專利名稱：用于經(jīng)皮施用免疫原的雙相脂小泡組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及為免疫或接種目的施用免疫原的方法。免疫原包埋于在中央核心區(qū)室具有水包油乳劑的脂小泡中。該小泡經(jīng)皮施用以施用包埋的免疫原。
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本發(fā)明的背景可誘導(dǎo)針對幾乎無限物質(zhì)種類的免疫應(yīng)答。有2類免疫應(yīng)答，即體液和細(xì)胞應(yīng)答。在體液應(yīng)答中，抗原或外源物質(zhì)被淋巴細(xì)胞表面的特異性受體識別，并刺激某些B-淋巴細(xì)胞增殖。這些細(xì)胞產(chǎn)生大量能結(jié)合抗原的抗體。結(jié)合后，去掉或破壞被結(jié)合的抗原。在細(xì)胞或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，T-淋巴細(xì)胞，特別是輔助和殺傷T-淋巴細(xì)胞在識別和破壞外源物質(zhì)中起作用。
作為抗傳染病的預(yù)防措施的誘導(dǎo)免疫過程稱為免疫接種。免疫接種可以是被動的，其中給動物施用抗體以提供短期免疫，免疫接種也可是主動的，主動免疫更常見，稱為種痘，其中將滅活的或減毒的抗原或其片段導(dǎo)入動物。該抗原致敏免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致如果該抗原后來進(jìn)入體內(nèi)，則迅速產(chǎn)生抗體以除去和/或破壞侵入的抗原。
大多數(shù)疫苗是含有所尋求針對其進(jìn)行保護(hù)的生物體或生物體部分的制品。該生物體被殺死或減毒，以便足以不引起疾病但可誘導(dǎo)免疫。有些疫苗含化學(xué)修飾的細(xì)菌毒素?？色@得針對各種傳染病的疫苗，例如，提供活的減毒疫苗以預(yù)防麻疹，流行性腮腺炎，風(fēng)疹，黃熱病和脊髓灰質(zhì)炎。白喉和破傷風(fēng)疫苗含有滅活的細(xì)菌毒素?；魜y，傷寒，百日咳，狂犬病，病毒性乙型肝炎和流感疫苗含有滅活的生物體，或者在乙型肝炎疫苗中僅含有病毒的一部分。
疫苗通常經(jīng)過注射入上臂給藥，或者，對于脊髓灰質(zhì)炎疫苗，經(jīng)過口服用藥。經(jīng)注射用藥通常不是很方便，尤其在第三世界國家，對于野外的士兵或?qū)τ诜侨祟悅€(gè)體，包括馬，奶牛和狗不是很方便。
本發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種簡便，有效的施用疫苗的方式。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種雙相脂小泡組合物用于經(jīng)皮經(jīng)皮施用包埋于脂小泡中的抗原。
在一個(gè)方面，本發(fā)明包括一種組合物，用于在受試者中誘導(dǎo)針對免疫原的免疫應(yīng)答。該組合物包括具有中央核心區(qū)室的雙相脂小泡的懸液，該核心區(qū)室中含有水包油乳劑、且在雙相脂小泡中包埋一種免疫原。
在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原是來自細(xì)菌、病毒、寄生蟲、植物或真菌來源的抗原。
免疫原有效誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，或者，有效誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
在另一實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括包埋于脂小泡中的佐劑。
在另一實(shí)施方案中，脂小泡懸液進(jìn)一步包括皮膚穿透增強(qiáng)劑。
優(yōu)選的穿透增強(qiáng)劑包括脂酰氨基酸和不飽和脂肪酸。
另一方面，本發(fā)明包括在受試者中誘發(fā)針對免疫原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給受試者經(jīng)皮經(jīng)皮施用一劑免疫原。如上所述，免疫原包埋在具有中央核心區(qū)室的雙相脂小泡中，該區(qū)室含有水包油乳劑。
在另一方面，本發(fā)明包括應(yīng)用針對受試者皮膚的裝置給受試者經(jīng)皮經(jīng)皮施用免疫原的方法。該裝置包括(i)經(jīng)過混合水包油乳劑與形成小泡的脂類形成的脂小泡懸液，該小泡由下列成份組成(a)由該形成小泡的脂類組成的脂雙層外膜，(b)含該水包油乳劑的中央核心區(qū)室和(c)包埋于小泡中的對誘發(fā)免疫應(yīng)答有效的一定劑量的免疫原；(ii)適于保持脂小泡懸液和適于從其中釋放脂小泡的貯藥器(reservoir)；和(iii)用于將該裝置附著到受試者上以經(jīng)皮經(jīng)皮施用免疫原的工具。
在另一方面，本發(fā)明包括一種用于經(jīng)皮施用免疫原的裝置，它含有經(jīng)過混合水包油乳劑與形成小泡的脂類而形成的脂小泡懸液。該小泡由下列成份組成(i)，由該形成小泡的脂類組成的脂雙層外膜，(ii)，含有該水包油乳劑的中央核心區(qū)室，(iii)，包埋于小泡中的，誘發(fā)免疫應(yīng)答有效劑量的免疫原。該裝置還包括一種保持脂小泡懸液和適于從其中釋放脂小泡的貯藥器，以及用于將該裝置附著在受試者上以經(jīng)皮施用免疫原的工具。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該裝置中的貯藥器由不通透的背襯件與用于使脂小泡從該貯藥器有效傳遞的膜所組成。
在另一實(shí)施方案中，脂小泡的懸液包括通透增強(qiáng)劑。例如，通透劑可以是脂酰氨基酸或不飽和的脂肪酸。
包埋于小泡中的免疫原優(yōu)選具有大約100-100,000,000道爾頓的分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原是用于接種動物或人的免疫原。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于將裝置附著于受試者上的工具是一種相鄰于膜的粘合層。
小泡懸液可包括一種佐劑，它包埋于脂小泡中或包含在懸液中。
本發(fā)明的這些和其它目的和特征在結(jié)合附圖閱讀下面的本發(fā)明詳細(xì)描述后將更加顯而易見。
附圖的簡要描述

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明制備的雙相脂小泡。
圖2顯示了制備用于本發(fā)明裝置中的在中央核心具有水包油乳劑的雙相脂小泡的一般程序。
圖3A-3C是適用于本發(fā)明的經(jīng)經(jīng)皮裝置的橫切面圖；圖4是顯示血清抗體反應(yīng)的布點(diǎn)圖，表示為從本發(fā)明的裝置經(jīng)皮經(jīng)皮施用包埋白細(xì)胞毒素的雙相脂小泡后在405nm下的光密度；圖5是顯示從對照小鼠(實(shí)心方塊)和從用含50μg(實(shí)心三角)或100μg(倒三角)包埋于雙相脂小泡中的白細(xì)胞毒素的經(jīng)皮藥貼施用白細(xì)胞毒素免疫的小鼠分離的大量脾細(xì)胞的增生反應(yīng)的布點(diǎn)圖；圖6是對于對照小鼠和用含50μg或100μg包埋于雙相脂小泡中的白細(xì)胞毒素的經(jīng)皮藥貼施用白細(xì)胞毒素免疫的小鼠經(jīng)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISPOT)測量的大量脾細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-4的布點(diǎn)圖；圖7是顯示經(jīng)皮經(jīng)皮施用雞蛋溶菌酶與各種雙相脂小泡配制品I-V免疫的小鼠中血清IgG反應(yīng)的柱形圖；圖8A-8D是顯示以ELISPOT試驗(yàn)測量的，用各種雙相脂小泡配制品I-V中的50μg雞蛋溶菌酶免疫后脾細(xì)胞(圖8A-8B)和引流的淋巴結(jié)細(xì)胞(圖8C-8D)分泌白細(xì)胞介素-4和干擾素-γ的柱形圖；圖9是顯示用包埋于雙相脂小泡中的雞蛋溶菌酶經(jīng)皮下和經(jīng)皮經(jīng)皮免疫后小鼠血清中的IgG反應(yīng)的柱形圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述I.定義本文使用的下面術(shù)語具有下述含義。
“抗原”指被抗體特異性識別和/或與抗體結(jié)合的物質(zhì)或材料。
“佐劑”指與抗原結(jié)合用藥時(shí)增效免疫反應(yīng)的物質(zhì)或材料。佐劑也可用于誘發(fā)更迅速的免疫反應(yīng)。
“雙相脂小泡”指由形成小泡的脂類形成的且在中央核心區(qū)室具有水包油乳劑的脂顆粒。術(shù)語脂小泡，小泡和雙相脂小泡在本文中可互換使用。
“免疫原”指能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的物質(zhì)或材料包括抗原。免疫原可單獨(dú)或與佐劑結(jié)合誘發(fā)免疫反應(yīng)。免疫原可以是合成的或是天然的，例如，可以是無機(jī)或有機(jī)化合物，如，半抗原，蛋白質(zhì)，肽，多糖，核蛋白，核酸或脂蛋白。免疫原可以來自細(xì)菌，病毒或原生動物，植物，或真菌生物或其部分。
“劑量”指誘發(fā)免疫反應(yīng)所需的免疫原的量。該量可隨動物，免疫原和下文所述的佐劑的存在而變化。免疫劑量用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法可較容易地測定，如通過宿主動物免疫和攻擊研究(Chanock等，(1987))來測定。
“貯藥器”指可保持并在其中分布一種介質(zhì)的貯存結(jié)構(gòu)。
II.雙相脂小泡懸液A.雙相脂小泡如上所述，本發(fā)明包括用于經(jīng)皮施用免疫原的脂小泡組合物。根據(jù)本發(fā)明的脂小泡在圖1中以示意圖描述。
在該附圖中，本發(fā)明的雙相脂小泡是多層脂小泡，如在該圖中所示的小泡10，它由一系列脂雙層組成，其中的兩個(gè)雙層顯示為雙層12，14。各脂雙層由下面討論的形成小泡的脂類的兩層組成，其中各脂分子，如分子16由其極性頭部基團(tuán)16a定向與親水區(qū)室18接觸，其疏水尾部16b與相鄰脂分子并排。
小泡最里面的雙層限定了一個(gè)中央?yún)^(qū)室20。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)重要特征，脂小泡的核心區(qū)室含水包油乳劑，在圖中由滴狀的22，24，26代表。如下文所述，經(jīng)過制備表面活性劑穩(wěn)定的水包油乳劑將水包油乳劑包埋于脂小泡中，在圖中表示為被表面活性劑分子22b包圍的親脂滴22a。該乳劑與形成小泡的脂類混合以形成包圍乳劑的脂雙層。
根據(jù)免疫原的藥物化學(xué)特征可用各種方式將免疫原包埋進(jìn)脂小泡中。例如，親水免疫原可以是中央核心區(qū)室中水包油乳劑的水相或是脂雙層間區(qū)室18中的水相。較疏水的免疫原可包含在水包油乳劑的油相中或在脂雙層中，如圖中30所示。制備包埋免疫原的雙相脂小泡的方法如下所述。
B.雙相脂小泡包埋的免疫原如上所述，本發(fā)明的組合物包括含有被包埋的免疫原的雙相脂小泡懸液，該免疫原能有效誘發(fā)免疫應(yīng)答，以便達(dá)到例如，免疫或接種的目的。
一般來說，本發(fā)明適用于各種類型的免疫原。下列抗原以說明的方式提供，而不打算用于排除其它抗原流感病毒抗原(如血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶抗原)，百日咳桿菌抗原(如百日咳毒素，絲狀血細(xì)胞凝集素，pertactin)，人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原，幽門螺桿菌抗原，狂犬病抗原，森林腦炎(TBE)抗原，腦膜炎球菌抗原(如血清型A，B，C，Y和W-135的莢膜多糖)，破傷風(fēng)抗原(如破傷風(fēng)類毒素)，白喉抗原(如白喉類毒素)，肺類球菌抗原(如肺炎鏈球菌3型莢膜多糖)，結(jié)核病抗原，人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(如GP-120，GP-160)，霍亂抗原(如霍亂毒素B亞基)，葡萄球菌抗原(如葡萄球菌腸毒素B)，志賀菌屬抗原(如志賀菌屬多糖)，水泡性口炎病毒抗原(如水泡性口炎病毒糖蛋白)，巨細(xì)胞病毒(CMV)抗原，肝炎抗原(如甲肝(HAV)，乙肝(HBV)，丙肝(HCV)，丁肝(HDV)和庚肝(HGV)病毒抗原)，呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，單純皰疹病毒抗原，或其組合(例如，白喉，百日喉和破傷風(fēng)的組合(DPT))。合適的抗原還包括那些被傳遞以誘導(dǎo)耐受力的抗原，如網(wǎng)膜抗原。還包含用于針對炭疽和鼠疫耶爾森氏菌的免疫/接種的抗原。
優(yōu)選的抗原包括百日咳桿菌抗原，腦膜炎球菌抗原，破傷風(fēng)抗原，白喉抗原，肺炎球菌抗原，結(jié)核病抗原和RSV抗原。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，包埋的免疫原具有大約100-100,000,000道爾頓的分子量，更優(yōu)選100-500,000道爾頓，最優(yōu)選100-100,000道爾頓。
在為支持本發(fā)明進(jìn)行的研究中，由溶血性巴斯德氏菌產(chǎn)生的外毒素白細(xì)胞毒素和雞蛋溶菌酶被包埋于雙相脂小泡中且經(jīng)皮經(jīng)皮傳遞，如下文所述。
III.雙相脂小泡的制備如上所述，本發(fā)明的雙相脂小泡在脂小泡的中央核心區(qū)室以及在分開脂雙層的含水空隙中包括水包油乳劑。一般來說，該脂小泡由混合水包油乳劑和形成小泡的脂類來制備。重要的是，在與形成小泡的脂類混合前用表面活性劑穩(wěn)定水包油乳劑。即，乳劑中的油滴被表面活性劑包裹，優(yōu)選被表面活性劑單層包裹。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定的表面活性劑不是形成雙相脂小泡雙層的小泡形成脂成份。
更具體地說，根據(jù)本發(fā)明的雙相脂小泡根據(jù)圖2列出的一般方法來制備。選擇的脂成份溶于合適的溶劑中，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，溶劑是藥用上可接受的親水溶劑，如多元醇，例如，丙二醇，乙二醇，甘油或醇類，如乙醇，或這些溶劑的混合物。根據(jù)脂成份的藥物化學(xué)特性和選擇的溶劑，可能需要加溫混合物，例如，加溫到40-80℃之間。
脂成份必需包括形成小泡的脂類，這意味著它是可在水中自發(fā)形成雙層小泡的具有疏水尾部和頭部基團(tuán)的兩親性脂類。形成小泡的脂類優(yōu)選是具有2個(gè)烴鏈，典型的是酰基鏈的脂類，且其中頭部基團(tuán)是極性的或非極性的。有各種合成的小泡形成脂類和天然存在的小泡形成脂類是適用的，如磷脂，它包括磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，磷脂酸和鞘磷脂，其中2條烴鏈典型地長度為大約14-22個(gè)碳原子，且具有不同程度的不飽和性。這些脂類可經(jīng)商業(yè)途徑獲得或根據(jù)公開的方法制備。
除了形成小泡的脂成份外，本發(fā)明的脂小泡可包括其它的脂成份，它能穩(wěn)定摻入脂雙層中，其疏水部分與雙層膜的內(nèi)面，即疏水區(qū)域接觸，而其極性頭部基團(tuán)指向外面，即膜的極性表面。例如，糖脂，神經(jīng)酰胺和固醇，如膽固醇，糞甾醇，膽甾烷醇和膽甾烷，長鏈脂肪酸(C16至C22)，如硬脂酸可被摻入脂雙層中。可使用的其它脂成份包括脂肪胺，脂酰化蛋白質(zhì)，脂酰化肽，油，脂肪醇，甘油酯，礦脂和蠟。也可預(yù)料在脂小泡的脂類成份中包括皮膚穿透增強(qiáng)劑，這將在下文進(jìn)行討論。
在圖2中，根據(jù)表面活性劑的親水—親脂平衡，經(jīng)過將表面活性劑溶于水或油中制備水包油乳劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將表面活性劑與蒸餾水混和并加入到油相中以形成乳劑?？墒褂脭嚢瑁鐒蛸|(zhì)化或乳化，或者可經(jīng)過不包含攪拌的微乳化技術(shù)形成乳劑。所得的乳劑優(yōu)選具有作為連續(xù)相的水和作為分散相的油。
根據(jù)本發(fā)明的重要特征，由于分散相中的油滴被表面活性劑包圍，所以水包油乳劑是穩(wěn)定的。這就是說，各表面活性劑分子的親水部分延伸進(jìn)乳劑的水相中，疏水部分與親脂滴接觸。如下所述，經(jīng)過將水包油乳劑與小泡形成脂類混合而形成脂小泡。如果在與小泡形成脂類接觸前乳劑不是表面活性劑穩(wěn)定過的，那么小泡形成脂類可用于首先穩(wěn)定乳劑而不是在水包油乳劑周圍形成脂雙層。
適用于形成水包油乳劑的表面活性劑有許多，包括陽離子，陰離子和非離子或兩性表面活性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的表面活性劑是陽離子表面活性劑，如亞油酰氨基丙基丙二醇—氯化二monium磷酸鹽，可可酰氨基丙基丙二醇—氯化二monium磷酸鹽和硬脂酰氨基丙二醇—氯化二monium磷酸鹽。這些合成的磷脂復(fù)合物可從Mona Industries，Inc(Patterson，NJ)分別以商標(biāo)PhospholipidEFATM，Phospholipid SVTM和Phospholipid SVCTM買到。用作雙相脂小泡雙層的主要脂類成份的另一優(yōu)選的小泡形成脂類是氫化磷脂酰膽堿。
舉例性的陰離子表面活性劑包括?；劝彼?，如三乙醇胺可可酰谷氨酸，月桂酰谷氨酸鈉，氫化牛脂谷氨酸鈉和可可酰谷氨酸鈉。
舉例性的非離子表面活性劑包括天然產(chǎn)生的乳化劑，如聚乙二醇-60杏仁油甘油酯，鱷梨油二乙醇胺，乙氧基化西蒙得木油(聚乙二醇-40西蒙得木酸和聚乙二醇-40西蒙得木醇)；聚氧乙烯衍生物，如聚氧乙烯-20脫水山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯-20脫水山梨糖醇單硬脂酸酯，羊毛脂衍生物，如polychol 20(LANETH 20)和polychol 40(LANETH 40)；和中性磷酸酯，如聚丙二醇—鯨蠟醚磷酸酯和二乙醇胺oleth-3磷酸酯。
在分散的油相中的油滴優(yōu)選具有小于約1μm的大小，更優(yōu)選直徑不超過大約0.5μm。當(dāng)然，油滴大小可經(jīng)過諸如剪切力和混合時(shí)間等的混合條件很容易地進(jìn)行調(diào)節(jié)。
可預(yù)料到可向水包油乳劑中加入其它成份，即，水包油乳劑不必是單獨(dú)的油，表面活性劑和水。例如，乳劑可包括抗微生物試劑，如羥苯甲酸甲酯，對羥苯甲酸丙酯，和增強(qiáng)劑成份，如蠟，脂肪醇，脂肪酸酯，甘油硬脂酸酯，礦脂，植物油和提取物，以及其組合。特別優(yōu)選的例子包括蜂蠟，橄欖油，甘油硬脂酸酯，鯨蠟醇，硬脂醇，豆蔻酸豆蔻酯和棕櫚酸鯨蠟酯，庚酸硬脂酸酯，和棕櫚酸硬脂酸酯。適用于本發(fā)明的舉例性的配制品在下文描述，且在共同擁有的美國專利申請流水號08/507,923中公開，本文作為參考文獻(xiàn)引用。
在圖2中，穩(wěn)定的水包油乳劑與溶解的小泡形成脂類混合，且如添加，則還有其它的脂成份，如膽甾醇。在有效形成在中央?yún)^(qū)室含有水包油乳劑的多層小泡的條件下混合乳劑與脂成份。
小泡大小典型地為大約0.1-100μm。為用于本發(fā)明，優(yōu)選脂小泡大小為大約0.5-25μm之間，經(jīng)過調(diào)節(jié)混合條件可極容易地達(dá)到這點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明形成的脂小泡組合物不需進(jìn)一步添加增稠劑或膠化劑就具有與奶油相似的粘稠度，因此，容易直接施用到受試者皮膚上用于經(jīng)皮經(jīng)皮施用包埋的免疫原。另外，該脂小泡組合物可容易地?fù)饺虢?jīng)皮經(jīng)皮用藥的裝置的容器中。
圖2所列的制備方法產(chǎn)生具有均勻大小分布和均勻組成的小泡群體，如共同未決的申請系列號08/507,923中所討論和顯示，該申請以其全文在本文中作為參考文獻(xiàn)引用。該小泡物理上穩(wěn)定，即，貯存4年期間很少有明顯的小泡聚集或融合。
A.其它脂小泡成份免疫原根據(jù)其理化特性可被包埋在脂雙層間的小泡中央核心區(qū)室內(nèi)，或在脂雙層的內(nèi)部，如下所述。
水溶性免疫原經(jīng)過在制備水包油乳劑期間將免疫原加入水相中而將其包埋在中央核心區(qū)室和在脂雙層間的外周區(qū)室內(nèi)。溶解或懸浮于水相中的免疫原在加入小泡形成脂類后在脂小泡形成期間作為乳劑部分被包埋。
在制備水包油乳劑期間將親脂免疫原加入油相中以便在中央?yún)^(qū)室和外周區(qū)室中包埋。另外或者作為選擇，經(jīng)過將免疫原加入小泡形成脂類和/或其它脂成份，如膽甾醇中可將親脂免疫原包埋進(jìn)脂雙層中。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，雙相脂小泡包括穿透增強(qiáng)劑以增強(qiáng)被包埋抗原的穿透。在皮膚用藥領(lǐng)域中已廣泛研究了這些增強(qiáng)劑的應(yīng)用(Santus等，1993)且可預(yù)料到這類增強(qiáng)劑適用于本發(fā)明。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，穿透增強(qiáng)劑是脂?；被?，如單月桂酰賴氨酸或雙棕櫚酰賴氨酸，不飽和脂肪酸，如油酸，短鏈脂肪酸，如月桂酸或水楊酸甲酯。穿透增強(qiáng)劑可以按上述包含包埋免疫原相同的方式包含進(jìn)水包油乳劑或脂雙層中。
在有些實(shí)施方案中，如上所述，制備用于本發(fā)明的雙相脂小泡包括抗微生物劑，如羥苯甲酸甲酯或?qū)αu苯甲酸丙酯。當(dāng)制備水包油乳劑時(shí)，該試劑可加入水相中并作為水相部分被包埋在脂小泡中。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，在雙相脂小泡組合物中包含佐劑。舉例性的佐劑包括完全Freund氏佐劑(CFA)，不完全Freund’s佐劑(IFA)，氫氧化鋁，細(xì)菌，病毒或合成佐劑。佐劑在用藥位點(diǎn)經(jīng)過幫助和延緩免疫原的釋放而起作用。例如，油基佐劑誘導(dǎo)形成肉芽瘤，它主要是由巨噬細(xì)胞和其它的抗原呈遞細(xì)胞聚集形成。佐劑也幫助將免疫原傳遞給淋巴系統(tǒng)，使免疫原鄰近抗原呈遞細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞。
盡管已知CFA是有力的佐劑激活劑，但由于存在熱滅活的分枝桿菌或類似抗原性的表位，其應(yīng)用局限于動物。另外，可使用其它佐劑激活劑，如熱滅活的棒狀桿菌屬或博德特氏桿菌屬種類的成員，細(xì)菌細(xì)胞肽聚糖或胞壁酰二肽，它們將抗原定位在T-細(xì)胞依賴區(qū)域以便抗原呈遞細(xì)胞和免疫細(xì)胞活化。
用于本發(fā)明的另一類佐劑激活劑包括兩親性和表面活化的試劑，如皂苷，溶血卵磷脂，視黃醛，Quil A和pluronic聚合物配制品。當(dāng)膜成份用作免疫原時(shí)表面活性佐劑的效率特別顯著。其它類型的佐劑包括惰性載體，如皂土和丙烯酰載體；多克隆T-細(xì)胞活化劑，如純化的蛋白質(zhì)衍生物(PPD)和polyUpolyA。
IV.經(jīng)皮裝置如上所述，本發(fā)明的雙相脂載體組合物用于經(jīng)皮經(jīng)皮用藥。該組合物可直接施用到皮膚上，例如，用作洗劑，乳劑或凝膠，或者可摻入經(jīng)皮裝置中?，F(xiàn)在對該裝置進(jìn)行描述。
在最基本的實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)皮裝置包括適合于在貯存期間保持及在用藥中釋放含有包埋的免疫原的脂小泡的一種貯藥器。舉例性的裝置在圖3A-3C中顯示，然而，可預(yù)料到在本領(lǐng)域中已描述了各種各樣的經(jīng)皮裝置且它們均適用于本發(fā)明。
在圖3A中顯示的舉例性的經(jīng)皮裝置40包括由不通透的背襯層44和膜46限定的貯藥器42。背襯層和膜在該裝置的外周附近連接在一起。如48所示。這些層經(jīng)過粘連，熱密封等連接起來。裝置40還包括粘合層50，作為將該裝置附著到受試者皮膚上的工具。該裝置在使用前去掉可剝離離型紙52以暴露粘合層50。
背襯層44限定了藥貼的遠(yuǎn)側(cè)，即使用時(shí)離皮膚最遠(yuǎn)的側(cè)面。背襯層是該裝置的主要結(jié)構(gòu)元件，使該裝置具有機(jī)械特性，例如，柔韌性。背襯層用作保護(hù)性的不通透的覆蓋物以防止貯藥器42內(nèi)的內(nèi)容物損失。合適的背襯材料包括商業(yè)上可獲得的醫(yī)用膜，如由3M公司，Dow Chemical或Fasson Medical Industries提供的那些醫(yī)用膜。典型的背襯材料可由聚酯等制成且可被染色或硬化。
膜46是高度多孔的元件，它保持貯藥器42內(nèi)的配制品，即，阻止大量配制品流出貯藥器，但允許配制品從貯藥器傳遞進(jìn)皮膚。適用作膜46的材料包括非織造織物，如非織造聚酯，聚乙烯，聚丙烯和其它合成聚合物。該材料優(yōu)選經(jīng)加熱或者其它方式密封到背襯層上以擋住貯藥器內(nèi)容物的橫向流動。
由背襯和膜之間的空間或空隙限定的貯藥器42提供了一種貯存結(jié)構(gòu)，其中保持待施用的脂小泡懸液。脂小泡懸液將在下面進(jìn)行詳細(xì)描述。
粘合層50是將裝置附著在皮膚上的裝置。該層由藥用上可接受的壓敏粘合劑，如聚二甲基硅氧烷，聚異丁烯，聚丙烯酸酯，聚氨基甲酸乙酯等制備。如圖3A所示，粘合層50是線內(nèi)粘合劑?？深A(yù)料到粘合層也可以是外周或邊緣的粘合層，如圖3B所示。
裝置40包括揭片條或可剝離離型紙以覆蓋粘合層的表面并且在貯存期間防止貯藥器內(nèi)容物損失。使用前，從該裝置中去掉可剝離離型紙。可剝離離型紙一般是對貯藥器內(nèi)容物不通透的材料，例如聚對苯二甲酸乙二醇酯，通常經(jīng)過用聚硅氧烷或碳氟化合物處理而可剝離。
在圖3B中，顯示了第二個(gè)舉例性的經(jīng)皮裝置，包括背襯層62，膜64和外周粘合層66。在該實(shí)施方案中，背襯層62和膜64在該裝置的外周被加熱密封，如68所示。由背襯層和膜之間的空間限定的貯藥器70提供待經(jīng)皮經(jīng)皮用藥的脂小泡懸液的貯存點(diǎn)。外周粘合層66直接加至背襯層62?？蓜冸x離型紙72在貯存期間保護(hù)該裝置。適用于背襯層，膜，粘合劑和可剝離離型紙的材料如對圖3A中所述。
第3種舉例性的經(jīng)皮裝置80在圖3C中顯示。在該裝置中，貯藥器82中的內(nèi)容物當(dāng)裝置附著到受試者上時(shí)直接與皮膚接觸。該裝置中的貯藥器由吸附性海綿或多孔的高通透性的聚合物組成。適用于貯藥器的材料包括聚氨基甲酸乙酯，聚乙烯或聚丙烯材料。不通透的背襯層84防止貯藥器內(nèi)容物通過該裝置的遠(yuǎn)端頂側(cè)流失。背襯層在其遠(yuǎn)側(cè)用粘合性上襯86覆蓋。它受到背襯層或聚合物層88的保護(hù)。使用前，經(jīng)過從該裝置的近皮膚側(cè)揭去可剝離離型紙90和不通透的保護(hù)條92暴露粘合性上襯的外周邊緣。
在上述實(shí)施方案中，該裝置粘附到使用者的皮膚上，當(dāng)然，將該裝置附著到皮膚上的其它工具是可想象的，且是適用的，如彈性臂箍或可調(diào)腰帶。
經(jīng)皮裝置中的膜優(yōu)選多孔的，高通透性膜，相對于皮膚具有對貯藥器內(nèi)容物擴(kuò)散的最小阻力。同時(shí)，膜具有防止貯藥器內(nèi)容物大量流出該裝置的功能。如下所述，貯藥器中含有懸液形式的脂小泡，脂小泡穿過該膜與皮膚接觸且穿透皮膚用于施用包埋的免疫原。適用作膜的材料包括親水和疏水織物，布料和適合于傳遞脂小泡的具有多孔性的聚合物膜。該材料可以是非織造織物或者可以是具有限定孔經(jīng)的織物材料。一種優(yōu)選的材料是PecapTM聚酯HC7-51，它具有51μm的孔經(jīng)(Tetco，Inc.，Briarcliff Manor，NY)。其它優(yōu)選的材料是Saatifil聚酯PES47126(Saati Corp，Stamford，CT)和具有10μm篩徑的9-COP-105 Fluortex(Tetco，Inc.，Briarcliff Manor，NY)。
可預(yù)料到，可選擇膜以提供所需更大或更小的擴(kuò)散阻力。例如，為了設(shè)計(jì)經(jīng)膜速率而不是經(jīng)皮膚速率受到控制的裝置，可選擇具有更緊密織物或更小孔徑的膜。
B.經(jīng)皮裝置的制備經(jīng)皮經(jīng)皮用藥的含免疫原的雙相脂小泡懸液包含在經(jīng)皮裝置的貯藥器內(nèi)，如圖3A-3C所示。該裝置的制備是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。且本發(fā)明的經(jīng)皮裝置的具體例子的制備在下文實(shí)施例2中描述。
可預(yù)料到，經(jīng)皮裝置中膜的選擇部分依賴于雙相脂小泡的大小。典型的是，膜的孔徑略大于脂小泡的直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜孔徑為0.1-500μm，更優(yōu)選0.1-200μm。膜孔徑與脂小泡直徑間大小的差異影響雙相脂小泡從該裝置的釋放速率。差異越小，脂小泡轉(zhuǎn)移的速率越慢。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，具有不均勻大小分布的雙相脂小泡包含在該裝置的貯藥器中。較小的小泡含有第一免疫原和/或佐劑，較大的小泡含有第二免疫原和/或佐劑。對于給定的膜，較小的小泡從該裝置中的釋放比較大的小泡速率快，產(chǎn)生第一次用藥和第二次用藥的組合物。
V.使用方法在另一方面，本發(fā)明包含在受試者中誘導(dǎo)針對免疫原的免疫應(yīng)答的方法。該方法包括給受試者經(jīng)皮施用本文所述的包埋于雙相脂小泡中的免疫原。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙相脂小泡以如上文所述的參考圖3A-3C的經(jīng)皮傳遞的裝置中用藥。
為支持本發(fā)明進(jìn)行的研究中，制備的雙相脂小泡包括白細(xì)胞毒素，它是溶血性巴斯德氏菌產(chǎn)生的一種外毒素。溶血性巴斯德氏菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，通常是從帶有巴斯德氏菌肺病的家畜肺中分離出來的(Collier等，1962)。白細(xì)胞毒素被鑒定為潛在的毒性因子(Benson等，1978；Berggren等，(1981))，在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組蛋白用于免疫家畜以預(yù)防纖維性肺炎(Harland，等，1992)。為達(dá)到本發(fā)明的目的，白細(xì)胞毒素被用作樣板抗原以證實(shí)經(jīng)皮傳遞疫苗抗原可在小鼠中誘發(fā)免疫應(yīng)答，例如，抗體反應(yīng)。
如實(shí)施例1所述，根據(jù)上述方法制備的雙相脂小泡包含白細(xì)胞毒素。將小泡形成脂類、即氫化磷脂酰膽堿和膽甾醇溶于丙二醇中(見成份含量實(shí)施例的表1)。經(jīng)過制備含有抗微生物劑羥苯甲酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯的水溶液制備水包油乳劑。將親脂組合物，橄欖油，甘油單硬脂酸酯，鯨蠟醇，合成蜂蠟混合在一起并在表面活性劑磷脂EFA存在的條件下與水相勻質(zhì)化以形成表面活性劑穩(wěn)定的水包油乳劑。
在有效形成雙相多層脂小泡的條件下同時(shí)向脂類成份中加入乳劑和100mg/ml白細(xì)胞毒素的水溶液。該制品維持在40-50℃，用渦旋混合混合5分鐘。獲得大約0.5-10μm的雙相脂小泡。
按實(shí)施例2所述制備經(jīng)皮藥貼。用60mg雙相脂小泡的懸液填充每塊藥貼的貯藥器，其中脂小泡含有50μg或100μg白細(xì)胞毒素。按實(shí)施例3所述將藥貼貼在小鼠上，使其固定3天。3周后，經(jīng)過將一塊新藥貼貼在各試驗(yàn)小鼠上并使藥貼固定3天來進(jìn)行重復(fù)免疫。在第21天的第二次免疫10天后，給小鼠放血并分析血清中白細(xì)胞毒素特異性抗體，如實(shí)施例3所述。
結(jié)果在圖4中顯示，其中顯示了含安慰劑的雙相脂小泡的對照藥貼和含有包埋于雙相脂小泡中的50μg或100μg白細(xì)胞毒素的藥貼在405nm下的光密度。結(jié)果表明用來自雙相脂小泡的50μg或100μg白細(xì)胞毒素經(jīng)皮用藥免疫后可獲得明顯的抗體水平。
圖5顯示了從對照和使用本發(fā)明以白細(xì)胞毒素免疫的小鼠分離的大量脾細(xì)胞的增生反應(yīng)。從免疫的和對照的小鼠中分離了大量脾細(xì)胞且經(jīng)過在25μg/ml白細(xì)胞毒素存在下培養(yǎng)細(xì)胞測量增生。結(jié)果表示為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均刺激指數(shù)，如實(shí)施例4所示。
圖6顯示了以斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測量的大量脾細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-4。測量了從對照和白細(xì)胞毒素免疫的小鼠分離的脾細(xì)胞分泌的IL-4。按下文所述，在免疫程序后，分離了脾細(xì)胞并與白細(xì)胞毒素接觸。如實(shí)施例5所述，經(jīng)過計(jì)數(shù)分泌IL-4的集落數(shù)鑒定產(chǎn)IL-4的細(xì)胞。
在為支持本發(fā)明進(jìn)行的其它研究中，制備了含雞蛋溶菌酶的雙相脂小泡且經(jīng)皮傳遞給動物。如實(shí)施例6所述，制備了含有包埋了雞蛋溶菌酶的脂小泡的經(jīng)皮傳遞裝置。如I-V號所示，制備了5種不同的雙相脂小泡配制品。各配制品含有形成脂小泡的脂類，氫化磷脂酰膽堿和膽甾醇，且在水包油乳劑的成份上有區(qū)別。各配制品含有20mg/ml雞蛋溶菌酶。
如實(shí)施例7所述，經(jīng)過將該裝置附著在小鼠上并測量誘發(fā)的免疫反應(yīng)體內(nèi)試驗(yàn)5種不同的經(jīng)皮配制品。經(jīng)過在兩個(gè)免疫時(shí)間點(diǎn)的每一次粘附一塊新的藥貼進(jìn)行3天的給藥以3周的間隔免疫試驗(yàn)動物。第二次免疫后10天，處死小鼠以評價(jià)對雞蛋溶菌酶的免疫反應(yīng)。
圖7是顯示試驗(yàn)動物血清中雞蛋溶菌酶特異性IgG反應(yīng)的柱形圖，按實(shí)施例7所述以在405nm下的光密度進(jìn)行測量。該數(shù)據(jù)顯示從試驗(yàn)動物血清中雞蛋溶菌酶特異性IgG滴度證實(shí)所有這些試驗(yàn)配制品均能有效地誘發(fā)免疫應(yīng)答。用V號脂小泡配制品免疫的小鼠在血清中具有最高水平的抗原特異性IgG。對于所有的試驗(yàn)配制品，抗雞蛋溶菌酶IgG反應(yīng)被鑒定為主要是IgG1亞類，如表2所示。
表2
*滴度表示為5個(gè)小鼠的幾何平均值。
圖8A-8D是顯示體外局部免疫來自雙相脂小泡配制品I-V號每一種中的50μg雞蛋溶菌酶后大量脾細(xì)胞(圖8A-8B)和引流的淋巴節(jié)細(xì)胞(圖8C-8D)分泌白細(xì)胞介素-4和干擾素-γ的布點(diǎn)圖。按實(shí)施例8所述在20μg雞蛋溶菌酶存在下培養(yǎng)細(xì)胞，以ELISAPOT評價(jià)淋巴結(jié)和脾中分泌白細(xì)胞介素-4和干擾素-γ的細(xì)胞頻率。可見體外抗原刺激來自這些組織的細(xì)胞顯示相對于干擾素-γ而言白細(xì)胞介素-4反應(yīng)占主導(dǎo)地位。
通過經(jīng)皮和皮下施用包埋于雙相脂小泡中的50μg雞蛋溶菌酶檢查了用藥途徑的效力。免疫后，使用ELISA分析小鼠血清的抗雞蛋溶菌酶的水平。在圖9中可見，經(jīng)皮途徑誘發(fā)的雞蛋溶菌酶特異性抗體反應(yīng)與經(jīng)皮下用藥獲得的反應(yīng)相當(dāng)。
根據(jù)已知的免疫活化機(jī)制技術(shù)人員可確定免疫的時(shí)間和劑量。用免疫原免疫后，免疫反應(yīng)遵循特征的方式。開始，在免疫受試者的免疫時(shí)間和抗體水平對數(shù)增加之間出現(xiàn)延遲期。開始接觸免疫原導(dǎo)致抗體水平增加，且主要是針對免疫原抗原性表位的IgM抗體，在免疫大約3周后逐漸減少。在第一次接觸3至4周后的隨后免疫攻擊導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，其中主要的抗體類型是IgG類。這種次級免疫應(yīng)答強(qiáng)度更大，持續(xù)時(shí)間更長。
一般來說，確定針對抗原的合適反應(yīng)的免疫方案落在本領(lǐng)域已知的參數(shù)中。具體免疫原的劑量取決于其抗原性潛力，抗原決定簇的大小和多樣性，以及免疫原劑刺激抗原呈遞細(xì)胞的能力。不同類型免疫原的劑量范圍的例子參見下面表3。
表3
在包括細(xì)菌或病毒的免疫方案中，使用免疫原的減毒形式以防止感染疾病。經(jīng)過將它們暴露在例如，高溫、化學(xué)變性劑中或經(jīng)過將它們在厭氧條件下生長可減毒或滅活細(xì)菌和病毒。免疫原的化學(xué)修飾可包括免疫原的甲?；⒓谆?，乙酰化或自身交聯(lián)或與其它修飾劑交聯(lián)。
免疫原不必以純的形式才有效。為了保證特定表位或多個(gè)表位的最佳機(jī)會以及免疫應(yīng)答具體類型(體液與細(xì)胞)的最佳機(jī)會，可進(jìn)一步純化或合成免疫原。例如，共價(jià)附著于蛋白質(zhì)上的小的化合物可用于刺激對選定表位特異性的體液應(yīng)答。另一方面，可尋求分別經(jīng)過呈遞到第I類或第II類主要組織相容性復(fù)合物上刺激特定T細(xì)胞類型，例如細(xì)胞毒性細(xì)胞或輔助細(xì)胞的肽，這對于抗原加工和呈遞領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的。
VI.實(shí)施例下面實(shí)施例說明了本發(fā)明裝置的制備和使用。這些實(shí)施例并不打算限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1含白細(xì)胞毒素的雙相脂小泡的制備A、脂類成份的制備將脂成份，氫化磷脂酰膽堿(Phospholipon 90HTM，NattermanGmbH，德國)和膽甾醇以表1所示的量與丙二醇混合且混合時(shí)加熱到大約65-75℃之間。
B、水包油乳劑的制備經(jīng)過將表面活性劑亞油酰氨基丙基丙二醇—氯化二monium磷酸鹽(Phospholipid EFATM，Mona Industries Inc.，Patterson，NJ)羥苯甲酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯以表1所示量在蒸餾水中混合制備水包油乳劑。
在一個(gè)分離的容器中，將親脂成份橄欖油，甘油單硬脂酸酯，鯨蠟醇和合成蜂蠟混合在一起。
將水相和油相在高壓勻漿機(jī)(H-5000 Laboratories HomogenizerMicrofluidic Corp.)中以40psi混合20分鐘。肉眼可見，乳劑是具有水稠度的乳狀溶液。
C、雙相脂小泡形成將脂成份和水包油乳劑以50-300rpm經(jīng)渦旋或螺旋漿混合在一起。
表1
實(shí)施例2經(jīng)皮裝置的制備按如下所述用如下材料制備經(jīng)皮裝置。
背襯層從熱密封的聚酯膜ScotchpakTM1009(3M公司，St Paul，MN)上剪下使直徑為18mm。
將具有外徑為18mm，內(nèi)徑為10mm的藥用級轉(zhuǎn)移粘合劑(3M公司，#9871)圓環(huán)片貼到背襯層上。
從轉(zhuǎn)移粘合劑上取下可剝離離型紙并用外徑為18mm，內(nèi)徑為10mm的泡沫環(huán)(ARCare 7298 Medical Foam，Adhesives Research，Inc.，Clen Rock，PA)固定在粘合劑覆蓋的背襯層。不與背襯層接觸的環(huán)邊緣用醫(yī)用級粘合劑覆蓋。
用60mg雙相脂小泡懸液填充藥貼，其中該小泡含50μg或100μg白細(xì)胞毒素且按實(shí)施例1所述制備。
填充后，將PeCapTM膜(3M公司的聚酯HCT-51)剪成具有12mm外徑的盤片，并貼到泡沫環(huán)的邊緣。
將18mm可剝離離型紙圓片(3M公司#1022)貼到藥貼的皮膚側(cè)。
該裝置具有18mm外徑，活性傳遞區(qū)域?yàn)?.8mm2。
實(shí)施例3經(jīng)皮施用來自雙相脂小泡的白細(xì)胞毒素在6-8周齡的雌性Balb/c小鼠上試驗(yàn)按實(shí)施例2所述制備的裝置(動物資源中心(Saskatchewan大學(xué)))。經(jīng)過吸入鹵烷(MTCPharmaceuticals，Cambridge，Ontario)麻醉小鼠，用電動剃須刀去掉背部區(qū)域毛發(fā)。剃毛24小時(shí)后將含疫苗配制品的藥貼貼到去毛的皮膚上并用塑料繃帶固定藥貼，藥貼固定3天。在第21天重復(fù)免疫，10天后給動物放血，按如下所述分析血清中白細(xì)胞毒素特異性的抗體滴度。
經(jīng)ELISA測定白細(xì)胞毒素特異性的抗體滴度。用溶于碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的純化的白細(xì)胞毒素(0.05μg/孔)覆蓋96-孔平板(Immulon2；Dynatech Laboratories，Alexandria，VA)。平板在4℃培養(yǎng)過夜，然后在含0.5％明膠的PBS-T中洗滌4次。在PBS-T中制備4倍稀釋的小鼠血清并分配成200μl體積。培養(yǎng)平板1小時(shí)并洗滌。1/5,000稀釋的親和純化的馬抗小鼠IgG(H&L)-生物素綴合物(Vector Laboratories Inc.，Toronto，Ontario)用作檢測抗體。培養(yǎng)2小時(shí)及隨后洗滌4次后，在室溫下加入在PBS-T(含0.5％明膠)中的1/10,000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白—堿性磷酸酶(BIO/CAN)1小時(shí)。Di(Tris)對硝基苯基磷酸鹽(PNPP，Sigma化學(xué)公司，St，Louis，MO)用作生色底物。10分鐘后在405nm(Bio-Rad，Richmond，CA)下閱讀吸光率。
結(jié)果在圖4中顯示，其中顯示了用對照藥貼(藥貼貯藥器中含安慰劑雙相脂小泡)處理的動物和用含有包埋于雙相脂小泡中的50μg或100μg白細(xì)胞毒素的藥貼處理的動物在405nm下的光密度。
實(shí)施例4脾細(xì)胞對白細(xì)胞毒素的增生反應(yīng)從未免疫的和免疫的小鼠中無菌取出脾臟并撕破通過尼龍篩。使用TRIS緩沖的氯化銨(0.75％)在1分鐘裂解步驟中去掉大多數(shù)的紅細(xì)胞。具核的脾細(xì)胞洗滌2次并隨后重懸于培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)基由補(bǔ)充有100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(Sigma化學(xué)公司)，2mM L-谷氨酰胺(Gibco-Life Technologies)，100μm非必需氨基酸(Gibco-Life Technologies)，1mM HEPES(Gibco-LifeTechnologies)和5×10-5M 2-巰基乙醇(Sigma化學(xué)公司)的AIM-V(Gibco-Life Technologies，Burlington，Canada)組成。
A.增生2×10-5個(gè)脾細(xì)胞以100μl體積分配進(jìn)微滴板的孔中。將各種濃度的白細(xì)胞毒素抗原以100μl體積一式三份加入各孔中。培養(yǎng)3天后，用0.4μCi/孔濃度的[3H]胸苷(Amersham，Oakville，Canada)標(biāo)記細(xì)胞。18小時(shí)后收獲細(xì)胞，經(jīng)液閃計(jì)數(shù)評價(jià)胸苷的摻入。表示為刺激指數(shù)(有抗原時(shí)每分鐘的計(jì)數(shù)/無抗原時(shí)每分鐘的計(jì)數(shù))的增生反應(yīng)在圖5中顯示。
實(shí)施例5分泌白細(xì)胞介素-4(IL-4)的脾細(xì)胞的定量按以前所述(Czerkinsky等，1988)使用白細(xì)胞介素-4特異性的ELISPOT試驗(yàn)。簡單地說，在37℃下5％CO2中，在有或無白細(xì)胞毒素(0.5μg/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)脾細(xì)胞。洗滌細(xì)胞2次并以合適的濃度重懸于培養(yǎng)基中。在環(huán)境溫度下用在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中稀釋的2μg/ml純化的抗小鼠白細(xì)胞介素-4(IL-4)(11B11，Pharmingen，San Diego，CA)包被硝酸纖維素平板(Miuipore Multiscreen-HA；Miuipore，Bedford MA)2小時(shí)。經(jīng)過在含0.05％Tween 20(Sigma Chemical Co.)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(PBS-T)中洗滌一次并用PBS洗滌3次去掉未結(jié)合的抗體。隨后在培養(yǎng)基中封閉2小時(shí)。傾去培養(yǎng)基并以一式三份向孔中加入100μl的各細(xì)胞懸液。培養(yǎng)過夜后，在冷的PBC-T中洗平板以去掉所有細(xì)胞。
使用在0.1％BSA/PBS中稀釋到3μg/ml濃度的生物素標(biāo)記的對小鼠IL-4特異性的抗體(BVD5-24G2，Pharmingen)完成對IL-4的夾心ELISA。向各孔中加入100μl各懸液并在環(huán)境溫度下培養(yǎng)2-4小時(shí)。在PBS-T中洗滌平板3次。制備在0.1％BSA/PBS中1/1000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白—堿性磷酸酶(BIO/CANScientific，Mississauga，Ontario，Canada)并分配成100μl體積。在環(huán)境溫度下培養(yǎng)2小時(shí)，隨后在PBS中連續(xù)洗滌8次。按如下制備底物將5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)(Sigma Chemical Co.)溶于二甲基甲酰胺(Sigma化學(xué)公司)得到14mg/ml至15mg/ml的濃度，將1.5mg加入到10ml含3mg氮藍(lán)四唑(NBT)(sigma化學(xué)公司)的15mM硼酸鹽緩沖液(pH9.8)中。加入氯化鎂至5mM濃度。過濾底物且向每孔中加入100μl體積，在室溫培養(yǎng)10-60分鐘，在蒸餾水中洗滌平板，并隨后空氣干燥。使用解剖顯微鏡計(jì)數(shù)代表過夜培養(yǎng)期間脾細(xì)胞分泌IL-4的位置的斑點(diǎn)。結(jié)果在圖6中作布點(diǎn)圖，其中數(shù)值表示為每5×105個(gè)細(xì)胞中染色斑陽性的數(shù)目。
結(jié)果表示為從4只小鼠合并的脾細(xì)胞的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差，且反映了分泌白細(xì)胞介素-4的細(xì)胞的活化。白細(xì)胞介素-4也稱為B-細(xì)胞生長因子-1，它是T-細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，觸發(fā)抗原引發(fā)的B-細(xì)胞增生。IL-4不僅刺激B-細(xì)胞的增生，而且增強(qiáng)MHC-II型在抗原呈遞細(xì)胞表面的表達(dá)以及T-細(xì)胞的細(xì)胞毒性活力的激活。
實(shí)施例6制備含有包埋于雙相脂小泡中的雞蛋溶菌酶的經(jīng)皮裝置根據(jù)實(shí)施例1的方法將雞蛋溶菌酶(Sigma，St.Louis，Mo)配制在雙相脂小泡中。制備5種不同的雙相脂小泡，本文稱為配制品I-V號，在脂小泡脂雙層中包含氫化磷脂酰膽堿(PhospholiponTM90H)和膽甾醇。配制品的區(qū)別主要在于水包油乳劑的組成，各配制品包含20mg/ml雞蛋溶菌酶。
經(jīng)皮用藥貼按實(shí)施例2所述制備，且用60mg的一種配制品填充以獲得每片藥貼100μg劑量的雞蛋溶菌酶。
實(shí)施例7雞蛋溶菌酶的經(jīng)皮用藥雌性Balb/c小鼠為6-8周齡，且由動物資源中心(Saskatchewan大學(xué))提供。經(jīng)過吸入鹵烷(MTC Pharmaceuticals，Cambridge，Ontarto)麻醉小鼠，用電動剃須刀在背部去毛。將含不同雙相脂小泡疫苗配制品I-V號的藥貼(實(shí)施例6)貼到去毛的皮膚上，用塑料繃帶固定和保護(hù)住，以3周的間隙免疫動物2次并在最后一次免疫10天后將動物安樂處死以評價(jià)對雞蛋溶菌酶的免疫應(yīng)答。對于每次免疫，使用新鮮制備的藥貼并貼3天。
經(jīng)ELISA測定對雞蛋溶菌酶特異性的抗體滴度。用在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中的純化的雞蛋溶菌酶(0.05mg/孔)包被96孔平板(Immulon2；Dynatech Laboratories Inc.，Alexandria，VA)。平板在4℃培養(yǎng)過夜然后在含0.5％明膠的PBS-T中洗滌4次。在PBS-T中制備4倍稀釋的小鼠血清并分配成200μl體積。將平板培養(yǎng)1小時(shí)并洗滌。使用1/5000稀釋的親和純化的馬抗小鼠IgG(H&L)-生物素綴合物(Vector Laboratories Inc.，Toronto，Ont)作為檢測抗體。培養(yǎng)2小時(shí)并隨后進(jìn)行4次洗滌后，在室溫下加入在PBS-T(含0.5％明膠)中1/10,000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白—堿性磷酸酶(BIO/CAN)1小時(shí)。Di(Tris)對硝基苯基磷酸酯(PNPP，Sigma)用作生色底物。10分鐘后在405nm下讀吸光率(BIO-RAO，Richmond，CA)。結(jié)果在圖7中顯示。
實(shí)施例8定量分泌IL-4和INF-γ的脾和淋巴細(xì)胞從未處理過的和免疫過的小鼠中無菌摘取脾臟并撕破使通過尼龍篩，使用TRIS緩沖的氯化銨(0.75％)在1分鐘的裂解步驟中去掉大多紅細(xì)胞。洗滌細(xì)胞2次并隨后重懸于培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)基由補(bǔ)充了100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(Sigma化學(xué)公司，St Louis，Missouri)，2mM L-谷氨酰胺(Gibco，LifeTechnologies)，100μM非必需氨基酸(Gibco，Life Technologies)，和5×10-5M 2-巰基乙醇(Sigma化學(xué)公司)的AIM-V(Gibco，LifeTechnologies，Burlington，Canada)組成。
ELISPOT試驗(yàn)用于定量分泌白細(xì)胞介素-4(IL-4)和干擾素-γ(IFN-γ)的細(xì)胞的頻率。簡單地說，脾細(xì)胞在37℃下5％CO2中在有或無雞蛋溶菌酶(2μg/ml)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。洗滌細(xì)胞2次并以適當(dāng)濃度重懸于培養(yǎng)基中。用在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中稀釋的2μg/ml純化的抗-小鼠IL-4(11B11)或抗小鼠IFN-γ(R4-6A2)(Pharmingen，San Diego，CA)在環(huán)境溫度下包被硝酸纖維素平板(Millipore Multiscreen-HA；Millipore，Bedfood，MA)2小時(shí)。經(jīng)過在含0.05％Tween20(Sigma公司)的磷酸鹽緩沖液(PBS)(PBS-T)中洗滌1次并用PBS洗滌3次去掉未結(jié)合的抗體。隨后在培養(yǎng)基中封閉2小時(shí)。傾去培養(yǎng)基并以一式三份向孔中加入100μl各細(xì)胞懸液。培養(yǎng)過夜后，在冷的PBS-T中洗滌平板以去掉所有的細(xì)胞。在0.1％BSA/PBS中將對小鼠IL-4(BVD6-24G2)或IFN-γ(XMG1.2)特異性的生物素標(biāo)記的抗體(Pharmingen)稀釋成3μg/ml的濃度。向各孔中加入100μl各懸液并在環(huán)境溫度下培養(yǎng)2-4小時(shí)。平板在PBS-T中洗滌3次，制備在0.1％BSA/PBS中1/1000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白—堿性磷酸酶(BIO/CAN Scientific，Mississawga，Ont，Candda)并分配成100μl體積。在環(huán)境溫度下培養(yǎng)2小時(shí)，隨后在PBS中連續(xù)洗滌8次。按下述制備底物將5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)(Sigma化學(xué)公司)溶于二甲基甲酰胺(Sigma化學(xué)公司)以達(dá)到15mg/ml濃度，將1.5mg加入含3mg氮藍(lán)四唑(NBT)(Sigma化學(xué)公司)的10ml 15mM硼酸鹽緩沖液(pH9.8)中。加入氯化鎂至5mM濃度。過濾底物且向孔中加入100μl體積在室溫下培養(yǎng)10-60分鐘。在蒸餾水中洗滌平板并隨后空氣干燥。使用解剖顯微鏡計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。數(shù)值表示為每5×105個(gè)細(xì)胞染色斑點(diǎn)陽性的數(shù)目且在圖8A-8D中顯示。
盡管本發(fā)明針對具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但在不偏離本發(fā)明的前提下做出各種改變和修飾對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.一種用于經(jīng)皮施用免疫原以在個(gè)體中誘發(fā)針對免疫原的免疫應(yīng)答的組合物，包含一種具有含水包油乳劑的中央核心區(qū)室的雙相脂小泡懸液，和包埋于雙相脂小泡中的一種免疫原。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中免疫原選自來自細(xì)菌、病毒、寄生蟲、植物和真菌來源的抗原。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中免疫原可有效引發(fā)體液免疫應(yīng)答。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中免疫原可有效引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
5.權(quán)利要求1的組合物，它進(jìn)一步包括包埋于脂小泡中的佐劑。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中脂小泡懸液進(jìn)一步包括皮膚穿透增強(qiáng)劑。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中的穿透增強(qiáng)劑選自脂酰化氨基酸和不飽和的脂肪酸。
8.一種用于在個(gè)體中誘發(fā)針對免疫原的免疫應(yīng)答的方法，包括經(jīng)皮給所說的個(gè)體施用一定劑量的所述免疫原，所說的免疫原包埋于具有含水包油乳劑的中央核心區(qū)室的雙相脂小泡中。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的免疫原是細(xì)菌，病毒或真菌來源的抗原。
10.權(quán)利要求8的方法，其中的免疫原可有效誘發(fā)體液免疫應(yīng)答。
11.權(quán)利要求8的方法，其中的免疫原可有效誘發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
12.權(quán)利要求8的方法，它進(jìn)一步包括包埋于脂小泡中的一種佐劑。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所說的脂小泡懸液包含于適于其保存的貯藥器中。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所說的貯藥器由不通透的背襯件和有效用于使所說的脂小泡從所說的貯藥器傳遞的膜所限定。
15.權(quán)利要求8的方法，其中所說的脂小泡懸液進(jìn)一步包括穿透增強(qiáng)劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所說的穿透增強(qiáng)劑選自脂酰化氨基酸和不飽和的脂肪酸。
17.用于給個(gè)體經(jīng)皮施用免疫原的方法，包括，給個(gè)體皮膚貼上一種裝置，所說裝置包括(i)經(jīng)過將水包油乳劑與形成小泡的脂類混合形成的脂小泡懸液，所說的小泡由下述部分組成(a)由所述的小泡形成脂組成的脂雙層外膜，(b)含所述水包油乳劑的中央核心區(qū)室和(c)包埋于所述小泡中的有效誘發(fā)免疫反應(yīng)劑量的免疫原；(ii)適于保持所說的脂小泡懸液且適于從其中釋放脂小泡的貯藥器；和(iii)將該裝置附著到個(gè)體上以經(jīng)皮施用所述免疫原的工具。
18.權(quán)利要求書17的方法，其中所述的貯藥器由不通透的背襯件和有效用于使所述脂小泡從所述貯藥器傳遞的膜限定。
19.權(quán)利要求書17的方法，其中所述的脂小泡懸液包括通透增強(qiáng)劑。
20.權(quán)利要求書19的方法，其中所述的穿透增強(qiáng)劑選自脂?；被岷筒伙柡椭舅?。
21.權(quán)利要求書17的方法，其中所述的用于附著的工具是鄰近所述膜的粘合層。
22.權(quán)利要求書17的方法，它還包括包埋于所述脂小泡中的佐劑。
23.一種用于經(jīng)皮施用免疫原的裝置，包括由水包油乳劑與小泡形成脂類混合形成的脂小泡懸液，所述的小泡由下述成份組成(i)由該小泡形成脂組成的脂雙層外膜，(ii)含該水包油乳劑的中央核心區(qū)室和(iii)包埋于所述小泡中的有效誘發(fā)免疫反應(yīng)劑量的免疫原；適于保持所述懸液且適于從其中釋放脂小泡的貯藥器；和用于將該裝置附著在個(gè)體上以經(jīng)皮施用所述免疫原的工具。
24.權(quán)利要求書23的裝置，其中所述的貯藥器由不通透的背襯件和有效用于使所說的脂小泡從所述貯藥器中傳遞的膜限定。
25.權(quán)利要求書23的裝置，其中所述的的脂小泡懸液包含一種穿透增強(qiáng)劑。
26.權(quán)利要求書23的裝置，其中所述的穿透增強(qiáng)劑選自脂?；被岷筒伙柡偷闹舅?。
27.權(quán)利要求書23的裝置，其中所述的用于附著的裝置是鄰近所述膜的粘合層。
28.權(quán)利要求書23的裝置，還進(jìn)一步包括包埋于所述脂小泡中的一種佐劑。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用于經(jīng)皮經(jīng)皮施用免疫原的組合物。該免疫原包埋于在中央核心區(qū)室具有水包油乳劑的脂小泡中。該小泡經(jīng)皮施用以引發(fā)受試者的免疫應(yīng)答。
文檔編號A61K39/39GK1277551SQ98810498
公開日2000年12月20日 申請日期1998年8月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月29日
發(fā)明者瑪麗安娜·福爾德瓦里, 瑪麗亞·巴卡－埃斯特拉達(dá) 申請人:法瑪?shù)履穼?shí)驗(yàn)室有限公司