專利名稱：刺猬蛋白的藥物組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及刺猬蛋白(hedgehog proteins)的藥物組合物及其特別在骨和軟骨上局部釋放這些蛋白質(zhì)方面的應用。
人們認為刺猬(hh)蛋白是一族分泌性信號蛋白，它們導致胚胎發(fā)生中多種結構的形成(J.C.Smith，細胞(Cell)76(1994)193-196,N.Perrimon，細胞80(1995)517-520,C.Chiang等，自然(Nature)83(1996)407,M.J.Bitgood等，當代生物學(Curr.Biol.)6(1996)296,A.Vortkamp等，科學(Science)273(1996)613,C.J.Lai等，發(fā)育(Development)121(1995)2349)。在其生物合成期間，在信號序列的裂解以及自動催化裂解之后得到20kDN端結構域和25kDC端結構域。該N端結構域在其天然形式中被膽固醇修飾(J.A.Porter等，科學274(1996)255-259)。在高級生物形式中，該hh族至少包括三種，即發(fā)音的hh(sonic hh)、印度hh(indianhh)和荒漠hh(deserthh)(Shh、Ihh、Dhh；M.Fietz等，發(fā)育(增刊)(1994)43-51)。在原核生物和真核生物中生成之后，觀察到重組產(chǎn)生的刺猬蛋白存在活性差異(M.Hynes等，神經(jīng)元(Neuron)15(1995)35-44以及T.Nakamura等，生物化學與生物物理學研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)237(1997)465-469)。
Hynes等將轉(zhuǎn)化的人胚腎293細胞上清液中的hh(真核生物hh)的活性與從大腸桿菌(E.Coli)產(chǎn)生的hh作了比較，發(fā)現(xiàn)腎細胞系上清液中的hh活性高4倍。討論了該增大的活性的原因是只在真核細胞中表達的潛在另外的輔助因子，翻譯后修飾，不同的N端，因為從大腸桿菌分離的hh包含50％的攜帶兩種另外的N端氨基酸(Gly-Ser)或被減短5～6個氨基酸的hh，或者更高的聚集狀態(tài)(例如通過與鎳瓊脂糖珠結合)。
Nakamura等將轉(zhuǎn)化的雞胚成纖維細胞上清液中的shh的活性與從大腸桿菌分離的仍具有N端聚組氨酸部分的shh融合蛋白作了比較。對于C3H10T 1/2細胞中堿性磷酸酶(AP)的刺激來說，成纖維細胞的上清液中shh的活性比純化的大腸桿菌蛋白的活性高7倍。認為例如骨形成蛋白(BMPs)這樣的分子是增大的活性的原因，這種蛋白只存在于真核細胞上清液中并引起更強的AP誘導作用。
Kinto等在FEBS通訊(FEBS Letters),404(1997)319-323中描述，分泌hh的成纖維細胞誘導i.m.植入術中膠原上形成異位骨。因此刺猬蛋白具有骨誘導活性。
從WO 90/08551得到應用藻酸鹽生產(chǎn)具有延遲釋放功能的蛋白質(zhì)送遞系統(tǒng)的方法。在該方法中形成兩相體系，第一相包含高濃度的蛋白質(zhì)(飽和溶液)，第二相包含藻酸鹽。然而，當大量生產(chǎn)藥物組合物時，這種相分離困難，操作麻煩。
從Kikuchi,A.等，控制釋放雜志(J.Controlled Release)47(1997)21-29得知從藻酸鈣復合體脈動釋放葡聚糖。但是Kikuchi未描述刺猬蛋白與這種復合體的偶合。
Robinson,C.J.等在生物技術趨勢(Trends inBiotechnology)14(1996)451-452中描述了心室內(nèi)植入藻酸鹽微球作為局部應用NGF或NGF-分泌細胞的方法。但是，未描述關于刺猬蛋白的應用。
Downs,E.C.等在細胞生理學雜志(J.Cell.Physiol.)152(1992)422-429中描述了應用藻酸鈣微球作為血管生成因子的送遞系統(tǒng)。但是，未描述該方法或該送遞系統(tǒng)對于刺猬蛋白的應用。
Crey,C.J.和J.Dowsett在生物技術與生物工程(Biotechnol.Bioeng.)31(1988)607-612中描述了藻酸鈣/藻酸鋅微球作為胰島素送遞系統(tǒng)的應用。但是，從該文獻未知該方法在生產(chǎn)刺猬蛋白送遞系統(tǒng)方面的應用。
從Yang等，發(fā)育124(1997)4393-4404得知，要達到活體內(nèi)藥物上有效的活性，則體內(nèi)作用部位上高局部刺猬蛋白濃度必須維持至少達16h。Yang等描述的載體系統(tǒng)類似于Marti等在自然375(1995)322-325中描述的裝填刺猬蛋白的層析介質(zhì)Affigel CM，鎳-瓊脂糖，或者Lopez-Martinez等在當代生物學5(1995)791-796中應用的Affigel Blue或其中應用的肝素-瓊脂糖粒子，它們不適合藥物應用，因為它們是免疫原性的因而能引起炎癥反應。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，只要這些刺猬蛋白僅通過離子相互作用與載體結合，則Kinto等描述的有關hh-表達細胞的生物相容性和可生物降解性載體膠原也不適合刺猬蛋白的最佳局部藥物應用。已發(fā)現(xiàn)當膠原載體在生理條件(pH約為7以及弱酸性(高達pH 4.5))下負載刺猬蛋白時，則大部分應用的刺猬蛋白在數(shù)分鐘內(nèi)就從基質(zhì)釋放出來。根據(jù)本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，該不充分的結合是由于刺猬蛋白和載體之間缺乏足夠的離子相互作用。至于在酸性條件(pH低于4.5)下負載，大量應用的刺猬蛋白被變性并且不可逆地與載體結合。
因此，本發(fā)明的目的是提供刺猬蛋白與生物相容性載體的藥物組合物，其中該載體與呈活性、折疊結構的刺猬蛋白結合并能在活體內(nèi)呈延遲方式以其活性形式釋放刺猬蛋白。這種制劑尤其適合修復骨缺陷和軟骨缺陷，但也能用于修復神經(jīng)元缺損或用于系統(tǒng)送遞。
該目的是通過刺猬蛋白的藥物組合物達到的，該組合物的特征在于該刺猬蛋白與生物相容的親水性載體結合，其中該載體是聚合物，它-作為帶負電荷的載體通過離子相互作用與刺猬蛋白結合，-當刺猬蛋白與其結合時該載體不會使刺猬蛋白變性，-該載體在中性條件下每個單體至少含0.1～1個、優(yōu)選0.1～2個帶負電荷的殘基，-該電荷介于酸性基團例如硫酸基、羧基或磷酸基形式中，-該載體的平均分子量至少是50,000Da。
意外地證明了，如果刺猬蛋白與帶負電荷的可溶性或不溶性聚合物基質(zhì)結合，則刺猬蛋白能在活體內(nèi)呈延遲方式以活性形式可逆地從載體釋放而不會引起活體內(nèi)的均相反應和/或炎癥反應。
優(yōu)選地應用親水性載體基質(zhì)，特別優(yōu)選的是可溶的或不溶的有機親水性載體基質(zhì)。該載體基質(zhì)特別優(yōu)選地包含陰離子型多糖，例如優(yōu)選為透明質(zhì)酸(及其化學交聯(lián)的形式)、硫酸軟骨素、聚硫酸乙烯酯、硫酸角蛋白、葡聚糖硫酸酯、果膠、角叉菜聚糖以及其它親水膠體、硫酸化藻酸鹽、硫酸皮膚素、藻酸鹽(優(yōu)選為藻酸鈣)或者是至少兩種這樣的陰離子型多糖的組合或者是這些帶電荷的多糖與其它聚合物(例如尤其是膠原)的組合，其中帶電荷的多糖重量百分數(shù)是10～50％。本發(fā)明意義中的不溶性基質(zhì)表示，在體外室溫下10～20小時內(nèi)該基質(zhì)基本上不分解或者看不到溶于緩沖溶液中。在這一點上特別優(yōu)選的是，本發(fā)明應用的載體包含少于50％、優(yōu)選少于20％且特別優(yōu)選大體上沒有中性多糖。分子量至少為106道爾頓、尤其分子量為4×106道爾頓的透明質(zhì)酸特別適合作為載體基質(zhì)。
在進一步的實施方案中，已證實基于無機不溶性磷酸鹽(如羥磷灰石或磷酸三鈣)的親水性載體也適合作為本發(fā)明的不溶性載體基質(zhì)。
本發(fā)明的延遲釋放應理解為刺猬蛋白在至少14小時規(guī)定期間以藥理上有效劑量釋放。藥理效果應理解為對神經(jīng)細胞的神經(jīng)效果，軟骨形成和/或誘導軟骨形成以及優(yōu)選為骨生成和/或骨誘導，例如Kinto等在FEBS通訊，404(1997)319-323中描述的骨誘導，Miao等在神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)17(1997)5891-5899中描述的對神經(jīng)細胞的效果，以及Stott等在細胞科學雜志(J.Cell.Sci.)110(1997)2691-2701中描述的軟骨細胞誘導。
優(yōu)選將可酶促降解載體用作該載體，它可被得自細胞的分泌性酶(例如蛋白酶)降解，對所述細胞進行該活體內(nèi)局部應用。然而，載體的半壽命至少應為12h，但可以是數(shù)周。如果載體是由多糖構成的，則該載體優(yōu)選被存在于細胞中并被分泌的糖苷酶和水解酶降解。不過，并非在各種情況中要求載體的這種可生物降解性。如果進行釋放以治療骨質(zhì)疏松癥或神經(jīng)元疾病，就不需可生物降解性。然而，這類載體優(yōu)選在生理條件下溶解性差，因而在較長時間(數(shù)周至數(shù)月)被身體吸收。
需要高濃度的刺猬蛋白溶液以便按這種方式生產(chǎn)涂覆了刺猬蛋白的載體基質(zhì)，使得當局部應用時它們表現(xiàn)適當?shù)乃幮АＲ炎C實涂覆了可藥用的刺猬蛋白的載體應優(yōu)選包含濃度為1～5mg/ml，優(yōu)選為3mg/ml載體或更大的刺猬蛋白。包含濃度為10mg/ml或更大的刺猬蛋白的載體是特別優(yōu)選的。刺猬蛋白本身溶解性差。然而，意外地已證實，在含精氨酸或精氨酸離子(優(yōu)選為硫酸精氨酸)的溶液中刺猬蛋白的溶解性急劇增大。于是，本發(fā)明的又一主題是3mg/ml或更大濃度的刺猬蛋白的水溶液，該溶液含精氨酸和精氨酸離子并且優(yōu)選被緩沖處理。本發(fā)明的又一主題是生產(chǎn)涂覆了刺猬蛋白的載體基質(zhì)的方法，其特征在于該載體基質(zhì)與3mg/ml濃度的、含精氨酸或精氨酸離子的刺猬蛋白溶液保溫，再分離以這種方式涂覆的載體基質(zhì)。
這類溶液適合生產(chǎn)含藥物上有效濃度的刺猬蛋白的載體基質(zhì)，而且該載體基質(zhì)適合藥物應用。這樣，本發(fā)明的又一主題是載體基質(zhì)，其中每ml載體基質(zhì)含3mg或更多、優(yōu)選含10mg或更多的刺猬蛋白，以及含精氨酸或精氨酸離子。精氨酸的濃度優(yōu)選在10～500mmol/l，優(yōu)選在6-8的pH范圍內(nèi)。
本發(fā)明意義中的活性應理解為多肽能在哺乳動物細胞中誘導的堿性磷酸酶(刺激堿性磷酸酶的表達)的活性(堿性磷酸酶分析中的活性)。為此，將小鼠間充質(zhì)細胞系在含胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接著添加無菌過濾的樣品，約5天后將細胞裂解，通過顯色底物(pNP，對硝基苯酚)的裂解(J.Asahina，實驗細胞研究(Exp.Cell.Res.222(1996)38-47以及T.Nakamura(1977))測定細胞裂解液中堿性磷酸酶的活性。
刺猬蛋白在本發(fā)明中應理解為分泌性信號蛋白，它導致胚胎發(fā)生中形成多種結構。發(fā)音的hh、印度hh或荒漠hh被特別優(yōu)選應用(Fietz M.等，發(fā)育(增刊)(1994)43-51)。具有EMBL數(shù)據(jù)庫中在No.L38518下所述序列的hh蛋白被優(yōu)選應用。刺猬族蛋白質(zhì)表現(xiàn)顯著的氨基酸序列同源性，這就是為什么也優(yōu)選表達編碼刺猬蛋白的那些核酸，所述刺猬蛋白具有與前述發(fā)音刺猬蛋白的序列80％或更高的同源性。
人發(fā)音刺猬前體蛋白包括EMBL數(shù)據(jù)庫中在No.L38518下所述序列的氨基酸1～462。氨基酸1～23代表信號肽，氨基酸24～197代表成熟的信號結構域，氨基酸32～197代表減短8個氨基酸的信號結構域，氨基酸198～462則代表自我蛋白酶解之后的自動加工結構域。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含實際上起支持結構物質(zhì)作用的另一種聚合物，它還優(yōu)選具有粘附細胞的功能但不基于離子相互作用結合在刺猬蛋白上。優(yōu)選地，該物質(zhì)是可生物降解的蛋白質(zhì)或水解降解產(chǎn)物，它可例如呈完整蛋白質(zhì)纖維的形式用作溶解蛋白或部分水解蛋白。這些支持結構物質(zhì)優(yōu)選是膠原、明膠、彈性蛋白或纖維蛋白。該支持結構物質(zhì)存在的量優(yōu)選低于本發(fā)明的所述親水性生物相容的載體。因此該支持結構物質(zhì)的比率為30％或更少，優(yōu)選為10％或更少。不過，該支持結構物質(zhì)還可以高于親水性載體的量存在。此時只需本發(fā)明的藥物組合物中親水性載體的量足夠高以保證治療有效量的刺猬蛋白與該親水性載體結合。因而優(yōu)選應用比刺猬蛋白至少多5倍的親水性載體。此外，為制備藥物組合物應在4.5或更大的pH下進行刺猬蛋白與載體的結合。如前所述，已發(fā)現(xiàn)刺猬蛋白在pH低于4.5時變性并且不可逆地結合蛋白質(zhì)類載體(如膠原)。因此，刺猬蛋白與載體應在中性pH范圍內(nèi)進行結合。
除了親水性載體外還包含支持結構化合物的載體例如有蛋白質(zhì)/多糖復合物。優(yōu)選的復合物描述于美國專利4,614,794中。
該藥物組合物是通過將刺猬蛋白與親水性載體在4.5或更大的pH下、優(yōu)選在中性范圍內(nèi)的pH(pH6～8)下保溫而制備的，由此實現(xiàn)刺猬蛋白與載體的結合。優(yōu)選在緩沖溶液中進行保溫。當應用另外還包含可生物降解的蛋白質(zhì)(如膠原)的基質(zhì)作載體時，在pH為4.5或更大時保溫將保證避免刺猬蛋白(它在更低pH值下變性)與可生物降解蛋白的不可逆結合。已發(fā)現(xiàn)只要刺猬蛋白不含疏水性修飾，則在這些條件下刺猬蛋白與可生物降解蛋白不發(fā)生結合或者只發(fā)生可忽略的結合，于是可生物降解蛋白只起支持結構物質(zhì)的作用。
疏水性修飾的(親脂的)刺猬蛋白是這種刺猬蛋白，即與未修飾的hh蛋白(例如在原核生物中重組產(chǎn)生的蛋白)相比顯示表面疏水性的增大。蛋白質(zhì)的親脂度是按Haque,Z.等在農(nóng)業(yè)食品化學雜志(J.Agric.Food Chem.)30(1982)481中所述方法通過在脂質(zhì)層中整合而測定的。這種親脂性hh蛋白按本發(fā)明按照與非親脂性hh蛋白相同的那種方式和親水性載體結合，但它們還與可生物降解蛋白通過疏水性相互作用結合。
要生產(chǎn)該藥物組合物，另外優(yōu)選添加下列輔助物質(zhì)例如糖(甘露糖醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖，優(yōu)選20-100mg/ml)，或者氨基酸如甘氨酸或精氨酸，以及抗氧劑如EDTA，檸檬酸鹽，聚乙二醇(1-10wt％)，洗滌劑，優(yōu)選是非離子型洗滌劑(優(yōu)選0.005～1wt％)如聚山梨醇酯(Tween20或Tween80)或聚氧化乙烯，抗炎組分，局部麻醉劑，抗生素和/或穩(wěn)定劑如脂質(zhì)、脂肪酸和甘油。
在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的刺猬蛋白藥物組合物與蘇拉明結合是優(yōu)選的，這可有效地應用。
該藥物組合物可包含其它藥物輔助物質(zhì)。
在一優(yōu)選的實施方案中，該藥物組合物含濃度為0.1～100mg/ml的刺猬蛋白。
在一優(yōu)選的實施方案中，該藥物組合物另外含藥物上可接受的生物相容性緩沖劑，該緩沖劑優(yōu)選在pH4和pH10之間的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在pH6和pH8之間的范圍內(nèi)，特別在約pH7的pH值。該藥物組合物的pH值應在pH4以上較合適，以防變性以及刺猬蛋白中復合的鋅的移除。緩沖劑的濃度優(yōu)選為1～500mmol/l，更優(yōu)選為5～150mmol/l，特別優(yōu)選為10～100mmol/l。在一合適的實施方案中，將20mmol/l磷酸鉀緩沖劑(pH7.2)，或100mmol/l氯化精氨酸(pH7.2)用作緩沖劑。
如下實施例、文獻和圖進一步闡釋本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍由權利要求書決定。所述方法應理解為甚至在更改后仍描述本發(fā)明的主題的實施例。


圖1從膠原基質(zhì)體外釋放shh。圖2從藻酸鈣膠囊體外釋放shh。圖3從透明質(zhì)酸凝膠體外釋放shh。圖4從藻酸鹽/膠原基質(zhì)體外釋放shh。
實施例實施例1含hh蛋白的藻酸鹽凝膠的制備攪拌hh蛋白溶液(1mg/ml shh在50mg/ml蔗糖、50mM磷酸鉀中的溶液，pH7.2)等分液與藻酸鈉貯備液(Pronova,Biopolymer,NO)(于水中，大于0.1％)使之形成膠狀藻酸鹽蛋白質(zhì)混合物。可直接將該凝膠用作可注射的基質(zhì)或者進一步加工成藻酸鈣膠囊或者以凍干物形式貯存。實施例2含hh蛋白的膠原混合物的制備(比較實施例)將100μl于下列物質(zhì)中的hh溶液(1mg/ml hh)a)20mM磷酸鉀， pH7.4或b)50mM乙酸鈉， pH4.5或c)0.1％三氟乙酸，pH2滴加到大小為10×10×3mm的膠原海綿狀物(Helistat,IntegraLife Sciences,USA)上。然后冷凍(-70℃)該負載的載體，凍干后分析。為此，將該負載的海綿狀物在37℃下適當體積的緩沖液(10mmol/l磷酸鉀，150mmol/l NaCl,pH7.2)中保溫。通過RP-HPLC法測定釋放的hh量。實施例33.1藻酸鈣膠囊的制備在連續(xù)攪拌下，將實施例1中所述含hh蛋白的藻酸鹽凝膠滴加到CaCl2溶液(約1.5％)中。自發(fā)形成含該蛋白質(zhì)的藻酸鈣復合物。形成的膠囊大小取決于滴加液滴的大小且可按所需改變。在CaCl2溶液中保溫5～10分鐘后，過濾出膠囊，在緩沖液(20mmol/l磷酸鉀，pH7.2)中洗滌。這些膠囊可直接作為植入物應用或者可通過凍干法被進一步加工。3.2凍干在-70℃下冷凍該藻酸鈣膠囊，接著凍干。凍干可穩(wěn)定貯存該膠囊，另外也便于植入，因為呈干燥態(tài)的膠囊易于操作。實施例4體外釋放Shh體外釋放動力學分析表明，Shh以延遲方式在至少70h期間從藻酸鈣膠囊被釋放(圖2)，而shh從膠原基質(zhì)在數(shù)分鐘到約20分鐘內(nèi)被釋放(圖1)。將包含shh的凍干的藻酸鹽球狀物在37℃下的10mM磷酸鉀、150mM NaCl,pH7.2(Rotatherm)中保溫。在5分、1h、5h、10h、1d、34h、2d、3d和6d后取樣，通過SDS聚丙烯酰胺電泳法分析它們的shh含量(圖2)。將從藻酸鹽膠囊釋放的累積shh量對時間繪圖。
應用低分量型(LMW；分子量約為1.3×106Da)或高分子量型(HMW；分子量約為4×106Da)透明質(zhì)酸檢測從2.5％透明質(zhì)酸凝膠釋放shh的動力學示于圖3。為此將負載了shh的透明質(zhì)酸凝膠裝入透析管(分離大小為300,000Da)，將透析管在37℃下的PBS中保溫。在所述時間取釋放介質(zhì)樣品，通過反相HPLC法分析它們的shh含量。顯然，負載的刺猬蛋白部分呈延遲方式被釋放。該蛋白質(zhì)的另一部分仍保持與透明質(zhì)酸結合并且可在活體內(nèi)通過透明質(zhì)酸的降解被釋放。
檢測從膠原-藻酸鹽基質(zhì)(FibracolTM，參見美國專利4,614,794)釋放shh的動力學示于圖4。為此將Fibracol海綿狀物(1×1×0.3cm)在PBS中負載0.2mg的hshh。將負載的海綿狀物冷凍(-70℃)，凍干后在37℃下適當體積的PBS中保溫。在所述時間取釋放介質(zhì)的樣品，通過反相HPLC法分析它們的shh含量。顯然只有約10～20％負載的刺猬蛋白被釋放入介質(zhì)，而主要部分則仍保持與膠原-藻酸鹽基質(zhì)結合。該部分可通過基質(zhì)的降解在活體內(nèi)被釋放。
參考文獻表Asahina,J.，實驗細胞研究(Exp.Cell.Res.)222(1996)38-47Bitgood,M.J.等，當代生物學(Curr.Biol.)6(1996)296Chiang,C.等，自然(Nature)83(1996)407Crey,C.J.等，生物技術與生物工程(Biotechnol.Bioeng.)31(1988)607-612Downs,E.C.等，細胞生理學雜志(J.Cellular Physiology)152(1992)422-429Fietz,M.等，發(fā)育(增刊)(Development(Suppl))(1994)43-51Haque,Z.等，農(nóng)業(yè)食品化學雜志(J.Agric.Food Chem.)30(1982)481Hynes,M.等，神經(jīng)元(Neuron)15(1995)35-44Karablis等，基因及發(fā)育(Genes and Development)8(1994)277-289Kikuchi,A.等，控制釋放雜志(J.Controlled Release)47(1997)21-29Kinto等，F(xiàn)EBS通訊(FEBS Letters),404(1997)319-323Lai,C.J.等，發(fā)育(Development)121(1995)2349Lopez-Martinez等，當代生物學，5(1995)791-796Marti等，自然375(1995)322-325Miao等，神經(jīng)科學雜志(J.Neurosci.)17(1997)5891-5899Nakamura,T.等，生物化學與生物物理學研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)237(1997)465-469Perrimon,N.，細胞(Cell)80(1995)517-520
Porter,J.A.等，科學(Science)274(1996)255-259Robinson,C.J.等，生物技術趨勢(Trends inBiotechnology)14(1996)451-452Smith,J.C.，細胞76(1994)193-196Stott等，細胞科學雜志(J.Cell Sci.)110(1997)2691-2701美國專利4,614,794Vortkamp,A.等，科學273(1996)613WO 90/08551Yang等，發(fā)育124(1997)4393-440權利要求
1．刺猬蛋白的藥物組合物，其特征在于該刺猬蛋白與生物相容的親水性載體結合，其中該載體是聚合物，它-作為帶負電荷的載體通過離子相互作用與刺猬蛋白結合，-當刺猬蛋白與其結合時該載體不會使刺猬蛋白變性，-在中性條件下每個單體至少含0.1～2個帶負電荷的殘基，-含呈酸性基團形式的電荷，-具有的平均分子量至少是50,000Da，-并且不含瓊脂糖。
2．權利要求1的藥物組合物，其中該載體包括有機親水性載體基質(zhì)或無機不溶性磷酸鹽。
3．權利要求1或2的藥物組合物，其中該載體包括陰離子型多糖或無機不溶性磷酸鹽。
4．權利要求1-3的藥物組合物，其中該親水性載體是透明質(zhì)酸。
5．權利要求1-4的藥物組合物，其中該藥物組合物含濃度為0.1-100mg/ml的刺猬蛋白。
6．權利要求1-5的藥物組合物，其中該組合物在pH4-10的范圍內(nèi)被緩沖處理。
7．權利要求1-6的藥物組合物，其中該組合物含精氨酸或精氨酸離子。
8．制備含刺猬蛋白的藥物組合物的方法，該刺猬蛋白結合在生物相容的親水性載體上，其中該載體是聚合物，它-作為帶負電荷的載體通過離子相互作用與刺猬蛋白結合，-當刺猬蛋白與其結合時該載體不會使刺猬蛋白變性，-在中性條件下每個單體至少含0.1～2個帶負電荷的殘基，-含呈酸性基團形式的電荷，-具有的平均分子量至少是50,000Da，-并且不含瓊脂糖，其中藥物上有效量的刺猬蛋白被用作該藥劑的基本成分。
9．權利要求8的方法，其中應用濃度為0.1～100mg/ml的刺猬蛋白。
10．在人體內(nèi)延遲釋放刺猬蛋白的方法，其中該刺猬蛋白在人體內(nèi)以權利要求1-6的藥物組合物形式被局部應用。
11．權利要求10的方法，其中該刺猬蛋白在0.1～100mg/ml的濃度下被應用。
12．權利要求8-11的方法，其中該親水性載體是透明質(zhì)酸。
13．權利要求8-12的方法，其中刺猬蛋白與親水性載體的結合是通過在4.5或更大的pH下保溫而進行的。
14．不溶性載體基質(zhì)，其中每ml載體基質(zhì)含至少3mg刺猬蛋白以及至少10mmol/l精氨酸或精氨酸離子。
15．制備含刺猬蛋白的不溶性載體基質(zhì)的方法，其中將該載體基質(zhì)與含濃度為3mg/ml或更大的刺猬蛋白以及濃度為10mmol/l或更大的精氨酸或精氨酸離子的溶液保溫，接著分離以該方式涂覆的載體基質(zhì)。
16．權利要求15的方法，其中刺猬蛋白與親水性載體的結合是通過在4.5或更大的pH下保溫而進行的。
全文摘要
刺猬蛋白的藥物組合物,其特征在于該刺猬蛋白與生物相容性且可生物降解的親水性載體結合,其中該載體是聚合物,它作為帶負電荷的載體通過離子相互作用與刺猬蛋白結合;當刺猬蛋白與其結合時該載體不會使刺猬蛋白變性;在中性條件下每個單體至少含0.1～2個帶負電荷的殘基;含呈酸性基團形式的電荷;平均分子量至少是50,000Da;不含瓊脂糖。在活體內(nèi)從載體以延遲的方式可逆地并主動地釋放刺猬蛋白。
文檔編號A61K31/00GK1228994SQ9910176
公開日1999年9月22日 申請日期1999年2月4日 優(yōu)先權日1998年2月4日
發(fā)明者K·蘭格, A·帕普迪米卓奧 申請人:伯倫格曼海姆有限公司