處理(PCT)后(UVA＝1J/cm2)增殖T細(xì)胞的減少(參見(jiàn)實(shí)施例1)。
圖2顯示在MLR試驗(yàn)中用不同藥物劑量的S-59處理的效應(yīng)細(xì)胞的3H-胸苷摻入(參見(jiàn)實(shí)施例2)。
圖3顯示用不同藥物劑量的S-59光化學(xué)處理的效應(yīng)細(xì)胞在MLR中的IL-2產(chǎn)生水平(參見(jiàn)實(shí)施例2)。
圖4顯示用不同藥物劑量的S-59光化學(xué)處理的效應(yīng)細(xì)胞在MLR中的IFN-γ產(chǎn)生水平(參見(jiàn)實(shí)施例2)。
圖5顯示用不同濃度的S-59和0.5J/cm2UVA對(duì)PC中的白細(xì)胞PCT后，隨PCT后時(shí)間而變的產(chǎn)生的IL-8水平(參見(jiàn)實(shí)施例2)。
圖6顯示用不同劑量的AMT和1J/cm2UVA PCT后，隨處理后時(shí)間而變化的CD69標(biāo)記表達(dá)的水平(參見(jiàn)實(shí)施例3)。
圖7顯示在PC中用多種補(bǔ)骨脂素光化學(xué)處理后補(bǔ)骨脂素-DNA加合物的形成。S-59(正方形)；AMT(三角形)；8-MOP(圓形)；1.9J/cm2UVA(參見(jiàn)實(shí)施例3)。
圖8顯示S-59+UVA處理對(duì)被處理細(xì)胞增殖的影響，在MLR試驗(yàn)中根據(jù)3H胸苷摻入測(cè)定。NR表示未處理的細(xì)胞；UV表示無(wú)S-59時(shí)用UVA照射的細(xì)胞。也顯示了在三種不同濃度的S-59存在下用3J/cm2UVA照射細(xì)胞時(shí)獲得的結(jié)果。詳見(jiàn)實(shí)施例14。
圖9顯示用抗-CD3抗體使被處理細(xì)胞激活后測(cè)定的，S-59+UVA處理對(duì)被處理細(xì)胞增殖的影響。詳見(jiàn)實(shí)施例14。
圖10A顯示用S-59+UVA光化學(xué)處理并在MLR中刺激的人PBMC的IL-2產(chǎn)生。通過(guò)夾心ELISA測(cè)定。詳見(jiàn)實(shí)施例14。
圖10B顯示用S-59+UVA光化學(xué)處理并在MLR中刺激的人PBMC的IFN-γ產(chǎn)生。通過(guò)夾心ELISA測(cè)定。
圖11A顯示用抗-CD3激活后于不同時(shí)間(小時(shí))測(cè)定的經(jīng)處理的及對(duì)照細(xì)胞中的CD69表達(dá)。
圖11B顯示用抗-CD3激活后于不同時(shí)間(小時(shí))測(cè)定的經(jīng)處理的及對(duì)照細(xì)胞中的CD25表達(dá)。
圖12顯示用抗-CD3激活后于不同時(shí)間(小時(shí))測(cè)定的經(jīng)處理的及對(duì)照未處理細(xì)胞中的CD40L表達(dá)。
圖13顯示光化學(xué)處理、激活的白細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性，根據(jù)與經(jīng)處理的白細(xì)胞共溫育的靶細(xì)胞的51Cr釋放來(lái)測(cè)定。
圖14顯示接受MHC-錯(cuò)配骨髓移植與S-59+UVA處理的脾細(xì)胞、然后在移植三天后用白血病細(xì)胞攻擊的受照射鼠中，平均體重的測(cè)定。如圖所示，在0.01μM S-59存在下使脾細(xì)胞暴露于UVA下不同時(shí)間長(zhǎng)度。
圖15顯示在有或無(wú)經(jīng)處理的白細(xì)胞輸注時(shí)接受骨髓移植的白血病攻擊的小鼠中GVL活性的分析。GVL活性用無(wú)白血病存活百分率證明(括號(hào)中給出了存活比)。
圖16顯示S-303處理的效應(yīng)細(xì)胞增殖能力的分析，在MLR中與γ-滅活的同種異體刺激細(xì)胞共培養(yǎng)后6-7天，根據(jù)3H-胸苷摻入測(cè)定。
圖17顯示MLR上清液中的IFN-γ水平，其中在共培養(yǎng)之前用不同濃度的S-303處理效應(yīng)細(xì)胞。
發(fā)明詳述縮寫(xiě)使用下列縮寫(xiě)B(tài)MT骨髓移植DLI供體白細(xì)胞輸注LDA有限稀釋分析MLR混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)PA光化學(xué)抑制的；PCT光化學(xué)處理；PI-DLI光化學(xué)滅活的供體白細(xì)胞輸注；PUVA補(bǔ)骨脂素及紫外線A照射。
PAP4’-和5’-伯氨基取代的補(bǔ)骨脂素S-59一種具有下式的伯氨基取代的補(bǔ)骨脂素
PBSC外周血干細(xì)胞PC血小板濃縮物TA-GVHD轉(zhuǎn)輸相關(guān)的移植物抗宿主疾病
PHA植物凝集素定義“同種異體”是指相同種的遺傳上不同的成員之間存在的關(guān)系，即這些成員不是同源的。
“宿主”可與“受體”交換作用，是指同種異體供體白細(xì)胞的哺乳動(dòng)物受體。通常，宿主是人，但也包括其它哺乳動(dòng)物，如小鼠、狗、貓、猴、馬等。
“白細(xì)胞”是指任何白細(xì)胞，包括譜系祖細(xì)胞?！翱乖蔬f細(xì)胞”包括巨噬細(xì)胞，和在外周血中少量存在的樹(shù)突細(xì)胞，以及它們各自的前身細(xì)胞。白細(xì)胞存在于循環(huán)血液中和骨髓中，以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的髓細(xì)胞形成、淋巴和網(wǎng)狀部位。
在此使用的“白細(xì)胞群體”是指含有超過(guò)一種白細(xì)胞細(xì)胞型的白細(xì)胞群體，并且至少包括T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞和NK細(xì)胞。
“供體白細(xì)胞”指對(duì)于宿主動(dòng)物不是內(nèi)源的而來(lái)源于一種同種異體供體的白細(xì)胞。對(duì)于體外和非人類應(yīng)用，白細(xì)胞群體和供體白細(xì)胞可來(lái)源于哺乳動(dòng)物，包括嚙齒類動(dòng)物、兔、狗等等。
“純化的”意思是，白細(xì)胞群體已從身體中分離，并被處理使得基本上不含非白細(xì)胞的細(xì)胞型，并且優(yōu)選地不含其它污染物，如白細(xì)胞來(lái)源中存在的細(xì)胞殘片，該來(lái)源一般為外周血、骨髓甚至脾細(xì)胞。優(yōu)選地，純化白細(xì)胞群體，使其含有少于13％的紅細(xì)胞(RBC)，更優(yōu)選地少于5％，甚至更優(yōu)選地少于1％。在一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中，血細(xì)胞比容水平低于0.5％。以下描述了白細(xì)胞純化方法。
“經(jīng)處理的白細(xì)胞”指已暴露于或接觸一種能與核酸形成一個(gè)或更多共價(jià)鍵的化合物的白細(xì)胞。白細(xì)胞能通過(guò)PCT或用烷化劑化合物“處理”。“光化學(xué)滅活的”或“光化學(xué)抑制的”(PA)或“PCT抑制的”白細(xì)胞指甚至在刺激后仍不能增殖的PCT白細(xì)胞，并不意味著白細(xì)胞在蛋白質(zhì)表達(dá)和免疫功能方面被滅活。
本發(fā)明的白細(xì)胞群體含有但不限于“不增殖的”細(xì)胞。如果在DNA復(fù)制中細(xì)胞被抑制，從而甚至在用試劑如促分裂原、細(xì)胞因子、抗原、抗體或其它增殖刺激物刺激后仍不能分裂產(chǎn)生新細(xì)胞，則這種細(xì)胞是“不增殖的”。本發(fā)明的方法導(dǎo)致制劑中每種白細(xì)胞的復(fù)制均抑制不是必需的。對(duì)于本發(fā)明，只要能增殖的少部分白細(xì)胞不足以在同種異體宿主中引起GVHD，則在純化的群體內(nèi)至少90％、更優(yōu)選地至少95％的白細(xì)胞中，白細(xì)胞群體增殖受到抑制就足夠了。在一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中，群體內(nèi)99％或更多的白細(xì)胞是不增殖的。例如，通過(guò)有限稀釋試驗(yàn)(LDA)或單獨(dú)通過(guò)3H-胸苷摻入法，或如以下實(shí)施例所述作為MLR試驗(yàn)的一部分，能測(cè)定增殖活性。在一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中，群體中的T細(xì)胞被增殖抑制到LDA檢測(cè)的下限。已表明這些試驗(yàn)結(jié)果預(yù)示經(jīng)處理的白細(xì)胞在體內(nèi)增殖的能力。
“移植物抗宿主疾病”或“GVHD”起因于存在于轉(zhuǎn)輸BMT或DLI中的供體T細(xì)胞的克隆擴(kuò)展、增殖和定居于宿主組織。已證實(shí)GVHD的發(fā)生與嚴(yán)重程度與可克隆T細(xì)胞的存在有關(guān)(參見(jiàn)Kernan，N.A.等人，血液68770-773，1986)。在與供體HLA-匹配的患者中，GVHD的發(fā)生起因于次要組織相容性抗原。GVHD的發(fā)病是由于免疫抑制的患者中免疫功能的缺乏，這是BMT成功所必需的條件。供體T細(xì)胞能在該環(huán)境中不受攻擊地增殖，并攻擊宿主組織，引起病理癥狀。在細(xì)胞水平上，宿主的抗原呈遞細(xì)胞與供體T細(xì)胞在主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I和II的范圍內(nèi)相互作用，并誘導(dǎo)其對(duì)攜有宿主特異性(次要)抗原的細(xì)胞的激活。這導(dǎo)致激活T細(xì)胞的克隆增殖，其攻擊宿主組織并釋放細(xì)胞因子。T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子也激活宿主的多種其它效應(yīng)細(xì)胞，這通過(guò)細(xì)胞因子的另外產(chǎn)生(細(xì)胞因子潮)加重組織損傷。參見(jiàn)，例如Burakoff，S.J.等人，移植物抗宿主疾病免疫學(xué)、病理生理學(xué)與治療。于Brinkhous KMS，S.A.(編)《血液學(xué)》(Hematology)第12卷(第一版)，紐約，Marcell Dekker，Inc.，1990，725頁(yè)。
當(dāng)診斷有GVHD時(shí)，通常給予患者高劑量的免疫抑制藥物來(lái)抑制GVHD。然而，這些藥物也使移植的白細(xì)胞在GVL方面無(wú)效，并且患者可復(fù)發(fā)為白血病。
白細(xì)胞群體引起GVHD的能力可如以下實(shí)施例4所述在體內(nèi)測(cè)定，或者通過(guò)有限稀釋試驗(yàn)(LDA)在體外測(cè)定，或者如以下實(shí)施例5所述通過(guò)MLR測(cè)定。根據(jù)LDA測(cè)定，如果群體中的可克隆T細(xì)胞數(shù)量為未處理白細(xì)胞對(duì)照群體(GVHD和增殖的陽(yáng)性對(duì)照)中存在的10-3-10-4，則判斷該白細(xì)胞群體不能引起GVHD。在體內(nèi)，白細(xì)胞群體的同種異體受體中GVHD臨床癥狀(實(shí)施例4所述癥狀)的缺乏表明該群體不能引起GVHD。
如果一種白細(xì)胞群體包括這樣的白細(xì)胞，其能直接或間接參與能有效地從身體中殺傷或清除目標(biāo)疾病細(xì)胞(或病原體)、或限制疾病細(xì)胞(或病原體)增殖的免疫應(yīng)答，則認(rèn)為該群體“對(duì)于促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體的破壞是有效的”。不是白細(xì)胞群體中存在的每種白細(xì)胞都能促進(jìn)破壞，但總體上該群體應(yīng)在此方面有效。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，疾病細(xì)胞或病原體能通過(guò)任何機(jī)制被破壞。通過(guò)經(jīng)處理的白細(xì)胞能介導(dǎo)破壞的特定機(jī)制限制處理白細(xì)胞的方法不是本發(fā)明的目的。疾病細(xì)胞可被T細(xì)胞或NK細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞溶解而破壞，而且也能被其它機(jī)制殺傷，如被誘導(dǎo)經(jīng)歷凋亡。疾病細(xì)胞或病原體也能被依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)、巨噬細(xì)胞的吞噬作用所破壞，或通過(guò)哺乳動(dòng)物中天然存在的任一免疫機(jī)制被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所清除。通過(guò)殺傷其存活所依賴的宿主細(xì)胞，能間接破壞駐留于宿主細(xì)胞內(nèi)的病原體。在標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)教科書(shū)如《基礎(chǔ)與臨床免疫學(xué)》第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(編)，Appelton & Lange，Norwalk CT，1994中，討論了免疫系統(tǒng)使機(jī)體擺脫惡性細(xì)胞、受感染細(xì)胞或病原體的機(jī)制?！坝行А碧幚淼墓w白細(xì)胞可以是一種效應(yīng)細(xì)胞，如細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、NK細(xì)胞或一種巨噬細(xì)胞，其直接殺傷靶疾病細(xì)胞或病原體，或誘導(dǎo)疾病細(xì)胞經(jīng)歷凋亡。此外，通過(guò)刺激其它白細(xì)胞，例如來(lái)自于移植的骨髓、以前DLI的白細(xì)胞，或宿主自身的白細(xì)胞，經(jīng)處理的供體白細(xì)胞能介導(dǎo)破壞，從而進(jìn)行殺傷或清除。通過(guò)表面抗原表達(dá)、細(xì)胞因子分泌或任何適當(dāng)?shù)臋C(jī)制能對(duì)其它白細(xì)胞進(jìn)行刺激。經(jīng)MHC-限制和/或非MHC限制(如NK細(xì)胞)的機(jī)制能發(fā)生細(xì)胞溶解。
白細(xì)胞群體促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的效能可通過(guò)多種試驗(yàn)測(cè)定，如以下實(shí)施例所述的MLR或51Cr釋放試驗(yàn)。例如，根據(jù)在51Cr釋放試驗(yàn)中介導(dǎo)白血病細(xì)胞殺傷的能力證明了細(xì)胞溶解的效能。對(duì)于本發(fā)明，如果在適當(dāng)試驗(yàn)中(例如51Cr釋放試驗(yàn))，白細(xì)胞群體顯示比陰性對(duì)照群體至少高約20％的水平的溶細(xì)胞能力，則認(rèn)為該群體對(duì)促進(jìn)疾病細(xì)胞的破壞是有效的。以下提供了用于殺傷的疾病細(xì)胞和病原體類型。
通常，促進(jìn)破壞的效能需要白細(xì)胞群體保持一定的蛋白質(zhì)合成水平，以使得包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(如細(xì)胞因子)的蛋白質(zhì)能產(chǎn)生并分泌。優(yōu)選地，在質(zhì)膜上也有表面抗原包括受體，粘附分子和協(xié)同刺激分子的表達(dá)。細(xì)胞生存力和膜完整性對(duì)于介導(dǎo)GVL效應(yīng)是重要的?！凹?xì)胞生存力”在此定義為循環(huán)中即血流和其它組織中的存活率。
盡管某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生可被抑制，但優(yōu)選地細(xì)胞因子產(chǎn)生保持在用上述化合物處理之前的至少70％、更優(yōu)選地80％、甚至更優(yōu)選地高于90％，最優(yōu)選地高于95％的水平。優(yōu)選地，白細(xì)胞群體包括在刺激下能至少分泌白細(xì)胞介素-2(IL-2)和干擾素-γ(IFN-γ)的白細(xì)胞。由于這些細(xì)胞因子在T細(xì)胞激活和GVHD/GVL中的明確作用，它們是相關(guān)的。其它相關(guān)細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)。例如，用本實(shí)施例以下部分所述的細(xì)胞因子測(cè)定試劑盒(例如，R & D Systems的試劑盒)能容易地測(cè)定細(xì)胞因子的分泌。
在純化白細(xì)胞群體中的白細(xì)胞上表達(dá)的表面抗原(也被稱為表面標(biāo)記)取決于特定的細(xì)胞型。優(yōu)選地，該群體包括表達(dá)下列表面抗原的白細(xì)胞CD2、CD28、CTLA4、CD40配體(gp39)、CD18、CD25、CD69(淋巴細(xì)胞激活標(biāo)記)和CD16/CD56、抗原，已知它們參與T細(xì)胞與NK細(xì)胞激活有關(guān)的相互作用和免疫功能。優(yōu)選地，白細(xì)胞也表達(dá)其它表面標(biāo)記，包括MHC I類和II類、CD8、CD4、CD3/TcR(T細(xì)胞受體)、粘附分子如CD54(ICAM-1)、LFA-1和VLA-4，及其它共同刺激分子?？捎枚喾N測(cè)定法能檢測(cè)及測(cè)定表面抗原的表達(dá)，例如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)FACS-SCAN分析用對(duì)特定抗原特異的抗體染色細(xì)胞并檢測(cè)已被直接或間接標(biāo)記的抗體。本領(lǐng)域所知的其它方法包括表面抗原的免疫沉淀和免疫印跡。
在此使用的“疾病細(xì)胞”是指癌細(xì)胞、受感染細(xì)胞或任何類型病變的細(xì)胞，它們可能存在于體內(nèi)或體外。癌細(xì)胞或惡性細(xì)胞可能來(lái)源于任何類型的癌癥、是任何組織或細(xì)胞型來(lái)源的。這些惡性或癌細(xì)胞包括但不限于下列惡性腫瘤的細(xì)胞白血病，包括慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)；多發(fā)性骨髓瘤(MM)；非何杰金氏淋巴瘤和何杰金氏病(淋巴瘤)；實(shí)體瘤，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、腎細(xì)胞癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和頭頸腫瘤。受感染細(xì)胞包括被下列任何微生物感染的細(xì)胞細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)或其它任何病原微生物。
“病原體”被定義為含有核酸并且能引起人類、其它哺乳動(dòng)物或脊椎動(dòng)物疾病的任何媒介。病原體的實(shí)例包括引起人類、其它哺乳動(dòng)物或脊椎動(dòng)物疾病的細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、真菌、酵母、霉菌和支原體。病原體的遺傳物質(zhì)可以是DNA或RNA，遺傳物質(zhì)可以作為單鏈或雙鏈核酸存在。病原體可能位于細(xì)胞之外，或駐留于細(xì)胞內(nèi)，如巨噬細(xì)胞中的HIV所例證的。
術(shù)語(yǔ)供體白細(xì)胞“輸注”和“轉(zhuǎn)輸”在此可交換地使用，是指相同的方法。
“光劑量”或“PCT劑量”，以J/cm2的單位確定，是指PCT過(guò)程中白細(xì)胞樣品接受的每單位區(qū)域的總光能。通過(guò)改變光線強(qiáng)度和細(xì)胞樣品暴露于光線的時(shí)間能改變光劑量。
以mW/cm2單位測(cè)定的光線“強(qiáng)度”是指每秒每單位樣品接受的光能。
“可光活化部分”在此被定義為一種隨電磁輻射經(jīng)受化學(xué)改變的部分。當(dāng)含有可光活化部分的化合物被電磁輻射光活化時(shí)，光活化部分與核酸形成共價(jià)鍵，形成一種化合物核酸復(fù)合體，在此稱作“加合物”。
“芳族嵌入物”是指一種具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)、能插入核酸中的化合物或其部分。芳族嵌入物包括但不限于蒽、吖啶、萘、萘甲酸，等等。
在此使用的“分離的細(xì)胞群體”包括在細(xì)胞正常駐留的生物之外存在的細(xì)胞群體。
在此使用的“免疫學(xué)活性”是指免疫系統(tǒng)的細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞(APC)及其它細(xì)胞所表達(dá)的功能，這些功能包括但不限于細(xì)胞因子的合成與分泌、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、抗體的合成與分泌、抗原及抗原片段的加工和呈遞、表示免疫細(xì)胞特征的表面標(biāo)記的表達(dá)。引入作為參考本申請(qǐng)中引用的參考文獻(xiàn)，包括專利、公布的專利申請(qǐng)及其它出版物，在此引入作為參考。優(yōu)選實(shí)施方案描述以下總結(jié)了本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選方面，并在隨后的詳細(xì)描述及實(shí)施例中進(jìn)一步描述并說(shuō)明。
本發(fā)明提供一種方法，用于處理分離的白細(xì)胞群體，以使該群體的一部分不能增殖到該群體可引起最小GVHD的程度，但仍保留能有效促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的足夠的免疫功能?！白钚VHD”意思是，GVHD的程度不足以引起哺乳動(dòng)物的死亡，或消除白細(xì)胞群體促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞和/或介導(dǎo)GVL效應(yīng)的能力。
GVHD明確地與供體T細(xì)胞的克隆擴(kuò)展有關(guān)，原則上，去除、滅活或殺傷白細(xì)胞的任何處理對(duì)其都是有效的。另一方面，GVL與供體白細(xì)胞的免疫應(yīng)答有關(guān)，并且可能是細(xì)胞溶解作用、抗原呈遞、特異性細(xì)胞因子合成或以上組合的結(jié)果。對(duì)于觀察到GVL效應(yīng)需要供體白細(xì)胞的某些功能是完整的。在避免GVHD的嘗試中對(duì)供體白細(xì)胞功能的滅活也使供體BM或白細(xì)胞不能有效地為無(wú)免疫應(yīng)答者或BMT宿主提供必要的免疫功能。
為了使處理能在同種異體宿主中消除GVHD而仍提供免疫保護(hù)和/或誘導(dǎo)GVL效應(yīng)，必須選擇性地去除白細(xì)胞的增殖能力，而保留一定水平的白細(xì)胞功能。本發(fā)明提供了具有這些特征的白細(xì)胞群體。
本發(fā)明的分離的白細(xì)胞群體提供了優(yōu)于以前所述及使用的群體的許多優(yōu)點(diǎn)。一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)是，消除GVHD的發(fā)病將允許供體白細(xì)胞向患者中的安全輸入。因此，缺乏免疫系統(tǒng)或具有嵌合免疫系統(tǒng)的宿主能接受大劑量的經(jīng)處理的供體白細(xì)胞和/或多次DLI，從而提高了疾病治療的效能。以前，GVHD的威脅限制了輸入的白細(xì)胞的量。
非增殖性白細(xì)胞群體能有效地為宿主提供對(duì)抗癌癥和感染的充分免疫防御。這些白細(xì)胞可用于治療復(fù)發(fā)的血液惡性腫瘤，如慢性骨髓性、急性骨髓性、急性淋巴細(xì)胞性、多發(fā)性骨髓瘤及其它形式的白血病和骨髓瘤，作為BMT后治療的一部分或作為BMT的一種備擇方法。DLI引起的GVL效應(yīng)不僅可用于去除最小殘余疾病，而且也能用于較高惡性細(xì)胞荷載的治療，尤其是因?yàn)榘准?xì)胞擴(kuò)展的缺乏允許更大量細(xì)胞的安全輸入。本發(fā)明的經(jīng)處理的白細(xì)胞群體也可用于對(duì)免疫調(diào)節(jié)治療敏感的某些實(shí)體瘤(例如乳腺癌和腎細(xì)胞癌)的治療，并且可用于防止匹配及錯(cuò)配異體BMT過(guò)程中的移植排斥。以下詳述了在治療中該經(jīng)處理的白細(xì)胞適用的其它多種臨床適應(yīng)癥。
本發(fā)明的處理白細(xì)胞的方法包括下列步驟?？蓮墓撬琛⒛氀蛉蝎@得白細(xì)胞。最方便的白細(xì)胞來(lái)源是外周血。科學(xué)文獻(xiàn)中描述了從其它來(lái)源分離白細(xì)胞的方法。例如，通過(guò)紅細(xì)胞去除或白細(xì)胞電泳處理全血來(lái)純化并富集白細(xì)胞。得到的純化白細(xì)胞群體大約99％不含紅細(xì)胞，與白細(xì)胞相比紅細(xì)胞有不同的大小和密度，易于通過(guò)這些方法去除。
然后將白細(xì)胞群體與化合物混合，并在能有效抑制白細(xì)胞增殖而不損害細(xì)胞生存力和完整性的條件下處理。去除未反應(yīng)的化合物，或者隨時(shí)間延長(zhǎng)該化合物可變?yōu)闊o(wú)活性的，而不必要去除。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，“化合物”是指能與一種核酸形成共價(jià)鍵的化合物。共價(jià)鍵的形成在每108個(gè)白細(xì)胞基因組DNA堿基對(duì)中可形成大約1-104個(gè)加合物，優(yōu)選地5-103個(gè)加合物，最優(yōu)選地103個(gè)加合物。重要的是，處理?xiàng)l件使得對(duì)蛋白質(zhì)及其它細(xì)胞成分的非特異性損傷減至最小并避免膜損傷。大多數(shù)經(jīng)處理的白細(xì)胞的膜完整性對(duì)于發(fā)生GVL效應(yīng)是必要的。這些處理?xiàng)l件也能有效地使經(jīng)處理的白細(xì)胞在引入同種異體宿主中后不能引起GVHD，或者使之在體外MLR試驗(yàn)中無(wú)反應(yīng)性。另外，經(jīng)處理的白細(xì)胞應(yīng)保持對(duì)于完成免疫功能、尤其對(duì)于促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體在體內(nèi)(或體外)的破壞有效的蛋白質(zhì)表達(dá)。
以下公開(kāi)了能與核酸、優(yōu)選地雙鏈DNA形成共價(jià)鍵的適當(dāng)化合物的性質(zhì)。這些化合物可含有一種能與核酸形成共價(jià)鍵的部分，該部分是可光活化的或化學(xué)反應(yīng)性的。該化合物通過(guò)與基因組DNA形成共價(jià)鍵、進(jìn)而干擾DNA聚合酶的功能并使白細(xì)胞不能增殖，來(lái)抑制細(xì)胞的增殖能調(diào)節(jié)化合物與白細(xì)胞核酸形成的共價(jià)加合物的數(shù)量，使得該化合物能抑制增殖，但保留對(duì)促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體的破壞有效的免疫功能。應(yīng)用烷化劑化合物，通過(guò)調(diào)節(jié)化合物濃度以及在去除未結(jié)合的化合物之前白細(xì)胞與化合物接觸的時(shí)間長(zhǎng)度，能調(diào)節(jié)這一作用。所需的濃度取決于特定化合物的性質(zhì)，如在水溶液中的溶解度和DNA結(jié)合常數(shù)。一般以每108個(gè)白細(xì)胞基因組DNA堿基對(duì)中能有效產(chǎn)生大約1-104個(gè)共價(jià)結(jié)合化合物的加合物、優(yōu)選地約5-103個(gè)加合物、更優(yōu)選地約102-103個(gè)加合物的濃度使用該化合物。理想地，處理白細(xì)胞群體的條件在每108個(gè)基因組DNA堿基對(duì)中將產(chǎn)生大約103個(gè)加合物。能有效獲得本發(fā)明的白細(xì)胞組合物的最低化合物濃度是優(yōu)選的濃度。
應(yīng)用可光活化化合物，通過(guò)調(diào)節(jié)化合物濃度、光線波長(zhǎng)和暴露于光線的時(shí)間長(zhǎng)度能調(diào)節(jié)PCT作用。以下詳述了使用補(bǔ)骨脂素及其它可光活化化合物進(jìn)行PCT的條件。
處理?xiàng)l件的目的是在每108個(gè)白細(xì)胞基因組DNA堿基對(duì)中產(chǎn)生大約1-104個(gè)共價(jià)結(jié)合化合物的加合物、優(yōu)選地約5-104個(gè)加合物、更優(yōu)選地約102-103個(gè)加合物。理想地，該處理?xiàng)l件在每108個(gè)基因組DNA堿基對(duì)中將產(chǎn)生大約103個(gè)加合物。例如，通過(guò)使用如以下實(shí)施例所述的放射性標(biāo)記的DNA結(jié)合化合物，能測(cè)量由處理產(chǎn)生的化合物-DNA加合物的數(shù)量。
能在白細(xì)胞處理中使用的另一種類型的化合物是一種作為DNA復(fù)制抑制劑的小分子。如上所述，這種小分子復(fù)制抑制劑可任選地含有一種連接體(脆性的或相反)和一種效應(yīng)物部分。DNA復(fù)制的任何步驟都能作為抑制的目標(biāo)，包括起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合體(ORC)的形成、ORC對(duì)起點(diǎn)的補(bǔ)充、復(fù)制的起始、延伸等。另外，有利于復(fù)制過(guò)程的酶的抑制劑，如解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶，也是有用的。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的實(shí)例包括，例如喜樹(shù)堿和道諾霉素。
為了使白細(xì)胞樣品與化合物混合，可將本發(fā)明的化合物以幾種形式引入白細(xì)胞懸液(白細(xì)胞樣品)中?？梢宰鳛樗?、鹽水中的水溶液、合成培養(yǎng)基(如“SterilyteTM3.0”)或懸浮白細(xì)胞的溶液引入化合物。以下提供了適于重懸浮白細(xì)胞的溶液(輸血級(jí)和非輸血級(jí))?！昂铣膳囵B(yǎng)基”在此被定義為水性合成血液或血液制品貯存培養(yǎng)基。另外能以含或不含佐劑的干燥制劑提供化合物。然后攪拌細(xì)胞懸液混合該化合物。
將待用化合物處理的白細(xì)胞重懸浮于生理平衡溶液中，如血漿、合成培養(yǎng)基或其組合物。能以200mL-1L的體積提供白細(xì)胞。用于處理的白細(xì)胞優(yōu)選地包含于一種反應(yīng)容器如血袋中。血袋為本領(lǐng)域所知。
通過(guò)體外及體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)鼙O(jiān)測(cè)用化合物處理對(duì)白細(xì)胞群體生存力及功能的影響，從而確定使增殖和GVHD活性減至最小而使細(xì)胞毒性功能和/或GVL效應(yīng)達(dá)到最大的最佳處理?xiàng)l件。最佳條件將隨所用化合物的性質(zhì)而不同，并由疾病或病原體所證實(shí)。對(duì)于可光活化化合物，最優(yōu)選的PCT條件包括最低化合物濃度和最低光劑量，其足以提供增殖被抑制但能有效促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的白細(xì)胞群體。將如下表征經(jīng)處理的白細(xì)胞群體。
將評(píng)價(jià)經(jīng)處理的白細(xì)胞群體的細(xì)胞生存力。如本實(shí)施例以下部分所述，例如，通過(guò)PCR分析檢測(cè)對(duì)供體白細(xì)胞特異的序列，能在體內(nèi)測(cè)定細(xì)胞的生存力。優(yōu)選地，該白細(xì)胞群體具有至少3周的細(xì)胞生存力。處理后白細(xì)胞的快速清除可影響其誘導(dǎo)抗白血病反應(yīng)的能力。被處理白細(xì)胞的膜完整性對(duì)于發(fā)生GVL效應(yīng)也是必要的。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)或碘化丙錠染料排除法能測(cè)定膜完整性。如果使用，在使具有完整細(xì)胞膜的白細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大的光劑量和/或化合物濃度方面，優(yōu)化PCT方法。
如以下本實(shí)施例所述，例如，通過(guò)有限稀釋試驗(yàn)(LDA)或混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)試驗(yàn)?zāi)軠y(cè)定增殖活性。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)試驗(yàn)中的白細(xì)胞活性預(yù)示被處理的白細(xì)胞在體內(nèi)介導(dǎo)GVHD的能力。此外，通過(guò)監(jiān)測(cè)已輸入經(jīng)處理的白細(xì)胞的MHC匹配動(dòng)物中的GVHD癥狀和/或GVHD誘導(dǎo)的發(fā)病率和死亡率能確定GVHD。
通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子合成、表面抗原性標(biāo)記的表達(dá)和溶解靶細(xì)胞的能力，能確定白細(xì)胞活性。利用合適的抗原特異性抗體和標(biāo)準(zhǔn)FACS-SCAN分析測(cè)定表面抗原性標(biāo)記的表達(dá)。作為共價(jià)結(jié)合化合物濃度和(若使用時(shí))PCT光劑量的函數(shù)測(cè)定抗原性標(biāo)記CD2、CD28、CTLA4、CD40配體(gp39)、CD18、CD25、CD69(淋巴細(xì)胞激活標(biāo)記)和CD16/CD56的存在，已知它們參與與T細(xì)胞和NK細(xì)胞激活相關(guān)的相互作用及免疫功能。假如PCT對(duì)蛋白質(zhì)作用溫和，PCT條件下表面分子的穩(wěn)定性預(yù)計(jì)不受影響。選擇處理?xiàng)l件例如PCT，使得它們不能相反地影響表面分子的表達(dá)或使細(xì)胞因子的產(chǎn)生降低至希望水平(以上公開(kāi)的優(yōu)選水平)之下。
例如，在51Cr釋放試驗(yàn)中通過(guò)人或小鼠白血病細(xì)胞系的溶解，能測(cè)定預(yù)示GVL活性的溶細(xì)胞活性。如Choudhury等人，血液891133-1142，1997所述能在體外測(cè)定抗白血病效應(yīng)，或者如Johnson等人，血液853302-3312，1995所述在體內(nèi)測(cè)定。對(duì)實(shí)體瘤的活性能用例如實(shí)體瘤的鼠模型來(lái)檢測(cè)。介導(dǎo)受感染細(xì)胞或病原體溶解的能力能在動(dòng)物模型中用受感染動(dòng)物來(lái)測(cè)定。GVHD和GVL能力也能如以下實(shí)施例4及5所述在體內(nèi)測(cè)定。
以下實(shí)施例中描述了所有上述試驗(yàn)。由于鼠與人之間免疫應(yīng)答的相似性，使用鼠模型進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)預(yù)示人的應(yīng)答。例如，GVL效應(yīng)在鼠和人系統(tǒng)中都得到很好證明。這些試驗(yàn)的結(jié)果預(yù)示DLI處理的宿主中的體內(nèi)生物學(xué)反應(yīng)。
根據(jù)動(dòng)物模型的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)有代表性數(shù)量的患者測(cè)試確定有效的化合物濃度，并使用導(dǎo)致患者疾病緩解的最有效化合物濃度。對(duì)大多數(shù)患者使用的條件是最優(yōu)選的。這些患者一般是BM移植后的患者。
根據(jù)這些試驗(yàn)和檢測(cè)的結(jié)果，確定最佳處理?xiàng)l件是可能的，該條件將產(chǎn)生不能增殖和引發(fā)GVHD，但能有效地促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的白細(xì)胞群體。被處理的白細(xì)胞群體應(yīng)當(dāng)具有GVL活性。白細(xì)胞供體的選擇對(duì)于DLI，供體與白細(xì)胞輸注的宿主(受體)必須是同種異體的。HLA-A及-B是HLA I基因，而HLA-DR是HLA II基因。這些基因的每一種都以多種不同的等位基因形式存在。由于每一個(gè)體固有兩個(gè)拷貝的染色體6(含有HLA基因)，所以個(gè)體能表達(dá)最高可達(dá)6個(gè)的不同HLA-A、-B和-DR蛋白質(zhì)(每一基因座兩個(gè)不同等位基因的產(chǎn)物)。優(yōu)選地，同種異體供體在HLA-A、B和DR的6個(gè)HLA基因座的3個(gè)或更多上是基因型相同的。在“單倍體相同的”移植中，供體和宿主在6個(gè)HLA基因座的3個(gè)上匹配。理想地，供體和受體在HLA-A、B和DRB1上相同。通過(guò)美國(guó)國(guó)家骨髓供體程序(NMPD)能搜索到HLA-匹配的無(wú)關(guān)供體。
當(dāng)前，對(duì)于接受未修飾的非T細(xì)胞排除移植的已達(dá)55歲的患者，患者與供體的HLA-A、B和DRB1基因必須相同。36歲或更年輕的患者能從HLA-A、-B或-DR相差不超過(guò)1個(gè)次要抗原匹配的供體移植。HLA-A或B次要匹配被定義為屬于相同交叉反應(yīng)組的兩種抗原。HLA-DR次要匹配被定義為表達(dá)相同DR特異性但DRB1等位基因不同的兩種單元型。對(duì)于合適的同種異體供體的方案，參見(jiàn)O’Reilly，R.等人，異體骨髓移植用于缺少供體的患者的方法，于《血液學(xué)》-1996，美國(guó)血液學(xué)協(xié)會(huì)教育計(jì)劃，第132-146頁(yè)。白細(xì)胞的制備本發(fā)明的白細(xì)胞群體的起始材料能由例如地區(qū)性血液處理中心提供，其類似于現(xiàn)有的處理外周血干細(xì)胞以及造血干細(xì)胞的其它來(lái)源(如骨髓)的中心。能在用于進(jìn)行處理的任何合適的設(shè)施輸入(能在多種設(shè)施包括當(dāng)?shù)匮褐行幕蜥t(yī)院血庫(kù)進(jìn)行輸入)并處理供體的白細(xì)胞。此外，輸入的白細(xì)胞能連夜運(yùn)往優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)的細(xì)胞處理設(shè)施進(jìn)行處理和質(zhì)量保證試驗(yàn)。然后將用于DLI的經(jīng)處理的白細(xì)胞通過(guò)當(dāng)日快遞送往患者所在醫(yī)院，用于對(duì)患者施用。此外，能使用本領(lǐng)域所知的方法冷藏處理的白細(xì)胞，如控制在10％DMSO中的冷凍速度，并貯存于液氮中(參見(jiàn)Russel等人，骨髓移植19861-866，1997)。當(dāng)需要移植時(shí)，融化冷凍的白細(xì)胞，洗滌去除DMSO。
一種用于純化白細(xì)胞制劑的常規(guī)方法包括通過(guò)密度梯度離心從全血中分離。這一般包括通過(guò)Ficoll梯度離心分離富含T細(xì)胞的白細(xì)胞。參見(jiàn)，例如，Longley和Stewart，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)12133-38，1989。該方法如下進(jìn)行(1)仔細(xì)地在Ficoll上層加新抽取的血樣(例如50-200毫升)，使得界面不受干擾；(2)通過(guò)吸出位于梯度界面的不透明細(xì)胞帶(離心后)收集白細(xì)胞；和(3)洗滌收集的細(xì)胞，使之不含F(xiàn)icoll。在該系統(tǒng)中沉淀紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。為了去除Ficoll，一般通過(guò)離心并棄上清液，洗滌細(xì)胞一次或多次。該方法產(chǎn)生純化的白細(xì)胞制劑，即基本上不含紅細(xì)胞的制劑。
存在制備大量白細(xì)胞制劑的自動(dòng)化方法。例如，本發(fā)明構(gòu)思了根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)用白細(xì)胞電泳儀(例如，COBE Spectra Apheresis System，COBE BCT，Inc.Lakewood，CO)處理血液。優(yōu)選地，使用產(chǎn)生具有最低百分血細(xì)胞比容的白細(xì)胞制劑的輸入(apheresis)儀。白細(xì)胞電泳后，用適當(dāng)溶液(如上所述的血漿、輸血級(jí)溶液等)洗滌并稀釋白細(xì)胞制劑，使之達(dá)到低于0.5％的最終血細(xì)胞比容。如果以上步驟不能充分降低血細(xì)胞比容水平，則用Percoll分離作為進(jìn)一步的純化步驟。作為白細(xì)胞電泳的一種備擇方法，紅細(xì)胞去除法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的。
如果基本上只含有T細(xì)胞和NK細(xì)胞或其它白細(xì)胞混合物的白細(xì)胞群體是所希望的，則能利用例如用鑒定特異性細(xì)胞表面標(biāo)記的適當(dāng)抗體的陽(yáng)性和/或陰性選擇，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)，從白細(xì)胞制劑中分離所選的細(xì)胞亞群。能用于篩選的表面標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于CD4、CD8、CD16和CD56。這些細(xì)胞分離法在本領(lǐng)域中眾所周知，參見(jiàn)，例如，Ed Harlow和David Lane，《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibody，A Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約，1988。
將純化的白細(xì)胞群體懸浮于如上公開(kāi)的適當(dāng)溶液中。能立即處理純化的白細(xì)胞群體，或冷藏用于以后的處理。在對(duì)于增殖滅活的制劑中，將純化、混合的白細(xì)胞制劑重懸浮于等滲溶液如血漿、合成培養(yǎng)基或此兩者的組合物中。一般以每毫升10-109個(gè)細(xì)胞、優(yōu)選地104-107細(xì)胞/ml、理想地2×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度制備純化的白細(xì)胞群體。
本發(fā)明構(gòu)思了經(jīng)處理的白細(xì)胞的制備和施用或應(yīng)用的多種方案?？墒占庵苎?或另外的白細(xì)胞來(lái)源包括骨髓或臍血)，并冷凍直到用于增殖滅活處理，處理時(shí)融化細(xì)胞并洗滌使之不含冷藏劑，任選地加工以獲得純化的白細(xì)胞制劑，并進(jìn)行處理。隨后能將經(jīng)處理的白細(xì)胞群體輸入患者。下列備擇方案也是可能的i)外周血的收集、加工、白細(xì)胞處理和輸注；ii)收集、加工、白細(xì)胞處理、經(jīng)處理的細(xì)胞的冷凍、洗掉冷藏劑和輸注；iii)用靶抗原接種供體以擴(kuò)展抗原特異性T細(xì)胞、從接種的供體收集外周血、加工、處理并輸注；iv)用靶抗原對(duì)供體白細(xì)胞體外致敏以擴(kuò)展抗原特異性T細(xì)胞、白細(xì)胞處理和輸注。化合物在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，能與核酸形成共價(jià)鍵的化合物適于獲得本發(fā)明的白細(xì)胞群體的目的。這些化合物優(yōu)選地包含一種與核酸非共價(jià)結(jié)合的部分，以及能與核酸反應(yīng)形成共價(jià)鍵的相同或不同的部分。該化合物優(yōu)選地具有下列性質(zhì)i)對(duì)核酸的高結(jié)合親和力；ii)在水溶液中的可溶性；和iii)穿透白細(xì)胞膜的能力。能與核酸形成共價(jià)鍵的部分包括化學(xué)反應(yīng)性部分，其不需要外部刺激來(lái)激活并可與核酸反應(yīng)，和可光活化的部分，其只在以電磁輻射形式刺激后才與核酸反應(yīng)。
在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“烷化劑化合物”是指一種化合物，其包含至少一種化學(xué)反應(yīng)性部分，該部分在沒(méi)有外部刺激如光刺激時(shí)能與核酸反應(yīng)形成共價(jià)鍵。
能與核酸形成共價(jià)鍵的化合物還可能是可光活化的。在此定義的“可光活化化合物”包括一種在被某種波長(zhǎng)的光線刺激光活化后能與核酸形成共價(jià)鍵的部分。
優(yōu)選地，該化合物包含能與核酸反應(yīng)形成共價(jià)鍵的部分，和能與核酸非共價(jià)結(jié)合的部分。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，能與核酸結(jié)合的部分也可以作為能與核酸共價(jià)反應(yīng)的部分，并且可以是例如可光活化的。
在一種實(shí)施方案中，烷化劑化合物包含核酸結(jié)合部分；能與核酸反應(yīng)形成共價(jià)鍵的部分(“在此被稱為效應(yīng)物部分”)；和共價(jià)連接核酸部分與效應(yīng)物部分的脆性連接體。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，在水溶液中，適當(dāng)pH值時(shí)，這些化合物具有一段時(shí)間的活性，其間它們能與核酸結(jié)合并反應(yīng)。該階段后，化合物分解為不再能與核酸很好地結(jié)合也不能與之反應(yīng)的產(chǎn)物。
這些烷化劑化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)可被大致地描述為一種能與脆性連接體共價(jià)鍵合的錨，共價(jià)連接于一種效應(yīng)物上?！板^”，也被稱為“核酸結(jié)合部分”被定義為能與核酸生物聚合體(DNA、RNA或其合成類似物)非共價(jià)結(jié)合的部分?！靶?yīng)物”或“效應(yīng)物部分”被定義為一種能通過(guò)與核酸形成共價(jià)鍵的機(jī)制與該核酸反應(yīng)的部分。“脆性連接體”被定義為一種用來(lái)共價(jià)連接錨與效應(yīng)物的部分，其在某些條件下降解，使錨與效應(yīng)物不再共價(jià)連接。錨-脆性連接體-效應(yīng)物的排列使化合物能與核酸特異結(jié)合(由于錨的結(jié)合能力)。這使效應(yīng)物進(jìn)入附近與核酸反應(yīng)。
優(yōu)選地，核酸結(jié)合部分選自芳族嵌入物、吖啶、吖啶衍生物、橢圓玫瑰樹(shù)堿、2-多胺、溝結(jié)合劑和疏水或擇形結(jié)合劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，脆性連接體含有一種功能性單位，其選自正向酯、反向酯、正向硫代酯、反向硫代酯、正向及反向硫羰酸酯、正向及反向二硫代羧酸、硫酸酯、正向及反向磺酸酯、磷酸酯和正向及反向膦酸酯基。效應(yīng)物部分優(yōu)選地含有一種官能團(tuán)，選自芥子基、芥子基相當(dāng)物、環(huán)氧化物、醛和甲醛合成體。
當(dāng)烷化劑化合物與白細(xì)胞組合物在生理pH下結(jié)合形成一種反應(yīng)混合物時(shí)，該化合物的效應(yīng)物部分與所接觸的核酸反應(yīng)。不能與核酸反應(yīng)的效應(yīng)物部分逐漸被溶劑水解。脆性連接體的水解與效應(yīng)物-核酸反應(yīng)和效應(yīng)物水解同時(shí)發(fā)生。理想的是脆性連接體以低得足以使白細(xì)胞增殖失活的速率分解；即，脆性連接體的分解速率低于該化合物與白細(xì)胞核酸反應(yīng)的速率。經(jīng)過(guò)足夠長(zhǎng)的時(shí)間后，該化合物分解為錨(其也可帶有脆性連接體片段)和效應(yīng)物-核酸分解產(chǎn)物(脆性連接體片段也可能仍與效應(yīng)物連接)，或者分解為錨(其也可帶有脆性連接體片段)和水解的效應(yīng)物分解產(chǎn)物(脆性連接體片段也可能仍與效應(yīng)物連接)。不與錨或效應(yīng)物保持連接的化合物降解后，也能產(chǎn)生脆性連接體的其它片段。本發(fā)明的烷化劑化合物的確切實(shí)施方案確定錨分解產(chǎn)物或效應(yīng)物分解產(chǎn)物是否帶有脆性連接體片段，或者是否產(chǎn)生脆性連接體的其它片段，這些片段不與錨或效應(yīng)物分解產(chǎn)物結(jié)合。
優(yōu)選的烷化劑化合物是在脆性連接體分裂后產(chǎn)生低誘變性分解產(chǎn)物的化合物。效應(yīng)物水解后化合物的誘變性主要?dú)w因于錨部分，因?yàn)樵撳^與核酸相互作用，并且可能具有干擾核酸復(fù)制的能力，即使效應(yīng)物部分水解后仍如此。脆性連接體分裂后，錨片段具有大大降低的誘變性。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，在一段時(shí)間后從反應(yīng)混合物中去除能與核酸形成共價(jià)鍵的化合物。最佳反應(yīng)時(shí)間可以經(jīng)驗(yàn)地確定，如下文實(shí)施例中所述。在共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/779,830、08/779,885和09/003,113中以及在1998年7月8日申請(qǐng)的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)代理人目錄號(hào)28217-20004.21和28217-20004.22中，提供了用于從反應(yīng)混合物中去除化合物的方法和組合物。上一句所提及的所有專利申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容在此都完全引入作為參考。此外，也向反應(yīng)混合物中加入能與化合物反應(yīng)并使之失活的猝滅劑。在1998年1月6日申請(qǐng)的共同擁有的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/070,597和1998年7月6日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)代理人目錄號(hào)28217-20006.00中，公開(kāi)了典型的猝滅劑和方法；其公開(kāi)內(nèi)容在此都完全引入作為參考。
多種類型適用于作為錨、連接體和效應(yīng)物。能在烷化劑化合物中使用的錨基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于嵌入物(包括芳族嵌入物)、小溝結(jié)合劑、大溝結(jié)合劑、通過(guò)靜電相互作用或疏水相互作用結(jié)合的分子以及通過(guò)序列特異性相互作用結(jié)合的分子。以下是可能的錨基團(tuán)的非限制性列表吖啶(及吖啶衍生物，例如硫酸原黃素、吖啶黃素、二吖啶、吖啶酮、苯并吖啶、喹吖因)、放線菌素、蒽環(huán)酮、紫紅菌素、道諾霉素、噻噸酮(及噻噸酮衍生物，例如竹桃霉素D)、氨茴霉素、絲裂霉素、棘霉素(醌霉素A)、三骨菌素、橢圓玫瑰樹(shù)堿(及二聚體、三聚體及其類似物)、norphilin A、芴(及衍生物，如芴酮、芴二胺)、吩嗪、菲啶、吩噻嗪(例如氯丙嗪)、吩噁嗪、苯并噻唑、呫噸和噻噸、蒽醌、蒽吡唑、苯并噻喃吲哚、3，4-苯并芘、1-芘基環(huán)氧乙烷、苯并蒽、苯并二吡喃酮、喹啉(例如氯奎、奎寧、苯基喹啉、氨甲酰)、呋喃香豆素(例如補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素)、乙錠、丙錠、coralyne和多環(huán)芳香烴及其環(huán)氧乙烷衍生物；偏端霉素、紡錘霉素、其它lexitropsin、Hoechst 33258及其它Hoechst染料、DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)、berenil和三芳基甲烷染料；黃曲霉毒素；精胺、亞精胺及其它多胺；和核酸或類似物，它們通過(guò)序列特異性相互作用如三股螺旋形成、D-環(huán)形成和與單鏈標(biāo)靶的直接堿基配對(duì)來(lái)結(jié)合。這些化合物的衍生物也是錨基的非限制性實(shí)例，其中化合物衍生物包括但不限于，在任何位置帶有一種或多種任何種類的取代基的化合物，該化合物氧化或還原產(chǎn)物，等等。
能在本發(fā)明中使用的連接體的實(shí)例包括但不限于含有如下官能團(tuán)的化合物，如酯(其中該酯的羰基碳位于錨與酯的sp3氧之間；該排列也叫做“正向酯”)、“反向酯”(其中該酯的sp3氧位于錨與該酯的羰基碳之間)、硫代酯(其中該硫代酯的羰基碳位于錨與該硫代酯的硫之間，也叫做“正向硫代酯”)、反向硫代酯(其中該硫代酯的硫位于錨與該硫代酯的羰基碳之間，也叫做“反向硫代酯”)、正向及反向硫羰酸酯、正向及反向二硫代羧酸、硫酸酯、正向及反向磺酸酯、磷酸酯、正向及反向膦酸酯基?！傲虼ァ北硎?C(＝O)-S-基；“硫羰酸酯”表示-C(＝S)-O-基，“二硫代羧酸”表示-C(＝S)-S-基。對(duì)于被稱為“正向”和“反向”的基團(tuán)，正向是這樣的官能團(tuán)方向，其中在官能團(tuán)水解后，產(chǎn)生的酸性官能團(tuán)可與錨部分共價(jià)連接，而產(chǎn)生的醇或硫醇官能團(tuán)可與效應(yīng)物部分共價(jià)連接。反向是這樣的官能團(tuán)方向，其中在官能團(tuán)水解后，產(chǎn)生的酸性官能團(tuán)可與效應(yīng)物部分共價(jià)連接，而產(chǎn)生的醇或硫醇官能團(tuán)可與錨部分共價(jià)連接。
能在本發(fā)明中使用的效應(yīng)物的實(shí)例包括但不限于芥子基、芥子基相當(dāng)物、環(huán)氧化物、醛、甲醛合成體和其它烷化及交聯(lián)劑。芥子基被定義為含有單或雙鹵乙胺基和單鹵乙硫醚基。芥子基相當(dāng)物被定義為通過(guò)類似于芥子基的機(jī)制(即，通過(guò)形成一種吖丙啶鎓中間物，或者通過(guò)含有或形成一種氮丙啶環(huán)，它能與親核物質(zhì)反應(yīng))反應(yīng)的基團(tuán)，如單或雙甲磺?；野坊渭谆酋；伊蛎鸦?、單或雙甲苯磺?；野坊蛦渭妆交酋；伊蛎鸦?。甲醛合成體被定義為能在水溶液中分解為甲醛的任何化合物，包括羥甲胺如羥甲基甘氨酸。美國(guó)專利號(hào)4,337,269和國(guó)際專利申請(qǐng)WO 97/02028中給出了甲醛合成體的實(shí)例。
用下列通式I、II和III描述能用來(lái)制備本發(fā)明的白細(xì)胞的烷化劑化合物。
通式I為
其中至少R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9之一是如下所述的-V-W-X-E，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9的剩余者獨(dú)立地選自-H、-R10、-O-R10、-NO2、-NH2、-NH-R10、-N(R10)2、-F、-Cl、-Br、-I、-C(＝O)R10、-C(＝O)-O-R10和-O-C(＝O)-R10，其中-R10獨(dú)立地為H、-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；V獨(dú)立地為-R11-、-NH-R11-或-N(CH3)-R11-，其中-R11-獨(dú)立地為-C1-8烷基-、-C1-8雜烷基-、-芳基-、-雜芳基-、-C1-3烷基-芳基-、-C1-3雜烷基-芳基-、-C1-3烷基-雜芳基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-、-芳基-C1-3烷基-、-芳基-C1-3雜烷基-、-雜芳基-C1-3烷基-、-雜芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-；W獨(dú)立地為-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-O-S(＝O)2-O-、-S(＝O)2-O-、-O-S(＝O)2-、-O-P(＝O)(-OR10)-O-、-P(＝O)(-OR10)-O-、-O-P(＝O)(-OR10)-；X獨(dú)立地為-R11-；并且E獨(dú)立地選自-N(R12)2、-N(R12)(R13)、-S-R12和
其中-R12為-CH2CH2-G，其中每個(gè)G獨(dú)立地為-Cl、-Br、-I、-O-S(＝O)2-CH3、-O-S(＝O)2-CH2-C6H5或-O-S(＝O)2-C6H4-CH3；其中R13獨(dú)立地為-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；及其所有的鹽和立體異構(gòu)體(包括對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體)。
根據(jù)通式I的一種優(yōu)選組合物是化合物S-303，其中V為-NHR11-，R11為-CH2CH2-，W為-C(＝O)-O-，X為-CH2CH2-，E為-N(R12)2，R12為-CH2CH2G，G為-Cl。參見(jiàn)共同擁有的PCT申請(qǐng)US98/00531。通式II為
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8獨(dú)立地選自-H、-R10、-O-R10、-NO2、-NH2、-NH-R10、-N(R10)2、-F、-Cl、-Br、-I、-C(＝O)R10、-C(＝O)-O-R10和-O-C(＝O)-R10，其中-R10獨(dú)立地為H、-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；R20為-H或-CH3；并且R21為-R11-W-X-E，其中-R11-獨(dú)立地為-C1-8烷基-、-C1-8雜烷基-、-芳基-、-雜芳基-、-C1-3烷基-芳基-、-C1-3雜烷基-芳基-、-C1-3烷基-雜芳基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-、-芳基-C1-3烷基-、-芳基-C1-3雜烷基-、-雜芳基-C1-3烷基-、-雜芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-；W獨(dú)立地為-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-O-S(＝O)2-O-、-S(＝O)2-O-、-O-S(＝O)2-、-O-P(＝O)(-OR10)-O-、-P(＝O)(-OR10)-O-、-O-P(＝O)(-OR10)-；X獨(dú)立地為-R11-；并且E獨(dú)立地選自-N(R12)2、-N(R12)(R13)、-S-R12和
其中-R12為-CH2CH2-G，其中每個(gè)G獨(dú)立地為-Cl、-Br、-I、-O-S(＝O)2-CH3、-O-S(＝O)2-CH2-C6H5或-O-S(＝O)2-C6H4-CH3；其中R13獨(dú)立地為-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；及其所有的鹽和立體異構(gòu)體(包括對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體)。
通式III為
其中至少R44、R55、R3、R4、R5和R8之一是-V-W-X-E，而R44、R55、R3、R4、R5和R8的剩余者獨(dú)立地選自-H、-R10、-O-R10、-NO2、-NH2、-NH-R10、-N(R10)2、-F、-Cl、-Br、-I、-C(＝O)R10、-C(＝O)-O-R10和-O-C(＝O)-R10，其中-R10獨(dú)立地為H、-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；V獨(dú)立地為-R11-、-NH-R11-或-N(CH3)-R11-，其中-R11-獨(dú)立地為-C1-8烷基-、-C1-8雜烷基-、-芳基-、-雜芳基-、-C1-3烷基-芳基-、-C1-3雜烷基-芳基-、-C1-3烷基-雜芳基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-、-芳基-C1-3烷基-、-芳基-C1-3雜烷基-、-雜芳基-C1-3烷基-、-雜芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-；W獨(dú)立地為-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-O-S(＝O)2-O-、-S(＝O)2-O-、-O-S(＝O)2-、-O-P(＝O)(-OR10)-O-、-P(＝O)(-OR10)-O-、-O-P(＝O)(-OR10)-；X獨(dú)立地為-R11-；并且E獨(dú)立地選自-N(R12)2、-N(R12)(R13)、-S-R12和
其中-R12為-CH2CH2-G，其中每個(gè)G獨(dú)立地為-Cl、-Br、-I、-O-S(＝O)2-CH3、-O-S(＝O)2-CH2-C6H5或-O-S(＝O)2-C6H4-CH3；其中R13獨(dú)立地為-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；及其所有的鹽和立體異構(gòu)體(包括對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體)。
應(yīng)當(dāng)理解，在上述通式I中，吖啶核是錨部分，-V-W-X-基團(tuán)包括脆性連接體、E基團(tuán)為效應(yīng)物基團(tuán)。同樣，在上述通式III中，補(bǔ)骨脂素核是錨部分，-V-W-X-基團(tuán)包括脆性連接體、E基團(tuán)為效應(yīng)物基團(tuán)。通式II是通式I的子集。
實(shí)施例7-12說(shuō)明這些化合物的合成，用于產(chǎn)生本發(fā)明的白細(xì)胞。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，以前在共同擁有的美國(guó)專利號(hào)5,399,719(其公開(kāi)內(nèi)容在此完全引入作為參考)中公開(kāi)的4’-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(“S-59”)也可用于對(duì)白細(xì)胞群體的光化學(xué)處理。
適用于本發(fā)明方法的可光活化化合物包括呋喃香豆素、放線菌素、蒽環(huán)酮、氨茴霉素、苯并二吡喃酮、芴和芴酮、單星脂肪藍(lán)、norphillinA、有機(jī)染料、菲啶、吩噻嗪硫鎓鹽、吩嗪、吩噻嗪、疊氮基苯、喹啉和噻噸酮。在此所述的可光活化化合物的優(yōu)選種通常是指呋喃香豆素。補(bǔ)骨脂素及衍生物補(bǔ)骨脂素是屬于呋喃香豆素組的平面芳香族有機(jī)化合物。補(bǔ)骨脂素存在于自然中，主要在植物中，包括椴樹(shù)、丁香、芹菜、歐防風(fēng)和無(wú)花果。至于人類，補(bǔ)骨脂素已經(jīng)用于對(duì)白癲風(fēng)、牛皮癬和蕈樣肉芽腫治療的光化學(xué)療法。關(guān)于補(bǔ)骨脂素光化學(xué)的綜述，參見(jiàn)Parsons，B.J.，光化學(xué)與光生物學(xué)32813-821，1980。以下顯示了補(bǔ)骨脂素的基本結(jié)構(gòu)。
特別地，本發(fā)明考慮補(bǔ)骨脂素，[7H-呋喃(3，2-g)-(1)-苯并吡喃-7-酮，或6-羥基-5-苯并呋喃丙烯酸的b-內(nèi)酯]，它是線性的
其中附加于中心芳香部分的兩個(gè)氧殘基具有1，3方向，另外其中的呋喃環(huán)部分連接于兩個(gè)環(huán)的香豆精系統(tǒng)的位置6上。補(bǔ)骨脂素衍生物由線性呋喃香豆素在位置3、4、5、8、4’或5’的取代所產(chǎn)生。
關(guān)于安全問(wèn)題，補(bǔ)骨脂素已存在于我們的飲食中。無(wú)長(zhǎng)波長(zhǎng)UVA照射時(shí)，補(bǔ)骨脂素是相對(duì)無(wú)活性的。測(cè)得UVA激活的補(bǔ)骨脂素的有效半衰期為幾毫秒。照射后剩余的所有藥物都回復(fù)為無(wú)活性狀態(tài)，從而限制其副作用。
以前用于病原體滅活的方案需要在暴露于光線之前及光照期間從反應(yīng)中去除分子氧，來(lái)防止照射過(guò)程中產(chǎn)生的氧自由基對(duì)血液制品的損傷。參見(jiàn)L.Lin等人，血液74517(1989)；Wiesehahn的美國(guó)專利號(hào)4,727,027。本發(fā)明的方法能用來(lái)在氧存在下抑制白細(xì)胞的增殖。此外，應(yīng)用本發(fā)明的方法使用的新型補(bǔ)骨脂素，不需要降低分子氧的濃度。優(yōu)選的補(bǔ)骨脂素具有低誘變性和高核酸結(jié)合親和力。
8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(在文獻(xiàn)中有不同的名稱，例如，花椒毒素、甲氧補(bǔ)骨脂素、8-MOP)是一種天然存在的補(bǔ)骨脂素，在埃姆斯試驗(yàn)中具有低誘變性。
4’-氨甲基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(AMT)是最有反應(yīng)性的核酸結(jié)合補(bǔ)骨脂素衍生物之一，可在每3.5個(gè)DNA堿基對(duì)中產(chǎn)生可達(dá)1個(gè)的AMT加合物(S.T.Issacs，G.Wiesehahn和L.M.Hallick，NCI專論(NCI Monograph)6621，1984)。
“4’-伯氨基取代的補(bǔ)骨脂素”或“4-PAP”被定義為這樣的補(bǔ)骨脂素化合物，其具有通過(guò)總長(zhǎng)為2-20個(gè)碳的烴鏈與補(bǔ)骨脂素4’位置連接的NH2基，其中這些碳的0-6個(gè)獨(dú)立地被NH或O所取代，取代的每一點(diǎn)與取代的其它點(diǎn)至少隔開(kāi)兩個(gè)碳，與補(bǔ)骨脂素至少隔開(kāi)一個(gè)碳。4’-伯氨基取代的補(bǔ)骨脂素可以在補(bǔ)骨脂素的4、5’和8位置上具有其它的取代，這些取代包括但不限于下列基團(tuán)H和(CH2)nCH3，其中n＝0-6。
“5’-伯氨基取代的補(bǔ)骨脂素”，在此也用縮寫(xiě)“5-PAP”表示，被定義為這樣的補(bǔ)骨脂素化合物，其具有通過(guò)總長(zhǎng)為1-20個(gè)碳的烴鏈與補(bǔ)骨脂素5’位置連接的NH2基，其中這些碳的0-6個(gè)獨(dú)立地被NH或O取代，取代的每一點(diǎn)與取代的其它點(diǎn)至少隔開(kāi)兩個(gè)碳，與補(bǔ)骨脂素至少隔開(kāi)一個(gè)碳。5’-伯氨基取代的補(bǔ)骨脂素可以在補(bǔ)骨脂素4、4’和8位置上具有其它的取代，這些取代包括但不限于下列基團(tuán)H和(CH2)nCH3，其中n＝0-6。美國(guó)專利號(hào)5,585,503、5,578,736、5,556,993和5,399,719中公開(kāi)了4-PAP和5-PAP的實(shí)例(包括S-59)以及它們的合成方法。
優(yōu)選的補(bǔ)骨脂素包括5’-伯氨基取代的補(bǔ)骨脂素和4’-伯氨基取代的補(bǔ)骨脂素(在此通稱為PAP)、8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP)、4’-氨甲基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(AMT)、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素(5-MOP)和三氧雜啉4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。AMT、5-MOP、8-MOP和三氧雜啉是可商業(yè)獲得的。
最優(yōu)選的補(bǔ)骨脂素是具有以上所示結(jié)構(gòu)式的S-59(見(jiàn)縮寫(xiě)S-59)。S-59是一種能通過(guò)嵌入與核酸可逆結(jié)合的合成補(bǔ)骨脂素。一旦用UVA照射，嵌入的S-59即形成單加合物并與RNA和DNA鏈間交聯(lián)。S-59光化學(xué)處理是核酸特異的，S-59易于穿過(guò)細(xì)胞膜和核膜。S-59兼具高水溶性和核酸結(jié)合親和力的特點(diǎn)，對(duì)于核酸加合物的形成具有高的量子產(chǎn)量。這使較低補(bǔ)骨脂素濃度能用于PCT，在無(wú)非特異性細(xì)胞損傷的情況下抑制增殖。對(duì)S-59的誘變性和基因毒性研究證明了對(duì)于用來(lái)凈化血液制品中的病原體的濃度而言40000-67000倍的安全限度。最后，用于PCT的S-59劑量大大低于呋喃香豆素(包括補(bǔ)骨脂素的化學(xué)基團(tuán))的平均每日飲食攝入量(Wagstaff.D.J.Reg.Tox.Pharm.14261-272，1991)。
在一種實(shí)施方案中，用一種可光活化化合物處理含有一種白細(xì)胞群體的細(xì)胞群體，該化合物含有一種在光活化后能與核酸形成共價(jià)鍵的部分。因此，為了與核酸形成共價(jià)鍵，可光活化化合物必須用光線活化。光線包括紫外線(UVA、UVB、UVC)和可見(jiàn)光。在一種實(shí)施方案中，用于PCT的波長(zhǎng)范圍為200-450nm。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，用于PCT的光線波長(zhǎng)為320-400nm。
優(yōu)選地，用波長(zhǎng)為320-400nm的UV線光化學(xué)處理該細(xì)胞群體。單純的UVA照射對(duì)細(xì)胞引起最小的損傷。
在一種實(shí)施方案中，可光活化化合物包括一種補(bǔ)骨脂素分子。應(yīng)用適當(dāng)濃度補(bǔ)骨脂素和UVA線劑量的PCT將引起增殖抑制，而保持白細(xì)胞的免疫原性功能，例如，該功能可有效地促進(jìn)疾病細(xì)胞、受感染細(xì)胞或病原體的破壞，誘導(dǎo)抗白血病反應(yīng)，便于第二種細(xì)胞群體的植入，促進(jìn)免疫重建，利于免疫治療及治療混合嵌合狀態(tài)。補(bǔ)骨脂素反應(yīng)性不僅特別針對(duì)細(xì)胞中的核酸之于蛋白質(zhì)，而且對(duì)于DAN之于RNA分子也有不同的補(bǔ)骨脂素結(jié)合親和力，這是由于使得能更好嵌入DNA中的核酸結(jié)構(gòu)的不同(Cimino，G.D.等人，生物化學(xué)年述(Ann.Rev.Biochem.)541151-1193，1985)。另外，利用該技術(shù)，能區(qū)別性地修飾轉(zhuǎn)錄活性(相比無(wú)活性)基因，這是由于可影響補(bǔ)骨脂素結(jié)合的不同構(gòu)象和組蛋白結(jié)合狀態(tài)。因此，如PCT的處理具有主要在DNA合成(復(fù)制)水平上干擾細(xì)胞功能的能力，對(duì)轉(zhuǎn)錄有較小的影響，對(duì)蛋白質(zhì)合成有最小的影響或無(wú)影響。例如，在PCT的情況中，根據(jù)所用的補(bǔ)骨脂素濃度和UVA線劑量確定干擾的水平。
與可光活化化合物混合的白細(xì)胞樣品用一種光活化裝置光化學(xué)處理。通常，適用于本PCT方法的光活化裝置包括下列部分(a)一種裝置，用于提供適當(dāng)波長(zhǎng)的電磁輻射，以引起可光活化化合物的活化；(b)在光活化期間支持多種樣品的裝置，它與提供輻射的裝置有固定的關(guān)系；和(c)在光活化期間使樣品溫度保持于希望的溫度范圍內(nèi)的裝置。
在一種實(shí)施方案中，該光活化裝置能夠發(fā)射出特定強(qiáng)度的電磁輻射光譜，包括200-450nm、優(yōu)選地320-400nm的波長(zhǎng)。使用光活化裝置內(nèi)的適當(dāng)濾波器能選擇特定的波長(zhǎng)。在Hearst等人的美國(guó)專利號(hào)5,184,020和5,503,721及WO 96/39820中公開(kāi)了一種合適的光活化裝置以及利用該裝置光活化可光活化化合物的方法。可以使用的其它光活化裝置包括General Electric F20TI2-BLB型熒光UVA燈泡(Alter，H.J.等人，柳葉刀241446(1988))和倫敦P.W.Allen Co.制造的A405-TLGW/05型長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外線燈。用補(bǔ)骨脂素對(duì)白細(xì)胞的光化學(xué)處理在水中或在如以下實(shí)施例所述的適當(dāng)溶劑中制備補(bǔ)骨脂素貯存液。
將補(bǔ)骨脂素貯存液加入純化的供體白細(xì)胞群體懸液中至希望的終濃度。以上述制備方法，用8-MOP飽和的PAS制備用8-MOP處理的單位。在光活化裝置中用UVA線照射純化的供體白細(xì)胞，至10-3-100J/cm2的終劑量。照射期間攪拌樣品。在照射之前采取白細(xì)胞樣品作為對(duì)照。
一般而言，向純化的白細(xì)胞制劑中加入濃度為10-4-150μM、優(yōu)選地10-3-150μM的PAP。白細(xì)胞的細(xì)胞密度一般為約10-109細(xì)胞/ml，優(yōu)選地約103-108細(xì)胞/ml，更優(yōu)選地約104-107細(xì)胞/ml，最優(yōu)選地約2×106細(xì)胞/ml，在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，利用波長(zhǎng)為320-400nm的紫外線對(duì)與S-59混合的白細(xì)胞進(jìn)行PCT。將光活化方法限于大于320nm的波長(zhǎng)使直接核酸損傷減到最小，因?yàn)楦哂?13nm時(shí)核酸的吸收很小。細(xì)胞優(yōu)選地將接受約10-3-100J/cm2、更優(yōu)選地1-3J/cm2的光劑量。在一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中，光劑量為3J/cm2。照射一般為1-50mW/cm2的光強(qiáng)度。白細(xì)胞樣品暴露于UV線的時(shí)間為約1秒到60分鐘，優(yōu)選地約3分鐘，更優(yōu)選地約1分鐘。
PCT后，如上及實(shí)施例所述測(cè)定白細(xì)胞樣品增殖及參與白細(xì)胞活性的效能。主要是測(cè)定下列參數(shù)細(xì)胞生存力、增殖能力、細(xì)胞因子分泌和表面抗原表達(dá)。治療應(yīng)用本發(fā)明的經(jīng)處理的白細(xì)胞群體是不增殖的但保留免疫學(xué)活性，如下所述具有多種預(yù)防及治療用途。一般地，接受含有經(jīng)處理的白細(xì)胞群體的DLI的個(gè)體包括但不限于移植患者，如BM后移植患者或預(yù)期進(jìn)行實(shí)體器官移植的患者。經(jīng)處理的白細(xì)胞不能引起GVHD這一事實(shí)使得在DLI中能施用更大量的白細(xì)胞(即更大的細(xì)胞劑量)，從而使治療的效能達(dá)到最大。
經(jīng)處理的白細(xì)胞可用于供體白細(xì)胞輸注(DLI)，尤其是對(duì)異體BMT患者或無(wú)免疫應(yīng)答患者(如患有CLL的老年患者)提供免疫活性。使用經(jīng)處理的白細(xì)胞的DLI可用于緩解包括下列的多種病癥白血病，包括慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、慢性骨髓單核細(xì)胞性白血病(CmML)、急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)；多發(fā)性骨髓瘤(MM)；非何杰金氏淋巴瘤和何杰金氏淋巴瘤；大細(xì)胞淋巴瘤(LCL)；和EB病毒誘導(dǎo)的B淋巴增生性疾病(EBV-BLPD或EBV-誘導(dǎo)的淋巴瘤)；
實(shí)體瘤，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌和結(jié)腸癌、黑素瘤、腎細(xì)胞癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、頭頸腫瘤；再生障礙性貧血；脊髓發(fā)育不良；免疫缺陷，例如常見(jiàn)多種免疫缺陷、SCID、維-奧二氏綜合癥；粒性白細(xì)胞缺乏癥；混合嵌合狀態(tài)；和遺傳病。
DLI可以用于預(yù)防或治療目的的多種形式(a)對(duì)所有同種異體移植的過(guò)繼免疫治療；(b)對(duì)于免疫抑制或免疫缺陷患者的免疫重建；(c)對(duì)不適于移植的老年白血病患者的治療(d)BMT少量或小型移植。
BMT少量方案是兩個(gè)步驟的方法，包括i)使用最小條件方案和供體干細(xì)胞對(duì)移植耐受性的誘導(dǎo)；和ii)重復(fù)用DLI的治療。該方案避免了化學(xué)治療方案的毒性。BMT少量方案適用于下列適應(yīng)癥不能正常地適于移植的患者，尤其是老年患者(＞65歲)；CLL患者，其中大多數(shù)嚴(yán)重?zé)o免疫應(yīng)答。BMT少量方案降低了毒性、GVHD和感染。以下實(shí)施例13中描述了一種典型的BMT少量方案。
(e)CD34選擇的/T細(xì)胞排除的同種異體移植加同時(shí)的DLI。
與CD34+選擇的細(xì)胞(為了富集干細(xì)胞及祖細(xì)胞的選擇)同時(shí)提供的DLI可用于提供對(duì)感染的過(guò)繼免疫治療，如CMV、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒引起的感染，和真菌感染，并可用于治療白血病，例如CML。
(f)混合嵌合狀態(tài)的治療。
(g)補(bǔ)救化學(xué)治療或化學(xué)抗性白血病。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，在單倍體相同的(單倍)移植中施以PA-DLI。一般地，單移植需要幾乎完全的T細(xì)胞排除，導(dǎo)致嚴(yán)重的、持續(xù)的免疫抑制。PA-DLI可用于保持宿主的免疫活性；另外，可為癌癥的治療提供GVL效應(yīng)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的無(wú)GVHD能力但保留某些免疫功能的白細(xì)胞，在DLI中用于復(fù)發(fā)性癌癥的緩解或同種異體BMT后最小殘余疾病的去除，尤其是CML和急性白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。對(duì)CML的bcr-abl蛋白質(zhì)特異的大量供體CTL有助于復(fù)發(fā)CML中DLI的效能。如果通過(guò)醫(yī)生常規(guī)用來(lái)監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞存在的方法能檢測(cè)到惡性細(xì)胞，則確定癌癥患者患有“復(fù)發(fā)”。
在另一種實(shí)施方案中，在誘導(dǎo)化學(xué)治療(化學(xué)治療的最初一輪)期間白血病患者的治療中使用含有非增殖性白細(xì)胞的DLI，來(lái)避免重度骨髓抑制方案并消除最小殘余疾病。在該安排中使用DLI，能降低誘導(dǎo)期間所用化療藥物的有毒劑量。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，PA-DLI也能用于實(shí)體器官的移植(例如腎臟、心臟、皮膚)，作為一種提高異體移植物壽命和供體器官接受的機(jī)會(huì)的方法。由于供體器官中過(guò)客白細(xì)胞的存在，在異體移植中大多發(fā)生器官排斥。由于不能增殖且不能介導(dǎo)GVHD，DLI(使用器官供體的白細(xì)胞)可作為移植前耐受方案，用于將以其它方式誘導(dǎo)器官排斥的免疫應(yīng)答的抑制。對(duì)于實(shí)體器官移植的宿主的耐受包括下列步驟在器官移植過(guò)程之前或期間，用相當(dāng)水平的重度骨髓抑制方案進(jìn)行含或不含供體干細(xì)胞的PA-DLI輸入，使供體細(xì)胞能在循環(huán)中存活。DLI可便于該方案中供體干細(xì)胞的植入，允許宿主中的混合嵌合狀態(tài)。
在所有類型的移植和植入情況中，能在移植之前、同時(shí)或之后對(duì)宿主施用經(jīng)處理的白細(xì)胞。能在這些時(shí)間中的任何時(shí)間進(jìn)行多次經(jīng)處理的細(xì)胞群體的輸注。
不增殖的、免疫功能性的白細(xì)胞對(duì)于由于高齡或comorbid病而禁忌傳統(tǒng)異體BMT的患者的DLI特別重要。患有癌癥的老年患者(＞65歲)不是異體BMT的主要候選者，部分地是由于移植不能很好地重建老化的免疫系統(tǒng)，并由于該方法的嚴(yán)格性。當(dāng)前，對(duì)控制老年患者中的癌癥有效的唯一選擇是化學(xué)治療，其副作用對(duì)于這些患者是無(wú)法忍受的。本發(fā)明的經(jīng)處理的白細(xì)胞提供一種十分需要的備擇方法，用于治療老齡患者癌癥并提供對(duì)機(jī)會(huì)感染的免疫防御。DLI對(duì)于破壞癌細(xì)胞而不引起伴隨的GVHD是有用的。
有些治療情況中，在用上述化合物處理供體白細(xì)胞群體之前，擴(kuò)展供體白細(xì)胞亞群尤其是抗原特異性T細(xì)胞和前身細(xì)胞是所希望的。能用對(duì)疾病細(xì)胞(例如，腫瘤相關(guān)抗原)或病原體特異的抗原刺激白細(xì)胞群體，來(lái)擴(kuò)展/富集對(duì)該抗原特異的細(xì)胞毒性及輔助T細(xì)胞的數(shù)量。通過(guò)在從被刺激的供體中分離白細(xì)胞之前用適當(dāng)抗原接種供體，能在體內(nèi)進(jìn)行刺激；此外，在用化合物處理白細(xì)胞群體之前能在體外進(jìn)行對(duì)分離白細(xì)胞的刺激。
例如，用多發(fā)性骨髓瘤患者的IgG接種的供體含有高水平的骨髓瘤特異的前身CTL。因此，對(duì)于治療多發(fā)性骨髓瘤(MM)中的應(yīng)用，從這些接種的供體中制備白細(xì)胞是優(yōu)選的。Hsu，F(xiàn)J等人，國(guó)家醫(yī)學(xué)(Nat.Med.)252-58，1996中描述了為了用非何杰金氏淋巴瘤免疫患者而用腫瘤相關(guān)肽對(duì)樹(shù)突細(xì)胞脈沖。在Stingl，G.等人，今日免疫(Immunol.Today)16330-333，1995中綜述了用肽/抗原對(duì)樹(shù)突細(xì)胞脈沖的技術(shù)。Pardoll，D.等人，免疫(Immunity)3165-169，1995中描述了cDNA免疫(用合適的cDNA轉(zhuǎn)染樹(shù)突細(xì)胞)。在用于CML治療的過(guò)繼免疫治療中，在分離供體白細(xì)胞之前，能用bcr-abl肽接種供體，用于通過(guò)本發(fā)明的方法治療及隨后的輸注。例如，ten Bosch，G.等人，血液883522-3527，1996描述了用于接種的有效的及免疫原性的肽。在另一種實(shí)施例中，在根據(jù)本發(fā)明的方法治療之前，用前列腺特異性抗原(PSA)在體內(nèi)或體外預(yù)刺激用于前列腺癌治療的供體白細(xì)胞。這樣的接種能用于增加前身T細(xì)胞群體和/或?qū)ζ渌[瘤特異性抗原、病毒抗原及其它病原體抗原特異的T細(xì)胞群體。
用合適的抗原接種的供體的白細(xì)胞可用于為無(wú)免疫應(yīng)答的患者提供對(duì)機(jī)會(huì)感染的免疫防御的預(yù)防或治療，這些機(jī)會(huì)感染如巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒或腺病毒(Ad)感染。一種實(shí)例中，能對(duì)CMV抗原接種供體，分離其白細(xì)胞，并根據(jù)本發(fā)明的方法處理，以在DLI中用來(lái)治療由于免疫抑制而患CMV感染的患者。無(wú)免疫應(yīng)答的患者包括處于免疫抑制藥物治療中的患者，如器官移植患者(BM及其它器官)、HIV或EBV感染的人體、癌癥患者和具有免疫缺陷病的個(gè)體。
也能在體外刺激供體白細(xì)胞(也被稱為離體的擴(kuò)展)來(lái)擴(kuò)大前身細(xì)胞集合。例如，在多發(fā)性骨髓瘤情況中，在治療阻斷GVHD活性之前，通過(guò)與由樹(shù)突細(xì)胞呈遞的患者特異的MM抗原在體外一起培養(yǎng)，能刺激供體白細(xì)胞。
也能利用離體的或體外刺激擴(kuò)展抗白血病T細(xì)胞群體用于CML的治療。在CML中，染色體9上的c-abl癌基因向染色體22上的斷點(diǎn)簇區(qū)(bcr)的經(jīng)典易位(t(9；22)(q34；q11))產(chǎn)生bcr-abl融合基因及bcr-abl210kD融合癌蛋白質(zhì)的表達(dá)。bcr-abl融合蛋白質(zhì)是CML特異的，bcr-abl蛋白質(zhì)的兩種主要變體是良好表征的抗原。能進(jìn)行體外刺激來(lái)擴(kuò)展bcr-abl蛋白質(zhì)特異的T細(xì)胞，例如，如Choudhury，A.等人，血液891133-1142，1997；ten Bosch，G.等人，血液883522-3527，1996及Mannering等人，血液90290-297，1997所述。代表斷點(diǎn)區(qū)或接點(diǎn)(新的接點(diǎn)氨基酸序列)的肽能作為免疫原，用于對(duì)來(lái)源于健康供體的人T細(xì)胞的體外免疫(參見(jiàn)，ten Bosch，G.等人，1996，如上文；Mannering等人，1997，如上文)。產(chǎn)生的CD4+T細(xì)胞識(shí)別來(lái)源于同種異體CML患者的bcr-abl表達(dá)細(xì)胞。在另一種方法中，能從CML患者的外周血細(xì)胞中體外產(chǎn)生樹(shù)突細(xì)胞(DC)，并作為抗原呈遞細(xì)胞用于抗白血病T細(xì)胞的離體擴(kuò)展(Choudhury等人，1997，如上文)。一般來(lái)說(shuō)，供體抗原呈遞細(xì)胞(APC)能用表現(xiàn)疾病細(xì)胞特征的抗原脈沖，或者能與疾病細(xì)胞(例如，滅活的腫瘤細(xì)胞)協(xié)同培養(yǎng)；然后可在向受體中輸入供體白細(xì)胞之前使這些APC接觸供體白細(xì)胞。此外，供體白細(xì)胞與疾病細(xì)胞(或疾病細(xì)胞抗原)的直接接觸能用來(lái)擴(kuò)展供體淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞群體。
用來(lái)擴(kuò)展T細(xì)胞的“抗原”可以是多肽、脂類或碳水化合物部分(或任何組合，如糖蛋白)，并能從疾病細(xì)胞或病原體中分離或重組產(chǎn)生。含有多肽的抗原不需要組成全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，只要它包括至少一種表位即可。該抗原能作為全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或其片段或作為重組產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)包含于疫苗組合物中，可與或者不與一種佐劑結(jié)合或以其它方式呈遞。疫苗能采用多種形式表達(dá)抗原的疾病細(xì)胞，或其細(xì)胞膜制劑；或者病原體，優(yōu)選地為滅活形式。制備疫苗的方法在文獻(xiàn)中有講授，參見(jiàn)，例如，Harlow，如上文。免疫和體外(離體)刺激和前身細(xì)胞群體擴(kuò)展的方法在本領(lǐng)域中已知，參見(jiàn)，例如，Choudhury，A.等人，血液891133-1142，1997；ten Bosch，G.等人，血液883522-3527，1996；Mannering等人，血液90290-297，1997。
對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用，白細(xì)胞一般在血漿、合成培養(yǎng)基或其它生理緩沖溶液中施用，劑量為每次輸注每kg大約105-1011個(gè)白細(xì)胞，體積大約為50-500ml或更多。這些參數(shù)隨治療和疾病而不同，并由治療患者的醫(yī)生來(lái)決定。標(biāo)準(zhǔn)DLI實(shí)踐是以每kg體重107-108個(gè)細(xì)胞的劑量施用白細(xì)胞。能與化學(xué)治療結(jié)合施行DLI。
對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用，本發(fā)明的白細(xì)胞一般是靜脈內(nèi)施用的。
在BMT后90天內(nèi)GVHD通常是明顯。為了緩解癌癥復(fù)發(fā)患者中的疾病，優(yōu)選地在復(fù)發(fā)診斷后1周-3月內(nèi)進(jìn)行DLI。對(duì)于異體BMT后的過(guò)繼免疫治療，能從BMT之前到幾年后進(jìn)行DLI作為維持治療。對(duì)于接受DLI代替BMT的癌癥患者，優(yōu)選地在癌癥診斷不久后即施以DLI。在不進(jìn)行BMT時(shí)，能在化學(xué)及放射方案或其它治療方案之前、期間或之后進(jìn)行DLI。在所有指標(biāo)中，DLI的適當(dāng)時(shí)間安排將由在疾病治療方面熟練的醫(yī)生來(lái)確定。
治療成功的評(píng)價(jià)DLI后，就常規(guī)方法后的GVHD監(jiān)測(cè)宿主或患者。在輸注后90天內(nèi)GVHD通常是明顯的。臨床GVHD癥狀包括皮疹、腫脹和肝、腸、肺及關(guān)節(jié)損傷、嚴(yán)重的腹瀉和黃疸。能測(cè)定患者膽紅素和肝功能酶的水平，并且也能進(jìn)行肝臟的活組織檢查。能定期對(duì)接受DLI的患者監(jiān)測(cè)詳細(xì)病史、身體檢查、綜合實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)，包括完全血細(xì)胞計(jì)數(shù)和差別血細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿分析、血液尿素氮肌酸酐、膽紅素、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶、Na+、K+、Cl-、清蛋白、總蛋白質(zhì)、葡萄糖和放射顯影檢查。癌癥狀況能通過(guò)例如骨髓抽取檢查和活組織檢查、細(xì)胞遺傳檢查(包括免疫組化分析)和分子分析來(lái)評(píng)價(jià)。
對(duì)于本發(fā)明，如果有可見(jiàn)的或可測(cè)量的疾病癥狀或疾病引起的癥狀的好轉(zhuǎn)，則本發(fā)明經(jīng)處理的白細(xì)胞的受體病情緩解(病情指惡性腫瘤或感染)。癥狀及評(píng)價(jià)其好轉(zhuǎn)的方法隨病情而不同，但為臨床醫(yī)生所熟悉。用來(lái)評(píng)價(jià)治療成功的一種有用的終點(diǎn)是100天的死亡率。
本發(fā)明的方法和組合物也可用于非DLI情況中GVHD的預(yù)防。這些包括但不限于血小板轉(zhuǎn)輸及血小板貯存過(guò)程中細(xì)胞因子積累引起的發(fā)熱、非溶血性輸血反應(yīng)。
本方法及本發(fā)明的經(jīng)處理的、不增殖的白細(xì)胞也具有體外用途。例如，PCT方法是在原代培養(yǎng)物或具有分化能力的細(xì)胞系(如祖細(xì)胞和干細(xì)胞)中抑制DNA合成而不影響細(xì)胞生物合成的最低侵入性方法。因此，能在試驗(yàn)中用處理?xiàng)l件來(lái)制備分離的干細(xì)胞、白細(xì)胞或其它細(xì)胞系，從而檢測(cè)細(xì)胞分化或發(fā)育步驟是否取決于增殖/DNA合成。這些研究可以鑒定沿分化或發(fā)育途徑的靶分子，并且有利于抑制或促進(jìn)分化的藥物的發(fā)展。例如，也能用經(jīng)處理的白細(xì)胞作為單向MLR試驗(yàn)中的刺激細(xì)胞，來(lái)刺激有增殖能力的同種異體細(xì)胞的免疫應(yīng)答，而刺激細(xì)胞本身不同時(shí)增殖。使用能與DNA形成共價(jià)鍵的化合物的PCT及有關(guān)處理，將代替當(dāng)前輻射或絲裂霉素C的應(yīng)用，來(lái)實(shí)現(xiàn)刺激細(xì)胞的細(xì)胞抑制(cytostatis)。對(duì)于體外應(yīng)用，能單獨(dú)或作為測(cè)定試劑盒的一部分來(lái)提供經(jīng)處理的白細(xì)胞或其它細(xì)胞的組合物。該測(cè)定試劑盒能用于MLR或用于分化測(cè)定。為此目的，經(jīng)處理的細(xì)胞一般以冷凍形式提供。此外，試劑盒可提供用于制備白細(xì)胞或具有上述特征的其它細(xì)胞的試劑和說(shuō)明書(shū)。這些試劑包括一種或多種能與DNA形成共價(jià)鍵的化合物。例如，一種用于PCT的試劑盒將包括一種或多種可光活化化合物，優(yōu)選地為PAP或吖啶，更優(yōu)選地為S-59。
下列實(shí)施例是為了說(shuō)明在此所述的本發(fā)明而不是限制其范圍。對(duì)該方法的有些修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是易于明白的，并且包含于權(quán)利要求書(shū)中。
實(shí)施例多種試驗(yàn)根據(jù)3H胸苷摻入的增殖測(cè)定法在一種典型測(cè)定中，在測(cè)試化合物(例如DNA復(fù)制抑制劑或促分裂原)的存在或不存在下，在96孔板中將細(xì)胞培養(yǎng)預(yù)期的一段時(shí)間。使用大約20Ci/mmol比活的3H胸苷制備一般含有1μCi/50μl/孔的介質(zhì)。將該介質(zhì)/標(biāo)記物加入細(xì)胞中，并將細(xì)胞于37℃溫育約4-6小時(shí)或更長(zhǎng)。為方便起見(jiàn)，用一種多通道細(xì)胞收集器將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到濾紙片上，并洗掉游離的(未摻入的)標(biāo)記物。然后干燥該濾片，轉(zhuǎn)移至小瓶，并浸于閃爍液中。然后可將小瓶置于自動(dòng)計(jì)數(shù)器中，計(jì)數(shù)氚全范圍，確定一式三份樣品的每分鐘平均計(jì)數(shù)(cpm)。化合物-DNA加合物的測(cè)定用3H標(biāo)記的PAP測(cè)定DNA修飾的程度。向純化的白細(xì)胞樣品中加入PAP至希望的終濃度。以適當(dāng)?shù)腢V線劑量照射小型-PL2410塑料容器中的20mL等份。對(duì)照樣品在無(wú)UVA時(shí)只用PAP處理。照射后，純化白細(xì)胞DNA。通過(guò)測(cè)定260nm的吸光度測(cè)定每一樣品的DNA含量。由DNA樣品的放射性計(jì)算每1000個(gè)堿基對(duì)(bp)的補(bǔ)骨脂素加合物的數(shù)量。標(biāo)準(zhǔn)曲線使3H計(jì)數(shù)的量與加合物的數(shù)量相關(guān)。PCR抑制試驗(yàn)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法在本領(lǐng)域中眾所周知。參見(jiàn)K.B.Mullis等人，美國(guó)專利號(hào)4,683,195和4,683,202，在此引入作為參考?？捎迷撛囼?yàn)來(lái)估計(jì)PAP-DNA加合物對(duì)特定核酸序列的模板功能的作用。
為了獲得HLA-DQα基因座中的242bp序列或?qū)Ζ?珠蛋白基因座中的439bp序列，PCR擴(kuò)增由光化學(xué)處理的或γ照射的血小板濃縮物獲得的DNA樣品(1μg)。連續(xù)稀釋(1∶10)然后擴(kuò)增對(duì)照(未處理的)DNA。不稀釋地?cái)U(kuò)增處理的DNA。PCR擴(kuò)增進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。該試驗(yàn)提供了一種方法，用于將細(xì)胞增殖試驗(yàn)所測(cè)定的功能性T細(xì)胞增殖抑制與核酸的直接修飾相關(guān)聯(lián)。
下列實(shí)施例1-4表明，PCT對(duì)被處理白細(xì)胞性質(zhì)的影響與白細(xì)胞DNA的修飾及聚合酶活性的抑制相關(guān)。其次，對(duì)血小板濃縮物中白細(xì)胞的PCT處理能防止鼠轉(zhuǎn)輸模型中轉(zhuǎn)輸激活的GVHD。
實(shí)施例1T細(xì)胞的光化學(xué)滅活實(shí)施例1證明，PCT能以依賴劑量的方式滅活白細(xì)胞。作為例子，補(bǔ)骨脂素，可使用S-59、AMT和8-MOP。PCT的劑量依賴性隨所用補(bǔ)骨脂素的性質(zhì)而不同，S-59是所試最有效的。
表征了應(yīng)用S-59(正方形)、4’-氨甲基4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素[AMT](三角形)和8-甲氧基補(bǔ)骨脂素[8-MOP](圓形)的光化學(xué)處理對(duì)血小板濃縮物(PC)中白細(xì)胞的劑量相關(guān)的作用，結(jié)果顯示于圖1中。血小板濃縮物如美國(guó)專利號(hào)5,593,823所述制備并處理，該專利在此引入作為參考。在LDA試驗(yàn)中將來(lái)自于光化學(xué)處理的及未處理的合并隨機(jī)供體PC的白細(xì)胞加于板上。在1焦耳/cm2UVA的恒定光劑量下使用不同濃度的三種補(bǔ)骨脂素。用0.05μM S-59、1.0μM AMT和10.0μM 8-MOP滅活T細(xì)胞至LDA的檢測(cè)下限(用箭頭標(biāo)出)。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，在抑制T細(xì)胞增殖方面，與AMT和8-MOP相比，S-59是更好的光試劑。
實(shí)施例2混合白細(xì)胞反應(yīng)從4個(gè)個(gè)體中抽取外周血置于抗凝劑檸檬酸葡萄糖(ACD)試管中。通過(guò)在Ficoll上的密度梯度離心分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。合并三名供體的PBMC，用作異體刺激物。剩余個(gè)體的PBMC用作效應(yīng)物。刺激物和效應(yīng)物PBMC用補(bǔ)加有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI洗兩次，重懸浮于補(bǔ)加培養(yǎng)基中。
使刺激物PBMC暴露于血庫(kù)137銫輻射體的2500cGyγ輻射下。然后將刺激物細(xì)胞以含有1.0×105個(gè)細(xì)胞的100μL等份加于96孔圓底平板中。
效應(yīng)物細(xì)胞如下經(jīng)受應(yīng)用S-59的PCT。將效應(yīng)物細(xì)胞重懸浮于30mL上述細(xì)胞培養(yǎng)基中，并向細(xì)胞懸液中加入水性S-59貯存液(溶解于水中)至圖2、圖3或圖4中所說(shuō)明的終濃度。S-59貯存液的濃度和使用體積依希望的S-59終濃度而不同。然后將含有S-59的30mL細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到小PL2410袋中，用3J/cm2劑量的UVA線照射。對(duì)于圖3，光劑量為3.0J/cm2。然后離心細(xì)胞，重懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基中，以含有1.0×105個(gè)細(xì)胞的100μL等份加板，并與刺激物細(xì)胞混合為每孔200μL的終體積。
然后在37℃、5％CO2下溫育培養(yǎng)板。溫育1、2及7天后取出MLR的上清液樣品，貯存于-80℃，用于隨后的細(xì)胞因子分析。用來(lái)測(cè)定細(xì)胞增殖的孔溫育6天。6天溫育后，用來(lái)測(cè)定細(xì)胞增殖的所有孔接受1μCi3H胸苷。在3H胸苷存在下溫育24小時(shí)后，將細(xì)胞收獲于玻璃纖維紙上。然后通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)定量摻入的3H胸苷的量。圖2顯示了用不同濃度S-59光化學(xué)處理的效應(yīng)細(xì)胞的3H胸苷摻入的結(jié)果。
用R&D Systems提供的ELISA測(cè)定試劑盒按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行被處理細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ合成的分析。圖3和圖4分別顯示IL-2和干擾素-γ產(chǎn)生的結(jié)果。圖4中，對(duì)第7天采取的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行IFN-γ分析。
實(shí)施例3PCT的白細(xì)胞功能調(diào)節(jié)實(shí)施例3表明，用于PCT的補(bǔ)骨脂素濃度和光劑量能調(diào)節(jié)根據(jù)細(xì)胞因子合成和表面標(biāo)記表達(dá)(例如CD69淋巴細(xì)胞活化標(biāo)記表達(dá))確定的白細(xì)胞活性。該數(shù)據(jù)提供了證據(jù)表明，能滴定UVA光劑量和可光活化化合物的濃度，來(lái)獲得對(duì)于阻斷白細(xì)胞群體中的T細(xì)胞增殖及保持白細(xì)胞活性都有效的適當(dāng)范圍，正如細(xì)胞因子合成和表面標(biāo)記表達(dá)所證明的。a.PCT對(duì)細(xì)胞因子合成的調(diào)節(jié)以0.5J/cm2UVA的恒定光劑量用不同濃度S-59的PCT后也測(cè)定了IL-8的合成(見(jiàn)圖5)。發(fā)現(xiàn)用隨S-59濃度逐漸增加的PCT能調(diào)節(jié)IL-8合成。在S-59濃度范圍內(nèi)以1.0J/cm2UVA時(shí)也獲得相似的行為(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，細(xì)胞因子的合成能被用于PCT的補(bǔ)骨脂素濃度和光劑量所調(diào)節(jié)。b.PCT處理后白細(xì)胞上CD69表達(dá)的調(diào)節(jié)借助于CD69的熒光抗體和FACS掃描分析，測(cè)定被PMA和鈣離子載體激活后白細(xì)胞對(duì)CD69表達(dá)的誘導(dǎo)(見(jiàn)圖6)。用不同濃度AMT和1J/cm2UVA光化學(xué)處理后隨時(shí)間的變化測(cè)定CD69的表達(dá)。也發(fā)現(xiàn)PCT對(duì)CD69表達(dá)誘導(dǎo)的影響是依賴補(bǔ)骨脂素劑量的，在AMT濃度越來(lái)越高時(shí)，CD69的表達(dá)顯示更大的抑制。在本研究中為S-59的低劑量時(shí)，誘導(dǎo)保持不變。
實(shí)施例4PCT引起的DNA修飾實(shí)施例4表明，PCT對(duì)所處理白細(xì)胞性質(zhì)的影響與白細(xì)胞DNA修飾和聚合酶活性的抑制相關(guān)。
利用3H放射性標(biāo)記的S-59、AMT和8-MOP加1.9J/cm2UVA以及對(duì)經(jīng)處理的白細(xì)胞的分離DNA的閃爍計(jì)數(shù)，在合并的隨機(jī)供體PC的光化學(xué)處理后測(cè)定白細(xì)胞基因組DNA上的補(bǔ)骨脂素加合物(圖7)。用150μM S-59、AMT和8-MOP的光化學(xué)處理分別誘導(dǎo)12.0、6.0和0.7個(gè)加合物/1000bp DNA。PCT后被處理白細(xì)胞基因組DNA上加合物的相對(duì)數(shù)量與PCT對(duì)白細(xì)胞功能的影響相關(guān)，并且證明該影響是DNA修飾的直接后果。PCR抑制試驗(yàn)中對(duì)DNA聚合酶DNA擴(kuò)增的抑制(數(shù)據(jù)未顯示)顯示對(duì)PCT過(guò)程中所用補(bǔ)骨脂素濃度的相同依賴性。
由在此用于研究PCT對(duì)白細(xì)胞體外影響的所有生物學(xué)及分子參數(shù)得出的結(jié)果是一致的。通過(guò)有限稀釋分析對(duì)白細(xì)胞功能的估計(jì)、細(xì)胞因子產(chǎn)生的測(cè)定及補(bǔ)骨脂素誘導(dǎo)的DNA損傷的定量顯示，PCT以劑量依賴的方式滅活白細(xì)胞。使用適當(dāng)?shù)膭┝?，能控制白?xì)胞的功能如細(xì)胞因子的產(chǎn)生或抗原性標(biāo)記的表達(dá)。另外，在所試的三種補(bǔ)骨脂素中，S-59在滅活白細(xì)胞方面是最有效的。S-59抑制T細(xì)胞增殖的劑量范圍大約為3.5log單位。因此，能抑制白細(xì)胞增殖和伴隨的GVHD但保留免疫功能的劑量窗口大于其它滅活方法所提供的。
實(shí)施例5鼠轉(zhuǎn)輸模型中TA-GVHD的預(yù)防下列鼠轉(zhuǎn)輸模型是很好表征的模擬人TA-GVHD臨床綜合征的模型(Fast，LD等人，血液82292，1993)。根據(jù)預(yù)期的體外結(jié)果，使用該體內(nèi)模型，通過(guò)將純合親本(A株，H-2a)的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)輸?shù)矫庖呋钚噪s合F1雜交受體(B6AF1株，H-2a/b)中，來(lái)估計(jì)S-59光化學(xué)處理對(duì)TA-GVHD抑制的影響。
經(jīng)外側(cè)尾靜脈將大約108個(gè)的供體(A或F1)脾細(xì)胞輸入每一受體(F1)中。由密度梯度離心獲得的脾細(xì)胞用作活T細(xì)胞的來(lái)源。使用三個(gè)轉(zhuǎn)輸組(1)處理對(duì)照組(F1→F1)將B6AF1脾細(xì)胞輸入B6AF1受體中；(2)陽(yáng)性TA-GVHD對(duì)照組(A→F1)將供體A脾細(xì)胞輸入B6AF1受體中；(3)S-59光化學(xué)處理組(PCT A→F1)用150μM S-59和3焦耳/cm2UVA處理供體A的脾細(xì)胞，然后輸入B6AF1受體中。
轉(zhuǎn)輸后2周內(nèi)監(jiān)測(cè)受體的TA-GVHD的生物學(xué)證據(jù)。用雙色熒光激活流式細(xì)胞儀分析受體脾細(xì)胞的供體T細(xì)胞移植。該試驗(yàn)中，用pan-T細(xì)胞、抗-CD3抗體也用抗H-2b抗體染色脾T細(xì)胞。根據(jù)與抗H-2b抗體反應(yīng)的缺乏檢測(cè)供體A的T細(xì)胞。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)1→F1受體的超過(guò)99％的CD3陽(yáng)性脾細(xì)胞都用抗H-2b抗體標(biāo)記。平行地，用51Cr裂解試驗(yàn)測(cè)定受體脾臟中細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)的存在。將脾細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的EL-4細(xì)胞(H-2b)以150∶1的效應(yīng)物靶比值在37℃下溫育4-6小時(shí)。根據(jù)靶細(xì)胞的裂解和51Cr向培養(yǎng)基中的釋放來(lái)測(cè)定CTL的細(xì)胞毒性。
結(jié)果表明，盡管在本研究期間對(duì)照F1→F1組中的受體仍然健康，但A→F1組中的受體在供體脾細(xì)胞輸入2-3周后發(fā)展TA-GVHD的生物學(xué)癥狀。TA-GVHD的特征在于脾大、供體T細(xì)胞(H-2a)的移入(28.6±11.3％)和受體脾臟中CTL的存在(35±18.7％51Cr裂解)(表1)。
轉(zhuǎn)輸兩周后通過(guò)測(cè)定脾臟∶體重比值來(lái)估計(jì)脾大。轉(zhuǎn)輸三周后通過(guò)胸腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)來(lái)檢測(cè)免疫缺陷的發(fā)展。胸腺發(fā)育不全是與TA-GVHD相關(guān)的獲得性免疫缺陷的可靠指標(biāo)。
也監(jiān)測(cè)受體的GVHD臨床癥狀，包括體重、姿勢(shì)、活動(dòng)、皮膚完整性、毛皮質(zhì)地、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)。F1→F1組中健康動(dòng)物的每周體重隨時(shí)間增加，而A→F1組中動(dòng)物的平均體重不隨時(shí)間增加。
A→F1組中動(dòng)物的平均臨床得分(0-2級(jí)，健康動(dòng)物為0級(jí))隨時(shí)間增加，表明TA-GVHD表面上是明顯的并逐漸地加重。PCT A→F1組中的動(dòng)物類似于對(duì)照F1→F1組中的動(dòng)物，仍然健康并且沒(méi)有可見(jiàn)的TA-GVHD臨床表現(xiàn)。當(dāng)轉(zhuǎn)輸后超過(guò)10周時(shí)在A→F1組中觀察到25％的死亡率，而對(duì)照F1→F1和PCT A→F1組中的所有動(dòng)物都保持健康。
表1
1.S.D.＝標(biāo)準(zhǔn)差2.轉(zhuǎn)輸兩周后測(cè)定3.轉(zhuǎn)輸三周后測(cè)定在盲編后制備組織切片并檢查其組織學(xué)異常。對(duì)肝臟評(píng)價(jià)淋巴浸潤(rùn)液的存在與膽管破壞及血管內(nèi)皮炎癥和浸潤(rùn)。就淋巴小囊的保留或破壞評(píng)價(jià)脾的組織學(xué)。評(píng)價(jià)皮膚切片的皮下區(qū)和附器中的淋巴浸潤(rùn)。評(píng)價(jià)骨髓切片每一主要譜系脊髓、細(xì)胞胞類和巨核細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成熟。在盲試中，A→F1小鼠在肝、脾、骨髓和口腔粘膜中發(fā)展GVHD的組織學(xué)證據(jù)。相反，光化學(xué)處理的供體細(xì)胞(PCT-A)或同源細(xì)胞(F1)的受體不顯示組織學(xué)異常。
用濃度為50nM-150μM的S-59和3J/cm2UVA處理的輸入細(xì)胞的幾組小鼠的轉(zhuǎn)輸，在該范圍內(nèi)顯示完全的GVHD抑制。這表明GVHD能被PCT體內(nèi)抑制的劑量窗口類似于體外試驗(yàn)所獲得的。
體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)的結(jié)論為，在3.5對(duì)數(shù)單位的S-59濃度中，對(duì)白細(xì)胞的PCT處理在體外能抑制其增殖并且在體內(nèi)抑制TA-GVHD。對(duì)于相同的濃度范圍，觀察到體外白細(xì)胞功能(細(xì)胞因子合成和表面分子表達(dá))的依賴劑量的調(diào)節(jié)。
實(shí)施例6本實(shí)施例描述了一種方法，用來(lái)確定適于抑制GVHD而保留DLI的GVL效應(yīng)的PCT條件，例如用于在對(duì)同種異體BMT后復(fù)發(fā)白血病患者的治療。實(shí)驗(yàn)?zāi)康目偨Y(jié)如下。
A.在PCT中使用的補(bǔ)骨脂素濃度范圍的確定，以防止體外淋巴細(xì)胞的增殖，從而抑制GVHD。
B.體外光化學(xué)處理的白細(xì)胞表型的表征，以確定細(xì)胞生存力和預(yù)示產(chǎn)生體內(nèi)GVL效應(yīng)的T細(xì)胞及NK細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。
C.對(duì)體外經(jīng)處理的白細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)的定性及定量分析。
D.鼠白血病模型中體內(nèi)經(jīng)處理的白細(xì)胞-DLI對(duì)GVHD抑制的證明。用補(bǔ)骨脂素對(duì)白細(xì)胞的光化學(xué)處理如下所述制備補(bǔ)骨脂素的貯存液。通過(guò)在10mL蒸餾水中溶解50mgAMT粉末制備15mM的AMT貯存液。劇烈混合該溶液，并通過(guò)0.2μm針筒式濾膜過(guò)濾。使用Shimadzu UV160U分光光度計(jì)測(cè)定溶液在250nm的吸光度，來(lái)確定濾過(guò)液中AMT的濃度。用25000M-1cm-1的消光系數(shù)值計(jì)算AMT的濃度。
通過(guò)在蒸餾水中溶解S-59粉末制備S-59補(bǔ)骨脂素的貯存液。劇烈混合該溶液，并通過(guò)0.2μm針筒式濾膜過(guò)濾。使用Shimadzu UV160U分光光度計(jì)測(cè)定溶液在250nm的吸光度，來(lái)測(cè)定濾過(guò)溶液中S-59的濃度。用25400M-1cm-1的消光系數(shù)值計(jì)算S-59的濃度。
8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP)在水溶液中是溶解度較差。因此，使用以8-MOP飽和的PAS溶液(PAS，可從Baxter獲得，是一種人工血液代用品，由pH7.2、300mOsm的乙酸鈉、檸檬酸三鈉、氯化鈉磷酸緩沖液組成)制備用8-MOP和紫外線處理的白細(xì)胞制劑。通過(guò)在100mLPAS中懸浮100mg 8-MOP制備其飽和溶液。在黑暗容器中于室溫下將該溶液攪拌16小時(shí)。通過(guò)0.2μm濾膜過(guò)濾得到的溶液，以除去任何不溶的8-MOP。使用Shimadzu UV160U分光光度計(jì)測(cè)定248nm的吸光度，來(lái)測(cè)定8-MOP的終濃度。用22900M-1cm-1的消光系數(shù)值計(jì)算8-MOP的濃度。
向純化的供體白細(xì)胞群體懸液中加入補(bǔ)骨脂素貯存液至希望的終濃度。按上述制備方法，使用8-MOP飽和的PAS制備用8-MOP處理的單位。在光活化裝置中用UVA線照射純化的供體白細(xì)胞至10-3-100J/cm2的終劑量。在照射過(guò)程中以70轉(zhuǎn)/分鐘攪拌該單位。在照射之前采取白細(xì)胞樣品用作對(duì)照。
以10-4-150μM的濃度向純化的白細(xì)胞制劑中加入S-59。白細(xì)胞將具有10-108細(xì)胞/mL、優(yōu)選地107細(xì)胞/mL、更優(yōu)選地2×106細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度。
使與S-59混合的白細(xì)胞群體樣品暴露于波長(zhǎng)為200-450nm、優(yōu)選地320-400nm的紫外線下。細(xì)胞優(yōu)選地接受約10-3-100J/cm2的光劑量。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，光劑量為3J/cm2。UV線暴露的時(shí)限約為1秒到60分鐘，優(yōu)選地約1分鐘。
PCT后，如上及實(shí)施例中所述，測(cè)定白細(xì)胞樣品增殖及參與白細(xì)胞活性的能力。應(yīng)測(cè)定下列參數(shù)細(xì)胞生存力和完整性；增殖活性；表面抗原表達(dá)；細(xì)胞因子分泌；GVHD和GVL活性。
下列試驗(yàn)?zāi)苡糜谕榛瘎┨幚淼幕蚬饣瘜W(xué)處理的白細(xì)胞。A.體外白細(xì)胞的劑量反應(yīng)動(dòng)力學(xué)i)有限稀釋試驗(yàn)(LDA)該試驗(yàn)直接測(cè)定可克隆的T細(xì)胞數(shù)量，它在體內(nèi)直接與GVHD的發(fā)病率和嚴(yán)重程度相關(guān)(Keman，N.A.等人，血液68770-773，1986)。FDA使用LDA對(duì)血液制品的γ照射建立通用規(guī)程。該試驗(yàn)按照Pelsynski，M.等人，血液831683-1689，1994的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，在用不同濃度藥物和恒定劑量光線PCT處理后測(cè)定人白細(xì)胞增殖細(xì)胞的數(shù)量。用合并的致死性γ-照射的異體刺激細(xì)胞來(lái)刺激生長(zhǎng)。增殖對(duì)照包括未處理的白細(xì)胞(作為增殖的陽(yáng)性對(duì)照)和接受致死性γ-照射的PCT前的白細(xì)胞(陰性對(duì)照)。根據(jù)分離的增殖集落的數(shù)量測(cè)定生長(zhǎng)。對(duì)人白細(xì)胞測(cè)定所用劑量與被增殖抑制的細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。從該實(shí)驗(yàn)獲得的劑量反應(yīng)預(yù)計(jì)類似于對(duì)于血小板濃縮物中的白細(xì)胞所獲得的。
如下進(jìn)行LDA。通過(guò)白細(xì)胞電泳從外周血中分離白細(xì)胞。刺激活T細(xì)胞，使之在含有RPMI培養(yǎng)基的微量滴定板的孔中增殖，培養(yǎng)基中補(bǔ)加有胎牛血清(FBS)、植物凝集素(PHA)、重組白細(xì)胞介素-2(rIL-2)和T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(TCGF)。每一孔中也含有從10個(gè)個(gè)體的PBMC合并物制備并用5000cGyγ射線照射的105個(gè)異體刺激細(xì)胞。
將每一未處理的對(duì)照樣品的白細(xì)胞以兩個(gè)獨(dú)立的系列稀釋。在每孔中加入含有一個(gè)系列的105、104、103、102、101和100個(gè)細(xì)胞或第二系列的300、100、33、11和4個(gè)細(xì)胞的100μL等份。每一稀釋度以10個(gè)重復(fù)樣本加入板中。培養(yǎng)含有1.1×107個(gè)總白細(xì)胞的光化學(xué)處理的樣品的11mL等份，來(lái)檢測(cè)活T細(xì)胞。將該樣品的100μL等份不稀釋地加入110孔中。
將微量滴定板在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育3周。溫育0.5、1及2周后，對(duì)每孔飼以TCGF、FBS、rIL-2和PHA。在3周溫育期的最后，就T細(xì)胞克隆的存在對(duì)每孔評(píng)分。將含有一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞克隆的孔評(píng)分為陽(yáng)性。不含T細(xì)胞克隆的孔被評(píng)分為陰性。用基于泊松分布的最小卡方分析計(jì)算每一樣品的T細(xì)胞頻率。用下列公式計(jì)算T細(xì)胞減少系數(shù)T細(xì)胞減少系數(shù)＝f對(duì)照/f處理，其中f對(duì)照和f處理分別為對(duì)照和經(jīng)處理的樣品的T細(xì)胞頻率。
對(duì)照等份或者不處理或者只用UVA或只用S-59處理。一個(gè)等份以2500cGy臨床劑量的γ射線照射。向其余等份中加入S-59至終濃度為10-4μM-150μM。然后以10-3-100焦耳/cm2的UV光劑量照射。ii)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)試驗(yàn)該試驗(yàn)也被稱為MLC試驗(yàn)，按照Kraemer，K.H.等人，皮膚病學(xué)研究雜志77235-239，1981和Kraemer，K.H.等人，皮膚病學(xué)研究雜志7680-87，1981的方法進(jìn)行。至于該試驗(yàn)的基本原理和控制，參見(jiàn)《基礎(chǔ)與臨床免疫學(xué)》，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(編)，Appleton & Lange，Norwalk，CT，1994，246-247頁(yè)。它間接測(cè)定異體刺激誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞中DNA合成。當(dāng)在組織培養(yǎng)中合并兩種HLA-不同的個(gè)體的淋巴細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膨大、合成DNA并增殖，而HLA-相同的細(xì)胞仍然靜止。根據(jù)3H-胸苷向增殖細(xì)胞內(nèi)核酸的摻入測(cè)定誘導(dǎo)的DNA合成。然后收獲細(xì)胞，洗去未結(jié)合的放射性，并在β計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)內(nèi)化的放射性。
在單路MLR中測(cè)定白細(xì)胞的效應(yīng)物及刺激物功能。包括標(biāo)準(zhǔn)、適當(dāng)?shù)年?yáng)性和陰性對(duì)照。通過(guò)將效應(yīng)細(xì)胞與致死性γ-照射的合并人白細(xì)胞(刺激細(xì)胞)一起溫育來(lái)測(cè)定效應(yīng)功能。在致死性γ-照射以阻斷胸苷攝取后，通過(guò)與正常合并的人白細(xì)胞一起溫育來(lái)測(cè)定被處理白細(xì)胞(用PCT或其它烷化劑化合物處理)的刺激功能。將獲得的隨處理劑量而變的結(jié)果與雙道MLR相比較。
盡管MLR將提供LDA所提供的信息的一部分，但它能夠提供關(guān)于被處理白細(xì)胞刺激其它細(xì)胞的能力的信息。MLR中被處理白細(xì)胞的刺激能作為一種抗白血病免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的模型，其在BMT轉(zhuǎn)輸患者中被DLI激活。該情況中，抗白血病的免疫應(yīng)答(GVL效應(yīng))可被BMT中存在的宿主或供體細(xì)胞起動(dòng)。B.受處理白細(xì)胞的表型特征i)表面抗原性標(biāo)記表達(dá)利用合適的熒光標(biāo)記抗體(Pharmingen)和標(biāo)準(zhǔn)FACS-SCAN分析測(cè)定PCT或烷化劑處理對(duì)表面抗原性標(biāo)記表達(dá)的影響。如Coligan，J.E.等人，《免疫學(xué)通用方案通用方案》，紐約，John Wiley & Sons，Inc.，1991中所述，利用合適的熒光標(biāo)記抗體(Pharmingen)和標(biāo)準(zhǔn)FACS-SCAN分析，作為處理劑量的函數(shù)測(cè)定抗原性標(biāo)記CD2、CD28、CTLA4、CD40配體(gp39)、CD18、CD25、CD69和CD16/CD56的存在，已知這些標(biāo)記參與與T細(xì)胞和NK細(xì)胞激活及免疫功能相關(guān)的相互作用。假如對(duì)蛋白質(zhì)的PCT及相關(guān)處理性質(zhì)溫和，則在處理?xiàng)l件下表面分子的穩(wěn)定性預(yù)計(jì)不受影響；然而，其表達(dá)的誘導(dǎo)預(yù)計(jì)是劑量依賴的。
關(guān)于被處理的人淋巴細(xì)胞在增殖、表面標(biāo)記表達(dá)、細(xì)胞因子合成和細(xì)胞毒性方面的表征，見(jiàn)實(shí)施例14。ii)白血病細(xì)胞系裂解為了測(cè)定受處理細(xì)胞誘導(dǎo)的直接GVL效應(yīng)，研究對(duì)一系列人及小鼠白血病細(xì)胞系(可從ATCC獲得)的溶細(xì)胞能力。按照J(rèn)iang，Y.Z.等人，骨髓移植8233-238，1991的條件進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如Coligan，J.E.等人，《免疫學(xué)通用方案通用方案》，紐約，John Wiley & Sons，Inc.，1991所述，在標(biāo)準(zhǔn)條件下用51Cr標(biāo)記白血病細(xì)胞。根據(jù)上清液中51Cr放射性的釋放測(cè)定達(dá)到的所有裂解，并與作為背景和總裂解的對(duì)照相比較。監(jiān)測(cè)處理劑量對(duì)受處理T細(xì)胞的溶細(xì)胞能力的影響。通過(guò)加入漸增數(shù)量的經(jīng)處理的白細(xì)胞并觀察是否發(fā)生裂解來(lái)進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。能用T細(xì)胞亞群重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。盡管白血病系的直接裂解提供了GVL效應(yīng)的一種直接機(jī)制，但其缺乏可能意味著DLI誘導(dǎo)GVL效應(yīng)的一種間接機(jī)制。因此，另外，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞因子產(chǎn)生如IFN-γ、IL-2或GM-CSF的產(chǎn)生能測(cè)定細(xì)胞毒性。iii)體內(nèi)細(xì)胞生存力為了估計(jì)體內(nèi)經(jīng)處理的細(xì)胞的生存力，在不同劑量的處理后，將雄性小鼠的白細(xì)胞輸入雌性同源或異源受體中。利用對(duì)脾細(xì)胞轉(zhuǎn)輸后希望的時(shí)點(diǎn)采取的血液樣品所進(jìn)行的PCR方法(Goodarzi，M.O.等人，輸血35145-149，1995)，監(jiān)測(cè)循環(huán)中經(jīng)處理的細(xì)胞的存在。該方法檢測(cè)只存在于雄性(供體)細(xì)胞中的Y-染色體特異性基因序列的存在，具有每50μL宿主血液1-5個(gè)細(xì)胞的敏感度。該實(shí)驗(yàn)將測(cè)定對(duì)活動(dòng)物中輸入細(xì)胞的清除的影響，以及處理劑量與體內(nèi)細(xì)胞循環(huán)之間的關(guān)系。如Johnson等人，斯堪的納維亞免疫學(xué)雜志(Scand.J.Immunol.)45511-514，1997所述，通過(guò)在輸注之前對(duì)白細(xì)胞的PKH-26標(biāo)記也能檢測(cè)體內(nèi)經(jīng)處理的白細(xì)胞的生存力。C.細(xì)胞因子合成的定量及定性表征利用可商業(yè)獲得的Elisa試劑盒(R&D Systems)，在效應(yīng)細(xì)胞與刺激細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)之后對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行定量及定性細(xì)胞因子測(cè)定。按照Elisa廠商提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)。將對(duì)每一樣品的吸光度測(cè)定與每一測(cè)定試劑盒提供的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，估計(jì)結(jié)果。作為化合物濃度的函數(shù)和—在PCT的情況下—光劑量及處理與測(cè)定之間的時(shí)間間隔的函數(shù)對(duì)處理的白細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子測(cè)定。由于在T細(xì)胞激活和GVHD/GVL中的明確作用而測(cè)定IL-1、 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ細(xì)胞因子。
對(duì)待處理的白細(xì)胞細(xì)胞因子合成的確定在測(cè)定細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞因子產(chǎn)生作為免疫應(yīng)答誘導(dǎo)物起作用的能力中是重要的；它也可用作對(duì)生化功能和蛋白質(zhì)合成的測(cè)定。
關(guān)于被處理的人淋巴細(xì)胞在增殖、表面標(biāo)記表達(dá)、細(xì)胞因子合成和細(xì)胞毒性方面的表征，見(jiàn)實(shí)施例14。D.體內(nèi)鼠模型對(duì)于證明GVHD抑制和GVL效應(yīng)誘導(dǎo)的應(yīng)用對(duì)于研究移植物抗宿主疾病和移植物抗白血病效應(yīng)，小鼠是非常完善的模型。為了分別估計(jì)經(jīng)處理的白細(xì)胞對(duì)GVHD和GVL的影響，使用在Johnson，B.D.等人，骨髓移植11329-336，1993和Johnson，B.D.等人，血液853302-3312，1995中所述的移植鼠模型。該模型中，亞致死地照射(9Gy)雌性AKR/J小鼠(H-2k)，然后給予MHC-匹配雌性B10.BR供體(H-2k)的107個(gè)BM細(xì)胞加3×107個(gè)脾細(xì)胞。這種處理顯示引起急性GVHD臨床癥狀并在50天內(nèi)死亡。輸入的脾細(xì)胞的消除導(dǎo)致混合嵌合體的完全存活，而未BMT導(dǎo)致50％的死亡率。本實(shí)施例中，在轉(zhuǎn)輸之前對(duì)鼠脾細(xì)胞進(jìn)行處理，以根據(jù)死亡率測(cè)定檢測(cè)處理對(duì)GVHD的抑制，并且也提供抑制GVHD發(fā)病的最低劑量。脾細(xì)胞是小鼠血液白細(xì)胞的公認(rèn)替代品，因?yàn)樾∈蟮难喝莘e對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)而言太小。
為了評(píng)估處理細(xì)胞的GVL反應(yīng)性，BMT 21天后，向受體輸入例如PA異體脾細(xì)胞，然后在7天后用AKR白血病細(xì)胞攻擊。據(jù)所知，BMT恢復(fù)后(28天)5×104AKR白血病細(xì)胞向小鼠的輸入引起白血病和白血病攻擊25天后95％的死亡率(Johnson，B.D.等人，移植54104-112，1992)。相反，BMT 21天后異體脾細(xì)胞的輸入顯示，在7天后用AKR細(xì)胞攻擊后可誘導(dǎo)GVL效應(yīng)。該作用過(guò)程導(dǎo)致70天后70％的存活率。如果證明有GVHD的預(yù)防，則轉(zhuǎn)輸前脾細(xì)胞的處理使得在無(wú)GVHD時(shí)能檢測(cè)到GVL的誘導(dǎo)。其測(cè)定是根據(jù)輸入經(jīng)處理的脾細(xì)胞的BMT受體的存活率，該受體用AKR細(xì)胞攻擊。
作為處理劑量的函數(shù)檢測(cè)使用待處理的白細(xì)胞的DLI對(duì)白血病攻擊存活率的影響，并與進(jìn)行未處理脾細(xì)胞輸注的對(duì)照組相比較。利用如Johnson，B.D.等人，骨髓移植11329-336，1993所述的PCR測(cè)定法，檢測(cè)存活小鼠的嵌合狀態(tài)和白血病荷載。
該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，通過(guò)死亡前對(duì)血液的白細(xì)胞計(jì)數(shù)或PCR分析能診斷白血病的死因，因?yàn)榘籽】梢餉KR白血病細(xì)胞的擴(kuò)展。對(duì)AKR白血病細(xì)胞特異性標(biāo)記特異的引物可用于PCR分析。根據(jù)低白細(xì)胞計(jì)數(shù)和脾萎縮以及通過(guò)特有的臨床癥狀(毛皮和姿勢(shì)的改變、粘性糞便等)診斷GVHD引起的死亡。通過(guò)注射更少或更大量的AKR白血病細(xì)胞檢測(cè)PA-DLI對(duì)最小殘余疾病或更高腫瘤荷載的效能。
根據(jù)本發(fā)明例如通過(guò)PCT法對(duì)白細(xì)胞的處理，如果在不引起GVHD的條件下，在施以白血病攻擊后能誘導(dǎo)用處理細(xì)胞DLI處理的小鼠存活率統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的提高，則認(rèn)為這對(duì)誘導(dǎo)GVL效應(yīng)是有效的。存活動(dòng)物的遺傳型應(yīng)該也是完全嵌合的，因?yàn)樵谌祟愔羞@與無(wú)病長(zhǎng)期存活的更高發(fā)病率有關(guān)。在最初BMT后100天內(nèi)，存活率的提高易于證明。
將在上述對(duì)于供體白細(xì)胞的條件下處理脾細(xì)胞。
關(guān)于鼠模型系統(tǒng)中在無(wú)GVHD時(shí)引起的經(jīng)處理的白細(xì)胞GVL效應(yīng)的情況，見(jiàn)實(shí)施例15。
實(shí)施例7-12
下列具體實(shí)施例是為了說(shuō)明在本發(fā)明方法中有用的代表性烷化劑化合物的制備方法，提供關(guān)于對(duì)專業(yè)人員有用的化合物的有關(guān)資料，并且說(shuō)明測(cè)定化合物有效性的方法。除非另外提出，在CDCl3中Varian 200MHz儀器上記錄所有NMR譜；報(bào)告相對(duì)于四甲硅烷(TMS)的化學(xué)位移。用Perkin Elmer FTIR記錄IR譜。用5mM含水H3PO4作為A流動(dòng)相A，用5mM CH3CN作為流動(dòng)相B，用YMC C8柱以梯度模式進(jìn)行HPLC。在DMSO或乙醇中制備樣品，并在注射前保持于≤15℃。
表2顯示用于不同化合物的化合物號(hào)的名稱。
表2
實(shí)施例7N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(化合物IV)的合成步驟A.N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯在N2下于-15℃，向干THF中的N-(叔丁氧羰基)-β-丙氨酸(20.3g，107mmol)和4-甲基嗎啉(13.0mL，12.0g，119mmol)的攪拌溶液(200mL)中加入氯甲酸異丁基酯(13.9mL，14.6g，107mmol)，導(dǎo)致白色沉淀(4-甲基嗎啉·HCl)的立即形成。在-15℃下攪拌反應(yīng)混合物5分鐘，隨后將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到燒瓶中，該燒瓶中含有-15℃下干THF中的三乙醇胺(48.3g，324mmol)的攪拌溶液(150mL)。將反應(yīng)混合物加溫到23℃，并攪拌另外1.5小時(shí)，隨后通過(guò)真空抽濾去除沉淀。然后在真空中從濾液中去除THF，在水(500mL)與EtOAc(5×150mL)之間分配剩余的粘性黃色油。在Na2SO4上干燥合并的有機(jī)層。真空中溶劑的去除產(chǎn)生25.8g(75％)的希望產(chǎn)物N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯，為一種暗黃色的油。1H NMRδ5.32(brs，1H)，4.18(t，J＝5.4Hz，2H)，3.58(t，J＝5.1Hz，4H)，3.37-3.23(m，2H)，2.80(t，J＝5.4Hz，2H)，2.69(t，J＝5.1Hz，4H)，2.51(t，J＝6.0Hz，2H)，1.41(s，9H)未發(fā)現(xiàn)羥基質(zhì)子。13CNMRδ173.0，156.4，79.8，63.3，60.2，57.3，54.1，36.7，35.3，28.8.步驟B.N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-叔-丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯在N2下將由步驟A獲得的N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯(22.7g，70.9mmol)與咪唑(11.1g，163mmol)的乙腈攪拌溶液(70mL)冷卻至0℃。然后加入叔丁基二甲基氯硅烷(534mg，3.54mmol)，并在0℃下將反應(yīng)混合物攪拌另外5分鐘。將反應(yīng)混合物加溫到23℃，攪拌2小時(shí)，隨后通過(guò)真空抽濾除去產(chǎn)生的白色沉淀(咪唑·HCl)。在真空中從濾液中除去乙腈，在飽和鹽水(600mL)與EtOAc(3×200mL)之間分配剩余的物質(zhì)。在Na2SO4上干燥合并的有機(jī)層。真空中溶劑的去除產(chǎn)生35.2g(90％)的希望產(chǎn)物N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯，為一種黃色的油。1HNMRδ5.29(brs，1H)，4.14(t，J＝6.0Hz，2H)，3.65(t，J＝6.3Hz，4H)，3.37(表觀q，2H)，2.85(t，J＝6.0Hz，2H)，2.71(t，J＝6.3Hz，4H)，2.49(t，J＝5.9Hz，2 H)，1.42(s，9H)，0.88(s，18H)，0.03(s，12H)；13C NMRδ172.7，156.3，79.7，63.3，62.4，57.7，54.3，36.7，35.3，28.9，26.4，18.7，-4.9.步驟C.β-丙氨酸2-[雙(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯向含有從步驟B獲得的N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯(3.01g，5.48mmol)的燒瓶中，加入純?nèi)宜?5mL)，導(dǎo)致CO2氣體的放出。攪拌反應(yīng)混合物5分鐘，在真空中去除三氟乙酸。在飽和NaHCO3(100mL)與EtOAc(3×30mL)之間分配剩余的物質(zhì)。在Na2SO4上干燥合并的有機(jī)層。真空中溶劑的去除產(chǎn)生2.45g(100％)的希望產(chǎn)物β-丙氨酸2-[雙(2-叔-丁二甲基甲硅烷氧乙基)氨基]乙酯，為一種暗黃色的油。1H NMRδ4.12(t，J＝6.0Hz，2H)，3.63(t，J＝6.4Hz，4H)，2.96(t，J＝6.2Hz，2H)，2.84(t，J＝6.0Hz，2H)，2.69(t，J＝6.4Hz，4H)，2.44(t，J＝6.2Hz，2H)，0.86(s，18H)，0.03(s，12H)未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。13C NMR(CDCl3)δ173.0，63.4，62.6，57.9，54.4，38.4，38.1，26.4，18.7，-4.9.步驟D.N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯通過(guò)室溫下在10mL CHCl3中攪拌12.5小時(shí)，使β-丙氨酸2-[雙(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯(736mg，1.64mmol)與9-甲氧基吖啶-2-羧酸甲酯(669mg，2.50mmol)反應(yīng)。然后過(guò)濾掉沉淀(吖啶酮)，在飽和水性NaHCO3(100mL)與CHCl3(3×35mL)之間分配濾過(guò)液。在Na2SO4上干燥合并的有機(jī)層，并在真空中濃縮，產(chǎn)生1.61g粘性褐色的油。通過(guò)在N2下將粗中間物溶解于3.0mL THF中，并在冷卻至0℃后立即用HF/吡啶(1.0mL)處理，來(lái)進(jìn)行對(duì)產(chǎn)生的二醇的脫保護(hù)。攪拌1小時(shí)使溶液升溫至室溫。在真空中去除揮發(fā)物，在飽和水性NaHCO3(100mL)與CHCl3(3×35mL)之間分配殘余物。干燥合并的有機(jī)層，濃縮產(chǎn)生649mg黃褐色的固體。制備型TLC(C-18，CH3CN)得到20％產(chǎn)率的希望的二醇，N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯(根據(jù)HPLC，純度＞80％)；1H NMRδ8.82(s，1H)，8.21-7.94(m，2H)，7.94-7.72(m，2H)，7.59(表觀t，1H)，7.23(表觀t，1H)，4.30-4.18(m，2H)，4.18-4.05(m，2H)，3.89(s，3H)，3.69-3.50(m，4H)，2.92-2.73(m，4H)，2.73-2.55(m，4H)步驟E.N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯向二氯化合物的轉(zhuǎn)化，是通過(guò)類似于Peck等人(美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)1959，813984)的方法實(shí)現(xiàn)的。將溶于純SOCl2(6mL)中從步驟D獲得的產(chǎn)物(41mg，0.090mmol)的黃色溶液在室溫下攪拌20小時(shí)。然后在真空中除去SOCl2得到一種黃色固體(二鹽酸鹽)。然后在飽和NaHCO3(50mL)與CH2Cl2(3×20mL)之間分配該物質(zhì)。在Na2SO4上干燥合并的有機(jī)層。在真空中溶劑的去除產(chǎn)生35.4mg游離堿的二氯化合物，為一種橙色的膠。1H NMRδ8.82(s，1H)，8.20-7.83(m，4H)，7.5(表觀t，1H)，7.25(表觀t，1H)，4.36-4.15(m，4H)，3.93(s，3H)，3.48(t，J＝6.9Hz，4H)，3.06-2.77(m，4H)，2.86(t，J＝6.9Hz，4H)未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。13CNMRδ172.3，166.6，155.2，146.5，144.6，133.1，131.6，128.7，124.6，124.3，116.1，114.3，63.7，57.2，53.5，52.9，46.3，42.5，35.2.
未發(fā)現(xiàn)其它的碳。通過(guò)加入1M醚中的HCl從CH2Cl2中沉淀HCl鹽，得到N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(化合物IV)，為一種黃色的固體(根據(jù)HPLC純度為81％)。
以相似的方法制備N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(化合物V)。在步驟D中用9-甲氧基吖啶代替9-甲氧基吖啶-2-羧酸甲酯，獲得為一種黃色油的中間體二醇(7.1％)(根據(jù)HPLC純度為74％)。1H NMRδ8.14(d，J＝7.5Hz，2H)，7.93(d，J＝8.6Hz，2H)，7.52(表觀t，2H)，7.23(表觀t，2H)，4.36-4.08(m，4H)，3.76-3.5(m，4H)，3.08-2.60(m，8H)未發(fā)現(xiàn)胺及羥基質(zhì)子。
將中間體二醇(37.3mg，0.0793mmol)的亞硫酰氯溶液(4.0mL)在23℃下攪拌7.5小時(shí)。在真空中去除亞硫酰氯，得到一種黃色的油。將該物質(zhì)溶解于乙醇(～4mL)中，并在真空中除去溶劑。然后將該物質(zhì)溶解于CH2Cl2(4mL)中并在真空中除去溶劑；該步驟重復(fù)兩次。然后用己烷(3×4mL)研磨該物質(zhì)，得到40.0mg為黃色吸水性玻璃狀固體形式的產(chǎn)物(根據(jù)HPLC純度為42％)。通過(guò)在飽和NaHCO3與CH2Cl2之間分配，隨后在Na2SO4上干燥合并的有機(jī)層，并在真空中除去溶劑，將有些物質(zhì)轉(zhuǎn)化為游離胺用于分析目的。1H NMRδ8.21-8.00(m，4H)，7.66(表觀t，2H)，7.38(表觀t，2H)，4.26-4.12(m，2H)，4.12-3.98(m，2H)，3.43(t，J＝6.9Hz，4H)，2.96-2.68(m，8H)未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。
按上述方法，但用N-(叔丁氧羰基)-4-氨基丁酸代替N-(叔丁氧羰基)-β-丙氨酸，制備N-[(2-甲酯基吖啶-9-基)] 4-氨基丁酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(化合物VI)(根據(jù)HPLC純度為78％)。1H NMRδ8.89(s，1)，8.12(表觀t，2)，7.93-7.80(m，2)，7.59(表觀q，1)，7.36-7.20(m，1)，4.16(t，2，J＝5.7Hz)，4.07-3.92(m，2)，3.97(s，3)，3.46(t，4，J＝6.9Hz)，2.93-2.80(m，6)，2.60(t，2，J＝6.5Hz)，2.29-2.12(m，2)未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。
實(shí)施例8用3-[N，N-雙(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)]氨基丙醇代替實(shí)施例7步驟A中的三乙醇胺，然后從步驟C繼續(xù)，制備N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸3-[雙(2-氯乙基)氨基]丙酯二鹽酸鹽(化合物VIII)(根據(jù)HPLC純度為63％)。1H NMRδ8.91(s，1)，8.20-7.93(m，4)，7.18(表現(xiàn)t，1)，7.39(表觀t，1)，4.30(m，4)，3.96(s，3)，3.48(t，4，J＝6.9Hz)，2.88-2.60(m，2)，2.83(t，4，J＝6.9Hz)，2.62(t，2，J＝6.7Hz)，1.85-1.68(m，2)未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。
實(shí)施例9在實(shí)施例7中合成的化合物也能用下列方法制備N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(化合物V)的合成方法II步驟A.N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯二鹽酸鹽合并9-氯吖啶(11.7g，《有機(jī)合成》(Organic Synthesis)，Coll.第三卷，第57頁(yè))、β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(9.9g)和甲醇鈉(3.26g)，加入60mL甲醇。用磁力攪拌器攪拌該混合物，并回流5.5小時(shí)。消除熱度，并在尚溫時(shí)(≤35℃)過(guò)濾懸液。用大約10mL另外的甲醇漂洗固體鹽，濃縮合并的深綠色濾液，產(chǎn)生21g潮濕的黃綠色固體。
將該固體溶解于350mL煮沸的2-丙醇中，使之在室溫下結(jié)晶。用大約15mL 2-丙醇和15mL己烷漂洗產(chǎn)生的結(jié)晶，然后風(fēng)干，產(chǎn)生15.5g亮黃色產(chǎn)物N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(產(chǎn)量為78.5％)。
1H NMRδ1.9(brs，2H)；3.24(t，J＝7.0Hz，2H)；3.76(s，3H)；4.45(brs，2H)；7.23(app.t，J＝8Hz，2H)；7.49(app.t，J＝8Hz，2H)；8.11(d，J＝8.4Hz，2H)；8.30(d，J＝8.4Hz，2H)；9.68(brs，0.5H).IR1574(s)，1691(s)，1726(s)，2336(m)，2361(m)，3227(m).步驟B.N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽在甲苯(750mL)、飽和水性Na2CO3(200mL)與H2O(50mL)之間分配由步驟A獲得的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽。用甲苯(3×250mL)再次萃取水層，合并有機(jī)層并用飽和水性Na2CO3(50mL)洗滌。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使甲苯的體積降至大約100mL。然后加入三乙醇胺(30mL)形成一種部分不能混合的系統(tǒng)。然后加入NaOMe(50mg)的MeOH溶液(2mL)。通過(guò)室溫?cái)嚢杓靶D(zhuǎn)蒸發(fā)從反應(yīng)混合液中快速除去溶劑。除去溶劑后，將反應(yīng)混合液真空下另外放置1-1.5小時(shí)，產(chǎn)生糖漿狀溶液。
在CH2Cl2(200mL)與鹽水(200mL)之間分配粗混合物，除去過(guò)量的三乙醇胺。用CH2Cl2(5×100mL)抽提鹽水層。合并有機(jī)層，用鹽水(50mL)洗滌，然后用0.5M HCl(2×100mL)抽提。合并酸性水層并用CH2Cl2(50mL)洗滌。在CH2Cl2(200mL)存在下用粉末K2CO3使酸溶液變?yōu)閴A性。分離有機(jī)層，用CH2Cl2(5×100mL)再次抽提水層。用鹽水(50mL)洗滌合并的有機(jī)層，用無(wú)水Na2SO4干燥，并解吸得到不含二醇的粗胺(5.02g)，一種黃色粘膠。根據(jù)NMR，該物質(zhì)與實(shí)施例1中用備擇方法制備的物質(zhì)相同。
將上述粗制品的一部分(0.400g)與異丙醇(100mL)劇烈攪拌，并用1MHCl乙醚溶液酸化。冷卻漿液，棄去首批沉淀。除去一半溶劑后，第二組結(jié)晶產(chǎn)生N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽，為一種明黃色的晶態(tài)固體(0.200g)，根據(jù)HPLC純度＞95％。
1H NMRδ8.11(表觀t，4H)，7.69(表觀t，2H)，7.41(表觀t，2H)，4.23(t，J＝5.4Hz，2H)，4.03(t，J＝5.9Hz，2H)，3.58(t，J＝5.2Hz，4H)，2.73(t，J＝5.4Hz，2H)，2.70(t，J＝5.9Hz，2H)2.68(t，J＝5.2Hz，4H).未發(fā)現(xiàn)胺及羥基質(zhì)子。
13C NMRδ173.3，151.7，149.4，130.5，129.5，124.0，123.4，118.4，63.5，60.1，57.3，54.0，46.6，35.8.步驟C.N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽向步驟B獲得的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(113mg，0.24mmol)的CH3CN溶液(0.5ml)中(攪拌懸液)加入SOCl2(0.5mL)。在23℃下攪拌得到的黃色溶液16小時(shí)，隨后在真空中去除揮發(fā)物。剩余的橙色油溶解于EtOH(～2mL)中，在真空中除去EtOH，得到一種黃色固體。然后用己烷(2×3mL)研磨該物質(zhì)。在真空中去除殘余溶劑，得到123mg希望的物質(zhì)N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(根據(jù)HPLC，純度為93％)，為一種黃色固體。1H NMRδ8.09(表觀t，J＝8.8Hz，4H)，7.66(表觀t，J＝7.6Hz，2H)，7.38(表觀t，J＝7.7Hz，2H)，4.14(t，J＝5.9Hz，2H)，4.00(t，J＝5.8Hz，2H)，3.43(t，J＝6.9Hz，4H)，2.87(t，J＝6.9Hz，4H)，2.77(t，J＝5.9Hz，2H)，2.69(t，J＝5.8Hz，2H).未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。13C NMRδ173.0，151.5，149.4，130.5，129.6，124.1，123.4，118.6，63.5，57.3，53.5，46.7，42.5，35.7.IR(HCl鹽的KBr沉淀)3423，3236，2939，2879，1736，1634，1586，1572，1540，1473，1272，1173cm-1.
實(shí)施例10N-(4-甲氧基-吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽，化合物IX。
N-(4-甲氧基-吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯的制備方法是將1.4g(5.84mmol)4，9-二甲氧基吖啶、0.89g(6.42mmol)β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和20mL甲醇混合，然后加熱，在N2下回流12小時(shí)。然后在真空中濃縮該反應(yīng)物，溶解于CHCl3-異丙醇中(50mL，4∶1v/v)，并用50％NH4OH(2×25mL)和鹽水(1×25mL)洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，在真空中濃縮產(chǎn)生1.24g(68％)甲酯(根據(jù)HPLC，純度＞74％)，為黃色的油；Rf(SiO2，乙酸乙酯)＝0.25；IR(薄膜)3363，2947，1730，1611，1573，1518，1484，1463，1423，1420，1246，1170，1081cm-1；1H NMRδ2.70(t，2H，J＝5.7Hz)，3.74(s，3H)，4.00(t，2H，J＝6.3Hz)，4.11(s，3H)，6.98(d，1H，J＝7.4Hz)，7.36(m，2H)，7.65(m，2H)，8.12(d，2H，J＝8.5Hz)；13C NMR)δ35.7，46.9，52.3，56.5，107.2，115.3，119.8，123.5，124.1，130.0，151.4，173.6.
在實(shí)施例3步驟B所述條件下將其轉(zhuǎn)化為二醇，產(chǎn)生647g黃色油。對(duì)粗混合物的HPLC分析顯示85％的產(chǎn)率(λ＝278nm)；Rf(SiO2，20％甲醇-乙酸乙酯)＝0.17；IR(薄膜)3337，2947，2828，1726，1616，1569，1522，1484，1463，1420，1348，1250，1174，1127，1081，1043cm-1；1H NMRδ2.7(m，8H)，3.55(m，4H)，3.97-4.08(m，2H)，4.08(s，3H)，4.19(t，2H，J＝5.5 Hz)，6.96(d，1H，J＝7.4Hz)，7.29(m，2H)，7.61(m，2H)，8.10(m，2H)；13C NMRδ36.0，46.9，53.7，56.4，57.1，60.1，63.3，107.4，115.7，119.1，119.6，123.2，123.5，123.9，128.5，130.0，140.8，147.4，151.6，151.7，154.3，173.3.
如實(shí)施例3步驟C所述，將其轉(zhuǎn)化為N-(4-甲氧基-吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽與亞硫酰氯。使用乙酸乙酯隨后用10％甲醇-乙酸乙酯對(duì)粗產(chǎn)物急速過(guò)濾(SiO2)，在有些產(chǎn)物的明顯柱上降解后得到58mg黃色油；Rf(SiOux，乙酸乙酯)＝0.26；IR(薄膜)3405，2955，2828，1726，1616，1577，1518，1463，1416，1348，1246，1174，1123，1081，1013cm-1；1H NMRδ2.69-2.99(m，8H)，3.45(t，4H，J＝6.7 Hz)，4.03(m，2H)，4.09(s，3H)，4.16(t，2H，J＝5.9Hz)，6.97(d，1H，J＝7.7Hz)，7.32(m，2H)，7.65(m，2H)，8.12(d，2H，J＝8.7Hz).
通過(guò)在真空中濃縮反應(yīng)液與共沸去除過(guò)量亞硫酰氯(2×5mL甲苯)，能以粗品形式分離二鹽酸鹽。HPLC分析表明原材料完全消耗而4-甲氧基吖啶(RT＝22.3分鐘)是主要的雜質(zhì)。1H NMR(CD3OD)δ3.18(t，2H，J＝6.4Hz)，3.71(m，6H)，4.04(m，4H)，4.18(s，3H)，4.51(m，2H)，7.17(m，2H)，7.56(m，2H)，7.91-8.15(m，2H)，8.55(d，1H，J＝8.8Hz).
同樣地從3-氯-9-甲氧基-4-甲基吖啶制備N-(3-氯-4-甲基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽，化合物X。游離堿的1HNMRδ7.96-8.17(m，3H)，7.29-7.52(m，3H)，4.19(t，J＝5.8Hz，2H)，4.00(s，3H)，3.89(t，J＝5.1Hz，2H)，3.47(t，J＝6.8Hz，4H)，2.91(t，J＝6.8Hz，4H)，2.83(t，J＝5.8Hz，2H)，2.67(t，J＝5.5Hz，2H).
同樣地從6-氯-2，9-二甲氧基吖啶制備N-(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽，化合物XIII。游離堿的1HNMRδ7.96-8.17(m，3H)，7.29-7.52(m，3H)，4.19(t，J＝5.8Hz，2H)，4.00(s，3H)，3.89(t，J＝5.1Hz，2H)，3.47(t，J＝6.8Hz，4H)，2.91(t，J＝6.8Hz，4H)，2.83(t，J＝5.8Hz，2H)，2.67(t，J＝5.5Hz，2H).
實(shí)施例11[N，N-雙(2-氯乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯二鹽酸鹽，化合物XI。步驟A.β-丙氨酸[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷基氧基)乙基]乙酯將β-丙氨酸乙酯鹽酸鹽(1.99g，12.9mmol)、K2CO3(6.0g，43.4mmol)和碘乙基三異丙甲硅烷基酯(9.47g，28.9mmol)的乙腈溶液(175mL)的漿液回流5-7天。溶劑真空蒸發(fā)后，用CH2Cl2研磨固體。用稀釋的Na2CO3(含水)然后用鹽水洗滌有機(jī)層，在無(wú)水Na2SO4上干燥。通過(guò)硅膠層析(1∶4 EtOAc/己烷)純化粗產(chǎn)物，得到5.60g油狀[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷氧基)乙基]β-丙氨酸乙酯(83.1％)。1H NMRδ4.12(q，J＝7.1Hz，2H)，3.73(t，J＝6.8Hz，4H)，2.92(t，J＝7.3Hz，2H)，2.70(t，J＝6.6Hz，4H)，2.46(t，J＝7.4Hz，2H)，1.4-0.9(m，45H，包括1.25(3H)時(shí)的三聯(lián)體和1.06及1.05時(shí)的單體)步驟B.[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷基氧基)乙基]-β-丙氨酸在乙醇中攪拌由上述步驟A獲得的β-丙氨酸[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷氧基)-乙基]乙酯(5.60g，10.8mmol)和氫氧化鋰(0.59g，14.1mmol)，并回流3小時(shí)。除去溶劑，在CH2Cl2與稀釋的NaHCO3(含水)之間分配粗產(chǎn)物。用鹽水洗滌有機(jī)層，在無(wú)水Na2SO4上干燥，解吸后得到[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷基氧基)乙基]-β-丙氨酸，為一種淡黃色的油(5.03g，95.1％產(chǎn)量)。1H NMRδ3.90(t，J＝5.5Hz，4H)，3.04(t，J＝6.2Hz，2H)，2.92(t，J＝5.5Hz，4H)，2.50(t，J＝6.1Hz，2H)，1.06(s，42H).步驟C.[N，N-雙(2-羥乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯于N2下在CH2Cl2(1mL)中攪拌由以上步驟B獲得的[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷氧基)乙基]-β-丙氨酸(51.0mg，0.104mmol)。在冰浴上冷卻時(shí)，逐滴加入SOCl2(0.5mL)，并攪拌反應(yīng)液2.25小時(shí)。解吸反應(yīng)混合液除去過(guò)量SOCl2后，加入干燥的CH2Cl2(0.5mL)，并于N2下在冰浴中冷卻該溶液。加入預(yù)冷的9-(3-羥基)丙胺基-6-氯-2-甲氧基-吖啶(29.0mg，91.5mmol)CH2Cl2漿液(1mL)。0.5小時(shí)后，在CH2Cl2與含水NaHCO3之間分配該混合物。用鹽水洗滌有機(jī)層，以無(wú)水Na2SO4上干燥并解吸。用己烷研磨獲得的膠，解吸己烷提取物，獲得一種極粗的三異丙基甲硅烷基保護(hù)的原材料與產(chǎn)物的混合物(53.5mg)。
為了去除三異丙甲硅烷基，在冰冷的THF(1mL)中攪拌一部分保護(hù)的粗二醇(33.1mg)。加入HF/吡啶(0.5ml)后，在充滿N2的氣囊中在環(huán)境溫度下攪拌混合物2.5小時(shí)。在CH2Cl2與NaHCO3(含水)之間分配反應(yīng)混合物，用稀釋的NaHCO3(含水)洗滌有機(jī)層數(shù)次，除去過(guò)量的HF/吡啶。用鹽水初步干燥后用無(wú)水Na2SO4干燥，除去溶劑得到粗二醇(13.1mg)。
將其與另外的粗二醇(5.0mg)合并，通過(guò)以95CH2Cl2/5iPA/1 TFA作為洗脫液的C-18制備型TLC純化，獲得二醇TFA鹽。將鹽在CH2Cl2與NaHCO3(含水)之間分配后，用鹽水干燥有機(jī)層，然后用無(wú)水Na2SO4干燥，并解吸獲得二醇的游離堿，[N，N-雙(2-羥乙基)]β-丙氨酸、3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯(5.0mg)。1H NMRδ7.92-8.25(m，3H)，7.23-7.47(m，3H)，430(t，J＝5.7Hz，2H))，3.98(s，3H)，3.81(t，J＝6.2Hz，2H)，3.64(t，J＝4.9Hz，4H)，2.86(t，J＝6.1Hz，2H)，2.67(t，J＝4.9Hz，4H)，2.51(t，J＝5.9Hz，2H)，2.04(明顯的五聯(lián)體，2H)步驟D.[N，N-雙(2-氯乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯二鹽酸鹽，化合物質(zhì)XI將以上獲得的[N，N-雙(2-羥乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯(4.0mg，0.0073mmol)溶解于CH2Cl2(1mL)中，在冰/水浴中冷卻。加入冰冷的SOCl2(0.1mL)，將反應(yīng)液在室溫下攪拌4小時(shí)。解吸反應(yīng)混合液除去溶劑，用己烷研磨，并在CH2Cl2與NaHCO3(含水)之間分配。用鹽水干燥有機(jī)層，然后用無(wú)水Na2SO4干燥并解吸，獲得為一種黃色膠的二氯化合物。1H NMRδ7.8-8.2(m，3H)，7.2-7.5(m，3H)，4.35(t，J＝5.9Hz，2H)，3.85-4.10(3.99，s，OMe和3.9-4.0，m，NHCH2，總5H)，3.48(t，J＝6.9Hz，4H)，2.9-3.0(m，6H)，2.49(t，J＝6.6Hz，2H)，2.1-2.3(m，2H).
在預(yù)冷的CH2Cl2中攪拌游離胺，用1M HCl乙醚溶液酸化，并用少數(shù)幾滴甲醇解吸，獲得希望的化合物，[N，N-雙(2-氯乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯二鹽酸鹽(2.5mg)，(3.5mg，81％)，為一種黃色固體。
以與前述步驟C相同的方法，但使用6-氯-9-(2-羥基)乙胺基-2-甲氧基-吖啶代替6-氯-9-(3-羥基)丙胺基-2-甲氧基-吖啶，制備類似的二醇。1H NMRδ7.96-8.13(m，3H)，7.20-7.47(m，3H)，4.76(t，J＝4.9Hz，2H)，3.99(s，3H)，3.92-4.14(m，2H)，3.60(t，J＝5.1Hz，4H)，2.78(t，J＝6.1Hz，2H)，2.63(t，J＝5.1Hz，4H)，2.45(t，J＝6.0Hz，2H).
通過(guò)類似于步驟D的步驟，其轉(zhuǎn)化為[N，N-雙(2-氯乙基)]β-丙氨酸2-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]乙酯二鹽酸鹽，化合物XII。1H NMRδ7.94-8.20(m)，7.20-7.50(m)，4.42(CH2OC＝O)，3.90-4.10(OCH3，NHCH2)，3.46(CH2Cl)，2.82(N(CH2)3)，2.39-2.56(CH2C＝O).
實(shí)施例124，5’，8-三甲基-4’-補(bǔ)骨脂素乙酸酯鹽酸鹽，化合物XIV步驟A.4，5’，8-三甲基-4’-補(bǔ)骨脂素乙酸[N，N-雙(2-羥乙基)]-2-氨乙基酯在100℃下攪拌4，5’，8-三甲基-4’-補(bǔ)骨脂素乙酸甲酯(250mg，0.832mmol)、三乙醇胺(12mL)和1M乙醚中的HCl(2mL)2小時(shí)。使得到的澄清褐色溶液冷卻至室溫，并在CH2Cl2與飽和NaHCO3(含水)之間分配。用飽和NaHCO3(含水)漂洗有機(jī)層數(shù)次。用無(wú)水Na2SO4干燥后，在真空中去除溶劑，在CH2Cl2與1M含水HCl之間分配殘余物。用CH2Cl2漂洗水層數(shù)次，然后在有機(jī)溶劑存在下用K2CO3使之變?yōu)閴A性。用水漂洗含有中性產(chǎn)物的有機(jī)層數(shù)次，然后干燥并濃縮。酸堿抽提過(guò)程的重復(fù)可產(chǎn)生一種米黃色固體的希望產(chǎn)物(84.3mg，24.3％)1HNMRδ7.53(s，1H)，6.24(s，1H)，4.23(t，J＝5.4Hz，2H)，3.69(s，2H)，3.56(t，J＝5.3Hz，4H)，2.82(t，J＝5.4Hz，2H)，2.69(t，J＝5.3Hz，4H)，2.57(s，3H)，2.51(d，J＝1.1Hz，3H)，2.47(s，3H).步驟B.4，5’，8-三甲基-4’-補(bǔ)骨脂素乙酸[N，N-雙(2-氯乙基)]-2-氨乙基酯鹽酸鹽向冰冷的上述二醇(9.8mg，0.023mmol)CH2Cl2混合液(1mL)中加入亞硫酰氯(0.2mL)，并在氮下于室溫?cái)嚢柽^(guò)液。濃縮得到的漿液，然后用己烷研磨，得到為一種灰白色固體的希望產(chǎn)物(6.2mg，53.9％)1H NMR(CD3OD)δ7.71(s，1H)，6.28(s，1H)，4.56(t，J＝4.8Hz，2H)，3.95(t，J＝6.1Hz，4H)，3.89(s，2H)，3.60-3.83(m，6H)，2.54(s，3H)，2.53(s，3H)，2.50(s，3H).
實(shí)施例13典型BMT小量或微移植方案在用異體外周血干細(xì)胞移植之前給顯示CLL的患者施行一種非分離的預(yù)備方案。移植之后用DLI支持，這是達(dá)到最大移植物抗惡性腫瘤反應(yīng)所必需的。輕度毒性的預(yù)備方案是基于氟達(dá)拉濱(FAMP)的，并根據(jù)惡性腫瘤類型加以改進(jìn)。對(duì)于晚期的和以前處理的CLL，對(duì)患者施用300mg/m2/dx3的FAMP和30mg/m2/dx3的環(huán)磷酰胺。用由30mg/m2/dx3的FAMP、25mg/m2/d/CIx4的順鉑和0.5gm mg/m2/dx2的Ara-c組成的方案處理Richter和大細(xì)胞淋巴瘤(LCL)。除了對(duì)LCL處理外，不進(jìn)行GVHD預(yù)防。該方案是為了產(chǎn)生嵌合狀態(tài)，并使植入成為可能，而降低常規(guī)誘導(dǎo)治療的毒性。能在移植1個(gè)月后施以DLI來(lái)加強(qiáng)移植。成功的移植為以后施用的DLI作了準(zhǔn)備，對(duì)于增強(qiáng)移植物抗白血病反應(yīng)和加速免疫恢復(fù)是必要的。
實(shí)施例14應(yīng)用人外周血淋巴細(xì)胞的體外研究為了表征特定類型的被處理細(xì)胞群體，檢查了經(jīng)受PCT并在體外培養(yǎng)的人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的幾個(gè)特征。這些包括生存力、T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子合成及分泌、表面抗原表達(dá)、體外細(xì)胞毒性和Fas配體表達(dá)。生存力用臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)定在3J/cm2UVA下接受10nM S-59的PBL的生存力。2天后存活率為75％，3天后為50％，4天后為25％。在有關(guān)實(shí)驗(yàn)中，觀察到被處理淋巴細(xì)胞的依賴劑量的存活率。增殖根據(jù)3H-胸苷向異體刺激的T細(xì)胞DNA中的摻入來(lái)測(cè)定淋巴細(xì)胞的增殖。從三名供體中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，合并，γ-照射(2500cGy)，以防止自身刺激，并在MLR中用作刺激細(xì)胞。從第4名供體中分離的PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞在3J/cm2UVA下用0.05、0.5或5nM 4’-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(“S-59”)處理，并與刺激細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)。對(duì)照、未處理的效應(yīng)細(xì)胞也與刺激細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后，向培養(yǎng)液中加入3H-胸苷，一天后收獲細(xì)胞，通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)分析細(xì)胞樣品測(cè)定3H-胸苷的攝入。圖8顯示，根據(jù)MLR中的3H-胸苷攝入所測(cè)定的被處理白細(xì)胞的增殖，在0.1nM-10nMS-59之間以劑量依賴的方式被消除，10nM S-59時(shí)增殖被完全抑制。
也可用一種備擇方法分析被處理白細(xì)胞的增殖能力，該方法中用表面結(jié)合的抗-CD3抗體激活被處理細(xì)胞。在該試驗(yàn)中，PBMC或未被處理、或在3J/cm2UVA劑量下用0.0001、0.001或0.01μM S-59處理、或在無(wú)S-59時(shí)照射。然后在附著抗-CD3抗體的培養(yǎng)板中在5％CO2、37℃下溫育細(xì)胞，來(lái)誘導(dǎo)T細(xì)胞的多克隆激活，并在培養(yǎng)1、2及3天后測(cè)定3H-胸苷的摻入。結(jié)果(圖9)顯示在所有處理?xiàng)l件下增殖能力依賴劑量的降低，和10nM S-59時(shí)增殖的完全抑制。細(xì)胞因子產(chǎn)生如前對(duì)于增殖分析的部分中所述，在MLR中培養(yǎng)人淋巴細(xì)胞。在3.0J/cm2UVA下用不同濃度的S-59(0.05、0.5或5nM)處理效應(yīng)細(xì)胞。培養(yǎng)2、4、6及7天后采取MLR細(xì)胞培養(yǎng)基樣品。用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定這些樣品的IL-2和IFN-γ水平，并用分光光度法定量結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)溶液用于建立將濃度(pg/ml)與吸光度相關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由它來(lái)確定試驗(yàn)樣品中的細(xì)胞因子濃度。
圖10A顯示對(duì)IL-2產(chǎn)生的分析。未處理的淋巴細(xì)胞及用較低濃度S-59(即，0.005和0.5nM)處理的淋巴細(xì)胞的IL-2分泌在培養(yǎng)2天時(shí)達(dá)到最高，然后由于IL-2被群體中增殖淋巴細(xì)胞消耗而下降。相反，在用5nM S-59處理的淋巴細(xì)胞中，IL-2不被非增殖的淋巴細(xì)胞消耗，而在第4、6及7天時(shí)仍以相當(dāng)高的水平存在于培養(yǎng)基中。
刺激PBMC的IFN-γ產(chǎn)生不受S-59+UVA處理的影響或被略微提高。見(jiàn)圖10B。IL-2和IFN-γ的綜合結(jié)果顯示，在增殖被抑制的條件下，被處理細(xì)胞仍然能合成并分泌與T細(xì)胞激活有關(guān)的細(xì)胞因子。表面抗原表達(dá)分析了被處理淋巴細(xì)胞上表面標(biāo)記表達(dá)的分析。經(jīng)Ficoll梯度離心獲得淋巴細(xì)胞，并通過(guò)用表面結(jié)合的抗-CD3抗體體外刺激來(lái)激活。應(yīng)用CD69、CD25(IL-2受體)或CD40L的熒光抗體，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分類(FACS)分析測(cè)定被激活、處理的淋巴細(xì)胞的表面抗原表達(dá)。作為激活后時(shí)間的函數(shù)測(cè)定表達(dá)，并與未處理細(xì)胞的表達(dá)相對(duì)比。
CD69是淋巴細(xì)胞激活的一種早期標(biāo)記。圖11A顯示，用1nM或10nM S-59+3J/cm2UVA處理的細(xì)胞在處理后高達(dá)48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)具有類似于或略高于未處理細(xì)胞的表面CD69水平。因此，盡管被處理的細(xì)胞不能增殖，但與激活有關(guān)的信號(hào)傳遞途徑仍具功能性。
CD25是IL-2受體，略晚(激活后)于CD69檢測(cè)到其表達(dá)。圖11B顯示，與未處理的細(xì)胞相比，在用1nM或10nM S-59+3J/cm2UVA處理的細(xì)胞中，表面CD25基本上不受影響。
T細(xì)胞上的CD40配體(CD40L)識(shí)別B細(xì)胞表面上表達(dá)的CD40分子，作為T細(xì)胞激活過(guò)程的一部分。T細(xì)胞上CD40L表達(dá)的抑制能誘導(dǎo)細(xì)胞無(wú)應(yīng)答性或無(wú)反應(yīng)性。因此，處理后CD40L在T細(xì)胞上未受干擾的表達(dá)是正常T細(xì)胞激活的指征。用抗-CD3抗體使經(jīng)處理的細(xì)胞激活后檢查PCT對(duì)CD40L表達(dá)的影響(圖12)。該分析的結(jié)果表明，對(duì)于隨后增殖能力被消除的處理?xiàng)l件，被處理細(xì)胞的CD40L表達(dá)與在未處理細(xì)胞中觀察到的緊密平行。
總之，在增殖嚴(yán)重降低或完全抑制的條件下(見(jiàn)圖8及9，本實(shí)施例)，早期T細(xì)胞激活標(biāo)記CD69和IL-2受體CD25的表達(dá)仍基本上不受影響；而CD40L水平與未處理的細(xì)胞平行。應(yīng)當(dāng)指出，一旦經(jīng)抗原或促有絲分裂刺激，CD69即在淋巴細(xì)胞上短暫表達(dá)，CD69的繼續(xù)表達(dá)需要新的轉(zhuǎn)錄。因此，在經(jīng)處理的非增殖細(xì)胞中觀察到高CD69水平，這進(jìn)一步支持了處理不能不可逆地抑制基因表達(dá)這一見(jiàn)解。細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能通過(guò)在MLR中產(chǎn)生對(duì)γ照射滅活的同種異體“刺激”細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，來(lái)估計(jì)S-59+UVA處理對(duì)T細(xì)胞裂解功能的影響。然后測(cè)定這些細(xì)胞毒性T細(xì)胞裂解51Cr-標(biāo)記的靶細(xì)胞的能力，這些靶細(xì)胞從用來(lái)提供滅活的刺激細(xì)胞的相同供體中獲得。
細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生從兩種供體中取出外周血(100mL)，一種被稱為“刺激物”，另一種被稱為“效應(yīng)物”。經(jīng)Ficoll梯度離心從兩種群體中分離PBMC。通過(guò)將效應(yīng)PBMC以5×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度置于組織培養(yǎng)瓶中1小時(shí)，來(lái)耗貧效應(yīng)PBMC中的單核細(xì)胞。γ-照射(2500cGy)刺激PBMC阻斷細(xì)胞分裂。將單核細(xì)胞耗貧的效應(yīng)物與照射的刺激物分開(kāi)重懸浮于RPMI完全培養(yǎng)基中至1×106細(xì)胞/ml的濃度。然后合并等體積的效應(yīng)物與刺激細(xì)胞懸液用于MLR，并在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育7天。
靶細(xì)胞的制備從為MLR提供刺激細(xì)胞的相同供體中抽取外周血(50ml)。如上分離PBMC，以1×106細(xì)胞/ml的濃度重懸浮于RPMI培養(yǎng)基中，然后用2μg/ml PHA-M(植物凝集素-M)和10單位/ml的重組IL-2在37℃下刺激7天。
用51Cr對(duì)靶細(xì)胞的標(biāo)記在200μCi Na251CrO4存在下37℃溫育靶細(xì)胞2小時(shí)，然后洗滌三次除去未摻入的標(biāo)記物。
對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的光化學(xué)處理(PCT)將效應(yīng)細(xì)胞(如上所述單核細(xì)胞耗貧的)分為四個(gè)等份，將每一份重懸浮于30ml含1％牛血清白蛋白的PBS中。向三份中加入S-59至0.1、0.01或0.001μM的終濃度；其余等份用作未處理的對(duì)照。將含有S-59的樣品轉(zhuǎn)移至30ml 2410血袋中，在Baxter/Fenwall UVA照射裝置中用3J/cm2UVA照射每一樣品。
CTL測(cè)定如下測(cè)定被處理的效應(yīng)細(xì)胞群體的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性。重懸浮被處理的細(xì)胞(或?qū)φ瘴刺幚砑?xì)胞)至1ml終體積中5×106細(xì)胞/ml的終濃度，進(jìn)行連續(xù)兩倍稀釋獲得2.5×106、1.25×106和0.625×106細(xì)胞/ml的終濃度。向圓底96孔微量滴定板的三孔的每孔中加入重懸浮的經(jīng)處理的效應(yīng)細(xì)胞和每一經(jīng)處理的效應(yīng)細(xì)胞稀釋度(“效應(yīng)細(xì)胞”)的100μl樣品。然后向每孔效應(yīng)細(xì)胞中加入含有5×103個(gè)細(xì)胞的100μl標(biāo)記靶細(xì)胞樣品(如上所述制備)，產(chǎn)生100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1的效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比值，在37℃下溫育混合物4小時(shí)。溫育后，以250×g離心培養(yǎng)板5分鐘，從每孔中取出100μl上清液。在γ計(jì)數(shù)器上定量上清液中51Cr的量。對(duì)每組三個(gè)孔計(jì)算平均51Cr cpm和標(biāo)準(zhǔn)差。
對(duì)照稀釋未標(biāo)記的靶細(xì)胞，并以與效應(yīng)細(xì)胞相同的比例用標(biāo)記的靶細(xì)胞加板，來(lái)測(cè)定51Cr的自發(fā)釋放。標(biāo)記的靶細(xì)胞也與RPMI和1％Triton X-1000(每個(gè)3孔)一起溫育，來(lái)測(cè)定51Cr的最大釋放。對(duì)每組三個(gè)孔計(jì)算平均51Cr cpm和標(biāo)準(zhǔn)差。
結(jié)果圖13顯示對(duì)于經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的白細(xì)胞，在不同效應(yīng)物靶(或未標(biāo)記的靶標(biāo)記的靶)比值時(shí)的51Cr釋放。這些結(jié)果表明，用能阻斷增殖的S-59劑量和UVA處理的白細(xì)胞保留了溶細(xì)胞功能。因此，不能增殖的被處理白細(xì)胞不僅具有與未處理細(xì)胞相同的表型(如表面標(biāo)記和細(xì)胞因子表達(dá)所示)，而且具有相似的功能性質(zhì)。
總之，對(duì)被處理白細(xì)胞群體的增殖、表面標(biāo)記表達(dá)、細(xì)胞因子合成及CTL活性的分析顯示了被處理細(xì)胞的下列特性1.一旦經(jīng)處理，即可觀察到增殖能力的劑量依賴的抑制。
2.被處理細(xì)胞保留細(xì)胞因子合成、細(xì)胞表面抗原表達(dá)和體外細(xì)胞毒性。
因此，如此所述處理的白細(xì)胞群體及相當(dāng)?shù)募?xì)胞群體能有利于供體細(xì)胞(如造血細(xì)胞和造血干細(xì)胞)向非重度骨髓抑制的宿主中的植入?？蓪?shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的一種機(jī)制是通過(guò)經(jīng)處理的白細(xì)胞群體對(duì)供體特異耐受性的誘導(dǎo)。
實(shí)施例15鼠模型系統(tǒng)中被處理白細(xì)胞在無(wú)GVHD時(shí)GVL效應(yīng)的準(zhǔn)備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究S-59+UVA處理對(duì)MHC-錯(cuò)配的B6/AKR鼠模型系統(tǒng)中供體淋巴細(xì)胞GVL活性的影響。使供體脾細(xì)胞通過(guò)細(xì)孔濾網(wǎng)，獲得未分離的脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，然后用0.01μM S-59和不同劑量的UVA處理(0.5分鐘、1分鐘、2分鐘及8分鐘)。將1×107個(gè)處理的供體脾細(xì)胞與5×106個(gè)排除T細(xì)胞的骨髓細(xì)胞一起(C57BL/6、H-2b、Thy1.2+)注射入經(jīng)受1100R全身輻射的AKR、H-2k、Thy1.1+宿主中。移植3天后用250個(gè)AKR-M2白血病細(xì)胞攻擊每組小鼠(每組6只動(dòng)物)。觀察移植動(dòng)物的GVHD臨床癥狀、白血病復(fù)發(fā)及死亡。另外，移植后每3-4天記錄一次移植動(dòng)物的體重。
結(jié)果總結(jié)于表3和圖14及15中，表明能獲得UVA+S-59劑量的適當(dāng)范圍，其在MHC-錯(cuò)配移植中能有效地保留GVL活性而降低GVHD。例如，向排除T細(xì)胞的骨髓中加入未處理的或溫和處理的(0.5分鐘UVA+0.01μM S-59；照射劑量＝1.8 J-nM/cm2)淋巴細(xì)胞在移植受體中導(dǎo)致輕度到重度GVHD(根據(jù)這些組動(dòng)物中降低的體重而證明；圖14)。相反，用1分鐘UVA+0.01μM S-59(照射劑量＝3.7 J-nM/cm2)處理的淋巴細(xì)胞能有效地保留GVL活性(白血病攻擊70天后，3只中有3只存活者)而無(wú)GVHD癥狀。見(jiàn)表3及圖15。用1分鐘UVA+0.01μM S-59處理的動(dòng)物的體重(圖14)也表明無(wú)GVHD。如果用相同的S-59濃度及更高的UVA劑量(2及8分鐘UVA，分別相當(dāng)于7.5和30 J-nM/cm2的照射劑量)處理細(xì)胞，則供體淋巴細(xì)胞的GVL活性消除。在這些情況下，移植后20天內(nèi)3只小鼠中有3只死亡，見(jiàn)圖15。
表3施用PCT白細(xì)胞的B6/AKR嵌合體中的GVL活性
注意-所有組都在第1天照射并接受MHC-錯(cuò)配的骨髓移植，和第0天經(jīng)處理的脾細(xì)胞(如適用)。
-如果進(jìn)行白血病攻擊，則在第3天。
-MST＝存活時(shí)間的中值，單位為天。
-范圍＝死亡天數(shù)(移植后)(X＝存活)
從這些結(jié)果能得出結(jié)論，向排除T細(xì)胞的骨髓中加入用適量S-59+UVA處理的白細(xì)胞能在主要MHC-錯(cuò)配鼠模型系統(tǒng)中防止GVHD。此外，適當(dāng)處理的白細(xì)胞的加入有利于供體植入，并導(dǎo)致MHC-錯(cuò)配移植宿主中的穩(wěn)定嵌合狀態(tài)。最后，被處理白細(xì)胞的GVL活性保留。因此，用S-59+UVA對(duì)白細(xì)胞的處理是一種調(diào)節(jié)供體淋巴細(xì)胞的免疫學(xué)活性以支持同種異體移植的新方法。
實(shí)施例16S-303對(duì)人淋巴細(xì)胞增殖及T細(xì)胞功能的影響在MLR試驗(yàn)中對(duì)經(jīng)處理的異體刺激T細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。從為了防止自身刺激而以2500cGy劑量γ輻射的供體中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，用作刺激細(xì)胞。從不同供體分離的PBMC用作效應(yīng)細(xì)胞。用0.1、0.2、0.3、0.4或0.5μM的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯(S-303)在室溫下處理濃度為2×106細(xì)胞/ml的效應(yīng)細(xì)胞大約15分鐘，用含有1％牛血清白蛋白的PBS洗兩次。將S-303處理的及未處理的效應(yīng)細(xì)胞與γ-輻射的刺激細(xì)胞以1∶1的比例協(xié)同培養(yǎng)。
淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定方法包括，協(xié)同培養(yǎng)開(kāi)始6天后向協(xié)同培養(yǎng)物中加入3H-胸苷，于第7天收獲細(xì)胞，及測(cè)定細(xì)胞中3H cpm的摻入。對(duì)協(xié)同培養(yǎng)開(kāi)始24及48小時(shí)后采取的培養(yǎng)上清液進(jìn)行夾心ELISA，分析細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
對(duì)S-303處理細(xì)胞的增殖能力的分析(圖16)顯示，S-303處理的異體刺激效應(yīng)細(xì)胞中3H-胸苷的摻入，在用0.1μM S-303處理的細(xì)胞中降低，而在用濃度為0.2μM或更高的S-303處理的細(xì)胞中完全被阻斷。因此，在S-303處理的白細(xì)胞中觀察到淋巴細(xì)胞增殖的劑量依賴的抑制。
作為對(duì)S-303處理白細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的測(cè)定，估計(jì)γ干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)生。圖17顯示，在用0.1μM及0.2μM S-303處理的細(xì)胞中，IFN-γ分泌不受影響，其中增殖分別嚴(yán)重降低及完全抑制(見(jiàn)圖16)。用0.3μM S-303處理的細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞的增殖完全被抑制(圖16)，產(chǎn)生對(duì)照水平大約的28％的IFN-γ(圖17)。
總之，S-303預(yù)處理以劑量依賴的方式抑制異體刺激的人淋巴細(xì)胞的增殖，如在MLR中測(cè)定的。此外，在增殖被完全抑制的條件下(例如，用0.2μM S-303對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的處理)，IFN-γ的合成不受影響。因此，能獲得能產(chǎn)生在刺激后不能增殖但保留免疫學(xué)活性的淋巴細(xì)胞的S-303處理?xiàng)l件。
盡管為了理解的清晰性，以圖表和實(shí)施例的方式相當(dāng)詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，在不背離本發(fā)明的精神的情況下可進(jìn)行多種改變和修改。因此，不應(yīng)把上述描述和實(shí)施例看作限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種待用于向同種異體受體中引入的分離的細(xì)胞群體，該細(xì)胞群體中含有一種白細(xì)胞群體，其中該白細(xì)胞群體的一部分是不增殖的，使得該受體中移植物抗宿主疾病(GVHD)的誘導(dǎo)被抑制，并且其中該白細(xì)胞群體的一部分保留免疫學(xué)活性。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞群體，其中白細(xì)胞群體含有T細(xì)胞、NK細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的細(xì)胞群體，其中在適當(dāng)刺激后該白細(xì)胞群體的一部分即產(chǎn)生細(xì)胞因子。
4.權(quán)利要求3的細(xì)胞群體，其中細(xì)胞因子選自IL-1、IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10和GM-CSF。
5.權(quán)利要求1的細(xì)胞群體，其中該白細(xì)胞群體的一部分表達(dá)一種表面標(biāo)記，該表面標(biāo)記選自CD2、CD28、CTLA4、CD40配體(gp39)、CD18、CD25、CD69(淋巴細(xì)胞激活標(biāo)記)和CD16/CD56、MHC I類和II類、CD8、CD4、CD3/TcR(T細(xì)胞受體)、CD54(ICAM-1)、LFA-1和VLA-4。
6.權(quán)利要求1的細(xì)胞群體，其中該群體中超過(guò)90％的白細(xì)胞是不增殖的。
7.權(quán)利要求1的細(xì)胞群體，其中通過(guò)接觸抗原或促分裂原刺激白細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1的細(xì)胞群體，其中白細(xì)胞在促進(jìn)疾病細(xì)胞的破壞方面有效。
9.權(quán)利要求1的細(xì)胞群體，其中白細(xì)胞在促進(jìn)受感染細(xì)胞的破壞方面有效。
10.權(quán)利要求1的細(xì)胞群體，其中白細(xì)胞有利于第二種細(xì)胞群體的植入。
11.權(quán)利要求10的細(xì)胞群體，其中第二種細(xì)胞群體選自造血細(xì)胞、髓細(xì)胞、白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
12.權(quán)利要求10的細(xì)胞群體，其中第二種細(xì)胞群體是一種器官。
13.權(quán)利要求1的群體，其中該白細(xì)胞群體含有第一種淋巴細(xì)胞亞群。
14.權(quán)利要求13的群體，其中第一種淋巴細(xì)胞亞群含有第二種T淋巴細(xì)胞亞群。
15.權(quán)利要求14的群體，其中根據(jù)表面標(biāo)記的表達(dá)獲得第二種亞群。
16.權(quán)利要求15的群體，其中表面標(biāo)記選自CD8、CD4、CD16和CD56。
17.權(quán)利要求1的群體，其中通過(guò)選自白細(xì)胞電泳和紅細(xì)胞去除的方法從全血中獲得白細(xì)胞群體。
18.一種用于供體白細(xì)胞輸注的方法，其中該方法包括在骨髓移植之后向受試哺乳動(dòng)物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞群體。
19.一種增強(qiáng)移植細(xì)胞群體的植入的方法，其中該方法包括在移植之前向受試哺乳動(dòng)物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞群體。
20.一種增強(qiáng)移植細(xì)胞群體的植入的方法，其中該方法包括在移植時(shí)向受試哺乳動(dòng)物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞群體。
21.一種增強(qiáng)移植細(xì)胞群體的植入的方法，其中該方法包括在移植之后向受試哺乳動(dòng)物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞群體。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中移植的細(xì)胞群體含有造血干細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中移植的細(xì)胞群體含有造血干細(xì)胞。
24.一種用于免疫重建的方法，其中該方法包括向受試哺乳動(dòng)物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞群體。
25.一種用于過(guò)繼免疫治療的方法，其中該方法包括向受試哺乳動(dòng)物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞群體。
26.一種用于混合嵌合狀態(tài)治療的方法，其中該方法包括向受試哺乳動(dòng)物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞群體。
27.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞群體的方法，其中該方法包括(a)形成一種體外反應(yīng)混合物，其含有白細(xì)胞群體和一種能與核酸形成共價(jià)鍵的化合物；和(b)在能產(chǎn)生一種含有白細(xì)胞群體的細(xì)胞群體的條件下溫育該反應(yīng)混合物；其中一部分白細(xì)胞群體是不增殖的，使得受體中移植物抗宿主疾病(GVHD)的誘導(dǎo)被抑制，并且其中該白細(xì)胞群體的一部分保留免疫學(xué)活性。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中免疫學(xué)活性包括疾病細(xì)胞、受感染細(xì)胞和病原體的破壞。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中該化合物以一定量存在，使得該化合物在每108個(gè)白細(xì)胞基因組DNA堿基對(duì)中形成約1到約104個(gè)加合物。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中該化合物以一定量存在，使得該化合物在每108個(gè)白細(xì)胞基因組DNA堿基對(duì)中形成約5到約103個(gè)加合物。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中未反應(yīng)的化合物被去除。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中通過(guò)向反應(yīng)混合物中加入猝滅劑去除未反應(yīng)的化合物。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求27的方法制備的細(xì)胞群體。
34.一種細(xì)胞群體，其性質(zhì)相當(dāng)于根據(jù)權(quán)利要求33的群體。
35.一種細(xì)胞群體，其性質(zhì)相當(dāng)于根據(jù)權(quán)利要求1的群體。
36.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中被處理的白細(xì)胞群體內(nèi)至少90％的T細(xì)胞中增殖被抑制。
37.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中該化合物含有一種能與核酸非共價(jià)結(jié)合的核酸結(jié)合部分。
38.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中該化合物含有(a)一種核酸結(jié)合部分；(b)一種能與核酸形成共價(jià)鍵的效應(yīng)物部分；和(c)一種共價(jià)連接核酸結(jié)合部分與效應(yīng)物部分的脆性連接體。
39.權(quán)利要求38的方法，其中核酸結(jié)合部分是一種芳族嵌入物，而效應(yīng)物部分是一種芥子基。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中該化合物是具有通式
的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯(S-303)及其鹽。
41.權(quán)利要求27的方法，其中該化合物也是一種復(fù)制抑制劑。
42.權(quán)利要求27的方法，其中該化合物也是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。
43.權(quán)利要求42的方法，其中該化合物選自喜樹(shù)堿和道諾霉素。
44.權(quán)利要求27的方法，其中該化合物含有一種可光活化部分，其在電磁刺激后與核酸形成共價(jià)鍵。
45.權(quán)利要求44的方法，其中該方法進(jìn)一步包括使反應(yīng)混合物暴露于光下，光活化該可光活化部分，從而導(dǎo)致可光活化部分與白細(xì)胞基因組DNA間共價(jià)鍵的形成。
46.權(quán)利要求45的方法，其中該化合物選自呋喃香豆素、放線菌素、蒽環(huán)酮、氨茴霉素、苯并二吡喃酮、芴、芴酮、單星脂肪藍(lán)、norphillin A、有機(jī)染料；菲啶、吩噻嗪硫鎓鹽、吩嗪、吩噻嗪、疊氮基苯、喹啉和噻噸酮、吖啶和橢圓玫瑰樹(shù)堿。
47.權(quán)利要求46的方法，其中呋喃香豆素是一種補(bǔ)骨脂素。
48.權(quán)利要求47的方法，其中補(bǔ)骨脂素選自PAP、8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP)、4’-氨基甲基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(AMT)、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素(5-MOP)和三氧雜啉4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素。
49.權(quán)利要求47的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于波長(zhǎng)為200-450nm的紫外線下。
50.權(quán)利要求49的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于波長(zhǎng)為320-400nm的紫外線下。
51.權(quán)利要求50的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于劑量為10-3-100J/cm2的紫外線下。
52.權(quán)利要求51的方法，其中使該反應(yīng)混合物在紫外線下暴露1秒-60分鐘的一段時(shí)間。
53.權(quán)利要求52的方法，其中補(bǔ)骨脂素以10-4-150μM的濃度存在。
54.權(quán)利要求53的方法，其中該補(bǔ)骨脂素為具有通式
的4’-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5’，8-三甲基補(bǔ)骨脂素(S-59)及其鹽。
55.權(quán)利要求54的方法，其中S-59的濃度為10-3-150μM。
56.權(quán)利要求55的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于波長(zhǎng)為200-450nm的紫外線下。
57.權(quán)利要求56的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于波長(zhǎng)為320-400nm的紫外線下。
58.權(quán)利要求57的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于劑量為10-3-100J/cm2的紫外線下。
59.權(quán)利要求58的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于劑量為3J/cm2的紫外線下。
60.權(quán)利要求58的方法，其中使該反應(yīng)混合物在紫外線下暴露1秒-60分鐘的一段時(shí)間。
61.權(quán)利要求60的方法，其中使該反應(yīng)混合物在紫外線下暴露大約1分鐘的時(shí)間。
62.權(quán)利要求61的方法，其中白細(xì)胞群體的細(xì)胞密度為每毫升10-109個(gè)細(xì)胞。
63.權(quán)利要求62的方法，其中白細(xì)胞群體的細(xì)胞密度為每毫升2×106個(gè)細(xì)胞。
64.一種根據(jù)權(quán)利要求38的方法產(chǎn)生的細(xì)胞群體。
65.一種根據(jù)權(quán)利要求40的方法產(chǎn)生的細(xì)胞群體。
66.一種根據(jù)權(quán)利要求41的方法產(chǎn)生的細(xì)胞群體。
67.一種根據(jù)權(quán)利要求46的方法產(chǎn)生的細(xì)胞群體。
68.一種根據(jù)權(quán)利要求54的方法產(chǎn)生的細(xì)胞群體。
69.一種根據(jù)權(quán)利要求59的方法產(chǎn)生的細(xì)胞群體。
70.一種根據(jù)權(quán)利要求63的方法產(chǎn)生的細(xì)胞群體。
71.一種促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的方法，包括將權(quán)利要求1的白細(xì)胞群體與含有疾病細(xì)胞或病原體的同種異體細(xì)胞群體相混合。
72.一種促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的方法，包括將權(quán)利要求70的白細(xì)胞群體與含有疾病細(xì)胞或病原體的同種異體細(xì)胞群體相混合。
73.權(quán)利要求72的方法，其中該疾病細(xì)胞是一種癌細(xì)胞。
74.權(quán)利要求73的方法，其中該癌細(xì)胞選自慢性骨髓性白血病(CML)細(xì)胞、慢性骨髓單核細(xì)胞性白血病(CmML)細(xì)胞、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)細(xì)胞、急性骨髓性白血病(AML)細(xì)胞、急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞、何杰金氏淋巴瘤細(xì)胞和非何杰金氏淋巴瘤細(xì)胞。
75.權(quán)利要求74的方法，其中癌細(xì)胞為慢性骨髓性白血病細(xì)胞。
76.權(quán)利要求74的方法，其中癌細(xì)胞為多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
77.權(quán)利要求73的方法，其中癌細(xì)胞選自乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、睪丸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞、頭癌細(xì)胞和頸癌細(xì)胞。
78.權(quán)利要求71的方法，其中疾病細(xì)胞是受感染細(xì)胞。
79.權(quán)利要求78的方法，其中受感染細(xì)胞被病毒感染。
80.權(quán)利要求79的方法，其中該病毒選自巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)和卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒。
81.權(quán)利要求71的方法，其中通過(guò)將供體白細(xì)胞輸入所述宿主中使白細(xì)胞群體與哺乳動(dòng)物宿主的同種異體細(xì)胞群體于體內(nèi)相混合。
82.權(quán)利要求81的方法，其中該哺乳動(dòng)物宿主患有骨髓移植后白血病或多發(fā)性骨髓瘤的復(fù)發(fā)。
83.權(quán)利要求71的方法，其中刺激白細(xì)胞群體以擴(kuò)展對(duì)疾病細(xì)胞或病原體抗原特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的數(shù)量。
84.權(quán)利要求83的方法，其中在從供體中分離白細(xì)胞群體之前在體內(nèi)進(jìn)行刺激。
85.權(quán)利要求84的方法，其中通過(guò)用抗原對(duì)白細(xì)胞供體接種進(jìn)行刺激。
86.權(quán)利要求85的方法，其中疾病細(xì)胞是CML細(xì)胞，并用CML細(xì)胞的bcr-abl抗原接種白細(xì)胞供體。
87.權(quán)利要求85的方法，其中疾病細(xì)胞是多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，并用骨髓瘤細(xì)胞的獨(dú)特型抗原接種白細(xì)胞供體。
88.權(quán)利要求83的方法，其中離體地進(jìn)行刺激。
89.權(quán)利要求83的方法，其中刺激起因于白細(xì)胞群體與疾病細(xì)胞間的接觸。
90.權(quán)利要求83的方法，其中刺激起因于白細(xì)胞群體與抗原呈遞細(xì)胞之間的接觸，其中該抗原呈遞細(xì)胞已經(jīng)接觸疾病細(xì)胞。
91.權(quán)利要求83的方法，其中刺激起因于白細(xì)胞群體與抗原呈遞細(xì)胞之間的接觸，其中該抗原呈遞細(xì)胞已經(jīng)接觸疾病細(xì)胞的一種抗原。
92.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞群體的方法，其中該方法包括(a)形成一種含有白細(xì)胞群體和復(fù)制抑制性化合物的體外反應(yīng)混合物；和(b)在一定條件下溫育該反應(yīng)混合物，該條件能產(chǎn)生一種含有白細(xì)胞群體的細(xì)胞群體，其中該白細(xì)胞群體的一部分是不增殖的，使得受體中移植物抗宿主疾病(GVHD)的誘導(dǎo)被抑制，并且該白細(xì)胞群體的一部分保留免疫學(xué)活性。
93.權(quán)利要求92的方法，其中該化合物是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。
94.權(quán)利要求93的方法，其中該化合物選自喜樹(shù)堿和道諾霉素。
95.一種制備經(jīng)處理的白細(xì)胞群體的方法，其中該白細(xì)胞群體總體上是不增殖的，并且不能在同種異體宿主中引起移植物抗宿主疾病(GVHD)，其包括下列步驟i)提供純化的白細(xì)胞群體的樣品；和ii)使白細(xì)胞樣品與能與核酸形成共價(jià)鍵的化合物以一定的量結(jié)合，使得該化合物在每108個(gè)白細(xì)胞基因組DNA堿基對(duì)中形成約1-104個(gè)加合物，從而抑制增殖但保留白細(xì)胞群體促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體破壞的有效性。
96.一種制備用于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的刺激細(xì)胞的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求27的方法處理含有白細(xì)胞群體的細(xì)胞群體，并用經(jīng)處理的細(xì)胞群體作為刺激細(xì)胞。
97.一種確定增殖是否為細(xì)胞功能所必需的方法，包括下列步驟(a)形成一種體外反應(yīng)混合物，其含有一種細(xì)胞群體和一種能與核酸形成共價(jià)鍵的化合物；(b)在一定條件下溫育該反應(yīng)混合物，該條件能產(chǎn)生一種不能DNA合成但能夠RNA及蛋白質(zhì)生物合成的細(xì)胞群體；并觀察細(xì)胞群體，確定細(xì)胞功能是否行使。
98.權(quán)利要求97的方法，其中該細(xì)胞功能是分化。
全文摘要
本發(fā)明提供了處理白細(xì)胞的方法與組合物,用于抑制白細(xì)胞的增殖并使它們不能引發(fā)移植物抗宿主疾病(GVHD),但能有效地增強(qiáng)同種異體供體細(xì)胞的植入,促進(jìn)疾病細(xì)胞或病原體的破壞。也提供了白細(xì)胞組合物及這些組合物在緩解疾病中的應(yīng)用方法,其有利于多種類型的免疫重建和免疫治療,并增強(qiáng)同種異體供體細(xì)胞的植入。
文檔編號(hào)A61K35/14GK1270630SQ98809097
公開(kāi)日2000年10月18日 申請(qǐng)日期1998年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月21日
發(fā)明者W·M·格林曼, J·A·格拉斯, S·塔利布, A·斯塔西諾波勞斯, D·J·海, J·E·赫爾斯特 申請(qǐng)人:塞魯斯公司