專利名稱:疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及疫苗組合物,包括來自HPV株系并可選地連接有一種免疫融合配偶體的E6或/和E7或E6、E7融合蛋白,其與一種含有CpG的寡聚核苷酸一起配制成疫苗,發(fā)現(xiàn)該疫苗在治療或預(yù)防人乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的腫瘤或損傷中有效。特別是,本發(fā)明涉及含有融合蛋白的疫苗,包括一種提供T輔助細(xì)胞的表位的蛋白或蛋白的一部分(如流感嗜血菌B的蛋白D)以及來自人乳頭瘤病毒的抗原(如含有來自與癌癥相關(guān)HPV16或18株系的的E6或E7蛋白),發(fā)現(xiàn)該融合蛋白在治療或預(yù)防人乳頭狀瘤誘導(dǎo)的腫瘤中有效,其中該疫苗用作為佐劑的含有CpG的寡聚核苷酸一起配制而成。
人乳頭狀瘤病毒是小的裸露的DNA腫瘤病毒(7.9千堿基對,雙鏈),它具有高度的種間特異性。已經(jīng)描述了有70種以上獨(dú)特的人乳頭狀瘤病毒(HPV)的基因型。乳頭狀瘤病毒的分類以所來源的物種(人類、牛等)以及與來源于同一物種中其他乳頭狀瘤病毒的遺傳相關(guān)性的程度為基礎(chǔ)。HPV通常是皮膚或黏膜表面所特有的,已經(jīng)大致地分為“低度”和“高度”危險(xiǎn)病毒。
低度危險(xiǎn)的HPV通常引起持續(xù)幾個(gè)月或幾年的良性損傷(疣或乳頭瘤)。高度危險(xiǎn)的HPV與腫瘤前的損傷和癌癥相關(guān)。HPV病毒和人類癌癥之間最為肯定的聯(lián)系是存在于HPV16和18與子宮頸癌之間的關(guān)系。在子宮頸癌中也發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種其它類型的HPV,包括HPV31和HPV32,雖然其存在的幾率較低。
在年輕的性生活活躍的婦女中,生殖器官的HPV感染很普遍,大多數(shù)個(gè)體或者清除感染,或者如果發(fā)展到損傷,這些癥狀將消退。受感染的個(gè)體中僅有一部分個(gè)體的損傷將發(fā)展成高度的上皮內(nèi)的瘤形成,其中僅有一部分進(jìn)一步發(fā)展成侵襲性的癌癥。
引起HPV感染的分子事件目前尚未清楚地確定。缺乏適當(dāng)?shù)膫鞑ト巳轭^狀瘤病毒的體外系統(tǒng)阻礙了關(guān)于該病毒周期的最佳信息的發(fā)展。
目前,借助細(xì)菌的克隆系統(tǒng)以及新近通過PCR擴(kuò)增,已經(jīng)分離并定性了不同類型的HPV。根據(jù)與清楚定性的牛乳頭狀瘤病毒Ⅰ(HPVⅠ)的比較,HPV基因組的分子組織已經(jīng)確定。
雖然確實(shí)存在較小的變化,但所描述的所有的HPV基因組均至少有七個(gè)早期基因,E1到E7和兩個(gè)晚期基因L1和L2。另外,一段上游調(diào)控區(qū)域隱蔽有調(diào)控序列,它顯示出控制HPV基因組的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄事件。
E1和E2基因分別與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄控制有關(guān),有被病毒整合打斷的傾向。E6和E7與病毒的轉(zhuǎn)化有關(guān)。此過程也涉及到E5。
在子宮頸癌所包括的HPV如HPV16和18中,致瘤過程發(fā)生在病毒DNA的整合之后。整合導(dǎo)致編碼衣殼蛋白L1和L2的基因失活,E2的抑制作用丟失導(dǎo)致設(shè)置兩種早期蛋白E6和E7持續(xù)過量表達(dá)的E6/E7開讀框的反常,這將導(dǎo)致正常細(xì)胞分化功能的逐步丟失以及癌癥的發(fā)展。E6和E7分別通過失活主要的腫瘤抑制蛋白,p53和pRB(成視網(wǎng)膜瘤基團(tuán)產(chǎn)物)來克服正常的細(xì)胞周期。
宮頸癌普遍存在于婦女中,其通過一種癌癥前的中間階段發(fā)展成經(jīng)常導(dǎo)致死亡的侵襲性的癌癥。已知該疾病的中間階段為子宮頸部上皮內(nèi)瘤形成的階段,以嚴(yán)重性的漸增分級為Ⅰ到Ⅲ(CINⅠ-Ⅲ)。
臨床上,女性陰肛部位的HPV感染以子宮頸扁平溫疣的形式顯現(xiàn),其特點(diǎn)是主要影響子宮頸鱗狀上皮的表皮和中間細(xì)胞的中空細(xì)胞病。
中空細(xì)胞(Koilocytes),是病毒引起細(xì)胞病變作用的結(jié)果,以具有清晰核周暈的多核細(xì)胞的形式顯現(xiàn)。反常角質(zhì)化引起的表皮增厚是形成多疣形式的損傷的原因。
當(dāng)HPV16或18血清型陽性時(shí),這種扁平濕疣是發(fā)展成子宮頸上皮內(nèi)瘤形成(CIN)及原位癌(CIS)的高度危險(xiǎn)的因素,這些癥狀本身被認(rèn)為是侵入性的宮頸癌的前導(dǎo)損傷。
致癌的HPV感染的自然過程呈現(xiàn)三個(gè)連續(xù)的階段,即(1)潛在感染階段,(2)核內(nèi)病毒復(fù)制階段,產(chǎn)物為完整的病毒顆粒,其對應(yīng)中空細(xì)胞*的出現(xiàn)。在這一階段中,HPV產(chǎn)生其全部范圍的蛋白,包括E2、E5、E6、E7、L1以及L2。
(3)病毒整合到細(xì)胞基因組的階段,它引發(fā)了惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)作,相應(yīng)于中空細(xì)胞漸進(jìn)性消失的CINⅡ和CINⅢ/CIS。在這一階段中,E2的表達(dá)被下調(diào),E6和E7的表達(dá)增強(qiáng)。在CINⅡ/Ⅲ和CINⅢ/宮頸癌階段之間,病毒DNA從在基細(xì)胞中的游離態(tài)轉(zhuǎn)變成僅整合E6和E7基因(腫瘤細(xì)胞)。所有宮頸癌的85%是鱗狀細(xì)胞癌,它們最主要與HPV16血清型相關(guān)。分別有10%和5%是腺癌和腺鱗細(xì)胞癌,這兩種類型均主要與HPV18血清型相關(guān)。然而也存在其它的致癌HPV。
國際專利申請編號WO 96/19496公布了人乳突淋瘤病毒E6和E7蛋白的變體,尤其是在E6及E7蛋白上均有缺失的E6/E7的融合蛋白。據(jù)報(bào)道這些缺失型的融合蛋白具有免疫原性。
具免疫調(diào)節(jié)活性的寡聚核苷酸含有未被甲基化的CpG二核苷酸("CpG")并且已被知曉(WO 96/02555,EP 468520)。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鳥苷二核苷酸基序的縮寫。歷史上,據(jù)研究BCG的DNA片段具有抗腫瘤作用。進(jìn)一步的研究顯示來源于BCG基因序列的合成的寡聚核苷酸可以(在體內(nèi)及體外)誘導(dǎo)免疫刺激效應(yīng)。這些研究的作者們總結(jié)認(rèn)為是這種含有中心CG基序的特定的回文序列具有這一活性。后來Krieg在出版物(自然374第546頁,1995)中闡明了CG基序在免疫刺激中的中心作用。具體的分析顯示CG基序必須存在于特定的序列環(huán)境中,同時(shí)也顯示這些序列在細(xì)菌DNA中普遍存在,但在脊椎動物DNA中卻罕見。
目前認(rèn)為這種進(jìn)化上的差異使得脊椎動物的免疫系統(tǒng)可以檢測到細(xì)菌DNA的存在(如感染時(shí)所發(fā)生的),從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)隨后即被激活。Krieg將該免疫刺激序列定義為嘌呤嘌呤CG嘧啶嘧啶,其中CG基序未被甲基化。這六種核苷酸以特定的形式結(jié)合呈現(xiàn)出回文序列。這些基序中的幾種,或者是一種基序的重復(fù),或者是不同基序的結(jié)合,可以存在于同一寡聚核苷酸中。一種或幾種這些含有寡聚核苷酸的免疫刺激序列中的的存在可以激活不同的免疫細(xì)胞亞群,包括自然殺傷細(xì)胞(它產(chǎn)生干擾素γ并具有溶解細(xì)胞活性)和巨噬細(xì)胞(Wooldrige等89卷(8期),1977)。雖然其它含有未被甲基化的CpG的序列沒有這種共有序列,但它們現(xiàn)在已經(jīng)顯示出具有免疫調(diào)節(jié)活性。
本發(fā)明所提供的組合物含有可選地連接有一種具有T細(xì)胞表位的免疫融合配偶體的E6或/和E7或E6/E7融合蛋白,同時(shí)用含有具免疫調(diào)節(jié)活性的CpG的寡聚核苷酸輔助。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選形式中,該免疫融合配偶體是來源于嗜血流感病毒B的蛋白D。優(yōu)選的是含有蛋白D的大約前1/3部分的該蛋白的衍生物,尤其是大約N-端的前100-110個(gè)氨基酸。蛋白D可能脂質(zhì)化(脂蛋白D)。其它的免疫融合配偶體包括來源于流感病毒的非結(jié)構(gòu)性蛋白NS1(血凝素)。典型地,使用的是N端的81個(gè)氨基酸,雖然也可使用不同的片段,只要它們含有T輔助細(xì)胞的表位。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,免疫融合配偶體是已知為LYTA的蛋白。優(yōu)選地使用該分子的C端部分。Lyta來源于肺炎鏈球菌,肺炎鏈球菌合成一種N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶,酰胺酶LYTA(由lytA基因編碼{基因43(1986)265-272頁}),它是一種自溶血素,特定地降解肽聚糖骨架中特定的鍵。LYTA蛋白的C端區(qū)域負(fù)責(zé)與膽堿或與一些膽堿的類似物如DEAE親和性。這種性質(zhì)已經(jīng)被用于發(fā)展對表達(dá)融合蛋白有用的大腸桿菌C-LYTA表達(dá)質(zhì)粒。在氨基端含有C-LYTA片段的雜種蛋白的純化已經(jīng)被公布{生物技術(shù)10,(1992)第795-798頁}。本說明書中所述的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例利用了Lyta分子中起始于第178位殘基的C末端重復(fù)片段。一種特別優(yōu)選的形式是包括第188-305位上的殘基。
因此,本發(fā)明在優(yōu)選的實(shí)施例中提供了包括一種具免疫調(diào)節(jié)活性的CpG寡聚核苷酸以及一種融合蛋白的組合物,融合蛋白包括-來源于HPV16的蛋白D-E6、來源于HPV16的蛋白D-E7、來源于HPV18的蛋白D-E7、來源于HPV18的蛋白D-E6、以及來源于HPV16和18的蛋白D-E6E7。優(yōu)選的蛋白D的片段含有蛋白D的前1/3部分??梢岳斫庥闷渌腅6和E7蛋白是來源于其它的HPV亞型。
本發(fā)明中所使用的蛋白優(yōu)選地在大腸桿菌中表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所表達(dá)的蛋白尾部含有5到9個(gè)組氨酸,優(yōu)選的是6個(gè)組氨酸殘基。這對于幫助純化是有利的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,蛋白E7在rb(成視網(wǎng)膜瘤基團(tuán)產(chǎn)物)的結(jié)合位點(diǎn)上帶有一處或幾處突變,因此排除了任何潛在的轉(zhuǎn)化能力。對于HPV16 E7,優(yōu)選的突變包括甘氨酸取代半胱氨酸24、或谷氨酰胺取代谷氨酸26。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,E7蛋白含有這兩種突變。
HPV18 E7的優(yōu)選的突變包括甘氨酸取代半胱氨酸27和/或谷氨酰胺取代谷氨酸29。優(yōu)選的也是兩種突變均存在。
一處或兩處突變也可引入E6的p53區(qū)域以排除任何潛在的轉(zhuǎn)化能力。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中,提供了來源于HPV并且連接有一種免疫融合配偶體,以及一種具免疫調(diào)節(jié)活性的CpG寡聚核苷酸的E6E7融合蛋白。
本發(fā)明中的疫苗優(yōu)選地誘導(dǎo)TH1型免疫應(yīng)答。
兩種主要類型的T輔助細(xì)胞已經(jīng)被定性為TH1和TH2,它們的不同在于所分泌的細(xì)胞因子的類型。這些細(xì)胞因子可以被認(rèn)為是產(chǎn)生2種不同類型的免疫應(yīng)答的背后的驅(qū)動力量TH1型的免疫應(yīng)答與細(xì)胞調(diào)節(jié)的效應(yīng)機(jī)制相關(guān),如T-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子INF-γ和IL-2。INF-γ可以依次激活其它細(xì)胞并誘導(dǎo)它們分泌其它重要的細(xì)胞因子和介質(zhì)(INF-γ激活的NK細(xì)胞產(chǎn)生IL12),IL-2激活的NK細(xì)胞轉(zhuǎn)化成淋巴激活素激活的殺傷細(xì)胞(LAK),INF-γ激活的巨噬細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)如TNFα、IL1、IL6以及釋放一氧化氮,IL2可以為抗原特異性、組織適合抗原限制性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的分化提供幫助。在抗體水平上,小鼠中的Th1型免疫應(yīng)答也與IgG2同型的抗體的產(chǎn)生相關(guān)(IgG2a在Balb/c小鼠中,IgG2b在C57BL/6小鼠中)。
Th2型的免疫應(yīng)答與針對抗原的體液免疫應(yīng)答相關(guān),它通過產(chǎn)生諸如IL4、IL5、IL6、IL10的細(xì)胞因子,以及通過產(chǎn)生廣范圍的免疫球蛋白同型(在小鼠中包括IgG1、IgA、以及IgM)來完成。
在人體中,Th1和Th2型的免疫應(yīng)答的區(qū)別不是絕對的。個(gè)體將支持一種主要為Th1或主要為Th2免疫應(yīng)答。然而,人們經(jīng)常簡便地以Mosmann和Coffinan(Mosman T.R.和Coffinan,R.L.(1989)TH1和TH2細(xì)胞淋巴因子分泌的不同類型導(dǎo)致不同的功能特性,免疫學(xué)年評,7,第145-173頁)在鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆中所描述的觀點(diǎn)來考慮細(xì)胞因子家族。
在人類,TH1類型的應(yīng)答也與細(xì)胞因子(IFNg和IL2)的出現(xiàn)相關(guān),最后與CT1和IgG2同型的出現(xiàn)相關(guān),在小鼠中對應(yīng)的為IgG1型抗體。
這種類型1的表型在防護(hù)抵御病毒和細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌感染以及在癌癥的治療中具有特別的重要性。
為了通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明中所使用的蛋白,可以使用的表達(dá)策略包括E7、E6的融合物或E6/E7融合有來自嗜血流感病毒B的蛋白D的N端1/3部分(一種提供T輔助細(xì)胞的表位的免疫融合配偶體)。在融合蛋白的羧基末端設(shè)計(jì)一段具親和力的聚組氨酸標(biāo)志,以簡化純化方法。這種重組抗原在大腸桿菌中以不溶蛋白的形式過量表達(dá)。
本發(fā)明中的蛋白可與反式硫氧還原蛋白(TIT)共同表達(dá)。反式硫氧還原蛋白的共表達(dá)相對于順式,在不需要蛋白酶的情況下保持硫氧還原蛋白不具抗原性是優(yōu)選的。硫氧還原蛋白的共表達(dá)使本發(fā)明中的蛋白的溶解變得容易。硫氧還原蛋白的共表達(dá)對蛋白純化產(chǎn)量和已純化蛋白的溶解度和特性中也有重要影響。
依據(jù)本發(fā)明,可復(fù)制的表達(dá)載體的制備可以通過裂解一種適合于宿主細(xì)胞的載體以提供一段具有一個(gè)完整復(fù)制子的線性DNA片段,以及將上述線性片段與一種或幾種DNA分子結(jié)合,在連接的條件下,該DNA分子與上述線性片段一起編碼所需的產(chǎn)物,如編碼本發(fā)明中的蛋白DNA聚合體或其衍生物。
因此,該DNA聚合體可以預(yù)先形成或在載體構(gòu)建的過程中形成,依需要而定。
載體的選擇一部分由宿主細(xì)胞決定,其可以為原核或真核生物,但優(yōu)選的是大腸桿菌。合適的載體包括質(zhì)粒、噬菌體、粘?;蛑亟M病毒。
可復(fù)制的表達(dá)載體制備的進(jìn)行,可以依慣例加入適當(dāng)?shù)拿敢韵拗艱NA的聚合及連接,通過此處所描述的程序進(jìn)行,例如,以上所引用的Maniatis等。
依據(jù)本發(fā)明,重組體宿主細(xì)胞的制備是在轉(zhuǎn)化條件下,將本發(fā)明中的可復(fù)制的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。合適的轉(zhuǎn)化條件是常規(guī)的及此處所描述的,例如,以上所引用的Maniatis等,或“DNA克隆”Vol.Ⅱ,D.M.Glover ed_IRL Press Ltd,1985。
轉(zhuǎn)化條件的選擇由宿主細(xì)胞決定。因此,細(xì)菌宿主如大腸桿菌可以用CaCl2溶液處理(Cohen等,美國國家科學(xué)院院報(bào),1973,69,2110),或者用含有RbCl、MnCl2醋酸鉀和甘油混合物的溶液處理,然后用3-[N-嗎啉]-丙烷-磺酸、RbCl和甘油處理。培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以通過載體DNA的鈣共同沉淀反應(yīng)進(jìn)入細(xì)胞中。本發(fā)明也提供了一種經(jīng)過本發(fā)明中的一種可復(fù)制的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在允許DNA聚合體表達(dá)的條件下培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞采用的是常規(guī)方法,如此處所描述的,例如,以上所引用的Maniatis等以及“DNA克隆”。因此,優(yōu)選的是細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)充分,并在50℃以下培養(yǎng)。
產(chǎn)品的回收依據(jù)宿主細(xì)胞采用常規(guī)方法。因此,當(dāng)宿主細(xì)胞是細(xì)菌,如大腸桿菌時(shí),可能需要通過物理的、化學(xué)的或酶解的方法將該細(xì)胞溶解并從所得的裂解物中分離蛋白質(zhì)產(chǎn)物。當(dāng)宿主細(xì)胞是哺乳動物的細(xì)胞時(shí),產(chǎn)物通常可從營養(yǎng)培養(yǎng)基或無細(xì)胞抽提液中分離。常規(guī)的蛋白分離技術(shù)包括選擇沉淀、吸附層析和親和層析(包括單克隆抗體親和柱)。
當(dāng)本發(fā)明中的蛋白質(zhì)以帶有組氨酸標(biāo)志(His tag)的形式表達(dá)時(shí)。該蛋白的純化可以簡便地采用親和層析,使用一種離子金屬親和層析柱(IMAC)進(jìn)行。
層析的第二步驟,如Q-瓊脂糖凝膠可以在IMAC柱之前或之后使用以得到高度純化的蛋白。如果免疫融合蛋白是C-LYTA,可能可以利用CLYTA對膽堿和/或DEAE的親和性來純化該產(chǎn)物。含有C-LYTA及其組氨酸標(biāo)簽的產(chǎn)物可以簡便有效地在兩步過程內(nèi)完成純化,該過程含有不同的親和層析。一步包括組氨酸標(biāo)志對IMAC柱的親和力,另一步包括LYTA的C端區(qū)域?qū)δ憠A或DEAE的親和力。
一種優(yōu)選的疫苗組合物至少包括來源于蛋白D-HPV16的E6或其衍生物以及蛋白D-HPV16的E7??蛇x擇地,E6和E7可以以單個(gè)分子的形式存在,優(yōu)選的是以蛋白D E6/E7融合物的形式存在。這種疫苗可以可選地含有來源于HPV18的E6或E7蛋白或二者均含有,優(yōu)選的是以蛋白D-E6或蛋白D-E7的融合蛋白或蛋白D E6/E7的融合蛋白的形式存在。本發(fā)明中的疫苗可能含有來源于HPV16或18的其它HPV抗原。尤其是疫苗可能含有L1或L2抗原單體??蛇x擇地,這種L1或L2抗原可以共同以病毒樣顆粒形式存在,或者單獨(dú)的L1蛋白以病毒樣顆?;驓ち=Y(jié)構(gòu)的形式存在。這些抗原(病毒樣顆粒和殼粒)本身是已知的。如見實(shí)施例WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792、以及WO93/02184。附加的早期蛋白可能包括如E2或優(yōu)選的是,如E5。本發(fā)明中的疫苗還可包括來源于其它HPV株系的抗原,優(yōu)選的是來源于HPV株系6、11、31或33。
疫苗的制備大致如疫苗設(shè)計(jì)-亞單位和佐劑方法(Powell andNewman編著)藥用生物技術(shù)Vol.6 Plenum Press 1995中所述。Fullerton描述了包裝在脂質(zhì)體中的方法,見美國專利第4,235,877號。
優(yōu)選的寡聚核苷酸優(yōu)選地含有被六個(gè)或更多的核苷酸分隔開的兩個(gè)或更多的CpG基序。本發(fā)明中的寡聚核苷酸典型地為脫氧核糖核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中,該寡聚核苷酸中的核苷酸間是二硫代磷酸酯鍵,或者更優(yōu)選的是硫代磷酸酯鍵,雖然磷酸二酯和其它核苷酸間的鍵也包括在本發(fā)明范圍內(nèi),包括具有混合的核苷酸間連接的寡聚核苷酸。
優(yōu)選的寡聚核苷酸具有以下序列該序列優(yōu)選地含有所有硫代磷酸酯修飾的核苷酸間連接。
寡聚核苷酸1TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT寡聚核苷酸2TCT CCC AGC GTG CGC CAT寡聚核苷酸3ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG本發(fā)明中所使用的CpG寡聚核苷酸可以通過本領(lǐng)域任何已知的方法進(jìn)行合成(如EP468520)。方便地,這種寡聚核苷酸可以使用一種自動合成儀進(jìn)行合成。生產(chǎn)硫代磷酸酯寡聚核苷酸或二硫代磷酸酯的方法如US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204中所描述。
本發(fā)明將通過參考以下實(shí)施例作進(jìn)一步的描述實(shí)施例1一種表達(dá)的融合蛋白-D1/3-E7-His(HPV16)的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1)-表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)-質(zhì)粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)是pMG81(英國專利申請編號n°951 3261.9,公布號為WO97/01640)的衍生物,其中來源于流感的NS1編碼區(qū)上的第4-81位密碼子被另一段密碼子取代,該密碼子相應(yīng)于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等,1991.傳染和免疫,一月,第119-125頁)的成熟蛋白D上的絲氨酸20→蘇氨酸127殘基。Prot-D 1/3的序列后跟隨一段多克隆位點(diǎn)(11個(gè)殘基)和一段編碼C-末端組氨酸標(biāo)志(6個(gè)組氨酸)的區(qū)域。這種質(zhì)粒用于表達(dá)融合蛋白D1/3-E7-His。
b)-HPV基因的E6和E7序列型HPV16(見Dorf等,病毒學(xué)1985,145,第181-185頁)從HPV16全長基因組中擴(kuò)增,在pBR322中克隆(從Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)中獲得,Referenzzentrumfür人病原乳頭瘤病毒-D 69120-Heidelberg),并亞克隆到pUC19中以得到TCA301(=pRIT14462)。
質(zhì)粒TCA308(=pRIT14501)的構(gòu)建一種表達(dá)融合蛋白-D1/3-E7-His的質(zhì)粒相應(yīng)于E7蛋白第1→98位氨基酸的核苷序列從pRIT14462中進(jìn)行擴(kuò)增。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中,在E7序列的5’和3’的末端構(gòu)造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位點(diǎn)、以使其可以插入質(zhì)粒PMGMCS Prot D1/3中相同的位點(diǎn),以獲得質(zhì)粒TCA308(=pRIT14501)。對插入進(jìn)行序列分析以確定在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中沒有修飾產(chǎn)生。融合蛋白-D1/3-E7-His (HPV16)序列的描述在序列編號1,編碼序列在序列編號2。
2)-AR58菌株的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pPIT14501導(dǎo)入大腸桿茵AR58(Mott等,1985,美國國家科學(xué)院院報(bào),8288)中,AR58為一種含有λpL啟動子的熱敏抑制子的缺陷型λ溶原性細(xì)菌。
3)-細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-Prot-D1/3-E7-His的表達(dá)通過質(zhì)粒pRIT14501轉(zhuǎn)化的AR58的細(xì)胞在含有50μgr/ml卡那霉素的100毫升LB培養(yǎng)基,30℃下生長。在細(xì)菌生長的對數(shù)期,將細(xì)茵轉(zhuǎn)為39℃以失活λ抑制子,打開蛋白D1/3-E7-His的合成。在39℃下的溫育持續(xù)4小時(shí)。將細(xì)菌離心沉淀并在-20℃下保存。實(shí)施例Ⅱ一種表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6-his/HPV16的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)質(zhì)粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)是pMG81(WO97/01640中所描述)的一種衍生物,其中來源于流感的NS1編碼區(qū)上的第4-81位密碼子被另一段密碼子取代,該密碼子相應(yīng)于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等,1991.感染和免疫,Jan.第119-125頁)的成熟蛋白D上的絲氨酸20→蘇氨酸127殘基。Prot-D 1/3的序列后跟隨一段多克隆位點(diǎn)(11個(gè)殘基)和一段編碼C-末端組氨酸標(biāo)志(6個(gè)組氨酸)的區(qū)域。這種質(zhì)粒用于表達(dá)融合蛋白D1/3-E6-His。
b)-HPV基因的E6和E7序列型HPV16(見Dorf等,病毒學(xué)1985,145,第181-185頁)從HPV16全長基因組中擴(kuò)增,在pBR322中克隆(從Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)中獲得,Referenzzentrumfür人病原乳頭瘤病毒-D 69120-Heidelberg),并亞克隆到pUC19中以得到TCA301(=pRIT14462)。
質(zhì)粒TCA 307(=pRIT14497)的構(gòu)建一種表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6-His/HPVI6的質(zhì)粒相應(yīng)于E6蛋白的第1→151位氨基酸的核苷酸序列從pRIT14462中進(jìn)行擴(kuò)增。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中,在E6序列的5’和3’的末端構(gòu)造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位點(diǎn)以使其可以插入質(zhì)粒pMGMCS Prot D1/3中相同的位點(diǎn),以獲得質(zhì)粒TCA307(=pRIT14497)。對插入進(jìn)行序列分析以確定在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中沒有修飾產(chǎn)生。融合蛋白-D1/3-E6-His的蛋白和編碼序列描述在序列編號3和4。
2.AR58菌株的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pPIT14497導(dǎo)入大腸桿菌AR58(Mott等,1985,美國科學(xué)院院報(bào),8288)中,AR58是一種含有λpL啟動子的熱敏抑制子的缺陷型λ溶原性細(xì)菌。
3.細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-Prot-D1/3-E6-His的表達(dá)通過質(zhì)粒pRIT14497轉(zhuǎn)化的AR58的細(xì)胞在100毫升添加50μgr/ml卡那霉素LB培養(yǎng)基,30℃下生長。在細(xì)菌生長的對數(shù)期,將細(xì)菌轉(zhuǎn)為39℃以失活λ抑制子,打開蛋白D1/3-E6-His的合成。在39℃下的溫育持續(xù)4小時(shí)。將細(xì)菌沉淀并在-20℃下保存。
4.融合蛋白D1/3-E6-his(HPV16)性質(zhì)的確定抽提物的制備溶解冰凍細(xì)胞并重懸在10毫升的PBS緩沖液中。細(xì)胞在一臺法國細(xì)胞壓力機(jī)SLM Aminco上以20,000磅/平方英寸(psi)(過三遍)進(jìn)行破碎。抽提物在4℃下,以16,000g離心30分鐘。
考馬斯亮藍(lán)-染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠和蛋白質(zhì)印跡的分析在對以上所描述的抽提物進(jìn)行離心之后,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡對上清液和沉淀部分進(jìn)行分析。
定位于沉淀部分、約32kDa的主要條帶的顯象是通過考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠,其鑒定是在蛋白質(zhì)印跡上通過兔的多克隆抗-蛋白-D抗體以及通過Ni-NTA綴合物,Ni-NTA綴合物連接有牛小腸堿性磷酸酶(Qiagencat.n°345 10),它可以檢測易受影響的組氨酸標(biāo)志。表達(dá)水平代表總體蛋白的約5%。
5.與硫氧還原蛋白的共同表達(dá)在與來源于HPV18的蛋白D1/3 E7 His的表達(dá)相似的模式中(實(shí)施例Ⅸ),用編碼硫氧還原蛋白和蛋白D1/3 E7 His (HPV16)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株AR58。
實(shí)施例Ⅲ一種表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6E7-his/HPV16的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)質(zhì)粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)是pMG81(上面所描述)的一種衍生物,其中來源于流感的NS1編碼區(qū)上的第4-81位密碼子被另一段密碼子取代,該密碼子相應(yīng)于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等,1991.傳染和免疫,1月第119-125頁)的天然蛋白D上的絲氨酸20→蘇氨酸127殘基。Prot-D 1/3的序列后跟隨一段多克隆位點(diǎn)(11個(gè)殘基)和一段編碼C-末端組氨酸標(biāo)志(6個(gè)組氨酸)的區(qū)域。這種質(zhì)粒用于表達(dá)融合蛋白D1/3-E6E7-his。
b)HPV基因的E6和E7序列型HPV16(見Dorf等,病毒學(xué)1985,145,第181-185頁)從HPV16全長基因組中擴(kuò)增,在pBR322中克隆(從Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)中獲得,Referenzzentrumfür人病原乳頭瘤病毒-D 69120-Heidelberg),并亞克隆到pUC 19中以得到TCA 301(=pRIT14462)。
c)在TCA301(=pRIT 14462)中編碼E6和E7的序列通過一段合成的寡聚核苷酸接頭(adaptor)(在AflⅢ and NsiⅠ位點(diǎn)之間插入)以使E6和E7基因間的5個(gè)核苷酸化被剔除,從而在質(zhì)粒TCA309(=pRIT 14556)中除去E6的終止子和產(chǎn)生融合的E6和E7編碼序列。
質(zhì)粒TCA311(=pRIT14512)的構(gòu)建一種表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6E7-His/HPVI6的質(zhì)粒相應(yīng)于融合蛋白E6E7的第1→249位氨基酸殘基的核苷酸序列從pRIT14556中進(jìn)行擴(kuò)增。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中,在E6E7融合序列的5’和3’的末端構(gòu)造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位點(diǎn),以使其可以插入質(zhì)粒PMGMCS Prot D1/3中相同的位點(diǎn)上,以獲得質(zhì)粒TCA311(=pRIT14512)。對插入序列進(jìn)行序列分析以確保在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中沒有修飾產(chǎn)生。融合蛋白-D1/3-E6E7 1/3-His的蛋白和編碼序列的描述在序列編號5和6。
2.AR58菌株的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pPIT14512導(dǎo)入大腸桿菌AR58(Mott等,1985,美國國家科學(xué)院院報(bào),8288)中,AR58為一種含有λpL啟動子的熱敏抑制子的缺陷型λ溶原性細(xì)菌。
3.細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-Prot-D1/3-E6E7-His的表達(dá)通過質(zhì)粒pRIT14512轉(zhuǎn)化的AR58的細(xì)胞在100毫升LB培養(yǎng)基,30℃下補(bǔ)充50μgr/ml卡那霉素。在細(xì)菌生長的對數(shù)期,將溫度轉(zhuǎn)為39℃以失活λ抑制子,打開蛋白D1/3-E6E7-his的合成。在39℃下的溫育持續(xù)4小時(shí)。將細(xì)菌沉淀并在-20℃下保存。
4.融合蛋白D1/3-E6E7-his性質(zhì)的確定溶解冰凍細(xì)胞并重懸在10毫升的磷酸緩沖液中。細(xì)胞在一臺法國壓力細(xì)胞壓碎機(jī)SLM Aminco上以20,000磅/平方英寸(psi)(過三遍)進(jìn)行破碎。抽提物在4℃下以16,000g持續(xù)離心30分鐘。
在對以上所描述的抽提物進(jìn)行離心之后,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、約48kDa的主要條帶的顯象是通過考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠,其鑒定是在蛋白質(zhì)印跡上通過兔的多克隆抗-蛋白-D以及Ni-NTA綴合物,Ni-NTA綴合物連接有牛小腸堿性磷酸酶(Qiagen cat.n°34510),它可以檢測易受影響的組氨酸標(biāo)志。表達(dá)水平占總體蛋白的約1%。實(shí)施例Ⅳ在一種相似的模式中,脂蛋白D1/3和來源于HPV16的E6-E7的融合蛋白在硫氧還原蛋白存在的情況下在大腸桿菌中表達(dá)。
在前蛋白(388個(gè)氨基酸)的N-端含有MDP殘基,其后跟隨有脂蛋白D(來源于流感嗜血菌)16個(gè)氨基酸的信號肽部分,其在體內(nèi)被切除以得到成熟的蛋白質(zhì)(370個(gè)氨基酸)。脂蛋白部分(第1到127位氨基酸)后跟有以融合物形式存在的蛋白E6和E7。該蛋白的C末端由TSGHHHHHH延伸。實(shí)施例Ⅴ表達(dá)融合蛋白D1/3-E7的大腸桿菌菌株B1002的構(gòu)建突變型(cys24→gly,glu26→gln)的HPV161)-表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建起始材料a)-質(zhì)粒pRIT 14501(=TCA 308),編碼融合蛋白D1/3-E7-Hisb)-質(zhì)粒LITMUS 28(New England Biolabs cat n°306-328),由一種克隆載體pUC衍生而來。
c)-質(zhì)粒pMG MCS ProtD1/3(pRIT 14589),一種pMG81(如上面所描述)的衍生物,其中來源于流感的NS1編碼區(qū)上的第4-81位密碼子被另一段密碼子取代,該密碼子相應(yīng)于流感嗜血菌株系772、生物型2 (H.Janson等,1991.傳染和免疫,1月第119-125頁)的成熟蛋白D上的絲氨酸20→蘇氨酸127殘基。蛋白-D 1/3的序列后跟隨一段多克隆位點(diǎn)(11個(gè)殘基)和一段編碼C-末端組氨酸標(biāo)志(6個(gè)組氨酸)的區(qū)域。質(zhì)粒pRIT 14733(=TCA347)的構(gòu)建一種表達(dá)具有組氨酸標(biāo)志突變型(cys24→gly,glu26→gln)的融合蛋白-D1/3-E7的質(zhì)粒pRIT 14501(=TCA308)中的NcoⅠ-XbaⅠ片段帶有HPV16中E7基因編碼序列并由一段組氨酸標(biāo)志延伸,它在一種有利于誘發(fā)突變得到PRIT14909(=TCA337)的中間載體Litmus28中進(jìn)行亞克隆。選擇雙突變cys24→gly(Edmonds和Vousden病毒學(xué)雜志632650,1989)和glu26→gln(Phelps等病毒學(xué)雜志662418-27,1992)是為了減弱對成視網(wǎng)膜瘤基團(tuán)(pRB)的抗腫瘤基因產(chǎn)物的結(jié)合。用定點(diǎn)誘變快速變化位點(diǎn)試劑盒(Stratagene cat n°200518)在E7基因中引入突變,以傳遞給質(zhì)粒pRIT 14681(=TCA343)。在通過序列分析確定完整E7基因的突變和完整性的存在后,將突變的E7基因?qū)胼d體pRIT14589(=pMG MCS ProtD 1/3)中以得到質(zhì)粒PRIT14733(=TCA347)的蛋白和編碼序列。
融合蛋白-D1/3-E 7突變體(cys24→gly,glu26→gln)-His的序列描述在序列編號7和8中。
2)-表達(dá)蛋白D1/3-E7突變型(cys24→gly,glu26→gln)-His/HPV16的菌株B1002的構(gòu)建質(zhì)粒pRIT14733被導(dǎo)入大腸桿菌AR58(Mott等,1985,美國國家科學(xué)院院報(bào),8288)中,AR58是一種含有γpL啟動子的熱敏抑制子的缺損的γ溶原性細(xì)菌,通過篩選抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化體以得到菌株B1002。
3)-細(xì)菌菌株B1002的生長和誘導(dǎo)-蛋白D1/3-E7突變體(cys24→gly,glu26→gln)-His/HPV16的表達(dá)通過質(zhì)粒pRIT14733(B1002菌株)轉(zhuǎn)化的AR58的細(xì)胞在100毫升LB培養(yǎng)基,30℃下補(bǔ)充50μgr/ml的卡那霉素下生長。在細(xì)菌生長的對數(shù)期,將溫度轉(zhuǎn)為39℃以失活λ抑制子,打開蛋白D1/3-E7突變體-His/HPV16的合成。在39℃下的溫育持續(xù)4小時(shí)。將細(xì)菌沉淀并在-20℃下保存。
4)-融合蛋白D1/3-E7突變體(cys24→gly,glu26→gln)-His型HPV16的性質(zhì)的確定溶解冰凍細(xì)胞并重懸在10毫升的磷酸緩沖液中。細(xì)胞在一臺法國壓力細(xì)胞壓碎機(jī)SLM Aminco上以20,000磅/平方英寸(psi)(過三遍)進(jìn)行破碎。抽提物在4℃下以16,000g持續(xù)離心30分鐘。
在對以上所描述的抽提物進(jìn)行離心之后,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、約33kDa的主要條帶的顯象是通過考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠,其鑒定是在蛋白質(zhì)印跡上通過兔的多克隆22J70抗-蛋白-D,通過來源于酵母的單克隆抗E7/HPV16以及通過Ni-NTA綴合物,Ni-NTA綴合物連接有牛小腸堿性磷酸酶(Qiagen cat.n°34510),它可以檢測易受影響的組氨酸標(biāo)志。表達(dá)水平代表總體蛋白的約3至5%。
B1002的細(xì)胞通過離心從培養(yǎng)液中分離出來。濃縮的B1002的細(xì)胞在-65℃下保存。
實(shí)施例Ⅵ一種表達(dá)融合物clyta-E6-his(HPV16)的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)-質(zhì)粒pRIT 14497(=TCA307),其編碼融合蛋白D1/3-E6-His/HPV16b)-質(zhì)粒pRIT14661(=DVA2),一種含有肺炎鏈球菌LytA的117個(gè)C-端密碼子的編碼序列。Lyta來源于肺炎鏈球菌,它合成一種N-乙酰L-丙氨酸酰胺酶,酰胺酶LYTA(由lytA基因編碼{基因,43(1986)第265-272頁})是一種自溶素,尤其可以降解肽聚糖主鏈上特定的鍵。LYTA蛋白的C-端區(qū)域負(fù)責(zé)與膽堿或與一些膽堿的類似物如DEAE的親和力。
1.b質(zhì)粒pRIT14634(=TCA332)的構(gòu)建一種表達(dá)融合物clyta-E6-His/HPV16的質(zhì)粒a)第一步是從質(zhì)粒pRIT14497中純化NcoⅠ-AflⅡ限制酶切大片段,以及從pRIT14661中純化小的AflⅡ-AflⅢ限制酶切片段b)第二步是將clyta序列連接到E7-His序列中(Ncol和AFlⅢ是兼容的限制酶切位點(diǎn)),從而得到質(zhì)粒pRIT14634(=TCA332),在pL啟動子的控制下編碼融合蛋白clyta-E6-His。
融合蛋白clyta-E6-His的蛋白和編碼序列是所描述的序列編號9和10。
AR58菌株的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pRIT14634被導(dǎo)入大腸桿菌AR58(Mott等,1985,美國國家科學(xué)院院報(bào),8288)中,AR58是一種含有γpL啟動子的熱敏抑制子的缺損的γ溶原性細(xì)菌中。
細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-clyta-E6-His的表達(dá)通過質(zhì)粒pRIT14634轉(zhuǎn)化的AR58細(xì)胞在100毫升LB培養(yǎng)基,30℃下補(bǔ)充50μgr/ml的卡那霉素中培養(yǎng)。在細(xì)菌生長的對數(shù)期,將溫度轉(zhuǎn)為39℃以失活λ抑制子,打開蛋白clyta-E6-his的合成。在39℃下的溫育持續(xù)4小時(shí)。將細(xì)菌沉淀并在-20℃下保存。
4.融合物clyta-E6-his的性質(zhì)的確定溶解冰凍細(xì)胞并重懸在10毫升的磷酸緩沖液中。細(xì)胞在一臺法國壓力細(xì)胞壓碎機(jī)SLM Aminco上以20,000磅/平方英寸(psi)(過三遍)進(jìn)行破碎。抽提物在4℃下以16,000g持續(xù)離心30分鐘。在對以上所描述的抽提物進(jìn)行離心之后,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、約33kDa的主要條帶的顯象是通過考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠,其鑒定是在蛋白質(zhì)印跡上通過兔的多克隆抗-clyta-抗體以及通過Ni-NTA綴合物,Ni-NTA綴合物連接有牛小腸堿性磷酸酶(Qiagen cat.n°34510),它可以檢測易受影響的組氨酸標(biāo)志。表達(dá)水平代表總體蛋白的約3%。
實(shí)施例Ⅶ一種表達(dá)融合物clyta-E7-his (HPV16)的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.a(chǎn)起始材料a)-質(zhì)粒pRIT14501(=TCA308),編碼融合物Prot D 1/3-E7-his/HPV16b)-質(zhì)粒pRIT14661(=DVA2),一種含有來源于肺炎鏈球菌的LytA的117個(gè)C端密碼子的編碼序列。
1.b質(zhì)粒pRIT14626(=TCA330)的構(gòu)建一種表達(dá)融合物clyta-E7-his/HPV16的質(zhì)粒a)第一步是從質(zhì)粒pRIT14501中純化大的NcoⅠ-AflⅡ限制酶切片段,以及pRIT14661中純化小的AflⅡ-AflⅢ限制酶切片段b)第二步是將clyta序列連接到E7-His序列中(Ncol和AFlⅢ是兼容的限制酶切位點(diǎn)),從而得到質(zhì)粒pRIT14626(=TCA330),在pL啟動子的控制下編碼融合蛋白clyta-E7-His。
融合蛋白clyta-E7-His的蛋白和編碼序列的描述的在序列編號11和12中。
2.AR58菌株的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pRIT14626被導(dǎo)入大腸桿菌AR58(Mott等,1985,美國國家科學(xué)院院報(bào),8288)中,AR58是一種含有γpL啟動子的熱敏抑制子的缺損的γ溶原性細(xì)菌。
3.細(xì)菌茵株的生長和誘導(dǎo)-clyta-E7-His的表達(dá)通過質(zhì)粒pRIT14626轉(zhuǎn)化的AR58的細(xì)胞在100毫升補(bǔ)充有50μgr/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)基,30℃下生長。在細(xì)菌生長的對數(shù)期,將溫度轉(zhuǎn)為39℃以失活λ抑制子,打開蛋白clyta-E7-his的合成。在39℃下的溫育持續(xù)4小時(shí)。將細(xì)菌沉淀并在-20℃下保存。
4.融合物clyta-E7-his的性質(zhì)的確定溶解冰凍細(xì)胞并重懸在10毫升的磷酸緩沖液中。細(xì)胞在一臺法國壓力細(xì)胞壓碎機(jī)SLM Aminco上以20,000磅/平方英寸(psi)(過三遍)進(jìn)行破碎。抽提物在4℃下以16,000g持續(xù)離心30分鐘。在對以上所描述的抽提物進(jìn)行離心之后,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、約35kDa的主要條帶的顯象是通過考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠,其鑒定是在蛋白質(zhì)印跡上通過兔的多克隆抗-clyta-抗體以及通過Ni-NTA綴合物,Ni-NTA綴合物連接有牛小腸堿性磷酸酶(Qiagen cat.n°345 10),它可以檢測易受影響的組氨酸標(biāo)志。表達(dá)水平代表總體蛋白的約5%。實(shí)施例Ⅷ一種表達(dá)融合物clyta-E6E7-his(HPV16)的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
1.a(chǎn)起始材料a)-質(zhì)粒pRIT14512(=TCA311),它編碼融合蛋白D1/3-E6E7-His/HPV16b)-質(zhì)粒pRIT14661(=DVA2),一種含有來源于肺炎鏈球菌的LytA的117個(gè)C端密碼子的編碼序列。
1.b質(zhì)粒pRIT14629(=TCA331)的構(gòu)建一種表達(dá)融合物clyta-E6E7-his/HPV16的質(zhì)粒a)第一步是從質(zhì)粒pRIT14512中純化大的NcoⅠ-AflⅡ限制酶切片段,以及pRIT14661中純化小的AflⅠ-AflⅢ限制酶切片段b)第二步是將clyta序列連接到E7-His序列中(Ncol和AFlⅡ是合適的限制酶切位點(diǎn)),從而得到質(zhì)粒pRIT 14629(=TCA331),在pL啟動子的控制下編碼融合蛋白clyta-E6E7-His。
融合蛋白clyta-E6E7-His的蛋白和編碼序列是序列編號13和14。
2.AR58菌株的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pRIT14629被導(dǎo)入大腸桿菌AR58(Mott等,1985,美國國家科學(xué)院院報(bào),8288)中,AR58是一種含有γpL啟動子的熱敏抑制子的缺損的γ溶原性細(xì)菌。
3.細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-clyta-E6E7-His的表達(dá)通過質(zhì)粒pRIT14629轉(zhuǎn)化的AR58的細(xì)胞,在100毫升補(bǔ)充有50μgr/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)基,30℃下生長。在細(xì)菌生長的對數(shù)期,將溫度轉(zhuǎn)為39℃以失活λ抑制子,打開蛋白clyta-E6E7-his的合成。在39℃下的溫育持續(xù)4小時(shí)。將細(xì)菌沉淀并在-20℃下保存。
4.融合物clyta-E6E7-his的性質(zhì)確定溶解冰凍細(xì)胞并重懸在10毫升的磷酸緩沖液中。細(xì)胞在一臺法國壓力細(xì)胞壓碎機(jī)SLM Aminco上以20,000磅/平方英寸(psi)(過三遍)進(jìn)行破碎。抽提物在4℃下以16,000g持續(xù)離心30分鐘。
在對以上所描述的抽提物進(jìn)行離心之后,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、約48kDa的主要條帶的顯象是通過考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠,其鑒定是在蛋白質(zhì)印跡上通過兔的多克隆抗-clyta-抗體以及通過Ni-NTA綴合物,Ni-NTA綴合物連接有牛小腸堿性磷酸酶(Qiagen cat.n°34510),它可以檢測易受影響的組氨酸標(biāo)志。表達(dá)水平代表總體蛋白的約1%。實(shí)施例Ⅸ蛋白D1/3E7 his(HPV18)(大腸桿菌B1011)蛋白D1/3 E7 his HPV與反式硫氧還原蛋白共同表達(dá)(大腸桿菌B1012)1)-表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1).a.質(zhì)粒TCA316(pRIT14532)的構(gòu)建一種表達(dá)融合蛋白D1/3-E7-his/HPV18的質(zhì)粒起始材料a)-質(zhì)粒pMG MCS ProtD1/3(pRIT14589)是pMG81(如英國專利申請編號n°951 3261.9中所描述,發(fā)表為WO97/01640)的一種衍生物,其中來源于流感的NS1編碼區(qū)上的第4-81位密碼子被另一段密碼子取代,該密碼子相應(yīng)于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等,1991.傳染和免疫,1月第119-125頁)的成熟蛋白D上的絲氨酸20→蘇氨酸127殘基。蛋白-D1/3的序列后跟隨一段多克隆位點(diǎn)(11個(gè)殘基)和一段編碼C-末端組氨酸標(biāo)志(6個(gè)組氨酸)的區(qū)域。用該質(zhì)粒表達(dá)融合蛋白D1/3-E7-hisb)HPV基因的E6和E7序列原型HPV18(Cole等,分子生物學(xué)雜志(1987)193,599-608)從HPV16全長基因組中擴(kuò)增,在pBR322中克隆(從Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)中獲得,Referenzzentrumfür人病原乳頭瘤病毒-D69120-Heidelberg),并亞克隆到pUC19中以得到TCA302(=pRIT14467)。
質(zhì)粒TCA316(=pRIT14532)的構(gòu)建相應(yīng)于蛋白E7的第1→105位氨基酸的核苷酸序列從pRIT14467中進(jìn)行擴(kuò)增。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中,在E7融合序列的5’和3’的末端構(gòu)造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位點(diǎn)以使其可以插入質(zhì)粒PMGMCS Prot D1/3中相同的位點(diǎn)上,以獲得質(zhì)粒TCA316(=pRIT14532)。對插入序列進(jìn)行序列分析,鑒定出E7基因上存在相對于E7/HPV18原型序列的修飾(核苷酸128位上G→A),由此引起一個(gè)甘氨酸被一個(gè)谷氨酸的取代(E7的第43位氨基酸,融合蛋白的第156位)。融合蛋白-D1/3-E7-His/HPV18的蛋白和編碼序列的列于序列編號15和序列編號16。
1).b.質(zhì)粒TCA313(=pRIT14523)的構(gòu)建一種表達(dá)硫氧還原蛋白的質(zhì)粒起始材料a)-質(zhì)粒pBBRlMCS4(Antoine R.和C.Locht,分子微生物學(xué)1992,6,1785-1799;M.E.Kovach等生物技術(shù)16,(5),800-802),它可以與含有ColEⅠ或P15a復(fù)制起始點(diǎn)的質(zhì)粒兼容。
b)-質(zhì)粒pMG42(如WO93/04175中所描述)含有λ噬菌體的啟動子pL的序列。
c)-質(zhì)粒pTRX(Invitrogcn,kit Thiofusion K350-01),帶有跟隨有AspA轉(zhuǎn)錄終止子的硫氧還原蛋白的編碼序列。
質(zhì)粒TCA313(=pRIT14523)的構(gòu)建帶有pL啟動子的來源于pMG42的EcoRl-Ndel片段,和來源于PTRX、帶有跟隨有AspA終止子的硫氧還原蛋白的編碼區(qū)的Ndel-HindⅢ片段,將二者純化并連接到質(zhì)粒載體pBBRlMCS4的EcoRⅠ和HindⅢ位點(diǎn)上以獲得質(zhì)粒TCA313(=pRIT14523)。
硫氧還原蛋白的編碼序列的描述在序列編號17。
2)-AR58菌株的轉(zhuǎn)化2).a.獲得表達(dá)蛋白D1/3-E7-His/HPVI8的菌株B1011將質(zhì)粒pRIT14532導(dǎo)入大腸桿菌AR58(Mott等,1985,美國國家科學(xué)院院報(bào),8288)中,AR58為一種含有γpL啟動子的熱敏抑制子的缺損的γ溶原性細(xì)菌,通過抗卡那霉素篩選轉(zhuǎn)化體。
2).b.表達(dá)ProtD1/3-E7-His/HPVI8和硫氧還原蛋白的菌株B1012的構(gòu)建將質(zhì)粒pRIT14532和pRIT14523導(dǎo)入大腸桿菌AR58(Mott等,1985,美國國家科學(xué)院院報(bào),8288)中,AR58為一種含有γpL啟動子的熱敏抑制子的缺損的γ溶原性細(xì)菌,通過抗卡那霉素和氨芐青霉素雙重篩選轉(zhuǎn)化體。
3)細(xì)菌菌株B1011和B1012的生長和誘導(dǎo)-沒有或有反式硫氧還原蛋白的蛋白D1/3-E7-His/HPV18的表達(dá)通過質(zhì)粒pRIT14532轉(zhuǎn)化的AR58的細(xì)胞(B1011株系)和通過質(zhì)粒pRIT14532及pRIT14523轉(zhuǎn)化的AR58的細(xì)胞(B1012株系)在30℃下100毫升LB培養(yǎng)基中生長,并對B1011株系補(bǔ)充50μgr/ml的卡那霉素,對B1012株系補(bǔ)充50μgr/ml的卡那霉素和100μgr/ml的氨芐青霉素。在細(xì)菌生長的對數(shù)期,將溫度轉(zhuǎn)為39℃以失活λ抑制子,打開蛋白D1/3-E7-his/HPV18及硫氧還原蛋白的合成。在39℃下的溫育持續(xù)4小時(shí)。
融合蛋白D1/3-E7-his/HPV18的性質(zhì)的確定抽提物的制備溶解冰凍細(xì)胞并重懸在10毫升的磷酸緩沖液中。細(xì)胞在一臺法國壓力細(xì)胞壓碎機(jī)SLM Aminco上以20.000磅/平方英寸(psi)(過三遍)進(jìn)行破碎。抽提物在4℃下以16,000g持續(xù)離心30分鐘。
對考馬斯亮藍(lán)-染色的聚丙烯酰胺凝膠和蛋白質(zhì)印跡的分析在對以上所描述的抽提物進(jìn)行離心之后,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析所得到的上清液和沉淀部分。
融合蛋白D1/3-E7-His(約31kDa)通過考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠進(jìn)行顯象,在微粒部分為菌株B1011和一部分(30%)定位于上清液中的為菌株B1012,其鑒定是在蛋白質(zhì)印跡上通過兔的多克隆抗-蛋白-D以及通過Ni-NTA綴合物,Ni-NTA綴合物連接有牛小腸堿性磷酸酶(Qiagencat.n°34510),它可以檢測易受影響的組氨酸標(biāo)志。當(dāng)在考馬斯亮藍(lán)-染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上顯示時(shí),其表達(dá)水平代表總體蛋白的約1-3%。
對于菌株B1012的抽提物,硫氧還原蛋白(約12Kda)在上清液中,通過考馬斯亮藍(lán)染色凝膠對其進(jìn)行顯象,在蛋白質(zhì)印跡中通過單克隆抗硫氧還原蛋白(Invitrogen R920-25)進(jìn)行鑒定。實(shí)施例Ⅹ表達(dá)融合蛋白D1/3-E7的大腸桿菌菌株B1098的構(gòu)建突變型(cys27→gly,glu29→gln)HPVl81)-表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建起始材料a)-質(zhì)粒pRIT 14532(=TCA316),其編碼融合蛋白D1/3-E7-Hisb)-質(zhì)粒LITMUS28 (New England Biolabs cat n°306-28),一種克隆載體pUC的衍生物c)-質(zhì)粒pMG MCS ProtD1/3(pRIT 14589),一種pMG81(如上面所述)的衍生物,其中來源于流感的NS1編碼區(qū)上的第4-81位密碼子被另一段密碼子取代,該密碼子相應(yīng)于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等,1991.傳染和免疫,1月第119-125頁)的成熟蛋白D上的絲氨酸20→蘇氨酸127殘基。Prot-D1/3的序列后跟隨一段多克隆位點(diǎn)(11個(gè)殘基)和一段編碼C-末端組氨酸標(biāo)志(6個(gè)組氨酸)的區(qū)域。質(zhì)粒pRIT14831(=TCA355)的構(gòu)建一種表達(dá)具有組氨酸標(biāo)志的融合蛋白-D1/3-E7突變體(cys27→gly,glu29→gln)的質(zhì)粒pRIT14532(=TCA 316)中的片段Ncol-XbaⅠ,帶有HPV18中E7基因的編碼序列,與一段組氨酸標(biāo)志一起延伸,在對誘發(fā)突變有利的中間載體Litmus28中進(jìn)行亞克隆,以獲得pRIT14910(=TCA348)。通過E7/HPV16的誘變相似的方法,選擇雙重突變cys27→gly和glu29→gln以減弱對成視網(wǎng)膜瘤基團(tuán)(pRB)的抗癌基因產(chǎn)物的結(jié)合。
在E7基因中引入突變是通過定點(diǎn)誘變快速變化試劑盒(Stratagene cat n°200518)實(shí)現(xiàn)的。由于對pRIT14532的序列分析,已經(jīng)指出存在E7中43位上的谷氨酸代替了HPV18原型序列中的甘氨酸,第二輪的誘變循環(huán)已了解到是在43位上引入甘氨酸。我們獲得了質(zhì)粒pRIT14829(=TCA353)。在通過序列分析確定全部E7基因的突變以及完整性的存在之后,將突變的E7基因引入載體pRIT14589(=pMGMCS ProtD1/3)中以得到質(zhì)粒pRIT14831(=TCA355)。
融合蛋白-D1/3-E7突變型(cys27→gly,glu29→gln)-His的蛋白和編碼序列的描述在序列編號18和19。
2).表達(dá)蛋白D1/3-E7突變型(cys27→gly,glu29→gln)-His/HPV18的菌株B1098的構(gòu)建質(zhì)粒pRIT14831被導(dǎo)入大腸桿菌AR58(Mott等,1985,美國國家科學(xué)院院報(bào),8288)中,AR58是一種含有γpL啟動子的熱敏抑制子的缺損的γ溶原性細(xì)菌,通過篩選抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化體以得到菌株B1098。
3).細(xì)菌菌株B1098的生長和誘導(dǎo)-蛋白D1/3-E7突變型(cys27→gly,glu29→gln)-His/HPV18的表達(dá)通過質(zhì)粒pRIT14831(B1098菌株)轉(zhuǎn)化的AR58的細(xì)胞在100毫升LB培養(yǎng)基,30℃下補(bǔ)充50μgr/ml的卡那霉素下生長。在細(xì)菌生長的對數(shù)期,將溫度轉(zhuǎn)為39℃以失活λ抑制子,打開蛋白D1/3-E7突變體-His/HPV18的合成。在39℃下的溫育持續(xù)4小時(shí)。將細(xì)菌沉淀并在-20℃下保存。
4)-融合蛋白D1/3-E7突變體(cys24→gly,glu26→gln)-His型HPVI6的性質(zhì)的確定溶解冰凍細(xì)胞并重懸在10毫升的磷酸緩沖液中。細(xì)胞在一臺法國壓力細(xì)胞壓碎機(jī)SLM Aminco上以20,000磅/平方英寸(psi)(過三遍)進(jìn)行破碎。抽提物在4℃下以16,000 g持續(xù)離心30分鐘。
對考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠和蛋白質(zhì)印跡的分析在對以上所描述的抽提物進(jìn)行離心之后,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析所得到的上清液和沉淀部分。定位于沉淀部分、約3lkDa的主要條帶的顯象是通過考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠,其鑒定是在蛋白質(zhì)印跡上通過兔的多克隆22 J 70抗-蛋白D,以及通過單克隆Penta-His(Qiagen cat.n°34660),它可以檢測易受影響的組氨酸標(biāo)志。表達(dá)水平代表總體蛋白的約3%至5%。實(shí)施例Ⅺ一種表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6-his/HPVI8的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)質(zhì)粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)是pMG81(如上面所描述)的衍生物,其中來源于流感的NS1編碼區(qū)上的第4-81位密碼子被另一段密碼子取代,該密碼子相應(yīng)于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等,1991.傳染和免疫,1月第119-125頁)的成熟蛋白D上的絲氨酸20→蘇氨酸127殘基。蛋白-D 1/3的序列后跟隨一段多克隆位點(diǎn)(11個(gè)殘基)和一段編碼C-末端組氨酸標(biāo)志(6個(gè)組氨酸)的區(qū)域。該質(zhì)粒用于表達(dá)融合蛋白D1/3-E6-his。
HPV基因組的E6和E7序列型HPV18(Cole等,分子生物學(xué)雜志.1987,193第599-608頁)從HPV18全長基因組中進(jìn)行擴(kuò)增并在pBR322(由Deutsches Krebsforschungszentnun(DKFZ)中獲得,Referenzzentnun für人病原乳頭瘤病毒-D 69120-Heidelberg)中克隆,并亞克隆到pUC19中以得到TCA302(=pRIT14467)。質(zhì)粒TCA 314(=pRIT14526)的構(gòu)建一種表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6-His/HPV18的質(zhì)粒相應(yīng)于E6蛋白的第1→158位氨基酸殘基的核苷酸序列從pRIT14467中進(jìn)行擴(kuò)增。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中,在E6序列的5’和3’的末端構(gòu)造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位點(diǎn),以使其可以插入質(zhì)粒PMGMCS Prot D1/3中相同的位點(diǎn)上,以獲得質(zhì)粒TCA314(=pRIT14526)。對插入序列進(jìn)行序列分析以確保在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中沒有修飾產(chǎn)生。關(guān)于融合蛋白-D1/3-E6-His的蛋白和編碼序列的描述在序列編號20和21中。
AR58菌株的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PKIT 14526被導(dǎo)入大腸桿菌AR58(Mott等,1985,美國國家科學(xué)院院報(bào),8288)中,AR58是一種含有γpL啟動子的熱敏抑制子的缺損的γ溶原性細(xì)菌。
3.細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-Prot-D1/3-E6-His的表達(dá)通過質(zhì)粒pRIT14526轉(zhuǎn)化的AR58的細(xì)胞在100毫升LB培養(yǎng)基,30℃下補(bǔ)充50μgr/ml的卡那霉素下生長。在細(xì)菌生長的對數(shù)期,將溫度轉(zhuǎn)為39℃以失活λ抑制子,打開蛋白D1/3-E6-his的合成。在39℃下的溫育持續(xù)4小時(shí)。將細(xì)菌沉淀并在-20℃下保存。
4.融合蛋白D1/3-E6-his的性質(zhì)的確定溶解冰凍細(xì)胞并重懸在10毫升的磷酸緩沖液中。細(xì)胞在一臺法國壓力細(xì)胞壓碎機(jī)SLM Aminco上以20,000磅/平方英寸(psi)(過三遍)進(jìn)行破碎。抽提物在4℃下以16,000g持續(xù)離心30分鐘。在對以上所描述的抽提物進(jìn)行離心之后,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、約32kDa的主要條帶的顯象是通過考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠,其鑒定是在蛋白質(zhì)印跡上通過兔的多克隆抗-蛋白-D以及通過Ni-NTA綴合物,Ni-NTA綴合物連接有牛小腸堿性磷酸酶(Qiagen cat.n°34510),它可以檢測易受影響的組氨酸標(biāo)志。表達(dá)水平代表總體蛋白的約3-5%。實(shí)施例Ⅻ一種表達(dá)融合蛋白D1/3-E6E7-his/HPVI8的大腸桿菌菌株的構(gòu)建1.表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建a)質(zhì)粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)是pMG81(如上面所描述)的衍生物,其中來源于流感的NS1編碼區(qū)上的第4-81位密碼子被另一段密碼子取代,該密碼子相應(yīng)于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等,1991.傳染和免疫,1月第119-125頁)的成熟蛋白D上的絲氨酸20→蘇氨酸127殘基。蛋白-D 1/3的序列后跟隨一段多克隆位點(diǎn)(11個(gè)殘基)和一段編碼C-末端組氨酸標(biāo)志(6個(gè)組氨酸)的區(qū)域。該質(zhì)粒用于表達(dá)融合蛋白D1/3-E6E7-his。
b)HPV基因組的E6和E7序列型HPV18(Cole等分子生物學(xué)雜志,1987,193,599-608)從HPV18全長基因組中進(jìn)行擴(kuò)增并在pBR322(由Deutsches Krebsforschungszentnun (DKFZ)中獲得,Referenzzentnun für人病原乳頭瘤病毒-D 69120-Heidelberg)中克隆,并亞克隆到pUC19中以得到TCA 302(=pRIT14467)。
c)TCA302(=pRIT14467)中的E6和E7編碼序列用一段合成的寡聚核苷酸接頭(插入到HgaⅠ和NsiⅠ位點(diǎn)之間)進(jìn)行修飾,導(dǎo)致E6和E7基因之間11個(gè)核苷酸丟失,從而去掉了E6的終止密碼子和在質(zhì)粒TCA320(=pRIT14618)中制造了融合的E6和E7編碼序列。
質(zhì)粒TCA328(=pRIT14567)的構(gòu)建一種表達(dá)融合蛋白-D1/3-E6E7-His/HPV18的質(zhì)粒相應(yīng)于融合的E6E7蛋白的第1→263位氨基酸殘基的核苷酸序列從pRIT14618中進(jìn)行擴(kuò)增。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中,在E6E7融合序列的5’和3’的末端,構(gòu)造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位點(diǎn),以使其可以插入質(zhì)粒pMGMCS Prot D1/3中相同的位點(diǎn)上,以獲得質(zhì)粒TCA328(=pRIT14567)。對插入序列進(jìn)行序列分析以確保在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中沒有修飾產(chǎn)生。關(guān)于融合蛋白-D1/3-E6E7-His的蛋白和編碼序列的描述在序列編號22和23。
2.AR58菌株的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pRIT14567被導(dǎo)入大腸桿菌AR58(Mott等,1985,美國國家科學(xué)院院報(bào),8288)的一段含有γpL啟動子的熱敏抑制子的缺損的γ溶素原中。
3.細(xì)菌菌株的生長和誘導(dǎo)-Prot-D1/3-E6E7-His的表達(dá)通過質(zhì)粒pRIT14512轉(zhuǎn)化的AR58的細(xì)胞在100毫升LB培養(yǎng)基,30℃下補(bǔ)充50μgr/ml的卡那霉素下生長。在細(xì)菌生長的對數(shù)期,將細(xì)菌轉(zhuǎn)為39℃以失活λ抑制子,打開蛋白D1/3-E6E7-his的合成。在39℃下的溫育持續(xù)4小時(shí)。將細(xì)菌沉淀并在-20℃下保存。
4.融合蛋白D1/3-E6E7-his的性質(zhì)描述溶解冰凍細(xì)胞并重懸在10毫升的磷酸緩沖液中。細(xì)胞在一臺法國壓力細(xì)胞壓碎機(jī)SLM Aminco上以20,000磅/平方英寸(psi)(過三遍)進(jìn)行破碎。抽提物在4℃下以16,000g持續(xù)離心30分鐘。
在對以上所描述的抽提物進(jìn)行離心之后,通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、約48kDa的主要條帶的顯象是通過考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠,其鑒定是在蛋白質(zhì)印跡上通過兔的多克隆抗-蛋白-D以及通過Ni-NTA綴合物,Ni-NTA綴合物連接有牛小腸堿性磷酸酶(Qiagen cat.n°345 10),它可以檢測易受影響的組氨酸標(biāo)志。表達(dá)水平代表總體蛋白的約1%。實(shí)施例ⅩⅢ含有PD1/3E7融合蛋白和不同CpG寡聚核苷酸的疫苗,在治療上的潛力在TCl(表達(dá)E7的腫瘤模型)中進(jìn)行評估。
1.治療試驗(yàn)方案10e6 TCl細(xì)胞,表達(dá)E7的腫瘤細(xì)胞皮下注射(200μl)入C57BL/6免疫活性小鼠的腰窩內(nèi)。在腫瘤入侵的7天和14天后對小鼠進(jìn)行預(yù)防接種,在不同佐劑存在的情況下,在腳墊間注射5微克ProtD 1/3 E7 HPV16(100μl∶50μl/腳墊)在第二次免疫的2周和4周后,解剖5只小鼠/組,取其脾臟或腘淋巴結(jié)進(jìn)行免疫應(yīng)答分析。
1.2結(jié)果小鼠的組別1)磷酸緩沖液2)蛋白D1/3 E7 HPV163)蛋白D1/3 E7 HPV 16+寡聚物11826(WD1001)TCC ATGACG TTC CTG ACG TT4)寡聚物15)蛋白D1/3 E7 HPV16+寡聚物2/1758(WD1002)TCT CCC AGCGTG CGC CAT6)寡聚物2腫瘤生長;每周兩次通過測量個(gè)體的腫瘤進(jìn)行監(jiān)測
圖1代表4周以上之后平均腫瘤生長(以mm2計(jì))/組n=10。
·皮下注射10e6TC 1細(xì)胞引起100%的動物發(fā)生腫瘤·用蛋白D1/3E7或單獨(dú)的佐劑接種100%的動物發(fā)生腫瘤·如圖1和2中所示,在接受含有一種CpG寡聚核苷酸的抗原的小鼠中,平均腫瘤生長保持十分低,而且兩組十分相似,由此反應(yīng)腫瘤生長或者降低或者幾種腫瘤被完全受排斥。
在最后一次接種的2周和4周之后,對每單個(gè)腫瘤的分析顯示各群中的全部排斥為28天(n=10)42天(n=5)E7+寡聚物1(1826)40%40%寡聚物1 0%0%E7+寡聚物2(1758)70%40%寡聚物2 0%0%通過PD1/3E7+CpG寡聚物接種的小鼠,其平均腫瘤生長/組十分相似,對單個(gè)腫瘤生長的分析顯示CpG寡聚物誘導(dǎo)延伸的完全腫瘤的抵制。
結(jié)論兩種CpG均(寡聚物2>寡聚物1)誘導(dǎo)完全的腫瘤衰退。
淋巴增生應(yīng)答的分析是在第二次免疫(Ⅲ)的2周和4周之后,在體外通過用PD1/3E7、蛋白E7(Bollen)和PD(完整)和PD1/3(包被或不包在乳液微滴中)(10,1,0.1μg/ml)對脾臟或淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)72小時(shí)的再次刺激。
·陽性對照(伴刀豆球蛋白A刺激)是陽性的。
·令人驚奇的是,在以脾臟細(xì)胞起始的第二次接種后的2或4周沒有觀察到E7特異性的和PD特異性的增生應(yīng)答(可能由于技術(shù)問題數(shù)據(jù)未顯示)·相反,在來源于接受CpG寡聚物1和2中的蛋白D1/3E7的小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞中,顯示出非常好的E7特異性的增生應(yīng)答,雖然即使是在最高的濃度100μg/ml下也幾乎沒有能觀察到PD(完整)特異性的應(yīng)答,即使包衣在乳液微滴中也沒有觀察到PD1/3特異性的應(yīng)答。
相同的數(shù)據(jù)在第二次接種的4周后也獲得。
血清學(xué)抗E7的抗體應(yīng)答通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)測定IgG總量和同型(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgGTot),使用了如材料和方法中所描述的包被抗原形式的E7蛋白。圖3和4分別顯示在第二次接種的2周和4周后,不同IgG同型在總的IgG中的相對百分率
·當(dāng)單獨(dú)注射PD1/3E7時(shí),觀察到寡聚物的影響僅微弱(寡聚2)或者連微弱的抗體應(yīng)答(寡聚1)也完全沒有·對于所有測試的制劑,占優(yōu)勢的E7特異性抗體亞型明顯為IgG2b(總體IgG的80-90%)在第二次接種的4周后也獲得相同的結(jié)果??笶7應(yīng)答(第二次接種之后,匯聚血清)的同型概況exp.97293
CTL分析當(dāng)在最近接種的2周之后進(jìn)行測定時(shí),當(dāng)細(xì)胞在體外被輻射過的TCl再次刺激時(shí),當(dāng)TCl或肽E7激活的EL4作為靶細(xì)胞時(shí),當(dāng)小鼠被PDl/3 E7+CpG寡聚物2>1(25-40%特異性溶胞)而不是被單獨(dú)的寡聚物免疫時(shí),即可檢測CTL應(yīng)答。
·觀察到TCl細(xì)胞中的溶胞強(qiáng)于肽酸E7激活的EL4細(xì)胞,但這主要是在經(jīng)PDl/3 E7+CpG寡聚物(2>1)接種的小鼠組群中觀察到的。在這一實(shí)驗(yàn)中的其它制劑沒有誘導(dǎo)CT1。
·使用E7激活的EL4細(xì)胞,當(dāng)小鼠接受單獨(dú)的蛋白或佐劑時(shí)沒有觀察到溶胞。
1.3材料和方法
1.3.1配制過程所有制劑均在注射當(dāng)天配制含有寡聚物的制劑單獨(dú)含有寡聚物而沒有其它佐劑的制劑的配制,是在pH7.4的磷酸緩沖液里,加CpG到稀釋過的PrtD 1/3-E7中。
沒有抗原的佐劑對照的制備是用磷酸緩沖液代替該蛋白。
1.3.2小鼠和細(xì)胞系小鼠6-8周齡的C5781/6(Iffa Credo)小鼠用于這些試驗(yàn)中。
細(xì)胞系TCl(獲自John Hopkin’s University)、EL4細(xì)胞在RPMI1640(Bjo Whittaker)中生長,RPMI 1640(Bio Whittaker)含有10%FCS和添加劑2mM L一谷氨酰胺、1%抗生素(10000U/ml青霉素、10000μg/ml鏈霉素)、1%非必需氨基酸100x、1%丙酮酸鈉(Gibco)、5 10e-5M 2-巰基乙醇。在注射之前將TG1細(xì)胞用胰蛋白酶處理,并在無血清培養(yǎng)基中清洗。
1.3.3腫瘤生長
所有動物在0天時(shí)均注射腫瘤細(xì)胞,在7天時(shí)隨機(jī)注射。隨時(shí)間跟蹤個(gè)體腫瘤的生長,每周兩次用測徑器測量2個(gè)主要直徑(A,B),AxB代表“腫瘤表面”,每組5個(gè)值的平均值隨時(shí)間顯示于圖解中6周。
1.3.4 CMI讀出體外淋巴細(xì)胞增殖淋巴細(xì)胞增殖在個(gè)體脾臟和淋巴結(jié)匯聚中進(jìn)行。將200000個(gè)脾臟細(xì)胞或腿彎部的淋巴結(jié)細(xì)胞一式三份涂于96孔微量反應(yīng)板內(nèi),用含有1%標(biāo)準(zhǔn)小鼠血清和添加劑的RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)。使用不同劑量的PD1/3 E7(1,0.1,0.01μg/ml)或E7(10,1,0.1μg/ml)在體外進(jìn)行再次刺激,72小時(shí)之后,去掉100μl的培養(yǎng)上清物,代之以含有1μCi 3H胸腺嘧啶(Amersham 5Ci/mmol)的新鮮培養(yǎng)基。16小時(shí)之后,將細(xì)胞收集到過濾板中。在一種β計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)摻入的放射線。結(jié)果以CPM(三孔平均)表示,或者以刺激指數(shù)(有抗原的培養(yǎng)物中的平均CPM/無抗原的培養(yǎng)物中的平均CPM)表示。
1.3.5 CTL分析在伴刀豆球蛋白A補(bǔ)足物(sup)(2%)存在或不存在的情況下,將20 10e6脾臟細(xì)胞與2 10e6輻射的(18000r)TCl細(xì)胞(表達(dá)E7的腫瘤)共培養(yǎng),持續(xù)7天。
用于估定細(xì)胞毒性的靶細(xì)胞為負(fù)載有(37℃,1小時(shí))CrS1(DuPontNEN 37MBq/ml)的TCl細(xì)胞或E7激活EL4細(xì)胞(37℃下持續(xù)1小時(shí)**,在細(xì)胞負(fù)載Cr51的過程中,10μg/ml的E7衍生的肽段(49-57)(QCB))。相對于EL4細(xì)胞,對K562靶細(xì)胞進(jìn)行NK依賴的溶胞估定。96孔平板(V bottom nunc 2-45128)中,2000個(gè)靶細(xì)胞/孔,100/l為最高效應(yīng)物/靶比率。自發(fā)或最高Cr51釋放的對照以六個(gè)一組進(jìn)行,并在培養(yǎng)基或1.5%的triton中作為靶細(xì)胞。所有平板菌輕輕離心并在7%CO2、37℃下溫育4小時(shí)。將50μl的上清液置于96w Lumaplate(Packard)let dry O/N中并在一臺Top Count計(jì)數(shù)器中進(jìn)行記數(shù)。數(shù)據(jù)以特異性溶胞百分率來表示,其從每分鐘記數(shù)(c.p.m)中通過公式(試驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/(最高釋放-自發(fā)釋放)X100來計(jì)算。
血清學(xué)抗E7抗體的定量是通過ELISA進(jìn)行,E7以包被抗原的形式使用??乖涂贵w的溶液在每孔中用50μl??乖趐H9.5的碳酸緩沖液中以終濃度為3μg/ml進(jìn)行稀釋,并在4℃下吸附到在96孔微量滴定板的孔內(nèi)過夜(MaxiSorb Immuno-plate,Nunc,丹麥)。將該平板在含有1%牛血清白蛋白和0.1%Tween 20(飽和緩沖液)的磷酸緩沖液中,在37℃下溫育1小時(shí)。在飽和緩沖液中,將稀釋兩倍的血清(起始為1/100的稀釋液)加入到E7涂層的平板中并在37℃下溫育1小時(shí)30分。將平板以PBS 0.1%Tween20沖洗3次,將在飽和緩沖液中稀釋1/5000的偶聯(lián)生物素抗小鼠IgG1、IgG2a或IgG2b或IgG總體(Amersham,UK)加入到每孔中,并在37℃下溫育1小時(shí)30分。清洗一次之后,將在飽和緩沖液中稀釋1/5000的鏈親和素-生物素標(biāo)記的過氧化物酶合成物在37℃下加入,保持30分鐘。依以上方法清洗平板并與TMB(四甲基-對二氨基聯(lián)苯)一起溫育10分鐘。該反應(yīng)用4N的H2SO4終止并在450nm讀數(shù)。中點(diǎn)稀釋通過SoftmaxPro(采用四個(gè)參數(shù)的方程)計(jì)算。實(shí)施例ⅩⅣ在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,測試本發(fā)明的疫苗以評估主鏈的顯著性。
治療實(shí)驗(yàn)方案·10e6 TCl細(xì)胞,表達(dá)E7的腫瘤細(xì)胞皮下注入(200μl)到具免疫活性的C57BL/6小鼠的腰窩處。
·兩種疫苗,腫瘤侵入的7天和14天以后,含有5μg ProtD 1/3 E7HPV16,注射入足墊內(nèi)(100μl50μl/足墊)+/-CpG寡聚;硫代磷酸酯修飾的寡聚1(WD1001)或相同的寡聚(WD1006)但它是磷酸二酯鍵的連接。
·5只動物/組腫瘤生長通過每周兩次測量個(gè)體腫瘤來監(jiān)測,每組5只動物的平均腫瘤生長如圖5所示,圖5顯示硫代磷酸酯修飾的寡聚核苷酸可以有效地引起腫瘤衰退。
結(jié)論·所有接受10 e6 TCl腫瘤細(xì)胞的動物均形成了不斷生長的腫瘤。
·單獨(dú)PD1/3 E7 HPV16蛋白接種兩次(間隔7天)的動物,100%形成腫瘤。
·在濃度測試中,接受PD1/3E7蛋白+寡聚WD1006的動物100%形成腫瘤。
·所有接受濃度變化為10到200微克的E7蛋白+CpG1001的組中的動物,均部分或完全(20-40%)顯示腫瘤的衰退。
在第一個(gè)濃度下,這種在腫瘤衰退上的治療效果的獲得不完全,該濃度為E7+1微克CpG寡聚1001。實(shí)施例ⅩⅤ在第三系列的實(shí)驗(yàn)中,評估本發(fā)明中的疫苗在表達(dá)E7蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠中的作用。
·該轉(zhuǎn)基因小鼠株系的產(chǎn)生如M.Parmentier和C.Ledent在IRIBHN(ULB)中所述(參照PNAS(USA)1990,87;6176-6180)。
·由于該轉(zhuǎn)基因小鼠負(fù)載E7 HPV16基因出生后就成活,所以認(rèn)為它們對這種基因(來源于HPV16的E7基因)“耐受”,在這種情況下,E7被認(rèn)做“自身抗原”。
·該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是由甲狀球蛋白啟動子驅(qū)動。由于甲狀球蛋白構(gòu)成性地僅在甲狀腺中表達(dá),所以E7在甲狀腺中表達(dá)。
·作為這一表達(dá)的結(jié)果,甲狀腺細(xì)胞增生,小鼠形成甲狀腺腫和小瘤,其在6個(gè)月到1年之后可以發(fā)展為入侵性的癌癥。
實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖6)顯示含有本說明書中所描述的CpG寡聚核苷酸和抗原的治療性的疫苗,導(dǎo)致腫瘤生長的減少并且可以引起完全的腫瘤衰退。
材料和方法·10e6 TCl細(xì)胞,表達(dá)E7的腫瘤細(xì)胞皮下注入(200μl)雄性或雌性的C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠的腰窩內(nèi),·小鼠在腫瘤入侵7天和14天之后接種5微克ProtD1/3 E7HPV16,在CpG寡聚核苷酸TCT CCC AGC GTG CGC CAT和兩種控制佐劑的存在下注射到腳墊內(nèi)(100μl∶50μl/腳墊),·10只動物/組第二次免疫的2周和4周之后解剖小鼠取其脾臟或腿彎部淋巴。
結(jié)論本發(fā)明中的疫苗在HPV誘導(dǎo)的腫瘤中,可以有效地引起腫瘤衰退。
序列清單(1)一般信息(ⅰ)申請者BRUCK,CLAUDINE(ⅱ)發(fā)明題目疫苗(ⅲ)序列數(shù)目23(ⅳ)通信地址(A)通信人SmithKline Beecham(B)街道2 New Horizons Court,Great West Road,B(C)城市Middx(D)州(E)國家英國(F)郵編TW 9EP(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEO for Windows Version 2.0(ⅵ)本次申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)柎a(B)存檔日期(C)分類(ⅶ)上次申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)柎a(B)存檔日期(ⅷ)代理商信息(A)姓名Dalton,Marcus J
(B)注冊號碼(C)參考/記錄號碼B45124(ⅸ)通訊信息(A)電話0181 9756348(B)電傳0181 9756177(C)電報(bào)(2)序列編號1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度220個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈的性質(zhì)單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性蛋白質(zhì)D 1/3 E7 his(ⅱ)序列描述序列編號1Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys1 5 10 15Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro20 25 30Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp35 40 45Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val50 55 60Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe65 70 75 80Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met100 105 110Ala Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu115 120 125Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser130 135 140Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro145 150 155 160Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser165 170 175Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu180 185 190Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser195 200 205Gln Lys Pro Thr Ser Gly His His His His His His210 215 220(2)序列編號2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度663個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈的性質(zhì)單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性蛋白質(zhì)D 1/3 E7 his(ⅹⅰ)序列描述序列編號2ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC60ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA120CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT180CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC240CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT300CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA ACCATGGCCA TGCATGGAGA TACACCTACA360TTGCATGAAT ATATGTTAGA TTTGCAACCA GAGACAACTG ATCTCTACTG TTATGAGCAA420TTAAATGACA GCTCAGAGGA GGAGGATGAA ATAGATGGTC CAGCTGGACA AGCAGAACCG480GACAGAGCCC ATTACAATAT TGTAACCTTT TGTTGCAAGT GTGACTCTAC GCTTCGGTTG540TGCGTACAAA GCACACACGT AGACATTCGT ACTTTGGAAG ACCTGTTAAT GGGCACACTA600GGAATTGTGT GCCCCATCTG TTCTCAGAAA CCAACTAGTG GCCACCATCA CCATCACCAT660TAA663(2)序列編號3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度822個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈的性質(zhì)單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性蛋白質(zhì)D 1/3 E6 His/HPV 16(ⅹⅰ)序列描述序列編號3ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC60ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA120CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT180CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC240CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT300CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA ACCATGGCCA TGTTTCAGGA CCCACAGGAG360CGACCCAGAA AGTTACCACA GTTATGCACA GAGCTGCAAA CAACTATACA TGATATAATA420TTAGAATGTG TGTACTGCAA GCAACAGTTA CTGCGACGTG AGGTATATGA CTTTGCTTTT480CGGGATTTAT GCATAGTATA TAGAGATGGG AATCCATATG CTGTATGTGA TAAATGTTTA540AAGTTTTATT CTAAAATTAG TGAGTATAGA CATTATTGTT ATAGTTTGTA TGGAACAACA600TTAGAACAGC AATACAACAA ACCGTTGTGT GATTTGTTAA TTAGGTGTAT TAACTGTCAA660AAGCCACTGT GTCCTGAAGA AAAGCAAAGA CATCTGGACA AAAAGCAAAG ATTCCATAAT720ATAAGGGGTC GGTGGACCGG 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Cys165 170 175Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr180 175 190Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro195 200 205Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys210 215 220Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn225 230 235 240Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser245 250 255Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Thr Ser Gly His His His His His260 265 270His(2)序列編號5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1116個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈的性質(zhì)單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性蛋白質(zhì)D 1/3 E6/E7/HPV16(ⅹⅰ)序列描述序列編號5ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC60ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA120CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT180CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC240CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT300CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA ACCATGGCCA TGTTTCAGGA CCCACAGGAG360CGACCCAGAA 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190Ala Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser195 200 205Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln Thr Ser Gly His His His210 215 220His His His225(2)序列編號20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度837個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈的性質(zhì)單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性蛋白質(zhì)D 1/3 E6-His HPV 18(ⅹⅰ)序列描述序列編號20ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC60ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA120CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT180CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC240CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT300CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA ACCATGGCGC GCTTTGAGGA TCCAACACGG360CGACCCTACA AGCTACCTGA TCTGTGCACG GAACTGAACA CTTCACTGCA AGACATAGAA420ATAACCTGTG TATATTGCAA GACAGTATTG GAACTTACAG AGGTATTTGA ATTTGCATTT480AAAGATTTAT TTGTGGTGTA TAGAGACAGT ATACCGCATG CTGCATGCCA TAAATGTATA540GATTTTTATT CTAGAATTAG AGAATTAAGA CATTATTCAG ACTCTGTGTA TGGAGACACA600TTGGAAAAAC TAACTAACAC TGGGTTATAC 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140Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe145 150 155 160Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys165 170 175His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr180 185 190Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly195 200 205Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn210 215 220Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg phe His Asn225 230 235 240Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala245 250 255Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Thr Ser Gly260 265 270His His His His His His275(2)序列編號22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1152個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈的性質(zhì)單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性蛋白質(zhì)D 1/3 E6 E7 His/HPV 18(ⅹⅰ)序列描述序列編號22ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC60ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA120CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT180CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC240CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT300CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA ACCATGGCGC GCTTTGAGGA TCCAACACGG360CGACCCTACA AGCTACCTGA TCTGTGCACG GAACTGAACA CTTCACTGCA AGACATAGAA420ATAACCTGTG TATATTGCAA GACAGTATTG GAACTTACAG AGGTATTTGA ATTTGCATTT480AAAGATTTAT TTGTGGTGTA TAGAGACAGT ATACCGCATG CTGCATGCCA TAAATGTATA540GATTTTTATT CTAGAATTAG AGAATTAAGA CATTATTCAG ACTCTGTGTA TGGAGACACA600TTGGAAAAAC TAACTAACAC TGGGTTATAC AATTTATTAA TAAGGTGCCT GCGGTGCCAG660AAACCGTTGA ATCCAGCAGA AAAACTTAGA CACCTTAATG AAAAACGACG ATTTCACAAC720ATAGCTGGGC ACTATAGAGG CCAGTGCCAT TCGTGCTGCA ACCGAGCACG ACAGGAACGA780CTCCAACGAC GCAGAGAAAC ACAAGTAATG CATGGACCTA AGGCAACATT GCAAGACATT840GTATTGCATT TAGAGCCCCA AAATGAAATT CCGGTTGACC TTCTATGTCA CGAGCAATTA900AGCGACTCAG AGGAAGAAAA CGATGAAATA GATGGAGTTA ATCATCAACA TTTACCAGCC960CGACGAGCCG AACCACAACG TCACACAATG TTGTGTATGT GTTGTAAGTG TGAAGCCAGA1020ATTGAGCTAG TAGTAGAAAG CTCAGCAGAC GACCTTCGAG CATTCCAGCA GCTGTTTCTG1080AACACCCTGT CCTTTGTGTG TCCGTGGTGT GCATCCCAGC AGACTAGTGG CCACCATCAC1140CATCACCATT AA1152(2)序列編號23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度384個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈的性質(zhì)單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性蛋白質(zhì)D 1/3 E6 E7 His/HPV 18(ⅹⅰ)序列描述序列編號23Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys1 5 10 15Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro20 25 30Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp35 40 45Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val50 55 60Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe65 70 75 80Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met100 105 110Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu115 120 125Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val130 135 140Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe145 150 155 160Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys165 170 175His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr180 185 190Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly195 200 205Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn210 215 220Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn225 230 235 240Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala245 250 255Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Met His Gly260 265 270Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn275 280 285Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu290 295 300Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala305 310 315 320Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys325 330 335Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu340 345 350Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro355 360 365Trp Cys Ala Ser Gln Gln Thr Ser Gly His His His His His His370 375 380
權(quán)利要求
1.一種含有來源于HPV并可選地連接有一段免疫融合配偶體的E6或E7或E6/E7融合蛋白、以及一種免疫調(diào)節(jié)劑CpG寡聚核苷酸的組合物。
2.如權(quán)利要求1中所述的組合物,其中的融合蛋白選自以下的各組來源于流感嗜血菌B的蛋白D或其片段、來源于流感嗜血菌B的脂蛋白D或其片段、來源于流感病毒的NS1或其片段、以及來源于肺炎鏈球菌的LYTA或其片段。
3.如權(quán)利要求1或2中所述的組合物,其中的E6或E7蛋白衍生于HPV16或HPV18。
4.如權(quán)利要求1、2或3中所述的組合物,其中的E7蛋白是突變的。
5.如權(quán)利要求1、2或3中所述的組合物,其中的E6蛋白是突變的。
6.如權(quán)利要求1至5任一條中所述的組合物,這些組合物額外地含有一段至少4個(gè)組氨酸殘基的組氨酸標(biāo)志。
7.在本權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的組合物,這些組合物含有附加的HPV抗原。
8.在本權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的組合物,其中的免疫調(diào)節(jié)劑CpG寡聚核苷酸含有一個(gè)六聚體基序嘌呤嘌呤胞嘧啶鳥苷嘧啶嘧啶。
9.在本權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的組合物,其中的免疫調(diào)節(jié)劑CpG寡聚核苷酸含有兩個(gè)或更多的CpG基序。
10.在本權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的組合物,其中的免疫調(diào)節(jié)劑CpG寡聚核苷酸含有一個(gè)硫代磷酸酯的核苷酸間連接。
11.在本權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的組合物,其中的免疫調(diào)節(jié)劑CpG寡聚核苷酸是選自以下的組寡聚物1TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT寡聚物2TCT CCC AGC GTG CGC CAT寡聚物3ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
12.在本權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的用于醫(yī)藥組合物。
13.一種誘導(dǎo)患者對HPV抗原的免疫應(yīng)答的方法,包括施安全有效劑量的組合物。
14.一種阻止或治療患者體內(nèi)HPV誘導(dǎo)的腫瘤的方法,包括施用的安全有效劑量的組合物。
15.一種制備在本權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的組合物的方法,包括混合可選地連接有一種免疫融合配偶體的E6、E7或E6/E7融合蛋白,以及免疫調(diào)節(jié)劑CpG寡聚核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了人乳頭狀瘤病毒融合蛋白,該蛋白連接有一種對HPV抗原提供T細(xì)胞輔助的表位的免疫融合配偶體。提供了在治療或預(yù)防HPV誘導(dǎo)的腫瘤上有效的疫苗制劑配體。
文檔編號A61P31/04GK1284884SQ98813794
公開日2001年2月21日 申請日期1998年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月24日
發(fā)明者W·L·J·達(dá)勒曼斯, C·M·G·格拉德 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司