專利名稱：人HsgⅢ基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的多肽、編碼這些多肽的多核苷酸和這些多核苷酸和多肽在治療和可能可以用于治療的其激動劑、拮抗劑和／或抑制劑化合物的鑒定中的用途以及這些多肽和多核苷酸的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
尋找藥物的方法正經(jīng)歷著根本性的變化，新的方法中包括“功能基因組學”，即基于基因組或基因的高流通量生物學。該方法正在迅速取代原來基于“位置克隆”的方法。首先鑒定表現(xiàn)為生物功能或遺傳病的表型，然后根據(jù)其遺傳圖譜位置逆向?qū)ふ矣嘘P(guān)基因。
功能基因組學主要依賴各種生物信息學工具，由現(xiàn)有的多個分子生物學數(shù)據(jù)庫中鑒定可能的目的基因序列。這就需要不斷鑒定和表征其他基因及其相關(guān)多肽／蛋白質(zhì)，作為尋找藥物的靶。
本發(fā)明的肽還包括以下分離的多肽，其氨基酸序列與序列2的整個氨基酸序列的同一性為至少70％，優(yōu)選同一性為至少80％，更優(yōu)選同一性為至少90％，更加優(yōu)選同一性為至少95％，最優(yōu)選同一性為至少97—99％。這些多肽還包括序列2的多肽。
本發(fā)明的多肽還包括由含有序列1的多核苷酸編碼的分離多肽。
據(jù)信本發(fā)明的多肽是分泌粒蛋白多肽家族的成員。它們引起人們的關(guān)注是因為人HsgⅢ基因是使用EST測序克隆自正常垂體。該基因與其他生物中的配偶體高度類似，可能在信號傳導中起作用，并參與分泌途徑。這些特性以下稱為“NPCABC08活性”或“NPCABC08多肽活性”或“NPCABC08生物活性”。這些活性還包括所述NPCABC08多肽的抗原和免疫原活性，特別是序列2的多肽的抗原和免疫原活性。優(yōu)選，本發(fā)明的多肽具有至少一種NPCABC08的生物活性。
本發(fā)明的多肽可以是“成熟”蛋白的形式，也可以是較大蛋白如融合蛋白的一部分。通常包括附加氨基酸序列較為有利，附加氨基酸序列包括分泌或前導序列，原序列，幫助純化的序列如聚組氨酸殘基，或重組生產(chǎn)過程中有助于穩(wěn)定的附加序列。
本發(fā)明也包括上述多肽的變體，即參照物中保守氨基酸發(fā)生置換的多肽，保守置換是指一個殘基被具有類似特性的其他氨基酸殘基置換。典型的這種置換包括Ala，Val，Leu和IIe之間的置換；Ser和Thr之間的置換；酸性殘基Asp和Glu之間的置換；Asn和Gln之間的置換；堿性殘基Lys和Arg之間的置換；或芳香族殘基Phe和Tyr之間的置換。特別優(yōu)選的是其中置換、缺失或增加幾個、5—10個、1—5個、1—3個、1—2個或1個氨基酸或這些方式的組合的變體。
本發(fā)明的多肽可以通過任何合適的方式制備。這些多肽包括分離的天然存在的多肽，重組生產(chǎn)的多肽，合成生產(chǎn)的多肽，或這些方法組合生產(chǎn)的多肽。制備這些多肽的方法在本領(lǐng)域廣為人知。
本發(fā)明另一方面涉及NPCABC08多核苷酸。這些多核苷酸包括含有以下核苷酸序列的分離多核苷酸，所述核苷酸序列編碼的多肽與序列2的整個氨基酸序列的同一性為至少70％，優(yōu)選同一性為至少80％，更優(yōu)選同一性為至少90％，更加優(yōu)選同一性為至少95％。多肽同一性為至少97％是高度優(yōu)選的，多肽同一性為至少98—99％更高度優(yōu)選，多肽同一性為至少99％是最優(yōu)選的。這些多核苷酸包括含有編碼序列2的多肽的序列1中的核苷酸序列的多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸還包括含有以下核苷酸序列的分離的多核苷酸，上述核苷酸序列與編碼序列2多肽的核苷酸序列整個編碼區(qū)的同一性為至少70％，優(yōu)選同一性為至少80％，更優(yōu)選同一性為至少90％，更加優(yōu)選同一性為至少95％。同一性為至少97％的多核苷酸是高度優(yōu)選的，同一性為至少98—99％的多核苷酸更高度優(yōu)選，同一性為至少99％的多核苷酸是最優(yōu)選的。
本發(fā)明的多核苷酸還包括含有以下核苷酸序列的分離的多核苷酸，上述核苷酸序列與序列1的整個核苷酸序列的同一性為至少70％，優(yōu)選同一性為至少80％，更優(yōu)選同一性為至少90％，更加優(yōu)選同一性為至少95％。同一性為至少97％的多核苷酸是高度優(yōu)選的，同一性為至少98—99％的多核苷酸更高度優(yōu)選，同一性為至少99％的多核苷酸是最優(yōu)選的。這些多核苷酸包括含有序列1的多核苷酸的多核苷酸和序列1的多核苷酸。
本發(fā)明也提供上述多核苷酸的互補多核苷酸。
序列1的核苷酸序列與小鼠分泌粒蛋白Ⅲ(SgⅢ)mRNA同源(A．Dopazo，J．Mo1．Neurosei．1993；4225—233)。序列1的核苷酸序列為eDNA序列，含有一個多肽編碼序列(核苷酸286—1689)，編碼序列2的468氨基酸的多肽。編碼序列2多肽的核苷酸序列可以與序列1中的多肽編碼序列相同，或者不同，而是由于遺傳密碼的豐余(簡并)形成的，但也編碼序列2的多肽。序列2的多肽結(jié)構(gòu)上與分泌粒蛋白Ⅲ(SgⅢ)家族的其他蛋白相關(guān)，與小鼠分泌粒蛋白Ⅲ(SgⅢ)mRNA具有同源性和／或結(jié)構(gòu)相似性(A．Dopazo，J．Mol．Neurosci．1993；4225—233)。
預期本發(fā)明優(yōu)選的多肽和多核苷酸具有其同源多肽和多核苷酸類似的生物功能／特性。并且，本發(fā)明的優(yōu)選多肽和多核苷酸具有至少一種NPCABC08活性。
本發(fā)明的多核苷酸可以通過標準克隆和篩選技術(shù)從cDNA文庫中獲得，該文庫使用表達序列標記(EST)分析由正常人垂體細胞的mRNA衍生(Adams，M．K．，et a1．，Science(1991)2521651—1656；Adams，M．D．，eta1．，Nature，(1992)355632—634；Adams，M．D．，et al．，Nature(1995)377Supp3—174)。本發(fā)明的多核苷酸也可以來自天然來源如基因組DNA文庫，或可以使用眾所周知的市售技術(shù)合成。
當本發(fā)明的多核苷酸用于重組生產(chǎn)本發(fā)明的多肽時，該多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列本身；成熟多肽編碼序列與其他編碼序列框內(nèi)融合的序列，其他編碼序列例如前導或分泌序列、前或原或前原蛋白序列或其他融合肽部分的編碼序列。例如可以編碼幫助融合多肽純化的標記序列。在本發(fā)明這一方面的一些優(yōu)選實施方案中，標記序列是6—組氨酸肽或HA標記，前者以pQE載體提供(Qiagen，Inc．)，有關(guān)論述參見Gentz et al．，Proc Natl Acad Sci USA(1989)86821—824。多核苷酸也可以含有非編碼的5′或3′序列，如轉(zhuǎn)錄、非翻譯序列，剪切和聚腺苷酸化信號，核糖體結(jié)合位點和穩(wěn)定mRNA的序列。
本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案包括編碼多肽變體的多核苷酸，所述變體包括序列2的氨基酸序列(序列2)，其中置換、缺失或增加幾個、5—10、1—5、1—3、l—2或1個氨基酸殘基或是這些方式的組合。
本發(fā)明的多核苷酸與序列1的核苷酸序列等同或足夠等同，因此可以用作cDNA和基因組DNA的雜交探針或核酸擴增(PCR)反應的引物，以分離編碼本發(fā)明多肽的全長cDNA和基因組克隆，也可以分離與序列1具有高序列相似性的其他基因(包括編碼除人以外的物種的同源物和直向同源物的基因)的cDNA和基因組克隆。一般這些核苷酸序列與參照物序列的同一性為70％、優(yōu)選同一性為80％，更優(yōu)選同一性為90％，最優(yōu)選同一性為95％。探針或引物一般包括至少15個核苷酸，優(yōu)選至少30個核苷酸，也可以包括至少50個核苷酸。特別優(yōu)選的探針為30到50個核苷酸。
獲得編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸包括除人以外的物種的同源物或直向同源物的方法包括以下步驟用具有序列1或其片段的標記探針在嚴緊雜交條件下篩選合適的文庫；分離含有所述多核苷酸序列的全長cDNA和基因組克隆。這些雜交技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選的嚴緊雜交條件包括在如下溶液中42℃溫育過夜，然后在約65℃用0．1×SSC洗滌濾膜，所述溶液包括50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7．6)，5×Denhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg／ml變性剪切的鮭精DNA。因此，本發(fā)明也包括通過用具有序列1或其片段的序列的標記探針在嚴緊雜交條件下篩選合適的文庫獲得的多核苷酸。
技術(shù)人員可以認識到，在多種情況下，分離的cDNA序列是不完整的，其中編碼多肽的區(qū)域在cDNA的5′末端被切短。這是由于逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，該酶本身具有較低的持續(xù)合成能力(聚合反應過程中酶保持附著于模板的能力的度量)，在第1條cDNA鏈合成過程中不能獲得mRNA模板的完整DNA拷貝。
獲得全長cDNA或延長短cDNA的方法現(xiàn)有幾種是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如基于cDNA末端快速擴增(RACE)法的方法(參見例如Frohman et al．，PNAS USA 85，8998—9002，1988)。最新的技術(shù)改進如MarathonTM技術(shù)(Clonteeh Laboratories Inc．)大大簡化了長鏈cDNA的搜尋工作。在MarathonTM技術(shù)中，由自選定組織抽提的mRNA制備cDNA，在其兩端連接“銜接子”序列。然后使用基因特異性和銜接子特異性的寡核苷酸引物組合進行核酸擴增(PCR)，擴增cDNA“缺失”的5′端。使用“嵌套”引物重復PCR反應，所謂嵌套引物是指設計成在擴增產(chǎn)物內(nèi)退火的引物(通常為在銜接子序列3′下游退火的銜接子特異性引物和在已知基因序列5′上游退火的基因特異性引物)。通過DNA測序分析該反應產(chǎn)物，將該產(chǎn)物直接與現(xiàn)有cDNA連接獲得完整序列，或使用新序列信息設計5′引物另外進行全長PCR，從而構(gòu)建全長cDNA。
本發(fā)明的重組多肽可以通過本領(lǐng)域已知的方法由含有表達系統(tǒng)的遺傳工程改造的宿主細胞制備。因此，本發(fā)明另一方面涉及含有本發(fā)明的一個或多個多核苷酸的表達系統(tǒng)，經(jīng)遺傳工程改造含有本發(fā)明表達系統(tǒng)的宿主細胞，和通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。利用衍生自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA，無細胞翻譯系統(tǒng)可用來生產(chǎn)這些蛋白。
為進行重組生產(chǎn)，宿主細胞可以經(jīng)遺傳工程改造含有本發(fā)明多核苷酸的表達系統(tǒng)或其部分。將多核苷酸導入宿主細胞可以通過多種標準實驗手冊中所述的方法實現(xiàn)，所述實驗手冊如Davis et al．，《分子生物學基本方法》(1986)和Sambrook et al．，《分子克隆實驗室手冊》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N．Y．(1989)。優(yōu)選的這些方法包括例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE—葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位、微注射、陽離子脂介導的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導、摩擦轉(zhuǎn)化、粒子轟擊或感染。
合適宿主的代表性實例包括細菌細胞，如鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈霉菌和枯草桿菌細胞；真菌細胞，如酵母細胞和曲霉細胞；昆蟲細胞，如果蠅S2和草地夜蛾Sf9細胞；動物細胞，如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK 293和Bowes melanoma細胞；以及植物細胞。
可使用多種表達系統(tǒng)，這些表達系統(tǒng)包括染色體、附加體和病毒衍生的系統(tǒng)等，例如衍生自細菌質(zhì)粒、細菌噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒的載體，和衍生自上述元件組合的載體，所述病毒包括桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，組合載體如衍生自質(zhì)粒和細菌噬菌體遺傳元件、粘粒和噬菌粒的載體。表達系統(tǒng)可以含有調(diào)節(jié)和啟動表達的控制區(qū)。一般來說，任何適于在宿主中維持、增殖或表達多核苷酸生成多肽的系統(tǒng)或載體均可使用。合適的核苷酸序列可以通過多種已知的常規(guī)技術(shù)插入到表達系統(tǒng)中，所述技術(shù)可參見例如Sambrook et al．，《分子克隆實驗室手冊》第2版(同上)。為了翻譯的蛋白可以分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)、周質(zhì)空間或胞外環(huán)境，可以向所需的多肽上加入合適的分泌信號。這些信號可以是多肽內(nèi)源的，也可以是外源分泌信號。
如果本發(fā)明的多肽要表達用于篩選試驗，一般優(yōu)選多肽在細胞表面生成。在這種情況下，細胞可以在用于篩選試驗之前收獲。如果該多肽分泌到培養(yǎng)基中，可以回收培養(yǎng)基以回收和純化多肽；如果在細胞內(nèi)生成，細胞首先要裂解，然后回收多肽。
本發(fā)明的多肽可以通過已知方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸抽提，陰離子或陽離子交換色譜，磷酸纖維素色譜，疏水相互作用色譜，親和色譜，羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。最優(yōu)選高效液相色譜用于純化。如果多肽在分離或純化過程中變性，已知的重折疊蛋白的方法可用于恢復活性構(gòu)象。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽作為診斷試劑的應用。檢測特征在于與功能障礙相關(guān)的序列1多核苷酸的基因的突變形式可以提供一種診斷工具，這可以增加或限定一種由于該基因的表達不足、表達過量或表達異常產(chǎn)生的疾病或疾病易感性的診斷。該基因中攜帶突變的個體可以通過多種技術(shù)在DNA水平上檢測出來。
診斷核酸可以獲自受試者細胞，如血、尿、唾液、組織活檢樣品或尸檢材料。基因組DNA可以直接用來檢測，或在分析之前使用PCR或其他擴增技術(shù)酶促擴增。RNA或cDNA可以類似方式使用。缺失和插入可以通過與正常基因型相比擴增產(chǎn)物的大小變化檢測。點突變可以通過將擴增DNA與標記的NPCABC08核苷酸序列雜交來鑒別。完全匹配的序列可以通過RNA酶消化或融解溫度上的差異與錯配雙鏈區(qū)分。DNA序列差異也可以通過DNA片段在加入或不加變性劑的凝膠上的電泳遷移率或直接DNA測序來檢測(可參見例如Myers et al．，Science(1985)2301242)。在特定位置的序列變化也可以通過核酸酶保護試驗如RNA酶和S1保護法或化學切割法來顯示(可參見Cotton et al．，PNASUSA(1985)854397—4401)。在另一個實施方案中，可以構(gòu)建含有NPCABC08核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針陣列(array)，以便進行例如基因突變的有效篩選。陣列技術(shù)方法廣為人知，適用性廣泛，可用來解決分子遺傳學中的多種問題，包括基因表達，遺傳連鎖和遺傳變異性。(參見例如M．Chee et al．，Science，Vol．274，pp610—613(1996)。
診斷試驗通過利用上述方法檢測NPCABC08基因的突變，提供了診斷或確定對本發(fā)明限定疾病的易感性的方法。此外，這些疾病可以通過以下方法診斷確定來自受試者樣品中的多肽或mRNA的水平異常降低或增加。表達降低或增加可以使用核苷酸定量領(lǐng)域已知的任何方法在RNA水平上確定，所述方法例如核酸擴增，包括PCR、RT—PCR、RNA酶保護、RNA印跡和其他雜交方法?？捎糜诖_定來自宿主的樣品中的蛋白如本發(fā)明多肽的水平的試驗技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些試驗方法包括放射免疫試驗、競爭結(jié)合試驗、蛋白印跡分析和ELISA試驗。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及包括以下成分的診斷藥盒(a)本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選序列1的核苷酸序列，或其片段；(b)與(a)中核苷酸互補的核苷酸序列；(c)本發(fā)明的多肽，優(yōu)選序列2的多肽，或其片段；(d)本發(fā)明多肽的抗體，優(yōu)選序列2的多肽的抗體。
應當理解，在這種藥盒中，(a)，(b)，(c)或(d)可以包括一種主要成分(substantial component)。這種藥盒可用于診斷疾病或?qū)膊〉囊赘行裕黾膊√貏e是癌癥、白血病、糖尿病、腎病、自身免疫病等。
本發(fā)明的核苷酸序列對染色體鑒定也有價值。該序列可以特異靶向一個個體染色體上的特定位置并可與其雜交。根據(jù)本發(fā)明染色體相關(guān)序列的作圖是將這些序列與疾病相關(guān)的基因聯(lián)系起來的重要的第一步。一旦序列已經(jīng)被定位在具體的染色體位置，該序列在染色體上的物理位置可以與遺傳圖譜數(shù)據(jù)聯(lián)系起來。這些數(shù)據(jù)可參見例如V．McKusick，《人類的孟德爾遺傳》(由Johns Hopkins University Welch Medical Library在線獲得)。定位在同一染色體區(qū)域的基因和疾病之間的關(guān)系可以通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)確定。
受影響和正常個體中cDNA或基因組序列的差異也可以確定。如果在某些或全部受影響個體中觀察到某一突變，而在正常個體中未觀察到該突變，則該突變可能是疾病的病因。
本發(fā)明的多肽或其片段或類似物或表達它們的細胞也可用作免疫原，生成對本發(fā)明的多肽免疫特異性的抗體?！懊庖咛禺愋缘摹痹诒绢I(lǐng)域中表示對本發(fā)明多肽的親和力明顯大于對本領(lǐng)域其他相關(guān)多肽的親和力。
針對本發(fā)明的多肽的抗體可以通過常規(guī)方法向動物優(yōu)選非人類的動物給藥多肽或含表位片段、類似物或細胞獲得。為了制備單克隆抗體，可以使用提供連續(xù)細胞系培養(yǎng)物生成的抗體的任何技術(shù)。實例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler，G．a(chǎn)nd Milstein，C．，Nature(1975)256495—497)，三瘤(trioma)技術(shù)、人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al．，ImmunologyToday(1983)472)和EBV雜交瘤技術(shù)(Co1e et a1．，《單克隆抗體和癌癥治療》，pp77—96，Alan R．Liss，Inc．，1985)。
生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)如美國專利4，946，778所述的技術(shù)也可以改進后用來生產(chǎn)本發(fā)明多肽的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠或其他有機體包括其他哺乳動物也可以用來表達人源化抗體。
上述抗體也可以用來分離或鑒定表達所述多肽的克隆或純化親和色譜技術(shù)制備的多肽。
抗本發(fā)明多肽的抗體也可以用來治療本發(fā)明限定疾病等。
另一方面，本發(fā)明涉及遺傳工程改造的含有本發(fā)明多肽的可溶性融合蛋白或其片段，和各亞類(IgG，IgM，IgA，IgE)免疫球蛋白重鏈或輕鏈恒定區(qū)的各個部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是人IgG特別是IgG1的重鏈恒定區(qū)部分，其中融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一個具體實施方案中，可以通過加入可被血凝因子Xa切割的切割序列將Fc部分除去。此外，本發(fā)明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，和其在藥物篩選、診斷和治療中的應用。本發(fā)明的另一方面還涉及編碼這些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的實例可以參見國際專利申請WO 94／29458和WO94／22914。
本發(fā)明的其他方面涉及在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，包括用本發(fā)明的多肽免疫接種哺乳動物，產(chǎn)生抗體和／或T細胞應答，從而保護該動物免于本發(fā)明限定疾病等。本發(fā)明的其他方面也涉及在哺乳動物中誘導免疫應答的方法，通過在體內(nèi)指導多核苷酸表達并編碼多肽的載體來給藥本發(fā)明的多肽，以便誘導免疫應答，生成抗體保護動物免于疾病。
本發(fā)明的其他方面涉及免疫原／疫苗制劑(組合物)，將其引入哺乳動物宿主時，可誘導針對本發(fā)明多肽的免疫應答，其中該組合物含有本發(fā)明的多肽或多核苷酸。該疫苗制劑還可以含有合適的載體。因為該多肽在胃中可以被降解，優(yōu)選通過腸胃外途徑給藥(包括皮下、肌肉、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)等注射)。適合胃腸外給藥的制劑包括含水和不含水的無菌注射液，其中可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與受者血液等滲的溶質(zhì)；含水和不含水的無菌懸浮液，其中可以含有懸浮劑或增稠劑。該制劑可以是單劑或多劑容器形式，例如密封安瓿和小瓶，也可以保存在凍干條件下，只需在使用前加入無菌液體載體即可。疫苗制劑也可以含有增強制劑免疫原性的佐劑系統(tǒng)，如水包油系統(tǒng)或本領(lǐng)域已知的其他系統(tǒng)。劑量取決于疫苗的比活性，可以通過常規(guī)試驗方便地確定。
本發(fā)明的多肽與多種生物功能有關(guān)，包括多種疾病狀態(tài)，特別是以上所述本發(fā)明限定疾病。因此，有必要設計鑒定刺激或抑制多肽功能的化合物的篩選方法。因而，本發(fā)明另一方面提供篩選化合物的方法，以鑒定刺激或抑制多肽功能的化合物。一般來說，激動劑或拮抗劑可以用于以上所述本發(fā)明限定疾病的治療和預防目的。化合物可以從多種來源鑒定，例如細胞、無細胞制備物、化學文庫和天然產(chǎn)品混合物。鑒定的這些激動劑、拮抗劑或抑制劑可以是本發(fā)明多肽的天然或修飾的底物、配體、受體、酶等；或者是本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)或功能模擬物?？蓞⒁奀oligan et al．，Current Protocol in Immunology 1(2)Chapter 5(1991)。
篩選試驗可以簡單地測試候選化合物與多肽、具有該多肽的細胞或細胞膜或其融合蛋白的結(jié)合，利用直接或間接與候選化合物結(jié)合的標記檢測。或者篩選方法包括與標記競爭物的競爭。并且，這些篩選方法可以測試候選化合物是否會產(chǎn)生多肽激活或抑制產(chǎn)生的信號，使用適合于具有多肽的細胞的檢測系統(tǒng)。激活抑制劑通常在已知激動劑存在時試驗，觀察候選化合物存在對激動劑激活的影響。結(jié)構(gòu)活性多肽可以用于篩選反向激動劑或抑制劑的方法中，在不存在激動劑或抑制劑時測定候選化合物是否抑制多肽的激活。另外，篩選試驗可以簡單地包括以下步驟混合候選化合物與含有本發(fā)明多肽的溶液，形成混合物，測定混合物中NPCABC08活性，比較混合物與標準品的NPCABC08活性。如上述由Fc部分和NPCABC08多肽形成的融合蛋白等融合蛋白也可用于高流通量篩選試驗，以鑒定本發(fā)明多肽的拮抗劑(參見D．Bennett et al．，JMol Recognition，852—58(1995)；and K．Johanson et al．，J Biol Chem，270(16)9459—9471(1995))。
本發(fā)明的多核苷酸、多肽和多肽的抗體也可以用來設計檢測加入的化合物對細胞中mRNA和多肽生成的影響的篩選方法。例如，可以設計ELISA，通過本領(lǐng)域已知的標準方法使用單克隆和多克隆抗體來測定分泌或細胞結(jié)合的多肽水平。這可以用來從合適的工程改造的細胞或組織中尋找可以抑制或增加多肽生成的物質(zhì)(也可以分別稱為拮抗劑或激動劑)。
該多肽可以用來鑒定存在的膜結(jié)合或可溶受體，使用本領(lǐng)域已知的標準受體結(jié)合技術(shù)。這些包括但不限于配體結(jié)合和交聯(lián)試驗，其中多肽用放射性同位素(如125I)標記，化學修飾(如生物素化)，或與適合檢測或純化的肽序列融合，與推測的受體源(細胞、細胞膜、細胞上清、組織提取物、體液)溫育。其他方法包括生物物理技術(shù)，如表面胞質(zhì)共振和分光術(shù)。這些篩選方法也可以用來鑒定多肽的激動劑和拮抗劑，它們與多肽對存在的受體的結(jié)合競爭。進行這些試驗的標準方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。
可能的多肽拮抗劑的實例包括多肽的抗體，或者在某些情況下為與多肽的配體、底物、受體、酶等密切相關(guān)的寡核苷酸或蛋白，例如配體、底物、受體、酶等的片段；或者為與本發(fā)明的多肽結(jié)合但不引發(fā)應答的小分子，從而抑制多肽的活性。
因此，本發(fā)明另一方面涉及一種篩選藥盒，用來鑒定本發(fā)明多肽的激動劑、拮抗劑、配體、受體、底物、酶等；或者是降低或增加這些多肽生成的化合物，該藥盒包括(a)本發(fā)明的多肽；(b)表達本發(fā)明多肽的重組細胞；(c)表達本發(fā)明多肽的細胞膜；(d)本發(fā)明多肽的抗體；其中，多肽優(yōu)選為序列2的多肽。
應當理解，在這種藥盒中，(a)，(b)，(c)或(d)可以包括一種主要成分。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易意識到，本發(fā)明的多肽也可以用于基于結(jié)構(gòu)設計多肽的激動劑、拮抗劑或抑制劑的方法中，包括(a)首先確定多肽的三維結(jié)構(gòu)；(b)推測激動劑、拮抗劑或抑制劑中可能的反應或結(jié)合部位的三維結(jié)構(gòu)；(c)合成預期與推測的結(jié)合或反應部位結(jié)合或反應的候選化合物；(d)測試候選化合物是否確實為激動劑、拮抗劑或抑制劑。應當理解，該過程通常是交互式過程。
另一方面，本發(fā)明提供了與NPCABC08多肽活性過高或過低有關(guān)的異常癥狀如癌癥、白血病、糖尿病、腎病、自身免疫病的治療方法。
如果多肽活性過高，可以有幾種方法。一種方法包括向受試者給藥上述抑制劑化合物(拮抗劑)，可選與可藥用載體組合，其用量可以抑制多肽的功能，例如通過阻斷配體、底物、受體、酶等的結(jié)合，或通過抑制第二信號，從而緩解異常癥狀。另一種方法中給藥能夠與內(nèi)源多肽競爭結(jié)合配體、底物、酶、受體等的可溶形式的多肽。這種競爭物的典型實例包括NPCABC08多肽的片段。
在另一種方法中，可以使用表達阻斷技術(shù)抑制編碼內(nèi)源NPCABC08多肽的基因的表達。已知的這種技術(shù)包括使用反義序列，可以是內(nèi)部產(chǎn)生的或單獨給藥(參見例如O′Connor，J Neurochem(1991)56560，《基因表達反義抑制劑的寡脫氧核苷酸》CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))?；蛘呖梢允褂门c基因形成三螺旋的寡核苷酸(參見例如Lee，et al．，Nucleic Acid Res(1979)63073；Cooney et al．，Science(1988)241456；Dervan et al．，Scicence(1991)2511360)?？梢越o藥這些寡聚體或在體內(nèi)表達有關(guān)寡聚體。
為了治療NPCABC08和其活性表達不足的異常癥狀，有幾種方法可以使用。一種方法包括向受試者給藥治療有效量的激活本發(fā)明多肽的化合物，即上述激動劑，結(jié)合給藥可藥用的載體，從而緩解異常癥狀?；蛘撸梢允褂没蛑委焷韺崿F(xiàn)受試者相關(guān)細胞內(nèi)源生產(chǎn)NPCABC08。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以如上述經(jīng)工程改造用復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達。然后分離逆轉(zhuǎn)錄病毒表達構(gòu)建體并導入用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導的包裝細胞中，載體中含有編碼本發(fā)明多肽的RNA，因而包裝細胞可以產(chǎn)生含有目的基因的感染性病毒粒子?？梢韵蚴茉囌呓o藥這些生產(chǎn)細胞，以便體內(nèi)改造細胞并在體內(nèi)表達多肽?；蛑委煹挠嘘P(guān)論述可參見第20章，“基因治療和其他基于分子遺傳學的治療方法(及其中的參考文獻)，《人類分子遺傳學》，T Strachanand A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)。另一種方法是給藥治療有效量的本發(fā)明的多肽，結(jié)合給藥合適的藥用載體。
另一方面，本發(fā)明提供含有治療有效量的多肽和可藥用載體或賦形劑的藥物組合物，所述多肽如本發(fā)明多肽的可溶形式，激動劑／拮抗劑肽或小分子化合物。這些載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其組合。本發(fā)明還涉及藥包和藥盒，其中包括一個或多個容器，裝有一種或多種本發(fā)明的上述組合物成分。本發(fā)明的多肽和其他化合物可以單獨使用，或與其他化合物如治療化合物聯(lián)合使用。
組合物應適于給藥途徑，例如全身或口服途徑。優(yōu)選的全身給藥方式包括注射，一般是靜脈內(nèi)注射。也可使用其他注射途徑如皮下、肌肉、或腹膜內(nèi)途徑。全身給藥的其他方法包括使用膽酸鹽或梭鏈孢酸或其他表面活性劑等滲透劑經(jīng)粘膜和經(jīng)皮給藥。此外，如果本發(fā)明的多肽或其他化合物可以配制成腸道或膠囊劑，也可以口服給藥。這些化合物也可以以軟膏、糊劑、凝膠等形式表面和／或局部給藥。
所需劑量范圍取決于本發(fā)明肽或其他化合物的選擇、給藥途徑、制劑性質(zhì)、受試者癥狀的性質(zhì)和主治醫(yī)師的判斷。合適的劑量范圍為0．1到1OOμg／kg。鑒于可以獲得的化合物有多種，不同的給藥途徑有不同的效果，所需劑量的變化范圍很大是可以預見的。例如，預期口服給藥較靜脈注射所需劑量大。這些劑量水平的變化可以使用用來優(yōu)化的標準實驗方法調(diào)整，這在本領(lǐng)域是眾所周知的。
治療用多肽也可以在受試者體內(nèi)內(nèi)源產(chǎn)生，這種治療形式通常稱為“基因治療”。因此，例如來自受試者的細胞可以用多核苷酸如編碼來自體內(nèi)的多肽的DNA或RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體工程改造。然后將這些細胞引入受試者體內(nèi)。
多核苷酸和多肽序列構(gòu)成了有價值的信息源，可以用來鑒定具有類似同源性的其他序列。通過將序列存儲在計算機可讀介質(zhì)上，然后利用存儲的數(shù)據(jù)借助眾所周知的檢索工具如GCC檢索序列數(shù)據(jù)庫，使鑒定大為便利。因此，本發(fā)明另一方面提供一種計算機可讀介質(zhì)，其上存儲有含有序列1的多核苷酸和／或由其編碼的多肽序列。
為便于理解本說明書中常用的術(shù)語，提供以下定義。
“抗體”在本文中包括單克隆和多克隆抗體、嵌合、單鏈和人源化抗體以及Fab片段，包括Fab或其他免疫球蛋白表達文庫的產(chǎn)物。
“分離的”表示“通過人工”改變其天然狀態(tài)。如果“分離的”組合物或物質(zhì)在自然界中存在，則它已經(jīng)從其原始環(huán)境改變或取出或者已經(jīng)取出并改變。例如，在本文中使用該術(shù)語時，在活動物體內(nèi)存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但已經(jīng)與天然狀態(tài)下共存的物質(zhì)分開的同樣多核苷酸或多肽就是“分離的”。
“多核苷酸”一般指聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，可以是未修飾或修飾的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于單鏈和雙鏈DNA，單鏈和雙鏈區(qū)混合的DNA，單鏈和雙鏈RNA，單鏈和雙鏈區(qū)混合的RNA，含有DNA和RNA的雜合分子，可以是單鏈或更常見為雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)的混合物。此外，“多核苷酸”還指含有RNA或DNA或RNA和DNA的三鏈區(qū)。術(shù)語“多核苷酸”也包括含有一個或多個修飾堿基的DNA或RNA，以及為穩(wěn)定性或其他原因已對骨架進行修飾的DNA或RNA。“修飾”堿基包括例如三苯甲基化堿基和肌苷等稀有堿基?？梢詫NA和RNA進行多種修飾，因此，“多核苷酸”包括自然界中常見的多核苷酸的化學、酶促或代謝修飾形式，以及病毒和細胞特征性的DNA和RNA化學形式。“多核苷酸”也包括相對短的、通常被稱為寡核苷酸的多核苷酸。
“多肽”指含有通過肽鍵或修飾的肽鍵即肽等排物(peptideisosteres)互相連接的兩個或多個氨基酸的任何肽或蛋白?！岸嚯摹奔劝ǘ替?通常稱為肽)的寡肽或寡聚體，也包括長鏈(通常稱為蛋白)。多肽可能含有20種基因編碼的氨基酸之外的氨基酸?！岸嚯摹卑ㄍㄟ^翻譯后加工等天然方法或本領(lǐng)域已知的化學修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。這些修飾在基本教科書和專論以及大量研究論文中敘述詳盡。修飾可以發(fā)生在多肽的任何部位，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。在給定多肽的不同位點同類修飾可以以相同或不同的程度存在。并且給定多肽可以含有多種類型的修飾。多肽可以由于遍在蛋白化而分支，也可以為分支或不分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支和分支環(huán)狀多肽可能由于翻譯后的天然加工或合成方法產(chǎn)生。修飾包括乙?；?、?；?、ADP—核糖基化、酰胺化、黃素的共價輟合、血紅素的共價輟合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價輟合、脂或脂衍生物的共價輟合、磷脂酰肌醇的共價輟合、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價交聯(lián)的形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲?；ⅵ敏然?、糖基化、GPI錨定物形成、羥化、碘化、甲基化、肉豆蔻?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二?；?、外消旋化、硒?；?selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)運RNA介導的氨基酸加入蛋白質(zhì)，如精氨?；捅樵诘鞍谆?可以參見例如《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性》第2版，T．E．Creighton，W．H．Freeman andCompany，New York，1993 and Wold，F(xiàn)．，“翻譯后蛋白修飾前景與展望”，1—12頁，《蛋白的翻譯后共價修飾》B．C．Johnson，Ed．，AcademicPress，New York，1983；Seifter et al．，“蛋白修飾和非蛋白輔因子的分析”，Meth Enzymol(1990)182626—646和Rattan et al．，“蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾和老化”，Ann NY Acad Sci(1992)66348—62)。
“變體”指不同于參照多核苷酸或多肽但保留了基本特性的多核苷酸或多肽。一般多核苷酸變體的核苷酸序列與參照多核苷酸不同。變體核苷酸序列的變化可能改變或不改變由參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改變可能導致參照序列編碼的多肽中氨基酸的置換、添加、缺失、融合和截短。一般多肽變體的氨基酸序列與參照多肽不同。通常，差異有限，因此參照多肽和變體的序列在總體上是極其近似的，在許多區(qū)域是相同的。變體和參照多肽在氨基酸序列上可以有任何組合形式的一個或多個置換、添加、缺失的區(qū)別。置換或插入的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼編碼的氨基酸。多核苷酸或多肽的變體可以是天然存在的，如等位變體，或者是非天然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽變體可以通過誘變技術(shù)或直接合成制備。
“同一性”在本領(lǐng)域中已知是通過比較序列確定的兩個或多個多肽序列或多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”也表示通過這些序列鏈之間的匹配確定的多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴笨梢酝ㄟ^已知方法方便地計算，包括但不限于以下文獻中所述方法《計算分子生物學》，Lesk，A．M．，ed．OxfordUniversity Ptess，New York，1988；《計算生物學簡介和基因組工程》，Smith D．W．，ed．，Academic Press，New York，1993；《序列數(shù)據(jù)的計算機分析》第l部分，Griffin A．M．，and Griffin H．G．，eds．，Humana Press，NewJersey，1994；《分子生物學中的序列分析》，von Heinje，G．，AcademicPress，1987；《序列分析引物》，Gribskov，M．a(chǎn)nd Devereux，J．，eds．，MStockton Press，New York，1991；Carillo，H．，ard Lipman，D．，SIAM J．Applied Math．，481073(1988)。確定同一性的方法被設計成使測試的序列之間匹配最大。而且，確定同一性和相似性的優(yōu)選方法已被編成可公開獲得的計算機程序。確定兩個序列之間的同一性和相似性的計算機程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J．，et al．，Nucleic AcidsResearch(1984)12(1)387)，BLASTP，BLASTN，F(xiàn)ASTA(Atschul，S．F．et al．，J Molec Biol(1990)215403)。BLAST X程序可從NCBI或其他來源獲得(BLAST手冊，A1tschul，S．，et al．，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S．，et al．，J．Mol．Biol．215403—4lO(1990)。眾所周知的Smith Waterman算法也可以用來確定同一性。
多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括1)算法Needleman and Wunsch，J．Mol Biol．48443—453(1970)比較矩陣(Comparison matrix)BLOSSUM62，來自Hentikoff andHentikoff，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．8910915—10919(1992)缺口補償12缺口長度補償4可以應用這些參數(shù)的一個程序是Genetics Computers Group，MadisonWI提供的gap程序。上述參數(shù)是肽比較的缺省參數(shù)(末端缺口不補償)。
多核苷酸比較的優(yōu)選參數(shù)包括1)算法Needleman and Wunsch，J．Mol Biol．48443—453(1970)比較矩陣(Comparison matrix)匹配=+10，錯配=0缺口補償50缺口長度補償3可以獲得的程序Genetics Computers Group，Madison WI提供的gap程序。這些是核酸比較的缺省參數(shù)。
例如，本發(fā)明的多核苷酸序列可以與序列2的參照序列相同，即同一性為100％，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的氨基酸改變，因此同一性小于100％。這種改變可以選自至少一個核酸缺失、置換(包括轉(zhuǎn)換和顛換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多核苷酸序列的5′或3′末端或兩個末端之間的任何位置，分別散在分布在參照序列的核酸之間，或者以一個或多個毗連群散在分布在參照序列中。同一性百分數(shù)一定時核酸改變的數(shù)量如下確定序列2中的總氨基酸數(shù)乘以同一性百分數(shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從序列2的總氨基酸數(shù)中減除，或者nn≤xn—(xn·y)其中nn為氨基酸改變數(shù)量，xn為序列2的總氨基酸數(shù)，y值在70％時為0．70，在80％時為0．80，在85％時為O．85，依此類推，其中若xn和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xn中減除。
例如，本發(fā)明的多肽序列可以與序列2的參照序列相同，即同一性為100％，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的氨基酸改變，因此同一性小于100％。這種改變可以選自至少一個氨基酸缺失、置換(包括保守和非保守置換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多肽序列的氨基或羧基末端或兩個末端之間的任何位置，分別散在分布在參照序列的氨基酸之間，或者以一個或多個毗連群散在分布在參照序列中。同一性百分數(shù)一定時氨基酸改變的數(shù)量如下確定序列2中的總氨基酸數(shù)乘以同一性百分數(shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從序列2的總氨基酸數(shù)中減除，或者na≤xa—(xa·y)其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa為序列2的總氨基酸數(shù)，y值在70％時為0．70，在80％時為0．80，在85％時為0．85，依此類推，其中若xa和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xa中減除。
“融合蛋白”指由兩個通常不相關(guān)的融合基因或其片段編碼的蛋白。例如，EP—A—0 464公開了含有免疫球蛋白分子恒定區(qū)各部分和其他人蛋白或其部分的融合蛋白。在很多情況下，在治療和診斷中使用免疫球蛋白Fc區(qū)作為融合蛋白的一部分較為有利，可以導致改進的藥物動力特性(參見例如EP—A 0232 262)。另一方面，在某一些應用中，在融合蛋白表達、檢測和純化后能夠切除Fc部分較為理想。
本說明書中所引用的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請，全部引作參考，如同每一出版物單獨和個別地指明引作參考一樣。序列信息序列1TAAAGCTACG CCCTGGCCGC AGTCTCCGCG TCACAGGAAC TTCAGCACCC ACAGGGCGGA 60CAGCGCTCCC CTCTACCTGG AGACTTGACT CCCGCGCGCC CCAACCCTGC TTATCCCTTG120ACCGTCGAGT GTCAGAGATC CTGCAGCCGC CCAGTCCCGG CCCCTCTCCC GCCCCACACC180CACCCTCCTG GCTCTTCCTG TTTTTACTCC TCCTTTTCAT TCATAACAAA AGCTACAGCT240CCAGGAGCCC AGCGCCGGGC TGTGACCCAA GCCGAGCGTG GAAGAATGGG GTTCCTCGGG300ACCGGCACTT GGATTCTGGT GTTAGTGCTC CCGATTCAAG CTTTCCCCAA ACCTGGAGGA360AGCCAAGACA AATCTCTACA TAATAGAGAA TTAAGTGCAG AAAGACCTTT GAATGAACAG420ATTGCTGAAG CAGAAGAAGA CAAGATTAAA AAAACATATC CTCCAGAAAA CAAGCCAGGT480CAGAGCAACT ATTCTTTTGT TGATAACTTG AACCTGCTAA GGGCAATAAC AGAAAAGGAA540AAAATTGAGA AAGAAAGACA ATCTATAAGA AGCTCCCCAC TTGATAATAA GTTGAATGTG600GAAGATGTTG ATTCAACCAA GAATCGAAAA CTGATCGATG ATTATGACTC TACTAAGAGT660GGATTGGATC ATAAATTTCA AGATGATCCA GATGGTCTTC ATCAACTAGA CGGGACTCCT720TTAACCGCTG AAGACATTGT CCATAAAATC GCTGCCAGGA TTTATGAAGA AAATGACAGA780GCCGTGTTTG ACAAGATTGT TTCTAAACTA CTTAATCTCG GCCTTATCAC AGAAAGCCAA840GCACATACAC TGGAAGATGA AGTAGCAGAG GTTTTACAAA AATTAATCTC AAAGGAAGCC900AACAATTATG AGGAGGATCC CAATAAGCCC ACAAGCTGGA CTGAGAATCA GGCTGGAAAA960ATACCAGAGA AAGTGACTCC AATGGCAGCA ATTCAAGATG GTCTTGCTAA GGGAGAAAAC 1020GATGAAACAG TATCTAACAC ATTAACCTTG ACAAATGGCT TGGAAAGGAG AACTAAAACC 1080TACAGTGAAG ACAACTTTAG GGACTTCCAA TATTTCCCAA ATTTCTATGC GCTACTGAAA 1140AGTATTGATT CAGAAAAAGA AGCAAAAGAG AAAGAAACAC TGATTACTAT CATGAAAACA 1200CTGATTGACT TTGTGAAGAT GATGGTGAAA TATGGAACAA TATCTCCAGA AGAAGGTGTT 1260TCCTACCTTG AAAACTTGGA TGAAATGATT GCTCTTCAGA CCAAAAACAA GCTAGAAAAA 1320AATGCTACTG ACAATATAAG CAAGCTTTTC CCAGCACCAT CAGAGAAGAG TCATGAAGAA 1380ACAGACAGTA CCAAGGAAGA AGCAGCTAAG ATGGAAAAGG AATATGGAAG CTTGAAGGAT 1440TCCACAAAAG ATGATAACTC CAACCCAGGA GGAAAGACAG ATGAACCCAA AGGAAAAACA 1500GAAGCCTATT TGGAAGCCAT CAGAAAAAAT ATTGAATGGT TGAAGAAACA TGACAAAAAG 1560GGAAATAAAG AAGATTATGA CCTTTCAAAG ATGAGAGACT TCATCAATAA ACAAGCTGAT 1620GCTTATGTGG AGAAAGGCAT CCTTGACAAG GAAGAAGCCG AGGCCATCAA GCGCATTTAT 1680AGCAGCCTGT AAAAATGGCA AAAGATCCAG GAGTCTTTCA ACTGTTTCAG AAAACATAAT 1740ATAGCTTAAA ACACTTCTAA TTCTGTGATT AAAATTTTTT GACCCAAGGG TTATTAGAAA 1800GTGCTGAATT TACAGTAGTT AACCTTTTAC AAGTGGTTAA AACATAGCTT TCTTCCCGTA 1860AAAACTATCT GAAAGTAAAG TTGTATGTAA GCTGAGATTT TGTATACAGG AATCCTTATT 1920TCCTCATAGN CTTATTATTT TATAATCAGG AATATGTTGC TTTGGAAAAA GCCTCTTAAT 1980GGGCTGACCN TAAAAACTCA ATCCNTCTTC CACTGTC2017序列2Met Gly Phe Leu Gly Thr Gly Thr Trp Ile Leu Val Leu Val Leu Pro1 5 10 15Ile Gln Ala Phe Pro Lys Pro Gly Gly Ser Gln Asp Lys Ser Leu His20 25 30Asn Arg Glu Leu Ser Ala Glu Arg Pro Leu Asn Glu Gln Ile Ala Glu35 40 45Ala Glu Glu Asp Lys Ile Lys Lys Thr Tyr Pro Pro Glu Asn Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Asn Tyr Ser Phe Val Asp Asn Leu Asn Leu Leu Arg Ala65 70 5 80Ile Thr Glu Lys Glu Lys Ile Glu Lys Glu Ars Gln Ser Ile Arg Ser85 90 95Ser Pro Leu Asp Asn Lys Leu Asn Val Glu Asp Val Asp Ser Thr Lys100 105 110Asn Arg Lys Leu Ile Asp Asp Tyr Asp Ser Thr Lys Ser Gly Leu Asp115 120 125His Lys Phe Gln Asp Asp Pro Asp Gly Leu His Gln Leu Asp Gly Thr130 135 140Pro Leu Thr Ala Glu Asp Ile Val His Lys Ile Ala Ala Arg Ile Tyr145 150 155 160Glu Glu Asn Asp Arg Ala Val Phe Asp Lys Ile Val Ser Lys Leu Leu165 170 175Asn Leu Gly Leu Ile Thr Glu Ser Gln Ala His Thr Leu Glu Asp Glu180 185 190Val Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Ile Ser Lys Glu Ala Asn Asn Tyr195 200 205Glu Glu Asp Pro Asn Lys Pro Thr Ser Trp Thr Glu Asn Gln Ala Gly210 215 220Lys Ile Pro Glu Lys Val Thr Pro Met Ala Ala Ile Gln Asp Gly Leu225 230 235 240Ala Lys Gly Glu Asn Asp Glu Thr Val Ser Asn Thr Leu Thr Leu Thr245 250 255Asn G1y Leu Glu Arg Arg Thr Lys Thr Tyr Ser Glu Asp Asn Phe Arg260 265 270Asp Phe Gln Tyr Phe Pro ASn Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Ser Ile Asp275 280 285Ser Glu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Glu Thr Leu Ile Thr Ile Met Lys290 295 300Thr Leu Ile Asp Phe Val Lys Met Met Val Lys Tyr Gly Thr Ile Ser305 310 315 320Pro Glu Glu Gly Val Ser Tyr Leu Glu Asn Leu Asp Glu Met Ile Ala325 330 335Leu Gln Thr Lys Asn Lys Leu Glu Lys Asn Ala Thr Asp Asn Ile Ser340 345 350Lys Leu Phe Pro Ala Pro Ser Glu Lys Ser His Glu Glu Thr Asp Ser355 360 365Thr Lys Glu Glu Ala Ala Lys Met Glu Lys Glu Tyr Gly Ser Leu Lys370 375 380Asp Ser Thr Lys Asp Asp Asn Ser Asn Pro Gly Gly Lys Thr Asp Glu385 390 395 400Pro Lys Gly Lys Thr Glu Ala Tyr Leu Glu Ala Ile Arg Lys Asn Ile405 410 415Glu Trp Leu Lys Lys His Asp Lys Lys Gly Asn Lys Glu Asp Tyr Asp420 425 430Leu Ser Lys Met Arg Asp Phe Ile Asn Lys Gln Ala Asp Ala Tyr Val435 440 445Glu Lys Gly Ile Leu Asp Lys Glu Glu Ala Glu Ala Ile Lys Arg Ile450 455 460Tyr Ser Ser Leu465
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人上海第二醫(yī)科大學(ⅱ)發(fā)明名稱人HSG Ⅲ基因(ⅲ)序列數(shù)2(ⅳ)通訊資料(A)聯(lián)系人 Ratner & Prestia(B)街道 P．O．Box 980(C)城市 Valley Forge(D)州PA(E)國家 USA(F)郵編19482(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM兼容(C)操作系統(tǒng) DOS(D)軟件 FastSEQ for Windows Version 2．0(ⅵ)當前申請資料(A)申請?zhí)柎?B)申請日(C)分類號未知(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(ⅷ)律師／代理人資料(A)姓名 Prestia， Paul F(B)注冊號23，031(C)資料／文檔號GP—70526(ⅸ)電訊信息(A)電話610—407—0700(B)傳真610—407—0700(C)電傳846169
(2) SEQ ID NO:1 資料(ⅰ)序列特征(A)長度2017堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型 cDNA(ⅹⅰ)序列描述 SEQ ID NO1TAAAGCTACG CCCTGCCCGC AGTCTCCGCG TCACAGGAAC TTCAGCACCC ACAGGGCGGA 60CAGCCCTCCC CTCTACCTGG AGACTTGACT CCCCCGCGCC CCAACCCTGC TTATCCCTTG120ACCGTCGAGT GTCAGAGATC CTGCAGCCGC CCAGTCCCGG CCCCTCTCCC GCCCCACACC180CACCCTCCTG GCTCTTCCTG TTTTTACTCC TCCTTTTCAT TCATAACAAA AGCTACAGCT240CCAGGAGCCC AGCGCCGGGC TGTGACCCAA GCCGAGCGTG GAAGAATGGG GTTCCTCGGG300ACCGGCACTT GGATTCTGGT GTTAGTGCTC CCGATTCAAG CTTTCCCCAA ACCTGGAGGA360AGCCAAGACA AATCTCTACA TAATAGAGAA TTAAGTGCAG AAAGACCTTT GAATGAACAG420ATTGCTGAAG CAGAAGAAGA CAAGATTAAA AAAACATATC CTCCAGAAAA CAAGCCAGGT480CAGAGCAACT ATTCTTTTGT TGATAACTTG AACCTGCTAA GGGCAATAAC AGAAAAGGAA540AAAATTGAGA AAGAAAGACA ATCTATAAGA AGCTCCCCAC TTGATAATAA GTTGAATGTG600GAAGATGTTG ATTCAACCAA GAATCGAAAA CTGATCGATG ATTATGACTC TACTAAGAGT660GGATTGGATC ATAAATTTCA AGATGATCCA GATGGTCTTC ATCAACTAGA CGGGACTCCT720TTAACCGCTG AAGACATTGT CCATAAAATC GCTGCCAGGA TTTATGAAGA AAATGACAGA780GCCGTGTTTG ACAAGATTGT TTCTAAACTA CTTAATCTCG GCCTTATCAC AGAAAGCCAA840GCACATACAC TGGAAGATGA AGTAGCAGAG GTTTTACAAA AATTAATCTC AAAGGAAGCC900AACAATTATG AGGAGGATCC CAATAAGCCC ACAAGCTGGA CTGAGAATCA GGCTGGAAAA960ATACCAGAGA AAGTGACTCC AATGGCAGCA ATTCAAGATG GTCTTGCTAA GGGAGAAAAC1020GATGAAACAG TATCTAACAC ATTAACCTTG ACAAATGGCT TGGAAAGGAG AACTAAAACC1080TACAGTGAAG ACAACTTTAG GGACTTCCAA TATTTCCCAA ATTTCTATGC GCTACTGAAA1140AGTATTGATT CAGAAAAAGA AGCAAAAGAG AAAGAAACAC TGATTACTAT CATGAAAACA1200CTGATTGACT TTGTGAAGAT GATGGTGAAA TATGGAACAA TATCTCCAGA AGAAGGTGTT1260TCCTACCTTG AAAACTTGGA TGAAATGATT GCTCTTCAGA CCAAAAACAA GCTAGAAAAA1320AATGCTACTG ACAATATAAG CAAGCTTTTC CCAGCACCAT CAGAGAAGAG TCATGAAGAA1380ACAGACAGTA CCAAGGAAGA AGCAGCTAAG ATGGAAAAGG AATATGGAAG CTTGAAGGAT1440TCCACAAAAG ATGATAACTC CAACCCAGGA GGAAAGACAG ATGAACCCAA AGGAAAAACA1500GAAGCCTATT TGGAAGCCAT CAGAAAAAAT ATTGAATGGT TGAAGAAACA TGACAAAAAG1560GGAAATAAAG AAGATTATGA CCTTTCAAAG ATGAGAGACT TCATCAATAA ACAAGCTGAT1620GCTTATGTGG AGAAAGGCAT CCTTGACAAG GAAGAAGCCG AGGCCATCAA GCGCATTTAT1680AGCAGCCTGT AAAAATGGCA AAAGATCCAG GAGTCTTTCA ACTGTTTCAG AAAACATAAT1740ATAGCTTAAA ACACTTCTAA TTCTGTGATT AAAATTTTTT GACCCAAGGG TTATTAGAAA1800GTGCTGAATT TACAGTAGTT AACCTTTTAC AAGTGGTTAA AACATAGCTT TCTTCCCGTA1860AAAACTATCT GAAAGTAAAG TTGTATGTAA GCTGAGATTT TGTATACAGG AATCCTTATT1920TCCTCATAGN CTTATTATTT TATAATCAGG AATATGTTGC TTTGGAAAAA GCCTCTTAAT1980GGGCTGACCN TAAAAACTCA ATCCNTCTTC CACTGTC 2017(2) SEQ ID NO2資料
(ⅰ)序列特征(A)長度468氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述 SEQ ID NO2Met Gly Phe Leu Gly Thr Gly Thr Trp Ile Leu Val Leu Val Leu Pro1 5 10 15Ile Gln Ala Phe Pro Lys Pro Gly Gly Ser Gln Asp Lys Ser Leu His20 25 30Asn Arg Glu Leu Ser Ala Glu Arg Pro Leu Asn Glu Gln Ile Ala Glu35 40 45Ala Glu Glu Asp Lys Ile Lys Lys Thr Tyr Pro Pro Glu Asn Lys Pro50 55 60Gly Gin Ser Asn Tyr Ser Phe Val Asp Asn Leu Asn Leu Leu Arg Ala65 70 75 80Ile Thr Glu Lys Glu Lys Ile Glu Lys G1u Arg Gln Ser Ile Arg Ser85 90 95Ser Pro Leu Asp Asn Lys Leu ASn Val Glu Asp Val Asp Ser Thr Lys100 105 110Asn Arg Lys Leu Ile Asp Asp Tyr Asp Ser Thr Lys Ser Gly Leu Asp115 120 125His Lys Phe Gln Asp Asp Pro Asp Gly Leu His Gln Leu Asp Gly Thr130 135 140Pro Leu Thr Ala Glu Asp Ile Val His Lys Ile Ala Ala Arg Ile Tyr145 150 155 160Glu Glu Asn Asp Arg Ala Val Phe Asp Lys Ile Val Ser Lys Leu Leu165 170 175Asn Leu Gly Leu Ile Thr Glu Ser Gln Ala His Thr Leu Glu Asp Glu180 185 190Val Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Ile Ser Lys Glu Ala Asn Asn Tyr195 200 205Glu Glu Asp Pro Asn Lys Pro Thr Ser Trp Thr Glu Asn Gln Ala Gly210 215 220Lys Ile Pro Glu Lys Val Thr Pro Met Ala Ala Ile Gln Asp Gly Leu225 230 235 240Ala Lys Gly Glu Asn Asp Glu Thr Val Ser Asn Thr Leu Thr Leu Thr245 250 255ASn Gly Leu Glu Arg Arg Thr Lys Thr Tyr Ser Glu Asp Asn Phe Arg260 265 270Asp Phe Gln Tyr Phe Pro ASn Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Ser Ile Asp275 280 285Ser Glu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Glu Thr Leu Ile Thr Ile Met Lys290 295 300Thr Leu Ile Asp Phe Val Lys Met Met Val Lys Tyr Gly Thr Ile Ser305 310 315 320Pro Glu Glu Gly Val Ser Tyr Leu Glu Asn Leu Asp Glu Met Ile Ala325 330 335Leu Gln Thr Lys Asn Lys Leu Glu Lys ASn Ala Thr Asp Asn Ile Ser340 345 350Lys Leu Phe Pro Ala Pro Ser Glu Lys Ser His Glu Glu Thr Asp Ser355 360 365Thr Lys Glu Glu Ala Ala Lys Met Glu Lys Glu Tyr Gly Ser Leu Lys370 375 380Asp Ser Thr Lys Asp Asp Asn Ser Asn Pro Gly Gly Lys Thr Asp Glu385 390 395 400Pro Lys Gly Lys Thr Glu Ala Tyr Leu Glu Ala Ile Arg Lys Asn Ile405 410 415Glu Trp Leu Lys Lys His Asp Lys Lys Gly Asn Lys Glu Asp Tyr Asp420 425 430Leu Ser Lys Met Arg Asp Phe Ile Asn Lys Gln Ala Asp Ala Tyr Val435 440 445Glu Lys Gly Ile Leu Asp Lys Glu Glu Ala Glu Ala Ile Lys Arg lle450 455 460Tyr Ser Ser Leu46權(quán)利要求
1．一種選自以下多肽的分離的多肽(ⅰ)含有與序列2的整個氨基酸序列的同一性為至少(a)70％(b)80％(c)90％；或(a)95％的氨基酸序列的分離多肽；(ⅱ)含有序列2氨基酸序列的分離多肽；或(ⅲ)其氨基酸序列為序列2的分離多肽．
2．一種選自以下多核苷酸的分離的多核苷酸(ⅰ)分離的多核苷酸，其含有的核苷酸序列編碼與序列2的整個氨基酸序列的同一性為至少(a)70％(b)80％(c)90％；或(a)95％的氨基酸序列的多肽；(ⅱ)分離的多核苷酸，其含有與序列2多肽序列的整個編碼核苷酸序列的同一性為至少(a)70％(b)80％(c)90％；或(a)95％的核苷酸序列；(ⅲ)分離的多核苷酸，其含有與序列1的整個核苷酸序列的同一性為至少(a)70％(b)80％(c)90％；或(a)95％的核苷酸序列；(ⅳ)分離的多核苷酸，其含有編碼序列2多肽的核苷酸序列；(ⅴ)分離的多核苷酸，其為序列1的多核苷酸；或(ⅵ)分離的多核苷酸，其可用具有序列1或其片段的序列的標記探針在嚴緊雜交條件下篩選合適的文庫獲得；或與所述分離多核苷酸序列互補的核苷酸序列。
3．權(quán)利要求1的多肽的免疫特異性抗體。
4．一種治療方法，用于治療(ⅰ)需要權(quán)利要求1的多肽活性或表達提高的受試者，包括(a)向受試者給藥治療有效量的所述多肽的激動劑；和／或(b)向受試者提供分離的多核苷酸，其含有編碼所述多肽的核苷酸序列，其形式可以實現(xiàn)所述多肽活性的體內(nèi)產(chǎn)生；或(ⅱ)需要抑制權(quán)利要求1的多肽的活性或表達的受試者，包括(a)向受試者給藥治療有效量的所述多肽的拮抗劑；和／或(b)向受試者提供抑制編碼所述多肽的核苷酸序列表達的核酸分子；和／或(c)向受試者給藥治療有效量的與所述多肽競爭其配體、底物或受體的多肽。
5．診斷受試者中與權(quán)利要求1多肽的表達或活性相關(guān)的疾病或疾病的易感性的方法，包括(a)確定受試者基因組中所述多肽的編碼核苷酸序列是否存在突變；和／或(b)分析來自所述受試者的樣品中是否有所述多肽表達或其表達量。
6．鑒定刺激或抑制權(quán)利要求1的多肽功能的化合物的篩選方法，包括選自以下的一種方法(a)利用直接或間接與候選化合物結(jié)合的標記測定候選化合物與多肽(或具有該多肽的細胞或細胞膜)或其融合蛋白的結(jié)合；(b)在標記競爭物存在時測定候選化合物與多肽(或具有該多肽的細胞或細胞膜)或其融合蛋白的結(jié)合；(c)利用對具有多肽的細胞或細胞膜合適的檢測系統(tǒng)，確定候選化合物是否產(chǎn)生多肽激活或抑制產(chǎn)生的信號；(d)將候選化合物與含有權(quán)利要求1的多肽的溶液混合，形成混合物，測定混合物中的多肽活性，比較混合物與標準品的活性；或(e)利用ELISA試驗等測定候選化合物對細胞中所述多肽和編碼所述多肽的mRNA的生成的影響。
7．權(quán)利要求1的多肽的激動劑或拮抗劑。
8．含有一種多核苷酸的表達系統(tǒng)，該多核苷酸在所述表達系統(tǒng)存在于相容細胞中時能夠產(chǎn)生權(quán)利要求1的多肽。
9．制備重組宿主細胞的方法，包括用權(quán)利要求8的表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞，使得宿主細胞在合適的培養(yǎng)條件下能夠生成一種多肽，其含有與序列2的整個氨基酸序列的同一性為至少70％的氨基酸序列。
10．權(quán)利要求9的方法制備的重組宿主細胞。
11．權(quán)利要求10的重組宿主細胞的膜，其表達一種多肽，所述多肽包括與序列2的整個氨基酸序列的同一性為至少70％的氨基酸序列。
12．生產(chǎn)多肽的方法，包括在足以產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求10的宿主細胞，由培養(yǎng)物中回收多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了NPCABC08多肽和多核苷酸以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)該多肽的方法。本發(fā)明還公開了在治療和診斷試驗中利用NPCABC08多肽和多核苷酸的方法。
文檔編號A61K38/00GK1279716SQ98811405
公開日2001年1月10日 申請日期1998年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月22日
發(fā)明者陳家倫, 付剛, 宋懷東 申請人:上海第二醫(yī)科大學