專利名稱：壓縮的eb病毒復(fù)制子的制作方法
背景技術(shù)：
EB病毒是一種人皰疹病毒，具有以環(huán)狀病毒DNA的穩(wěn)定的游離型增殖為特征的潛伏期。有兩個不連續(xù)DNA元件為潛伏期復(fù)制所必需復(fù)制的順式作用起點OriP，以及復(fù)制所需的唯一由病毒編碼的蛋白EB核抗原1(EBNA1)(Yates et a1.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA813806-10，1984；Yates et al.Nature 313812-5，1985)。 由于EBNAl及OriP鏈段的巨大的尺寸，多數(shù)EBV載體十分巨大，約為10KB或更大(不含插入片段)。多數(shù)現(xiàn)存的EBV EBNA1及OriP的尺寸妨礙了可以包含于其他基因遞送載體，如反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒的改良表達(dá)載體的建立，以及壓縮的基因表達(dá)和持續(xù)盒的構(gòu)建。
發(fā)明簡述大體上，本發(fā)明以支持在哺乳動物細(xì)胞中游離復(fù)制的核酸序列為特征。核酸序列包含(a)經(jīng)缺失的OriP序列和(b)經(jīng)缺失的EBNA1序列，它們可操作地連接到啟動子上，核酸序列的長度小于3KB，優(yōu)選小于2KB，最優(yōu)選小于1.8KB。
優(yōu)選實施方案中，OriP序列大約包含SEQ ID NO1的1-495位殘基；EBNA1大約包含SEQ ID NO1的627-1718位殘基；核酸序列還包含多腺苷化共有序列(如，接近SEQ ID NO2序列)；且啟動子為病毒啟動子。
在相關(guān)方面，本發(fā)明還以包含這一核酸序列的載體和細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞)為特征。
詳述首先描述附圖。


圖1是截短的EBV OriP和EBNA-1盒的序列。
圖2是可用于與壓縮EBV復(fù)制子相連的壓縮的合成雙向多腺苷化序列。
大量缺失和突變后，發(fā)現(xiàn)可能將EBV病毒游離復(fù)制所必需的順式和反式作用元件嵌入小于2KB的片斷中。特別是，圖1所示用作壓縮EBV復(fù)制子的1748bp的例舉性片段(SEQ ID NO1)。除多腺苷化共有序列之外，該片段含有有效表達(dá)EBNA-1蛋白所必需的所有序列。該片段是一Bg12 BamH1鏈段，在殘基1-495含有OriP元件，在殘基496-616含有來自單純皰疹病毒1胸苷激酶的修飾的啟動子，在殘基627-1718含有經(jīng)缺失和修飾的EBNA-1編碼序列?；谠撔蛄械馁|(zhì)粒載體以游離基因的形式在非嚙齒來源的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的核中復(fù)制(Yates等，1985，見上文)。
為從整體上使序列長度最小化，上述片段被設(shè)計插入到合適載體的雙向多腺苷化序列的上游。圖2中提供了壓縮的合成雙向多腺苷化序列(SEQ ID NO2)。發(fā)現(xiàn)壓縮EBV復(fù)制子可用于基因治療載體，如，基因遞送載體如表達(dá)載體。
其他實施方案包含于權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種核酸序列，它在哺乳動物細(xì)胞中支持游離基因復(fù)制，所述核酸序列包括(a)OriP序列和(b)EBNA1序列，它們可操作地連接到啟動子上，所述核酸序列之長度小于3kb。
2.權(quán)利要求1的核酸序列，所述核酸長度小于2kb。2a.權(quán)利要求1的核酸序列，所述核酸長度小于1.8kb。
3.權(quán)利要求1的核酸序列，其中所述OriP序列大約包含SEQ IDNO1的1-495位殘基。
4.權(quán)利要求1的核酸序列，其中所述EBNA1序列大約包含SEQ IDNO1的627-1718位殘基。
5.權(quán)利要求1的核酸序列，其中所述核酸序列還包含多腺苷化共有序列。
6.權(quán)利要求5的核酸序列，其中所述多腺苷化序列大約包含SEQID NO2。
7.權(quán)利要求1的核酸序列，其中所述啟動子是一病毒啟動子。
8.包含權(quán)利要求1的核酸序列的載體，所述載體能以游離基因形式在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的核中復(fù)制。
9.包含權(quán)利要求1的核酸序列的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了支持在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行游離復(fù)制的核酸序列。該核酸序列長度小于3kb,包括(a)經(jīng)缺失的OriP序列,和(b)經(jīng)缺失的EBNA1序列,它們可操作地與啟動子相連。
文檔編號A61K35/76GK1278185SQ98810816
公開日2000年12月27日 申請日期1998年4月14日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月19日
發(fā)明者B·塞德 申請人:綜合醫(yī)院公司