專利名稱：由海綿分離的包括Asmarine A和B的細(xì)胞毒性生物堿衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從海綿Raspailia物種分離的新型細(xì)胞毒性生物堿Asmarine A和B。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了或者具有結(jié)構(gòu)式(I)，或者具有結(jié)構(gòu)式(II)的新型二萜生物堿 (I) (II)其中R1代表氫原子或低級烷基或低級鏈烷酰基；R2代表氫原子或低級烷基；R3或者是含有一個或多個異戊二烯單位的烷基或環(huán)烷基，或者是一個單萜或倍半萜烯或二萜基團(tuán)；R4和R5代表氫原子或低級烷基；R6代表低級烷基；X代表F或Cl或Br或I。
在結(jié)構(gòu)式(I)和(II)的基團(tuán)的定義中，所述低級烷基以及低級鏈烷?；牡图壨榛糠质侵负?到6個碳原子的直鏈或分支烷基基團(tuán)，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基和己基。
更具體地說，本發(fā)明涉及從海綿Raspailia物種提取和分離出的Asmarine A和Asmarine B。這些化合物的結(jié)構(gòu)如下所示 Asmarine A Asmarine B所顯示的立體化學(xué)在兩種情況下都是相對構(gòu)型。
Asmarine A和Asmarine B顯示出抗腫瘤活性。具體地說，Asmarine A和Asmarine B顯示出針對來自人類實體瘤(如人肺癌、人結(jié)腸癌和人黑素癌)的細(xì)胞系的抗腫瘤活性，并且相似地對其它腫瘤細(xì)胞系，如白血病和淋巴瘤有效。
本發(fā)明還提供治療罹患惡性腫瘤的哺乳動物的方法，所述惡性腫瘤對具有結(jié)構(gòu)式(I)或結(jié)構(gòu)式(II)的化合物敏感，該方法包括給予治療有效量的具有結(jié)構(gòu)式(I)或結(jié)構(gòu)式(II)的化合物，或其藥用組合物。
本發(fā)明還提供了含有具有結(jié)構(gòu)式(I)或結(jié)構(gòu)式(II)的化合物作為活性成分的藥用組合物，以及制備這些藥用組合物的方法。
本發(fā)明的又一方面是制備化合物Asmarine A和Asmarine B的方法，該方法包括從海綿Raspailia物種的提取和分離。
藥用組合物的例子包括任何適合口服給予、局部給予或胃腸外給予而配制的固體(片劑、丸劑、膠囊、顆粒劑等)或液體(溶液、懸浮液或乳液)，它們可以僅含有純化合物或與任何載體或其它藥物學(xué)上有活性的化合物組合。當(dāng)胃腸外給予時，這些組合物必須是無菌的。
含有具有結(jié)構(gòu)式(I)或結(jié)構(gòu)式(II)的化合物的藥用組合物的正確劑量將根據(jù)藥物制劑、使用方法以及要治療的具體部位、宿主和腫瘤而變化。其它因素應(yīng)該考慮在內(nèi)，如年齡、體重、性別、食譜、給藥時間、排泄率、宿主的疾病狀況、聯(lián)合用藥情況、反應(yīng)敏感性和疾病的嚴(yán)重程度。在最大耐受劑量內(nèi)，可以持續(xù)或定期給藥。抗腫瘤活性在含有Earle’s平衡鹽、2.0mM L-谷氨酸、非必需氨基酸、不含碳酸氫鈉的Eagle’s極限必需培養(yǎng)基(EMEM/neaa)中，添加10％胎牛血清(FCS)、10-2M碳酸氫鈉和0，1g/L青霉素-G+鏈霉素硫酸鹽，維持細(xì)胞處于對數(shù)生長期。
使用Bergeron等人(參考資料3)描述的方法的修改形式，已經(jīng)執(zhí)行了一個篩選程序來確定和比較這些化合物的抗腫瘤活性。所使用的抗腫瘤細(xì)胞是P-388(得自DBA/2小鼠的淋巴樣腫瘤的懸浮培養(yǎng)物)、A-549(人肺癌的單層培養(yǎng)物)、HT-29(人結(jié)腸癌的單層培養(yǎng)物)和MEL-28(人黑素癌的單層培養(yǎng)物)。
將P-388細(xì)胞以1×104每孔接種到16mm孔中1ml等分的含有指定濃度藥物的MEM 5FCS中。接種另外一組不含藥物的培養(yǎng)物作為對照生長，以確保所述細(xì)胞維持在指數(shù)生長期。所有測定都一式兩份進(jìn)行。在37℃、10％CO2、98％濕度空氣中孵育三天后，通過比較有藥物的孔中的生長和對照孔中的生長，確定大致的IC50。
將A-549、HT-29以及MEL-28細(xì)胞以2×104個細(xì)胞每孔接種到16mm孔中1ml等分的含有指定濃度藥物的MEM 10FCS中。接種另外一組不含藥物的培養(yǎng)物作為對照生長，以確保所述細(xì)胞維持在指數(shù)生長期。所有測定都一式兩份進(jìn)行。在37℃、10％CO2、98％濕度空氣中孵育三天后，用0.1％結(jié)晶紫染色這些孔。通過比較有藥物的孔中的生長和對照孔中的生長，確定大致的IC50。
使用細(xì)胞系P-388、A-549、HT-29以及MEL-28對Asmarine A和Asmarine B的體外細(xì)胞毒性測定的結(jié)果在下表中給出IC50(μM)P-388 A-549 HT-29 MEL-28Asmarine A 1.18 1.18 1.18 1.18Asmarine B 0.24 0.12 0.12 0.24提取和分離在一臺EIMS質(zhì)譜儀上記錄低分辨率質(zhì)譜。在一臺Bruker ARX-500波譜儀上記錄1H和13C-NMR波譜。根據(jù)TMS(δ＝0ppm)報告所有化學(xué)位移。
Raspailia物種(Rob Van Soest)，(尋常海綿綱異固海綿目Raspailiidea科)是由SCUBA于1997年5月在Dahlak Archipelago，Eritrea潛水到23.5m的深度采集到的。一個參考樣品保藏在Tel Aviv大學(xué)(ET-388)。將所述海綿當(dāng)場冰凍起來。使用2倍乙酸乙酯提取凍干的海綿(20gr)，蒸發(fā)后得到1.2g棕色膠。將此棕色膠通過Kupchon分級分離到四個部分中己烷、四氯化碳、氯仿和水。CHCl3和CCl4部分是相似的。將這兩個部分合并，在sephadex LH-20柱上進(jìn)行層析，使用MeOH∶CHCl3(1∶1)洗脫后，產(chǎn)生五個組分。使用同樣的溶劑系統(tǒng)將組分(3-5)在sephadex LH-20上進(jìn)一步反復(fù)層析，得到作為固體的Asmarine A(100mg)，mp＝232℃，m/z+＝423(C25H37N5O)，(100％)188(C8H6N5O+)，[α]D20＋55°(c＝0.5，CHCl3)，IR 3400，2928，1600，1553，1451，1400，1388，900cm-1，該Asmarine A的結(jié)構(gòu)由X-射線分析證實。使用同樣的溶劑還分離了作為油狀物的Asmarine B(120mg)，m/z+＝423(C25H37N5O)，(100％)188(C8H6N5O+)，[α]D20＋60°(c＝0.5，CHCl3)，IR 3400，2927，1606，1553，1451，1404，1388，900cm-1。
Asmarine A和B的NMR數(shù)據(jù)見于下表在所有情況下溶劑都是CHCl3，并且根據(jù)TMS(δ＝0ppm)報告所有化學(xué)位移。

參考資料1.Faulkner，D.Nat.Prod.Rep.1997，14，259-302以及其中的參考資料。2.Nakamura，H.等人。Tetrahedron Lert.1984，25，2989-2992。3.Raymond J.Bergeron，Paul F.Cavanaugh，Jr.，Steven J.Kline，RobertG.Hughes，Jr.，Gray T.和Carl W.Porter。亞精胺兒茶酚酰胺catecholamide鐵螯合劑的抗腫瘤和抗皰疹活性。Biochem.Bioph.Res.Comm.1984，121，848-85。
權(quán)利要求
1.具有結(jié)構(gòu)式(I)，或者具有結(jié)構(gòu)式(II)的化合物 (I)(II)其中R1代表氫或低級烷基或低級鏈烷?；籖2代表氫原子或低級烷基；R3或者是含有一個或多個異戊二烯單位的烷基或環(huán)烷基，或者是單萜或倍半萜烯或二萜基團(tuán)；R4和R5代表氫或低級烷基；R6代表低級烷基；X代表F或Cl或Br或I。在結(jié)構(gòu)式(I)和(II)的基團(tuán)的定義中，所述低級烷基以及所述低級鏈烷?；牡图壨榛糠质侵负?到6個碳原子的直鏈或分支烷基基團(tuán)，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基和己基。
2.依照權(quán)利要求1的化合物Asmarine A，具有下面的結(jié)構(gòu)式 Asmarine A
3.依照權(quán)利要求1的化合物Asmarine B，具有下面的結(jié)構(gòu)式 Asmarine B
4.治療罹患惡性腫瘤的哺乳動物的方法，所述惡性腫瘤對如權(quán)利要求1所定義的具有結(jié)構(gòu)式(I)或結(jié)構(gòu)式(II)的化合物敏感，該方法包括給予所述患病個體治療有效量的所述化合物或其藥用組合物。
5.治療罹患惡性腫瘤的哺乳動物的方法，所述惡性腫瘤對Asmarine A(如權(quán)利要求2所定義)或Asmarine B(如權(quán)利要求3所定義)敏感，該方法包括給予所述患病個體治療有效量的Asmarine A或Asmarine B或其藥用組合物。
6.包含如權(quán)利要求1所定義的具有結(jié)構(gòu)式(I)或者具有結(jié)構(gòu)式(II)的化合物作為活性成分的藥用組合物。
7.包含Asmarine A(如權(quán)利要求2所定義)或Asmarine B(如權(quán)利要求3所定義)作為活性成分的藥用組合物。
8.治療罹患惡性腫瘤的哺乳動物的方法，該方法包括給予所述患病個體治療有效量的如權(quán)利要求1所定義的具有結(jié)構(gòu)式(I)或者具有結(jié)構(gòu)式(II)的化合物以及其它一種或多種抗腫瘤化合物。
9.治療罹患惡性腫瘤的哺乳動物的方法，該方法包括給予所述患病個體治療有效量的Asmarine A(如權(quán)利要求2所定義)或AsmarineB(如權(quán)利要求3所定義)以及其它一種或多種抗腫瘤化合物。
10.制備Asmarine A(如權(quán)利要求2所定義)或Asmarine B(如權(quán)利要求3所定義)的方法，該方法包括從海綿Raspailia物種的提取和分離。
全文摘要
從海綿Raspailia物種分離了新型細(xì)胞毒性生物堿Asmarine A和B。已經(jīng)在NMR數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上建立了這些化合物的結(jié)構(gòu)并通過X－射線分析予以證實。同時還要求對化合物(I)或(II)的權(quán)益進(jìn)行保護(hù),其中R
文檔編號A61K31/52GK1336928SQ9881361
公開日2002年2月20日 申請日期1998年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月23日
發(fā)明者Y·卡什曼, A·魯?shù)? T·約瑟夫, D·G·格拉瓦洛斯 申請人:拜奧馬研究所有限公司