專利名稱：毒性相關核酸序列及其應用的制作方法
背景技術：
本發(fā)明涉及與微生物的致病性有關的核酸分子、基因和多肽。
病原體采用多種遺傳策略來在其宿主中引起感染，并偶爾產生疾病。微生物致病性的表達依賴于復雜的遺傳調節(jié)途徑。對微生物致病性主旨的了解對于我們理解病原體的毒性機制以及開發(fā)新型的“抗毒或抗病原體”試劑來說是必不可少的，而后者又為我們對抗感染和疾病所必需。
在一個特殊實施例中，人的機會病原體---銅綠假單胞菌是一種廣泛存在的革蘭氏陰性桿菌，它可以從土壤、水和植物中分離(Palleroni,J.N.In:Bergey’s Manual of SystematicBacteriology,ed.J.G.Holt,Williams,Baltimore,MD,pp.141-172,1984)。已經有多種銅綠假單胞菌的毒力因子得到了描述，它們中的大多數(shù)，例如外毒素A、彈性蛋白酶和磷脂酶C，開始時都是在其細胞毒活性的基礎上用生物化學的方法檢測出來的(Fink,R.B.,Pseudomonas aeruginosa the Opportunist:Pathogenesisand Disease,Boca Raton,CRC Press Inc.,1993)。隨后，對應于這些因子的基因或調節(jié)這些因子表達的基因被鑒定?？偟膩碚f，哺乳動物的細菌性病原體的多數(shù)致病性相關基因開始時都是使用生物試驗檢測出來的。與哺乳動物病原體不同，簡單、系統(tǒng)的遺傳策略已經常規(guī)用于在植物病原體中鑒定致病性相關的基因。在經過隨機的轉座子介導的誘變之后，成千上萬的植物病原菌的突變克隆被單獨接種到一個個的植物中，來確定它們是否含有一個能影響與宿主致病性相互作用的突變(Boucher等，J.Bacteriol.168:5626-5623,1987；Comai和Kosuge,J.Bacteriol.149:40-46,1982；Lindgren等，J.Bacteriol.168:512-522,1986；Rahme等，J.Bacteriol.173:575-586,1991；Willis等，Mol.Plant-Microbe Interact.3:149-156,1990)。難以使用全動物的哺乳動物致病性模型來進行比較實驗，因為這需要使用大量的動物來進行致病性攻擊。
發(fā)明簡述我們已經鑒定和分析了大量的核酸分子、多肽和小分子(例如吩嗪)，它們都參與使一種病原體具有致病性和毒性。因此這個發(fā)現(xiàn)提供了一個藥物篩選的基礎，這種藥物篩選的目的是評估和鑒定能夠阻斷一種病原體的致病性和毒性的“抗毒性”試劑(例如通過選擇性地將病原體基因表達打開或關上)或能夠滅活或抑制一種參與微生物致病性的多肽的活性的“抗毒性”試劑。靶向這些分子的藥物作為這樣的抗毒性試劑非常有用。
在一個方面，本發(fā)明描述了一種分離核酸分子，它含有與以下任何一種序列基本上相同的序列BI48(SEQID NO:1),ORF2(SEQ ID NO:2),ORF3(SEQ ID NO:4),ORF602c(SEQ ID NO:6),ORF214(SEQ IDNO:8),ORF1242c(SEQ ID NO:10),ORF594(SEQ ID NO:12),ORF1040(SEQ IDNO:14),ORF1640c(SEQ ID NO:16),ORF2228c(SEQ ID NO:18),ORF2068c(SEQID NO:20),ORF1997(SEQ ID NO:22),ORF2558c(SEQ ID NO:24),ORF2929c(SEQ ID NO:26),ORF3965c(SEQ ID NO:28),ORF3218(SEQ ID NO:30),ORF3568(SEQ ID NO:32),ORF4506c(SEQ ID NO:34),ORF3973(SEQ IDNO:36),ORF4271(SEQ ID NO:38),ORF4698(SEQ ID NO:40),ORF5028(SEQ IDNO:42),ORF5080(SEQ ID NO:44),ORF6479c(SEQ ID NO:46),ORF5496(SEQID NO:48),ORF5840(SEQ ID NO:50),ORF5899(SEQ ID NO:52),ORF6325(SEQID NO:54),ORF7567c(SEQ ID NO:56),ORF7180(SEQ ID NO:58),ORF7501(SEQ ID NO:60),ORF7584(SEQ ID NO:62),ORF8208c(SEQ ID NO:64),ORF8109(SEQ ID NO:66),ORF9005c(SEQ ID NO:68),ORF8222(SEQ IDNO:70),ORF8755c(SEQ ID NO:72),ORF9431c(SEQ ID NO:74),ORF9158(SEQID NO:76),ORF10125c(SEQ ID NO:78),ORF9770(SEQ ID NO:80),ORF9991(SEQ ID NO:82),ORF10765c(SEQ ID NO:84),ORF10475(SEQ ID NO:86),ORF11095c(SEQ ID NO:88),ORF11264(SEQ ID NO:90),ORF11738(SEQ IDNO:92),ORF12348c(SEQ ID NO:94),ORF12314c(SEQ ID NO:96),ORF13156c(SEQ ID NO:98),ORF12795(SEQ ID NO:100),ORF13755c(SEQ ID NO:210),ORF13795c(SEQ ID NO:212),ORF14727c(SEQ ID NO:214),ORF13779(SEQ IDNO:216),ORF14293c(SEQ ID NO:218),ORFI4155(SEQ ID NO:220),ORF14360(SEQ ID NO:222),ORF15342c(SEQ ID NO:224),ORF15260c(SEQ ID NO:226),ORF14991(SEQ ID NO:228),ORF15590c(SEQ ID NO:230),ORF15675c(SEQ IDNO:232),ORF16405(SEQ ID NO:234),ORF16925(SEQ ID NO:236),ORF17793c(SEQ ID NO:238),ORF18548c(SEQ ID NO:240),ORF17875(SEQ ID NO:242),ORF18479(SEQ ID NO:244),ORF19027c(SEQ ID NO:246),ORF19305(SEQ IDNO:248),ORF19519(SEQ ID NO:250),ORF19544(SEQ ID NO:252),ORF20008(SEQ ID NO:254),ORF20623c(SEQ ID NO:256),ORF21210c(SEQ ID NO:258),ORF21493c(SEQ ID NO:260),ORF21333(SEQ ID NO:262),ORF22074c(SEQ IDNO:264),ORF21421(SEQ ID NO:266),ORF22608c(SEQ ID NO:268),ORF22626(SEQ ID NO:270),ORF23228(SEQ ID NO:272),ORF23367(SEQ ID NO:274),ORF25103c(SEQ ID NO:276),ORF23556(SEQ ID NO:278),ORF26191c(SEQ IDNO:280),ORF23751(SEQ ID NO:282),ORF24222(SEQ ID NO:284),ORF24368(SEQ ID NO:286),ORF24888c(SEQ ID NO:288),ORF25398c(SEQ ID NO:290),ORF25892c(SEQ ID NO:292),ORF25110(SEQ ID NO:294),ORF25510(SEQ IDNO:296),ORF26762c(SEQ ID NO:298),ORF26257(SEQ ID NO:300),ORF26844c(SEQ ID NO:302),ORF26486(SEQ ID NO:304),ORF26857c(SEQ ID NO:306),ORF27314c(SEQ ID NO:308),ORF27730c(SEQ ID NO:310),ORF26983(SEQ IDNO:312),ORF28068c(SEQ ID NO:314),ORF27522(SEQ ID NO:316),ORF28033c(SEQ ID NO:318),ORF29701c(SEQ ID NO:320),ORF28118(SEQ ID NO:322),ORF28129(SEQ ID NO:324),ORF29709c(SEQ ID NO:326),ORF29189(SEQ IDNO:328),ORF29382(SEQ ID NO:330),ORF30590c(SEQ ID NO:332),ORF29729(SEQ ID NO:334),ORF30221(SEQ ID NO:336),ORF30736c(SEQ ID NO:338),ORF30539(SEQ ID NO:340),ORF31247c(SEQ ID NO:342),ORF31539c(SEQ IDNO:346),ORF31222(SEQ ID NO:348),ORF31266(SEQ ID NO:350),ORF31661c(SEQ ID NO:352),ORF32061c(SEQ ID NO:354),ORF32072c(SEQ ID NO:356),ORF31784(SEQ ID NO:358),ORF32568c(SEQ ID NO:360),ORF33157c(SEQ IDNO:362),ORF32539(SEQ ID NO:364),ORF33705c(SEQ ID NO:366),ORF32832(SEQ ID NO:368),ORF33547c(SEQ ID NO:370),ORF33205(SEQ ID NO:372),ORF33512(SEQ ID NO:374),ORF33771(SEQ ID NO:376),ORF34385c(SEQ IDNO:378),ORF33988(SEQ ID NO:380),ORF34274(SEQ ID NO:382),ORF34726c(SEQ ID NO:384),ORF34916(SEQ ID NO:386),ORF35464c(SEQ ID NO:388),ORF35289(SEQ ID NO:390),ORF35410(SEQ ID NO:392),ORF35907c(SEQ IDNO:394),ORF35534(SEQ ID NO:396),ORF35930(SEQ ID NO:398),ORF36246(SEQ ID NO:400),ORF26640c(SEQ ID NO:402),ORF36739(SEQ ID NO:404),ORF37932c(SEQ ID NO:406),ORF38640c(SEQ ID NO:408),ORF39309c(SEQID NO:410),ORF38768(SEQ ID NO:412),ORF40047c(SEQ ID NO:414),ORF40560c(SEQ ID NO:416),ORF40238(SEQ ID NO:418),ORF40329(SEQ IDNO:420),ORF40709c(SEQ ID NO:422),ORF40507(SEQ ID NO:424),ORF41275c(SEQ ID NO:426),ORF42234c(SEQ ID NO:428),ORF41764c(SEQ ID NO:430),ORF41284(SEQ ID NO:432),ORF41598(SEQ ID NO:434),ORF42172c(SEQ IDNO:436),ORF42233c(SEQ ID NO:438),33A9(SEQ ID NO:102,189,190,191,192,193,194,195,196,197,and198),34B12(SEQ ID NO:104),34B12-ORF1(SEQID NO:105),34B12-ORF2(SEQ ID NO:106),36A4(SEQ ID NO:109),36A4 contig(SEQ ID NO:111),2342(SEQ ID NO:112),3E8 phn(-)(SEQ ID NO:114),3E8contigPAO1(SEQ ID NO:115),34H4(SEQ ID NO:118),33C7(SEQ ID NO:119),25al2.3(SEQ ID NO:120),8C12(SEQ ID NO:121),2A8 (SEQ ID NO:122),41A5(SEQ ID NO:123),50E12(SEQ ID NO:124),35A9(SEQ ID NO:125),pho23(SEQID NO:126),16G12(SEQ ID NO:127),25F1(SEQ ID NO:128),PA14 degP(SEQID NO:131),1126 contig(SEQ ID NO:135),contig 1344(SEQ ID NO:136),ORFA(SEQ ID NO:440),ORFB(SEQ ID NO:441),ORFC(SEQ ID NO:442),phzR(SEQID NO:164, 和 1G2(SEQ ID NO:137).優(yōu)選地，分離核酸分子包含上述序列的任何一種或其片段，并來源于一種病原體(例如來源于一種細菌病原體如銅綠假單胞菌)。此外，本發(fā)明包括載體和細胞，它們每一個都至少含有一種本發(fā)明的分離核酸分子；并且本發(fā)明包括制備重組多肽的方法，這種方法包括提供用本發(fā)明的一種核酸分子轉化的細胞，其定位使其可以在細胞中表達，在適合于表達該核酸分子的條件下培養(yǎng)轉化細胞，并分離重組多肽。本發(fā)明進一步描述了這樣表達本發(fā)明的分離核酸分子而制備的重組多肽，以及能特異性地識別與結合這樣一種重組多肽的基本上純的抗體。
在另一個方面，本發(fā)明描述了一種基本上純的多肽，它包含與下列任何一種氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列ORF2(SEQ ID NO:3),ORF3(SEQ ID NO:5),ORF602c(SEQ ID NO:7),ORF214(SEQ ID NO:9),ORF1242c(SEQ ID NO:11),ORF594(SEQ ID NO:13),ORF1040(SEQ ID NO:15),ORF1640c(SEQ ID NO:17),ORF2228c(SEQ ID NO:19),ORF2068c(SEQ ID NO:21),ORF1997(SEQ IDNO:23),ORF2558c(SEQ ID NO:25),ORF2929c(SEQ ID NO:27),ORF3965c(SEQID NO:29),ORF3218(SEQ ID NO:31),ORF3568(SEQ ID NO:33),ORF4506c(SEQ ID NO:35),ORF3973(SEQ ID NO:37),ORF4271(SEQ ID NO:39),ORF4698(SEQ ID NO:41),ORF5028(SEQ ID NO:43),ORF5080(SEQ ID NO:45),ORF6479c(SEQ ID NO:47),ORF5496(SEQ ID NO:49),ORF5840(SEQ IDNO:51),ORF5899(SEQ ID NO:53),ORF6325(SEQ ID NO:55),ORF7567c(SEQID NO:57),ORF7180(SEQ ID NO:59),ORF7501(SEQ ID NO:61),ORF7584(SEQID NO:63),ORF8208c(SEQ ID NO:65),ORF8109(SEQ ID NO:67),ORF9005c(SEQ ID NO:69),ORF8222(SEQ ID NO:71),ORF8755c(SEQ ID NO:73),ORF9431c(SEQ ID NO:75),ORF9158(SEQ ID NO:77),ORF10125c(SEQ IDNO:79),ORF9770(SEQ ID NO:81),ORF9991(SEQ ID NO:83),ORF10765c(SEQID NO:85),ORF10475(SEQ ID NO:87),ORF11095c(SEQ ID NO:89),ORF11264(SEQ ID NO:91),ORF11738(SEQ ID NO:93),ORF12348c(SEQ ID NO:95),ORF12314c(SEQ ID NO:97),ORF13156c(SEQ ID NO:99),ORF12795(SEQ IDNO:101),ORF13755c(SEQ ID NO:211),ORF13795c(SEQ ID NO:213),ORF14727c(SEQ ID NO:215),ORF13779(SEQ ID NO:217),ORF14293c(SEQ IDNO:219),ORF14155(SEQ ID NO:221),ORF14360(SEQ ID NO:223),ORF15342c(SEQ ID NO:225),ORF15260c(SEQ ID NO:227),ORF14991(SEQ ID NO:229),ORF15590c(SEQ ID NO:231),ORF15675c(SEQ ID NO:233),ORF16405(SEQ IDNO:235),ORF16925(SEQ ID NO:237),ORF17793c(SEQ ID NO:239),ORF18548c(SEQ ID NO:241),ORF17875(SEQ ID NO:243),ORF18479(SEQ ID NO:245),ORF19027c(SEQ ID NO:247),ORF19305(SEQ ID NO:249),ORF19519(SEQ IDNO:251),ORF19544(SEQ ID NO:253),ORF20008(SEQ ID NO:255),ORF20623c(SEQ ID NO:257),ORF21210c(SEQ ID NO:259),ORF21493c(SEQ ID NO:261),ORF21333(SEQ ID NO:263),ORF22074c (SEQ ID NO:265),ORF21421(SEQ IDNO:267),ORF22608c(SEQ ID NO:269),ORF22626 (SEQ ID NO:271),ORF23228(SEQ ID NO:273),ORF23367(SEQ ID NO:275),ORF25103c(SEQ ID NO:277),ORF23556(SEQ ID NO:279),ORF26191c(SEQ ID NO:281),ORF23751(SEQ IDNO:283),ORF24222(SEQ ID NO:285),ORF24368(SEQ ID NO:287),ORF24888c(SEQ ID NO:289),ORF25398c(SEQ ID NO:291),ORF25892c(SEQ ID NO:293),ORF25110(SEQ ID NO:295),ORF25510(SEQ ID NO:297),ORF26762c(SEQ IDNO:299),ORF26257(SEQ ID NO:301),ORF26844c(SEQ ID NO:303),ORF26486(SEQ ID NO:305),ORF26857c(SEQ ID NO:307),ORF27314c(SEQ ID NO:309),ORF27730c(SEQ ID NO:311),ORF26983(SEQ ID NO:313),ORF28068c(SEQ IDNO:315),ORF27522(SEQ ID NO:317),ORF28033c(SEQ ID NO:319),ORF29701c(SEQ ID NO:321),ORF28118(SEQ ID NO:323),ORF28129(SEQ ID NO:325),ORF29709c(SEQ ID NO:327),ORF29189(SEQ ID NO:329),ORF29382(SEQ IDNO:331),ORF30590c(SEQ ID NO:333),ORF29729(SEQ ID NO:335),ORF30221(SEQ ID NO:337),ORF30736c(SEQ ID NO:339),ORF30539(SEQ ID NO:341),ORF31247c(SEQ ID NO:343),ORF30963c(SEQ ID NO:345),ORF31539c(SEQID NO:347),ORF31222(SEQ ID NO:349),ORF31266(SEQ ID NO:351),ORF31661c(SEQ ID NO:353),ORF32061c(SEQ ID NO:355),ORF32072c(SEQID NO:357),ORF31784(SEQ ID NO:359),ORF32568c(SEQ ID NO:361),ORF33157c(SEQ ID NO:363),ORF32530(SEQ ID NO:365),ORF33705c(SEQ IDNO:367),ORF32832(SEQ ID NO:369),ORF33547c(SEQ ID NO:371),ORF33205(SEQ ID NO:373),ORF33512(SEQ ID NO:375),ORF33771(SEQ ID NO:377),ORF34385c(SEQ ID NO:379),ORF33988(SEQ ID NO:381),ORF34274(SEQ IDNO:383),ORF34726c(SEQ ID NO:385),ORF34916(SEQ ID NO:387),ORF35464c(SEQ ID NO:389),ORF35289(SEQ ID NO:391),ORF35410(SEQ ID NO:393),ORF35907c(SEQ ID NO:395),ORF35534(SEQ ID NO:397),ORF35930(SEQ IDNO:399),ORF36246(SEQ ID NO:401),ORF26640c(SEQ ID NO:403),ORF36769(SEQ ID NO:405),ORF37932c(SEQ ID NO:407),ORF38640c(SEQ ID NO:409),ORF39309c(SEQ ID NO:411),ORF38768(SEQ ID NO:413),ORF40047c(SEQ IDNO:415),ORF40560c(SEQ ID NO:417),ORF40238(SEQ ID NO:419),ORF40329(SEQ ID NO:421),ORF40709c(SEQ ID NO:423),ORF40507(SEQ ID NO:425),ORF41275c(SEQ ID NO:427),ORF42234c(SEQ ID NO:429),ORF41764c(SEQID NO:431),ORF41284(SEQ ID NO:433),ORF41598(SEQ ID NO:435),ORF42172c(SEQ ID NO:437),ORF42233c(SEQ ID NO:439),33A9(SEQ IDNOS:103,199,200,201,202,203,204,205,206,207,and 208),34B12-ORF1(SEQID NO:107),34B12-ORF2(SEQ ID NO:108),36A4(SEQ ID NO:110),3E8phzA(SEQ ID NO:116),3E8phzB(SEQ ID NO:117),PhzR (SEQ ID NO:165),ORFA(SEQ ID NO:443),ORFB(SEQ ID NO:444),ORFC(SEQ ID NO:445),和 PA14degP (SEQ ID NO:132).優(yōu)選地，基本上純的多肽包含上述序列的任何一種或其片段，并來源于一種病原體(例如來源于一種細菌病原體如銅綠假單胞菌)。
在另一個相關方面，本發(fā)明描述了鑒定一種能降低致病性毒力因子(例如，在轉錄或轉錄后水平)的表達的化合物的方法，包括(a)提供一種能表達本發(fā)明的任何一種分離核酸分子的致病性細胞；并(b)將該致病性細胞與一種候選化合物作用，在與候選化合物作用后該核酸分子的表達降低就證明該化合物能降低一種致病性毒力因子的表達。在一個優(yōu)選的實施方案中，用該致病性細胞感染一種哺乳動物(例如人)或一種植物。
在另一個相關方面，本發(fā)明描述了鑒定能與一種多肽結合的化合物的方法，包括(a)將一種候選化合物與一種基本上純的、包含本發(fā)明的任何一種氨基酸序列的多肽在允許結合作用發(fā)生的條件下作用；并(b)檢測候選化合物與該多肽的結合。
此外，本發(fā)明描述了一種在哺乳動物中治療致病性感染的方法，包括(a)鑒定帶有一種致病性感染的哺乳動物；并(b)將治療有效量的一種組合物給予該哺乳動物，所說的組合物能抑制一種由本發(fā)明的任何一種核酸分子編碼的多肽的表達或活性。在優(yōu)選的實施方案中，病原體是銅綠假單胞菌。
在另一個方面，本發(fā)明描述了一種在哺乳動物中治療致病性感染的方法，包括(a)鑒定帶有一種致病性感染的哺乳動物；并(b)將治療有效量的一種組合物給予該哺乳動物，所說的組合物能結合并抑制一種由本發(fā)明的任何一種氨基酸序列編碼的多肽。在優(yōu)選的實施方案中，致病性感染是由銅綠假單胞菌引起的。
而且，本發(fā)明描述了鑒定能抑制一種假單胞菌細胞的毒性的化合物的方法，包括(a)提供一種假單胞菌細胞；(b)將該細胞與一種候選化合物作用；并(c)檢測吩嗪的存在，當相對于未處理的對照培養(yǎng)物該吩嗪降低，就表明該化合物抑制該假單胞菌細胞的毒性。在優(yōu)選的實施方案中，該細胞是銅綠假單胞菌；該細胞存在于一種細胞培養(yǎng)物中，吩嗪用光譜學來檢測(例如綠膿素在520nm的吸收處進行檢測)綠膿素一般按照任何標準方法例如這里介紹的方法進行檢測。
“分離核酸分子”是指這樣一種核酸(例如一種DNA)，它不含在獲得本發(fā)明的該核酸分子的有機體的天然基因組中位于該基因兩翼的基因。因此該詞包括，例如整合在載體中、自主復制的質?；虿《局?、或原核或真核細胞的基因組DNA中、或以不合其他序列的單獨分子形式存在(例如，用PCR或限制酶切消化制備的一種cDNA或基因組或cDNA片段)的重組DNA。此外，該詞包括這樣一種RNA分子，它轉錄自一種DNA分子以及一種重組DNA，同時后者又是一種編碼額外多肽序列的雜合基因的一部分。
“多肽”是指任何的氨基酸鏈，不管其長度或翻譯后修飾(例如糖基化或磷酸化)。
“基本上純的多肽”是指這樣一種本發(fā)明的多肽，它已從天然伴隨它的組分中分離出來。通常，當在重量上60％不含天然與其相伴的蛋白和天然有機分子時，多肽就是基本上純的。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽制備物在重量上至少為75％純、更優(yōu)選至少為90％、最優(yōu)選至少為99％。本發(fā)明的基本上純的多肽可通過，例如從一種天然原料(例如一種病原體)中抽提、用編碼這樣一種多肽的重組核酸表達、或化學合成該蛋白的方法來獲得。純度可用任何合適的方法來測量，例如柱色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳、或用HPLC分析。
“基本上相同”是指一種多肽或核酸分子顯示與一種參照氨基酸序列(例如這里介紹的任何一種氨基酸序列)或核酸序列(例如這里介紹的任何一種核酸序列)至少有25％的同一樣。這樣一種序列優(yōu)選至少與用來比較的序列在氨基酸水平或核酸水平上至少有30％、40％、50％、60％、更優(yōu)選為80％、最優(yōu)選為90％或甚至95％的同一性。
序列的同一性通常使用序列分析軟件(例如Genetics ComputerGroup,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,MadiSon WI 53705的Sequence AhalysisSoftware Package，或BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)進行測定。這種軟件通過分配與不同取代、刪除和/或其他修飾的同源程度來將相同或相似的序列匹配。保守取代通常包括下列各組中的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、并亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在一個確定同一性程度的方法實例中，可以使用一種BLAST程序，其中可能性分數(shù)在e-3和e-100之間，這表示一種密切相關的序列。
“轉化細胞”是指這樣一種細胞，在該細胞(或其親本細胞)中已用重組DNA技術的方法導入了編碼本發(fā)明的一種多肽的DNA分子(如這里使用的)。
“表達定位”是指DNA分子定位于與一種能指導該序列轉錄和翻譯的DNA序列(即協(xié)助諸如本發(fā)明的一種重組多肽或RNA分子產生)連接。
“純化的抗體”是指這樣一種抗體，它在重量上至少為60％不含與其天然相伴的蛋白和天然有機分子?？贵w制備物優(yōu)選在重量上至少為75％純、更優(yōu)選至少為90％、最優(yōu)選至少為99％。本發(fā)明的純化抗體可以通過諸如使用本發(fā)明的一種重組制備的多肽進行親和層析以及標準技術來獲得。
“特異性結合”是指這樣一種化合物或抗體，它能識別和結合本發(fā)明的一種多肽，但基本上不結合和識別在天然含有本發(fā)明的一種多肽的樣品例如一種生物樣品中的其他分子。
“來源自”是指分離形式或具有天然產生序列的序列(例如一種cDNA、基因組DNA、合成的、或其組合形式)。
“抑制一種病原體”是指一種候選化合物的減少、抑制、減弱、消除或阻礙一種病原體介導的疾病或一種感染在真核宿主有機體中發(fā)展或進行的能力。這種抑制在任何合適的致病性試驗(例如這里介紹的試驗)中與沒有該候選化合物的癥狀相比，優(yōu)選將致病性降低至少5％、更優(yōu)選至少25％、最優(yōu)選至少50％。在一個特殊實施例中，抑制可以通過在與候選化合物或抽提物作用的宿主有機體中監(jiān)測致病癥狀來進行測定，相對于未與該化合物作用的宿主有機體中的致病性癥狀水平，癥狀水平的下降就表明了該化合物介導的對病原體的抑制。
“致病性毒力因子”是指這樣一種細胞組分(例如一種蛋白如轉錄因子以及編碼這樣一種蛋白的基因)，在沒有該組分時，病原體不能在一種真核宿主有機體中引起疾病或感染。
本發(fā)明提供多種靶，這些靶可用于發(fā)展能特異性地阻斷一種微生物的致病性的藥物。此外，本發(fā)明的方法提供一種方便的方法，用來鑒定能安全地用于真核宿主有機體(即不會對該有機體的正常發(fā)育和生理產生有害影響的化合物)并有效地對抗致病性微生物(即通過抑制病原體的毒性)的化合物。此外，本發(fā)明的方法提供一種途徑，用來高體積通量地、高敏感性地和低復雜性地分析事實上任何數(shù)量的具有抗毒性作用的化合物。這些方法施用起來也相對廉價，并且能分析在純化的或粗制的抽提物形式中發(fā)現(xiàn)的微量的活性物質。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在發(fā)明詳述和權利要求中表現(xiàn)。
發(fā)明詳述首先介紹附圖。
附1是顯示了粘粒BI48的物理圖譜和所鑒定的開放閱讀框(ORFs)的方向的示意圖。
圖2顯示了粘粒BI48的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
圖3顯示了如下序列的核苷酸序列ORF2(SEQ ID NO:2),ORF3(SEQ ID NO:4),ORF602c(SEQ ID NO:6),ORF214(SEQ ID NO:8),ORF1242c(SEQ ID NO:10),ORF594(SEQ ID NO:12),ORF1040(SEQ ID NO:14),ORF1640c(SEQ ID NO:16),ORF2228c(SEQ ID NO:18),ORF2068c(SEQ ID NO:20),ORF1997(SEQ ID NO:22),ORF2558c(SEQ ID NO:24),ORF2929c(SEQ IDNO:26),ORF3965c(SEQ ID NO:28),ORF3218(SEQ ID NO:30),ORF3568(SEQID NO:32),ORF4506c(SEQ ID NO:34),ORF3973(SEQ ID NO:36),ORF4271(SEQ ID NO:38),ORF4698(SEQ ID NO:40),ORF5028(SEQ ID NO:42),ORF5080(SEQ ID NO:44),ORF6479c(SEQ ID NO:46),ORF5496(SEQ ID NO:48),ORF5840(SEQ ID NO:50),ORF5899(SEQ ID NO:52),ORF6325(SEQ ID NO:54),ORF7567c(SEQ ID NO:56),ORF7180(SEQ ID NO:58),ORF7501(SEQ IDNO:60),ORF7584(SEQ ID NO:62),ORF8208c(SEQ ID NO:64),ORF8109(SEQID NO:66),ORF9005c(SEQ ID NO:68),ORF8222(SEQ ID NO:70),ORF8755c(SEQ ID NO:72),ORF9431c(SEQ ID NO:74),ORF9158(SEQ ID NO:76),ORF10125c(SEQ ID NO:78),ORF9770(SEQ ID NO:80),ORF9991(SEQ IDNO:82),ORF10765c(SEQ ID NO:84),ORF10475(SEQ ID NO:86),ORF11095c(SEQ ID NO:88),ORF11264(SEQ ID NO:90),ORF11738(SEQ ID NO:92),ORF12348c(SEQ ID NO:94),ORF12314c(SEQ ID NO:96),ORF13156c(SEQ IDNO:98),ORF12795(SEQ ID NO:100),ORF13755c(SEQ ID NO:210),ORF13795c(SEQ ID NO:212),ORF14727c(SEQ ID NO:214),ORF13779(SEQ ID NO:216),ORF14293c(SEQ ID NO:218),ORF14155(SEQ ID NO:220),ORF14360(SEQ IDNO:222),ORF15342c(SEQ ID NO:224),ORF15260c(SEQ ID NO:226),ORF14991(SEQ ID NO:228),ORF15590c(SEQ ID NO:230),ORF15675c(SEQ ID NO:232),ORF16405(SEQ ID NO:234),ORF16925(SEQ ID NO:236),ORF17793c(SEQ IDNO:238),ORF18548c(SEQ ID NO:240),ORF17875(SEQ ID NO:242),ORF18479(SEQ ID NO:244),ORF19027c(SEQ ID NO:246),ORF19305(SEQ ID NO:248),ORF19519(SEQ ID NO:250),ORF19544(SEQ ID NO:252),ORF20008(SEQ IDNO:254),ORF20623c(SEQ ID NO:256),ORF21210c(SEQ ID NO:258),ORF21493c(SEQ ID NO:260),ORF21333(SEQ ID NO:262),ORF22074c(SEQ IDNO:264),ORF21421(SEQ ID NO:266),ORF22608c(SEQ ID NO:268),ORF22626(SEQ ID NO:270),ORF23228(SEQ ID NO:272),ORF23367(SEQ ID NO:274),ORF25103c(SEQ ID NO:276),ORF23556(SEQ ID NO:278),ORF26191c(SEQ IDNO:280),ORF23751(SEQ ID NO:282),ORF24222(SEQ ID NO:284),ORF24368(SEQ ID NO:286),ORF24888c(SEQ ID NO:288),ORF25398c(SEQ ID NO:290),ORF25892c(SEQ ID NO:292),ORF25110(SEQ ID NO:294),ORF25510(SEQ IDNO:296),ORF26762c(SEQ ID NO:298),ORF26257(SEQ ID NO:300),ORF26844c(SEQ ID NO:302),ORF26486(SEQ ID NO:304),ORF26857c(SEQ ID NO:306),ORF27314c(SEQ ID NO:308),ORF27730c(SEQ ID NO:310),ORF26983(SEQ IDNO:312),ORF28068c(SEQ ID NO:314),ORF27522(SEQ ID NO:316),ORF28033c(SEQ ID NO:318),ORF29701c(SEQ ID NO:320),ORF28118(SEQ ID NO:322),ORF28129(SEQ ID NO:324),ORF29709c(SEQ ID NO:326),ORF29189(SEQ IDNO:328),ORF29382(SEQ ID NO:330),ORF30590c(SEQ ID NO:332),ORF29729(SEQ ID NO:334),ORF30221(SEQ ID NO:336),ORF30736c(SEQ ID NO:338),ORF30539(SEQ ID NO:340),ORF31247c(SEQ ID NO:342),ORF31539c(SEQ IDNO:346),ORF31222(SEQ ID NO:348),ORF31266(SEQ ID NO:350),ORF31661c(SEQ ID NO:352),ORF32061c(SEQ ID NO:354),ORF32072c(SEQ ID NO:356),ORF31784(SEQ ID NO:358),ORF32568c(SEQ ID NO:360),ORF33157c(SEQ IDNO:362),ORF32539(SEQ ID NO:364),ORF33705c(SEQ ID NO:366),ORF32832(SEQ ID NO:368),ORF33547c(SEQ ID NO:370),ORF33205(SEQ ID NO:372),ORF33512(SEQ ID NO:374),ORF33771(SEQ ID NO:376),ORF34385c(SEQ IDNO:378),ORF33988(SEQ ID NO:380),ORF34274(SEQ ID NO:382),ORF34726c(SEQ ID NO:384),ORF34916(SEQ ID NO:386),ORF35464c(SEQ ID NO:388),ORF35289(SEQ ID NO:390),ORF35410(SEQ ID NO:392),ORF35907c(SEQ IDNO:394),ORF35534(SEQ ID NO:396),ORF35930(SEQ ID NO:398),ORF36246(SEQ ID NO:400),ORF26640c(SEQ ID NO:402),ORF36739(SEQ ID NO:404),ORF37932c(SEQ ID NO:406),ORF38640c(SEQ ID NO:408),ORF39309c(SEQID NO:410),ORF38768(SEQ ID NO:412),ORF40047c(SEQ ID NO:414),ORF40560c(SEQ ID NO:416),ORF40238(SEQ ID NO:418),ORF40329(SEQ IDNO:420),ORF40709c(SEQ ID NO:422),ORF40507(SEQ ID NO:424),ORF41275c(SEQ ID NO:426),ORF42234c(SEQ ID NO:428),ORF41764c(SEQ ID NO:430),ORF41284(SEQ ID NO:432),ORF41598(SEQ ID NO:434),ORF42172c(SEQ IDNO:436), 和 ORF42233c(SEQ ID NO:438).
圖4顯示了如下序列的推導的氨基酸序列ORF2(SEQ ID NO:3),ORF3(SEQ ID NO:5),ORF602c(SEQ ID NO:7),ORF214(SEQ IDNO:9),ORF1242c(SEQ ID NO:11),ORF594(SEQ ID NO:I3),ORF1040(SEQ IDNO:15),ORF1640c(SEQ ID NO:17),ORF2228c(SEQ ID NO:19),ORF2068c(SEQID NO:21),ORF1997(SEQ ID NO:23),ORF2558c(SEQ ID NO:25),ORF2929c(SEQ ID NO:27),ORF3965c(SEQ ID NO:29),ORF3218(SEQ ID NO:31),ORF3568(SEQ ID NO:33),ORF4506c(SEQ ID NO:35),ORF3973(SEQ IDNO:37),ORF4271(SEQ ID NO:39),ORF4698(SEQ ID NO:41),ORF5028(SEQ IDNO:43),ORF5080(SEQ ID NO:45),ORF6479c(SEQ ID NO:47),ORF5496(SEQID NO:49),ORF5840(SEQ ID NO:51),ORF5899(SEQ ID NO:53),ORF6325(SEQID NO:55),ORF7567c(SEQ ID NO:57),ORF7180(SEQ ID NO:59),ORF7501(SEQ ID NO:61),ORF7584(SEQ ID NO:63),ORF8208c(SEQ ID NO:65),ORF8109(SEQ ID NO:67),ORF9005c(SEQ ID NO:69),ORF8222(SEQ IDNO:71),ORF8755c(SEQ ID NO:73),ORF9431c(SEQ ID NO:75),ORF9158(SEQID NO:77),ORF10125c(SEQ ID NO:79),ORF9770(SEQ ID NO:81),ORF9991(SEQ ID NO:83),ORF10765c(SEQ ID NO:85),ORF10475(SEQ ID NO:87),ORF11095c(SEQ ID NO:89),ORF11264(SEQ ID NO:91),ORF11738(SEQ IDNO:93),ORF12348c(SEQ ID NO:95),ORF12314c(SEQ ID NO:97),ORF13156c(SEQ ID NO:99),ORF12795(SEQ ID NO:101),ORF13755c(SEQ ID NO:211),ORF13795c(SEQ ID NO:213),ORF14727c(SEQ ID NO:215),ORF13779(SEQ IDNO:217),ORF14293c(SEQ ID NO:219),ORF14155(SEQ ID NO:221),ORF14360(SEQ ID NO:223),ORF15342c(SEQ ID NO:225),ORF15260c(SEQ ID NO:227),ORF14991(SEQ ID NO:229),ORF15590c(SEQ ID NO:231),ORF15675c(SEQ IDNO:233),ORF16405(SEQ ID NO:235),ORF16925(SEQ ID NO:237),ORF17793c(SEQ ID NO:239),ORF18548c(SEQ ID NO:241),ORF17875(SEQ ID NO:243),ORF18479(SEQ ID NO:245),ORF19027c(SEQ ID NO:247),ORF19305(SEQ IDNO:249),ORF19519(SEQ ID NO:251),ORF19544(SEQ ID NO:253),ORF20008(SEQ ID NO:255),ORF20623c(SEQ ID NO:257),ORF21210c(SEQ ID NO:259),ORF21493c(SEQ ID NO:261),ORF21333(SEQ ID NO:263),ORF22074c(SEQ IDNO:265),ORF21421(SEQ ID NO:267),ORF22608c(SEQ ID NO:269),ORF22626(SEQ ID NO:271),ORF23228(SEQ ID NO:273),ORF23367(SEQ ID NO:275),ORF25103c(SEQ ID NO:277),ORF23556(SEQ ID NO:279),ORF26191c(SEQ IDNO:281),ORF23751(SEQ ID NO:283),ORF24222(SEQ ID NO:285),ORF24368(SEQ ID NO:287),ORF24888c(SEQ ID NO:289),ORF25398c(SEQ ID NO:291),ORF25892c(SEQ ID NO:293),ORF25110(SEQ ID NO:295),ORF25510(SEQ IDNO:297),ORF26762c(SEQ ID NO:299),ORF26257(SEQ ID NO:301),ORF26844c(SEQ ID NO:303),ORF26486(SEQ ID NO:305),ORF26857c(SEQ ID NO:307),ORF27314c(SEQ ID NO:309),ORF27730c(SEQ ID NO:311),ORF26983(SEQ IDNO:313),ORF28068c(SEQ ID NO:315),ORF27522(SEQ ID NO:317),ORF28033c(SEQ ID NO:319),ORF29701c(SEQ ID NO:321),ORF28118(SEQ ID NO:323),ORF28129(SEQ ID NO:325),ORF29709c(SEQ ID NO:327),ORF29189(SEQ IDNO:329),ORF29382(SEQ ID NO:331),ORF30590c(SEQ ID NO:333),ORF29729(SEQ ID NO:335),ORF30221(SEQ ID NO:337),ORF30736c(SEQ ID NO:339),ORF30539(SEQ ID NO:341),ORF31247c(SEQ ID NO:343),ORF30963c(SEQ IDNO:345),ORF31539c(SEQ ID NO:347),ORF31222(SEQ ID NO:349),ORF31266(SEQ ID NO:351),ORF31661c(SEQ ID NO:353),ORF32061c(SEQ ID NO:355),ORF32072c(SEQ ID NO:357),ORF31784(SEQ ID NO:359),ORF32568c(SEQ IDNO:361),ORF33157c(SEQ ID NO:363),ORF32530(SEQ ID NO:365),ORF33705c(SEQ ID NO:367),ORF32832(SEQ ID NO:369),ORF33547c(SEQ ID NO:371),ORF33205(SEQ ID NO:373),ORF33512(SEQ ID NO:375),ORF33771(SEQ IDNO:377),ORF34385c(SEQ ID NO:379),ORF33988(SEQ ID NO:381),ORF34274(SEQ ID NO:383),ORF34726c(SEQ ID NO:385),ORF34916(SEQ ID NO:387),ORF35464c(SEQ ID NO:389),ORF35289(SEQ ID NO:391),ORF35410(SEQ IDNO:393),ORF35907c(SEQ ID NO:395),ORF35534(SEQ ID NO:397),ORF35930(SEQ ID NO:399),ORF36246(SEQ ID NO:401),ORF26640c(SEQ ID NO:403),ORF36769(SEQ ID NO:405),ORF37932c(SEQ ID NO:407),ORF38640c(SEQ IDNO:409),ORF39309c(SEQ ID NO:411),ORF38768(SEQ ID NO:413),ORF40047c(SEQ ID NO:415),ORF40560c(SEQ ID NO:417),ORF40238(SEQ ID NO:419),ORF40329(SEQ ID NO:421),ORF40709c(SEQ ID NO:423),ORF40507(SEQ IDNO:425),ORF41275c(SEQ ID NO:427),ORF42234c(SEQ ID NO:429),ORF41764c(SEQ ID NO:431),ORF41284(SEQ ID NO:433),ORF41598(SEQ IDNO:435),ORF42172c(SEQ ID NO:437), 和 ORF42233c(SEQID NO:439).
圖5顯示了編碼由33A9序列編碼的一種蛋白質的核苷酸序列(SEQ ID NO:102)。
圖6A顯示了由33A9序列編碼的一種蛋白質的推導的氨基酸序列(SEQ ID NO:103)。
圖6B顯示了在33A9序列中鑒定的幾種ORF---1-10的核苷酸序列(SEQ ID NO:189、190、191、192、193、194、195、196、197和198)以及它們相應的氨基酸序列(ORFs1-10；SEQ ID NOS:199、200、201、202、203、204、205、206、207和208)。
圖7顯示了34B12 EcoRⅠ片段的物理圖譜，該圖譜確定了三個ORFs的位置ORF1(L-S)、ORF2和ORF1S。還顯示了含有ORF1(L-S)(SEQ ID NOS:105和107)、ORF2(SEQ ID NOS:106和108)和ORF1-S(SEQ DI NOS:208和209)的對應于pho34B12插入子(SEQID NO:104)的核苷酸序列。
圖8顯示了圖7中描述的ORF1(L-S)(SEQ ID NO:107)的推導的氨基酸序列。
圖9顯示了圖7中描述的ORF2(SEQ ID NO:108)的推導的氨基酸序列。


圖10顯示了對應于36A4插入子的核苷酸序列(SEQ ID NO:109)。
圖11顯示了由36A4序列編碼的多肽的推導的氨基酸序列(SEQ IDNO:110)。由36A4序列編碼的推測的多肽與丁香假單胞菌的hrpM基因具有同源性(Loubens et al.Mol.Microbiol.10:329-340,1993)。
圖12顯示了使用36A4核苷酸序列確定的毗連群2507的核苷酸序列(SEQ ID NO:111)。
圖13顯示了對應于23A2插入子的核苷酸序列(SEQ ID NO:112)。
圖14A顯示了由23A2序列編碼的多肽的推導的氨基酸序列(SEQID NO:113)。由23A2序列推測的多肽與銅綠假單胞菌(菌株CD10)中的一種已知蛋白---mexA基因同源。該基因是還含有兩種其他基因---mexB和orpM的一個操縱子的一部分(Poole等，Mol.Microbiol.10:529-544,1993)；GenBank登記號L11616。
圖14B顯示了PA14 mexA和mexB的核苷酸序列(SEQ ID NO:148)和推測的氨基酸序列(分別為SEQ ID NOS:149和150)。
圖15顯示了使用3E8序列標記確定的PA01吩嗪操縱子的核苷酸序列(SEQ ID NO:114)。
圖16A顯示了3E8序列標記的核苷酸序列(SEQ ID NO:115)。
圖16B顯示了3E8序列標記兩翼的核苷酸序列(SEQ ID NO:160)。
圖17顯示了推導的3E8 PHZA氨基酸序列(SEQ ID NO:116)。
圖18A顯示了推導的3E8 PHZB氨基酸序列(SEQ ID NO:117)。
圖18B顯示了推導的3E8 PHZA的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:116)。
圖18C顯示了推導的3E8 PHZB的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:116)。
圖18D顯示了推導的3E8 PHZC的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:116)。
圖18E顯示了PA14phzR的核苷酸序列(SEQ ID NO:164)和推導的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:165)。
圖19顯示了34H4序列標記的核苷酸序列(SEQ ID NO:118)。
圖20顯示了33C7序列標記的核苷酸序列(SEQ ID NO:119)。
圖21顯示了25a12.3序列標記的核苷酸序列(SEQ ID NO:120)。
圖22顯示了8C12序列標記的核苷酸序列(SEQ ID NO:121)。
圖23顯示了2A8序列標記的核苷酸序列(SEQ ID NO:122)。
圖24A分別顯示了41A5、50E12、35A9、pho23、16G12和25F1TnphoA序列標記的核苷酸序列(SEQ ID NO:123、124、125、126、127和128)。
圖24B顯示了PA14pho15的核苷酸序列(SEQ ID NO:166)和推導的氨基酸序列(SEQ ID NO:167)。
圖24C顯示了編碼YgdPpa(SEQ ID NO:169)和PtsPpa(SEQ IDNO:170)的PA14 50E12的核苷酸序列(SEQ ID NO:168)。
圖24D顯示了編碼mtrRpa(SEQ ID NO:172)的PA14 35A9的核苷酸序列(SEQ ID NO:171)。
圖24E顯示了編碼ORFT(SEQ ID NO:174)、ORFU(SEQ ID NO:175)和DjlApa(SEQ ID NO:176)的PA14 25F1的核苷酸序列(SEQID NO:173)。
圖25分別顯示了PA01和PA14的銅綠假單胞菌的phnA和phnB基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:129)。
圖26顯示了PHNA的推測的氨基酸序列(SEQ ID NO:130)。
圖27顯示了PA14 degP基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:131)。
圖28顯示了PA14 degP基因的推導的氨基酸序列(SEQ ID NO:132)。
圖29顯示了銅綠假單胞菌菌株8830的algD基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:133)。
圖30顯示了銅綠假單胞菌菌株8830的algD基因的推導的氨基酸序列(SEQID NO:134)。
圖31顯示了使用25A12確定的1126毗連群的核苷酸序列(SEQ IDNO:135)。
圖32顯示了使用33C7確定的1344毗連群(SEQ ID NO:136)的物理圖譜，它顯示了三個確定的ORFs:ORFA(SEQ ID NO:440)、ORFB(SEQ ID NO:441)和ORFC(SEQ ID NO:442)。還顯示了分別由這些ORF編碼的ORFA(SEQ ID NO:443)、ORFB(SEQ ID NO:444)和ORFC(SEQ ID NO:445)的氨基酸序列。
圖33顯示了1G2序列標記的核苷酸序列(SEQ ID NO:137)。
圖34A-D是使用新小桿線蟲(C.elegans)慢致死試驗的4個TnphoA突變體的蠕蟲致病表型互補的顯示圖。
圖34A是如下內容的顯示圖非致病表型的突變體12A1(空心菱形)可以用在菌株12A1(pKDT17)(空心圓圈)中位于組成型lacZ啟動子的反式控制下的、來自PA01的1asR基因完全互補成野生型PA14水平(實心方塊)。重組的lasR突變體---PA14 lasR-G(空心方塊)與12A1(空心菱形)一樣是非致病性的。還顯示了由使用1日齡的成蟲的一個試驗所獲得的結果。
圖34B是pho15的延遲致死表型的互補的顯示圖。菌株pho15(pEcdsbA)(空心菱形)和pho15(pPAdsbA)攜帶了位于組成型lacZ啟動子控制之下的分別來自大腸桿菌和銅綠假單胞菌的dsbA基因。
圖34C是如下內容的顯示圖25F1的延遲致死表型分別只被攜帶了含有orf338和orf338-orf224-djlApa的質粒的菌株25F1(pORF338)和25F1(p3-ORFs)部分保留。
圖34D是50E12被orf159-ptsPpa操縱子互補的顯示圖。菌株50e12(pUCP18)如同突變體12A1一樣，即使經過63小時也不能殺死蠕蟲。兩種表達假定的orf159-ptsPpa操縱子的菌株---50E12(pMT205-1ac)和50E12(pMT206-nat)能夠殺死新小桿線蟲(C.elegans)。在50E12(pMT205-lac)中，orf159-ptsPpa的轉錄在組成型lacZ啟動子的控制之下，而在50E12(pMT206-nat)中，操縱子由其天然啟動子控制。
每個數(shù)據(jù)點代表3-4個重復的平均值±SD。除非另外說明，在實驗中使用同步的L4蠕蟲。對于每一個互補分析，至少進行兩次獨立的實驗。
圖35A是顯示鄰氨基苯甲酸合成酶復合物的示意圖，該復合物由phnA和phnB基因編碼，它催化分支酸轉變?yōu)猷彴被郊姿?。鄰氨基苯甲酸在銅綠假單胞菌菌株PA01中是綠膿素合成的前體(Essar等，J.Bacteriol.172:884-900,1990)。雙箭頭表示參與導致鄰氨基苯甲酸轉變?yōu)榫G膿素的多個未確定的步驟。
圖35B顯示在phnA和phnB基因中框內刪除1602 bp而產生ΔphnAphnB突變體的示意圖。
圖35C是ΔphnAphnB突變體對新小桿線蟲快速致死的影響的顯示圖?？焖僦滤缹嶒炇褂靡吧蚉A14菌株、TnphoA突變體3E8或ΔphnAphnB菌株進行。在開始暴露于細菌3小時后監(jiān)測蠕蟲的死亡，并將在ΔphnAphnB菌株中所見的快速致死缺陷與另一種吩嗪突變體---3E8進行比較。
毒力因子的鑒定和表征如同這里所介紹的，植物被用作一種體內致病模型，來鑒定人機會病原體---銅綠假單胞菌的毒力因子。在選擇弱致病性突變體的植物葉試驗中鑒定的9個銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14的TnphoA突變衍生物中，9個突變衍生物也都在小鼠燒傷試驗中顯示明顯降低的致病性，這說明銅綠假單胞菌在感染兩種宿主時使用許多共同策略。這9個突變體中有7個在以前不知道的基因中含有TnphoA插入。這些結果證明，一種人類細菌病原體的另一種非脊椎動物的宿主可以用于一種高通量的體內篩選，用于鑒定參與哺乳動物致病的新型細菌毒力因子。這些實驗性實施例是用來說明而不是限制本發(fā)明的范圍。
這些實驗使用下列技術來進行。
菌株、生長條件和質粒。銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14是一種人臨床分離株，它被用于這些鑒定新型毒性相關基因的實驗中(Ausubel等，篩選適用于防止感染或致病的化合物的方法，分別提交于1995年3月25日，1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs08/411,560,08/852,927，和08/962,750.Rahme等，Science 268:1899-1902,1995)，銅綠假單胞菌菌株PAK(Ishimoto和Lory,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1954-1957,1989)和PA01(Holloway等，Microbiol.Rev.43:73-102,1979)已在許多實驗室中進行了廣泛的研究。Luria Bertani肉湯和瓊脂被用于在37℃培養(yǎng)銅綠假單胞菌和大腸桿菌菌株?；九囵B(yǎng)基(M9)也被用于培養(yǎng)銅綠假單胞菌。
轉座子誘變。UCBPP-PA14的轉座子介導的誘變使用大腸桿菌SM10λpir中自殺質粒pRT731上攜帶的TnphoA來進行(Taylor等，J.Bacteriol.171:1870-1878,1989)。在這種培養(yǎng)基中生長的供體和受體細胞一起鋪于Luria Bertani瓊脂平板，并在37℃溫育8至10小時，并接著鋪于含有利福平(100ug/ml)(用來針對大腸桿菌供體進行選擇)和卡那霉素(200ug/ml)(用來選擇含有TnphoA的銅綠假單胞菌細胞)的Luria Bertani平板。將能在利福平和卡那霉素培養(yǎng)基上生長的克隆復制至含有氨芐青霉素(300ug/ml)的Luria Bertani；氨芐青霉素抗性克隆就表明pRT731整合進UCBPP-PA14的基因組，將它們棄去。
堿性磷酸酶活性。將二千五百(2500)個原養(yǎng)型UCBPP-PA14TnphoA突變體在含有40ug/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(XP)的蛋白胨葡萄糖瓊脂平板上進行選擇(Ostroff等，J.Bacteriol.172:5915-5923,1990)。選用蛋白胨培養(yǎng)基是因為它能抑制內源性藍-綠色素綠膿素和黃色熒光色素綠膿菌熒光素的產生，從而能夠觀察到由phoA+突變體產生的周質堿性磷酸酶對XP進行去磷酸化而產生的藍色。
培養(yǎng)條件和突變體分離策略。將在L肉湯中在37℃培養(yǎng)至飽和的銅綠假單胞菌菌株在10mM MgSO4中洗滌，并重懸于10mM MgSO4中，使其光密度為0.2(OD600=0.2)，并按1∶100和1∶1000稀釋(分別相當于約106和105cfu/ml的細菌密度)。使用一只自動移液器將約10ml的稀釋細胞接種到在溫室(26℃)中在MetroMix盆栽土壤中生長的約12周齡的萵苣植物(Romain或Great lake變種)的莖中。將莖用0.1％的漂白粉洗滌，并置于含有一張Whatman濾紙(Whatman#1)的15cm直徑的培養(yǎng)皿中，濾紙預先用10mM MgSO4浸潤。每個萵苣葉的中脈用三種不同的將要檢測的能產生TnphoA的銅綠假單胞菌突變體進行接種，使用野生型的UCBPP-PA14作為對照。在實驗過程中，將平板放置在一個培養(yǎng)箱內，參數(shù)為28-30℃和90-100％的相對濕度。每天監(jiān)測癥狀，共進行5天。
在擬南芥葉浸潤模型中，將按上面方法培養(yǎng)和洗滌的銅綠假單胞菌按1∶100在10mM MgSO4中進行稀釋(相當于103/cm2葉盤面積的細菌密度)，并按對丁香假單胞菌浸潤的介紹注射到6周齡的擬南芥植物的葉中(Ausubel等，篩選適用于防止感染或致病的化合物的方法，分別提交于1995年3月25日，1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs 08/411,560,08/852,927，和08/962,750；Rahme等，science 268:1899-1902,1995；Dong等，Plant Cell 3:61-72,1991)。接種條件和癥狀的監(jiān)測與萵苣實驗相同。收集含有細菌的葉細胞間液，并按介紹確定細菌的數(shù)量(Rahme等，Science 268:1899-1902,1995；Dong等，Plant Cell 3:61-72,1991)。每個樣品使用兩個葉盤，共采用4個不同的樣品。使用10mM MgSO4接種的對照植物顯示無癥狀發(fā)展。
小鼠致死研究。按前面的介紹在重量為25至30gm之間的雄性AKR/J小鼠的伸出的腹部皮膚制造一個5％總表面積的燒傷(Ausubel等，篩選適用于防止感染或致病的化合物的方法，分別提交于1995年3月25日，1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs08/411,560,08/852,927，和08/962,750；Rahme等，science 268:1899-1902,1995:Stevens,J.Burn Care Rehabil.15:232-23,1994)。燒傷后，立即向小鼠注射5×103或5×105的銅綠假單胞菌細胞，并每天監(jiān)測死于敗血癥的動物數(shù)目，共進行10天。MassachusettsGeneral Hospital的動物研究分委會對該動物研究方法進行了評價和認可。使用Yates’校正的x2檢驗和Fisher’s精確檢驗確定了致死數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學意義。各組間的差別在P≤0.05時被認為是有統(tǒng)計學意義。
TnphoA突變體的DNA操作、分子克隆和序列分析。銅綠假單胞菌的染色體DNA用酚抽提法進行分離(Storm和Lory,J.Bacteriol.165:367-372,1986),DNA印跡和雜交研究按Ausuber等(CurrentProtocols in Molecular Biology,Wiley,New York,1996)的介紹進行。
寡核苷酸5’-AATATCGCCCTGAGCAGC-3’(LGR1)(SEQ ID NO:138)和5’-AATACACTCACTATGCGCTG-3’(LGR2)(SEQ ID NO:139)對應于TnphoA的相反鏈上5’末端的序列。寡核苷酸5’-CCATCTCATCAGAGGGTA-3’(LGR3)(SEQ ID NO:140)和5’-CGTTACCATGTTAGGAGGTC-3’(LGR4)(SEQ ID NO:141)對應于TnphoA的相反鏈上3’末端的序列。LGR1+LGR2或LGR3+LGR4被用來按介紹通過反向PCR(IPCR)擴增與TnphoA插入位點相鄰的DNA序列(Ochman等，1993，方法和應用指南，eds.Innis,M.A.,States,D.J.,1990)。將大小范圍在350至650堿基對之間的擴增DNA片段克隆到pBlueScript SK+/-中，方法是在亞克隆到pBlueScript SK+/-的EcoRV位點之前，將IPCR產物的末端補平。為測定IPCR擴增產物的序列，使用Sequenase 2.0試劑盒(U.S.BiochEmical,Inc.)進行雙鏈DNA測序。使用BLASTX程序(Gish和States,Nat.GenEt.3:266-272,1993)將所獲得的序列在National Center forBiotechnology Information(NCBI)與非豐余肽序列數(shù)據(jù)庫進行比較。
從UCBPP-PA14基因組文庫中分離含有對應于pho34B12突變的基因的野生型克隆及DNA操作。由UCBPP-PA14 TnphoA突變體pho34B12突變體制備的IPCR產物使用一種隨機引物DNA標記試劑盒(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)進行標記，并用作探針在一個pJSR1中的UCBPP-PA14染色體DNA的基因組文庫中(Rahme等，Science 268:1899-1902,1995)篩選含有對應于pho34B12突變的基因的克隆。在對應于phoA34B12突變的粘?？寺LGR34B12中鑒定了一個3.7kb的EcoRⅠ片段，在將載體和片段的末端補平后，將該片段亞克隆到pRR54(Roberts等，J.Bacteriol.172:6204-6216)的EcoRⅠ位點，構建成pLGRE34812。將同一片段(將其平末端化)亞克隆到pCVD(Donnenberg和Kaper,Infect.Immun.59:4310-4317,1991)的SmaⅠ位點，構建成pLGR34。pLGR被用于按介紹使用一種野生型拷貝取代突變的pho34B12基因(Donnenberg和Kaper,Infect.Immun.59:4310-4317,1991)。還將該3.7kb的EcoRⅠ片段亞克隆到pBlueScript SK+/-的EcoRⅠ位點，構建成pBSR34B12，并用于DNA分析。
一個對應于pho34B12插入子的1,659堿基對序列在相反的鏈上含有兩個重疊的開放閱讀框(ORF1和ORF2)，將該序列提交給GenBank，并獲得登錄號AF031571。ORF1為1,148bp(核苷酸361至1509),ORF2為1,022bp(核苷酸1458至436)。兩個ORF的重疊是從核苷酸436至1458。ORF1在核苷酸751含有第二個可能的翻譯起始位點，相當于一個758bp的編碼區(qū)。寡核苷酸引物5’-CGCATCGTCGAAACGCTGGCGGCC-3’(SEQ ID NO:142)和5’-GCCGATGGCGAGATCATGGCGATG-3’(SEQ ID NO:143)被用來從含有ORF1的pBSR34B12中擴增一個1100bp的片段。因為在ORF1中存在兩個可能的起始位點，寡核苷酸引物5’-TGCGCAACGATACGCCGTTGCCGACGATC-3’(SEQ ID NO:144)和5’-GATTCCACCTTCGCAGCGCAGCCC-3’(Reg3)(SEQ ID NO:145)也被用來從含有ORF1的pBSR34B12中擴增一個1659bp的片段。寡核苷酸引物5’-GATTCCACCTTCGCAGCGCAGCCC-3’(SEQ ID NO:146)和5’-GCCGATGGCGAGATCATGGCGATG-3’(SEQ ID NO:147)被用來從含有ORF2的pBSR34B12中擴增一個1302 bp的片段。所有引物組合都被設計來含有每種ORF的假定上游調節(jié)元件。將所獲得的PCR產物(1100、1659和1302bp)克隆到pCR2.1中，分別構建成pLE15、pLE1和pLE2。將所有三種PCR產物亞克隆到pRR54中，分別構建成pRRLE15、pRRLE1和pRRLE2。
TnphoA突變體的酶活性。將在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時的銅綠假單胞菌菌株用于酶活性分析。蛋白水解活性和彈性蛋白水解活性按前面介紹的方法進行測定(Toder等，Mol.Microbiol.5:2003-2010,1991)。綠膿素的量按介紹進行測定(Essar等，J.Bact.172:884-900)。在補加了5％綿羊紅細胞的含有胰胨豆胨瓊脂(BBL)的平板上溫育后，檢測溶血活性(Ostroff和Vasil,J.Bacteriol.169:4957-4601)。
一種非極性GacA突變的制備。通過將一個來自粘粒pLGR43(Rahme等，Science 268:1899-1902)的含有gacA基因的3.5kb的PstⅠ片段使用BamHⅠ接頭克隆到自殺載體pEGBR(Akerley等，Cell80:611-620,1995)的單一BamHⅠ酶切位點，在UC BPP-PA14中構建了一個非極性的gacA突變。然后將來自pUC18K(Menard等，J.Bacteriol.175:5899-5906,1993)的含有卡那霉素抗性基因盒的一個Klenow末端補平的950bp的EcoRⅠ-HincⅡ片段克隆到gacA中的單一BamHⅠ酶切位點(補平)，這樣使轉錄維持，并且gacA下游部分的翻譯在卡那霉素基因盒的3’端重新開始。所獲得的結構物SW7-4在gacA基因內部含有轉錄方向的該卡那霉素基因盒，SW7-4被用于通過同源重組將破壞的gacA基因標記交換到野生型UCBPP-PA14的基因組中。
銅綠假單胞菌毒力因子的分離和鑒定。使用上面介紹的方法，用轉座子TnphoA對銅綠假單胞菌UCBPP-PA14的基因組進行誘變，使用萵苣莖試驗在2500個原養(yǎng)型突變體中篩選被破壞的致病性。該萵苣試驗允許在一個單個的萵苣莖上檢測數(shù)個突變體。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)萵苣不僅對UCPBB-PA14的感染易感，還對已經得到很好研究的銅綠假單胞菌菌株PAK(Ishimoto和Lory,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1954-1957,1989)和PAO1(Hollow等，Microbiol.Rev.43:73,1979)易感。后兩種菌株都能在萵苣葉上增殖，并顯示與UCBPP-PA14相似的疾病癥狀，其特征是感染4-5天后出現(xiàn)水浸潤，接著腐爛。在感染后期，所有三種菌株都侵入萵苣葉的整個中脈，導致組織的完全浸軟和萎縮。
如同表1中所概述的，我們在2500個被篩選的原養(yǎng)型中鑒定了9個UCBPP-PA14的能產生TnphoA的突變體，與野生型菌株相比，它們在萵苣莖上表現(xiàn)出沒有、微弱或中等的腐爛癥狀。
表1
a4個不同的樣品均使用兩個葉盤/樣品來進行。用10mM MgSO4接種的對照植物在實驗過程中顯示無癥狀。三個獨立的實驗給出了相似的結果。
b感染4至5天后觀察到的結果。無，無癥狀；退綠，接種位點的周圍退綠；弱，接種位點周圍的組織局部水浸透和退綠；中等，接種位點周圍中等強度的水浸透和退綠，并且組織大部分松軟；嚴重，整個葉出現(xiàn)嚴重的松軟腐爛，其特征是在感染2至3天后，接種位點周圍出現(xiàn)水浸透反應圈和退綠。
c所有的動物實驗均使用8-10個動物/實驗進行兩次。獨立實驗顯示相似的死亡率百分數(shù)。小鼠用約5×103或5×105細胞注射。
dBLASTX分析沒有獲得有明顯同源性的編碼蛋白。
用任何突變體都沒有觀察到葉的嚴重浸軟。將一個含有TnphoA的卡那霉素抗性基因的1542堿基對的BglⅠ-BamHⅠ片段(Taylor等，J.Bact.171:1870-1878,1989)用作探針，DNA印跡分析顯示，9個突變體每個都含有一個單一的TnphoA插入。9個UCBPP-PA14TnphoA突變體中有兩個---pho34B1和pho15能表達堿性磷酸酶活性，這說明含有這些TnphoA插入的基因編碼跨膜或分泌型的蛋白(Taylor等，J.Bact.171:1870-1878,1989；Manoil和Beckwith,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5117,1985)。
通過測量它們在擬南芥葉上在4天中的生長速率，對這9個TnphoA突變體進行了進一步的檢測，作為致病性的定量測定(Rahme等，Science 268:1899-1902,1995；Dong等，Plant Cell 3:61-72,1991)。雖然在加富和基本培養(yǎng)基中，與野生型菌株相比，沒有突變體在其生長速率上顯示任何明顯的差別，但所有9個突變體在擬南芥葉上的生長速率比野生型菌株低。表1列出了每個突變體在感染4天后達到的最高生長水平。對所有9個突變體來說，較少的嚴重癥狀形成反映了葉中細菌數(shù)目的減少。所有突變體除了33C7都顯示弱的或中等的腐爛以及伴隨不同程度退綠(變黃)的水浸潤癥狀(表1)。但有趣的是，如表1中的概述，單個突變體的增殖并不與它們表現(xiàn)出的癥狀的嚴重程度直接相關。例如，雖然突變體25A12(圖1)的生長水平與突變體33A9(圖5和圖6A-B)、pho34B12(圖7、8和9)以及34H4(圖19)相似，只是野生型UCBPP-PA14的十分之一，但突變體25A12顯示非常弱的癥狀。與此類似，突變體33C7(圖20)、pho15(圖24B)和25F1(圖24A)都能達到相似的最高生長水平(比野生型的生長約低103倍)，但只有突變體33C7不產生任何疾病癥狀(表1)。在10個突變體中觀察到的癥狀程度與增殖水平之間的差異，說明這些突變體可能在參與植物感染過程不同階段的基因中攜帶插入子。
9個在植物葉試驗中顯示較低致病性的產TnphoA突變體各自的致病性，都在一個全厚皮膚熱燒傷小鼠模型中進行了測定(Rahme等，Science 268:1899-1902,1995；Stevens,J.Burn Care Rehabil.15:232-23,1994)。如表1中所示，所有9個突變體在兩種劑量時都與野生型有明顯的差異(P≤0.05)，除了25A12和16G12(圖24A)在5×105細胞的較高劑量時與野生型沒有明顯的差異。除了表1中所示的數(shù)據(jù)，突變體33A9即使在5×106的高劑量時也不會致死。
我們使用DNA印跡分析和DNA序列分析來測定在9個致病性較低的突變體中TnphoA是否插入到了已知基因中。DNA印跡分析顯示，突變體1D7含有一個插入到gacA基因(Laville等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1562-1566,1992；Gaffney等，Mol.Plant-MicrobeInteract.7:455-463,1994)的TnphoA，我們在前面已經介紹，gacA是銅綠假單胞菌在植物和動物中的一個重要致病因子(Ausubel等，篩選適用于防止感染或致病的化合物的方法，分別提交于1995年3月25日，1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs08/411,560,08/852,927，和08/962,750.Rahme等，Scienee 268:4927-4931,1995)。使用程序BLASTX進行的計算機分析顯示，當將對應于其他7個TnphoA插入的DNA序列按所有可能的閱讀框翻譯時，沒有發(fā)現(xiàn)與任何已知的基因有明顯的相似性(表1)。
我們進行各種生化試驗來將9個致病性較低的UCBPP-PA14突變體分類，分類的基礎是它們是否在以前已知的主要毒力因子和/或代謝途徑中帶有缺陷。所有突變體都被測試了蛋白酶、彈性蛋白酶和磷酸酶活性以及它們分泌次級代謝產物綠膿素的能力(Toder等，Mol.Microbiol.5:2003-2010,1991；Essar等，J.Bact.172:884-900；Ostroff和Vasil,J.Bacteriol.169:45974601,1987)。綠膿素是一種氧化還原活性的吩嗪化合物，它可被大多數(shù)銅綠假單胞菌的臨床株外泌，通過產生活性氧中間物殺死哺乳動物細胞和細菌細胞，它被認為是銅綠假單胞菌的一種毒力因子(Hassett等，Infect.Immun.60:328-336,1992；Kanthakumar等，Infect.Immun.61:2848-2853,1993；Miller等，Infect.Immun.64:182,1996)。突變體33C7、33A9、34H4、25F1和16G12沒有在任何所用的生化試驗中顯示缺陷。突變體pho34B12顯示在血瓊脂平板上的溶血活性降低、彈性蛋白酶活性降低(約50％)以及沒有可檢測到的綠膿素產生。突變體pho15顯示僅有痕量的彈性蛋白酶活性，與野生型相比蛋白酶活性降低(60-70％)。突變體25A12顯示彈性蛋白酶活性減低50％。最后，在gacA中含有一個插入的突變體1D7顯示，與野生型相比其綠膿素水平降低(約50％)。除了突變體1D7，第二個獨立的gac::TnphoA突變體---突變體33D11在我們的植物篩選中被鑒定。后一突變體也在綠膿素產生上顯示相似的降低，并在植物和小鼠中毒力降低。
根據(jù)突變體的DNA序列分析和生化試驗，突變體1D7和pho34B12中被TnphoA靶向插入的基因被選擇來作進一步的分析。如上文所討論的，1D7在gacA中含有一個插入，我們在前面已經介紹，gacA編碼一種銅綠假單胞菌的毒力因子(Rahme等，Science 268:1899-1902，1995)。最近，一種gacA樣的基因也顯示是鼠傷寒沙門氏菌的一種重要毒力因子(Johnston等，Mol.Microbiol.22:715,1996)。但兩種gacA::TnphoA插入(1D7和33D11)、我們以前構建的gacA插入突變體(Ausubel等，篩選適用于防止感染或致病的化合物的方法，分別提交于1995年3月25日，1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs 08/411,560,08/852,927，和08/962,750.Rahme等，Science 268:1899-1902,1995)、以及一個獨立構建的能影響數(shù)種已知毒力因子產生的銅綠假單胞菌gacA突變體(Hassett等，Infect.Immun.60:328-336,1992)都至少對一種基因---緊接著gacA下游的一種大腸桿菌uvrC基因的同源物產生極性作用(Rahme等，Science 268:1899-1902,1995；Laville等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1562-1566,1992；Reimmann等，Mol.Microbiol.24:309-319,1997)。為提供明確的證據(jù)來說明，這里介紹的gacA突變體的致病表型喪失是由于gacA開放閱讀框本身的破壞，而不是gacA下游一個基因的極性作用，我們使用一個編碼卡那霉素抗性的基因盒在UCBPP-PA14中構建了一個非極性的gacA突變體。重要的是，該非極性gacA突變體在小鼠試驗(50％致死)和擬南芥試驗(4天后長至3×106cfu/cm2)中顯示與gacA::TnphoA突變體(1D7)相同的致病水平降低，但不顯示極性gacA突變體的極度UV敏感性。和1D7一樣，與野生型相比，非極性的gacA突變體也外泌較低水平的綠膿素(50％)。
根據(jù)以下原因，突變體pho34B12被選擇來進行進一步的分析。首先，pho34B12中的插入直接位于銅綠假單胞菌綠膿素生物合成基因phnA和phnB的下游(Essar等，J.Bact.172:884-900,1990)，插入在銅綠假單胞菌基因組的一個以前沒有分析的區(qū)域內。第二，pho34B12插入導致了多種表型，包括彈性蛋白酶活性和溶血活性降低，這說明pho34B12的TnphoA插入所處的基因可能編碼不同致病因子的一個調節(jié)子。
為排除這樣一種可能性，即pho34B12中的第二個突變而不是TnphoA插入導致了致病表型的喪失，我們通過同源重組用相應的野生型基因置換了pho34B12::TnphoA突變。這導致在植物和動物中致病性缺陷的回復，以及溶血活性和彈性蛋白酶活性和綠膿素產生回復到野生型的水平(下文表2)。
表2a
a表格內條目的解釋見表1。
表2中的這些結果顯示，pho34B12中的TnphoA插入是該菌多種表型包括致病表型喪失的原因。在pho34B12::TnphoA插入后面的終止密碼子的下游500bp內沒有可能的ORFs存在，這個事實說明，TnphoA不太可能對負責突變體pho34B12的下游基因產生極性作用。用一個含有3.7kb插入子(該插入子包括pho34B12和部分phnAB區(qū))對pho34B12進行遺傳互補分析可導致彈性蛋白酶和溶血活性回復到野生型水平，并可產生10倍過量表達的綠膿素(表2)。但是pho34B12在擬南芥和小鼠中破壞的致病性不能被pLGRE34B12互補(表2)，很可能是因為多個拷貝的相當于pho34B12的野生型基因的存在。
進一步的DNA序列分析顯示，含有pho34B12突變的區(qū)域編碼兩個幾乎完全重疊但以相反方向轉錄的開放閱讀框(ORFs)(ORF1和ORF2)。而且，ORF1具有兩個潛在的甲硫氨酸起始密碼子(命名為ORF1-S和ORF1-L)。由ORF1-s和ORF1-L編碼的預計的蛋白以與phnA和phnB相同的方向轉錄，它們和phoA基因都含有一個共有基元，該基元相當于在多種原核生物膜脂蛋白中發(fā)現(xiàn)的一種脂結合位點(Hayashi和Wu,J.Bioenerg.Biomembr.22:451-471,1990)。這些膜脂蛋白與一個前體信號肽一起合成，這就為pho34B12插入的Pho+表型提供了一種解釋(Hayashi和Wu,J.Bioenerg.Biomembr.22:451-471,1990)。由ORF2編碼的預計的蛋白含有N末端的“螺旋-轉角-螺旋”DNA結合基元，這個基元與在轉錄調節(jié)子LysR家族中發(fā)現(xiàn)的“螺旋-轉角-螺旋”基元相似(Henikoff等，Proc.Natl.Acad.sci.USA 85:6602-6606,1988；Viale等，J.Bacteriol.173:5224-5229,1991)。這個家族的蛋白包括參與哺乳動物和植物致病的調節(jié)子(Finlay和Falkow,Microbiol.and Mol.Biol.Rev.61:136-169,1997)。兩個有功能的、幾乎完全重疊的ORFs的存在在細菌基因組中是不常見的。
為確定pho34B12區(qū)域中編碼的ORFs哪一個是有功能的，我們使用含有對應于ORF1-S、ORF1-L和ORF2的PCR產物的質粒進行另外的互補分析(圖7)。能合成ORF2編碼的蛋白的質粒(pRRLE2)能使綠膿素的產量和彈性蛋白酶活性回復到野生型水平的20-40％。與此類似，這個互補菌株的溶血活性被部分回復。用分別相當于ORF1-S和ORF1-L的質粒對pho34B12進行互補，也能回復溶血、綠膿素和彈性蛋白酶活性。但有趣的是，質粒pRRLE1和pRRLE15的存在能產生10倍高產量的綠膿素和2倍高水平的彈性蛋白酶活性。無論pRRLE1、pRRLE15還是pRRLE2都不能互補突變體pho34B12在植物或動物中的致病性喪失表型(表2)。對該區(qū)域的進一步分析包括位點特異性誘變將進一步闡明三個ORFs中哪一個是在植物和動物中致病所必需的。
上面列出的結果證明，以前未知的在哺乳動物致病性中起明顯作用的銅綠假單胞菌毒力因子(基因)可以很方便地通過在隨機的銅綠假單胞菌突變體中篩選在植物中顯示致病性減弱的突變體來鑒定。這與我們以前的研究一致，在以前的研究中我們證明，至少三種銅綠假單胞菌基因編碼參與植物和動物致病性的毒性因子(Ausubel等，篩選適用于防止感染或致病的化合物的方法，分別提交于1995年3月25日，1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs 08/411,560,08/852,927，和08/962,750.Rahme等，Science 268:1899-1902，1995)。在另一方面，我們未曾預料到，我們分離的在植物中有較低致病性的9個突變體也都在小鼠中具有較低致病性。這個結果最簡單的解釋是，銅綠假單胞菌在植物和動物中的致病性都利用一套基本上重疊的基因，這些基因可被認為是基本的毒力基因。另一個可能的解釋是，某些已鑒定的基因可能編碼控制不同效應分子的調節(jié)蛋白(即pho34B12)，它們的一些亞類可能對植物或動物具有特異性。我們也未預料到在該研究中鑒定的突變體大多數(shù)(9個中有7個)會對應于以前不知道的基因。使用泊松分布，根據(jù)銅綠假單胞菌的5.9Mb大小的基因組和平均基因大小為1.1kb，我們計算出，檢測2500個突變體代表在試驗中檢測每種基因的95％可能性所需要檢測的總數(shù)目的25％。因此，由于我們對銅綠假單胞菌毒力突變體的篩選并不接近飽和，有可能很多其他的在致病性中起重要作用的銅綠假單胞菌基因等待發(fā)現(xiàn)。
重要的是，至少在我們的模型中鑒定出的在植物致病性中起重要作用的兩個以前已知的毒力因子(基因)，不僅在小鼠燒傷模型中對銅綠假單胞菌來說是重要的毒力因子，而且在其他革蘭氏陰性病原體中也被描述為重要的毒力因子。后面這些致病因子(基因)包括dsbA和gacA(Shevehik等，Mol.Microbiol.16:745-753,1995；Peek和Taylor,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6210-6214,1992；Watarai等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4927-4931,1995；Johnston等，Mol.Microbiol.22:715,1996)。這說明在銅綠假單胞菌中鑒定的以前未知的因子，很多都通常與革蘭氏陰性致病性有關。
這個研究可得出得另一個重要結論是，我們發(fā)展的高通量的體內篩選方法可以導致與明顯的生化缺陷沒有關系的致病因子的鑒定。突變體33C7、33A9、34H4、25F1和16G12顯示在數(shù)種已知的銅綠假單胞菌的致病因子中沒有可檢測到的缺陷，并且重要的是，突變體33C7和33A9在小鼠模型中最弱。而且，即使突變體pho34B12和25A12的確顯示已知毒力因子的產生減少，但這些突變所對應的基因以前沒有被鑒定，這很可能是因為這些突變體中的生化缺陷在一個簡單的高通量篩選中不能被有效地鑒定。這證明了我們對致病表型喪失進行篩選的敏感性。
在過去的幾年中，其他鑒定細菌致病因子的高通量篩選已經有介紹。IVET(體內表達技術)能鑒定在致病過程中特異性激活的啟動子(Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:10434-10439,1996；Mahan等，Science 259:686-688,1993),STM(信號標志轉座子技術)能鑒定在一種宿主中生存所需的基因(Hensel,Science 268:400-403,1995)，以及DFI(差別熒光誘導)利用綠色熒光蛋白和熒光激活的細胞分選來鑒別在特殊環(huán)境或在特殊宿主細胞類型中活化的基因(Valdivia和Falkow,Mol.Microbiol.22:367-378，1996)。這些方法可以與我們在本發(fā)明中介紹的方法互補，并且每種方法都有其優(yōu)點和缺點。我們的篩選方法在非脊椎動物宿主中的一個優(yōu)點是，它可直接測定致病性，而IVET和DFI方法測量致病性相關基因的表達。不像STM方法，它鑒別其功能不能被用于接種的細菌突變體混合物反式互補的基因，本發(fā)明的篩選方法在非脊椎動物中涉及單獨檢測每個突變克隆。
其他毒力靶33A9核酸序列(圖5和6A-B)也在一種被命名為BI48的粘?？寺≈械玫借b定(圖1)。該粘粒被全分子測序，其核酸序列示于圖2。使用標準的數(shù)據(jù)分析，鑒定了幾個其他開放閱讀框的核苷酸序列和推導的氨基酸序列(圖3和4)。該分析的概述示于表3。同上面介紹的序列一樣，在圖3和4中發(fā)現(xiàn)的任何一種序列都可用于篩選能降低一種病原體的毒力的化合物(例如使用上面介紹的方法)。
從菌株PA14的pBI48粘粒中所獲得的序列顯示，33A9位于菌毛基因簇上游約5kb處(圖1，表3)。該基因簇含有pilS/pilR基因，已知它們參與菌毛形成的調節(jié)。而且，33A9上游序列的分析沒有顯示與以前鑒定的序列具有任何同源性，因而表明33A9周圍的整個區(qū)域可能是一個致病島。圖3(orf19544)、圖4(orf19544)、圖5、圖6A和圖6B顯示了33A9的核苷酸序列以及鑒定的ORFs。
此外，對從pBI48粘?？寺～@得的序列進行分析表明，在33A9下游約2kb處存在一個序列，它顯示與tRNA序列有很高的同源性(ORF22626，圖1)。因為對tRNA序列上游序列的分析沒有顯示與數(shù)據(jù)庫中存在的序列有任何同源性，并且因為tRNA序列代表著DNA插入的“熱點”，我們推測tRNA序列代表PA14中存在的致病島插入的右邊界。如圖1所示，代表插入外源DNA片段的區(qū)域大小大約是25kb。假定的致病島上游邊界的確定有助于確定插入DNA片段的準確大小。而且，對33A9區(qū)域的分析還說明，存在超過一種的在蛋白水平上與整合酶和轉座酶同源的序列(分別為ORF21421和ORF8109)。最后，我們的數(shù)據(jù)顯示，33A9位點存在于數(shù)種高致病性的銅綠假單胞菌臨床分離株中，并且不存在于PA01中，后者是一種致病性較低的銅綠假單胞菌菌株。
對從pBI48粘粒獲得的序列數(shù)據(jù)進行的分析還表明，在33A9兩翼存在兩種序列，它們含有參與細胞粘附的識別基元。對分別位于33A9上游和下游的ORF11738(2436 bp)和ORF23228(2565 bp)進行的序列分析表明，在這兩個開放閱讀框中存在RGD基元。RGD三肽序列是一種特征性的真核細胞識別基元，能結合宿主細胞表面的整合素，并且被發(fā)現(xiàn)參與細菌粘附。通過模仿宿主分子，含有這些RGD基元的細菌粘附素能夠在需要啟動細胞-細胞粘附的宿主中產生應答。
對這兩種含RGD的ORFs在33A9和野生型菌株PA14中的表達進行了評價。轉錄水平通過使用一種對應于ORF11738和ORF23228的一個內部區(qū)域的放射標記的DNA探針進行雜交來測定。從突變體33A9中的兩個ORFs獲得的數(shù)據(jù)顯示，與野生型PA14相比轉錄水平降低，這說明ORF11738和ORF23228編碼的基因都受33A9調節(jié)。這些數(shù)據(jù)顯示，33A9是一種起重要作用的多基因調節(jié)子，負責調節(jié)參與細菌粘附到宿主細胞表面的基因的表達。
表3
此外，使用植物和AuSubel等介紹的(篩選適用于防止感染或致病的化合物的方法，分別提交于1995年3月25日，1997年5月7日和1997年11月3日的USSNs 08/411,560,08/852,927，和08/962,750.)線蟲篩選試驗(慢或快致死試驗)，幾種其他的銅綠假單胞菌突變菌株被鑒定為具有較低的毒性。這些研究中所用的慢和快致死試驗在下面進行介紹。
慢致死試驗。在進行慢致死試驗時，將10ul細菌的過夜培養(yǎng)物鋪于NG平板(由NGM瓊脂修改，NGM由Sulston和Hodgkin介紹(In:線蟲新小桿線蟲，W.B.Wood,ed.,Cold Spring Harbor,NY:ColdSpring Harbor Laboratory,188,pp.587-606)(使用0.35％蛋白胨取代0.25％)，并在37℃溫育24小時。在室溫下(23-25℃)放置8-24小時后，在每個平板(直徑3.5cm)中用40-50個雌雄同體的L4新小桿線蟲Bristol株接種，為進行統(tǒng)計學處理，每個試驗進行3-4個重復。平板在25℃溫育，每4-6小時監(jiān)測線蟲死亡的數(shù)量。當用睫毛觸動時不再運動和不能顯示咽泵動作時，線蟲被認為死亡。對于每批試驗的突變體，P14和大腸桿菌OP50用作陽性和陰性對照。任何因固定到平板壁上而死亡的線蟲都在分析時被排除。為測定LT50s，用數(shù)據(jù)進行作圖(被殺死的線蟲的百分數(shù)對與待測菌株作用后的時間(小時))。使用計算機程序SYSTAT5.2.1時，一種曲線形式殺死百分數(shù)=A+(1-A)/)1+exp(B-Gxlog(作用后的小時數(shù)))能與數(shù)據(jù)擬合，其中A表示在OP50對照實驗中死亡的線蟲部分，B和G是為擬合曲線而變化的參數(shù)。一旦B和G被測定，LT50就可用公式LT50=exp(B/G)×(1-2xA)^(1/G)進行計算。
在發(fā)展這種篩選時，我們利用兩個觀察結果。首先，殺死線蟲所需的時間越長，產生的子代就越多。第二，幼蟲早期階段對銅綠假單胞菌的殺傷作用明顯具有較高的抵抗力。這使我們能夠設計方便和非常敏感的試驗，來鑒定在其致病能力中只有輕微破壞的TnphoA突變體。這些減毒突變體在殺死線蟲時的效率較低，存活個體的后代產量能有效地將即使一個微弱的缺陷“放大”成可方便地觀察到的表型。這樣，在含有減毒的PA14::TnphoA突變體的平板上，由開始時接種的雌雄同體，可以獲得成百的線蟲。在用非致病性突變體接種的平板上，5天后可見到上千的線蟲，并且細菌菌苔被完全消耗，而在用野生型菌株接種的平板上，只能發(fā)現(xiàn)沒有或很少的活的線蟲。將在初步篩選中鑒定的假定的非致病性活減毒突變體進行再檢測，并用來進行毒力試驗，來測定新小桿線蟲殺傷的動力學。
快致死試驗?？熘滤涝囼炁c慢致死試驗一樣，可用于鑒定致病微生物的毒力因子。此外，該試驗可用于鑒定能夠抑制致病性或增加機體對病原體抗性的治療物。在優(yōu)選的實施方案中，快致死試驗使用對一種化合物例如毒素如秋水仙素具有增加的穿透性的線蟲株來進行。具有這種增加的穿透性的線蟲的例子包括但不限于在P-糖蛋白如PGP-1、PGP-3或MRP-1中具有突變的動物。這種突變的線蟲在快致死試驗中非常有用，因為由于其膜穿透性增加，它們對毒素的敏感性增加。這個特征使試驗中對毒性化合物的完全敏感和完全抵抗的差別提高。快致死試驗也可按下面的介紹通過提高培養(yǎng)基的滲透摩爾濃度來進行。
這里使用的快致死試驗條件如下將5ul在Kings B中過夜培養(yǎng)的PA14培養(yǎng)物鋪于含有蛋白胨-葡萄糖(PG)(1％Bacto-Peptone、1％NaCl、1％葡萄糖、1.7％Bacto-Agar)的平板(直徑3.5cm)。因為快致死的效率被發(fā)現(xiàn)依賴于滲透摩爾濃度，我們加入0.15M山梨糖醇對PG培養(yǎng)基進行修改。將細菌培養(yǎng)物鋪板后，平板在37℃溫育24小時，然后在室溫放置8-12小時。將15至20只線蟲置于試驗平板，然后將其置于25℃溫育。每個獨立試驗包括3-4個重復。依時間監(jiān)測線蟲的死亡，當線蟲按上面的介紹不能對觸動應答時就被認為死亡。大腸桿菌菌株DH5α在快致死試驗中用作對照。
對這些菌株以及上面鑒定的菌株的分析表明，它們可分為以下幾種不同的類型一些突變體在植物和線蟲中都具有較低的致病性，而其他則是在植物或線蟲中但不是二者中致病性降低。如下細菌突變體被定義為在植物中具有較低致病性，在滲入后(DPI)第4天，在相同的實驗條件下最大平均滴度(來自5個葉樣品)比野生型低兩個標準差。野生型對照是必需的，因為4個DPI后野生型達到的最高水平在各實驗中有數(shù)量級上的差別，這是由植物防御應答上的生長條件中的微小差別造成的。與此類似，如果殺死50％的喂飼的線蟲所需的平均時間(來自3個重復的LT50)比在相同實驗中的野生型PA14低兩個標準差，該突變體就被認為是在線蟲上的致病性降低。
一般來說，在植物中具有降低的致病性的突變菌株包括16G12、25A12、33A9和33C7，在線蟲中具有降低的致病性的突變菌株包括35A9、44B1、1G2、8C12和2A8，在植物和線蟲中都具有降低的致病性的突變菌株包括25F1、41A5、50E12、pho15、12A1、pho23、34B12、34H4、3E8、23A2和36A4。表4和表5(下文)概述了這些突變菌株的致病性表型。對因插入突變而具有降低的致病性的這些菌株進行序列分析。表4和表5中概述的DNA序列分析顯示，新型和已知的基因都能在我們的篩選試驗中鑒定。來自50E12和41C1的序列都顯示與以前介紹的在大腸桿菌中功能未知的開放閱讀框(ORFs)具有很高的同源性。突變體35A9鑒定了一個淋病耐瑟氏球菌(SwissProtP39897)mtrR的同源物。突變體25F1鑒定了一個操縱子，該操縱子編碼3個與微溫著色菌的orfT、MPK和DjlAEC相同的蛋白。來自48D9、35H7和12A1的序列分別對應于lEmA、gacA和1asR基因。在突變體41A5和44B1中被破壞的序列不與GenBank中登記的任何序列具有明顯的同源性。(44B1序列標記只有148bp，并且在PA01數(shù)據(jù)庫中沒有對應于44Bl插入的序列得到鑒定)。因此，這些序列鑒定了其他的毒力因子。從這些實驗獲得的核苷酸序列和氨基酸序列示于圖10、11、12、13、14A、14B、15、16A、16B、17、18A、18B、18C、18D和18E以及圖22、23、24A、24B、24C、24D、24E、25、26、27和28。
我們還對TnphoA突變體41A5、50E12、41C1、35A9、48D9、12A1、44B1和35H7進行了一套標準的生化檢測，來評估是否在已知的對哺乳動物致病性中起重要作用的毒力因子中含有缺陷。這些檢測包括一種對H2O2敏感的標準平板試驗以及對細胞外蛋白酶、彈性蛋白酶、磷脂酶C和綠膿素的標準定量分析。例外的情況如下，大多數(shù)PA14TnphoA突變體與親本PA14菌株沒有生化水平的差異。突變體12A1顯示彈性蛋白酶和蛋白酶活性降低，但過量產生綠膿素。突變體50E12產生比PA14高3倍水平的綠膿素。突變體41A5只有約70％的野生型水平的蛋白酶活性。
使用慢致死試驗鑒定的這些突變體的各自的DNA序列分析和生化分析的詳細介紹在下面各節(jié)中展示。
突變體12A1。12A1中的phoA插入子插入在前面介紹的銅綠假單胞菌PA01的lasR基因的154密碼子處。12A1的表型與其他已知的lasR突變體一樣是多型性的，包括彈性蛋白酶和蛋白酶的產生減少。此外，12A1在穩(wěn)定期產生比親本PA14菌株多2-3倍的綠膿素。而且，表達GFP的lasR突變體(PA14lasR::GFP19-1)不能在線蟲消化道維持其自身，因為在喂飼48小時后在新小桿線蟲的腸道中只能檢查到非常少的熒光。
圖34顯示，當銅綠假單胞菌PA01的lasR基因在組成型的lacZ啟動子的反式控制之下在菌株12A1(pKDT17)中表達時，12A1的線蟲慢致死缺陷表型能夠被完全回復。彈性蛋白酶的產生也被發(fā)現(xiàn)在12A1(pKDT17)中回復到野生型水平，但不過量產生綠膿素。因為不希望綠膿素過量產生表型，我們通過標記轉換，用一個慶大霉素盒插入PA14基因組破壞lasR基因，構建了一種新的lasR突變體---lasR::Gm。該lasR::Gm突變體與12A1一樣沒有致病性(圖34A)，但產生正常水平的綠膿素，這說明12A1可能攜帶第二個突變，后一突變導致綠膿素產生的上調。這個結果還說明，在穩(wěn)定期中綠膿素產生的上調與致病性減弱表型無關。
突變體pho15。pho15中的dsbA基因破壞被發(fā)現(xiàn)對其非致病性表型負責。圖24B顯示了PA14pho15的核苷酸序列(SEQ ID NO:166)和推測的氨基酸序列(SEQ ID NO:167).pho15在新小桿線蟲中致病性缺陷表型也被發(fā)現(xiàn)能在pho15背景中被反式的組成型表達的大腸桿菌dsbAEc基因或PA14dsbAPa完全回復(圖34B)。為進行這些實驗，大腸桿菌dsbAEc基因按下面的方法克隆到pUC18中。將PCR擴增的大腸桿菌dsbA基因克隆到pBAD18的KpnⅠ和XbaⅠ位點構建成pCH3。這使大腸桿菌dsbA基因置于大腸桿菌阿拉伯糖啟動子的控制之下。將含有大腸桿菌dsbA基因的700bp的KpnⅠ/SphⅠ片段克隆到pUC18的KpnⅠ/SphⅠ位點，產生pEcdsbA，使大腸桿菌dsbA基因置于組成型大腸桿菌lacZ啟動子的控制之下。pEcdsbA接著被用來轉化PA14和pho15，分別構建菌株PA14(pEcdsbA)和pho15(pEcdsbA)。
PA14dsbAPa按下述方法構建。根據(jù)PA01的dsbA序列(GenBank登記號U84726)，引物TMW8(5’-GCACTGATCGCTGCGTAGCACGGC-3’；SEQID NO:177)和TMW9(5’-TGACGTAGCCGGAACGCAGGCTGC-3’；SEQ ID NO:178)被用來擴增一個1126bp的片段，該片段含有來自PA14基因組DNA的dsbA基因加上dsbA基因翻譯起始位點上游的176bp.使用TA克隆試劑盒(Invitrogen)，該片段被克隆到pCR2.1載體中，產生pCRdsbA。含有dsbA的SacⅠ/XbaⅠ片段被克隆到SacⅠ/XbaⅠ消化的pUCP18中，構建成pPAdsbA，使dsbA的轉錄置于組成型lacZ啟動子的控制之下。菌株pho15(PadsbA)通過用pPAdsbAPa轉化pho15來構建。
突變體25F1。在25F1中，TnphoA被發(fā)現(xiàn)插入在一個假定基因(orf338)的100密碼子處，該基因編碼一個338氨基酸的蛋白，它是一個推測的3基因操縱子的第一個基因。推測的下游基因(orf224和orf252)分別編碼224和252個氨基酸的蛋白。GAP分析顯示，orf338與微溫著色菌的orfT有28.5％的同一性(37.7％的相似性)(GenBank登記號U58313)。ORF224的BLASTP與來自真核生物、古細菌、藍細菌和分枝菌屬的甘露糖-I-磷酸鳥苷酸轉移酶(MPG；EC2.7.7.13)相同，但不與蛋白細菌---銅綠假單胞菌的近親相同。還不清楚ORF224是否是一種有功能的MGP，因為所有已知的MPGs都由359-388個氨基酸殘基組成，而ORF224只由224個氨基酸殘基組成。ORF252與大腸桿菌DjlAEc同源。DjlAEc被認為在多種膜蛋白的正確裝配、活性和/或維持中起重要作用，包括兩組分的組氨酸激酶信號傳導系統(tǒng)。
為檢測orf338是否是對在線蟲中致病性降低負責的基因，我們比較了單獨攜帶orf338的菌株---25F1(pORF338)與野生型PA14和單獨攜帶載體的25F1的殺傷動力學。25F1(pORF338)按下列方法構建。
使用引物F2327(5’-CGAGGAATCCAGTCGAGGTG-3’；SEQ ID NO:179)和R4180(5’-GCAAGATGCAGCCGAGAGTAG-3’；SEQ ID NO:180)從PA14的基因組DNA中擴增含有482 bp的上游啟動子、整個的orf338和一個剪短的orf224的1.8kb的PCR片段。將產物克隆到載體pCR2.1(TA Cloning,Invitrogen)中，構建質粒pMT403C-R。將來自pMT403C-R的含有PCR產物的SacⅠ/XbaⅠ片段克隆到pUCP18的SacⅠ/XbaⅠ位點，構建pORF338，使off338置于其天然啟動子的控制之下。25F1用pORF338轉化，產生菌株25F1(pORF338)。
此外，一個含有整個操縱子(orf338、orf224和djlApa)的菌株按如下方法構建。使用引物RIF3115(5’-GTCAGAATTCTCAGCTTGACGTTGTTGCCC-3’；SEQ ID NO:181)和RIR6757(5’-GTCAGAATTCGACTTCTATTACCGCGACGCC-3’；SEQ ID NO:182)，采用PCR策略擴增一個含有orf338、orf224和djlAPa及其上游轉錄序列的3.6kb的基因組片段。引物中存在EcoRⅠ位點(劃線)，但在基因組序列中沒有。對PCR產物進行雙鏈測序，以確定菌株PA14中的orf338、orf224和djlAPa的序列。將PCR EcoRⅠ消化產物克隆到pUCP18的EcoRⅠ位點，并通過限制消化確定插入方向。在質粒p3-ORFs中，orf338、orf224和djlAPa在其天然啟動子的控制之下，然后用p3-ORFs轉化25F1，產生菌株25F1(p3-ORFs)。
如圖34C中所示，菌株25F1(pORF338)不能完全互補慢致死表型。而含有完整操縱子(orf338、orf224和djlAPa)的菌株25F1(p3-ORFs)也只顯示突變表型的部分互補。這個結果說明，TnphoA對致病性表型負責，部分互補可能是基因劑量的結果。菌株25F1(p3-ORFs)與菌株25F1(pORF338)相比達到的較高死亡進一步說明，下游基因---orf224和/或djlAPa也可能在PA14的毒性中起作用。
圖24E顯示了編碼ORFT(SEQ DI NO:174)、ORFU(SEQ ID NO:175)和DjlAPa(SEQ ID NO:176)的PA1425F1的核苷酸序列(SEQID NO:173)。
突變體50E12。50E12中的TnphoA插入子插入在一個推測的759氨基酸蛋白的39密碼子位置，該蛋白與大腸桿菌的PtsPEc蛋白43％相同(54％相似)。根據(jù)序列分析，推測ptsPEc編碼酶INtr,INtr是一種738氨基酸的蛋白，它含有一個N末端的Nif-A結構域和一個C末端的酶Ⅰ結構域；后者在磷酸烯醇丙酮酸依賴的磷酸轉移酶系統(tǒng)中起作用。據(jù)認為Nif-A結構域起信號傳導功能，或者直接感應小分子信號，或者從NifL樣蛋白接受信號。兩種機制都可以調節(jié)酶Ⅰ結構域的催化活性，后者又被認為能磷酸化NPr(氮相關HPr)，并因而調節(jié)RpoN依賴的操縱子的轉錄。PA14 ptsPpa同源物緊接著的上游是開放閱讀框(orf159)，推測它編碼一個159氨基酸的蛋白，并且似乎與ptsPPa共轉錄。圖24C顯示了編碼YgdPPa(SEQ ID NO:169)和PtsPPa(SEQ ID NO:170)的PA14 50E12的核苷酸序列(SEQ ID NO:168)。ORF159與YgdP蛋白有62.3-64.8％的相同，YgdP蛋白是在流感嗜血菌(GenBank登記號Q57045)和大腸桿菌(GenBank登記號Q46930)中發(fā)現(xiàn)的功能未知的蛋白。這些蛋白與幽門螺桿菌和桿狀巴爾通氏體中的入侵蛋白A密切相關。桿狀巴爾通氏體的入侵蛋白A(SwissProt登記號P35640)由ailA編碼，當ailA與ailB基因相鄰存在但獨立轉錄時，能夠使大腸桿菌具有侵入人紅細胞的能力。
對于50E12的互補，檢測了兩個菌株50E12(pMT206-lac)和50E12(pMT206-nat)。菌株50E12(pMT206-lac)攜帶質粒pMT206-lac，其中orf159和ptsPPa的轉錄在組成型lacZ啟動子的控制之下。對于菌株50E12(pMT206-nat),orf159和ptsPPa的轉錄只在它們的天然啟動子控制之下。這些菌株都按下列方法構建。
從銅綠假單胞菌PA14的基因組DNA中使用如下引物擴增一個在其兩端均有EcoRI位點的4.3kb的PCR片段RIF1698(5’-GTCAGAATTCGATGTTCCAGTCCCAGATCCC-3’；SEQ ID NO:183)和RIR6002(5’-GTCAGAATTCCAGTAGACCACCGCCGAGAG-3’；SEQ ID NO:184)。將該片段克隆到pUCP18的EcoRⅠ位點，產生pMT206-lac和pMT206-nat，它們用限制消化來證實。在pMT206-lac中，orf159和ptsPPa的轉錄在組成型lacZ啟動子和其天然啟動子的控制之下。在pMT206-nat中，orf159和ptsPPa的轉錄只在它們的天然啟動子控制之下。
如圖34D所示，兩種菌株都部分互補突變表型，這些互補菌株殺死100％線蟲所需的時間比野生型菌株長。在鼠燒傷試驗中觀察到了部分互補用5×105的來自菌株50E12(pMT206-nat)的細菌感染后，小鼠的死亡率為39％，當分別用野生型菌株和50E12感染時，相比較的死亡率為100％和0％。這些結果表明，假定的orf159-ptsPPa操縱子參與銅綠假單胞菌在線蟲和小鼠中的致病性。
突變體35A9。在35A9中，TnphoA插入子位于一個假定的210氨基酸蛋白中(由orf210編碼)，該蛋白與淋病耐瑟氏球菌的MtrRNg蛋白最為密切相關(31.5％相同)，后者屬于含有細菌轉錄調節(jié)蛋白的螺旋-轉角-螺旋的TetR家族。ORF210與三個基因相鄰但分別轉錄，這三個基因與銅綠假單胞菌的能量依賴的流出(EDE)系統(tǒng)的組分同源。對來自PA01的序列進行分析顯示，這四個基因一起組成了銅綠假單胞菌的一種新的能量依賴的流出(EDE)系統(tǒng)。以前介紹的銅綠假單胞菌的其他EDE系統(tǒng)是mexR、mexA-mexB-oprK系統(tǒng)、nfxB、mexC-mexD-oprJ系統(tǒng)和nfxC、mexE-mexF-oprN系統(tǒng)。圖24D顯示了編碼mtrRpa(SEQ ID NO:172)的PA14 35A9的核苷酸序列(SEQ IDNO:171)。
突變體37H7和1D7。對來自突變體37H7的IPCR產物進行分析顯示，在214個氨基酸的GacA蛋白的188密碼子處有一個TnphoA插入。DNA印跡分析顯示，1D7也在gacA基因中含有一個插入。
突變體48D9。TnphoA插入在925個氨基酸的LemA同源物的491密碼子和492密碼子之間，LemA同源物是傳感蛋白激酶，屬于一個細菌雙組分調節(jié)蛋白家族。丁香假單胞菌中LemA的識別應答調節(jié)蛋白是GacA，并且GacA+LemA已經顯示能影響多種毒力因子的表達。
突變體41C1。在突變體41C1中，TnphoA插入在假定的大腸桿菌膜內在蛋白的AefA同源物(SwissPort P77338)中。它是30-40kDUPF0003蛋白家族(PROSITE PDOC00959)的一個成員。除了大腸桿菌，它還存在于集胞藍細菌菌株PCC6803和詹氏甲烷球菌中。
此外，菌株pho34B12、3E8、8C12、1G2、35A9和23A2也被發(fā)現(xiàn)具有吩嗪減少的突變表型。而且，pho34B12、3E8、8C12和1G2突變體被發(fā)現(xiàn)色素的產生減少。另外一個突變體---6A6也被鑒定為色素減少。銅綠假單胞菌菌株的特征性顏色已經被歸因于被總稱為吩嗪的一組三環(huán)的次級代謝物，其中分析最多的是藍綠色素---綠膿素(1-羥基-5-甲基-吩嗪)。為檢測細菌突變體中的色素減少是否至少部分因為綠膿素的減少，對野生型PA14以及用快致死試驗獲得的所有突變體中的這種色素的水平進行定量。該分析的結果顯示，具有色素減少表型的pho34B12、3E8、8C12、1G2和6A6突變體的綠膿素產生也減少，其水平在野生型菌株的10至50％之間。其他突變體---13C9、23A2和36A4具有與野生型菌株相當?shù)木G膿素水平。
此外，3E8中被TnphoA突變破壞的序列被發(fā)現(xiàn)能預測一種蛋白，該蛋白與來自熒光假單胞菌的phzB基因同源，它是參與次級代謝產物---吩嗪產生的一個操縱子的部分(GenBank登記號L48616)。phzB基因在致金色假單胞菌中也有一個同源物，被稱為phzY(GenBank登記號AF007801)。使用序列標記，在銅綠假單胞菌數(shù)據(jù)庫中鑒定了一個含有該區(qū)域的粘粒(1G2503)，該粘粒同時含有phzA和phzB基因以及其他被認為在吩嗪生物合成中起作用的基因---pcnC和D基因(GenBank登記號AF005404)。檢測這些菌株中的四個---34B12、3E8、23A12和35A9在小鼠燒傷試驗中的致病性。令人驚奇的是，這些實驗顯示，吩嗪缺陷的菌株具有降低的致病性，這說明被TnphoA插入破壞的基因是哺乳動物毒力因子。這些菌株的核苷酸序列和推導的氨基酸序列包括序列標記示于圖7-9、13、14A、14B、15、16A、16B、17、18A、18B、18C、18D、18E、22、24A、24B、24C、24D、24E和33。此外，圖25和26分別顯示了銅綠假單胞菌的phnA和phnB的核苷酸序列和推導的PHNA的氨基酸序列。
對每種使用快致死試驗(上面介紹)鑒定的突變體進行DNA序列和生化分析的詳細介紹在下面各節(jié)中展示。
突變體36A4、23A2和13C9。從所有三個能夠產生野生型水平的綠膿素的突變體中獲得的DNA序列標記都與假單胞菌中已知的基因具有同源性。突變體36A4在與hrpM同源的一個基因中含有TnphoA插入，hrpM以前被鑒定為在植物病原體丁香假單胞菌中控制致病性的一個位點(Mills和Mukhopadhyay,In假單胞菌生物轉化、致病性和進化技術，S.Silver,A.M.Chakrabarty,B.Iglewiski和S.Kaplan,eds.美國微生物協(xié)會,1990,pp.47-57,Mukhopadhyay等，J.Bacteriol.170:5479-5488,1988)；GenBank登記號140793)。該位點還與大腸桿菌mdoH基因具有同源性，mdoH基因編碼一種參與周質葡聚糖生物合成的一種酶(Loubens等，Mol.Microbiol.10:329-340,1993；GenBank登記號X64197)。在突變體23A2中，TnphoA插入子插入在以前在銅綠假單胞菌PA01菌株中被鑒定為mexA的基因中(Poole等，Mol.Microbiol.10:529-544,1993；GenBank登記號L11616)。mexA的產物被推測是一種細胞質-膜-相關的脂蛋白，可能與包含在同一操縱子中的其他兩個基因的產物---mexB和oprM一起作用，作為一種具有廣譜底物特異性的非ATP酶的流出泵(Li等，Antimicrob.Agents.Chemother.39:1948-1953,1995)。第三個突變體13C9在色素產生上是野生型，對它兩翼的DNA進行序列分析顯示，它對應于另一個銅綠假單胞菌菌株PA01中以前已知的基因---orp(GenBank登記號U54794),Orp或磷脂酶C的滲透壓保護劑依賴的調節(jié)蛋白被鑒定為一種控制致病因子PlcH表達的因子，PlcH是銅綠假單胞菌產生的磷脂酶C的兩種異構體中的一種(Sage等，Mol.Microbiol.23:43-56,1997)。
突變體1G2和8C12。對兩種無色素的突變體1G2和8C12進行的分子分析顯示，它們在新的基因中含有插入，雖然1G2插入兩翼的DNA含有組氨酸傳感蛋白激酶的一個特征性基元。該基因在PA01基因組數(shù)據(jù)庫中不存在。盡管8C12序列標記在PA01數(shù)據(jù)庫中鑒定到了同源基因，但在此基因中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的基元。
突變體3E8和6A6。兩個突變體---3E8和6A6在相同的基因中含有TnphoA插入，這個基因與以前在熒光假單胞菌菌株2-79中鑒定的phzB基因(GenBank登記號AF007801)和在致金色假單胞菌中鑒定的phzY(GenBank登記號L48616)具有同源性。這兩種突變體在完全相同的位置含有TnphoA插入，但它們是獨立的分離株，因為它們獲自兩個不同的突變文庫。雖然phzB和phzY不含一致的序列基元，但它們存在于已知在熒光假單胞菌和致金色假單胞菌中調節(jié)吩嗪-1-羧化酶(PCA)產生的操縱子中(Mavrode等，J.Bacteriol.180:2541-2548,1998)。
突變體pho34A12。最后一個無色素突變體pho34B12中TnphoA插入子兩翼的DNA如前所述，以前已被克隆并且顯示是一個新的位點。有趣的是，該插入緊靠著在銅綠假單胞菌PA01菌株中鑒定的吩嗪生物合成基因---phnA和phnB的下游(Essar等，J.Bacteriol.172:884-900,1990)。
吩嗪是快速殺死新小桿線蟲所必需快致死篩選中產色素和不產色素突變體的分離說明，快致死過程涉及一個以上的因子。但是，對3E8和6A6突變體(在已知調節(jié)吩嗪產生的操縱子中含有插入)的分子分析強烈地說明，吩嗪代表一類介導快致死的毒素。為直接驗證這個假說，我們制備了一個另外的突變體---ΔphnA phnB，并按下述方法進行研究。
吩嗪生物合成基因phnA和phnB(Essar等，J.Bacteriol.172:884-900,1990)在PA14中位于前面分析的pho34812 TnphoA插入的上游(GenBank登記號AF031571)。將對應于該區(qū)域的野生型序列的一個3.7kb的EcoRⅠ片段(來自質粒pLGR34)亞克隆到pBluescript SK/+中，產生Bs34B12。該質粒含有944bp的phnA(全長為1591bp)、整個phnB(600bp)基因和1.7kb的下游序列。缺失的605bp的phnA和405bp上游使用如下寡核苷酸引物用PCR從PA14基因組DNA中擴增PHNA3(5’-GGTCTAGACGAACTGAGCGAGGAG-3’；SEQ ID NO:185)和PHNA2(5’-GCCTGCAGGCGTTCTACCTG-3’；SEQ ID NO:186)。引物以以前從銅綠假單胞菌菌株PA01中克隆的phnA和phnB的序列為基礎(Essar等，J.Bacteriol.172:884-900,1990,GenBank登記號M33811)。將1010bp的擴增序列亞克隆到pBs34B13的PstⅠ位點，產生結構物pBs34B12phnA。通過PCR使用引物PHNDEL1(5’-GGCTGCAGTGATTGACTGAGCGTCTGCTGGAGAACG-3’；SEQ ID NO:187)和PHNDEL2(5’-GGGAAGCTTCGTCTAGAATCACGTGAACATGTTCC-3’:SEQ IDNO:188)擴增一個1kb的片段，用此片段取代2.6kb的上述基因的野生型序列，在phnA、phnB中產生一個框內刪除，產生質粒pBs34b12phndel。將含有phnAphnB框內刪除的1.8kb的XbaⅠ片段亞克隆到陽性蔗糖選擇自殺載體pCVD442中(Donnenberg和Kaper,Infect.Immun.59:4310-4317,1991)。所產生的結構物---pCVD34B12phndel被用來將破壞的phnA、phnB基因通過同源重組引入野生型PA14基因組中，產生突變體PA14ΔphnAphnB。使用來自親本PA14和衍生的PA14ΔphnAphnB菌株的DNA進行DNA限制酶切分析和DNA印跡分析，以驗證突變體含有所需的刪除。
雖然對在銅綠假單胞菌和相關的假單胞菌中催化吩嗪形成的酶的本質知道的很少，但從分枝酸轉變?yōu)猷彴被郊姿岜徽J為是該途徑的一個關鍵步驟(圖35A)。在銅綠假單胞菌PA01中，該步驟很可能由phnA和phnB基因編碼的鄰氨基苯甲酸合成酶催化，因為這些基因中的突變導致吩嗪綠膿素的產量降低(Essar等，J.Bacteriol.172:884-900,1990)。從PA14中克隆了phnA和phnB基因，并且制備了一個在這些基因中含有一個1602bp刪除的ΔphnAphnB突變體(圖35B)。重要的是，該突變被設計為非極性的，并因而不會影響顯示直接位于phnA和phnB下游的兩個ORFs(上文)。對ΔphnAphnB突變體中的綠膿素的測量顯示，它只產生10％的野生型水平，這證明phnA和phnB在菌株PA14中和在PA01中一樣，參與綠膿素的產生。使用ΔphnAphnB進行的試驗表明，該菌株的快致死能力被嚴重降低。如圖35C所示，在接觸ΔphnAphnB 3小時后，少于5％的線蟲死亡，與此相對，接觸野生型菌株后，幾乎100％的線蟲死亡。ΔphnAphnB菌株的行為方式類似于另一種吩嗪突變體3E8，它在此實驗中用作減毒突變體對照。這些結果證明，吩嗪為新小桿線蟲快致死所必需。
為發(fā)現(xiàn)介導快致死的細菌因子是否與在其他宿主中的致病性相關，我們檢測了快致死突變體在擬南芥葉滲入模型以及小鼠全厚度皮膚燒傷模型中的毒性(上文)。我們檢測了5個快致死突變體在擬南芥葉上在4天內的生長，作為它們的致病性的定量檢測，并且在小鼠全厚度皮膚燒傷模型中也進行檢測。如表4和5所示，2個吩嗪突變體3E8和8C12在擬南芥葉上在感染后第4天的最大生長水平明顯較低。在小鼠模型中，這兩個突變體導致比野生型菌株明顯較低的死亡率，其P＜0.05，使用的接種量為5×105細胞。第三個吩嗪突變體1G2在植物和小鼠模型中都與野生型菌株沒有明顯的差別。
hrpM突變體36A4和mexA突變體23A2在擬南芥上的生長都被嚴重削弱，這表明在此模型中致病性有嚴重缺陷。在小鼠模型中，突變體36A4得到了一個令人驚奇的結果，在檢測的劑量上不導致死亡。相反，mexA突變體23A2僅受到輕微影響。這些結果證明，快致死篩選在鑒定植物和小鼠致病性所需的基因時非常有效，并且更進一步首次提供了體內的證明，即吩嗪為在這兩種宿主中的致病性所必需。
我們還注意到，我們已經鑒定了phz操縱子的一個調節(jié)子---phzR。圖18E顯示了PA14 phzR的核苷酸序列(SEQ ID NO:164)和推導的部分氨基酸序列(SEQ ID NO:165)。
吩嗪和致病性使快致死能力降低的PA14突變也影響色素合成。我們的分子分析表明，色素產生和致病性之間的關系不是簡單地因為調節(jié)因子對色素和毒素產生的協(xié)同調節(jié)。相反，我們發(fā)現(xiàn)，吩嗪生物合成基因中突變能降低毒力，這強烈地暗示吩嗪在快致死過程中是毒素。吩嗪是三環(huán)的色素化合物，它賦予假單胞菌特征性顏色(Turner和Messenger,Adv.Microb.Physiol.27:211-273)，它被認為是提高有機體在競爭環(huán)境中生存能力的次級代謝產物(Maplestone等，Gene 115:151-157,1992)。雖然PA14產生的吩嗪的所有組分還不清楚，但銅綠假單胞菌PA01至少產生6種不同的吩嗪，包括已經研究得很清楚的藍綠色素---綠膿素。吩嗪包括綠膿素已被證明對多種細菌、真菌和原生動物具有抗生素作用，這可歸功于它們的氧化還原活性特性。在其高反應性的還原狀態(tài)時，據(jù)介紹吩嗪能在不同的還原試劑或分子氧存在時進行氧化還原循環(huán)，導致超氧化物和過氧化氫形成(Hassan和Fridovich,J.Bacteriol.141:1556-163,1980)。在體外，這些中等細胞毒性的氧自由基可以通過鐵催化劑轉變成高細胞毒性的羥基(Britigan等，J.Clin.Invest.90:2187-2196,1992)。吩嗪導致的活性氧成分的形成還被認為是在體外真核細胞上觀察到的細胞毒作用的原因。這些作用包括抑制哺乳動物細胞呼吸、破壞纖毛搏動、以及免疫調節(jié)作用如刺激炎癥應答、抑制淋巴細胞增殖和改變T淋巴細胞對抗原的應答。
由于導致銅綠假單胞菌中吩嗪產生的生物合成途徑知道的很少，這使得鑒定在吩嗪產生途徑中被PA14突變缺陷阻斷的步驟非常困難。但是，在兩個突變體3E8和6A6中，轉座子插入破壞了一個與phzB同源的基因，phzB以前已被分析為在相關的假單胞菌---熒光假單胞菌和致金色假單胞菌中參與吩嗪產生。在熒光假單胞菌中，phzB顯示是參與吩嗪-1-羧酸產生的7基因操縱子(phzA-G)中的一個部分。對熒光假單胞菌和致金色假單胞菌中該操縱子進行比較顯示，二者具有很高的同源性，這說明導致吩嗪產生的途徑在產熒光的假單胞菌中是保守的(Mavrodi等，J.Bacteriol.180:2541-2548,1998)。雖然在銅綠假單胞菌菌株PA14中，phzA和phzB基因兩翼的DNA只進行了部分測序，我們的分析說明，這個區(qū)域與熒光假單胞菌phzA-F操縱子共有一個保守結構。PA14和熒光假單胞菌的phzA和phzB基因的推導的翻譯產物分別具有68和74％的同一性。此外，在銅綠假單胞菌菌株PA01中存在一個含有phzA-F樣基因的區(qū)域，這些基因的推測的翻譯產物顯示與其熒光假單胞菌同源物具有69至85％的同一性(GenBank登記號AF005404)。根據(jù)由phz操縱子在熒光假單胞菌和致金色假單胞菌中的作用進行的推斷，快致死缺陷型的PA14 phzB突變體的分離強烈地說明，吩嗪參與此過程。吩嗪包括綠膿素是快致死的介導因子之一，這一假說通過非極性破壞基因phnA和phnB進行了進一步的檢驗，這兩種基因編碼一種鄰氨基苯甲酸合成酶的兩個亞基，鄰氨基苯甲酸合成酶以前已經顯示在銅綠假單胞菌PA01中特異性參與吩嗪合成(Essar等，J.Bacteriol.172:884-900,1990)。與在吩嗪生物合成中的作用相一致，在PA14中刪除phnA和phnB基因嚴重降低了綠膿素的產生。而且，ΔphnAphnB突變體在快致死中有缺陷，這證明吩嗪在此過程中的重要作用。
吩嗪在致病性中的作用也在擬南芥和小鼠中進行了檢測。兩個在phzB基因含有插入的獨立突變體3E8和6A6在擬南芥葉滲入模型以及小鼠全厚度皮膚燒傷模型中致病性都明顯降低(表4和5)，這說明吩嗪是多宿主致病因子。有趣的是，我們注意到，在此研究和我們以前的研究中鑒定的其他多宿主致病因子，多數(shù)可能參與幾種其他毒力因子的產生，并且不是直接與宿主作用的效應蛋白或分子(上文介紹)。這樣，吩嗪代表了我們已經鑒別的僅知的一類多宿主致病性效應分子。這些發(fā)現(xiàn)也非常有意義，因為盡管對吩嗪已進行廣泛的體外分析，但它們產生的生理意義和它們在銅綠假單胞菌感染中的作用仍然受到爭論，在本研究之前，它們的作用沒有體內證明。
快致死是多因子的對能產生野生型水平的色素的快致死突變體進行的分析顯示，雖然吩嗪是快致死的必需介導物質，但還有其他因子參與此過程。對這樣一種突變體23A2進行的分子分析表明，轉座子插入到以前在銅綠假單胞菌菌株PA01中被鑒定為MexA的基因中，該基因是3基因操縱子MexA、B、OprM的一個部分(Poole等，Mol.Microbiol.10:529-544,1993)。這些基因的產物定位于細胞質(MexA、MexB)和外膜(OprM)，在那里，它們被推測以一種非ATP酶廣譜特異性的流出泵的形式起作用(Li等，Antimicrob.Agents Chemother.39:1948-1953,1995)。最初被鑒定是因為它在銅綠假單胞菌的多藥物抗性過程中起作用，該泵被認為在次級代謝產物的輸出中起一種通用的作用，雖然它的天然底物仍不知道(Poole,Antimicrob.AgentsChemother.34:453-456,1994)。快致死是一個由擴散的毒素介導的過程，mexA突變體在快致死中的缺陷很可能是因為參與該過程的一種或多種因子的外排的缺少。因為mexA突變體是產色的，吩嗪不可能是泵的底物。除了在快致死中有缺陷，mexA突變體在小鼠模型中的致病性輕微降低，在擬南芥葉滲入模型中致病性嚴重減弱。雖然特異性的毒力因子的外排缺乏可以解釋這些缺陷，另外一個模型是，mexA突變體細菌不能保護其自身抵抗應答于細菌感染而產生的宿主防御因子。這樣一種保護功能已在sap基因中得到證明，sap基因編碼與ATP結合盒(ABC)轉運子有關的蛋白，在人病原體鼠傷寒沙門氏菌以及植物病原體菊歐文氏菌中介導對宿主的抗微生物肽的抗性(Taylor,Plant Cell 10:873-875,1998)。
篩選中所獲得的第二個突變體---36A4，在一個與大腸桿菌MdoH同源的基因中含有一個轉座子插入，MdoH是MdoGH操縱子的一個部分。在大腸桿菌中，該操縱子的產物參與膜衍生的寡糖(MDO)或線形的周質葡聚糖的合成(Loubens等，Mol.Microbiol.10:329-340,1993)。在植物病原體丁香假單胞菌丁香致病變種中存在一個相似的位點，稱為hrpM(Mukhopadhyay等，J.Bacteriol.170:5479-5488，1988)，最初被鑒定是因為該位點中的突變造成在宿主植物上的疾病癥狀的發(fā)展以及在非宿主植物中的超敏應答被消除(Anderson和Mills,Phytopath.75:104-108,1985)。盡管對它們的功能了解的很少，周質葡聚糖已在廣泛的革蘭氏陰性菌中被發(fā)現(xiàn)，并且各不相同。在丁香假單胞菌中除了是基本的毒力因子外，其他的功能包括適應高滲透壓環(huán)境和細胞信號傳導，后者導致根瘤菌和農桿菌對真核宿主的識別(Kennedy,In大腸桿菌和沙門氏菌，F(xiàn).C.Neidardt ed,美國微生物協(xié)會出版，Washington,D.C.,pp1064-1071,1996)。但是，盡管在幾種動物病原體如沙門氏菌和克雷伯氏菌的周質中存在，直到本研究顯示在mdoH樣位點中帶有突變的銅綠假單胞菌在小鼠模型中致病性嚴重降低之前，周質葡聚糖還沒有被顯示在動物宿主感染中起作用。
表4銅綠假單胞菌菌株UCBPP-PA14突變體在不同宿主的致病性概述
bCFU/cm2，用103細菌接種4天后單位葉面積上的細菌數(shù)目4至5個樣品的平均值。當平均值來自4-5個樣品時，突變體被認為是致病性較低。當平均CFU/cm2葉面積上的細菌數(shù)目比在同樣實驗條件下的野生型低2個標準差時，突變體被認為是致病性較低。
c如果殺死50％的用其喂飼的線蟲所需的平均時間(來自三個重復的LT50)比相同實驗條件下的親本UCBPP-PA14的LT50少2個標準差，該突變體被認為是在線蟲中的致病性減弱(-)；有關LT50的計算，見材料與方法。
d6周齡的雄性ARK/J近交系小鼠(來自Jackson Laboratories)，重量在20至30mg之間，按Stevens等，J.of Burn Care and Rehabil.15:232-235,1994的介紹用5×105細胞進行注射。每天監(jiān)測因敗血癥而死亡的動物數(shù)目，共10天。
e兩個其他的獨立分離的gacA突變體是1D7(rpn9)和33D11(rpn10)。突變體rpn9在小鼠中進行了檢測，顯示50％的死亡率。
f只在線蟲中檢測。
g吩嗪缺陷的突變體。
h在快致死中缺陷的突變體，不影響慢致死dst*=下游表5PA14快致死突變體在植物和小鼠中的致病性
aCFU/cm2，用103細菌接種5天后單位葉面積上的細菌數(shù)目。數(shù)值代表4至5個樣品的平均值。當細菌數(shù)目的平均值比在同樣實驗條件下的野生型低2個標準差時，突變體就被認為是致病性較低。
b6周齡的雄性ARK/J近交系小鼠(來自Jackson Laboratories)，重量在20至30mg之間，用5×105細胞進行注射。(n)是接受注射小鼠的總數(shù)。每天監(jiān)測因敗血癥而死亡的小鼠數(shù)目，共7天。
c3E8和6A6是獨立制備的突變體，它們在完全相同的位點上含有一個TnphoA插入。報告的數(shù)目是用3E8獲得的。用6A6獲得了相似的結果(數(shù)據(jù)未顯示)。
分離另外的毒力基因根據(jù)這里介紹的核苷酸和氨基酸序列，使用本領域熟知的標準策略和技術，就可以分離另外的毒力因子的編碼序列。任何致病細胞都可以用作分子克隆這樣一種毒力基因的核酸來源，當基因編碼一個顯示與致病性有關的結構、特性或活性的蛋白時，這些序列就可被鑒定。
在這種分離技術的一個特殊實施例中，與核酸雜交篩選的傳統(tǒng)篩選技術一起，這里介紹的任何一種核苷酸序列都可以使用。這種雜交技術和篩選方法對本領域的技術人員來說是熟知的，并且在諸如Benton和Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:3961,1975)；Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,1997)；Berger和Kimmel(上文)；以及Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York中有介紹。在一個特殊實施例中，33A9序列(本文所述)的全部或部分可用作一種探針，來在一個重組植物DNA文庫中篩選與33A9基因序列相同的基因(圖5和6A-B)。雜交序列通過空斑或菌落雜交按照標準的方法進行檢測。
另外，使用33A9多肽的全部或部分氨基酸序列，可以方便地設計33A9特異性的寡核苷酸探針，包括簡并寡核苷酸探針(即針對一種給定氨基酸序列的全部可能的編碼序列的混合物)。這些寡核苷酸可以根據(jù)兩條DNA鏈中任意一條的序列和33A9蛋白的33A9序列的任何合適的部分(圖5和圖6A-B；分別為SEQ ID NO:102和103)。在諸如Ausubel等(上文)和Berger和Kimmel，分子克隆技術指導，1987,Academic Press,New York中提供了設計和制備這種探針的一般方法。這些寡核苷酸可用于分離33A9基因，既可以根據(jù)它們能與33A9互補序列雜交的能力將它們用作探針，也可以用作引物而用于各種擴增技術，例如聚合酶鏈反應(PCR)克隆策略。如果需要，可以使用不同的、可檢測標記的寡核苷酸探針的組合來對一個重組DNA文庫進行篩選。這種文庫可按照本領域熟知的方法進行制備，例如Ausubel等介紹的方法，或從商業(yè)途徑獲得。
如上文所討論的，序列特異的寡核苷酸也可以被用作引物而用于擴增克隆策略，例如PCR。PCR方法在本領域是熟知的，并在諸如PCR技術，Erlich,ed.Stockton Press,London,1989；PCR方法方法和應用指南，Innis等，eds.,Academic Press,Inc.,New York,1990；以及AuSubel等(上文)中有介紹。也可以選擇性地將引物設計來允許將擴增產物克隆到一種合適的載體中，例如在擴增片段的5’和3’末端包含合適的限制酶切位點(如這里所介紹的)。如果需要，核苷酸序列可以使用PCR“RACE”技術或cDNA末端的快速擴增(見諸如Innis等(上文))來分離。通過這種方法，根據(jù)一種所需序列設計的寡核苷酸引物在3’和5’方向定向，并被用來產生重疊的PGR片段。這些重疊的3’-和5’-末端RACE產物組合起來，產生一個完整的全長cDNA。該方法在Innis等(上文)和Frohman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8998,1988中介紹。
部分的毒力序列例如序列標記也可用作雜交探針來鑒定全長的序列以及在數(shù)據(jù)庫中篩選以前未鑒定的相關毒力基因。例如36A4、25A12和33C7的序列被擴展為分別包含毗連群2507、1126和1344的序列。
證明一種序列與致病性多肽相關可以通過多種傳統(tǒng)的方法來完成，這些方法包括但不限于功能互補試驗和基因及其表達產物的序列比較。此外，基因產物的活性可按照這里介紹的任何一種技術來進行評估，例如其編碼產物的功能或免疫特性。
一旦一種合適的序列被鑒定，就按照標準技術將其克隆，并可用于諸如篩選能降低病原體毒力的化合物。
多肽表達一般來說，本發(fā)明的多肽可通過如下方法來產生，即用位于合適表達載體中的多肽編碼核酸分子或其片段的全部或部分轉化一種合適的宿主細胞。
分子生物學領域的技術人員應當理解，多種表達系統(tǒng)中的任何一種都可用來提供重組蛋白。使用精確的宿主細胞不是本發(fā)明的關鍵。本發(fā)明的一種多肽可以在一種原核宿主(如大腸桿菌)或一種真核宿主(如啤酒酵母、昆蟲細胞如Sf21細胞或哺乳動物細胞如NIH3T3、HeLa或更優(yōu)選COS細胞)中生產。這種細胞可從廣泛的來源獲得(例如美國典型培養(yǎng)物包藏中心，Rockland,MD；也見Ausubel等，上文)。轉化或轉染的方法以及表達載體的選擇依賴于所選擇的宿主系統(tǒng)。轉化和轉染方法在諸如Ausubel等(上文)中介紹；表達載體可以從諸如克隆載體實驗室手冊(P.H.Pouwels等，1985,Supp.1987)提供的載體中選擇。
一個用于多肽生產的特殊細菌表達系統(tǒng)是大腸桿菌pET表達系統(tǒng)(Novagen,Inc.,MadiSon,WI)。根據(jù)該表達系統(tǒng)，將編碼一種多肽的DNA按照設計來允許表達的方向插入pET載體。因為編碼這樣一種多肽的基因位于T7調節(jié)信號的控制之下，該多肽的表達可以通過在宿主細胞中誘導T7 RNA聚合酶的表達來完成。這通常使用對IPTG應答而表達T7 RNA聚合酶的宿主菌株來完成。一旦生產后，重組多肽接著按照本領域熟知的標準方法進行分離，如這里介紹的方法。
另一種用于多肽生產的細菌表達系統(tǒng)是pGEX表達系統(tǒng)(Pharmacia)。該系統(tǒng)使用一種GST基因融合系統(tǒng)，它是設計來以融合蛋白的形式高水平表達基因或基因片段，并且表達產物可快速純化和功能復性。目標蛋白與來自Schistosoma japonicum的谷胱甘肽S轉移酶的羧基端融合，并可方便地使用谷胱甘肽Sepharose 4B通過親和層析從細菌裂解物中純化。融合蛋白可以用谷胱甘肽洗脫，在溫和條件下復性。從融合蛋白中切下谷胱甘肽S轉移酶結構域可以利用此結構域上游存在的位點特異性蛋白酶的識別位點來完成。例如，在pGEX-2T質粒中表達的蛋白可以用凝血酶切割，在pGEX-3X中表達的蛋白可以用Xa因子切割。
一旦本發(fā)明的重組多肽表達后，就可進行分離，例如使用親和層析。在一個實施例中，可以將一個針對本發(fā)明的多肽而制備的抗體(例如按這里介紹的方法制備)吸附到柱上，并用于分離重組多肽。在上親和層析前裂解和分級分離含有多肽的細胞，這可使用標準的方法來進行(見諸如Ausubel等，上文)。
一旦分離后，在需要時，重組蛋白就可進行進一步純化，例如使用高效液相色譜(見諸如Fisher，生物化學和分子生物學中的實驗室技術，eds.,Work和Burdon,Elsevier,1980)。
本發(fā)明的多肽，特別是短肽片段，也可以用化學合成的方法生產(例如使用固相肽合成，2nd,ed.,1984,The pierce Chemicai Co.,Rockford,IL中介紹的方法)。
這些多肽表達和純化的通用技術也可用來生產和分離有用的多肽片段或類似物(這里介紹)。
抗體為制備抗體，本發(fā)明的多肽的編碼序列可以以與谷胱甘肽S轉移酶(GST)C末端融合的方式表達(Smith等，Gene 67:31-40,1988)。融合蛋白在谷胱甘肽-Sepharose珠上純化，用谷胱甘肽洗脫，用凝血酶切割(在遺傳工程切割位點)，并純化至免疫兔所需的純度。初次免疫使用福氏完全佐劑進行，后續(xù)免疫使用福氏不完全佐劑?？贵w滴度使用GST融合蛋白的凝血酶切割的蛋白片段通過Western印跡和免疫沉淀分析來監(jiān)測。免疫血清使用CNBr-Sepharose偶聯(lián)蛋白進行親和純化?？寡逄禺愋允褂靡唤M不相關的GST蛋白來測定。
作為GST融合蛋白的替代或輔助的免疫原，可以制備對應于本發(fā)明的多肽的相對獨特的免疫原區(qū)域的肽，并通過一個引入的C末端賴氨酸將其與匙孔血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)。針對每種這樣的多肽的抗血清在與BSA接合的肽上進行相似的親和純化，并使用肽接合物在ELISA和Western印跡中進行特異性檢驗，以及使用以GST融合蛋白形式表達的多肽進行Western印跡和免疫沉淀。
此外，能夠特異性地結合本發(fā)明的任何一種多肽的單克隆抗體可按照標準的雜交瘤技術進行制備(見諸如Kohler等，Nature 256:495,1975；Kohler等，Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等，In單克隆抗體和T細胞雜交瘤，Elsevier,NY,1981；Ausubel等，上文)。在制備后，單克隆抗體同樣用Western印跡或免疫沉淀分析檢驗特異性識別能力(使用Ausubel等上文中介紹的方法)。能特異性識別本發(fā)明的多肽的抗體被認為在本發(fā)明中有用，這種抗體可用于例如免疫分析中。另外，單克隆抗體可以使用上面介紹的本發(fā)明的多肽和噬菌體文庫進行制備(Vaughan等，Nature Biotech 14:309-314,1996)。
本發(fā)明的抗體優(yōu)選使用本發(fā)明的多肽的片段來制備，這種片段位于通常保守的區(qū)域之外，并且看來具有抗原性，其特征是諸如具有高頻率的帶電荷的殘基。在一個特殊實施例中，這種片段通過標準的PCR技術制備并克隆到pGEX表達載體(AuSubel等，上文)中。融合蛋白在大腸桿菌中表達并按照Ausubel等(上文)的介紹使用一種谷胱甘肽瓊脂糖基質進行純化。為盡量減少抗血清的低親和性和特異性的潛在困難，對每種蛋白制備兩種或三種這樣的融合物，并將每種融合物注射到至少兩只兔中。進行系列注射，優(yōu)選包括至少三次加強注射，來產生抗體。
針對這里介紹的任何多肽的抗體可用于治療細菌感染。
篩選試驗如上文所討論的，我們已經鑒定了多種參與致病性和因而可以用于篩選能降低該有機體以及其他微生物病原體的毒性的化合物的銅綠假單胞菌毒力因子。例如，本發(fā)明提供了篩選化合物的方法，來鑒定能增強(刺激劑)和阻斷(拮抗劑)本發(fā)明的多肽的活性或核酸序列的基因表達的化合物。篩選方法可使用高通量的技術。
任何數(shù)量的方法可以用于進行這種篩選。按照一個方法，候選化合物按不同的濃度加入到表達本發(fā)明的一種核苷酸序列的致病細胞的培養(yǎng)基中。然后測量基因的表達，例如通過標準的Northern印跡分析(Ausubel等，上文)，使用從核酸分子制備的任何合適的片段作為雜交探針。將在存在候選化合物時的基因表達水平與在沒有候選分子的對照培養(yǎng)基中測量到的水平進行比較。能夠引起致病因子的表達減少的化合物就被認為在本發(fā)明中有用，這樣一種分子可以用作，例如一種治療藥物，來對抗一種感染有機體的致病性。
此外，在需要時，候選化合物的效果可以使用相同的通用方法和標準的免疫技術在多肽產生的水平上進行測量，例如使用一種對致病因子特異的抗體進行Western印跡或免疫沉淀。例如，免疫試驗可以用來檢測或監(jiān)測在病原有機體中至少一種本發(fā)明的多肽的表達。能夠結合這樣一種多肽的多克隆或單克隆抗體(按上面介紹的方法制備)可以在任何標準的免疫試驗程序(例如ELISA、Western印跡或RIA試驗中使用，來測量致病性多肽的水平。能引起致病性多肽表達減少的化合物被認為是特別有用的。同樣，這樣一種分子可以用作，例如一種治療藥物，來對抗感染有機體的致病性。
此外或另外，可以在候選化合物中篩選能特異性結合并抑制本發(fā)明的致病性多肽的化合物。這樣一種候選化合物的效果依賴于它與致病性多肽相互作用的能力。這種相互作用可方便地使用任何數(shù)量的標準結合技術和功能試驗進行分離(例如Ausubel等上文中介紹的方法)。例如，一種候選化合物可在體外檢測其與本發(fā)明的一種多肽的相互作用和結合的能力，并且它調節(jié)致病性的能力可以使用任何標準試驗進行分析(例如這里介紹的試驗)。
在一個特殊實施例中，一種能結合致病性多肽的候選化合物可以使用基于色譜的技術來鑒定。例如，本發(fā)明的一種重組多肽可以用標準的技術從遺傳工程改造來表達該多肽的細胞(例如上文所介紹的)中純化，并可以固定到一個柱上。然后將候選化合物的溶液經過該柱，對致病多肽具有特異性的化合物就可以根據(jù)它與致病性多肽結合的能力得到鑒別，并固定在柱上。為分離該化合物，洗滌柱以去除非特異性結合分子，然后使所需的化合物從柱上釋放，并進行收集。在需要時，用這種方法(或其他合適的方法)分離的化合物可進一步純化(例如通過高效液相色譜)。此外，可以測試這些候選化合物使一種病原體毒力降低的能力(例如按這里的介紹)。用這種方法分離的化合物也可以用作，例如一種治療藥物，來治療或預防病原體感染、疾病或兩者的發(fā)生。被鑒定為能與致病多肽結合并且親和常數(shù)小于或等于10mM的化合物被認為在本發(fā)明中特別有用。
在另一種方法中，通過監(jiān)測化合物對一種吩嗪(如綠膿素)產生的影響，來在候選化合物中篩選能抑制假單胞菌細胞的毒性的化合物。根據(jù)一種方法，候選化合物按不同的濃度加入到致病細胞的培養(yǎng)基中，然后按照任何標準方法測量綠膿素，例如監(jiān)測其在酸性溶液中在520nm的吸收(Essar等，J.Bacteriol.172:884,1990)。為使用于測量的液體培養(yǎng)中的綠膿素產量最大，細胞可培養(yǎng)在通過加入100uM FeCl3而修改的KA肉湯中(King等，J.Lab.Clin.Med.44:301,1954)。將存在候選化合物時的綠膿素產生水平與沒有候選分子的對照培養(yǎng)基中測量的水平進行比較。能引起綠膿素表達減少的化合物被認為是在本發(fā)明中有用，這樣一種分子可以用作，例如一種治療藥物，來對抗一種感染性有機體的致病性。相似的技術可以用來對其他合適的吩嗪進行篩選，包括但不限于膿玉紅素、銅綠菌素A、堆粘菌素和結核霉素A。其他吩嗪在Turner和Messenger(AdvancesIn Microbial Physilolgy 27:211-1275,1986)、Sorensen和Joseph(In銅綠假單胞菌是一種機會致病菌，Campa,M.ed.,Plenum Press,N.Y.,1993)、Ingram和Blackwood(Advances in AppliedMicrobiology 13:267,1970)和Gerber(In:CRC Handbook ofMicrobiology,Laskin,A.I.和Lechevalier,eds.,2ndedition,Vol.5,Chemical Rubber Co.,Cleveland,Ohio,1984,pp.573-576)中介紹。
潛在的拮抗劑包括能結合本發(fā)明的一種核酸序列或多肽并因而抑制或消除其活性的有機分子、肽、肽模擬物、多肽和抗體。潛在的拮抗劑還包括能結合和占據(jù)多肽的結合位點并因而抑制其與細胞結合分子結合從而抑制其正常生物活性的小分子。其他的潛在拮抗劑包括反義分子。
這里提供的每種DNA序列也可用于發(fā)現(xiàn)和發(fā)展抗病化合物(例如抗生素)。表達的編碼蛋白可以用作一種篩選抗菌藥物的靶。此外，編碼所編碼蛋白的氨基端區(qū)域或SD序列或相應mRNA的其他翻譯促進序列的DNA序列可以用來構建反義序列，來控制所需編碼序列的表達。
本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的多肽、多核苷酸或抑制劑來干擾病原體和哺乳動物宿主之間導致感染的最初的物理相互作用。特別是本發(fā)明的分子可以用于阻止細菌在哺乳動物細胞外基質蛋白、在傷口中的細胞外基質蛋白上的粘附和定居；阻斷對哺乳動物細胞的侵入；或阻止致病的正常過程。
本發(fā)明的拮抗劑和激活劑可用于，例如抑制和治療多種細菌感染。
另外非必須地，在上面介紹的任何試驗中鑒定的化合物可以被證明為能用于在任何標準動物模型(例如這里介紹的小鼠燒傷試驗)致病性感染的發(fā)展中提供保護，并且如果能成功的話，它們可以用作抗病原體藥物(例如抗生素)。
待測化合物和抽提物總的來說，能降低病原體毒力的化合物是按照本領域熟知的方法從大的天然產物或合成的(或半合成的)抽提物的文庫中或化學文庫中鑒定的。藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領域的技術人員應當理解，待測抽提物或化合物的準確來源對本發(fā)明的篩選方法來說不是關鍵。因此，事實上任何數(shù)量的化學抽提物或化合物都能使用這里介紹的方法進行篩選。這種抽提物或化合物的例子包括但不限于植物、真菌、原核生物或動物來源的抽提物、發(fā)酵肉湯、合成化合物以及已有化合物的修飾物。大量的方法也都可以用來制備任何數(shù)量的化合物的隨機或定向合成物(例如半合成或全合成)，這些化合物包括但不限于以多糖、脂、肽和核酸為基礎的化合物。合成化合物文庫可從Bandon Associates(Merrimack,NH)和Aldrich Chemical(Milwaukee,WI)購買。此外，細菌、真菌、植物和動物抽提物形式的天然化合物文庫可從多個來源購買，包括Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce,FL)和PharmaMar,U.S.A.(Cambridge,MA)。另外，在需要時，天然和合成產生的文庫可按照本領域熟知的標準方法來產生，例如使用標準的抽提和分級分離方法。而且，在需要時，任何文庫或化合物可使用標準的化學、物理或生化方法方便地修飾。
此外，藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)領域的技術人員很容易理解，用來對已經知道其致病活性的化合物進行去復制(例如分類去復制、生物去復制或化學去復制，或它們的任何組合)或消除復制或重復的方法，在任何可能的時候，都可以應用。
當發(fā)現(xiàn)一種粗抽提物具有抗病或抗毒活性或結合活性時，需要對產生陽性的抽提物進行進一步的分級分離，來分離導致所觀察到的效果的化學組分。這樣，抽提、分級分離和純化過程的目標是在具有抗病活性的粗抽提物中仔細分析和鑒定一種化學實體。這種異質抽提物的分級分離和純化的方法在本領域是熟知的。在需要時，顯示是一種對致病性治療有用的試劑的化合物可按照本領域熟知的方法進行化學修飾。
藥物治療劑和植物保護劑本發(fā)明提供一種簡單的方法來鑒別能抑制一種病原體的致病性或毒性的化合物(包括肽、小分子抑制物和模擬物)。因此，使用這里介紹的方法而被發(fā)現(xiàn)具有醫(yī)學或農業(yè)價值的一種化學實體，可以用作藥物、植物保護劑，或用作對已有的抗病化合物進行結構修飾的信息，例如通過合理的藥物設計。這種方法可用于篩選對多種病原體包括但不限于細菌、病毒、真菌、環(huán)節(jié)動物、線蟲、扁形動物和原生動物有效的化合物。致病細菌的例子包括但不限于氣桿菌、氣單胞菌、不動桿菌、農桿菌、芽孢桿菌、擬桿菌、巴爾通氏體、Bortella、布魯氏菌、鞘桿菌、彎曲桿菌、檸檬酸桿菌、梭菌、棒桿菌、腸桿菌、埃希氏菌、弗朗西斯氏菌、嗜血菌、哈夫尼菌、螺桿菌、克雷伯氏菌、軍團菌、李斯特氏菌、摩根氏菌、莫拉氏菌、變形菌、普羅威登氏菌、假單胞菌、沙門氏菌、沙雷氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、密螺旋體、黃單胞菌、孤菌和耶爾森氏菌。
為用于治療，使用這里介紹的方法鑒定的組合物或藥劑可以系統(tǒng)給藥，例如配制在一種可藥用的緩沖液如生理鹽水中。治療可直接完成，例如用能夠破壞、抑制、減弱或中和與致病肽有關的生物事件的拮抗劑處理動物。給藥的優(yōu)選途徑包括諸如能在患者中提供連續(xù)穩(wěn)定水平的藥物的皮內、靜脈、腹膜內、肌肉或皮下注射。對人類患者或其他動物的治療可以使用存在于一種生理接受的載劑中的治療有效量的抗病試劑。合適的載劑及其配制在諸如E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences中介紹。用于給藥的抗病試劑(例如一種抗生素)的數(shù)量根據(jù)給藥方式、患者的年齡和體重以及疾病的種類和疾病的范圍而各不相同。雖然由于化合物的特異性提高，在特定場合需要較低的劑量，但一般來說，劑量在那些用于治療其他微生物疾病時所用的其他藥劑的劑量范圍內?；衔锝o藥的劑量為能抑制微生物的增殖。例如，對于系統(tǒng)給藥，一種化合物通常給藥的范圍為0.1ng-10ng/kg體重。
為在農業(yè)中使用，使用這里介紹的方法鑒定的組合物或藥劑可以用作噴灑或粉塵化學劑施用于植物的葉面。這種藥劑通常在病原體之前給藥于植物表面以防止感染。也可以在種植后處理種子、鱗莖、根、塊莖和球莖，通過控制它們攜帶的或種植地點的土壤中存在的病原體，來防止病原體襲擊。準備種植蔬菜、觀賞植物、灌木或樹木的土壤也可以用化學熏蒸劑進行處理，來控制多種微生物病原體。處理優(yōu)選在種植前幾天或幾周進行。化合物可通過機械途徑例如拖拉機也可以通過手工操作進行施用。此外，使用試驗方法鑒定的化合物可以用作消毒劑。
其他實施方案總的來說，本發(fā)明包括可以按這里的介紹進行分離的核酸序列或使用本發(fā)明的核酸序列通過同源篩選或PCR擴增能方便地分離的任何核酸序列。本發(fā)明還包括能通過不消除其致病活性(進行試驗，例如按這里的介紹)的方法進行修飾的多肽。這種改變包括特定的突變、刪除、插入或翻譯后修飾，或可包括將本發(fā)明的多肽包含在一個較大的融合蛋白中，成為一個組分。本發(fā)明還包括失去了其致病性的多肽。
這樣，在其他實施方案中，本發(fā)明包括基本上與本發(fā)明的多肽相同的任何蛋白。這種同源物包括其他基本上純的天然產生的多肽以及等位突變體、天然突變體、誘導突變體、由能在高嚴謹條件下或較差一些---在低嚴謹條件下(例如在40℃用2x SSC洗滌，探針長度至少40個核苷酸)與本發(fā)明的任何一種核酸序列雜交的DNA編碼的蛋白、以及能被本發(fā)明的抗血清特異性結合的蛋白。
本發(fā)明進一步包括本發(fā)明的任何天然產生的多肽的類似物。類似物與本發(fā)明的天然產生的多肽的差別在于氨基酸差異、翻譯后修飾或兩者。本發(fā)明的類似物通常顯示與本發(fā)明的天然產生的氨基酸序列的全部或部分至少有85％的同一性，更優(yōu)選為90％，最優(yōu)選為95％甚至99％。進行比較的序列的長度至少為15個氨基酸殘基，優(yōu)選為至少25個氨基酸殘基，更優(yōu)選超過35個氨基酸殘基。同樣，在一個測定同一性的方法舉例中，可以使用一種BLAST程序，其中可能分數(shù)在e-3和e-100之間，這表示密切相關的序列。修飾包括多肽的體內或體外化學衍生，例如乙?；?、羧化、磷酸化或糖基化，這種修飾可在多肽合成、加工過程中或用分離的修飾酶處理后發(fā)生。類似物與本發(fā)明的天然產生的多肽的差別還可在于一級序列中的改變。這包括遺傳變異，自然和誘導的(例如，按照Sambrook,Fritsch和Maniatis，分子克隆實驗室手冊(2版)，CHS Press,1989或Ausubel等，上文中介紹的通過輻射或暴露于乙烷甲基硫酸進行隨機突變或進行位點特異性誘變)。還包括環(huán)肽、分子和含有L-氨基酸以外的殘基如D-氨基酸或非天然產生的或合成氨基酸如β或γ氨基酸的類似物。
除了全長的多肽，本發(fā)明還包括本發(fā)明的任何一種多肽的片段。用于此處，“片段“一詞是指至少5個連續(xù)氨基酸，優(yōu)選至少20個連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選至少30個連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選至少50個連續(xù)氨基酸，最優(yōu)選至少60至80個或更多的連續(xù)氨基酸。本發(fā)明的片段可以通過本領域的技術人員熟知的方法制備，或通過普通的蛋白加工產生(例如，從新生多肽中去除不是生物活性必需的氨基酸，或通過另外的mRNA剪接或另外的蛋白加工事件去除氨基酸)。
而且，本發(fā)明包括能幫助特異性檢測本發(fā)明的任何核酸序列的核苷酸序列。這樣，例如，這里介紹的核酸序列或其片段可用作探針，通過標準的雜交技術在常規(guī)條件下與核苷酸序列雜交。能與一種編碼序列的核酸序列或其互補序列雜交的序列被認為是在本發(fā)明中有用。能與本發(fā)明的一種核酸序列的編碼序列或其互補序列雜交的序列和編碼本發(fā)明的一種多肽的序列也被認為在本發(fā)明中有用。用于此處，“片段”一詞在用于核酸序列時，是指至少5個連續(xù)氨基酸，優(yōu)選至少10個連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選至少20至30個連續(xù)氨基酸，最優(yōu)選至少40至80個或更多的連續(xù)氨基酸。核酸序列的片段可通過本領域的技術人員熟知的方法制備。
本發(fā)明進一步提供在個體特別是人體中誘導一種免疫應答的方法，該方法包括用例如本發(fā)明的任何多肽(或其片段或類似物，或融合蛋白)接種該個體，產生一種抗體和/或T細胞免疫應答，來保護個體免于感染，尤其是細菌感染(例如銅綠假單胞菌感染)。本發(fā)明進一步包括在個體中誘導一種免疫應答的方法，它包括將一種核酸載體轉移進個體，指導這里介紹的多肽(或其片段或融合蛋白)表達，來誘導免疫應答。
本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的多肽或核酸序列的疫苗組合物。例如，本發(fā)明的多肽可以用作一種抗原，來在宿主中接種后產生特異性的抗體，這種抗體能針對細菌侵襲提供保護，例如，通過阻斷吩嗪的產生。因此，本發(fā)明包括一種疫苗制劑，它包括本發(fā)明的一種免疫原性多肽以及一種合適的載劑。
本發(fā)明進一步提供用于診斷致病情況的組合物(例如核苷酸序列探針)、多肽、抗體和方法。
本申請書中提到的所有出版物和專利申請，在此都各自獨立并具體地引入作為參考。
其他的實施方案在權利要求的范圍內。
權利要求
1．一種分離核酸分子，它包含一個與SEQ ID NO:252基本上相同的序列。
2．權利要求1的分離核酸分子，其中所說的核酸分子包含示于SEQ ID NO:252的序列。
3．一種分離核酸分子，它包含一個與SEQ ID NO:105基本上相同的序列。
4．權利要求3的分離核酸分子，其中所說的核酸分子包含示于SEQ ID NO:105的序列。
5．一種分離核酸分子，它包含一個與SEQ ID NO:106基本上相同的序列。
6．權利要求5的分離核酸分子，其中所說的核酸分子包含示于SEQ ID NO:106的序列。
7．一種基本上純的多肽，它含有一個與SEQ ID NO:253的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
8．權利要求7的基本上純的多肽，其中所說的氨基酸序列包含示于SEQ ID NO:253的序列。
9．一種基本上純的多肽，它含有一個與SEQ ID NO:107的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
10．權利要求9的基本上純的多肽，其中所說的氨基酸序列包含示于SEQ ID NO:107的序列。
11．一種基本上純的多肽，它含有一個與SEQ ID NO:108的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
12．權利要求11的基本上純的多肽，其中所說的氨基酸序列包含示于SEQ ID NO:108的序列。
13．鑒定能降低致病毒力因子表達的化合物的方法，所說的方法包括以下步驟(a)提供一種能表達權利要求1的一種核酸分子的致病細胞；并(b)將所說的致病細胞與一種候選化合物接觸，在與所說的候選化合物接觸后所說的核酸分子的表達降低，就鑒定了能降低一種致病毒力因子表達的化合物。
14．權利要求13的方法，其中所說的致病細胞感染一種哺乳動物。
15．權利要求13的方法，其中所說的致病細胞感染一種植物。
16．鑒定能降低致病毒力因子表達的化合物的方法，所說的方法包括以下步驟(a)提供一種能表達權利要求3的核酸分子的致病細胞；并(b)將所說的致病細胞與一種候選化合物接觸，在與所說的候選化合物接觸后所說的核酸分子的表達降低，就鑒定了一種能降低致病毒力因子表達的化合物。
17．權利要求16的方法，其中所說的致病細胞感染一種哺乳動物。
18．權利要求17的方法，其中所說的致病細胞感染一種植物。
19．鑒定能降低致病毒力因子表達的化合物的方法，所說的方法包括以下步驟(a)提供一種能表達權利要求5的核酸分子的致病細胞；并(b)將所說的致病細胞與一種候選化合物接觸，在與所說的候選化合物接觸后所說的核酸分子的表達降低，就鑒定了一種能降低致病毒力因子表達的化合物。
20．權利要求19的方法，其中所說的致病細胞感染一種哺乳動物。
21．權利要求19的方法，其中所說的致病細胞感染一種植物。
22．鑒定能結合一種多肽的化合物的方法，所說的方法包括以下步驟(a)將候選化合物與含有權利要求7的氨基酸序列的基本上純的多肽在允許結合的條件下接觸；并(b)檢測候選化合物與多肽的結合。
23．鑒定能結合一種多肽的化合物的方法，所說的方法包括以下步驟(a)將候選化合物與含有權利要求9的氨基酸序列的基本上純的多肽在允許結合的條件下接觸；并(b)檢測候選化合物與多肽的結合。
24．鑒定能結合一種多肽的化合物的方法，所說的方法包括以下步驟(a)將候選化合物與含有權利要求11的氨基酸序列的基本上純的多肽在允許結合的條件下接觸；并(b)檢測候選化合物與多肽的結合。
25．一種治療哺乳動物中致病性感染的方法，所說的方法包括以下步驟(a)確定具有致病性感染的哺乳動物，并；(b)將一種治療有效量的、能抑制在所說的病原體中由權利要求1的核酸分子編碼的多肽的表達或活性的組合物給藥于所說的哺乳動物。
26．一種治療哺乳動物中致病性感染的方法，所說的方法包括以下步驟(a)確定具有致病性感染的哺乳動物，并；(b)將一種治療有效量的、能抑制在所說的病原體中由權利要求3的核酸分子編碼的多肽的表達或活性的組合物給藥于所說的哺乳動物。
27．權利要求26的方法，其中所說的病原體是銅綠假單胞菌。
28．一種治療哺乳動物中致病性感染的方法，所說的方法包括以下步驟(a)確定具有致病性感染的哺乳動物，并；(b)將一種治療有效量的、能抑制在所說的病原體中由權利要求5的核酸分子編碼的多肽的表達或活性的組合物給藥于所說的哺乳動物。
29．權利要求28的方法，其中所說的病原體是銅綠假單胞菌。
30．一種治療哺乳動物中致病性感染的方法，所說的方法包括以下步驟(a)確定具有致病性感染的哺乳動物，并；(b)將一種治療有效量的、能結合和抑制由權利要求5的氨基酸序列編碼的多肽的組合物給藥于所說的哺乳動物。
31．權利要求30的方法，其中所說的病原體是銅綠假單胞菌。
32．一種治療哺乳動物中致病性感染的方法，所說的方法包括以下步驟(a)確定具有致病性感染的哺乳動物，并；(b)將一種治療有效量的、能結合和抑制由權利要求7的氨基酸序列編碼的多肽的組合物給藥于所說的哺乳動物。
33．權利要求32的方法，其中所說的致病性感染由銅綠假單胞菌引起。
34．一種治療哺乳動物中致病性感染的方法，所說的方法包括以下步驟(a)確定具有致病性感染的哺乳動物，并；(b)將一種治療有效量的、能結合和抑制由權利要求9的氨基酸序列編碼的多肽的組合物給藥于所說的哺乳動物。
35．權利要求34的方法，其中所說的致病性感染由銅綠假單胞菌引起。
36．一種治療哺乳動物中致病性感染的方法，所說的方法包括以下步驟(a)確定具有致病性感染的哺乳動物，并；(b)將一種治療有效量的、能結合和抑制含有權利要求11的氨基酸序列的基本上純的多肽的組合物給藥于所說的哺乳動物。
37．權利要求36的方法，其中所說的致病性感染由銅綠假單胞菌引起。
38．一種鑒定能抑制假單胞菌細胞的毒性的化合物的方法，所說的方法包括以下步驟(a)提供一種假單胞菌細胞；(b)將所說的細胞與候選化合物接觸，并(c)檢測一種吩嗪的存在，其中所說的吩嗪與未處理的對照細胞相比減少，就說明該化合物能抑制所說的假單胞菌細胞的毒性。
39．權利要求38的方法，其中所說的細胞是銅綠假單胞菌。
40．權利要求38的方法，其中所說的吩嗪用光譜學進行檢測。
41．權利要求38的方法，其中所說的吩嗪是綠膿素。
42．權利要求41的方法，其中所說的綠膿素用測量在520nm處的吸收來檢測。
43．權利要求38的方法，其中所說的細胞存在于一種細胞培養(yǎng)物中。
全文摘要
本發(fā)明公開了細菌毒性多肽、編碼這種多肽的核酸序列(例如DNA)、利用重組技術制備這種多肽的方法。本發(fā)明還提供利用這種多肽篩選抗菌性或抑菌性化合物的方法。
文檔編號A61P31/04GK1309720SQ98813271
公開日2001年8月22日 申請日期1998年11月25日 優(yōu)先權日1997年11月25日
發(fā)明者F·奧蘇貝爾, H·M·戈德曼, L·G·拉梅, S·馬哈賈－米克洛斯, M·W·譚, H·曹, E·德倫卡德, J·宋加利斯 申請人:綜合醫(yī)院公司