專利名稱：：誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒性的方法和組合物的制作方法本申請(qǐng)是1997年10月3日提交的未決申請(qǐng)專利系列號(hào)08／943，608的部分繼續(xù)申請(qǐng)，其全文在此引入作為參考。1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于腫瘤細(xì)胞生物學(xué)和癌癥治療領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及異源基因尤其是編碼細(xì)胞毒產(chǎn)物的基因在腫瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá)。2．發(fā)明背景2．1H19基因H19基因是少數(shù)已知的人類印記基因之一(Hurst等，1996，自然遺傳學(xué)12234-237)。在胚胎發(fā)生的最早期，H19在2個(gè)染色體等位基因上都表達(dá)(DeGroof等，1994，滋養(yǎng)層8285-302)。自此不久，出現(xiàn)父系等位基因沉默，而僅母系遺傳的等位基因被轉(zhuǎn)錄。H19在胚胎發(fā)生期廣泛表達(dá)，并首先被鑒定為通過(guò)反式作用基因座raf在肝中和甲胎蛋白協(xié)同調(diào)節(jié)的基因(Pachnis等，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)815523-5527)。另外，H19已被許多研究組用目的是分離在組織分化期表達(dá)的基因的篩選方法獨(dú)立克隆。例如，Davis等(1987，細(xì)胞51987-1000)在篩選C3H10T1／2細(xì)胞的分化過(guò)程中早期活性基因時(shí)鑒定了H19的小鼠同源物。Pourier等(1991，發(fā)育1131105-1114)發(fā)現(xiàn)鼠H19在干細(xì)胞分化期間和植入期表達(dá)。人H19基因的轉(zhuǎn)錄在人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞分化中也發(fā)現(xiàn)(Rachmilewitz等1992，分子生殖發(fā)育32196-202)。盡管H19RNA的轉(zhuǎn)錄在整個(gè)胎兒期和胎盤(pán)發(fā)育期許多不同的胚胎組織中發(fā)生，H19表達(dá)在出生后下調(diào)。然而，在鼠成年肌肉和肝中報(bào)道了相對(duì)低水平的H19轉(zhuǎn)錄(Brunkow和Tilghman，1991，基因和發(fā)育51092-1101)。在癌細(xì)胞中H19也在出生后活化。Ariel等人(1997，分子病理學(xué)5034-44)表明來(lái)源于出生前H19表達(dá)的組織的許多腫瘤中H19表達(dá)升高。另外，這些作者發(fā)現(xiàn)來(lái)源于神經(jīng)組織的腫瘤尤其是星形細(xì)胞瘤和成神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中有H19RNA，其中這被已知與H19的表達(dá)無(wú)關(guān)。鑒于大量癌細(xì)胞表達(dá)H19RNA，這些作者推測(cè)H19是一種癌胚RNA并建議研究作為人惡性腫瘤的腫瘤標(biāo)志的H19。已經(jīng)克隆和測(cè)序了人和鼠H19基因(Brannan等，1990，分子細(xì)胞生物學(xué)1028-36)。比較人和小鼠H19基因顯示全長(zhǎng)77％的核苷酸序列一致性。盡管種間核苷酸同源性的保守性，根據(jù)兩種基因的開(kāi)放讀框可預(yù)測(cè)非常低的氨基酸序列一致性(同上)。而且，雖然H19RNA被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，然后拼接和聚腺苷化，但似乎它不被翻譯。反之，發(fā)現(xiàn)H19RNA和28S細(xì)胞質(zhì)RNA有關(guān)，導(dǎo)致人們推測(cè)H19RNA可能作為核糖核苷酸蛋白的RNA組分起作用(同上)。H19的真正生理作用還沒(méi)有完全了解。H19能作為一種顯性致死基因起作用；H19轉(zhuǎn)基因的高異位表達(dá)引起小鼠將要出生前的致死性(Brunkow等，上文)。該致死期恰與H19的表達(dá)被抑制的時(shí)間相一致。另一方面，在攜帶H19敲除等位基因的雜合或純合的小鼠中，沒(méi)有觀察到缺陷(Leighton等，1995，自然37534-39)。敲除母系遺傳的等位基因確實(shí)干擾遺傳連鎖和相反印記IGF-2基因的印記過(guò)程；由于增加的出生前IGF-2的表達(dá)，得到的小鼠出生時(shí)比同窩鼠更大(同上)。因?yàn)檫@2個(gè)相反印記基因具有順式作用的調(diào)節(jié)序列，Leighton和同事們推測(cè)H19可能涉及IGF-2基因的印記。提出的H19基因產(chǎn)物的另一個(gè)功能是腫瘤抑制RNA。Hao等人(1993，自然365764-767)報(bào)道用H19表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的2種胚胎性腫瘤細(xì)胞系，RD和G401，導(dǎo)致在裸鼠中細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯，形態(tài)改變和降低致癌性。已注意到上述腫瘤抑制活性與小鼠中觀察到的異位表達(dá)的致死性(Hao等，同上)以及敲除母系H19等位基因的小鼠增加體積(Leighton等，同上)的結(jié)果一致。然而，H19是腫瘤抑制因子的建議存在爭(zhēng)議。某些結(jié)果被報(bào)道不能重復(fù)，可能存在另一種與H19緊密連鎖的候選腫瘤抑制基因(Areil等，同上)。建議的H19作為腫瘤抑制因子的作用還與以下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相抵觸，即H19在廣泛種類的腫瘤細(xì)胞中活化(如見(jiàn)例如Lustig-Yariv等，1997，癌基因23169-177)。2．2胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)基因IGF-2是另一種其表達(dá)依賴于它們父系來(lái)源的印記基因。不過(guò)與H19相反，在小鼠和人類中的IGF-2為母系印記，因此從父系遺傳的等位基因表達(dá)(Rainier等，1993，自然363747-749)。人IGF-2基因顯示復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄類型。有4種在組織中和以發(fā)育特異的方式活化的IGF-2啟動(dòng)子。在胚胎發(fā)育過(guò)程和癌組織中，僅3種啟動(dòng)子P2、P3和P4被印記和活化。第4種啟動(dòng)子P1不被印記，僅在成年肝和脈絡(luò)膜叢中活化(見(jiàn)Holthuizen等，1993，分子生殖發(fā)育35391-393)。IGF-2基因的P3啟動(dòng)子與肝硬變和肝細(xì)胞癌的發(fā)展有關(guān)(Kim和Park，1998，韓國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志13171-178)。IGF-2印記的丟失與Wilm＇s腫瘤有關(guān)(Ogawa等，1993，自然363749-751)。該觀察結(jié)果導(dǎo)致許多研究者推測(cè)印記的丟失和印記基因的雙等位表達(dá)可能涉及癌的生長(zhǎng)失調(diào)和發(fā)展(也見(jiàn)Rainier等，1993，自然362747-749和Glassman等，1996，癌癥遺傳細(xì)胞遺傳雜志8969-73)。2．3腫瘤特異的基因治療來(lái)自腫瘤有關(guān)的基因的調(diào)節(jié)序列被用于選擇地導(dǎo)向表達(dá)在衍生于腫瘤細(xì)胞中的自殺基因。例如，在肝細(xì)胞癌中誘導(dǎo)甲胎蛋白的表達(dá)。Huber等(1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)888039-8043)用來(lái)自白蛋白基因或胎兒蛋白基因的控制序列將水痘帶狀皰疹胸腺嘧啶激酶(VZVTK)基因編碼序列在肝癌細(xì)胞中導(dǎo)向表達(dá)。用含有這些表達(dá)構(gòu)建體之一的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的肝癌細(xì)胞表達(dá)VZVTK而變得對(duì)正常無(wú)毒性的藥物原6-甲基嘌呤阿拉伯核苷(araM)敏感。Kaneko等，(1995，癌癥研究555283-5287)構(gòu)建了在甲胎蛋白控調(diào)序列控制下表達(dá)HSVTK的腺病毒載體。含有該載體的重組腺病毒顆粒被直接注射到在無(wú)胸腺裸鼠中產(chǎn)生的衍生于肝細(xì)胞癌的腫瘤。接著用9-(1．3-二羥基-2-丙氧甲基)鳥(niǎo)嘌呤腹膜內(nèi)注射引起衍生于肝細(xì)胞癌的腫瘤消退。Osaki等(1994，癌癥研究545258-5261)把一種表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到A549肺癌細(xì)胞中，該表達(dá)構(gòu)建體含有連接負(fù)責(zé)簡(jiǎn)單皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSVTK)的編碼序列的肺癌胚抗原基因的控制序列。所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥(niǎo)嘌呤敏感。另外，在裸鼠中來(lái)自皮下注射轉(zhuǎn)染細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)被重復(fù)的腹膜內(nèi)注射9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)所抑制。不過(guò)，最近描述該癌胚抗原基因在正常結(jié)腸粘膜中表達(dá)，因而限制了這些控制序列作為腫瘤特異調(diào)節(jié)區(qū)的有用性(Osaka等，同上)。因此，開(kāi)發(fā)在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)基因產(chǎn)物的基因治療載體仍有必要。3．發(fā)明概述本發(fā)明涉及誘導(dǎo)在腫瘤細(xì)胞中選擇性表達(dá)異源基因的方法和組合物。具體而言，本發(fā)明涉及包含操作性與異源基因連接的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄序列的多核苷酸，它引起異源基因的腫瘤特異表達(dá)。更具體而言，該調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄序列來(lái)源于在癌細(xì)胞中特異表達(dá)的基因組印記基因如H19，IGF-2P3和P4啟動(dòng)子，而異源基因編碼細(xì)胞毒蛋白或細(xì)胞抑制基因產(chǎn)物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，IGF-1啟動(dòng)子與異源基因操作性相連接，以導(dǎo)致腫瘤特異的基因表達(dá)。該調(diào)節(jié)序列將調(diào)節(jié)在許多不同癌細(xì)胞類型中的基因表達(dá)。上述方法和組合物可用于廣泛種類的癌癥和增殖過(guò)度病情的治療。本發(fā)明的另一方面是含有多核苷酸的表達(dá)載體，該多核苷酸包括上述與異源基因操作性連接的調(diào)節(jié)區(qū)。特別優(yōu)選的調(diào)節(jié)區(qū)是那些編碼H19調(diào)節(jié)區(qū)如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，IGF-2P3或P4啟動(dòng)子或IGF-1啟動(dòng)子。從那種連接方式，H19的增強(qiáng)子和其活性部分可用于與H19啟動(dòng)子、IGF-1啟動(dòng)子、IGF-2P3啟動(dòng)子或IGF-2P4啟動(dòng)子形成任一種組合。本發(fā)明還包括含有上述載體的宿主細(xì)胞。關(guān)于這方面，含有由具有或沒(méi)有H19增強(qiáng)子的H19啟動(dòng)子控制的異源基因的表達(dá)構(gòu)建體可以和第2種構(gòu)建體共導(dǎo)入到細(xì)胞中，其中該第2種構(gòu)建體含有由與H19增強(qiáng)子組合在一起的IGF-1啟動(dòng)子或IGF-2P3或P4啟動(dòng)子控制的異源基因。在另一方面，本發(fā)明提供用上述載體在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異源基因的方法。而本發(fā)明的另一方面是在基因治療中利用本發(fā)明的載體治療癌癥。4．附圖簡(jiǎn)述圖1A-1C．人H19啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列。顯示從核苷酸位-837--7(相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn))的啟動(dòng)子區(qū)(SEQIDNO1)。圖2．在H19調(diào)節(jié)序列的控制下用所述的載體表達(dá)異源基因的簡(jiǎn)圖。圖3A-3E．H19調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)異源基因(CAT)在膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)。對(duì)于5種所示的不同細(xì)胞系，CAT的比活(cpm／μg蛋白)以所用轉(zhuǎn)染的載體的函數(shù)作圖。圖3AHT-1376細(xì)胞、圖3BEJ28細(xì)胞、圖3CT24P細(xì)胞、圖3D1197細(xì)胞、圖3EUM-UC-3細(xì)胞。下面的載體將在下面第6節(jié)更完整地描述(1)pCAT-基礎(chǔ)；(2)pCAT-對(duì)照；(3)pH19E；(4)pH19EH19D；和(5)pH19EH19R。圖4A-4E．IGF-2P3和P4啟動(dòng)子指導(dǎo)異源基因在膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)。對(duì)于5種所示的不同細(xì)胞系，螢光素酶的比活(每μg蛋白的計(jì)數(shù))以在轉(zhuǎn)染構(gòu)建體中所用的指導(dǎo)螢光素酶表達(dá)的IGF-2啟動(dòng)子的函數(shù)作圖表示。圖4AT24P細(xì)胞；圖4B1376細(xì)胞；圖4CUM-UC3細(xì)胞；圖4D1197細(xì)胞；圖4EEJ28細(xì)胞。所述的載體在下面第10節(jié)更完整地描述。圖5．人H19啟動(dòng)子片段的核苷酸序列(SEQIDNO2)。圖6．0．9kb的H19增強(qiáng)子片段的核苷酸序列(SEQIDNO3)。圖7A和7B．2kb的H19增強(qiáng)子片段的核苷酸序列(SEQIDNO4)。圖8A-8C．4kb的H19增強(qiáng)子片段的核苷酸序列(SEQIDNO5)。圖9A-9C．用含有各種H19調(diào)節(jié)區(qū)和P4啟動(dòng)子組合的載體的轉(zhuǎn)染指導(dǎo)螢光素酶在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。圖9A5637細(xì)胞；圖9BHuh7細(xì)胞；圖9C293T細(xì)胞。圖10A-10E．用含有H19調(diào)節(jié)區(qū)的載體的轉(zhuǎn)染指導(dǎo)螢光素酶在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。圖10A293T細(xì)胞；圖10BT24P細(xì)胞；圖10CHuh7細(xì)胞；圖10D5637細(xì)胞；圖10ERT112細(xì)胞。5．發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于如下的發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的基因組印記基因的調(diào)節(jié)區(qū)能用于導(dǎo)向目的編碼序列在癌細(xì)胞中表達(dá)。具體而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)H19的表達(dá)在各種類型的癌瘤中活化，這些腫瘤包括但不局限于膀胱癌、肝細(xì)胞癌、成肝細(xì)胞癌、成橫紋肌細(xì)胞瘤、卵巢癌、頸部癌、肺癌、乳腺癌、頭頸部扁平細(xì)胞癌、食管癌、類胸腺癌、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)神經(jīng)瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。而且發(fā)現(xiàn)含有操作性與一種異源基因相連的H19啟動(dòng)子區(qū)或操作性與一種異源基因相連的IGF-2P3或P4啟動(dòng)子的構(gòu)建體，或者含有啟動(dòng)子與H19增強(qiáng)子下游結(jié)合在一起的構(gòu)建體均在腫瘤細(xì)胞中被特異性活化。在本發(fā)明的另一方面，IGF-1的啟動(dòng)子被用于指導(dǎo)異源基因的表達(dá)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，本發(fā)明提供改變癌細(xì)胞表型或選擇性殺死癌細(xì)胞的方法和組合物。本目的通過(guò)把一種多核苷酸輸送到所述的細(xì)胞來(lái)完成，所述的多核苷酸包含來(lái)自操作性地與異源基因連結(jié)在一起，在癌細(xì)胞中表達(dá)的基因組印記基因的調(diào)節(jié)區(qū)。例如，該異源基因能編碼一種細(xì)胞抑制劑或細(xì)胞毒劑(如，毒素、反義RNA或核酶)。在癌細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)自基因組印記基因的調(diào)節(jié)區(qū)包括但不局限于H19啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及IGF-2P3和P4啟動(dòng)子。針對(duì)在此所描述的本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“操作性連接”意味著核苷酸序列用如下的方式與調(diào)節(jié)序列連接在一起，該方式允許所述的核苷酸序列的表達(dá)受調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)。為了本申請(qǐng)的目的，“異源的”基因序列指的是該基因序列一般情況下未與H19基因的調(diào)節(jié)序列操作性地連接在一起。大體來(lái)說(shuō)，異源基因序列包括編碼抑制細(xì)胞和細(xì)胞毒基因產(chǎn)物的序列。如本文所采用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”，意味著目的DNA的轉(zhuǎn)錄和剪接、加工、穩(wěn)定性以及可選擇的相應(yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄體的翻譯。根據(jù)所傳遞的DNA分子結(jié)構(gòu)，表達(dá)可以是瞬時(shí)或連續(xù)的。5．1H19基因的調(diào)節(jié)序列，IGF-2P3和P4啟動(dòng)子和IGF-1啟動(dòng)子在此描述的是H19調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列能用于指導(dǎo)異源編碼序列在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)。這些H19的調(diào)節(jié)序列包括上游H19啟動(dòng)子區(qū)和／或下游H19增強(qiáng)子區(qū)。一種H19啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列在圖1A-1C顯示(SEQIDNO1)。該830個(gè)核苷酸的序列從-837延長(zhǎng)到帽部位點(diǎn)的-7(如Brannan等的描述，上文)。一個(gè)共有的TATA序列出現(xiàn)在核苷酸-27～-35處。2個(gè)共有的AP2結(jié)合位點(diǎn)(8／9匹配)出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大約-500和-40的核苷酸處。當(dāng)如在下面更詳細(xì)討論的那樣被置于異源基因編碼區(qū)的上游時(shí)，大約830個(gè)堿基對(duì)的調(diào)節(jié)區(qū)足以指導(dǎo)操作性連接的異源基因在也表達(dá)內(nèi)源H19的癌細(xì)胞中表達(dá)。另外，另一個(gè)位于核苷酸-819-+14位核苷酸的H19啟動(dòng)子區(qū)(圖5，SEQIDNO2)也足以指導(dǎo)操作性連接的異源基因在癌細(xì)胞中表達(dá)。為了提供增強(qiáng)水平的腫瘤細(xì)胞特異性的表達(dá)，可任選將人H19基因的下游增強(qiáng)子區(qū)加到H19啟動(dòng)子／異源基因的構(gòu)建體上。如在第6節(jié)以實(shí)施例的形式更詳細(xì)描述和闡明的，下游增強(qiáng)子區(qū)包含在相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)從+6kb延長(zhǎng)到+11kb的SacⅠ限制性片段上。根據(jù)增強(qiáng)子序列預(yù)計(jì)，當(dāng)在H19啟動(dòng)子控制之下，以反向或正向(相對(duì)于內(nèi)源H19基因中的H19增強(qiáng)子的方向)置于異源基因編碼區(qū)的下游時(shí)，該下游增強(qiáng)子能發(fā)揮其作用。另外，含有在圖6、7A、7B和8A-8C(SEQIDNOS3-5)所示的序列的該增強(qiáng)子片段也可用于方便基因表達(dá)。IGF-1基因的表達(dá)和肺癌及乳腺癌有關(guān)。IGF-1啟動(dòng)子R(在人IGF-1基因序列中位于核苷酸1-1630的核苷酸序列(基因庫(kù)登記號(hào)M12659M77496)，在此引入以供參考；Rotwein等，1986，生物化學(xué)雜志2614828-4832)。用4種不同的啟動(dòng)子區(qū)之一表達(dá)IGF-2的基因產(chǎn)物。在胚胎組織中這4種啟動(dòng)子的3種被印記和表達(dá)；然而，啟動(dòng)子P1僅在成年組織中活化(Sussenbach等，1992，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)21-9)。P3啟動(dòng)子與肝癌有關(guān)。也發(fā)現(xiàn)印記的P4啟動(dòng)子(IGF-2基因的核苷酸序列-546～+102)和P3啟動(dòng)子(IGF-2基因的核苷酸序列-1229～+140)在人膀胱癌細(xì)胞中活化，并且可用于指導(dǎo)操作性連接的異源基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的表達(dá)。IGF-2P3和P4啟動(dòng)子可與H19增強(qiáng)子或其活性片段結(jié)合在一起使用。這些來(lái)自在癌細(xì)胞中表達(dá)的基因組印記和非印記基因的調(diào)節(jié)序列能進(jìn)一步去線性化，以確定獲得所希望的腫瘤特異性表達(dá)所需的最短調(diào)節(jié)序列。例如，通過(guò)添加、替換或缺失可改變啟動(dòng)子區(qū)，然后分析其保留的特異于腫瘤的表達(dá)功能。可逐個(gè)檢測(cè)H19下游增強(qiáng)子的各個(gè)部分增強(qiáng)從H19啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的能力。用各種化學(xué)和酶方法能引起調(diào)節(jié)序列中的各種改變，這些方法在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中眾所周知。例如，由限制性位點(diǎn)確定的序列區(qū)能被缺失。能用寡核苷酸定點(diǎn)誘變方法以確定的方式改變序列和／或把限制性位點(diǎn)導(dǎo)入到序列特定區(qū)中。另外，用諸如Bal31或ExoⅢ和S1核酸酶的DNA核酸酶能產(chǎn)生缺失突變體。通過(guò)把所述的DNA與核酸酶溫育更長(zhǎng)的時(shí)間逐步產(chǎn)生調(diào)節(jié)序列中更大的缺失(見(jiàn)Ausubel等，1989，分子生物學(xué)現(xiàn)代技術(shù)，見(jiàn)誘變技術(shù)綜述)。評(píng)價(jià)改變的序列在合適的宿主細(xì)胞，尤其是表達(dá)H19衍生于癌，細(xì)胞(例如膀胱癌細(xì)胞，稱為一個(gè)實(shí)施例)中，指導(dǎo)異源編碼序列的特異于腫瘤的表達(dá)的能力。為進(jìn)一步用途保留其指導(dǎo)腫瘤特異表達(dá)能力并結(jié)合到重組表達(dá)載體中的任何改變的調(diào)節(jié)序列在本發(fā)明的范圍之中。在這些調(diào)節(jié)序列的控制下能表達(dá)各種類型的異源基因，如編碼毒性基因產(chǎn)物、潛在的毒性基因產(chǎn)物、如抗增殖或抑制細(xì)胞的基因產(chǎn)物的基因。也能表達(dá)標(biāo)志基因，它們包括酶(如CAT、β-半乳糖苷酶、螢光素酶)、如綠色螢光蛋白的螢光蛋白或抗原標(biāo)記分子。廣義來(lái)說(shuō)，細(xì)胞毒基因產(chǎn)物定義為包括毒素和誘導(dǎo)凋亡劑。此外，針對(duì)本發(fā)明的目的，細(xì)胞毒基因產(chǎn)物包括把前藥轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒產(chǎn)物的藥物代謝酶類。用在本發(fā)明方法中的細(xì)胞毒基因產(chǎn)物的實(shí)施例包括白喉毒素、假單胞菌毒素、蓖麻毒蛋白霍亂毒素、PE40和腫瘤抑制子基因如視網(wǎng)膜成細(xì)胞瘤和p53。此外，也可用編碼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的凋亡肽的序列。上述凋亡肽包括阿爾海默茨Aβ肽(見(jiàn)LaFerla等，1995，自然遺傳學(xué)921-30)、前房鈉尿肽(見(jiàn)Wu等，1997，生物化學(xué)雜志27214860-14866)、降鈣素基因相關(guān)肽(見(jiàn)Sakuta等，1996，神經(jīng)免疫學(xué)雜志67103-109)、以及其他已知的或待發(fā)現(xiàn)的凋亡肽。把前藥轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒產(chǎn)物的藥物代謝酶包括胸腺嘧啶激酶(來(lái)自單純皰疹病毒或水痘帶狀皰疹病毒)、胞嘧啶脫氨酶、硝酸還原酶、細(xì)胞色素p-4502B1、胸腺嘧啶磷酸化酶、嘌呤核苷磷酸化酶、堿性磷酸酶、羧肽酶A和G2、亞麻苦苷酶(linamarase)、λ內(nèi)酰胺酶、黃嘌呤氧化酶(見(jiàn)Rigg和Sikora，19978月今日分子醫(yī)學(xué)，pp359-366的有關(guān)背景資料)。此外，用本發(fā)明描述的表達(dá)構(gòu)建體可把反義、反基因或aptameric寡核苷酸傳遞到癌細(xì)胞中。核酶或單鏈RNA也能在癌細(xì)胞中表達(dá)以抑制特殊的目的基因的表達(dá)。這些反義或核酶分子作用的靶基因應(yīng)該是那些對(duì)細(xì)胞維持或維持癌細(xì)胞表型所必需的編碼基因產(chǎn)物。上述靶基因包括但不局限于cdk2、cdk8、cdk21、cdc25A、周期蛋白D1、周期蛋白E、周期蛋白A和cdk4。例如，為了下調(diào)內(nèi)源基因的表達(dá)，把下列載體、反義RNAS或核酶導(dǎo)入到細(xì)胞中，其中所述的載體在來(lái)源于在癌細(xì)胞中表達(dá)的印記基因或IGF-1啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)序列控制下；而反義RNAS或核酶對(duì)癌基因形式的p53、c-fos、c-jun、kr-ras和／或Her2／neu的轉(zhuǎn)錄體具有特異性。表達(dá)H19和能活化H19調(diào)節(jié)序列(或特異性地活化IGF-1、IGF-2P3或P4啟動(dòng)子)的腫瘤細(xì)胞能特異地被導(dǎo)向用于表達(dá)反義RNA或核酶RNA。反義方法包括設(shè)計(jì)與靶mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸(在此情況下，mRNA)。該反義寡核苷酸將結(jié)合到互補(bǔ)的靶mRNA轉(zhuǎn)錄體，然后阻止翻譯。絕對(duì)的互補(bǔ)性，盡管是優(yōu)選的，并不需要。在此所指的對(duì)部分RNA的序列“互補(bǔ)性”意味著一種具有能和RNA雜交，形成穩(wěn)定的雙鏈體的足夠互補(bǔ)性的序列。雜交能力將依賴于互補(bǔ)性的程度和反義核酸的長(zhǎng)度。一般來(lái)說(shuō)，所雜交的核酸越長(zhǎng)，它可能含有的與RNA形成的堿基錯(cuò)配就越多，但仍能形成穩(wěn)定的雙鏈體(或三聯(lián)體，視具體情況而定)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用標(biāo)準(zhǔn)方法確定錯(cuò)配的可容許程度，以確定雜交復(fù)合體的熔點(diǎn)。與靶信使RNA的5′末端互補(bǔ)的寡核苷酸，例如直到并包括AUG起始密碼子的5′非翻譯序列，應(yīng)最有效地起抑制翻譯的作用。然而，最近研究表明，與mRNAs的3′非翻譯序列互補(bǔ)的序列也有效地抑制mRNAs的翻譯。一般性地參見(jiàn)，WagnerR，1994，自然372333-335。因此，與靶基因轉(zhuǎn)錄體的5′-或3′-非翻譯、非編碼區(qū)互補(bǔ)的寡核苷酸可用于反義方法，以抑制內(nèi)源基因的翻譯。與mRNA的5′非翻譯區(qū)互補(bǔ)的寡核苷酸應(yīng)包括AUG起始密碼子的互補(bǔ)部分。與mRNA編碼區(qū)互補(bǔ)的反義寡核苷酸是不太有效地翻譯抑制劑，但根據(jù)本發(fā)明可以使用。不管被設(shè)計(jì)成與靶mRNA的5′、3′或與編碼區(qū)雜交，反義核酸至少長(zhǎng)為6個(gè)核苷酸，優(yōu)選地為長(zhǎng)6-約50個(gè)核苷酸范圍的寡核苷酸。具體來(lái)說(shuō)，該寡核苷酸至少有10個(gè)核苷酸、至少17個(gè)核苷酸、至少25個(gè)核苷酸或至少50個(gè)核苷酸。不管如何選擇靶序列，首先進(jìn)行體外研究以定量確定反義寡核苷酸抑制基因表達(dá)的能力是優(yōu)選。這些研究應(yīng)該使用對(duì)照組，該對(duì)照組區(qū)分寡核苷酸的反義基因抑制和非特異的生物學(xué)效應(yīng)。將所述的靶RNA或蛋白水平與內(nèi)部對(duì)照RNA或蛋白的水平進(jìn)行比較的這些研究方法，也是優(yōu)選的。設(shè)計(jì)催化性裂解必需靶基因的核酶分子也能用于阻止靶mRNA的翻譯。(如見(jiàn)，PCT國(guó)際公開(kāi)WO90／11364，1990年10月4日公開(kāi)；Sarver等，1990，科學(xué)2471222-1255)。當(dāng)該核酶特異于一種編碼對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)必需的基因轉(zhuǎn)錄體時(shí)，上述核酶能引起癌細(xì)胞表型的逆轉(zhuǎn)。雖然在特異識(shí)別序列的位點(diǎn)裂解mRNA的核酶可被用于摧毀靶mRNAs時(shí)，但優(yōu)選地使用錘頭核酶。錘頭核酶在與靶mRNA形成互補(bǔ)堿基對(duì)的側(cè)翼區(qū)所示的位置裂解mRNAs。唯一的要求是靶mRNA具有下列2個(gè)堿基的序列5′-UG-3′。錘頭核酶的構(gòu)建和產(chǎn)生在本領(lǐng)域眾所周知，并且在Haseloff和Gerlach，1988，自然，334585-591的方法中更完整地描述。優(yōu)選工程化核酶，這樣裂解識(shí)別位點(diǎn)位于靶mRNA的5′末端附近；即能增加有效性并使細(xì)胞內(nèi)非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄體的積累最少。用于本發(fā)明的核酶也包括RNA內(nèi)切核糖核酸酶(下文被稱為“Cech型核酶”)，例如在嗜溫四膜蟲(chóng)中天然產(chǎn)生的核酶(稱之為IVS，或L-19IVSRNA)，該酶由ThomasCech和合作者進(jìn)行了深入的描述(Zaug等，1984，科學(xué)224574-578；Zaug和Cech，1986，科學(xué)，231470-475；Zaug等，1986，自然，324429-433；大學(xué)專利公司出版的公開(kāi)的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O88／04300；Been和Cech，1986，細(xì)胞，47207-216)。Cech型核酶擁有一個(gè)8堿基對(duì)的活性位點(diǎn)，該位點(diǎn)與靶RNA序列雜交，然后出現(xiàn)靶RNA的裂解。本發(fā)明設(shè)想使用靶定存在于靶基因中的8個(gè)堿基對(duì)活性位點(diǎn)序列的那些Cech類型的核酶。5．2在腫瘤細(xì)胞中的基因活化重新活化印記基因表達(dá)的細(xì)胞也能特異地活化表達(dá)構(gòu)建體，其中該表達(dá)構(gòu)建體含有操作性與異源基因相連的上述印記基因調(diào)節(jié)區(qū)。上述細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞，是本發(fā)明基因治療方法的合適靶物。應(yīng)用RNA分析、原位雜交和報(bào)道基因構(gòu)建體技術(shù)，可以測(cè)定H19和IGF-2P3和P4在腫瘤和細(xì)胞系中的特異表達(dá)。另外，用指導(dǎo)異源基因表達(dá)的IGF-1啟動(dòng)子、可類似地在基因治療中確定和導(dǎo)向具有活化的IGF-1基因表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。對(duì)于大部分RNA分析應(yīng)用，用本領(lǐng)域熟知的任何技術(shù)制備特異與目的基因轉(zhuǎn)錄體雜交的標(biāo)記探針。該標(biāo)記探針可含有至少15-30個(gè)與H19核苷酸序列互補(bǔ)的堿基，更優(yōu)選地含有與H19轉(zhuǎn)錄體互補(bǔ)的50-150個(gè)堿基。針對(duì)H19表達(dá)的特別優(yōu)選的雜交探針是一種與H19信使RNA的3′末端互補(bǔ)，從聚A位點(diǎn)上游大約800個(gè)堿基對(duì)到聚A位點(diǎn)的多核苷酸。在以下由實(shí)施例方式說(shuō)明的本發(fā)明具體實(shí)施方案中，用T7或T3表達(dá)質(zhì)粒體外產(chǎn)生標(biāo)記過(guò)的反義RNA探針。在標(biāo)記核苷酸的存在下通過(guò)隨機(jī)引物法，例如用Prime-It試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA；商品名號(hào)300392)，也能標(biāo)記H19探針。另外，標(biāo)記探針也能用PCR反應(yīng)或標(biāo)準(zhǔn)缺刻翻譯反應(yīng)的方法產(chǎn)生，其中在PCR反應(yīng)中，用H19編碼區(qū)的cDNA克隆和被設(shè)計(jì)用來(lái)擴(kuò)增編碼區(qū)的某一區(qū)域的探針。適于多核苷酸探針的標(biāo)記物包括摻入了放射性同位素(如35S和32P)、螢光素、發(fā)光和顯色標(biāo)簽分子和酶組分的核苷酸。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)原位把標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織樣品雜交，例如用以下實(shí)施例描述的方法及本文引作參考的未決美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08／704，786的方法。另外，如果能獲得足夠量的合適細(xì)胞，可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)RNA分析(如Northern分析、RNA酶保護(hù)法或RNA酶引物延伸法)，測(cè)定目的基因mRNA的表達(dá)水平。另外，有可能“原位”進(jìn)行上述基因表達(dá)分析，即直接從活檢或切除物獲得的病人組織的組織切片(固定和／或固定)上進(jìn)行，這樣沒(méi)有必要純化核酸。諸如上面描述的那些核酸試劑可在這些原位方法中用作探針和／或引物(例如見(jiàn)，Nuovo，G．J．1992，“原位雜交的PCR法方法和應(yīng)用”，Raven出版社，紐約)。確定一種細(xì)胞類型或腫瘤能特異地活化含有操作性與異源基因相連的特異調(diào)節(jié)區(qū)的表達(dá)構(gòu)建體的一種替代方法事實(shí)上是把上述表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。為這些目的，異源基因優(yōu)選是一種標(biāo)記基因產(chǎn)物。在一次對(duì)標(biāo)記基因產(chǎn)物分析中的陽(yáng)性結(jié)果顯示細(xì)胞或細(xì)胞系能從該調(diào)節(jié)區(qū)活化表達(dá)。用這些技術(shù)，具有活化的H19表達(dá)的實(shí)例性腫瘤類型表示如下A．兒童實(shí)體瘤1．Wilm′s腫瘤2．肝胚細(xì)胞瘤3．胚胎性成橫紋肌細(xì)胞瘤B．胚細(xì)胞腫瘤和滋養(yǎng)層腫瘤1．睪丸胚細(xì)胞瘤2．非成熟卵巢畸胎瘤3．骶尾瘤4．絨毛膜癌5．胎盤(pán)點(diǎn)滋養(yǎng)層腫瘤C．成人表皮腫瘤1．膀胱癌2．肝細(xì)胞癌3．卵巢癌4．頸部癌5．肺癌6．乳腺癌7．頭頸部扁平細(xì)胞癌8．食管癌9．類胸腺癌D．起源于神經(jīng)的腫瘤1．星形細(xì)胞瘤2．成神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)神經(jīng)瘤3．成神經(jīng)細(xì)胞瘤相應(yīng)地，通過(guò)本發(fā)明的方法可治療上述癌癥。事實(shí)上，活化H19表達(dá)的任何腫瘤可通過(guò)本發(fā)明的方法治療。另外，上面提到的技術(shù)可用于確定活化IGF-1和IGF-2P3及P4啟動(dòng)子的腫瘤。上述腫瘤也可通過(guò)本發(fā)明的方法治療。例如，在兒童腫瘤中，諸如Wilm′s瘤、成橫紋肌細(xì)胞瘤和成肝細(xì)胞瘤中，IGF-2被活化。5．3把在調(diào)節(jié)序列控制下的多核苷酸導(dǎo)入到宿主細(xì)胞的方法本發(fā)明也涉及一種用含有操作性與異源基因連接的調(diào)節(jié)區(qū)的多核苷酸轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞可用培養(yǎng)方法維持，或者是動(dòng)物的一部分，優(yōu)選哺乳動(dòng)物。一般來(lái)說(shuō)，用本發(fā)明披露的方法和材料，目的多核苷酸可插入到隨后被傳遞的各種載體的任一種中。用完全可靠的分子生物學(xué)技術(shù)(一般見(jiàn)，Sambrook等(1989)分子克?、?Ⅲ卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約和分子生物學(xué)當(dāng)代方法(1989)，JohnWiley&Sons，所有卷和定期的最新資料，在此引入僅供參考)，能產(chǎn)生上述載體。一般來(lái)說(shuō)，如果需要翻譯，也可改造目的異源基因以包含一種如有必要的合適的3′聚腺苷化序列。5．3．1培養(yǎng)細(xì)胞用含有操作性與異源基因連接的印記基因調(diào)節(jié)區(qū)的多核苷酸轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可以是任一種原核或真核細(xì)胞。把多核苷酸連接到基因構(gòu)建體如載體中，然后轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到真核(酵母、鳥(niǎo)類、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物)或原核(細(xì)菌細(xì)胞)的宿主細(xì)胞中是在微生物或組織培養(yǎng)技術(shù)中廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)方法。適于在諸如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞中培養(yǎng)目的多核苷酸的載體包括如下類型的質(zhì)粒來(lái)源于pBR322的質(zhì)粒、來(lái)源于pEMBL的質(zhì)粒、來(lái)源于pEX的質(zhì)粒、來(lái)源于pBTac的質(zhì)粒以及來(lái)源于pUC的質(zhì)粒。為了在酵母中復(fù)制，YEP24、YIP5、YEP51，pYES2和YRP17質(zhì)粒是用于把遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入到啤酒糖酵母中的克隆和表達(dá)載體(例如見(jiàn)，Broach等，1993，基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)操作，由M．Inouge編著，學(xué)術(shù)出版社，83頁(yè))。這些載體由于存在pBR322ori能在大腸桿菌中復(fù)制，并且由于酵母2μm環(huán)形質(zhì)粒的復(fù)制決定子能在酵母中復(fù)制。此外，也可用如氨芐霉素的藥物抗性標(biāo)記。相似地，用于本發(fā)明的多核苷酸的優(yōu)選的哺乳動(dòng)物載體含有2種原核生物的序列，以便于該載體在細(xì)菌中繁殖。應(yīng)用連接的選擇性標(biāo)記基因，設(shè)計(jì)上述載體當(dāng)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，以長(zhǎng)期穩(wěn)定的方式整合到哺乳動(dòng)物的染色體上。另外，諸如牛乳頭瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Barr病毒等病毒的衍生物能用于瞬時(shí)表達(dá)。用于制備宿主生物質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的各種方法在本領(lǐng)域眾所周知。有關(guān)合適的載體系統(tǒng)以及一般重組方法見(jiàn)Sambrook等，見(jiàn)上文。5．3．2基因治療本發(fā)明也包括含有操作性連接用于基因治療的異源基因的基因調(diào)節(jié)區(qū)的多核苷酸在治療癌癥和過(guò)度增殖疾病中的用途。為了基因治療的目的，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可用任一種生物有效載體施用，如能體內(nèi)有效地把重組基因傳遞到細(xì)胞的任一種制劑或組合物。這些方法包括把所述的基因插入到病毒載體或重組的細(xì)菌或真核生物的質(zhì)粒中，所述的病毒載體包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒有關(guān)的病毒、單純皰診病毒-1。病毒載體直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞；質(zhì)粒DNA用下列物質(zhì)輔助下傳遞，例如陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子脂質(zhì)體(如lipofectin，膽固醇衍生物如D．D．A．B．和陽(yáng)離子磷脂)或其衍生物(如連接抗體)、聚賴氨酸偶聯(lián)物、短桿菌肽S、人工病毒包被蛋白或其他上述細(xì)胞內(nèi)載體；也可以體內(nèi)進(jìn)行裸基因構(gòu)建體的直接注射、電穿孔或CaPO4沉淀法。用于癌癥基因治療的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)系統(tǒng)的最新綜述見(jiàn)Cooper，1996，腫瘤學(xué)討論會(huì)23172-187。應(yīng)當(dāng)理解，由于轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的靶細(xì)胞代表基因治療的重要的第一步，具體的基因傳遞系統(tǒng)的選擇性將依賴于目標(biāo)靶物的表型和如局部或全身給藥途徑等這些因素。而且，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，提供用作體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)構(gòu)建體的具體基因構(gòu)建體也用于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，例如用在上面描述的離體組織培養(yǎng)系統(tǒng)中。優(yōu)選的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)核酸到細(xì)胞中的方法是使用含有核酸的病毒載體，例如該核酸為一種在H19調(diào)節(jié)序列控制下的特異細(xì)胞毒基因。用病毒載體感染細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是大部分靶細(xì)胞能接受核酸。此外，在病毒載體中編碼的分子，如在病毒載體中含有的cDNA，可在接受病毒載體核酸的細(xì)胞中有效表達(dá)?？捎帽景l(fā)明披露的方法和組合物傳遞的合適載體，包括但不局限于單純皰診病毒載體、腺病毒載體、腺病毒有關(guān)的病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、假狂犬病毒載體、阿爾發(fā)-皰診病毒載體等。病毒載體尤其是適用于修飾非復(fù)制細(xì)胞的病毒載體，以及如何使用上述載體目的多核苷酸表達(dá)相連接的方法的完整綜述，在“病毒載體基因治療和神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用”Caplitl和Loewy編著，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥(1995)一書(shū)中可找到。已經(jīng)表明通過(guò)修飾病毒顆粒表面的病毒包裝蛋白(例如見(jiàn)PCT公開(kāi)WO93／25234和WO94／06920)，有可能限制病毒和接著基于病毒的載體的感染譜。例如，修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的感染譜的策略包括將特異于細(xì)胞表面抗原的抗體耦聯(lián)至病毒env蛋白中(Roux等，1989，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)869079-9083；Julan等，1992，普通病毒學(xué)雜志，u33251-3255；和Goud等，1983，病毒學(xué)163251-254)；或?qū)⒓?xì)胞表面受體配體耦聯(lián)至病毒env蛋白中(Neda等，1991，生物化學(xué)雜志；26614143-14146)。耦聯(lián)方法可以是和蛋白或其他種類的分子化學(xué)交聯(lián)的形式(如把env蛋白轉(zhuǎn)化成脫唾液酸糖蛋白的乳糖)，以及產(chǎn)生融合蛋白(如單鏈抗體／env融合蛋白)。例如，使用該技術(shù)，例如通過(guò)將抗腫瘤有關(guān)分子的抗體或癌細(xì)胞表面蛋白的抗體耦聯(lián)至重組病毒表面可靶定癌細(xì)胞。該技術(shù)，在用于限制或另外指導(dǎo)對(duì)某些組織類型的感染的同時(shí)，也能用于把外向載體轉(zhuǎn)變成兼嗜性載體。優(yōu)選的用于本發(fā)明的病毒基因傳遞系統(tǒng)使用衍生于腺病毒的載體?？刹僮魈幚硐俨《镜幕蚪M，使其編碼和表達(dá)目的基因產(chǎn)物，而在正常裂解性病毒生活周期中的復(fù)制能力方面被失活。例如見(jiàn)Berkner等，1988，生物技術(shù)6616；Rosenfeld等，1991，科學(xué)252∶431-434；和Rosenfeld等，1992，細(xì)胞68143-155。合適的來(lái)源于腺病毒株AD型5d1324或其他腺病毒株(如Ad2、Ad3、Ad7等)的腺病毒載體在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中眾所周知。在某些情況下重組腺病毒是有利的，因?yàn)樗鼈兛捎糜诟腥靖鞣N類型的細(xì)胞類型，這些細(xì)胞包括氣管表皮(Rosenfeld等，1992，見(jiàn)上文的引用)、內(nèi)皮細(xì)胞(Lemarchand等，1992，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)896482-6486)、肝細(xì)胞(Herz和Gerard，1993，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)902812-2816)和肌肉細(xì)胞(Quantin等，1992，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)892581-2584)。而且，病毒顆粒相對(duì)穩(wěn)定，容易純化和濃縮，并可被修飾以影響感染譜。此外，導(dǎo)入的腺病毒DNA(和含在其中的外源DNA)不整合到宿主細(xì)胞的基因組中但以附加體形式存在，因而避免可能出現(xiàn)的插入誘變的潛在問(wèn)題，在插入誘變的情形中，導(dǎo)入的DNA成為整合到宿主基因組中(如逆病毒DNA)。再者，相對(duì)于其他基因傳遞載體，腺病毒基因組攜帶外源DNA的能力大(高達(dá)8個(gè)堿基對(duì))(Berkner等，見(jiàn)上文的引用，Hai-Ahmand和Graham1986，病毒學(xué)雜志57267)。普遍使用并因此受本發(fā)明推崇的大部分復(fù)制缺陷的腺病毒載體，被缺失所有或部分病毒的E1和E3基因，但仍保留多達(dá)80％的腺病毒遺傳物質(zhì)(如見(jiàn)，Jones等，1979，細(xì)胞16683；Berkner等，同上；和Graham等，分子生物學(xué)方法，E．J．Murray編著(Humana，CliftonNJ，1991)7卷，109-127頁(yè))。另一種用于本發(fā)明目的表達(dá)構(gòu)建體傳遞之一的病毒載體系統(tǒng)是腺伴隨病毒(AAV)。腺伴隨病毒是一種天然產(chǎn)生的缺陷病毒，該病毒需要另一種病毒如腺病毒或皰診病毒作為輔助病毒，以進(jìn)行有效的復(fù)制和增殖性生命周期(見(jiàn)Muzyczka等的綜述，當(dāng)代微生物學(xué)和免疫學(xué)專題15897-129)。它也是可以把其DNA整合到非分裂細(xì)胞并表現(xiàn)為高頻率的穩(wěn)定相互作用的少數(shù)病毒之一(例如見(jiàn)Flotte等，1992，美國(guó)呼吸協(xié)會(huì)細(xì)胞分子生物學(xué)雜志7349-354，Samulski等，1989，病毒學(xué)雜志，633822-3828；和McLaughlin等，1989，病毒學(xué)雜志631963-1973)。含有少達(dá)300個(gè)AAV堿基對(duì)的載體能被包裝和整合。對(duì)外源DNA的空間限制為大約4．5kb。諸如在Tratschin等，1985，分子細(xì)胞生物學(xué)53251-3260中描述的一種AAV載體可用于把DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中。用AAV載體，已把各種核酸導(dǎo)入到不同類型的細(xì)胞中(例如見(jiàn)Hermonat等，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)816466-6470；Tratschin等，1985分子細(xì)胞生物學(xué)42072-2081；Wondisford等，1988，分子內(nèi)分泌學(xué)232-39；Tratschin等，1984，病毒學(xué)雜志51611-619；和Flotte等，1993，生物化學(xué)雜志2683781-3790)。除了如上述所描述的病毒輸送方法外，也可以使用非病毒方法以引起所需的外源基因在動(dòng)物組織中的定向表達(dá)。大多數(shù)基因輸送的非病毒法依賴于由哺乳動(dòng)物細(xì)胞用于吸收和胞內(nèi)運(yùn)送大分子的普通機(jī)理。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的非病毒基因傳遞系統(tǒng)依賴用于靶向細(xì)胞吸收目的表達(dá)構(gòu)建體的胞吞通路。該類型的說(shuō)明性基因傳遞系統(tǒng)包括來(lái)源于脂質(zhì)體的系統(tǒng)、聚賴氨酸偶聯(lián)物和人工病毒包被。在臨床應(yīng)用方面，用于治療性表達(dá)構(gòu)建體的基因傳遞系統(tǒng)可由眾多方法之任一種導(dǎo)入到病人中，其中每一種方法在本領(lǐng)域眾所周知。例如，基因傳遞系統(tǒng)的藥用制劑可通過(guò)如靜脈注射而全身性導(dǎo)入，并且由于異源基因的調(diào)節(jié)序列受控表達(dá)，或者與基因傳遞載體靶向具體細(xì)胞類型結(jié)合的調(diào)節(jié)序列，該構(gòu)建體在靶細(xì)胞中的特異表達(dá)根據(jù)由細(xì)胞類型或組織類型表達(dá)所提供的轉(zhuǎn)染特異性顯著地發(fā)生。在另一種實(shí)施方案中，伴隨著導(dǎo)入相當(dāng)局限的動(dòng)物中，重組表達(dá)構(gòu)建體的初始傳遞更受限制。例如，可用導(dǎo)管(見(jiàn)美國(guó)專利5，328，470)或立體注射法(例，Chen等，1994，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)913054-3057)導(dǎo)入基因傳遞載體?？稍诨蛑委煒?gòu)建體中，用例如由Dev等，1994，癌癥治療綜述20105-115所描述的技術(shù)經(jīng)電穿孔法傳遞本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體?；蛑委煒?gòu)建體的藥用制劑本質(zhì)上由在可接受的稀釋劑中的基因傳遞系統(tǒng)所組成，或者可包含一種緩釋基質(zhì)，其中所述基因傳遞載體包埋在該基質(zhì)中。另外，在完整的基因傳遞系統(tǒng)可完整地從重組細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該藥用制劑可包括產(chǎn)生基因傳遞系統(tǒng)的一種或多種細(xì)胞。5．3．3治療終點(diǎn)和劑量普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)懂得，從醫(yī)生或病人的角度來(lái)看，任何基本上緩解或預(yù)防和癌癥病情有關(guān)的非所希望的癥狀(如，疼痛、敏感性和體重減輕等)是合乎要求的。另外，任何腫瘤重量或生長(zhǎng)率的降低以及改善腫瘤組織病理圖像是所希望的。因此，關(guān)于本申請(qǐng)的目的，在此所用的術(shù)語(yǔ)“治療”、“治療用途”、或“醫(yī)藥用途”指的是所要求保護(hù)的組合物的任何及所有的用途，其中這些組合物治療疾病狀態(tài)或癥狀，或者換言之用任何提及的方法預(yù)防、阻止、延緩或逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展或其他非所需的癥狀。有效劑量和治療方案可通過(guò)常規(guī)方法確定，在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中用低劑量開(kāi)始，然后增加劑量并同時(shí)監(jiān)測(cè)作用效果，并也可以用全身性地改變劑量方案。動(dòng)物研究，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物研究通常被用來(lái)確定每公斤體重生物活性劑的最大可耐受劑量，或MTD。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常外推有效劑量并避免對(duì)其他物種，包括人類的毒性。進(jìn)行對(duì)人的效能研究前，在正常個(gè)體中的Ⅰ期臨床研究有助于確立安全劑量。當(dāng)確定對(duì)給定個(gè)體的最佳劑量時(shí)，臨床醫(yī)生可能考慮許多因素。這些因素中最主要的是所選擇的異源基因產(chǎn)物的毒性和半衰期。其他因素包括病人的個(gè)體大小、病人的年齡、病人的一般情況、被治療的具體癌癥、疾病的嚴(yán)重度、病人所用的其他藥物、基因產(chǎn)物的體內(nèi)活性等?？紤]動(dòng)物研究的結(jié)果和臨床文獻(xiàn)后，選擇實(shí)驗(yàn)劑量。例如，含有操作性與一種異源基因連接的H19調(diào)節(jié)區(qū)的腺病毒載體的直接注射到腫瘤塊內(nèi)的一般人用劑量為1×107pfu-1×1010pfu／天，其中所述的異源基因編碼一種諸如胸腺嘧啶激酶的細(xì)胞毒劑。更優(yōu)選地，把上述腺病毒載體直接注射到腫瘤內(nèi)的每日劑量為1×1O8pfu-1×10-10pfu。對(duì)于一種含有操作性與不同水平毒性的細(xì)胞毒基因產(chǎn)物連接的H19調(diào)節(jié)區(qū)的腺病毒載體來(lái)說(shuō)，這些值當(dāng)然將作相應(yīng)的改變。也能用相似劑量的一種腺病毒載體作為表示性起點(diǎn)，其中該腺病毒載體含有操作性與編碼如胸腺嘧啶激酶的細(xì)胞毒劑的異源基因的IGF-2P4啟動(dòng)子。尤其是考慮體內(nèi)使用時(shí)，本發(fā)明的各種生化組分優(yōu)選地具有高純度并且基本上無(wú)潛在的有害污染物(例如，至少國(guó)家食品(NF)級(jí)、通常至少分析級(jí)和優(yōu)選地至少藥用級(jí))。由于所確定的化合物必須使用前合成，上述合成或隨后的純化優(yōu)選產(chǎn)生這樣的產(chǎn)物，其中該產(chǎn)物在合成或純化方法中基本上無(wú)任何潛在的所用的毒性劑。對(duì)于用于治療個(gè)體的癌癥病情，本發(fā)明在一方面提供以無(wú)菌分裝的小瓶或安瓿形式的一種試劑盒或試劑包，其中它含有與編碼細(xì)胞毒劑的異源基因操作性連接在一起的H19調(diào)節(jié)區(qū)的多核苷酸載體或載體釋放細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，以即可給藥的制劑的形式，該試劑盒包含單劑或復(fù)劑形式的含有一種操作性與編碼細(xì)胞毒劑的異源基因連接的H19調(diào)節(jié)區(qū)的多核苷酸載體，其中所述的包裝內(nèi)含一種指導(dǎo)其內(nèi)含物用于治療癌癥的標(biāo)記物。另外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，該試劑包提供一種無(wú)菌分裝的含有上述釋放載體的細(xì)胞或細(xì)胞系的小瓶或安瓿瓶。為了貯存和運(yùn)輸，應(yīng)該冷凍載體釋放細(xì)胞或細(xì)胞系。另外，該試劑包也可以含有用于培養(yǎng)所述的釋放載體的細(xì)胞或細(xì)胞系的培養(yǎng)基和試劑。描述本發(fā)明后，提供下列實(shí)施例用以說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。6．實(shí)施例H19調(diào)節(jié)序列有利于異源基因在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)本節(jié)描述含有置于H19調(diào)節(jié)序列的控制下的CAT報(bào)道基因的各種表達(dá)構(gòu)建體的構(gòu)建方法，以及將它們轉(zhuǎn)移到幾種不同的膀胱癌細(xì)胞系。6．1材料和方法6．1．1細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染方法膀胱癌細(xì)胞系HT-1376、EJ28、T24P、1197和UM-UC-3從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，并按照ATCC推薦的方法維持。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行。把沉淀物(7μg質(zhì)粒)加入到30mm平皿0．3×106個(gè)細(xì)胞的1ml培養(yǎng)基中。16小時(shí)后，移去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并加入新鮮的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24-96小時(shí)收獲細(xì)胞，然后用丁?；?CoA有機(jī)相抽提法(Sambrook等，1989)測(cè)定CAT活性。把上層有機(jī)相的等分試樣(100μl)轉(zhuǎn)移到含有3ml閃爍液的孔中，然后計(jì)數(shù)。6．1．2表達(dá)載體的構(gòu)建方法pCAT基本質(zhì)粒(含有多個(gè)克隆位點(diǎn)之前的一個(gè)CAT報(bào)道基因)、pCAT啟動(dòng)子質(zhì)粒(含有在SV40啟動(dòng)子控制下的CAT報(bào)道基因)、pCAT增強(qiáng)子質(zhì)粒(含有位于CAT報(bào)道基因下游的SV40增強(qiáng)子)和一個(gè)用于在CAT報(bào)道基因上游插入啟動(dòng)子的多克隆位點(diǎn))以及pCAT對(duì)照質(zhì)粒(含有SV40啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的CAT報(bào)道基因)，全部按商業(yè)途徑從Promega(Madison，WI)購(gòu)得。為構(gòu)建含有H19啟動(dòng)子控制下的CAT報(bào)道基因的質(zhì)粒pH19E，首先把H19啟動(dòng)子區(qū)(SEQIDNO1)克隆到pBluescriptⅡSK+(Promega)中。從人胎盤(pán)DNA用下列引物，擴(kuò)增含有H19啟動(dòng)子序列的多核苷酸。ESPCR21CGGTTCCCCACTTCCCCAGTTT(SEQIDNO6)ESPCR22CGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT(SEQIDNO7)用Klenow酶把該P(yáng)CR產(chǎn)物的末端抹平并克隆到pBluescriptⅡSK+的EcoRⅤ位點(diǎn)上。所插入的DNA用內(nèi)切酶PvuⅡ、EcoRⅠ和ApaⅠ消化證實(shí)。該啟動(dòng)子的方向與載體的lacZ編碼區(qū)的方向相反。然后用HindⅢ和PstⅠ切割法切下該啟動(dòng)子區(qū)，所得到的大約0．9kb的片段插入到pCAT基本質(zhì)粒HindⅢ-PstⅠ位點(diǎn)中以產(chǎn)生pH19E。按下列方法構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，其中該表達(dá)質(zhì)粒含有在H19啟動(dòng)子／CAT報(bào)道基因下游2個(gè)方向插入的H19增強(qiáng)子區(qū)。一條含有H19下游增強(qiáng)子(相對(duì)于H19轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)+6．0kb～+11kb)的5kbSacⅠ片段被克隆到pUC19的SacⅠ位點(diǎn)。然后用EcoRⅠ和HindⅢ切下該增強(qiáng)子片段，并連接到pBluescriptⅡSK+的EcoRⅠ-HindⅢ位點(diǎn)上而產(chǎn)生pBhH19En-Sa。用BamHⅠ部分消化pBhH19En-Sa，含有H19增強(qiáng)子(和一個(gè)內(nèi)部BamHⅠ位點(diǎn))的該5kb片段被克隆到在pH19E中H19啟動(dòng)子／CAT報(bào)道基因的下游的BanHⅠ位點(diǎn)上。產(chǎn)生了在正方向(pH19EH19D)和反方向(pH19EH19R)含有H19增強(qiáng)子的質(zhì)粒。6．2結(jié)果和討論用pCAT基本質(zhì)粒(在圖2命名為P-E)、pCAT對(duì)照質(zhì)粒(在圖2命名為pSV40ESV40)、pH19E、pH19EH19D和pH19EH19R的每一種轉(zhuǎn)染5種不同的膀胱癌細(xì)胞系HT-1376、EJ28、T24P、1197和UM-UC-3。每種構(gòu)建體的表達(dá)結(jié)果在圖3A-3E表示。在每種細(xì)胞系中，用含有SV40增強(qiáng)子和SV40啟動(dòng)子的pCAT對(duì)照質(zhì)粒觀察到最高水平的CAT活性。該構(gòu)建體用作陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)橐呀?jīng)確立了SV40調(diào)節(jié)序列作為基因表達(dá)的誘導(dǎo)子。然而SV40調(diào)節(jié)序列其誘導(dǎo)基因表達(dá)的能力并不是腫瘤細(xì)胞特異的。用含有在H19啟動(dòng)子的控制下的CAT報(bào)道基因的pH19E轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，也顯示相對(duì)于背景明顯增加的CAT的表達(dá)。由H19啟動(dòng)子誘導(dǎo)CAT活性的水平范圍在從HT-1376細(xì)胞系中的5倍至在UM-UC-3細(xì)胞系中的1O倍。把H19增強(qiáng)子加入到H19啟動(dòng)子／CAT報(bào)道基因的構(gòu)建體中進(jìn)一步增加在某些細(xì)胞系中的表達(dá)水平。例如，在細(xì)胞系EJ28、T24P和1197中，H19增強(qiáng)子明顯地增加從H19啟動(dòng)子／CAT報(bào)道基因起始的表達(dá)。然而，增強(qiáng)子的方向在不同細(xì)胞系中得到不同的結(jié)果。在細(xì)胞系HT-1376和UM-UC-3中，該增強(qiáng)子對(duì)表達(dá)有微弱影響或沒(méi)有影響。這些結(jié)果表明人H19啟動(dòng)子區(qū)指導(dǎo)操作性連接的異源基因在各種類型的來(lái)源于膀胱癌的細(xì)胞系中表達(dá)。在一些來(lái)源于膀胱癌的細(xì)胞系中，該H19增強(qiáng)子能進(jìn)一步增加在H19控制下的報(bào)道基因的表達(dá)。7．實(shí)施例一種在H19調(diào)節(jié)序列控制下的毒素基因7．1材料和方法修飾在上述6節(jié)中描述的表達(dá)構(gòu)建體，替代CAT以表達(dá)編碼毒性產(chǎn)物或藥物原的序列。例如，用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法，移去編碼CAT基因產(chǎn)物的序列，并用編碼單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)的序列取代。把H19／藥物原表述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到在6節(jié)描述的來(lái)源于膀胱癌的細(xì)胞系中。當(dāng)轉(zhuǎn)染到膀胱癌細(xì)胞系中時(shí)，在9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥(niǎo)嘌呤的存在下，H19／HSV-TK表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞特異的細(xì)胞毒性。8．實(shí)施例在化學(xué)誘導(dǎo)的膀胱癌的小鼠模型中的H19表達(dá)8．1材料和方法以每籠6只小鼠飼養(yǎng)70只5周齡的雌性C3H／He小鼠(CharlesRiver)，并使小鼠適應(yīng)12小時(shí)光照／12小時(shí)黑暗周期的空調(diào)房間。在8周齡時(shí)，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，把小鼠強(qiáng)制分成對(duì)照組(10只小鼠)和實(shí)驗(yàn)組(60只小鼠)。隨意喂給實(shí)驗(yàn)組小鼠溶在飲用水中的0．05％N-丁基-N-(4-羥丁基)亞硝胺(TokyoKaseiKogyoCo．Ltd．東京，日本)。對(duì)照組小鼠喂給自來(lái)水。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的第4、8、12、16、20和26周殺死來(lái)自兩組的動(dòng)物。用標(biāo)準(zhǔn)方法切下膀胱，固定，并包埋在石蠟塊中。8．1．1探針的制備含有小鼠H19編碼區(qū)的2．1kb的片段亞克隆到pBluescriptⅡKS質(zhì)粒(Stratagene，LaJolla，CA)中T7和T3RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)之后。用T7聚合酶(BoehringerMannheim)和AmershamRPN2006試劑盒，從HindⅢ線性化的質(zhì)粒DNA中，體外產(chǎn)生〔35S〕標(biāo)記的反義H19RNA。體外產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄體具有107cpm／μg的比活。用T3聚合酶(BoehringerMannheim)和EcoRⅠ線性化模板制備的有義H19mRNA被用作對(duì)照。8．1．2原位雜交福爾馬林固定組織的石蠟切片(5μM)被固定在3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷(3-aminopropyltriethoxylane)(Tespa，Sigma)包被的顯微鏡用載玻片上，然后37℃干燥過(guò)夜。切片用二甲苯脫蠟，用4％多聚甲醛固定，然后用蛋白酶K(Sigma)處理。切片被乙?；越档吞结樀姆翘禺惤Y(jié)合，并通過(guò)系列乙醇脫水。按照Rangini等，1991，Mech．Dev．3513-24描述的方法(省略thio-AMP步驟)，用〔35S〕標(biāo)記的RNA探針(比活50，000CPU／μl)雜交。切片與顯影膜接觸10天，然后用蘇木精和伊紅復(fù)染。在明暗視野照明下用Polyvar(ReichertJung)顯微鏡檢查載玻片并照相。對(duì)照組包括與正義RNA探針雜交及RNA酶預(yù)雜交處理。另外，來(lái)自成年健康小鼠(不表達(dá)H19)和胚胎小鼠膀胱(表達(dá)H19)的膀胱切片分別用作陰性和陽(yáng)性對(duì)照。8．2結(jié)果和討論到第26周，所有存活的實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)可觸摸的膀胱腫瘤。在化學(xué)誘導(dǎo)的膀胱腫瘤中觀察到H19的廣泛表達(dá)。相反，在正常成年膀胱中，未檢測(cè)到H19的表達(dá)。因此，該化學(xué)誘導(dǎo)膀胱癌的小鼠模型可用作一種動(dòng)物模型，用來(lái)說(shuō)明含有操作性與毒素基因相連接的H19調(diào)節(jié)區(qū)的構(gòu)建體體內(nèi)特異于腫瘤的細(xì)胞毒性。9．實(shí)施例用H19調(diào)節(jié)序列以在膀胱癌小鼠模型中表達(dá)異源基因的基因治療為了體內(nèi)傳遞到小鼠膀胱中，把H19／毒素或前藥表達(dá)質(zhì)粒結(jié)合到脂質(zhì)體中(如按照Takashita等，1993，臨床研究雜志93652-651所描述的方法，在此引入僅供參考)。用于本實(shí)驗(yàn)的小鼠是在上面第8節(jié)描述的患有化學(xué)的膀胱腫瘤。簡(jiǎn)言之，將溶在500μl的Optimen′s無(wú)血清培養(yǎng)基(BRL生命技術(shù)公司，Gaithersburg，MD)的50μg質(zhì)粒DNA加到250μlLipofectamine及250μl水中?；旌弦涸谑覝叵聹赜?0分鐘，然后稀釋在10ml的平衡鹽溶液中(BSS(-)140mMNaCl，5．4mMKCl，10mMTris-HCl，pH7．6)。把溶液在15，000rpm離心30分鐘沉淀后，該脂質(zhì)體重新懸浮在1ml含有1mMCaCl2的BSS(-)中。大約0．2ml的濃縮脂質(zhì)體經(jīng)導(dǎo)管施用到載有化學(xué)誘導(dǎo)的膀胱腫瘤的小鼠中。帶有膀胱腫瘤的對(duì)照組小鼠接受沒(méi)有DNA的脂質(zhì)體，或者含有在H19調(diào)節(jié)序列控制下的無(wú)關(guān)基因的構(gòu)建體。在確定的時(shí)間點(diǎn)，殺死每組的小鼠，用標(biāo)準(zhǔn)方法切下膀胱，固定并包埋在石蠟塊中。在原位雜交中用上面描述的H19探針或針對(duì)假單胞桿菌毒素基因的編碼序列的探針處理另外的切片。此外，比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間腫瘤的大小、數(shù)量和壞死程度。發(fā)現(xiàn)假單胞菌毒素的表達(dá)與H19的表達(dá)共同定位在來(lái)自實(shí)驗(yàn)組小鼠的膀胱腫瘤內(nèi)。此外，與對(duì)照組小鼠中的膀胱腫瘤相比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠中的膀胱腫瘤大小減少并且壞死程度降低。10．實(shí)驗(yàn)例在腫瘤細(xì)胞系中從IGF-2P3和P4啟動(dòng)子起始的表達(dá)10．1材料和方法在本實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建各種含有置于4種不同的IGF-2啟動(dòng)子之一控制下的螢光素酶報(bào)道基因的表達(dá)構(gòu)建體，并轉(zhuǎn)移到幾種不同膀胱癌的細(xì)胞系中。制得了下列人IGF-2啟動(dòng)子／螢光脂酶構(gòu)建體<tablesid="table1"num="001"><table>質(zhì)粒構(gòu)建體IGF-2基因核苷酸序列啟動(dòng)子Hup1-980to+54啟動(dòng)子1Hup2-379to+271啟動(dòng)子2Hup3-1229to+140啟動(dòng)子3Hup4-546to+102啟動(dòng)子4</table></tables>在Sussenbuch等，1992，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)21-9中描述IGF-2的啟動(dòng)子序列，在此引入以供參考。螢光素酶報(bào)道基因按商業(yè)途徑從Promega公司，Madison，WI(目錄號(hào)#E1641)購(gòu)到。10．2結(jié)果和討論按上面第6節(jié)所描述的方法，把得到的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到人膀胱癌細(xì)胞系HT-1376、EJ28、T24P、1197和UM-UC-3中。用試劑盒(Promega公司，Medison，WI，目錄號(hào)E1500)測(cè)定螢光素酶活性。在圖4A-4E中顯示的結(jié)果說(shuō)明，IGF-2P4啟動(dòng)子指導(dǎo)在每種所測(cè)定的膀胱癌細(xì)胞系中螢光素酶報(bào)道基因的表達(dá)。在細(xì)胞系1197中，IGF-2P3啟動(dòng)子也指導(dǎo)螢光素酶報(bào)道基因的表達(dá)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，IGF-2P3和P4啟動(dòng)子被顯示指導(dǎo)螢光素酶在其他腫瘤細(xì)胞系包括絨毛膜癌細(xì)胞和成橫紋肌細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)。11．實(shí)施例H19啟動(dòng)子和IGF-2啟動(dòng)子與H19增強(qiáng)子一起作用促進(jìn)異源基因的表達(dá)11．1材料和方法4種螢光素酶報(bào)道基因載體，pGL3-基本、pGL3-啟動(dòng)子、PGL3-增強(qiáng)子和pGL3-對(duì)照從Promega公司獲得。用多種不同的轉(zhuǎn)染試劑和磷酸鈣方法(Gorman等，1982，分子細(xì)胞生物學(xué)21044-1051)，把這些載體轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細(xì)胞系中，所用的轉(zhuǎn)染試劑包括lipofetamine(Gibco／BRL)、fugene(Boehringer)、8種脂質(zhì)試劑的完美轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)、TFX-10、TFX-20、快速轉(zhuǎn)染試劑盒(Promega)。被克隆到pBluescriptⅡSK的EcoRV位點(diǎn)上的H19啟動(dòng)子(pbh19p#1)在第6節(jié)描述，同上。通過(guò)用SmaⅠ和HindⅢ切割切下H19啟動(dòng)子，然后將所得到的0．9kb的片段插入到pGL3-基本載體的SmaⅠ-HindⅢ位點(diǎn)上，以產(chǎn)生Luc-pbh19構(gòu)建體。用引物5′-ATATGGTACCGACAACCCTCACCAAAG-3′(上游，SEQIDNO8)和5′-ATATAAGCTTCTTCTCCCTCACCCTGCTC-3′(下游，SEQIDNO9)，從pbh19p#1質(zhì)粒經(jīng)PCR法擴(kuò)增來(lái)自nt-819-+14的H19啟動(dòng)子區(qū)。用kpnⅠ和HindⅢ消化所得到的PCR產(chǎn)物，然后連接到pGL-3-基本載體的KpnⅠ-HindⅢ位點(diǎn)上，產(chǎn)生Luc-PBH19構(gòu)建體。該P(yáng)CR產(chǎn)生的H19啟動(dòng)子通過(guò)自動(dòng)染料終止子循環(huán)測(cè)序法(ABTPrism377DNA測(cè)序儀，PerkinElmer)，在2個(gè)方向測(cè)序。圖5顯示通過(guò)PCR產(chǎn)生的H19啟動(dòng)子的核苷酸序列(SEQIDNO2)。按第6節(jié)描述的(同上)5kbH19下游增強(qiáng)子用DamH消化，產(chǎn)生2條片段4．1kb和3′末端的0．9kb。把H19增強(qiáng)子的0．9kb和4．1kb的BamHⅠ片段分別插入到Luc-PBH19質(zhì)粒的BamHⅠ位點(diǎn)上構(gòu)建Luc-PBH19-0．9EH19和Luc-PBH19-4EH19構(gòu)建體。該增強(qiáng)子序列定位在H19啟動(dòng)子／螢光素酶報(bào)道基因的下游。將0．9kbBamHⅠ增強(qiáng)子片段連接至pGL-基本載體的BamHⅠ位點(diǎn)以產(chǎn)生Luc-0．9EH19載體。用KpnⅠ-BamHⅠ切下pbh19p#1質(zhì)粒的H19啟動(dòng)子，并連接至Luc-0．9EH19構(gòu)建體的KpnⅠ-BglⅡ位點(diǎn)，產(chǎn)生包含如節(jié)6，見(jiàn)上文所描述的啟動(dòng)子克隆和位于H19Luc報(bào)道基因下游的0．9kb增強(qiáng)子的Luc-pbh19-0．9EH19表達(dá)載體。用Sussenbach等，1992，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)21-9中所描述的方法，構(gòu)建分別在人IGF-2啟動(dòng)子P1、P2、P3和P4控制下含有螢光素酶基因命名為Hup-1、Hup-2、Hup-3和Hup-4的表達(dá)載體。用引物5′-ACAGGTACCTCTAGAGTCGACCT-3′(上游，SEQIDNO10)和5′-ATATAAGCTTGCTCCCATCCTGCA-3′(下游，SEQIDNO11)，從Hup-4構(gòu)建體通過(guò)PCR法擴(kuò)增512bp的P4區(qū)。所得到的PCR產(chǎn)物用KpnⅠ-HindⅢ消化，然后連接到pGL3-基本報(bào)道基因載體的KpnⅠ-HindⅢ位點(diǎn)，以產(chǎn)生Luc-P4報(bào)道基因的載體。還制備了含有IGF-2P4啟動(dòng)子和H19增強(qiáng)子的表達(dá)載體。一條來(lái)源于前面描述的4．1kb片段的2kbBamHI增強(qiáng)子片段被克隆到Luc-P4構(gòu)建體的BamHI位點(diǎn)，產(chǎn)生Luc-P4-2EH19表達(dá)載體。用自動(dòng)DNA測(cè)序法對(duì)0．9kb、2kb和4．1kb的H19增強(qiáng)子測(cè)序。0．9kb增強(qiáng)子的核苷酸序列在圖6顯示(SEQIDNO3)。2kb增強(qiáng)子的核苷酸序列在圖7A和7B顯示(SEQIDNO4)。4．1kb增強(qiáng)子的核苷酸序列在圖8A-8C顯示(SEQIDNO5)。11．2結(jié)果和討論當(dāng)用幾種轉(zhuǎn)染試劑把4種含螢光素酶基因的載體導(dǎo)入到培養(yǎng)的細(xì)胞系時(shí)，對(duì)大部分所測(cè)定的細(xì)胞系來(lái)說(shuō)，磷酸鈣沉淀法產(chǎn)生最高的轉(zhuǎn)染效率。因此，鈣沉淀法隨后被用來(lái)轉(zhuǎn)染各種表達(dá)載體。此外，增加質(zhì)粒DNA的濃度不抑制轉(zhuǎn)染效率，甚至它們?cè)谄脚_(tái)期以上的濃度使用時(shí)也如此。將膀胱癌細(xì)胞系5637、肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞系Huh7和腎瘤細(xì)胞系293T用不同構(gòu)建體的每一種轉(zhuǎn)染，所述的構(gòu)建體含有和H19增強(qiáng)子結(jié)合在一起在H19或IGF-2P4啟動(dòng)子控制下的螢光素酶報(bào)道基因。相對(duì)于背景，用含有報(bào)道基因和H19啟動(dòng)子的Luc-ph19和Luc-PH19轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)為增加基因表達(dá)(圖9A-9C)。在所測(cè)定的每種細(xì)胞系中，含有PCR產(chǎn)生的啟動(dòng)子的構(gòu)建體Luc-PH19比Luc-ph19表現(xiàn)為更高的活性。把H190．9kb的增強(qiáng)子片段添加到Luc-ph19報(bào)道載體(Luc-ph19-0．9EH19)上進(jìn)一步在細(xì)胞系5637和293T中分別增加表達(dá)水平，為2-4倍。相對(duì)于背景，IGF-2P4啟動(dòng)子也增加在所有的細(xì)胞系中螢光素酶的表達(dá)。把2kbH19增強(qiáng)子片段添加到Luc-P4表達(dá)載體上增強(qiáng)P4啟動(dòng)子活性。由2kb增強(qiáng)子片段誘導(dǎo)的螢光素酶活性水平的范圍從293T細(xì)胞系的2倍至Huh7細(xì)胞系中的6倍，而該增強(qiáng)子僅微弱地增強(qiáng)在5673細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性。圖10A-10E顯示含有PCR產(chǎn)生的H19啟動(dòng)子和4．1kbH19增強(qiáng)子片段的構(gòu)建體Luc-ph19-4EH19的表達(dá)。除了在5637細(xì)胞系外，該增強(qiáng)子在細(xì)胞系中將啟動(dòng)子活性增強(qiáng)3-28倍。12．克隆的保藏根據(jù)用于專利程序的微生物保藏的國(guó)際承認(rèn)的布達(dá)佩斯條約的有關(guān)規(guī)定，將下述質(zhì)粒保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、Manassas，VA。克隆ATCC保藏日期登記號(hào)pH19EH192093221997年10月2日等值方案前面描述的具體內(nèi)容足以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。的確，對(duì)分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的在實(shí)施本發(fā)明時(shí)作出上述方案的各種修改方案被認(rèn)為在下列權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。在此引用的所有出版物其全文被引出參考。序列表&#60110&#62耶路撒冷希伯萊大學(xué)伊森姆研究開(kāi)發(fā)公司&#60120&#62誘導(dǎo)對(duì)腫瘤特異的細(xì)胞毒性的方法和組合物&#60130&#629457-0014-228&#60140&#62PCT／IL98／00486&#60141&#621998-10-04&#60150&#62US09／165，240&#60151&#621998-10-01&#60150&#62US08／943，608&#60151&#621997-10-03&#60160&#6211&#60170&#62FastSEQforWindowsversion3．0&#60210&#621&#60211&#62830&#60212&#62DNA&#60213&#62人類&#60400&#621ctgcagggccccaacaaccctcaccaaaggccaaggtggtgaccgacggacccacagcgg60ggtggctgggggagtcgaaactcgccagtctccactccactcccaaccgtggtgccccac120gcgggcctgggagagtctgtgaggccgcccaccgcttgtcagtagagtgcgcccgcgagc180cgtaagcacagcccggcaacatgcggtcttcagacaggaaagcggccgcgaacgggaccg240gggtgcccagcggctgtggggactctgtcctgcggaaaccgcggtgacgagcacaagctc300ggtcaactggatgggaatcggcctggggggctggcaccgcgcccaccagggggtttgcgg360cacttccctctgcccctcagcaccccacccctactctccaggaacgtgaggtctgagccg420tgatggtggcaggaaggggccctctgtgccatccgagtccccagggacccgcagctggcc480cccagccatgtgcaaagtatgtgcagggcgctggcaggcagggagcagcaggcatggtgt540cccctgaggggagacagtggtctgggagggagaggtcctggaccctgagggaggtgatgg600ggcaatgctcagccctgtctccggatgccaaaggaggggtgcggggaggccgtctttgga660gaattccaggatgggtgctgggtgagagagacgtgtgctggaactgtccagggcggaggt720gggccctgcgggggccctcgggagggccctgctctgattggccggcagggcaggggcggg780agttctggcgggccaccccagttagaaaaagcccgggctaggaccgagga830&#60210&#622&#60211&#62833&#60212&#62DNA&#60213&#62人類&#60400&#622gacaaccctcaccaagggccaaggtggtgaccgacggacccacagcggggtggctggggg60agtcgaaactcgccagtctccactccactcccaaccgtggtgccccacgcgggcctggga120gagtctgtgaggccgcccaccgcttgtcagtagagtgcgcccgcgagccgtaagcacagc180ccggcaacatgcggtcttcagacaggaaagtggccgcgaatgggaccggggtgcccagcg240gctgtggggactctgtcctgcggaaaccgcggtgacgagcacaagctcggtcaactggat300gggaatcggcctggggggctggcaccgcgcccaccagggggtttgcggcacttccctctg360cccctcagcaccccacccctactctccaggaacgtgagttctgagccgtgatggtggcag420gaaggggccctctgtgccatccgagtccccagggacccgcagctggcccccagccatgtg480caaagtatgtgcagggcgctggcaggcagggagcagcaggcatggtgtcccctgagggga540gacagtggtctgggagggagaagtcctggccctgagggaggtgatggggcaatgctcagc600cctgtctccggatgccaaaggaggggtgcggggaggccgtctttggagaattccaggatg660ggtgttgggtgagagagacgtgtgctggaactgtccagggcggaggtgggccctgcgggg720gccctcgggagggccctgctctgatgggccggcagggcaggggcgggaattctgggcggg780gccaccccagttagaaaaagcccgggctaggaccgaggagcagggtgagggag833&#60210&#623&#60211&#62877&#60212&#62DNA&#60213&#62人類&#60400&#623caaggacatggaatttcggaccttctgtccccaccctctctgctgagcctaggaacctct60gagcagcaggaaggccttgggtctagagcctagaaatggacccccacgtccacctgccca120gcctagacccccagcattgaagggtggtcagacttcctgtgagaggaagccactaagcgg180gatggacaccatcgcccactccacccggccctgcccagccctgcccagtccagcccagtc240cagcccagccctgcccttcccagccctgcccagcccagctcatccctgccctacccagcc300cagccctgtcctgccctgcccagcccagcccagcccagccctgccctgccctgccctgcc360cttcccagccctgaccttcccagccctgcccagcccagctcatccccgccctacccagct420cagccctgccctgccctgccctgccctgcccagccctacccagcccagccctgccctgcc480ctgcccagctcagccctgcccaccccagcccagcccagcccagcatgcgttctctggatg540gtgagcacaggcttgaccttagaaagaggctggcaacgagggctgaggccaccaggccac600tgggtgctcacgggtcagacaagcccagagcctgctcccctgccacgggtcggggctgtc660accgccagcatgctgtggatgtgcatggcctcagggctgctggctccaggctgcccccgc720cctggctcccgaggccacccctcttatgccatgaaccctgtgccacacccacctctgagc780tgtccccgctcctgccgcctgcaccccctgagcagccccctgtgtgtttcatgggagtct840tagcaaggaaggggagctcgaattcctgcagcccggg877&#60210&#624&#60211&#621960&#60212&#62DNA&#60213&#62人類&#60400&#624ccgggtaccgagctcccaggaagataaatgatttcctcctctctagagatgggggtggga60tctgagcactcagagccaagggcgcagtgggtccgggcgggggccctcctcggccctccc120aacatgggggccaggaggtcagcccctcaacctggaccccggctgggtctcagggaatgg180tctcccccagtggcccagcttgcttgtgttttcagatgggtgtgcatgggtgtgtgtgtg240tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgatgcctgacaagccccagagagccaa300agacctgagtggagatcttgtgacttctcaaaagggggattggaaggttcgagaaagagc360tgtggtcagccttgctctcccttaaggctgtggtaaccacactaggcatagcataggcct420gcgccccgtccctccttccctcctccgcgcctctcctttctctttctcccccctctaccc480cgctccctggcctgctcctggtgacaccgttggcccccttccagggctgagggaagccag540cgggggccccttcctgaaagcccacctgcaggccggcttgctgggaaggggctgctctcg600cagaggctcccgcccgccctgcagccgtttcctggaagcagtcgctgtgggtattctgtt660ccttgtcagcactgtgcttgcaaagaaagcagacactgtgctccttgtccttagggagcc720ccgctccatcacccaacacctggctggacacaggcgggaggccgggtccgcggggagcgg780cgcggggctggggccggaccattaaacacacacgggcgccaggcactgcaggctcctcct840cctcctcctgcccagcgcctctgctcacaggcacgtgccaagcccctaggccaggaggcc900agcagtgggtgcagaacaagctcctgggaagggggtgcagggcggacccccggggagaag960ggctggcagggctgtgggggacgctgaccgtgggccccacgttgcagaaaactggntgcc1020tggctggaagatgggggagatgccaagcctctgaggcagcacgagcagggtgcatggagg1080ccggggcgcggggaggctgcactgcagcatgcaccccaaagcccanagggagtggagacc1140aggccctggaatcgagaagtagaaaggcggcttggaggcctcggaaccggctgacctcca1200acagagtgggtcgccagcctggctctgccctgccgcaggtcccctcccctcattaccagg1260cctagagcctccagtcccggtggcccccagcccgagggtgaacggcctcaccctgggtcg1320tgggacagagggcacgttcatcaagagtggctcccaagggacacgtggctgtttgcagtt1380cacaggaagcattcgagataaggagcttgttttcccagtgggcacggagccagcaggggg1440gctgtggggcagcccagggtgcaaggccaggctgtggggctgcagctgccttgggcccca1500ctcccagscctttgcgggaggtgggaggcgggaggcggcagctgcacagtggccccaggc1560gaggctctcagccccagtcgctctccgggtgggcagcccaagagggtctggctgagcctc1620ccacatctgggactccatcacccaacaacttaattaaggctgaatttcacgtgtcctgtg1680acttgggtagacaaagcccctgtccaaaggggcagccagcctaaggcagtggggacggcg1740tgggtggcgggcgacgggggagatggacaacaggaccgagggtgtgcgggcgatggggga1800gatggacaacaggaccgagggtgtgcgggcgatgggggagatggacaacaggaccgaggg1860tgtgcgggacacgcatgtcactcatgcacgccaatggggggcgtgggaggctggggagca1920gacagactgggctgggctgggcgggaaggacgggcagatg1960&#60210&#625&#60211&#624085&#60212&#62DNA&#60213&#62人類&#60400&#625ccgggtaccgagctcccaggaagataaatgatttcctcctctctagagatgggggtggga60tctgagcactcagagccaagggcgcagtgggtccgggcgggggccctcctcggccctccc120aacatgggggccaggaggtcagcccctcaacctggaccccggctgggtctcagggaatgg180tctcccccagtggcccagcttgcttgtgttttcagatgggtgtgcatgggtgtgtgtgtg240tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgatgcctgacaagccccagagagccaa300asacctgagtggagatcttgtgacttctcaaaagggggattggaaggttcgagaaagagc360tgtggtcagccttgctctcccttaaggctgtggtaaccacactaggcatagcataggcct420gcgccccgttcctccttccctcctccgcgcctctcctttctctttctcccccctctaccc480cgctccctggcctgctcctggtgacaccgttggcccccttccagggctgagggaagccag540cgggggccccttcctgaaagcccacctgcaggccggcttgctgggaaggggctgctctcg600cagasgctcccgcccgccctgcagccgtttcctggaagcagtcgctgtgggtattctgtt660ccttgtcagca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c25A、周期蛋白D1、周期蛋白E、周期蛋白A、cdk4、癌基因形式的p53、c-fos、c-jun、Kr-ras和Her2／neu。10．權(quán)利要求1的方法，其中該異源序列編碼一種特異性裂解編碼下列基因的RNA的核酶，這些基因選自cdk2、cdk8、cdk21、cdc25A、周期蛋白D1、周期蛋白E、周期蛋白A、cdk4、癌基因形式的p53、c-fos、c-jun、Kr-ras和Her2／neu。11．權(quán)利要求1的方法，其中該腫瘤細(xì)胞在患者內(nèi)。12．權(quán)利要求11的方法，其中所述的患者患有選自下列種類的腫瘤，這些腫瘤為膀胱癌、肝細(xì)胞癌、肝胚細(xì)胞瘤、成橫紋肌細(xì)胞瘤、卵巢癌、頸部癌、肺癌、乳腺癌、頭頸部扁平細(xì)胞癌、食管癌、類胸腺癌、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)節(jié)膠原神經(jīng)瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。13．權(quán)利要求7的方法，其中該H19啟動(dòng)子包含SEQIDNO11-830位的核苷酸。14．權(quán)利要求7的方法，其中該H19啟動(dòng)子包含SEQIDNO2的序列。15．權(quán)利要求7的方法，其中該H19增強(qiáng)子包含克隆在質(zhì)粒pH19EH19(ATCC保藏號(hào)209322)中的H19增強(qiáng)子的序列。16．權(quán)利要求7的方法，其中該H19增強(qiáng)子包含SEQIDNO3的序列。17．權(quán)利要求7的方法，其中該H19增強(qiáng)子包含SEQIDNO4的序列。18．權(quán)利要求7的方法，其中該H19增強(qiáng)子包含SEQIDNO5的序列。19．權(quán)利要求7的方法，其中該H19增強(qiáng)子被置于異源序列的3′端。20．一種在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)序列的載體，該載體包括一種包含操作性與編碼細(xì)胞毒基因產(chǎn)物的異源序列連接的調(diào)節(jié)序列的多核苷酸，其中該調(diào)節(jié)序列來(lái)源于在腫瘤細(xì)胞中特異表達(dá)的基因組印記基因。21．權(quán)利要求20的載體，其中該調(diào)節(jié)序列是H19調(diào)節(jié)序列。22．權(quán)利要求20的載體，其中該調(diào)節(jié)序列是IGF-2P4啟動(dòng)子。23．權(quán)利要求20的載體，其中該調(diào)節(jié)序列是IGF-2P3啟動(dòng)子。24．權(quán)利要求21的載體，其中該H19調(diào)節(jié)序列包含H19啟動(dòng)子和H19增強(qiáng)子，而異源序列編碼一種選自如下種類的蛋白，這些蛋白為-λ半乳糖苷酶、白喉毒素、假單胞桿菌毒素、蓖麻毒蛋白、霍亂毒素、成視網(wǎng)膜瘤基因、p53、單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶、水痘帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶、胞嘧啶脫氨酶、硝酸還原酶、細(xì)胞色素p-4502B1、胸腺嘧啶磷酸化酶、嘌呤核苷磷酸化酶、堿性磷酸酶、羧肽酶A和G2、亞麻苦苷酶、λ內(nèi)酰胺酶和黃嘌呤氧化酶。25．一種含有權(quán)利要求20的載體的宿主細(xì)胞。26．一種治療癌癥患者的方法，該方法包括給患者施用一種核苷酸，所述的核苷酸編碼一種操作性與特異在癌細(xì)胞中表達(dá)，來(lái)源于基因組印記基因的調(diào)節(jié)序列連接的細(xì)胞毒或抑制細(xì)胞的基因產(chǎn)物。27．權(quán)利要求26的方法，其中該調(diào)節(jié)序列是H19調(diào)節(jié)序列。28．權(quán)利要求26的方法，其中該調(diào)節(jié)序列是IGF-2P4啟動(dòng)子。29．權(quán)利要求26的方法，其中該調(diào)節(jié)序列是IGF-2P3啟動(dòng)子。30．權(quán)利要求26的方法，其中細(xì)胞毒基因產(chǎn)物選自白喉毒素、假單胞桿菌毒素、蓖麻毒素、霍亂毒素、成視網(wǎng)膜瘤基因和p53。31．權(quán)利要求27的方法，其中H19調(diào)節(jié)序列是H19啟動(dòng)子、H19增強(qiáng)子或H19啟動(dòng)子和H19增強(qiáng)子兩者。32．權(quán)利要求31的方法，其中H19啟動(dòng)子包含SEQIDNO1的1-830位核苷酸。33．權(quán)利要求31的方法，其中H19啟動(dòng)子包含SEQIDNO2的序列。34．權(quán)利要求31的方法，其中H19增強(qiáng)子包含克隆在質(zhì)粒pH19EH19(ATCC保藏號(hào)209322)的H19增強(qiáng)子的序列。35．權(quán)利要求31的方法，其中H19增強(qiáng)子包含SEQIDNO3的序列。36．權(quán)利要求31的方法，其中H19增強(qiáng)子包含SEQIDN04的序列。37．權(quán)利要求31的方法，其中H19增強(qiáng)子包含SEQIDNO5的序列。38．權(quán)利要求31的方法，其中H19增強(qiáng)子被置于異源序列的3′端。39．權(quán)利要求31的方法，其中所述的癌癥選自膀胱癌、肝細(xì)胞癌、肝胚細(xì)胞癌、成橫紋肌細(xì)胞瘤、卵巢癌、頸部癌、肺癌、乳腺癌、頭頸部扁平細(xì)胞癌、食管癌、類胸腺癌、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。40．一種在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異源序列的方法，該方法包括把一種多核苷酸導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞中，其中所述的多核苷酸包含操作性與編碼細(xì)胞毒基因產(chǎn)物的異源序列連接的IGF-1啟動(dòng)子。41．一種在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異源序列的載體，其中該載體包括一種包含操作性與編碼細(xì)胞毒基因產(chǎn)物的異源序列連接的IGF-1啟動(dòng)子的多核苷酸。全文摘要本發(fā)明涉及在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄序列的控制下,異源序列尤其是編碼細(xì)胞毒性產(chǎn)物的基因在腫瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá)。特別優(yōu)選的啟動(dòng)子包括H19調(diào)節(jié)序列、IGF－1啟動(dòng)子和IGF－2P3和P4啟動(dòng)子。本發(fā)明提供表達(dá)構(gòu)建體和施用上述表達(dá)構(gòu)建體的方法。本發(fā)明的組合物和方法可用于癌癥治療。文檔編號(hào)A61K31/711GK1280616SQ98811833公開(kāi)日2001年1月17日申請(qǐng)日期1998年10月4日優(yōu)先權(quán)日1997年10月3日發(fā)明者A·霍赫貝格,S·阿耶什申請(qǐng)人:耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)伊森姆研究發(fā)展公司