專利名稱：帶電穿透劑通過屏障的電控轉(zhuǎn)運的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含穿透劑的制劑，該穿透劑由單分子或分子排列形成，由于其與屏障的孔能很好適配，故能透過屏障的孔，即使當所述屏障的孔小于所述穿透劑的平均直徑時也能透過，并且所述穿透劑能使藥物透過孔而轉(zhuǎn)運，或者在穿透劑進入所述孔后使藥物透過孔；選擇所述穿透劑的平均直徑和適配性，并使所述穿透劑和/或所述藥物具有足夠的電荷，以便在適當電驅(qū)動力的影響下所述穿透劑能使和/或控制藥物轉(zhuǎn)運通過所述孔，或者在穿透劑進入所述孔后藥物透過所述孔，在保持足夠穿透穩(wěn)定性的同時進行所述的選擇。本發(fā)明還涉及實現(xiàn)電驅(qū)動轉(zhuǎn)運所述穿透劑和有關(guān)分子透過屏障孔的方法。
驅(qū)動離子流穿過皮膚的任何透皮電勢在器官中都有擴大某些親水性通道的傾向。這通常發(fā)生在細胞之間最不密集部位，在這些部位最有可能發(fā)揮促進轉(zhuǎn)運的作用。
可用適合載體使皮膚的滲透作用達到同樣目的而無需使用輔助裝置或外部能源(Schatzlein，A.；Cevc，G.(1998)角質(zhì)層的非均勻多孔填充與完好皮膚的滲透性屏障功能采用高度變形泡囊(轉(zhuǎn)運體)的高分辨同焦點激光掃描電鏡研究)，Br.J.Dermatol.138583-592)。在處理前，通過皮膚親水性通路(孔)僅允許小分子(例如水)通過。然而，通過加入充分有效的穿透劑可使這些孔打開成為較寬的通道。
電勢差能驅(qū)動帶電穿透劑穿過屏障，例如皮膚；另外，電滲促進作用至少使器官中的某些親水性通道變寬。這種情況僅僅發(fā)生在皮膚的表皮角質(zhì)層(Stratum corneun)，構(gòu)成大多數(shù)皮膚滲透性屏障。根據(jù)新擴大的透皮通道的孔徑，通常所謂電泳(離子電滲)或電穿孔，分別用于電誘導(dǎo)離子流通過狹窄的通道和用于更廣泛通路的擴大。
例如，約0.4mAcm-2或低于0.4mAcm-2的電流將激活預(yù)先存在于皮膚細胞之間的一小部分狹窄的(～0.5nm)親水性通道。而后，這類通道的開放可持續(xù)許多小時(Green，P.G.；Hinz，R.S.； Kim，A.；Szoka，F(xiàn).C.Jr.；Guy，R.H.(1991)，離子電滲體外傳遞一系列三肽透過皮膚，Pharm.Res.Sep.；81121-7)，但當透皮電壓保持在生理可耐受范圍(對1cm2貼小于＜3V)時，該通道仍較狹窄(＜3nm，在裸鼠中)。
最寬的通道內(nèi)部是陰性的。中性通道僅是其一半寬，陽性通道小其二倍(twice smaller)(Pikal，M.J.；Shah，S.(1990b)，離子電滲的轉(zhuǎn)運機理II用于裸鼠皮膚的電滲流和轉(zhuǎn)移數(shù)量測定，Pharm.Res.7213-21)。至今，在低電壓電動透過皮膚期間存在的最寬通道據(jù)報道僅為20nm或不足20nm(Aguilelle，V.；Kontturi，K.；Murtomaeki，L.；Ramirez，P.(1994)，人尸皮膚中孔徑和電荷密度的評價，J.Contr.Rel.，32249-257)。
因此，標準的電皮膚滲透性促進方法(電泳)僅能改善相對較小(＜2nm)的帶電分子穿過器官的轉(zhuǎn)運。結(jié)論是，穿透皮膚的電泳對于某些多肽是切實可行的，但對于蛋白質(zhì)或其它大穿透劑的傳遞實際上沒有作用(綜述，參見Green，P.G.；Hinz，R.S.；Kim，A.；Szoka，F(xiàn).C.Jr.；Guy，R.H.(1991)，電泳體外傳遞一系列三肽穿過皮膚，Pharm.Res.Sep.；81121-7；Green，P.G.；Flanagan，M.；Shroot，B.；Guy，R.(1993)，藥物皮膚滲透促進中的電泳藥物傳遞(Walters，K.and Hadgraft，J.，eds.)Marcel Dekker，New York，297-319；Heith，M.C.；Williams，P.L；Jayes，F(xiàn).L.；Chang，S.K.；Riviere，J.E.(1993)皮膚的離子電滲肽傳遞體外和體內(nèi)，黃素化激素釋放的研究，J.Pharm.Sci.82240-3；Singh，S.；Singh，J.(1993)通過被動擴散和離子電滲透皮傳遞藥物的綜述Med.Res.Rev.13569-621；Singh，J.；Bhatia，K.S.(1996)，局部離子電滲的藥物傳遞途徑、原理、因素和皮膚刺激性，Med.Res.Rev.16285-96)。
通過低電壓和可耐受的小電流打開的透皮通道僅覆蓋總處理面積的0.005％，盡管通道的數(shù)量看起來很大(＜3×108cm-2)(Pikal，M.J.(1990)，離子電滲中的轉(zhuǎn)運機制.I，透皮離子電滲中電滲流對流動促進作用的理論模型，Pharm.Res.7118-26)。通過更高的電壓(＞150V)產(chǎn)生的更大范圍的局部皮膚穿孔是較罕見的，這種孔一般是以皮膚損傷已持續(xù)了數(shù)天。
透皮通道的大小受多種參數(shù)的影響。例如通道隨著電勢的提高而加寬也隨基礎(chǔ)電解質(zhì)濃度的提高而加寬，但后者的變化實際上僅可能在相對狹窄的限度內(nèi)。并且，至今還沒有關(guān)于如何利用這類原理改善穿過屏障的轉(zhuǎn)運的資料?；蛟S，這是歸因于皮膚中的電泳通道是電荷和分子量的選擇(Banga，A.K.；Chien，Y.W.(1993)，透皮傳遞肽/蛋白藥物的水凝膠離子電滲治療傳遞裝置，Pharm.Res.10697-702)，而對藥物的親脂性變化不太敏感(Green，P.G.；Hinz，R.S.； Kim，A.；Szoka，F(xiàn).C.Jr；Guy，R.H.(1991)，離子電滲體外傳遞一系列三肽穿過皮膚，Pharm.Res.Sep；81121-7)。
重復(fù)的電滲傳遞通過相同皮膚區(qū)域?qū)е路稚⒌?、但通常是較大的流量穿過屏障，這造成了數(shù)據(jù)解釋和評價的困難(Heith，M.C.；Williams，P.L.；Jayes，F(xiàn).L.；Chang，S.K.；Riviere，J.E.(1993)，通過離子電滲的肽透皮給藥使用促黃體激素釋放激素的體外和體內(nèi)研究，J.Pharm.Sci.82240-3)。其它的復(fù)雜情況源于電流通過皮膚中的附件，如毛囊。
電擴大皮膚的通道可通過下列對皮膚的滲透性的貢獻反映出來，Pi.el＝皮膚對離子的滲透性＝(ciZiF/RT)Di/ds該滲透性需要加上在沒有電力作用于屏障下觀察到的滲透性。除了打開孔以外，經(jīng)皮電勢梯度(ΔΨel)還激活那些驅(qū)動帶電穿透劑通過通道的電動勢。這就給出了用于模擬屏障(如經(jīng)皮)轉(zhuǎn)運的Fick轉(zhuǎn)運方程式中另一項參數(shù)(參見進一步的討論)ji＝…a ci+Pi.elΔψelci是物質(zhì)i的體積濃度，ZiF是摩爾電荷(價數(shù)乘以Faraday常數(shù))，RT是摩爾熱能。Di是物質(zhì)i的擴散系數(shù)，ds是皮膚的厚度。通過i-流量和ZiF的乘積得出對應(yīng)于i的電流，但總電流包括所有各種作用，因此是通過這些作用的總和得出。
電泳表示在電極的電場下帶電分子的定向流動。因此，藥物分子必須置于與藥物具有同種電荷的電極上。這種情況下，流量大小與各種遷移分子的凈電荷數(shù)和使用的電勢成正比。其它重要因素是屏障或皮膚中的藥物濃度和擴散系數(shù)(參見下文中給出的方程式)。
由于濃度的絕對差異，電泳電流通常還包括由于基礎(chǔ)電解質(zhì)離子(如Na+、Cl-)的作用。這使得藥物的作用減小，僅占所測量電流作用的一小部分。因此，提高電極下的離子濃度會降低電泳電流中的有用份額(Pikal，M.J.；Shah，S.(1990b)，離子電泳的轉(zhuǎn)運機制II.對裸鼠皮膚的電滲流和轉(zhuǎn)移數(shù)量的測定，Pharm.Res.7213-21；Pikal，M.J.；Shah，S(1990c)，離子電滲的轉(zhuǎn)運機制III.電滲流的作用及轉(zhuǎn)運低分子量和高分子量溶質(zhì)的滲透性變化的實驗室研究，Pharm.Res.7222-9)，這可從簡單的微分計算中看出來。
因此現(xiàn)有技術(shù)的情況是物理條件局限了可達到的或可耐受的穿透皮膚的最大電泳電流流經(jīng)已經(jīng)開通孔道的電流消耗了電能；這妨礙了通道數(shù)量的增加以及通道孔徑的增大(如上所述)，從而減少了可轉(zhuǎn)運的物質(zhì)量。另外，開通的孔道還由于皮膚能量消耗(皮膚搔癢和浸蝕)的不利作用而受限制。
電滲流量，即與攜帶無電荷物質(zhì)的轉(zhuǎn)運離子結(jié)合的水流量，該流量也依賴于皮膚中的親水性通道和使用的電勢。陽極下的流量通常超過陰極流量，這或許是由于正電荷和負電荷通道的平均大小不同。在10小時的恒電流離子電滲(0.36mAcm-2)期間，達到穩(wěn)態(tài)的平均流量水平較開始時(＜3μL h-1cm-2)高了數(shù)倍(Kim，A.；Green，P.G.；Rao，G.；Guy，R.H.(1993)，離子電滲期間穿過皮膚的對流溶劑流，Pharm.Res.，101315-20)。
在最初一小時的電泳過程中電誘發(fā)的皮膚變化最大(Pikal，M.J.；Shah，S.(1990b)，離子電滲的轉(zhuǎn)運機制II.對裸鼠皮膚的電滲流和轉(zhuǎn)移數(shù)量測定，Pharm.Res.，7213-21；Craane van-Hinsberg，W.H.；Bax，L.；Flinterman，N.H.；Verhoef，J.；Junginger，H.E.；Bodde，H.E.(1994)，肽穿過人體皮膚的體外離子電滲模型離子電滲方案、pH和離子強度對肽流量和皮膚阻抗的影響，Pharm.Res.Sep；111296-300)。這期間，阻力從＞20KΩ cm-2降低到該起始值的約10％。
用乙醇進行皮膚預(yù)處理會減弱(Brand，R.M.；Iversen，P.L.(1996)調(diào)聚寡核苷酸的離子電滲傳遞，Pharm.Res.138514-4)或增強(Srinivasan，V.；Higuchi，W.I.；Sims，S.M.；Ghanem，A.H.；Behl，C.R.(1989)藥物的離子電滲透皮給藥機理分析和多肽傳遞的應(yīng)用，J.Pharm.Sci.78370-5)通過器官的電泳轉(zhuǎn)運。大多數(shù)化學皮膚滲透增強劑可提高皮膚的導(dǎo)電性，因此也能增強電驅(qū)動的經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(Green，P.G.；Hinz，R.S.；Kim，A.；Szoka，F(xiàn).C.Jr.；Guy，R.H.(1991)，離子電滲體外傳遞一系列三肽通過皮膚，Pharm.Res.Sep.81121-7)；同樣調(diào)節(jié)pH，尤其是降低pH也能提高皮膚的導(dǎo)電性。這種作用一部分是由于電泳，一部分由于電滲透，但這種提高通常較小。
電泳增強穿過皮膚的分子的運動至今只取得了部分成功(產(chǎn)品和開發(fā)的最新調(diào)查，參見Cevc，G.(1997)，藥物通過皮膚傳遞，Exp.Opin.Invest，Drugs61887-1937)。用大分子得到的結(jié)果特別糟糕(參見，例如Siddiqui，O.；Chien，Y.W.的綜述，肽和蛋白類藥物的非胃腸給藥，Crit.Rev.Therap，Drug CarrierSyst.1987，3195-208和Banga，A.K.；Chien，Y.W.(1993)，肽/蛋白類藥物透皮傳遞的水凝膠基離子電滲療法的傳送裝置，Pharm.Res.10697-702)。例如，對于胰島素，在最佳情況下，離子電滲轉(zhuǎn)運的效率為4％/小時，通常低于3％/小時；所觀察的部分轉(zhuǎn)運或許是由于皮膚損傷(Siddiqui，O.；Chien，Y.W.的綜述，肽和蛋白類藥物的非胃腸給藥，Crit.Rev.Therap，Drug Carrier Syst.1987，3195-208)。
該問題部分是由于大分子質(zhì)量高，也由于大多數(shù)大分子的親水性，這兩者因素對于一般使用常規(guī)皮膚滲透促進技術(shù)都存在極大的困難。
其它大的穿透劑的情況也較差。至今，僅有一篇文獻涉及了驅(qū)動大的類脂聚集體、脂質(zhì)體穿透皮膚的問題，但沒有找到解決方法(參見進一步的討論)。
因此應(yīng)該說在本發(fā)明之前，還沒有一種已知方法能確保大的穿透劑電滲通過微孔屏障，例如哺乳動物皮膚。另外，至今也沒有人提出開通皮膚大孔道的通用方法。這對于需要經(jīng)皮釋放大分子例如肽和蛋白質(zhì)，以及長期以來人們需要控制聚集體穿透任何類型轉(zhuǎn)運屏障的愿望來說都是令人遺憾的。
聚集體穿透生物屏障例如角質(zhì)層的程度和機制存在著很大的爭議(Cevc，G.(1996)，皮膚上的類脂懸浮體.滲透促進、囊滲透和藥物的透皮傳送，CritRev.Therap.Drug Carrier Systems.13257-388)，對通過皮膚的滲透途徑也存在很大爭議。我們不只一次地討論趨水性是轉(zhuǎn)運表面親水的、高度變形泡囊通過生物屏障(例如皮膚)的最重要因素(Cevc，G.(1996)，皮膚上的類脂懸浮體.滲透促進、泡囊滲透和藥物的透皮給藥，Crit.Rev.Therap.Drug CarrierSystems.13257-388；Cevc，G.(1997)，穿過皮膚的藥物傳遞，Exp.Opin.Invest，Drugs 61887-1937)。我們的爭論是擴散不是轉(zhuǎn)運大的聚集體(即類脂泡囊)穿透這類屏障的好方法。
這其中的第一個原因是任何一種具有有效質(zhì)量的大聚集體的滲透性(Pa)非常低，滲透性通常與聚集體的數(shù)量(na)成正比。因為Pa值與擴散常數(shù)(Da)有關(guān)，這類大的物質(zhì)的滲透性和流量都會隨聚集體尺寸逐漸增大而呈線性降低。(Pa與Da～Dl/na成正比，其中Dl是單體的擴散常數(shù))。
聚集體擴散性低的第二個原因是聚集體穿越屏障能達到的最大濃度差很小(Δca＝Δcl/na，其中cl是飽和單體濃度)。正如第一Fick定律計算的那樣，流量jm＝PaΔca與DaΔca～DlΔcl/na2成正比。
由上述提及的兩種現(xiàn)象，得到Da(na＞＞1)→0并且Δca(na＞＞1)→0，這有助于泡囊轉(zhuǎn)運的可忽略的小的屏障滲透性Pa(na＞＞1)→0。
利用水活性梯度(Δaw)即趨水性來驅(qū)動穿越屏障轉(zhuǎn)運解決了第一部分的滲透性問題。我們對此的解釋是不依賴于水活性梯度的聚集體對聚集體中的所有極性分子表現(xiàn)出類似的吸引力；這種力使作用于各種聚集體上的壓力成比例增強，ΔPhyd.a～ΔawRTna，或者驅(qū)動聚集體轉(zhuǎn)運通過屏障的力相應(yīng)增強，F(xiàn)hvd.對聚集體的這兩種力要比對單分子的大得多。這補償了聚集體濃度差小的影響，從通用的Fick方程式中可以看出ja＝PaΔca+Pa”ΔawRTna～P’anaFhyd.lFhyd.l表示作用于聚集體中各單體的力，RT是熱能。
為最大程度地獲得“外部”轉(zhuǎn)運驅(qū)動力(該驅(qū)動力與滲透劑/穿透劑濃度無關(guān))，可使用PCT/EP 91/01596中描述的可變形聚集體。這樣由于將其推至設(shè)定的線性依賴性以下而降低了隨聚集體數(shù)量增加而增加的轉(zhuǎn)運阻力(見附

圖1)。
這方面的一個實例是由變形能量較低而具有足夠柔軟性的膜構(gòu)成的泡囊。當該囊受到強烈的各向異性(理想的是單向)應(yīng)力、“力量”或壓力時，尤其如此。在相應(yīng)條件下，分子聚集體與膜柔軟性的組合，即使當這類屏障的孔小于所述囊的直徑時，也可致使囊通過屏障。由此可使明顯的物流按所需的方向進行流動。
對每種外部的力(Fext)或壓力(Δpext)也一樣考慮，因此與濃度無關(guān)。其條件是聚集體大小對力的依賴性增加-或者導(dǎo)致穿越屏障壓力差的增加-超過了滲透性(Pa)隨聚集體增大而降低。由此得到穿越屏障的凈轉(zhuǎn)運量。附圖1描繪了這種關(guān)系。如果驅(qū)動力隨各移動物體上的電荷數(shù)呈線性增加并且條件是這類物體的轉(zhuǎn)運阻力的增加迅速低于驅(qū)動力(全線)，則最終可以得到凈轉(zhuǎn)運。這種情況是孔形狀適合的穿透劑。當穿透劑變得足夠大，驅(qū)動力超過轉(zhuǎn)運阻力，可進行有效的轉(zhuǎn)運。但如果穿透劑不能適應(yīng)于屏障的孔，當“穿透劑”平均大小超過孔的平均直徑時(虛線)時，則屏障的阻力不可避免地會超過驅(qū)動力。
只要轉(zhuǎn)運驅(qū)動力是恒定的或者只要轉(zhuǎn)運阻力的增加不超過尺寸大小依賴性的驅(qū)動力的升高，上述推理就可以應(yīng)用。受到足夠高外部壓力(Δpext，a)的可高度變形的聚集體就是這種實例；一般的、基本不可變形的聚集體在較小類似壓力下就會出現(xiàn)相反的情況，因為這些聚集體在穿越屏障時容易破裂。
外部電力(Fel)的情況下，可導(dǎo)致所謂的電泳，其應(yīng)用原理基本相似，但更為復(fù)雜并且以前并不為人所認知。
假設(shè)在最簡單的情況下，其中聚集體包含na個帶電分子，每個電荷為Ze0，并且相應(yīng)的抗衡離子是該系統(tǒng)中唯一的其它帶電體，聚集體轉(zhuǎn)運的速率隨聚集體大小或數(shù)量以及跨屏障電勢(E)梯度呈線性增加。只要轉(zhuǎn)運阻力保持恒定，情況就是如此，然后通過Fel＝naZe0E給出驅(qū)動力，并且Pa值被認為是恒定的。但是，如果轉(zhuǎn)運阻力依賴于聚集體的大小，并且也隨著na、Pa值的降低而增加，因此可以消除對聚集體數(shù)量變化的轉(zhuǎn)運速率敏感性。由于轉(zhuǎn)運阻力的升高速率高于線性升高速率，當Pa值的降低快于線性速率時，轉(zhuǎn)運速率隨na升高而降低。
因此，在上述三種情況的第一種情況下，人們僅期望一種有效的電泳。這在實際中容易產(chǎn)生更多的問題。幾乎所有帶電聚集體的懸浮液除了陰離子聚集體成分外，還含有與聚集體具有相同電荷的小離子。這些小的、外加的電荷與聚集體的電場作用并以相同方向侵入屏障。結(jié)果，“小電荷”的寄生流開始流動，最終抵消跨越屏障的電勢。如果這類“機會電荷”的轉(zhuǎn)運阻力小于有用的聚集體的阻力(情況通常如此)，聚集體的轉(zhuǎn)運最終可能會停止。
大物體電泳中的另一個預(yù)計的復(fù)雜情況是施加的電勢可能會優(yōu)先將聚集體的各帶電分子推過屏障，而不是傳送整個聚集體。預(yù)計有尺寸依賴性的轉(zhuǎn)運阻力符合這種情況，尤其是水溶性相對較強的帶電聚集體成分。由不同溶解度的物質(zhì)組成的高度可變的聚集體(PCT/EP 91/01596)完全滿足了這種要求。這對用于電泳的相應(yīng)超級變形囊的適宜性提出了質(zhì)疑。
實際上，僅有一個研究小組發(fā)表了使用脂質(zhì)體作為“滲透促進劑”獲得非常嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)，并報道了關(guān)于電驅(qū)動物質(zhì)通過皮膚轉(zhuǎn)運的結(jié)果。
第一篇關(guān)于脂質(zhì)體和離子電滲結(jié)合用于透皮給藥的報道，應(yīng)當是與本發(fā)明最接近的現(xiàn)有技術(shù)。Vutla et al.(Vutla，N.B.；Betageri，G.V.；Banga，A.K.(1996)配制在脂質(zhì)體中的腦啡肽的透皮離子電滲釋放，J.Pharm.Sci.，855-8)，報道了下面的內(nèi)容。
脂質(zhì)體包含二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿/膽固醇2/1 mol/mol與非特定量的陽離子性硬脂酰胺或陰離子性磷脂酰絲氨酸混合物，適當?shù)臅r候，制成帶電的囊。它們是通過擠出新制備的，大小為110nm。中性和陰性脂質(zhì)體的釋放高于陽性囊。
根據(jù)分子上的電荷，0.5mAcm-2密度的電流協(xié)同轉(zhuǎn)運[Leu5]腦啡肽從陰極或陽極通過皮膚。
離子電滲12小時后，對于陽性、陰性和中性囊，皮膚中發(fā)現(xiàn)了含量分別為約2.5％、0.75％和1.5％的脂質(zhì)體衍生的物質(zhì)；在沒有電流的情況下，皮膚中發(fā)現(xiàn)0.8％從中性脂質(zhì)體中衍生的物質(zhì)。從受試者體液中沒有回收到脂質(zhì)體衍生物。
使用陰性帶電囊沒有促進腦啡肽通過皮膚傳遞。與對照組相比，陽性脂質(zhì)體甚至減少了傳遞。
對于與電泳結(jié)合使用的中性囊，傳遞進入皮膚的多肽量最高(4.2％)，其次是沒有使用電流的這種囊(被動傳遞2.7％)；使用離子電滲的陰性和陽性囊皮下傳遞的藥物量要低得多，分別為0.5％和0.7％。
Vutla的研究清楚地表明常規(guī)脂質(zhì)體，無論是帶電的或不帶電的，都是電驅(qū)動物質(zhì)轉(zhuǎn)運進入皮膚的不良傳遞介質(zhì)。
因此，對于大的類脂聚集體(如囊)或其它大的單元以通過皮膚傳送為目的，至今還未想到用電驅(qū)動力代替趨水性。
基于前述理由，本發(fā)明的目的是提供一種含穿透劑的制劑，該穿透劑是通過單分子或分子排列形成的，即使在屏障孔的平均直徑小于所述穿透劑的平均直徑時，因為穿透劑與孔適配，所以也能滲透通過所述屏障的孔，并且所述穿透劑能轉(zhuǎn)運藥物使其通過所述孔，或者在穿透劑進入所述孔后，能使藥物穿過所述孔。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種施加跨屏電勢電驅(qū)動轉(zhuǎn)運穿透劑和與其結(jié)合的分子通過屏障孔的方法。
發(fā)明描述我們出人意料地發(fā)現(xiàn)通過外部施加電勢差可使帶電的超變形聚集體囊受力通過人工及天然的毫微孔屏障。條件是該囊有足夠的應(yīng)力，該應(yīng)力必須足以使囊變形。這種情況只有使用具有高柔軟性膜的囊才能實現(xiàn)。該方法涉及整個聚集體的變形，囊的大小與孔的穿透作用的適配性受平均囊/孔徑比率的影響。
我們還發(fā)現(xiàn)帶電聚集體的電運動對電解質(zhì)濃度敏感。出人意料地是，從測定的依賴關(guān)系看，在定性和定量上都偏離了非變形的小穿透劑通過屏障的已知電驅(qū)動的基線。高度變形囊通過“界定”孔的電驅(qū)動運動不同于常規(guī)的電泳，因此提供了通過各種屏障包括生物屏障傳遞藥物的新方法。
顯然，皮膚對超級變形聚集體懸浮液的非阻塞性滲透(隨后施加透皮電勢)可增加最終的電泳流量。我們推測這可能是由于通過非電方法打開了皮膚中的通道。由于有效、非電的通道打開而使器官提高總穿透性因而可用于傳遞帶電的囊穿過屏障。通過在阻塞情況下施加的透皮電勢推動上述囊穿過預(yù)處理的皮膚。
最后但并不是最不重要的一點是與先前看法似乎相反的假說大分子可以通過皮膚有效傳遞。它們的傳遞可通過大分子與帶電的超級可變形載體結(jié)合后進行，包括這類通常不適配的載蛋白轉(zhuǎn)運劑的透皮電驅(qū)動。
我們還討論了適于與電泳結(jié)合應(yīng)用的分子聚集體/相關(guān)物質(zhì)的有關(guān)性質(zhì)。我們僅關(guān)注在足夠大小的跨屏障電勢差的影響下可克服轉(zhuǎn)運屏障的復(fù)合體。我們描述了與這種現(xiàn)象有關(guān)的基本實驗并解釋了它們的結(jié)果。我們得出的結(jié)論適用于本研究中所主張的一般概念的運用。特別令人感興趣的但不是唯一的是我們的新方法可用于人藥和獸藥。
在本發(fā)明中，滲透是指濃度驅(qū)動分子擴散運動通過屏障。穿透是指大穿透物經(jīng)非擴散性運動通過屏障；與穿透有關(guān)的方法一般都誘使屏障阻力的降低(加寬孔或打開通道)。
所以，穿透劑是含有不能滲透通過屏障的單分子或分子聚集體的任何物質(zhì)。另一方面，滲透劑也是可滲透通過(半滲透)屏障的物質(zhì)。穿透劑受到外電場的驅(qū)動力與標稱穿透劑大小和施加電場成正比。如果這種力強至足以使穿透劑變形或加寬屏障的通道使其足以克服穿透劑大小的障礙，或者同時產(chǎn)生所述兩種效果，則這種力就可以推動穿透劑通過屏障。在皮膚中，例如轉(zhuǎn)運驅(qū)動力必須首先將穿透劑插入細胞中以形成寬于有效穿透劑大小的通道。(為獲得穿透劑高速率轉(zhuǎn)運，有效穿透劑大小應(yīng)小于標稱穿透劑大小)。使用可控的和應(yīng)力依賴的可變形穿透劑可實現(xiàn)最佳目標。穿透劑的平均直徑、電荷和/或其對孔的形狀或大小適配性的選擇應(yīng)使其產(chǎn)生電驅(qū)動的運動。
除非另有說明，電勢梯度(通過屏障的)是指任意電勢差的信號或大小。具體地說，產(chǎn)生電勢的電極不必直接放置在屏障上；產(chǎn)生跨屏障梯度的電極任何位置都是可以接受的?！半妱莶睢笔恰半妱萏荻取钡耐x詞。
對于其它定義，尤其是涉及高度變形復(fù)合體(聚集體)及其作用機理，以及選擇的藥物，詳述于我們已公布的或待審的專利中(DE 4107152、PCT/EP91/01596、PCT/EP 96/04526、DE 4447287)。這些專利還具體描述了這類聚集體的基本性質(zhì)和特征。
簡言之，類脂聚集體應(yīng)能補償其變形產(chǎn)生的局部應(yīng)力(變形能量)使其成為可極度變形的。這個目的可通過針對這類應(yīng)力來調(diào)整其局部組成而實現(xiàn)，并且僅在聚集體包含至少兩種成分的情況下可行。按常規(guī)選擇載體成分以便在最大受力部位的較少適配性成分被稀釋時，可將能較好保持變形的成分累積起來。這導(dǎo)致了暫時不穩(wěn)定性(亞穩(wěn)態(tài))，這種狀態(tài)的存在應(yīng)足夠短暫以不致危害聚集體的完整性。在上面提及的專利(申請)中被稱為傳遞體(Transfersome)的高度可變形的泡囊的設(shè)計尤其應(yīng)滿足這種需求并符合聚集體超變形性的要求。
穿透溫度通常在0-95℃。優(yōu)選在18-70℃，更優(yōu)選在15-45℃的溫度范圍。測定的皮膚溫度一般為32℃。然而，值得一提的是，對于含有可冷凍或非揮發(fā)性成分、冷或熱穩(wěn)定劑的體系，其它溫度范圍也是可以的。
如果需要保持完整性和各體系成分所需的性質(zhì)，可將含或不含活性成分的載體制劑冷藏(如，4℃)。也可以有時也有意要在惰性氣氛下例如氮氣氛下進行制造和保存?？赏ㄟ^使用一些不飽和的物質(zhì)，例如加入抗氧劑、螯合劑(chellators)和其它穩(wěn)定劑，或者從凍干或干燥混合物的特別制備方法來延長(含藥物的)載體制劑的保存期。
在大多數(shù)情況下，本發(fā)明在室溫下完成。使用混懸劑并在較低和較高溫度下并施加電勢均是可以的。這對于包含合成物質(zhì)的制劑具有特殊意義，所述物質(zhì)的溫度在室溫和皮膚或其它屏障溫度之間時具有剛性。
與電泳結(jié)合使用的制劑可在應(yīng)用部位進行制備。下列文獻中給出了帶電或不帶電的類脂囊我們以前的德國專利申請和“脂質(zhì)體”手冊(Gregoriadis，G.，Hrsg.，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)l.，Vols 1-3，1987)、專題論文集“作為藥物載體的脂質(zhì)體”(Gregoriadis，G.，Hrsg.，John Wiley & Sons，New York，1988)或?qū)嶒炇沂謨浴爸|(zhì)體使用手冊”(New，R.，Oxford-Press，1989)。如果需要，可在臨用前，稀釋或濃縮藥物(通過超離心或超濾)的懸浮液；在這時或之前也可加入添加劑。在任何系統(tǒng)操作之后，應(yīng)檢測載體的特性，并且如果需要，進行重新調(diào)整。
本發(fā)明涉及一種含穿透劑的制劑，該穿透劑是由單分子或分子排列形成的，其中所述穿透劑即使在屏障孔的平均直徑小于該穿透劑的平均直徑時，因為該穿透劑與孔適配也能滲透通過屏障的孔。如此，穿透劑能通過屏障的孔轉(zhuǎn)運藥物。當穿透劑進入孔時，穿透劑擴寬孔或打開通道?；蛘咚幬锿ㄟ^屏障中的(已經(jīng)打開的或加寬的)孔滲透而將物質(zhì)滲入所述的孔。選擇所述穿透劑的平均直徑和適配性并使所述穿透劑和/或所述藥物帶有足夠的電荷，在適當?shù)碾婒?qū)動力的影響下，使藥物或控制藥物被所述穿透劑轉(zhuǎn)運通過所述孔，或者另一種情況是在穿透劑穿入所述孔后，藥物滲透通過所述孔，這種選擇應(yīng)當同時保持足夠的穿透穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是，所述穿透劑至少在與藥物結(jié)合時具有足夠的電荷，并且在沒有電驅(qū)動力的作用下，穿透劑不易穿透屏障的孔；該帶電穿透劑或穿透劑和藥物的帶電結(jié)合體的平均直徑、電荷種類和數(shù)量和/或適配性的選擇應(yīng)當能控制藥物在電驅(qū)動力影響下通過屏障轉(zhuǎn)運。
另外優(yōu)選的是，如果穿透劑至少在與藥物結(jié)合時帶有足夠的電荷，并在沒有電驅(qū)動力的存在下，該穿透劑能通過屏障的孔；該帶電穿透劑或穿透劑和藥物的帶電結(jié)合體的平均直徑、電荷種類和數(shù)量和/或適配性的選擇應(yīng)當能控制藥物在電驅(qū)動力影響下通過屏障轉(zhuǎn)運。
還優(yōu)選的是，在適宜驅(qū)動力的影響下所述穿透劑能穿透所述孔，當穿透劑帶有適宜的電荷時，所述驅(qū)動力可以是電驅(qū)動力，并且在所述穿透劑進入所述孔后，使或者控制帶有足夠電荷的藥物滲透通過屏障的孔。
在本發(fā)明的一個特定方案中，所述制劑的特征在于帶電穿透劑通過帶電單分子或帶電分子的排列形成，并且所述穿透劑與一種或數(shù)種帶電或不帶電的藥物分子結(jié)合。
或者，上述穿透劑通過電中性的單分子或電中性的分子排列形成并且與至少一種帶電藥物結(jié)合，電荷的量應(yīng)足以進行轉(zhuǎn)運。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，將所述穿透劑懸浮于或分散于液體介質(zhì)中，其中包含的分子排列形式是由至少兩類或兩種形式的具有聚集傾向的兩親物質(zhì)的一層或數(shù)層類膜衣包圍的小液滴形式，所述至少兩種物質(zhì)在液體介質(zhì)優(yōu)選水中的溶解度相差至少10倍(factor)，這樣較易溶物質(zhì)的均聚集體的平均直徑或包括兩種所述物質(zhì)的雜聚集體的平均直徑小于溶解性較差物質(zhì)的均聚集體的平均直徑。
如果較易溶物質(zhì)是將被轉(zhuǎn)運通過屏障的藥物，并且具有與溶解性較差物質(zhì)形成較大的共同結(jié)構(gòu)的傾向，則是有利的。所述共同結(jié)構(gòu)可包括物理或化學復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是，如果較易溶物質(zhì)能溶解穿透劑小液滴并且該物質(zhì)的含量可高達溶解所述液滴所需的濃度的99mol％或者是與未溶解液滴中的飽和濃度的99mol％相應(yīng)，以較高的為準。
優(yōu)選較易溶物質(zhì)的含量低于所述物質(zhì)相應(yīng)溶解濃度的50％，更優(yōu)選40％，最優(yōu)選30％。
根據(jù)本發(fā)明，較易溶物質(zhì)的含量低于液滴中所述物質(zhì)的飽和濃度的99％，優(yōu)選80％，最優(yōu)選60％。
如果溶解性較差的自身聚集性物質(zhì)是類脂物質(zhì)，并且較易溶物質(zhì)是表面活性劑，則是有利的。
優(yōu)選的是，穿透劑的平均直徑為40～500nm，優(yōu)選50～250nm，更優(yōu)選55～150nm，尤其優(yōu)選在60～120nm。
還優(yōu)選的是，穿透劑的平均直徑比屏障的孔的平均直徑大2～25倍，優(yōu)選2.25～15倍，更優(yōu)選大2.5～8倍，最優(yōu)選比所述孔的平均直徑大3～6倍。
根據(jù)本發(fā)明，還有利的是液滴表面平均凈電荷密度為0.05Cbm-2(庫侖/平方米)～0.5Cbm-2，優(yōu)選0.075Cbm-2～0.4Cbm-2，尤其優(yōu)選0.10Cbm-2～0.35Cbm-2。
優(yōu)選的是，用于人或動物皮膚的制劑中液滴的重量優(yōu)選為制劑總物質(zhì)的0.01～40重量％，尤其是0.1～30重量％，更優(yōu)選為5～20重量％。
還優(yōu)選的是，用于人或動物粘膜的制劑中液滴的重量為0.0001～30重量％。
本發(fā)明公開的優(yōu)選方案中的藥物是促腎上腺皮質(zhì)激素、抗腎上腺素劑、雄激素和抗雄激素、殺寄生蟲藥、合成代謝劑、麻醉劑或止痛劑、強壯劑、抗過敏藥、抗心率失常藥、抗動脈硬化劑、止喘藥和/或支氣管解痙劑、抗生素、抗抑郁劑和/或抗精神病藥、抗糖尿病藥、解毒劑、止吐劑、鎮(zhèn)癲癇劑、抗纖維蛋白分解劑、解痙劑或抗膽堿能劑、酶、輔酶或相應(yīng)的酶抑制劑、抗組胺劑、抗高血壓劑、抗低血壓劑、抗凝劑、抗霉菌劑、抗肌無力劑、抗阿爾茨海默氏病或帕金森氏病的藥物、消炎劑、退熱劑、抗風濕劑、抗菌劑、呼吸興奮劑或呼吸刺激劑、支氣管炎劑、強心劑、化療藥物、冠脈擴張劑、細胞抑制劑、利尿劑、神經(jīng)節(jié)(genglium)-阻滯劑、糖皮質(zhì)激素、抗流感藥、止血劑、安眠藥、免疫球蛋白或其片段或者任何其它免疫活性物質(zhì)(例如免疫調(diào)節(jié)劑、細胞因子等)、生物活性碳水化合物(衍生物)、避孕藥、抗偏頭痛藥、皮質(zhì)類固醇、肌肉松弛劑、鎮(zhèn)靜劑、神經(jīng)治療劑、(多)核苷酸、神經(jīng)安定劑、神經(jīng)遞質(zhì)、(多)肽(衍生物)、鴉片制劑、眼用藥、擬(副)交感神經(jīng)藥、抗(副)交感神經(jīng)藥、蛋白質(zhì)(衍生物)、牛皮癬/神經(jīng)性皮炎藥、擴瞳藥、精神刺激劑、鼻科用藥、催眠劑、鎮(zhèn)靜劑、解痙劑、抗結(jié)核病藥、泌尿科用藥、血管收縮劑或血管擴張劑、抗病毒劑、傷口愈合劑、任何活性的上述藥物或其組合物的抑制劑(拮抗劑)或促進劑(激動劑)。
特別有利的是選擇液體介質(zhì)的特性、尤其是基礎(chǔ)電解質(zhì)的濃度和組成以控制穿透劑通過屏障孔進行有效轉(zhuǎn)運。
根據(jù)本發(fā)明，在單價(1∶1)的物質(zhì)中或其它底價電解質(zhì)中選擇基礎(chǔ)電解質(zhì)，尤其是緩沖劑，其體積濃度優(yōu)選低于150mM，更優(yōu)選低于100mM，最優(yōu)選低于50mM，并且尤其優(yōu)選不高于10mM。
此外，本發(fā)明提供了影響電驅(qū)動轉(zhuǎn)運上述穿透劑和結(jié)合的分子通過屏障的孔的方法，該方法的特征在于用足夠的電勢跨越屏障。
根據(jù)本發(fā)明，用于產(chǎn)生跨屏電勢的電極位于屏障的相對兩邊或同一邊并且將其排列成能確保所產(chǎn)生的絕大部分電流流過屏障。
對于每平方厘米的屏障表面，施加的電勢優(yōu)選低于30V，通常低于15V，更優(yōu)選低于10V。有利的是電勢驅(qū)動所產(chǎn)生的穿過屏障的電流是生理可耐受的，通常低于2mAcm-2、優(yōu)選低于1mAcm-2，更優(yōu)選低于0.6mAcm-2，最優(yōu)選低于0.4mAcm-2。
電極的尺寸優(yōu)選小于200cm2，更優(yōu)選小于100cm2，尤其是小于50cm2，最優(yōu)選小于10cm2，或者甚至小于5cm2。
根據(jù)本發(fā)明，電極的導(dǎo)電材料包括至少一種金屬，尤其是選自貴金屬，如銀和鈀，和/或這類金屬的生物相容性鹽或化學復(fù)合物，優(yōu)選生物相容性氯化物，最優(yōu)選氯化銀。
有利的是至少一個電極室裝有帶電穿透劑。
電極在應(yīng)用部位安裝或預(yù)先安裝也是有利的。
電極優(yōu)選在臨用前安裝，優(yōu)選在臨用前360分鐘內(nèi)，更優(yōu)選在臨用前60分鐘，甚至30分鐘內(nèi)安裝。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，電極裝有預(yù)先結(jié)合了待轉(zhuǎn)運分子，尤其是(生物活性)藥物的帶電穿透劑。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方案中，電極裝有穿透劑和待轉(zhuǎn)運分子，尤其是藥物，在裝載期間或之后與其結(jié)合。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，用一種或多種程序化的，優(yōu)選是小的便攜式或自帶式(例如手表式)的一次性或重復(fù)使用的器件控制所加電勢的極性、大小和/或時間依賴性。
最好是選擇不同處理的表面來控制這種轉(zhuǎn)運。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方案中，在引發(fā)帶電穿透劑的電驅(qū)動轉(zhuǎn)運之前，將適宜的穿透劑非阻塞性應(yīng)用于可改性的屏障上，尤其是由人或動物皮膚形成的屏障，由此對屏障進行預(yù)處理，以增加屏障中可穿透孔的數(shù)量或?qū)挾?，隨后用于穿過該預(yù)處理的皮膚屏障的電驅(qū)動轉(zhuǎn)運。
用于預(yù)處理屏障的帶電或不帶電的穿透劑優(yōu)選與隨后用于電驅(qū)動轉(zhuǎn)運的穿透劑相似或相同。
有利的是，在引發(fā)電驅(qū)動轉(zhuǎn)運帶電穿透劑和/或滲透劑透過屏障之前，非封閉性地應(yīng)用帶電的或不帶電的穿透劑至多24小時，甚至更長時間，通常是至多12小時，尤其是至多3小時，更優(yōu)選少于1.5小時，甚至少于30分鐘。應(yīng)強調(diào)的是，本發(fā)明的一個特征在于滲透劑(即任何能滲透通過屏障孔的物質(zhì))的電驅(qū)動轉(zhuǎn)運可通過上述在引發(fā)滲透劑的電驅(qū)動轉(zhuǎn)運之前的屏障進行預(yù)處理得以提高。
有利的是，帶電穿透劑通過屏障孔的轉(zhuǎn)運速率，即流量，被測定為電勢或穿越屏障的電流的函數(shù)。由此得到的函數(shù)可用于使該制劑或其應(yīng)用的最佳化。
下文給出本發(fā)明系統(tǒng)和方法的幾個解釋性實施例應(yīng)該清楚，它們不用于限定或限制本發(fā)明。除非另有說明，所有的溫度是指攝氏度，載體大小以納米為單位，比率和百分數(shù)以摩爾為單位。其它均使用標準SI單位。
除非另有說明，類脂總濃度通常為5重量％，一般稀釋至0.5％。該本體相包括緩沖成分(10mM)，在某些情況下，還包括稀電解質(zhì)(NaCl)。
在市售玻璃容器(Crown，Glass，Inc，USA)中使用實驗室制的鉑電極將其用金屬夾固定。用帶有兩個開孔的硬塑料蓋蓋緊(用空心金屬O型環(huán)密封)該容器，所述開孔用于加料和取樣。實驗期間，這兩個孔中的一個經(jīng)常是打開的，以使水解產(chǎn)生的氣體選出。還應(yīng)避免膜/容器連接破裂。
用微孔膜將新清潔過的電極與接收的液體隔開(例如，空白一側(cè)為10nm，試驗一側(cè)為30nm)。在供體一側(cè)，充填的體積(1.2L)大大高于空白一側(cè)(14.5mL)，其中使電極盡可能與屏障接近。該容器在水平位置上攪拌接收的液體。用小磁力棒進行攪拌，該磁力棒在試驗屏障的上面旋轉(zhuǎn)。該多孔屏障作為代用品或“人工”皮膚用來進行該研究。
確定限電條件，并維持衡流電源(PhoresorIomed，Salt Lake City，USA；一般誤差0.1mA)或衡壓電源(Siemens，Munich，Germany；一般誤差1mV)。使試驗懸浮液與陽極接觸，使空白樣品液體與陰極接觸。
接受液體包含帶電聚合物(藻酸0.25重量％)。首先將該緩沖聚合物溶于無鹽水(購自Elgastat純化單位(ELGA，UK))中，然后用0.01N氫氧化鈉滴定，將pH調(diào)至所需范圍(7～7.3)。為避免在混合類脂囊成分中的變化，接受室中的液體還含有10-5M的最易溶的囊性成分，即臨界膠團濃度的土溫80。加入芐醇(0.5體積％)以防止實驗期間微生物的污染。用一個螺旋泵驅(qū)使接受液循環(huán)通過比色杯(放于熒光計中)并通過其中插入了pH電極的樣品池。所有實驗均在37℃下進行。
連續(xù)讀取數(shù)據(jù)。用安裝有AD-轉(zhuǎn)化器和自編軟件的XT-IBM微機，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為可電分析和貯存的信息。
為進行數(shù)據(jù)比較，我們注意開始期間的數(shù)據(jù)，在此期間限電條件的改變僅為百分之幾。盡可能仔細地估計這些變化以便確定某些附圖所示的誤差。
為避免假陽性的產(chǎn)生，在實驗早期就確認了標記聚集體結(jié)合物的完全性。為測定表面活性劑增溶的標記物在混合類脂微膠團或其它類復(fù)合物中的相對量，試驗了各種懸浮液。該試驗通過將懸浮液推向具有10nm孔的膜來進行。標記的DPH懸浮液得到的流量非常小。但該相應(yīng)的流量值仍要減去最終的囊流量(未穿過10nm孔的)。在用表皮進行是實驗中，用Rho-DHPE作為熒光標記物。Rho-DHPE仍是高親脂性的，但較DPH易溶。由此，前一種標記物的背景信號高于DPH標記的小囊，這從附圖中可以直接看出，而不需要在減去其它的數(shù)據(jù)之后得出。
雖然沒有不帶電的囊發(fā)生轉(zhuǎn)運，但施加的跨屏電勢確實驅(qū)動了帶電小分子(主要是離子)通過屏障，正如從維持恒定電流條件下所見的情況一樣。附圖2在1.2V電勢差(產(chǎn)生0.279mAcm-2的跨屏電流)的情況下，物質(zhì)和囊轉(zhuǎn)運通過屏障的時間依賴性。使用帶電和不帶電的、兩性的類脂囊進行試驗。
由于普通類脂囊(脂質(zhì)體)僅能穿越較其自身直徑大得多的孔的，穿過比囊平均直徑小得多的開孔的聚集體應(yīng)可以忽略不計。附圖1包括無法預(yù)料的和從無前例的數(shù)據(jù)，這是需要討論的問題并需要用新的概念進行解釋。
例如附圖1和2所示的結(jié)果可通過總結(jié)本申請所描述的高度變形性聚集體滲透模型進行解釋(參見，例如Crit.Rev.Therapeutic Carrier Syst.，1997)。本申請的引言部分提出了對這種模型進行改進的基本思想。附圖3與泡囊有關(guān)的DPH熒光的產(chǎn)生，可將泡囊通過微孔屏障的轉(zhuǎn)運作用(滲透)推斷為時間的函數(shù)。該數(shù)據(jù)表明比孔大3倍的脂質(zhì)體不能通過這些阻礙，但是，與一種能使其膜更易變形的成分相混合的較大的、但更易變形的類脂囊的情況則相反。
0.1mol％DPH(相對于DOPG)226mg土溫8099mL磷酸鹽緩沖液，10mM，pH7囊/孔徑比率5.2電驅(qū)動力或參數(shù)電流1.8mA，2.3mA，2.5mA，2.8mA，3mA，4mA電流密度0.429mA/cm2，0.547mA/cm2，0.595mA/cm2，0.666mA/cm2，0.714mA/cm2，0.952mA/cm2實驗方法如實施例1-4所述。但在這一系列實驗中，研究了電勢差的作用。這是第一次使用超過平均孔徑5倍的較大囊進行研究。
附圖3中所示的該系列實驗的結(jié)果證明了施加至少1V跨屏電勢差的必需性，1.1V～1.2V足以轉(zhuǎn)運高度變形的囊通過30nm的孔。為使較大量的物質(zhì)轉(zhuǎn)運通過屏障，跨屏電勢需要超過1.5V。這種幅度的電勢差可產(chǎn)生相當高的[隨機性(opportunistic)]電流(高于0.5mAcm-2)。
因此，顯然高度變形性囊通過屏障的電通道在性質(zhì)上不同于簡單的電泳或囊的大量轉(zhuǎn)運。根據(jù)Ohm定律，可以預(yù)計驅(qū)動電流隨驅(qū)動轉(zhuǎn)運的電勢呈線性增加，對電導(dǎo)率/反向阻力也是如此。在常規(guī)電泳期間確實觀察到了這種線性依賴性和恒定的電阻。但是，在該研究中，發(fā)現(xiàn)了很強的非線性關(guān)系。這不會是改變屏障性質(zhì)的結(jié)果。因此附圖3中顯示的數(shù)據(jù)表明，施加電勢可增強囊穿透屏障的能力。以前曾作過關(guān)于高度變形性囊通過微孔屏障而進行水合驅(qū)動轉(zhuǎn)運的類似報導(dǎo)，這可用高度變形性的混合類脂膜的機械敏感性來解釋。附圖4囊的暫時特性(上圖)和電勢敏感性(下圖)，聚集體/孔徑比率約為5.2，在外部的轉(zhuǎn)運驅(qū)動電勢影響下穿透該轉(zhuǎn)運屏障。
電流1.4mA，1.6mA，1.8mA，2mA，2.5mA，3mA電流密度0.333mA/cm2，0.381mA/cm2，0.429mA/cm2，0.476mA/cm2，0.595mA/cm2，0.714mA/cm2如實施例1-11所述進行實驗和分析。要注意的差別是囊變小了，同時也將使囊穿過屏障所需的最低跨屏電勢降至1.2V(參見附圖4)。即使使用了迄今最高電勢差(1.7V)，電勢依賴性轉(zhuǎn)運增加，浸潤情況也未明顯減弱。但是，使用高于0.8V的電勢差顯然測得了較小的轉(zhuǎn)運流量。附圖5超變形性囊通過較平均聚集體直徑窄4.6倍的孔的滲透特性隨時間的變化(上圖)和電勢敏感性(下圖)。
高于1.3V的跨屏電勢使得DPH的流量(通過干擾，囊轉(zhuǎn)運)對跨屏驅(qū)動電勢的變化不太敏感。還不十分清楚的是用最高的探索性電勢差進行測量是否穿透能力不再增加可鑒別囊轉(zhuǎn)運過程中電勢依賴性的變化的浸潤狀態(tài)(參見實施例29-35)，或者簡單地是由于實驗的不可重復(fù)性。附圖5的中圖給出的數(shù)據(jù)支持了前一種解釋如果這種轉(zhuǎn)運被分析為是時間的函數(shù)，而不是使一定數(shù)量的非限制性離子通過屏障所需的時間的函數(shù)，所有曲線均用高于1V的這組驅(qū)動電勢測得。附圖6電勢差對高度變形的、中等大小的囊通過30nm孔的影響。上圖在恒電流條件下測定的流量隨時間的變化；中圖如上的數(shù)據(jù)，但將時間軸用給定的電流進行歸一化；下圖高度可變形的囊通過電驅(qū)動穿過固定大小的孔的能力。
在不同跨屏電勢和電流下測定的物質(zhì)轉(zhuǎn)運曲線的起始斜率大致上是恒定的。最下圖說明了這種情況，它給出了上圖中所示的歸一化曲線斜率。測定曲線的“前部分”解釋了不太強(如果有的話)的電勢依賴性。相反，后來的時間流量特性(約1小時后)表明該系統(tǒng)性質(zhì)的變化，這可在跨屏電勢或電流足夠高(分別為0.7V和0.225 mA cm-2)的時候看出。觀察到時間滯后對電流相當不敏感，正如附圖2的上圖中所示，但是滯后時間隨電流/電勢的升高確實變短了一些。
改變電壓不能明顯增高屏障的穿透性。因此，上述后來的穿透性變化更可能是由于類脂聚集體通過屏障能力增強所致。我們將這種差異解釋為囊對孔狹窄的適配性適度增加的標志。另一方面，起初的屏障轉(zhuǎn)運可能是由于相對較小的囊的簡單電泳。顯然，許多這樣的囊都是很小的，它們足以通過屏障的孔，或許這就是電介導(dǎo)的(或支持的)“擴散”過程。
附圖6的下圖中顯示的穿透能力數(shù)據(jù)可確定囊的完全適配性(最大的膜伸展性)，從這一點可看出，幾種高電勢的情況基本相同。附圖7相對小的、高度變形的囊通過屏障的30nm孔的電驅(qū)動。上圖由DPH流量計算得到的囊的絕對穿透作用；中圖與上面相同的數(shù)據(jù)作為歸一化時間的函數(shù)；下圖實驗系統(tǒng)(＝DPH得到的囊流量/單位電勢)的相對穿透力。可見兩種不同的轉(zhuǎn)運速率(Φ1和Φ2)表示兩種不同基質(zhì)的轉(zhuǎn)運現(xiàn)象。
比較該實驗和前述實驗測定的物質(zhì)流量、離子流和驅(qū)動電勢數(shù)據(jù)，為解釋聚集體電驅(qū)動通過狹孔的鹽依賴性抑制作用提供了線索。流過屏障的小離子(在此是Cl-)的相對作用大小與鹽的體積濃度成正比。所以，較低的驅(qū)動電勢有能力在較高的鹽濃度下維持恒定的電流通過屏障(見附圖7的下圖)。同時，較低的驅(qū)動電勢容易降低并因此可能降低大穿透劑的適配性和穿透能力(見右上圖)。但后者是使聚集體有效流過窄孔的條件。低于一定的適配性值(適配性受穿透劑/孔徑比例的影響)，聚集體的變形性因而變得很低，以致僅發(fā)生不明顯的轉(zhuǎn)運。
因此，向具有很強應(yīng)力驅(qū)動的可變形復(fù)合聚集體的懸浮液中加入鹽會對跨屏轉(zhuǎn)運產(chǎn)生不利影響。附圖8在不同鹽溶液的存在下，帶電的高度變形性囊穿過30nm孔的人工屏障進行電驅(qū)動轉(zhuǎn)運。左上圖DPH標記的囊的跨屏流量；右上圖復(fù)合聚集體的穿透能力；左下圖驅(qū)動恒定物流通過屏障的電勢隨時間的函數(shù)；右下圖轉(zhuǎn)運驅(qū)動電勢隨NaCl體積濃度的函數(shù)。
在該系列實驗期間，接受腔隙的pH降低約1.5～1.8，與施加電壓幾乎無關(guān)。經(jīng)過第一個小時電泳，pH變化小于1。(如果有變化，這種變化對于囊的電驅(qū)動影響也是很小的)。在流量平穩(wěn)時，供體腔隙的pH則相應(yīng)地變得更加堿性。后者的變化不會改變混合的脂質(zhì)囊上的電荷，因為膜中的離子性PG具有較低的pK＝2.9。至少在實驗的第一部分期間，認為不存在明顯的脂質(zhì)的降解(當帶電膜偏離最佳pH～7.1時，脂質(zhì)快速降解)。附圖9帶電的高度變形的囊通過具有30 nm孔的人工屏障的電驅(qū)動轉(zhuǎn)運。
左上圖屏障的電阻；右上圖恒定電流通過屏障所需的電勢；左下圖包含藻酸的接受腔隙中的pH值；右下圖存在于供體腔隙中的高彈性囊懸浮液的pH。
數(shù)據(jù)解釋當囊轉(zhuǎn)運通過屏障的速率高時，使恒定電流通過孔所需的電勢差開始隨時間迅速降低，最終隨時間升高。我們認為前一種現(xiàn)象是由于系統(tǒng)中高運動性離子的重新分布，尤其是在電極前和屏障附近的離子。第二種情況，在我們看來，其升高緩慢得多，這主要是由于堆積在屏障前的較大的變形性較差的囊逐漸阻塞了孔。
電極上及其周圍的變化可部分解釋屏障穿透性/驅(qū)動電勢值的第二種變化。特別是在使用高電流的情況下，我們經(jīng)?？梢钥吹轿镔|(zhì)(藻酸鹽？)沉淀在參考電極附近。在實驗期間，電極表面總是變成棕色；施加的電勢越高，所產(chǎn)生的電流也越大，這種情況就越明顯。最后但并不是最不重要的，溶液中排放的氫氣和氧氣偶爾會減輕懸浮液產(chǎn)生泡沫，也可能會影響上述的屏障電阻的變化。
表皮的電阻是皮膚完整性的良好標志。它也能鑒別器官屏障性能是否有任何變化。
附圖9給出了在透表皮電泳期間皮膚可變電阻作為時間函數(shù)的例子。附圖10體外進行的系列電泳實驗期間的表皮電阻。
切除皮膚的特定電阻(原來略高于10 kOhm cm-2)總是隨流經(jīng)皮膚的累積電流降低至起始值的約10-20％。該觀測值與起始的特定電阻值與文獻記載相比，文獻給出的人和鼠的皮膚特定電阻值要低20 kOhm cm-2。該稍高一些的電阻降至約10％起始值可能是由于總的累積電流的不同。
我們觀察到在試驗的人和豬的皮膚樣品之間，電阻、或其時間和電流變化沒有明顯區(qū)別。
用兩種皮膚制備方法進行另一個實驗(B部分)。為此，采用2小時或7小時的酶促作用，分別得到較厚(5.4V；3.7V)或較薄(7V)的樣品。并且，使用比A部分實驗稍小些的囊。盡管存在后者的差異，重復(fù)實驗結(jié)果證實了A部分實驗中觀察到的趨勢。它們還揭示了皮膚厚度對通過屏障的囊有效流量的重要性。與B部分中的用熒光標記流量測定法一樣，約22分鐘的滯后時間之后，超級變形性囊通過薄皮膚的轉(zhuǎn)運是相當大的(0.4微克/cm-2/分或約25微克/cm-2/小時，見附圖11)。相反，用兩種較厚的表皮樣品測得流量較小。然而，即使在較高流量下，也觀察到了浸潤現(xiàn)象。這可能是由于阻塞了皮膚中可用數(shù)量有限的孔，尤其是在該試驗使用的條件下。附圖11A)電驅(qū)動轉(zhuǎn)運超級變形性囊通過人表皮(上圖)、屏障的電阻(中圖)和電泳實驗期間接受腔隙中的pH(下圖)。
B)帶電囊通過施加電勢的薄或厚表皮樣品的轉(zhuǎn)運。
在約30分鐘的滯后時間后，開始觀察到了恒定的囊轉(zhuǎn)運。從以后的90分鐘線性時間內(nèi)計算的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移通過屏障的速率約為4微克/小時/cm-2。之后，根據(jù)用非放射性標記物進行的其它測量，未觀察到明顯的轉(zhuǎn)運。
該試驗清楚地證明了帶電載體(這里是由于DOPG的存在)可用于將不帶電的物質(zhì)(這里是3H-DPPC)通過施加電勢差的屏障進行電轉(zhuǎn)運。
附圖12與帶電的超級變形性囊結(jié)合的不帶電分子通過鼠表皮進行體外的電控轉(zhuǎn)運。
權(quán)利要求
1.一種含穿透劑的制劑，該穿透劑由單分子或分子排列形成，由于其與屏障的孔能很好適配，故能透過屏障的孔，即使當所述屏障的孔小于所述穿透劑的平均直徑時也能透過，并且所述穿透劑能使藥物透過孔而轉(zhuǎn)運，或者在穿透劑進入所述孔后使藥物透過孔；選擇所述穿透劑的平均直徑和適配性，并使所述穿透劑和/或所述藥物具有足夠的電荷，以便在適當電驅(qū)動力的影響下所述穿透劑能使和/或控制藥物轉(zhuǎn)運通過所述孔，或者在穿透劑進入所述孔后藥物透過所述孔，在保持足夠穿透穩(wěn)定性的同時進行所述的選擇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其特征在于所述穿透劑至少在與藥物結(jié)合時具有足夠的電荷，但在沒有電驅(qū)動力的影響下，穿透劑不易穿透屏障孔；選擇帶電穿透劑或穿透劑與藥物的帶電結(jié)合體的平均直徑、電荷的種類和數(shù)量和/或適配性，以實現(xiàn)在電驅(qū)動力的影響下控制所述的通過屏障轉(zhuǎn)運。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其特征在于所述穿透劑至少在與藥物結(jié)合時具有足夠的電荷，并所述穿透劑在沒有電驅(qū)動力的影響下能穿過屏障的孔；選擇帶電穿透劑或穿透劑與藥物的帶電結(jié)合體的平均直徑、電荷的種類和數(shù)量和/或適配性，使之在電驅(qū)動力的影響下控制藥物通過屏障轉(zhuǎn)運。
4.權(quán)利要求1-3任一項的制劑，所述穿透劑在適宜驅(qū)動力的影響下能穿過所述孔，當穿透劑帶有適宜的電荷時，所述驅(qū)動力可以是電驅(qū)動力，并且所述藥物具有足夠的電荷，所述穿透劑借助于電驅(qū)動力進入所述的孔之后使藥物和/或控制藥物滲透通過屏障的孔。
5.權(quán)利要求1-4任一項的制劑，其特征在于該帶電穿透劑或穿透劑與藥物的帶電結(jié)合體的平均直徑比屏障孔平均直徑至少大到2倍。
6.權(quán)利要求1-5任一項的制劑，其特征在于該穿透劑由帶電單分子或帶電分子的排列形成，并且與一種或多種帶電的或不帶電的藥物分子結(jié)合。
7.權(quán)利要求1-5任一項的制劑，其特征在于該穿透劑由電中性的單分子或電中性分子排列形成，并且與至少一種帶電藥物結(jié)合，該電荷的量應(yīng)足以能夠進行轉(zhuǎn)運。
8.權(quán)利要求6或7的制劑，其特征在于所述穿透劑懸浮于或分散于液體介質(zhì)中，并包含由至少兩類或兩種形式的具有聚集傾向的兩親物質(zhì)的一層或數(shù)層類膜涂層包圍的小液滴形式的分子排列，所述至少兩種物質(zhì)在優(yōu)選水的液體介質(zhì)中的溶解度相差至少10倍，這樣較易溶物質(zhì)的均聚集體的平均直徑或包括兩種所述物質(zhì)的雜聚集體的平均直徑小于溶解性較差物質(zhì)的均聚集體的平均直徑。
9.權(quán)利要求8的制劑，其特征在于較易溶物質(zhì)是被轉(zhuǎn)運通過屏障的藥物，并且具有與溶解性較差物質(zhì)形成較大共同結(jié)構(gòu)的傾向。
10.權(quán)利要求9的制劑，其特征在于所述共同結(jié)構(gòu)包括這些物質(zhì)的物理或化學復(fù)合物。
11.權(quán)利要求8、9或10的制劑，其特征在于較易溶物質(zhì)趨于溶解穿透劑小液滴并且該物質(zhì)的含量最高為溶解該液滴所需的濃度的99mol％或者最高為未溶解液滴中的飽和濃度的99mol％，以較高的為準。
12.權(quán)利要求11的制劑，其特征在于較易溶物質(zhì)的含量低于所述物質(zhì)相應(yīng)溶解濃度的50％，更優(yōu)選40％，最優(yōu)選30％。
13.權(quán)利要求11的制劑，其特征在于較易溶物質(zhì)的含量低于液滴中所述物質(zhì)的飽和濃度的99％，優(yōu)選80％，最優(yōu)選60％。
14.權(quán)利要求8-13任一項的制劑，其特征在于溶解性較差的本身聚集的物質(zhì)是類脂物質(zhì)，并且較易溶物質(zhì)是表面活性劑。
15.權(quán)利要求8-14任一項的制劑，其特征在于該穿透劑的平均直徑為40～500nm，優(yōu)選50～250nm，更優(yōu)選55～150nm，尤其優(yōu)選在60～120nm 。
16.權(quán)利要求8-14任一項的制劑，其特征在于該穿透劑的平均直徑比屏障孔的平均直徑大2～25倍，優(yōu)選2.25～15倍，更優(yōu)選2.5～8倍，最優(yōu)選3～6倍。
17.權(quán)利要求8-16任一項的制劑，其特征在于液滴表面平均凈電荷密度為0.05Cbm-2(庫侖/平方米)～0.5Cbm-2，優(yōu)選0.075Cbm-2～0.4Cbm-2，尤其優(yōu)選0.10Cbm-2～0.35Cbm-2。
18.權(quán)利要求8-17任一項的制劑，其特征在于用于人或動物皮膚的制劑中液滴的重量為總的制劑物質(zhì)的0.01～40重量％，尤其是0.1～30重量％，更優(yōu)選為5～20重量％。
19.權(quán)利要求8-17任一項的制劑，其特征在于用于人或動物粘膜的制劑中液滴的重量為0.0001～30重量％。
20.權(quán)利要求8-19任一項的制劑，其特征在于所述藥物是促腎上腺皮質(zhì)激素、抗腎上腺素劑、雄激素和抗雄激素、殺寄生蟲藥、合成代謝劑、麻醉劑或止痛劑、強壯劑、抗過敏藥、抗心率失常藥、抗動脈硬化劑、止喘藥和/或支氣管解痙劑、抗生素、抗抑郁劑和/或抗精神病藥、抗糖尿病藥、解毒劑、止吐劑、鎮(zhèn)癲癇劑、抗纖維蛋白分解劑、解痙劑或抗膽堿能劑、酶、輔酶或相應(yīng)的酶抑制劑、抗組胺劑、抗高血壓劑、抗低血壓劑、抗凝劑、抗霉菌劑、抗肌無力劑、抗阿爾茨海默氏病或帕金森氏病的藥物、消炎劑、退熱劑、抗風濕劑、抗菌劑、呼吸興奮劑或呼吸刺激劑、支氣管炎劑、強心劑、化療藥物、冠脈擴張劑、細胞抑制劑、利尿劑、神經(jīng)節(jié)阻滯劑、糖皮質(zhì)激素、抗流感藥、止血劑、安眠藥、免疫球蛋白或其片段或者任何其它免疫活性物質(zhì)例如免疫調(diào)節(jié)劑、細胞因子等、生物活性碳水化合物或衍生物、避孕藥、抗偏頭痛藥、皮質(zhì)類固醇、肌肉松弛劑、鎮(zhèn)靜劑、神經(jīng)治療劑、(多)核苷酸、神經(jīng)安定劑、神經(jīng)遞質(zhì)、(多)肽(衍生物)、鴉片制劑、眼用藥、擬(副)交感神經(jīng)藥、抗(副)交感神經(jīng)藥、蛋白質(zhì)(衍生物)、牛皮癬/神經(jīng)性皮炎藥、擴瞳藥、精神刺激劑、鼻科用藥、催眠劑、鎮(zhèn)靜劑、解痙劑、抗結(jié)核病藥、泌尿科用藥、血管收縮劑或血管擴張劑、抗病毒劑、傷口愈合劑、任何活性的上述藥物或其組合物的抑制劑(拮抗劑)或促進劑(激動劑)。
21.權(quán)利要求8-20任一項的制劑，其特征在于選擇的液體介質(zhì)的特性、尤其是基礎(chǔ)電解質(zhì)的濃度和組成應(yīng)使該穿透劑或控制該穿透劑通過屏障孔進行有效轉(zhuǎn)運。
22.權(quán)利要求8-21的制劑，其特征在于所述基礎(chǔ)電解質(zhì)，尤其是緩沖劑是選自單價(1∶1)的電解質(zhì)或其它低價電解質(zhì)，其體積濃度優(yōu)選低于150mM，更優(yōu)選低于100mM，最優(yōu)選低于50mM，并且尤其優(yōu)選不高于10mM。
23.一種影響前述任一種權(quán)利要求定義的電驅(qū)動轉(zhuǎn)運穿透劑和結(jié)合分子通過屏障孔的方法，其特征在于施加足夠的跨屏電勢。
24.權(quán)利要求23的方法，其特征在于用于產(chǎn)生跨屏電勢的電極位于屏障的相對兩邊或同一邊并且將其排列成能確保所產(chǎn)生的絕大部分電流流過屏障。
25.權(quán)利要求23或24的方法，其特征在于對于每平方厘米的屏障表面施加的電勢低于30V，通常低于15V，更優(yōu)選低于10V。
26.權(quán)利要求23或24的方法，其特征在于施加電勢產(chǎn)生的跨屏驅(qū)動電流是生理可耐受的，通常低于2mAcm-2、優(yōu)選低于1mAcm-2，更優(yōu)選低于0.6mAcm-2，最優(yōu)選低于0.4mAcm-2。
27.權(quán)利要求23-26任一項的方法，其特征在于電極的尺寸小于100cm2，更優(yōu)選小于100cm2，尤其是小于50cm2，最優(yōu)選小于10cm2，或者甚至小于5cm2。
28.權(quán)利要求23-27任一項的方法，其特征在于電極的導(dǎo)電材料包括至少一種金屬，尤其可選自貴金屬，如銀和鈀，和/或這類金屬的生物相容性鹽或化學復(fù)合物，優(yōu)選生物相容性氯化物，最優(yōu)選氯化銀。
29.權(quán)利要求23-28任一項的方法，其特征在于至少一個電極室盛有帶電穿透劑。
30.權(quán)利要求29的方法，其特征在于電極在應(yīng)用部位安裝或預(yù)先安裝。
31.權(quán)利要求29或30的方法，其特征在于在臨用前安裝電極，優(yōu)選在臨用前360分鐘內(nèi)，更優(yōu)選在臨用前60分鐘，甚至30分鐘內(nèi)安裝。
32.權(quán)利要求29、30或31的方法，其特征在于電極裝有預(yù)先結(jié)合了待轉(zhuǎn)運分子尤其是生物活性藥物的帶電穿透劑。
33.權(quán)利要求29、30或31的方法，其特征在于電極裝有穿透劑和與之結(jié)合的待轉(zhuǎn)運分子，尤其是在裝載期間或之后與穿透劑結(jié)合的藥物。
34.權(quán)利要求23-33任一項的方法，其特征在于用一種或多種程序化的，優(yōu)選是小的便攜式或自帶式例如手表式的一次性或重復(fù)使用的裝置控制所施加的電勢的極性、大小和/或時間依賴性。
35.權(quán)利要求23-34任一項的方法，其特征在于選擇不同治療的表面來控制轉(zhuǎn)運。
36.權(quán)利要求23-35任一項的方法，其特征在于屏障在帶電穿透劑初始進行電驅(qū)動轉(zhuǎn)運之前要進行預(yù)處理，即通過將適宜的穿透劑以非阻塞方式加到可變化的屏障上，尤其是由人或動物皮膚形成的屏障，預(yù)處理可增加屏障中可穿透孔的數(shù)量或?qū)挾?，該屏障就是用于電?qū)動轉(zhuǎn)運的所述預(yù)處理的皮膚屏障。
37.權(quán)利要求36的方法，其特征在于用于預(yù)處理屏障的帶電或不帶電的穿透劑與隨后用于電驅(qū)動轉(zhuǎn)運的穿透劑相似或相同。
38.權(quán)利要求36或37的方法，其特征在于帶電的或不帶電的穿透劑在初始進行電驅(qū)動轉(zhuǎn)運透過屏障之前，非阻塞性加載時間可多達24小時或甚至更長時間，通常是至多12小時，尤其是至多3小時，更優(yōu)選少于1.5小時，甚至少于30分鐘。
39.權(quán)利要求23-38任一項的方法，其特征在于帶電穿透劑通過屏障孔的轉(zhuǎn)運速率即流量被測定為所施加電勢的函數(shù)或穿越屏障的電流的函數(shù)，并且由此測得的函數(shù)被用于使制備或應(yīng)用最佳化。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種含穿透劑的制劑,該穿透劑由單分子或分子排列形成,由于其與屏障的孔能很好適配,故能透過屏障的孔,即使當所述屏障的孔小于所述穿透劑的平均直徑時也能透過,并且所述穿透劑能將藥物透過孔而轉(zhuǎn)運,或者在穿透劑進入所述孔后使藥物透過孔;選擇所述穿透劑的平均直徑和適配性,并使所述穿透劑和/或所述藥物具有足夠的電荷,以便在適當電驅(qū)動力的影響下所述穿透劑能使和/或控制藥物轉(zhuǎn)運通過所述孔,或者在穿透劑進入所述孔后藥物透過所述孔,所述的選擇是在保持足夠穿透穩(wěn)定性的同時進行。本發(fā)明還涉及實現(xiàn)電驅(qū)動轉(zhuǎn)運所述穿透劑和結(jié)合的分子透過屏障孔的方法。
文檔編號A61K47/34GK1322129SQ98814268
公開日2001年11月14日 申請日期1998年9月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月1日
發(fā)明者格雷戈爾·塞夫克 申請人:伊迪亞股份公司