專利名稱：編碼新孢子蟲蛋白質(zhì)的多核苷酸分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物保健領(lǐng)域，并涉及疫苗組合物和疾病診斷方法。具體地說，本發(fā)明涉及包含編碼新孢子蟲(Neospora)GRA1,GRA2,SAG1,MIC1和MAG1蛋白質(zhì)之核苷酸序列的多核苷酸分子，所說的多核苷酸分子和蛋白質(zhì)可用于生產(chǎn)抗新孢子蟲病的疫苗，及作為診斷試劑。
新孢子蟲是動物的一種病原性原生動物寄生蟲，已認定其為哺乳動物流產(chǎn)、新生兒死亡、先天性感染和腦炎病的主要原因(Dubey和Lindsay,1996，獸醫(yī)寄生蟲學(xué)，67:1-59；Dubey和Lindsay,1993，今日寄生蟲學(xué)，9:452-458)。犬新孢子蟲(Neospora caninum)會感染犬，并先天性地感染幼犬，常常導(dǎo)致麻痹。已從天然感染的幼犬體內(nèi)分離出了速殖體(Lindsay和Dubey,1989，寄生蟲學(xué)雜志，75:163-165)。新孢子蟲感染是奶牛和肉牛流產(chǎn)的主要原因。也已報導(dǎo)了綿羊、山羊和馬新孢子蟲相關(guān)疾病即新孢子蟲病的病例。
雖然犬新孢子蟲表面相似于病原體Toxoplasma gondii，但犬新孢子蟲和T.gondii彼此在抗原性和超結(jié)構(gòu)上是不同的(Dubey和Lindsay,1993，上述文獻)。此外，已顯示從流產(chǎn)的牛胎兒腦中分離的、并在體外連續(xù)培養(yǎng)的新孢子蟲樣原生動物寄生蟲在抗原性和超結(jié)構(gòu)上都明顯不同于T.gondii和Hammondia hammondi，而與犬新孢子蟲最為相似(Conrad等，1993，寄生蟲學(xué)，106:239-249)。再者，對核小亞單位核糖體RNA基因的分析表明，從牛和犬體內(nèi)分離的新孢子蟲株系之間沒有核苷酸差異，但新孢子蟲和T.gondii之間則顯示了一致的差異(Marsh等，1995，寄生蟲學(xué)雜志，81:530-535)。
已證實了新孢子蟲的牛分離物在牛流產(chǎn)和先天性疾病中的病原作用(Barr等，1994，獸醫(yī)診斷與研究雜志，6:207-215)。已使用被犬新孢子蟲感染的純系BALB/c小鼠建立了中樞神經(jīng)系統(tǒng)新孢子蟲病的嚙齒動物模型(Lindsay等，1995，寄生蟲學(xué)雜志，81:313-315)。另外，Cole等人(1995，寄生蟲學(xué)雜志，81:730-732)和Long等人(1996，寄生蟲學(xué)雜志，21:608-611)已分別描述了研究妊娠的雜系和純系小鼠中犬新孢蟲跨胎盤傳播的模型。已證明了十分相似于天然獲得性新孢子蟲誘發(fā)的牛流產(chǎn)的實驗性犬新孢子蟲矮山羊模型(Lindsay等，1995，美國獸醫(yī)研究雜志，56:1176-1180)。也已證明有一種實驗性犬新孢子蟲綿羊模型十分相似于天然獲得性新孢子蟲誘發(fā)的牛流產(chǎn)(Buxton等，1997,J.Camp.Path.117:1-16)。
在T.gondii中，包含抗原的排泄-分泌組的電子致密顆粒存在于速殖體的胞漿中。已將這些抗原定名為GRA蛋白。已報導(dǎo)T.gondii的GRA1蛋白質(zhì)的分子量為大約22-27KDa，并且T.gondii的GRA2蛋白質(zhì)的分子量為大約28KDa(Sam-Yellowe,1996，今日寄生蟲學(xué)，12:308-315)。相似的電子致密顆粒也存在于犬新孢子蟲速殖體的胞漿中(Bjerkas等，1994，臨床診斷與實驗免疫學(xué)，1:214-221；Hemphill等，1998，國際寄生蟲學(xué)雜志，28:429-438)。
也已知T.gondii含有一組定名為SAG的主要表面抗原。據(jù)報導(dǎo)T.gondii的SAG1蛋白的分子量約為30KDa(Kasper等，1983，免疫學(xué)雜志，130:2407-2412)。在組織培養(yǎng)條件下，抗T.gondii SAG1蛋白質(zhì)的單克隆抗體明顯地阻斷T.gondii速殖體侵入牛腎細胞的能力(Grimwood和Smith,1996，國際寄生蟲學(xué)雜志，26:169-173)。由于T.gondii SAG1似乎在侵入過程中發(fā)揮某種作用，所以推測SAG1對于支持毒力表型可能是必要的(Windeck和Gross,1996，寄生蟲學(xué)研究，82:715-719)。與這一推測一致的是，先用T.gondii SAG1免疫、然后用T.gondii攻擊的小鼠比對照組小鼠降低了它們的腦中的弓漿蟲孢囊形成(Debard等，1996，感染與免疫，64:2158-2166)。T.gondii SAG1可能在功能上與Hemphill等人(1997，寄生蟲學(xué)，115:371-380)所述的新孢子蟲中稱為NC-p36的相似分子有關(guān)。
微絲是位于T.gondii和新孢子蟲速殖體頂端的細胞內(nèi)細胞器，并可在侵入期間的宿主細胞識別和在細胞表面上附著中起作用(Formaux等，1996，微生物學(xué)與免疫學(xué)當(dāng)前論題，219:55-58)。已在T.gondii中鑒定了至少4種不同的微絲相關(guān)(MIC)蛋白質(zhì)。T.gondii的MIC1蛋白約60KDa，它與宿主細胞的表面結(jié)合，并已報導(dǎo)其與能結(jié)合到人肝細胞上的惡性瘧原蟲中的血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)性粘附蛋白(TRAP)有部分同源性。(Robson等，1995,EMBO J.,14:3883-3894)。
寄生蟲從速殖體轉(zhuǎn)變成慢殖體是T.gondii慢性感染和持久性的關(guān)鍵因素。已在T.gondii中鑒定了表達一種免疫顯性的稱為MAG1的慢殖體特異性65KD抗原的基因(Parmley等，1994，分子生物化學(xué)與寄生蟲學(xué)，66:283-296)。已報導(dǎo)可在慢殖體孢囊中，而不是在速殖體階段表達MAG1。這種表達特異性可能表明，MAG1參予寄生蟲生命周期中速殖體和慢殖體階段間的轉(zhuǎn)換(Bohne等，1996，微生物學(xué)與免疫學(xué)當(dāng)前論題，219:81-91)。
在新孢子蟲中鑒定T.gondii GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1蛋白的蛋白質(zhì)同系物，和編碼所述新孢子蟲蛋白之多核苷酸分子的核苷酸序列，將有利于開發(fā)抗新孢子蟲病的疫苗，以及診斷試劑。
本發(fā)明提供包含編碼犬新孢子蟲中GRA1蛋白的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。在一優(yōu)選實施方案中，GRA1蛋白具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明分離的編碼GRA1的多核苷酸分子包含選自下列一組的核苷酸序列SEQ ID NO:1的從大約nt205至大約nt777的核苷酸序列，存在于SEQ ID NO:3中從大約nt605至大約nt1304的GRA1基因之開放閱讀框(ORF)的核苷酸序列，和質(zhì)粒pRC77(ATCC209685)的編碼GRA1的ORF的核苷酸序列。在一非限制性實施方案中，本發(fā)明分離的編碼GRA1的多核苷酸分子包含選自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3之核苷酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供具有與本發(fā)明編碼GRA1的多核苷酸分子之核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離多核苷酸分子。本發(fā)明進一步提供包含編碼與犬新孢子蟲GRA1蛋白同源之多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸分子。本發(fā)明進一步提供由上文提到的任一種GRA1相關(guān)性多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列組成的多核苷酸分子。
本發(fā)明進一步提供包含編碼犬新孢子蟲GRA2蛋白之核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。在一優(yōu)選實施方案中，GRA2蛋白具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明分離的編碼GRA2的多核苷酸分子包含選自下列組中的核苷酸序列SEQ ID NO:4的從大約nt25至大約nt660的ORF核苷酸序列，質(zhì)粒pRC5(ATCC209686)的編碼GRA2的ORF的核苷酸序列。在一非限制性的實施方案中，本發(fā)明的分離的編碼GRA2的多核苷酸分子包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供具有與本發(fā)明編碼GRA2的多核苷酸分子之核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。本發(fā)明進一步提供包含編碼與犬新孢子蟲GRA2蛋白同源之多肽的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。本發(fā)明進一步提供由作為任何上述GRA2相關(guān)性多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列組成的多核苷酸分子。
本發(fā)明進一步提供包含編碼犬新孢子蟲SAG1之核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。在一優(yōu)選實施方案中，SAG1蛋白具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明分離的編碼SAG1的多核苷酸分子包含選自下列一組中的核苷酸序列SEQ ID NO:6中從大約nt130至大約nt1089的ORF的核苷酸序列，和質(zhì)粒pRC102(ATCC209687)之編碼SAG1的ORF的核苷酸序列。在一非限制性實施方案中，本發(fā)明的分離的編碼SAG1的多核苷酸分子包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供具有與本發(fā)明編碼SAG1的多核苷酸分子之核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。本發(fā)明進一步提供包含編碼同源于犬新孢子蟲SAG1蛋白之多肽的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。本發(fā)明進一步提供由作為上述任何SAG1相關(guān)性多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列組成的多核苷酸分子。
本發(fā)明進一步提供包含編碼犬新孢子蟲MIC1蛋白的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。在一優(yōu)選實施方案中，MIC1蛋白具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列。在進一步的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的編碼MIC1的多核苷酸分子包含選自下列一組中的核苷酸序列SEQ IDNO:8中從大約nt138至大約nt1520的ORF的核苷酸序列，作為SEQ IDNO:10給出的MIC1基因之ORF的核苷酸序列，及質(zhì)粒pRC340(ATCC209688)的編碼MIC1的ORF的核苷酸序列。在一非限制性實施方案中，本發(fā)明的分離的編碼MIC1的多核苷酸分子包含選自SEQ ID NO:8的核苷酸序列和SEQ ID NO:10的核苷酸序列的一種核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供具有與本發(fā)明編碼MIC1的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。本發(fā)明進一步提供包含編碼同源于犬新孢子蟲MIC1蛋白之多肽的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。本發(fā)明進一步提供由作為上述任何MIC1相關(guān)性多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列組成的多核苷酸分子。
本發(fā)明進一步提供包含編碼犬新孢子蟲MAG1蛋白的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。該MAG1蛋白具有SEQ ID NO:13中所示的推測的氨基酸序列。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明分離的編碼MAG1的多核苷酸分子包含選自下列成員的核苷酸序列存在于SEQ ID NO:11中的從大約nt1305至大約nt2786的核苷酸序列，從中制備的cDNA分子(如具有SEQ ID NO:12中從大約nt122至大約nt1381的ORF的cDNA分子)，和存在于質(zhì)粒bd304(ATCC203413)中的編碼MAG1的ORF的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供具有SEQ ID NO:11中給出的任何ORF的核苷酸序列的多核苷酸分子。在一非限制性實施方案中，本發(fā)明分離的編碼MAG1的多核苷酸分子包含選自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供具有與本發(fā)明編碼MAG1的多核苷酸分子之核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。本發(fā)明進一步提供包含編碼同源于犬新孢子蟲MAG1蛋白之多肽的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。本發(fā)明進一步提供由作為上述任何MAG1相關(guān)性多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列組成的多核苷酸分子。
本發(fā)明進一步提供包含犬新孢子蟲GRA1和MAG1基因啟動子之核苷酸序列的多核苷酸分子，所述核苷酸序列示于SEQ ID NO:1中從大約nt127至大約nt703，并包括其互補序列。
本發(fā)明進一步提供與本發(fā)明任何一種多核苷酸分子能雜交或與具有作為本發(fā)明任何一種多核苷酸分子之互補物的核苷酸序列的多核苷酸分子能雜交的寡核苷酸分子。
本發(fā)明進一步提供用于克隆和表達本發(fā)明任何一種多核苷酸分子的組合物及方法，其中包含重組克隆載體、重組表達載體、包含任何所說的載體的被轉(zhuǎn)化的宿主細胞和由之衍生的新的菌株或細胞系。更具體地說，本發(fā)明提供包含具有編碼犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1蛋白之核苷酸序列的多核苷酸分子的重組載體。在特定的非限制性實施方案中，本發(fā)明提供了編碼GRA1的質(zhì)粒pRC77(ATCC209685)、編碼GRA2的質(zhì)粒pRC5(ATCC209686)、編碼SAG1的質(zhì)粒pRC102(ATCC209687)、編碼MIC1的質(zhì)粒pRC340(ATCC209688)和包含MAG1基因序列及MAG1/GRA1雙向啟動子區(qū)域的質(zhì)粒bd304(ATCC203413)。
本發(fā)明進一步提供選自GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1蛋白的基本上已純化或分離的犬新孢子蟲多肽。在一優(yōu)選的實施方案中，犬新孢子蟲GRA1蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方案中，犬新孢子蟲GRA2蛋白具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方案中，犬新孢子蟲SAG1蛋白具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方案中，犬新孢子蟲MIC1蛋白具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方案中，犬新孢子蟲MAG1蛋白具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。本發(fā)明進一步提供同源于上述任何犬新孢子蟲蛋白的基本上已純化或分離的多肽。本發(fā)明進一步提供融合蛋白形式的多肽，所述融合蛋白中上述任一多肽與本領(lǐng)域已知的載體或融合對象融合。本發(fā)明進一步提供由上述任何多肽的基本部分組成的多肽。本發(fā)明的多肽適用于預(yù)防哺乳動物新孢子蟲病的疫苗組合物中和用作診斷試劑。
本發(fā)明進一步提供制備上述任何多肽的方法，其包括在適于表達多肽的條件下培養(yǎng)用重組表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，所說的載體包含含有編碼上述任何多肽之核苷酸序列的多核苷酸分子，其中所述核苷酸序列是以可操作方式與一個或多個調(diào)節(jié)元件連接的；再從細胞培養(yǎng)物中回收所表達的多肽。
本發(fā)明進一步提供抗犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1蛋白的特異性抗體。
本發(fā)明進一步提供可用于突變新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1基因以生產(chǎn)修飾過的新孢子蟲細胞的遺傳構(gòu)建體。這種經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞可用于疫苗組合物中以保護哺乳動物抗新孢子蟲病。在一優(yōu)選的非限制性實施方案中，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體包含一種多核苷酸分子，該多核苷酸分子含有與編碼犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1蛋白的核苷酸序列本來相同的核苷酸序列、或其基本部分，但還進一步包含可使該基因突變的一個或多個突變，即一或多個核苷酸缺失、插入和/或取代的多核苷酸分子。一旦轉(zhuǎn)化到新孢子蟲細胞中之后，該遺傳構(gòu)建體的多核苷酸分子就可例如通過同源重組而特異地導(dǎo)向特定的新孢子蟲基因，并缺失或取代該基因或其部分，或插入到該基因中。這一重組過程的結(jié)果是該新孢子蟲基因發(fā)生突變。所產(chǎn)生的突變基因較好是編碼部分無效或完全無效的蛋白質(zhì)，或不能編碼蛋白質(zhì)，因而部分或完全喪失活性。本發(fā)明進一步提供已通過一種或多種所說的基因突變得到修飾的新孢子蟲細胞，以及使用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體制備經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞的方法。
本發(fā)明進一步提供抗新孢子蟲病的疫苗，所說的疫苗包含免疫有效量的本發(fā)明的多肽，或免疫有效量的本發(fā)明的多核苷酸分子，或免疫有效量的本發(fā)明的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞；以及獸醫(yī)可接受的載體。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的疫苗包含表達GRA1-、GRA2-、SAG1-、MIC1-或MAG1-表型或這類表型的組合的修飾過的犬新孢子蟲活細胞。在一非限制性實施方案中，該疫苗是對抗新孢子病以及可選的一種或多種可危害哺乳動物的其他疾病或病理狀態(tài)以保護哺乳動物的聯(lián)合疫苗，該聯(lián)合疫苗含有免疫有效量的包含本發(fā)明的多肽、多核苷酸分子或經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞在內(nèi)的第一成分，免疫有效量的不同于第一成分、并且能夠誘導(dǎo)或有助于誘導(dǎo)對抗可給哺乳動物帶來痛苦之疾病或病理狀況的保護性反應(yīng)的第二成分，以及獸醫(yī)可接受的載體。
本發(fā)明進一步提供制備抗新孢子蟲病的疫苗的方法，該方法包括以適于給哺乳動物施用的方式，將免疫有效量的本發(fā)明犬新孢子蟲多肽，或免疫有效量的本發(fā)明的多核苷酸分子，或免疫有效量的本發(fā)明的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞與獸醫(yī)可接受的載體聯(lián)合使用。
本發(fā)明進一步提供給哺乳動物接種疫苗以對抗新孢子蟲病的方法，其包括給哺乳動物施用免疫有效量的本發(fā)明的疫苗。
本發(fā)明進一步提供可用于接種哺乳動物以對抗新孢子蟲病的試劑盒，其包含含有免疫有效量的本發(fā)明的多肽、或免疫有效量的本發(fā)明的多核苷酸分子、或免疫有效量的本發(fā)明的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞的第一容器，和含有獸醫(yī)可接受的載體或稀釋劑的第二容器。
1．多核苷酸分子本發(fā)明的分離的多核苷酸分子可具有衍生于新孢子蟲任何種或株系的核苷酸序列，但較好是來自致病性新孢子蟲如犬新孢子蟲?？捎脕矸蛛x或衍生本發(fā)明多核苷酸分子的犬新孢子蟲株系的一個非限制性例子是株系NC-1，該株系可得自于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(12301Parklawn Drive,Rockville,MD 20852,USA)保藏登記號No.CRL-12231的宿主MARC-145猴腎細胞中。Dubey等人(1988，美國獸醫(yī)醫(yī)學(xué)學(xué)會雜志，193:1259-63)也描述了株系NC-1，該出版物在此引入作為參考。或者，也可使用如上述文獻中公開的那些標準分離技術(shù)從被感染動物的器官、組織或體液中分離出可用于實施本發(fā)明的病原性新孢子蟲的種或株系。
本文所用的術(shù)語“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“編碼序列”、“開放閱讀框(ORF)”等是指單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子，可包含一個或多個原核序列，cDNA序列，包含外顯子和內(nèi)含子的基因組DNA序列，化學(xué)合成的DNA和RNA序列，以及有義和相應(yīng)的反義鏈。本文使用的術(shù)語“ORF”是指編碼特定的新孢子蟲蛋白質(zhì)，即GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1蛋白所需的、沒有任何干擾性終止密碼子的最小核苷酸序列。
生產(chǎn)和操作本文公開的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可按照已描述的重組技術(shù)(參見Maniatis等，1989，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，分子生物學(xué)當(dāng)前技術(shù)，Greene Publishing Associates&Wiley Interscience,NY；Sambrook等，1989，分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Innis等(編)，1995,PCR策略，Academic Press,Inc.,San Diego；和Erlich(編)，1992,PCR技術(shù)，牛津大學(xué)出版社，New York)完成。
1.1．GRA1相關(guān)性多核苷酸分子除非另外指出，本文下面提到的SEQ ID NO:1和3中所示的核苷酸序列和其基本部分也分別指存在于質(zhì)粒pRC77(ATCC209685)中的相應(yīng)核苷酸序列和其基本部分。另外，下文提到的SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列和其基本部分及肽片段，除另外說明者外，也分別指由質(zhì)粒pRC77(ATCC209685)中相應(yīng)的編碼GRA1的核苷酸序列所編碼的相應(yīng)氨基酸序列，和其基本部分及肽片段。
本發(fā)明提供包含編碼犬新孢子蟲GRA1蛋白的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。在一優(yōu)選實施方案中，GRA1蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在進一步的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明分離的編碼GRA1的多核苷酸分子包含選自下列成員的核苷酸序列SEQ ID NO:1中從大約nt205至大約nt777的核苷酸序列，GRA1基因開放閱讀框(ORF)的核苷酸序列(在SEQ ID NO:3中給出的從大約nt605至大約nt1304)，及質(zhì)粒pRC77(ATCC209685)中編碼GRA1的ORF的核苷酸序列。在一非限制性實施方案中，本發(fā)明分離的編碼GRA1的多核苷酸分子包含選自SEQID NO:1和SEQ ID NO:3核苷酸序列的核苷酸序列。SEQ ID NO:3中給出的GRA1基因包含從nt605到nt855和從nt983至nt1304的ORF并帶有一個從nt856至nt982的間插內(nèi)含子。另外，已在mRNA起始位點之5′端150bp內(nèi)鑒定了與在T.gondii GRA基因中發(fā)現(xiàn)的那些相類似的推定的啟動子基序(參見下文5.3節(jié))。
本發(fā)明進一步提供具有與本發(fā)明編碼GRA1的多核苷酸分子之核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。術(shù)語“同源”當(dāng)用于表示GRA1相關(guān)性多核苷酸分子時，是指具有下述核苷酸序列的多核苷酸分子(a)與本發(fā)明上述編碼GRA1的多核苷酸分子之一編碼相同蛋白質(zhì)、但根據(jù)遺傳密碼的簡并性而在核苷酸序列中包含一個或多個沉默改變的核苷酸序列；或(b)在中度嚴緊條件下，即在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃洗滌的條件(參見Ausubel等(編)，1989，分子生物學(xué)當(dāng)前技術(shù)，第1卷，Green Publishing Associntes,Inc.,and John Wiley&Sons,Inc.,NY,P.2.10.3)下，能與具有編碼犬新孢子蟲GRA1蛋白之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補物雜交，并可用于實施本發(fā)明的核苷酸序列。在一優(yōu)選實施方案中，該同源多核苷酸分子在高度嚴緊條件下，即在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.1×SSC/0.1％SDS中于68℃洗滌條件(Ausubel等，1989，上述文獻)下，與具有編碼犬新孢子蟲GRA1蛋白之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明。在更優(yōu)選的實施方案中，該同源多核苷酸分子在高度嚴緊條件下與由SEQ ID NO:1的ORF(從大約nt205至大約nt777)或GRA1基因ORF(SEQ ID NO:3中從大約nt605至大約nt1304)之核苷酸序列組成的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明。
本文所說的多核苷酸分子“可用于實施本發(fā)明”是指該多核苷酸分子可用于以標準擴增技術(shù)擴增新孢子蟲特異性多核苷酸分子，或作為診斷試劑用以檢測被新孢子蟲感染的動物體液或組織樣品中新孢子蟲特異性多核苷酸的存在。
具有與本發(fā)明編碼GRA1的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的本發(fā)明多核苷酸分子并不包括具有編碼T.gondii GRA蛋白的T.gondii天然核苷酸序列的多核苷酸分子，而且與這種T.gondii多核苷酸分子之間的序列同一性不超過約90％，較好不超過約80％，其中序列同一性是使用BLASTN算法(Gen Bank,National Center for BiotechnologyInformation)確定的。
本發(fā)明進一步提供包含編碼同源于犬新孢子蟲GRA1蛋白之多肽的核苷酸序列的一種分離多核苷酸分子。本文中提到同源于犬新孢子蟲GRA1蛋白的多肽時所使用的術(shù)語“同源”是指多肽本來具有犬新孢子蟲GRA1蛋白的氨基酸序列，但其中一個或多個氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基保守地取代，并且所得到的多肽可用于實施本發(fā)明。保守氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的。造成這樣的取代的規(guī)則包含由Dayhof,M.D.(1978，國家生物醫(yī)學(xué)研究基金，Washington,D.C.，第5卷，增刊3)等所述的取代規(guī)則。更具體地說，保守氨基酸取代發(fā)生在與其酸性、極性或側(cè)鏈大小相關(guān)聯(lián)的氨基酸家族內(nèi)。一般可將遺傳編碼的氨基酸分為四組(1)酸性氨基酸=天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性氨基酸=賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不帶電的極性氨基酸=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同分類為芳香氨基酸。任何特定組內(nèi)的一個或多個取代，例如用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、或用谷氨酸取代天冬氨酸、或用絲氨酸取代蘇氨酸，或任何其他氨基酸殘基結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸殘基，例如有相似酸性、極性、側(cè)鏈大小的，或在其某些組合方面有相似性的氨基酸殘基取代，一般對多肽的功能或免疫原性不會有太大影響。
本文中所說的多肽“可用于實施本發(fā)明”是指該多肽可用作診斷試劑以檢測新近被新孢子蟲感染的、或已被新孢子蟲感染的動物血液或血清樣品中新孢子蟲特異性抗體的存在。
本發(fā)明進一步提供由本發(fā)明的上述任何新孢子蟲GRA1相關(guān)性多核苷酸分子的基本部分組成的多核苷酸分子。GRA1相關(guān)性多核苷酸分子的“基本部分”在本文中是指組成上小于GRA1相關(guān)性多核苷酸分子的完整核苷酸序列，但包含GRA1相關(guān)性多核苷酸分子之核苷酸序列的至少約5％，較好至少約10％，并可用于實施本發(fā)明的多核苷酸分子。
除了上文提到的任何GRA1相關(guān)性多核苷酸分子的核苷酸序列之外，本發(fā)明的多核苷酸分子還可進一步包含，或者說可由選自下列者的核苷酸序列組成天然原位側(cè)接于犬新孢子蟲中GRA1 ORF或基因并包含SEQ ID NO:1中所示從大約nt1至大約nt204和從大約nt778至大約nt1265、或如SEQ ID NO:3中所示從大約nt1至大約nt604和從大約nt1305至大約nt1774的核苷酸序列的核苷酸序列，或其基本部分。
1.2 GRA2相關(guān)性多核苷酸分子下文提到的SEQ ID NO:4的核苷酸序列和其基本部分，除特別說明外，還分別指如質(zhì)粒pRC5(ATCC209686)中給出的相應(yīng)核苷酸序列和其基本部分。此外，除非另外指出，本文下面提到的SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列及其基本部分和肽片段，還分別指由存在于質(zhì)粒pRC5(ATCC209686)中相應(yīng)的編碼GRA2的核苷酸序列所編碼的相應(yīng)氨基酸序列及其基本部分和肽片段。
本發(fā)明進一步提供包含編碼犬新孢子蟲GRA2蛋白之核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。在一優(yōu)選實施方案中，GRA2蛋白具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明分離的編碼GRA2的多核苷酸分子包含選自下列一組中的核苷酸序列從大約nt25至大約nt660的SEQ ID NO:4之ORF的核苷酸序列，和質(zhì)粒pRC5(ATCC209686)中編碼GRA2的ORF的核苷酸序列。在一個非限制性實施方案中，本發(fā)明分離的編碼GRA2的多核苷酸分子包含SEQ IDNO:4的核苷酸序列。
本發(fā)明進一步提供具有與本發(fā)明編碼GRA2的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離多核苷酸分子。術(shù)語“同源”當(dāng)用于表示GRA2相關(guān)性多核苷酸分子時，是指具有下述核苷酸序列的多核苷酸分子(a)與本發(fā)明上述編碼GRA2的多核苷酸分子之一編碼相同樣蛋白質(zhì)、但根據(jù)遺傳密碼的簡并性而包含一個或多個沉默改變的核苷酸序列；或(b)在中度嚴緊條件下，即在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃洗滌的條件(參見Ausubel等，1989，出處同前)下，與具有編碼犬新孢子蟲GRA2蛋白之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子之互補物能雜交、并可用于實施本發(fā)明的核苷酸序列。在一優(yōu)選實施方案中，該同源多核苷酸分子在高度嚴緊條件下，即在0.5MNaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.1×SSC/0.1％SDS中于68℃洗滌條件(Ausubel等，1989，上述文獻)下，與具有編碼犬新孢子蟲GRA2蛋白之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明。在更優(yōu)選的實施方案中，該同源多核苷酸分子在高度嚴緊條件下與由SEQ ID NO:4中ORF的核苷酸序列(從大約nt25至大約nt660)組成的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明。
具有與本發(fā)明編碼GRA2的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的本發(fā)明多核苷酸分子并不包括具有編碼T.gondii GRA蛋白的T.gondii天然核苷酸序列的多核苷酸分子，并且與這種T.gondii多核苷酸分子之間的序列同一性不超過約90％，較好不超過約80％，其中序列同一性是使用BLASTN算法(GenBank,NCBI)確定的。
本發(fā)明進一步提供包含編碼同源于犬新孢子蟲GRA2蛋白之多肽的核苷酸序列的一種分離多核苷酸分子。本文中提到同源于犬新孢子蟲GRA2蛋白的多肽時所使用的術(shù)語“同源于”是指多肽本來具有犬新孢子蟲GRA2蛋白的氨基酸序列，但其中一個或多個氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基保守地取代(如上定義)，其中所得到的多肽可用于實施本發(fā)明(其中術(shù)語“可用于”具有上文就多肽所限定的含義)。
本發(fā)明進一步提供由本發(fā)明上述任何新孢子蟲GRA2相關(guān)性多核苷酸分子的基本部分組成的多核苷酸分子。GRA2相關(guān)性多核苷酸分子的“基本部分”在本文中是指組成上小于GRA2相關(guān)性多核苷酸分子的完整核苷酸序列、但包含GRA2相關(guān)性多核苷酸分子的核苷酸序列的至少約5％，較好至少約10％、并可用于實施本發(fā)明的多核苷酸分子(其中術(shù)語“可用于”具有上文就多核苷酸分子所限定的含義)。
除了上文提到的任何GRA2相關(guān)性多核苷酸分子的核苷酸序列之外，本發(fā)明的多核苷酸分子還可進一步包含，或者說可由選自下列者的核苷酸序列組成天然原位側(cè)接于犬新孢子蟲中GRA2 ORF或基因并包含SEQ ID NO:4中所示從大約nt1至大約nt24和從大約nt661至大約nt1031的側(cè)翼核苷酸序列的核苷酸序列，或其基本部分。
1.3 SAG-1相關(guān)性多核苷酸分子除非另外指出，本文下面提到的SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列和其基本部分也分別指存在于質(zhì)粒pRC102(ATCC209687)中的相應(yīng)核苷酸序列和其基本部分。另外，下文提到的SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列和其基本部分及肽片段，除另外說明者外，也分別指由質(zhì)粒pRC102(ATCC209687)中相應(yīng)的編碼SAG1的核苷酸序列所編碼的相應(yīng)氨基酸序列，和其基本部分及肽片段。
本發(fā)明進一步提供包含編碼犬新孢子蟲SAG1蛋白之核苷酸序列的一種分離多核苷酸分子。在一優(yōu)選實施方案中，SAG1蛋白具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明分離的編碼SAG1的多核苷酸分子包含選自下列成員的核苷酸序列SEQ ID NO:6中從大約nt130至大約nt1089的ORF的核苷酸序列，和質(zhì)粒pRC102(ATCC209687)中編碼SAG1的ORF的核苷酸序列。在一非限制性實施方案中，本發(fā)明分離的編碼SAG1的多核苷酸分子包含SEQ IDNO:6的核苷酸序列。
本發(fā)明進一步提供具有與本發(fā)明編碼SAG1的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離多核苷酸分子。術(shù)語“同源”當(dāng)用于表示SAG1相關(guān)性多核苷酸分子時，是指具有下述核苷酸序列的多核苷酸分子(a)與本發(fā)明上述編碼SAG1的多核苷酸分子之一編碼相同蛋白質(zhì)、但根據(jù)遺傳密碼的簡并性而包含一個或多個沉默改變的核苷酸序列；或(b)在中度嚴緊條件下，即在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃洗滌的條件(參見Ausubel等，1989，出處同前)下，與具有編碼犬新孢子蟲SAG1蛋白之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明的核苷酸序列(“可用于”具有上文就多核苷酸分子所限定的含義)。在一優(yōu)選實施方案中，該同源多核苷酸分子在高度嚴緊條件下，即在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.1×SSC/0.1％SDS中于68℃洗滌的條件(Ausubel等，1989，上述文獻)下，與具有編碼犬新孢子蟲SAG1蛋白之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明。在更優(yōu)選的實施方案中，該同源多核苷酸分子在高度嚴緊條件下與由SEQ ID NO:6之ORF的核苷酸序列(從大約nt130至大約nt1089)組成的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明。
具有與本發(fā)明編碼SAG1的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的本發(fā)明多核苷酸分子并不包括具有編碼T.gondii SAG1蛋白的T.gondii天然核苷酸序列的多核苷酸分子，而且與這種T.gondii多核苷酸分子之間的序列同一性不超過約90％，較好不超過約80％，其中序列同一性是使用BLASTN算法(GenBank,NCBI)確定的。
本發(fā)明進一步提供包含編碼同源于犬新孢子蟲SAG1蛋白之多肽的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。本文中提到同源于犬新孢子蟲SAG1蛋白的多肽時所使用的術(shù)語“同源”是指多肽本來具有犬新孢子蟲SAG1蛋白的氨基酸序列，但其中一個或多個氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基保守地取代(如上述定義)，其中所得到的多肽可用于實施本發(fā)明(其中術(shù)語“可用于”具有上文就多肽所限定的含義)。
本發(fā)明進一步提供由本發(fā)明上述任何新孢子蟲SAG1相關(guān)性多核苷酸分子的基本部分組成的多核苷酸分子。SAG1相關(guān)性多核苷酸分子的“基本部分”在本文中是指組成上小于SAG1相關(guān)性多核苷酸分子的完整核苷酸序列、但包含SAG1相關(guān)性多核苷酸分子的核苷酸序列的至少約5％，較好至少約10％、并可用于實施本發(fā)明的多核苷酸分子(其中術(shù)語“可用于”具有上文就多核苷酸分子所限定的含義)。
除了上文提到的任何SAG1相關(guān)性多核苷酸分子的核苷酸序列之外，本發(fā)明的多核苷酸分子還可進一步包含，或者說可由選自下列者的核苷酸序列組成天然原位側(cè)接于犬新孢子蟲中SAG1 ORF或基因、并包含SEQ ID NO:6中所示從大約nt1至大約nt129和從大約nt1090至大約nt1263的側(cè)翼核苷酸序列的核苷酸序列，或其基本部分。
1.4 MIC1相關(guān)性多核苷酸分子除非另外指出，本文下面提到的SEQ ID NO:8和10中所示的核苷酸序列和其基本部分也分別指存在于質(zhì)粒pRC340(ATCC209688)中的相應(yīng)核苷酸序列和其基本部分。另外，下文提到的SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列和其基本部分及肽片段，除另外說明者外，也分別指由質(zhì)粒pRC340(ATCC209688)中相應(yīng)的編碼MIC1的核苷酸序列編碼的相應(yīng)氨基酸序列，和其基本部分及肽片段。
本發(fā)明進一步提供包含編碼犬新孢子蟲MIC1蛋白的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。在一優(yōu)選實施方案中，MIC1蛋白具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明分離的編碼MIC1的多核苷酸分子包含選自下列成員的核苷酸序列SEQ ID NO:8中從大約nt138至大約nt1520之ORF的核苷酸序列，SEQ ID NO:10給出的MIC1基因之ORF的核苷酸序列，及質(zhì)粒pRC340(ATCC209688)中編碼MIC1之ORF的核苷酸序列的核苷酸序列。在一非限制性實施方案中，本發(fā)明分離的編碼MIC1的多核苷酸分子包含選自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10之核苷酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明進一步提供具有與本發(fā)明編碼MIC1的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離多核苷酸分子。術(shù)語“同源”當(dāng)用于表示MIC1相關(guān)性多核苷酸分子時，是指具有下述核苷酸序列的多核苷酸分子(a)與本發(fā)明上述編碼MIC1的多核苷酸分子之一編碼相同蛋白質(zhì)、但根據(jù)遺傳密碼的簡并性而包含一個或多個沉默改變的核苷酸序列；或(b)在中度嚴緊條件下，即在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃洗滌的條件(Ausubel等，1989，出處同前)下，與具有編碼犬新孢子蟲MIC1蛋白之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明的核苷酸序列(“可用于”具有上文就多核苷酸分子所限定的含義)。在一優(yōu)選實施方案中，該同源多核苷酸分子在高度嚴緊條件下，即在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.1×SSC/0.1％SDS中于68℃洗滌的條件(Ausubel等，1989，上述文獻)下，與具有編碼犬新孢子蟲MIC1蛋白之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明。在更優(yōu)選的實施方案中，該同源多核苷酸分子在高度嚴緊條件下與由SEQ ID NO:8中從大約nt138至大約nt1520的ORF或SEQ ID NO:10所給出的MIC1基因ORF的核苷酸序列組成的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明。
具有與本發(fā)明編碼MIC1的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的本發(fā)明多核苷酸分子并不包括具有編碼T.gondii MIC1蛋白的T.gondii天然核苷酸序列的多核苷酸分子，而且與這種T.gondii多核苷酸分子之間的序列同一性不超過約90％，較好不超過約80％，其中序列同一性是使用BLASTN算法(GenBank,NCBI)確定的。
本發(fā)明進一步提供包含編碼同源于犬新孢子蟲MIC1蛋白的多肽之核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。本文中提到同源于犬新孢子蟲MIC1蛋白的多肽時所使用的術(shù)語“同源”是指多肽本來具有犬新孢子蟲MIC1蛋白的氨基酸序列，但其中一個或多個氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基保守地取代(如上述定義)，其中所得到的多肽可用于實施本發(fā)明(其中術(shù)語“可用于”具有上文就多肽所限定的含義)。
本發(fā)明進一步提供由本發(fā)明的上述任何新孢子蟲MIC1相關(guān)性多核苷酸分子的基本部分組成的多核苷酸分子。MIC1相關(guān)性多核苷酸分子的“基本部分”在本文中是指組成上小于MIC1相關(guān)性多核苷酸分子的完整核苷酸序列，但包含MIC1相關(guān)性多核苷酸分子的核苷酸序列的至少約5％，較好至少約10％，并可用于實施本發(fā)明的多核苷酸分子。
除了上文提到的任何MCI相關(guān)性多核苷酸分子的核苷酸序列外，本發(fā)明的多核苷酸分子還可進一步包含，或者說可由選自下列者的核苷酸序列組成天然原位側(cè)接于犬新孢子蟲中MIC1 ORF或基因、并包含SEQID NO:8中所示從大約nt1至大約nt137和從大約nt1521至大約nt2069的核苷酸序列的核苷酸序列，或其基本部分。
1.5．MAG1相關(guān)性多核苷酸分子除非另外指出，本文下面提到的SEQ ID NO:11中所示核苷酸序列和其基本部分也分別指質(zhì)粒bd304(ATCC203413)中給出的相應(yīng)核苷酸序列和其基本部分。另外，除非特別指出，下文提到的SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列和其基本部分及肽片段，也分別是指由質(zhì)粒bd304(ATCC203413)中相應(yīng)的編碼MAG1的核苷酸序列所編碼的相應(yīng)氨基酸序列，和其基本部分及肽片段。
本發(fā)明進一步提供包含編碼犬新孢子蟲MAG1蛋白的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。在一優(yōu)選實施方案中，MAG1蛋白具有SEQID NO:13的氨基酸序列。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明分離的編碼MAG1的多核苷酸分子包含選自下列成員的核苷酸序列SEQ IDNO:11中給出的從大約nt1305至大約nt2786的核苷酸序列，由之制備的cDNA分子(如具有從大約nt122至大約nt1381的SEQ ID NO:12之ORF的cDNA分子)，和質(zhì)粒bd304(ATCC203413)中編碼MAG1的ORF的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供具有SEQ ID NO:11中任何ORF的核苷酸序列的多核苷酸分子。在一非限制性實施方案中，本發(fā)明分離的編碼MAG1的多核苷酸分子包含選自下列者的核苷酸序列SEO ID NO:11的核苷酸序列，基于推定的外顯子/內(nèi)含子邊緣而由之推測的cDNA的核苷酸序列。
本發(fā)明進一步提供具有與本發(fā)明編碼MAG1的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。術(shù)語“同源”當(dāng)用于表示MAG1相關(guān)性多核苷酸分子時，是指具有下述核苷酸序列的多核苷酸分子(a)與本發(fā)明上述編碼MAG1的多核苷酸分子編碼相同蛋白質(zhì)、但根據(jù)遺傳密碼的簡并性而包含一個或多個沉默改變的核苷酸序列；或(b)在中度嚴緊條件下，即在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃洗滌的條件(參見Ausubel等，1989，出處同前)下，與具有編碼犬新孢子蟲MAG1蛋白之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明的核苷酸序列(“可用于”具有上語言不多核苷酸分子所限定的含義)。在一優(yōu)選實施方案中該同源多核苷酸分子在高度嚴緊條件下，即在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并在0.1×SSC/0.1％SDS中于68℃洗滌的條件(Ausubel等，1989，上述文獻)下，與具有編碼犬新孢子蟲MAG1蛋白之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明。在更優(yōu)選的實施方案中，該同源多核苷酸分子在高度嚴緊條件下與由選自SEQ ID NO:11中從大約nt1305至大約nt2786的MAG1基因之ORF的核苷酸序列或基于推斷的外顯子/內(nèi)含子邊緣而由之制備的cDNA分子(例如具有從大約nt122至大約nt1381的SEQ ID NO:12之ORF的cDNA分子)的互補物能雜交，并可用于實施本發(fā)明。
具有與本發(fā)明編碼MAG1的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的本發(fā)明多核苷酸分子并不包括具有編碼T.gondii MAG1蛋白的T.gondii天然核苷酸序列的多核苷酸分子，而且與T.gondii多核苷酸分子之間的序列同一性不超過約90％，較好不超過約80％，其中序列同一性是使用BLASTN算法(GenBank,NCBI)確定的。
本發(fā)明進一步提供包含編碼同源于犬新孢子蟲MAG1蛋白之多肽的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。本文中提到同源于犬新孢子蟲MAG1蛋白的多肽時所使用的術(shù)語“同源”是指多肽本來具有犬新孢子蟲MAG1蛋白的氨基酸序列，但其中一個或多個氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基保守地取代(如上述定義)，其中所得到的多肽可用于實施本發(fā)明(“可用于”具有上文就多肽所限定的含義)。
本發(fā)明進一步提供由本發(fā)明的上述任何新孢子蟲MAG1相關(guān)性多核苷酸分子的基本部分組成的多核苷酸分子。MAG1相關(guān)性多核苷酸分子的“基本部分”在本文中是指組成上小于MAG1相關(guān)性多核苷酸分子的完整核苷酸序列，但包含MAG1相關(guān)性多核苷酸分子的核苷酸序列的至少約5％，較好至少約10％，并可用于實施本發(fā)明的多核苷酸分子(術(shù)語“可用于”具有上文就多核苷酸分子所限定的含義)。例如，SEQ ID NO:11所示多核苷酸分子的基本部分可包含從大約nt704至大約nt820的推測的外顯子1，或從大約nt1301至大約nt1399的推定的外顯子2，或從大約nt1510至大約nt1808的推測的外顯子3，或從大約nt1921至大約nt3297的推測的外顯子4。
除了上文提到的任何MAG1相關(guān)性多核苷酸分子的核苷酸序列之外，本發(fā)明的多核苷酸分子還可進一步包含，或者說可由選自下列者的核苷酸序列組成天然側(cè)接于犬新孢子蟲原位MAG1基因或ORF、并且包括如SEQ ID NO:11中所示從大約nt1至大約nt1304和從大約nt2787至大約nt4242的核苷酸序列的核苷酸序列，或天然側(cè)接于基于推測的外顯子/內(nèi)含子邊緣而由之制備的cDNA分子的ORF，并包括具有SEQ ID NO:12中ORF的cDNA分子ORF的側(cè)翼序列(從大約nt1至大約121和從大約nt1382至大約nt1892)的核苷酸序列，或其基本部分。
2．Gra1/Mag1啟動子區(qū)域本發(fā)明進一步提供包含犬新孢子蟲GRA1和MAG1基因啟動子之核苷酸序列的多核苷酸分子。在進行本文公開的實驗工作期間，確定了本文公開的犬新孢子蟲GRA1和MAG1基因在原位是以頭-頭方向天然排列的，它們之間有一長度約577nt的間插核苷酸序列。如SEQ ID NO:11中所示從nt127至nt703的該間插核苷酸序列代表包含犬新孢子蟲GRA1和MAG1基因二者的啟動子在內(nèi)的假定的雙向啟動子區(qū)。
本發(fā)明的GRA1/MAG1雙向啟動子區(qū)可用于多種目的，包括在犬新孢子蟲宿主細胞中，或在任何其他種的新孢子蟲或Apicomplexa其他成員的宿主細胞中，或其他任何適當(dāng)?shù)乃拗骷毎锌刂艷RA1或MAG1基因，或這兩種基因，或者一種或多種其他基因或編碼序列的重組表達。這種其他基因或編碼序列可以是重組宿主細胞固有的或異源的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的標準重組技術(shù)，將該啟動子序列融合到特定基因或編碼序列上，以使該啟動子序列以可操作方式與之連接(“可操作的連接”的定義見下文)。可利用該啟動子構(gòu)建重組表達系統(tǒng)，并用以篩選可調(diào)節(jié)新孢子蟲或Apicomlexa其他成員的GRA1和MAG1基因表達的化合物和轉(zhuǎn)錄因子。此外，可使用這樣的啟動子構(gòu)建體在新孢子蟲或Apicomplexa的其他成員中表達異源多肽。
3．寡核苷酸分子本發(fā)明進一步提供與本發(fā)明上述任何一種多核苷酸分子能雜交，或與具有作為本發(fā)明上述任一多核苷酸分子之互補物的核苷酸序列的多核苷酸分子能雜交的多核苷酸分子。這樣的寡核苷酸分子較好是至少長約10nt，更好是長約15至約30nt，并可在高度嚴緊條件下與一種或多種上述多核苷酸分子雜交。所說的高度嚴緊條件是在6×SSC/0.5％焦磷酸鈉中洗膜，并且洗膜溫度對于長約14堿基者，為大約37℃，長約17堿基者為大約48℃，長約20堿基者為大約55℃，長約23堿基者為大約60℃。本發(fā)明的較長寡核苷酸分子的其他雜交條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員按照標準技術(shù)來確定。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸分子互補于本發(fā)明上述多核苷酸分子至少之一的一部分。
可用于實施本發(fā)明的寡核苷酸分子的非限制性特定實例包括選自SEQ ID NO:14-26和28-34的寡核苷酸分子，及其互補物。
本發(fā)明的寡核苷酸分子可用于多種目的，其中包括作為擴增新孢子蟲特異性多核苷酸分子的引物以用于諸如疾病鑒別診斷，或者編碼或用作基因調(diào)節(jié)的反義分子。就診斷方面來說，可使用適當(dāng)設(shè)計的引物檢測動物組織或體液，如腦組織、肺組織、胎盤組織、血液、腦脊液、粘液、尿液、羊水等樣品中新孢子蟲特異性多核苷酸分子的存在。特異性擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生可支持新孢子蟲感染的診斷，而缺少擴增的產(chǎn)物則可能指示沒有感染。例如Innis等人(1995，出處同前)和Erlicch(1992，出處同前)編輯的前述文獻中描述了進行擴增的方法，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法。本領(lǐng)域已知的其他擴增技術(shù)也可使用，例如連接酶鏈反應(yīng)法。也可使用本文公開的多核苷酸分子的序列設(shè)計用于從新孢子蟲的其他種或株系中，或者從Apicomplexa的其他成員中分離同源基因的引物。
4．重組表達系統(tǒng)4.1克隆和表達載體本發(fā)明進一步提供可用于克隆和表達本發(fā)明任何一種多核苷酸分子的組合物，包括克隆載體、表達載體、包含任何所說的載體的被轉(zhuǎn)化宿主細胞，以及由其衍生的新的株系或細胞系。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供包含一種多核苷酸分子的重組載體，所說多核苷酸分子具有編碼犬新孢子蟲之GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1蛋白的核苷酸序列。在特定的但非限制性的實施方案中，本發(fā)明提供了編碼犬新孢子蟲GRA1蛋白的質(zhì)粒pRC77(ATCC209685)、編碼犬新孢子蟲GRA2蛋白的質(zhì)粒pRC5(ATCC209686)、編碼犬新孢子蟲SAG1蛋白的質(zhì)粒pRC102(ATCC209687)、編碼犬新孢子蟲MIC1蛋白的質(zhì)粒pRC340(ATCC209688)、編碼犬新孢子蟲MAG1蛋白的質(zhì)粒bd304(ATCC203413)，并且諸質(zhì)粒還包含上述的雙向啟動子區(qū)域。
優(yōu)選地，本發(fā)明的重組載體，特別是表達載體的構(gòu)建方式能使得本發(fā)明多核苷酸分子的編碼序列與轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼序列所需的一個或多個調(diào)節(jié)元件可操作性地連接，以產(chǎn)生多肽。本文中使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”包括但不只限于編碼誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動子、增強子、操縱子及本領(lǐng)域已知的可用于驅(qū)動和/或調(diào)節(jié)多核苷酸編碼序列表達的其它元件的核苷酸序列。另外，本文所說的編碼序列與一個或多個調(diào)節(jié)元件“可操作性地連接”是指調(diào)節(jié)元件可有效地調(diào)節(jié)并允許轉(zhuǎn)錄編碼序列或翻譯其mRNA，或發(fā)揮兩方面的功能。
構(gòu)建包含與適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)元件可操作性地連接的特定編碼序列的重組載體的方法是已知的，并可使用這些方法實現(xiàn)本發(fā)明。這些方法包括體外重組技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組(如參見Maniatis等人(1989),Ausubel等人(1989)、Sambrook等人(1989),Innis等人(1989)和Erlich(1992)的上述文獻)。
可用于表達本發(fā)明的GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1編碼序列的各種表達載體是本領(lǐng)域已知的，其中包括含有特定編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA和粘粒DNA表達載體?？山?jīng)加工而含有本發(fā)明的多核苷酸分子的典型原核表達載體質(zhì)粒包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(Biorad Laboratories,Richmond,CA)、pPL和pKK223(Pharmacia,Piscataway,NJ)、pQE50(Qiagen,Chatsworth,CA)和pGEM-T EASY(Promega,Madison,WI)等?？山?jīng)加工而含有本發(fā)明的多核苷酸分子的典型真核表達載體包括蛻皮激素誘導(dǎo)型哺乳動物表達系統(tǒng)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、基于巨細胞病毒啟動子-增強子的系統(tǒng)(Promega,Madison,WI；Stratagene,La Jolla,CA；Invitrogen)，和基于桿狀病毒的表達系統(tǒng)(Promega)等。
這些和其他載體的調(diào)節(jié)元件可在其強度和特異性方面各不相同?；谒玫乃拗?載體系統(tǒng)，可以使用多種適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任一種。例如，當(dāng)在哺乳動物細胞系統(tǒng)中克隆時，可使用從哺乳動物細胞基因組中分離的啟動子，如小鼠金屬硫蛋白啟動子，或從生長于這些細胞內(nèi)的病毒中分離的啟動子，如痘苗病毒7.5K啟動子或莫洛尼鼠類肉瘤病毒長末端重復(fù)序列?？墒褂靡灾亟MDNA或合成技術(shù)得到的啟動子以轉(zhuǎn)錄被插入的序列。另外，在特定誘導(dǎo)子，例如適于金屬硫蛋白啟動子的鋅和鎘離子的存在下，由某些啟動子啟動的表達可以被增強。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)或啟動子的非限制性例子包括用于細菌的β-gal啟動子、T7啟動子、TAC啟動子、λ左向和右向啟動子、trp和lac啟動子、trp-lac融合啟動子等；用于酵母的糖酵解酶啟動子，如ADH-和ADH-Ⅱ啟動子、GPK啟動子、PGI啟動子、TRP啟動子等；以及用于哺乳動物細胞的SV40早期和晚期啟動子、腺病毒主要晚期啟動子等。本發(fā)明進一步提供包含犬新孢子蟲GRA1和MAG1基因之啟動子的核苷酸序列的多核苷酸分子，其可用于在新孢子蟲或Apicomplexa的其他成員中表達本發(fā)明的任何編碼序列。
為足夠地翻譯被插入的編碼序列，還需要特異性起始信號。這些信號一般包括ATG起始密碼子及相鄰序列。在將包含其自身的起始密碼子和相鄰序列的本發(fā)明的多核苷酸分子插入到適當(dāng)?shù)谋磉_載體中的情況下，可能不必加入另外的翻譯控制信號。然而，當(dāng)只插入一部分編碼序列時，可能需要包括ATG起始密碼子等的外源翻譯控制信號?？蓮母鞣N來源，即天然和合成來源，得到這些外源翻譯控制信號和起始密碼子。再者，起始密碼子必須與編碼區(qū)的讀框一致，以確保整個插入片段符合讀框地翻譯。
也可構(gòu)建將表達包含本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的融合蛋白質(zhì)的表達載體。這樣的融合蛋白質(zhì)例如可用于產(chǎn)生抗新孢子蟲蛋白的抗血清、研究新孢子蟲蛋白的生化性質(zhì)、工程化修飾表現(xiàn)有不同免疫學(xué)或功能性質(zhì)的新孢子蟲蛋白、幫助鑒定或純化重組表達的新孢子蟲蛋白或改善其穩(wěn)定性。可能的融合蛋白表達載體包括但不只限于插入了編碼β半乳糖苷酶和trpE融合體、麥芽糖結(jié)合蛋白融合體、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合體及多組氨酸融合體(載體區(qū)域)之序列的載體?？捎糜跇?gòu)建編碼這些和其他融合蛋白的表達載體的方法是本領(lǐng)域已知的。
可用融合蛋白質(zhì)幫助純化已表達的蛋白質(zhì)。在一非限制性實施方案中，可使用直鏈淀粉樹脂純化GRA 1-麥芽糖結(jié)合性融合蛋白，可使用谷胱甘肽瓊脂糖小球純化GRA 1-谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白質(zhì)，可使用二價鎳樹脂純化GRA1-多組氨酸融合蛋白質(zhì)?；蛘?，也可使用抗載體蛋白質(zhì)或肽的抗體對融合蛋白質(zhì)進行親和層析純化。例如，可將編碼單克隆抗體之靶表位的核苷酸序列工程化轉(zhuǎn)移到與調(diào)節(jié)元件可操作性地連接的表達載體中，并限定其位置以使所表達的表位融合到本發(fā)明的新孢子蟲蛋白上。在一非限制性實施方案中，可用標準技術(shù)在相當(dāng)于GRA1蛋白之氨基或羧基末端的某個點上插入編碼FLAGTM表位標記(其為親水性標記肽)(Znternational Biotechnologies Inc.)的核苷酸序列中，然后可使用市售的抗FLAGTM抗體檢測并親和純化所表達的GRA1蛋白-FLAGTM表位融合體產(chǎn)物。
也可以修飾表達載體使之含有編碼特定蛋白酶切割位點的多接頭序列，從而可經(jīng)特定蛋白酶處理而從載體區(qū)域或融合對象釋放出已表達的新孢子蟲蛋白。例如，融合蛋白載體可包含編碼凝血酶或因子Xa裂解位點的核苷酸序列。
可使用已知方法將位于新孢子蟲蛋白編碼序列上游且讀框一致的信號序列加工到表達載體中，以指導(dǎo)所表達之蛋白質(zhì)的運輸和分泌。信號序列的非限制性實例包括α因子、免疫球蛋白、外膜蛋白質(zhì)、青霉素酶及T細胞受體等的信號序列。
為了有助于篩選出經(jīng)本發(fā)明重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞，可以工程化修飾載體使之進一步包含報道基因產(chǎn)物或其他選擇標志的編碼序列。這樣的編碼序列較好是與上述調(diào)節(jié)元件可操作性地連接的。用于實施本發(fā)明的報道基因是本領(lǐng)域熟知的，包括編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白、熒火蟲熒光素酶和人生長激素等的基因。編碼選擇標志的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的，包括編碼賦予抗生素抗性或抗代謝物抗性，或提供營養(yǎng)缺陷型需要等的基因產(chǎn)物的那些核苷酸序列。這些序列的例子包括編碼胸苷激酶活性，或抗氨甲喋呤、氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、zeocin、嘧啶甲胺、氨基糖苷或潮霉素等的那些序列。
4.2．宿主細胞轉(zhuǎn)化本發(fā)明進一步提供包含本發(fā)明的多核苷酸分子或重組載體的已轉(zhuǎn)化的宿主細胞，以及由之衍生的細胞系?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的宿主細胞可以是真核或原核細胞。這樣的已轉(zhuǎn)化宿主細胞包括但不只限于微生物，例如用重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA載體轉(zhuǎn)化的細菌，或者用重組載體轉(zhuǎn)化的酵母，或者是動物細胞，如用重組病毒載體如桿狀病毒感染的昆蟲細胞，或用重組病毒載體如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳動物細胞等。例如，可使用大腸桿菌菌株，如可得自ATCC(Rockville,MD,USA)(登記號No.31343)或Stratagene(La Jolla,CA)的DH5α菌株。真核宿主細胞包括酵母細胞，但也可有效地利用小鼠、倉鼠、牛、猴或人細胞系等哺乳動物細胞?？捎糜诒磉_本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)的真核宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如ATCC登記號No.CCL-61),NIHSwiss小鼠胚胎細胞NIH/3T3(例如ATCC登記號No.CRL-1658)，和Madin-Darby牛腎(MDBK)細胞(ATCC登記號No.CCL-22)。
較好是將本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到細胞的基本均質(zhì)培養(yǎng)物的一個或多個宿主細胞中。一般可按照已知技術(shù)，例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、磷酸鈣沉淀、氯化鈣處理、微量注射、電穿孔、經(jīng)與重組的病毒接觸進行感染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合或微粒轟擊等技術(shù)將載體導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)?？墒褂脴藴史椒ㄟx擇轉(zhuǎn)化體，例如通過選擇表達與重組表達載體相關(guān)的可選擇標志如抗生素抗性的細胞的方法。
一旦將表達載體導(dǎo)入宿主細胞后，即可使用Southern雜交分析、限制性酶切分析、包括反轉(zhuǎn)錄酶PCR(rt-PCR)的PCR分析等標準技術(shù)證實本發(fā)明的多核苷酸分子是否整合并保留在宿主細胞基因組中或以附加體形式存在，或者用免疫學(xué)檢測法檢測預(yù)期的蛋白質(zhì)產(chǎn)物?？捎帽绢I(lǐng)域已知的至少下列四種一般性方法中的一種鑒定含有和/或表達本發(fā)明的多核苷酸分子的宿主細胞(ⅰ)DNA-DNA、DNA-RNA、或RNA-反義RNA雜交；(ⅱ)檢測“標志”基因功能的存在；(ⅲ)檢測特異性mRNA轉(zhuǎn)錄本在宿主細胞中的表達，以估計轉(zhuǎn)錄水平；或(ⅳ)以本領(lǐng)域已知的免疫檢測法檢測成熟多肽產(chǎn)物的存在。
4.3．重組多肽的表達和純化一旦已將本發(fā)明的多核苷酸分子穩(wěn)定導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷毎兄螅纯煽寺≡鲋骋艳D(zhuǎn)化的宿主細胞，并在有助于最大量產(chǎn)生所編碼的多肽的條件下培養(yǎng)所得到的細胞。這樣的條件一般包括培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的細胞達到高密度。當(dāng)表達載體含有誘導(dǎo)型啟動子時，可根據(jù)需要，利用溫度改變、營養(yǎng)素耗盡、加入義務(wù)誘導(dǎo)劑(如糖類類似物，例如異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、過量代謝付產(chǎn)物積聚等適當(dāng)誘導(dǎo)條件以誘導(dǎo)表達。
當(dāng)多肽保留在宿主細胞內(nèi)時，應(yīng)收獲并裂解細胞，并在本領(lǐng)域已知的盡可能減少蛋白質(zhì)降解的提取條件下，例如于4℃和/或有蛋白酶抑制劑存在條件下，從裂解物中基本上純化或分離產(chǎn)物。如多肽能從宿主細胞中分泌出來，則可簡單地收集已耗竭的營養(yǎng)素培養(yǎng)基，并從中基本上純化或分離多肽。
必要時，可使用標準方法，包括但不只限于硫酸銨沉淀，大小分級分離、離子交換層析、HPLC、密度梯度離心及親和層析法，從細胞裂解物或培養(yǎng)基中基本上純化或分離多肽。如果多肽缺乏生物學(xué)活性，則可作根據(jù)分子大小、或與多肽特異性抗體的反應(yīng)性，或根據(jù)融合體標記的存在檢測之。用于實施本發(fā)明時，多肽可以是已分泌到培養(yǎng)液中或存在于細胞裂解物中的未純化狀態(tài)，但較好是已從中得到基本純化或分離。本文中所說的多肽“基本上已純化”，是指該多肽構(gòu)成特定制劑中蛋白質(zhì)的至少約20％(重量)。另外，本文中所說的多肽“已分離”，指的是該多肽構(gòu)成特定制劑中蛋白質(zhì)的至少約80％(重量)。
因此，本發(fā)明提供由本發(fā)明的多核苷酸編碼的基本上已純化或分離的多肽。在一非限制性實施方案中，該多肽是選自GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1蛋白的犬新孢子蟲蛋白。在另一優(yōu)選實施方案中，犬新孢子蟲GRA1蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一優(yōu)選實施方案中，犬新孢子蟲GRA2蛋白具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方案中，犬新孢子蟲SAG1蛋白具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方案中，犬新孢子蟲MIC1蛋白具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方案中，犬新孢子蟲MAG1蛋白具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
本發(fā)明進一步提供同源于上述任何一種犬新孢子蟲蛋白的多肽，其中術(shù)語“同源”具有上文就多肽所限定的含義。本發(fā)明的與上述犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1蛋白任何一種同源的多肽并不包括具有T.gondii GRA、SAG、MIC或MAG蛋白所固有的氨基酸序列的多肽，而且與這樣的T.gondii多肽之間的氨基酸序列同一性不超過大約90％，較好不超過大約80％，其中序列同一性是使用BLASTP算法(GenBank,NCBI)確定的。
本發(fā)明進一步提供由本發(fā)明任何一種上述多肽的基本部分組成的多肽。本文使用的術(shù)語-本發(fā)明多肽的“基本部分”或“肽片段”意指組成上小于相應(yīng)全長度多肽之完整氨基酸序列、但包含其氨基酸序列的至少約10％、較好至少約20％、并可用于實施本發(fā)明的多肽(“可用于”具有上文就多肽所限定的含義)。特別優(yōu)選的是具有免疫原性(即能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)而產(chǎn)生特異地抗相應(yīng)的全長度新孢子蟲多肽的抗體)的肽片段。
本發(fā)明進一步提供包含與本領(lǐng)域已知的載體或融合對象融合的任一種上述多肽的融合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進一步提供制備任一種上述多肽的方法，包括在有利于多肽表達的條件下培養(yǎng)已用重組表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其中所說的重組表達載體包含含有編碼特定多肽之核苷酸序列的多核苷酸分子，并且該多核苷酸分子與一種或多種調(diào)節(jié)元件可操作性地連接；然后從細胞培養(yǎng)物中回收所表達的多肽。
5．多肽的應(yīng)用一旦本發(fā)明的多肽已達到足夠的純度，即可使用SDS-PAGE、大小排阻層析、氨基酸序列分析、免疫學(xué)活性、生物學(xué)活性等標準方法鑒定其特性?？蛇M一步使用親水性分析(參見Hopp和Woods,1981，美國國家科學(xué)院院報，78:3824)、類似的軟件算法鑒定多肽的疏水性和親水性區(qū)域。可進行結(jié)構(gòu)分析以鑒定呈現(xiàn)特異性二級結(jié)構(gòu)的多肽區(qū)域。可使用X射線晶體分析法(Engstrom,1974，生物化學(xué)與實驗生物學(xué)，11:7-13)、計算機模型繪制(Fletterick和Zoller(編)，1996,Current Communicationsin Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY)及核磁共振(NMR)等生物物理方法制圖并研究多肽與其他推測的相互作用性蛋白質(zhì)/受體/分子之間相互作用的潛在位點?？墒褂脧倪@些研究中獲得的信息設(shè)計缺失突變體和疫苗組合物，并設(shè)計或選擇可在體內(nèi)特異性阻斷該多肽之生物學(xué)功能的治療或藥用化合物。
本發(fā)明的多肽可用于多種目的，包括作為疫苗組合物的成分以用于保護哺乳動物免患新孢子蟲病，或作為診斷試劑，例如以ELISA檢測等標準檢測法篩選動物血液或血清樣品中的新孢子蟲特異性抗體；或如下所述用作產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體的抗原，其中可以使用所述抗體作為診斷試劑，例如以Western印跡檢測法等標準技術(shù)篩選動物細胞、組織或體液樣品中的新孢子蟲特異性蛋白質(zhì)。
6．多肽的類似物和衍生物可以在蛋白質(zhì)水平上修飾本發(fā)明的任何多肽，以改善或改變其生物學(xué)或免疫學(xué)特征?？墒褂靡阎夹g(shù)對多肽進行一種或多種化學(xué)修飾，以制備其類似物，這些技術(shù)包括但不只限于下述中任何一種用相應(yīng)的D型氨基酸、氨基酸類似物或氨基酸模擬物取代多肽的一個或多個L型氨基酸，以便例如產(chǎn)生肼基甲酸酯類(carbazates)或三元中心；或者特異性化學(xué)修飾，例如用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶或V8蛋白酶進行蛋白水解性切割，或者用NaBH4或溴化氰處理，或者乙酰化、甲酰化、氧化或還原等。另一種方案或同時地，也可用遺傳重組技術(shù)修飾本發(fā)明的多肽。
可以在分子上連接一個或多個化學(xué)基團，包括但不只限于乙?；?、硫橋基、糖基、脂和磷酸，和/或連接到本發(fā)明的第二種多肽，或另一種蛋白質(zhì)如血清白蛋白、匙孔血蘭蛋白或商品上已活化的BSA，或者多聚氨基酸(如多聚賴氨酸)，或多糖(如Sepharose，瓊脂糖，或經(jīng)過修飾或未經(jīng)修飾的纖維素)上等，以制備本發(fā)明多肽的衍生物。較好是在多肽的氨基酸側(cè)鏈和/或N末端或C末端上進行共價連接。進行這些連接反應(yīng)的方法是蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域中已知的。
可用于實現(xiàn)本發(fā)明的衍生物包括那些將水溶性聚合物如聚乙二醇連接到本發(fā)明的多肽或其類似物或衍生物上，以提供其他所期望的性質(zhì)，同時保留多肽的至少一部分免疫原性的衍生物。這些附加的預(yù)期性質(zhì)包括比如提高在水溶液中的溶解度，提高貯存穩(wěn)定性、提高對蛋白降解的抗性，提高體內(nèi)半壽期等。適于連接到本發(fā)明多肽上的水溶性聚合物包括但不只限于聚乙二醇均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇與丙二醇的共聚物，其中所說的均聚物和共聚物未被取代或在一側(cè)末端被烷基、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、聚乙烯醚酯類和α、β-多(2-羥乙基)-DL-天冬酰胺取代的。特別優(yōu)選的是聚乙二醇。制備多肽的水溶性聚合物結(jié)合物的方法是本領(lǐng)域已知的，并且已在下列專利文獻中描述過美國專利3,788,948、3,960,830、4,002,531、4,055,635、4,179,337、4,261,973、4,412,989、4,414,147、4,415,665、4,609,546、4,732,863、4,745,180，歐洲專利(EP)152,847、98,110；和日本專利5,792,435等，這些專利均在此引入作為參考。
7．抗體本發(fā)明進一步提供抗本發(fā)明多肽的分離抗體。在一優(yōu)選實施方案中，可使用已知方法產(chǎn)生抗犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1蛋白的抗體。可用部分或基本上純化或分離的犬新孢子蟲蛋白，或其如上文描述的同系物、融合蛋白、基本部分、類似物或衍生物免疫選自豬、牛、馬、兔、山羊、綿羊或小鼠等各種宿主動物?？墒褂孟挛拿枋龅淖魟┨岣呖贵w產(chǎn)生量。
可從被免疫動物的血清中得到和分離多克隆抗體，并使用常規(guī)方法試驗其對抗原的特異性。或者，也可使用由培養(yǎng)的連續(xù)細胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)制備并分離單克隆抗體。這些技術(shù)包括但不只限于原先由Kohler和Milstein(自然，1975,256:495-497)描述的雜交瘤技術(shù)、人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，1983，今日免疫學(xué)，4:72；Cote等，1983，美國國家科學(xué)院院報，80:2026-2030)，以及EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss,Inc.,PP.77-86)?；蛘撸刹捎靡咽龅纳a(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(如參見美國專利4,946,778)生產(chǎn)犬新孢子蟲抗原特異性單鏈抗體。
含有本發(fā)明多肽的特異性結(jié)合位點的抗體片段也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，并可用已知技術(shù)制備。這樣的片段包括但不只限于可由胃蛋白酶消化完整抗體分子而產(chǎn)生的F(ab′)2片段，和可經(jīng)還原F(ab′)2片段的二硫橋而產(chǎn)生的Fab片段?；蛘撸部蓸?gòu)建Fab表達文庫(Huse等，1989，科學(xué)，246:1275-1281)，以迅速鑒定對犬新孢子蟲蛋白有所需特異性的Fab片段。
生產(chǎn)和分離單克隆抗體及抗體片段的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并在例如下列文獻中給出了更詳細的描述Harlow和Lane,1988，抗體實驗室手冊，冷泉港實驗室和J.W.Cooding,1986，單克隆抗體原理與實踐，Academic Press,London(其列為本文參考文獻)。
8．新孢子蟲基因的定向突變基于對本發(fā)明多核苷酸分子的公開，可以制備可用于使新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1基因(以下合在一起或單獨稱為“新孢子蟲基因”)失活或發(fā)生突變的遺傳構(gòu)建體?？墒褂眠m當(dāng)設(shè)計的遺傳構(gòu)建體，結(jié)合現(xiàn)在已知的或有待進一步發(fā)展的遺傳技術(shù)對每種新孢子蟲基因進行突變。例如可以使用可發(fā)揮下列功能的本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體突變新孢子蟲基因(a)刪除該新孢子蟲基因的所有或部分編碼序列或調(diào)節(jié)序列，或(b)用不同的核苷酸序列取代該新孢子蟲基因的所有或部分編碼序列或調(diào)節(jié)序列；或(c)將一個或多個核苷酸或者含有新孢子蟲或異源來源的核苷酸序列的寡核苷酸分子或多核苷酸分子插入到該新孢子蟲基因的編碼序列或調(diào)節(jié)序列中；或(d)完成(a)、(b)或(c)的某種組合。
若其內(nèi)一種新孢子蟲基因已突變的新孢子蟲細胞與其內(nèi)基因未被突變的新孢子蟲同樣株系的細胞相比，基因的突變使攜帶該已突變基因的新孢子蟲細胞的病原性降低，并且可將攜帶失活基因的這種新孢子蟲細胞用于疫苗組合物中，特別是用于經(jīng)修飾的活疫苗中，以誘導(dǎo)或有助于誘導(dǎo)哺乳動物抗新孢子蟲病的保護性反應(yīng)，則該已突變的新孢子蟲細胞可用于實施本發(fā)明。在一優(yōu)選實施方案中，該突變可使所述新孢子蟲基因部分或完全失活，或者使新孢子蟲基因編碼的蛋白質(zhì)部分或完全失活。在此，如果不產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物(例如已缺失該基因)，或者所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不再完成其正常生物學(xué)功能，或者不再能被運輸?shù)狡湔＜毎课簧希蛘咚a(chǎn)生的產(chǎn)物雖能完成其正常生物學(xué)功能，但明顯降低了速率，或者如果這種突變導(dǎo)致與其內(nèi)基因未被如此突變的同一株系細胞相比，其內(nèi)基因已被如此突變的新孢子蟲致病性株系的細胞的致病性發(fā)生可檢測水平的降低，則認為這種新孢子蟲基因或蛋白質(zhì)是部分或完全失活的。
在一非限制性實施方案中，可用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體，可以以不同的核苷酸序列，例如突變的編碼序列或突變的調(diào)節(jié)序列或者其部分，取代野生型基因的編碼序列或其啟動子或其他調(diào)節(jié)區(qū)域或者其部分，而突變野生型新孢子蟲基因?？捎靡族e聚合酶鏈反應(yīng)法或盒式誘變法等多種已知方法產(chǎn)生用于這種遺傳構(gòu)建體中的突變的新孢子蟲基因序列。例如，可以利用寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法，按限定的方式改變野生型新孢子蟲基因的編碼序列或啟動子序列，例如在序列內(nèi)的特定點上導(dǎo)入移碼突變或終止密碼子。另一種方式是或附加地，可將一個或多個核苷酸、寡核苷酸分子或多核苷酸分子插入到編碼序列或啟動子序列中，或用一個或多個不同的核苷酸、寡核苷酸分子或多核苷酸分子取代一部分編碼序列或啟動子序列，從而制備可用于本發(fā)明遺傳構(gòu)建體中的突變的核苷酸序列?？蓮娜魏翁烊粊碓椿蚝铣傻玫竭@樣的寡核苷酸分子或多核苷酸分子。插入的序列可以只是簡單地破壞新孢子蟲基因的讀框，或可進一步編碼如可選擇標志等異源基因產(chǎn)物。
另一種方式是或者額外地，可用隨機誘變法產(chǎn)生突變的新孢子蟲基因序列，以用于本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體中。可用現(xiàn)在知道的或有待進一步發(fā)展的任何技術(shù)，如將攜帶新孢子蟲基因的細胞暴露于紫外照射下或X光照射，或與N-甲基-N′-亞硝基胍、甲基磺酸乙酯、亞硝酸或氮芥子氣等化學(xué)誘變劑接觸以完成突變，然后選擇特定基因中攜帶突變的細胞即可完成隨機誘變(有關(guān)誘變技術(shù)的綜述可參見Ausubel,1989，上述文獻)。
產(chǎn)生如上述可用于實施本發(fā)明的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞的突變可發(fā)生于新孢子蟲基因內(nèi)的任何區(qū)段，其中包含ORF、啟動子或其他調(diào)節(jié)區(qū)，或發(fā)生于天然包含該基因或ORF的任何其他序列中。這樣的新孢子蟲細胞包括能產(chǎn)生其中由新孢子蟲基因正常編碼的蛋白質(zhì)受到修飾、或者不產(chǎn)生由新孢子蟲基因正常編碼的蛋白質(zhì)的突變體，并且可以是無效突變體、條件突變體或滲漏突變體。
或者，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可包含天然側(cè)接于新孢子蟲原位基因或ORF的核苷酸序列，例如SEQ ID NO:1,3,4,6,8,10,11和12中給出的那些，其中只有一部分或沒有該基因編碼區(qū)的核苷酸序列。這樣的遺傳構(gòu)建體例如可用于刪除整個所述新孢子蟲基因或ORF。
在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體包含可用于使一種新孢子蟲基因失活的多核苷酸分子，包括(a)具有與編碼新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1蛋白的核苷酸序列本來相同的核苷酸序列、但其中還進一步包含一個或多個失活突變的多核苷酸分子；或者(b)含有天然側(cè)接于原位新孢子蟲基因ORF上的核苷酸序列的多核苷酸分子。當(dāng)被轉(zhuǎn)化到新孢子蟲株系的細胞中之后，即通過同源重組使遺傳構(gòu)建體的多核苷酸分子定向結(jié)合于特定新孢子蟲基因，并進而取代該基因或其部分，或插入到該基因中。該重組過程的結(jié)果是使特定新孢子蟲株系固有的新孢子蟲基因被失活了。
在寄生性原生動物中完成同源性基因置換的方法是本領(lǐng)域已知的，并已在其他文獻中作出描述(如參見Cruz和Beverley,1990，自然，348:171-173；Cruz等，1991，美國國家科學(xué)院院報，88:7170-7174；Donald和Roos,1994，分子生物學(xué)與寄生蟲學(xué)，63:245-253，和Titus等，1995，美國國家科學(xué)院院報，92:10267-10271，這些文獻均列為本文參考文獻)。
為了通過同源重組造成定向基因突變，遺傳構(gòu)建體較好是含有上述已突變的核苷酸序列的環(huán)形或線性化的質(zhì)粒。在一非限制性實施方案中，使用至少約200個核苷酸的突變序列將本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體導(dǎo)向特定的新孢子蟲基因以進行同源重組，盡管使用長度較短的核苷酸序列可能也是有效的。此外，質(zhì)粒較好是包含附加的編碼報道基因產(chǎn)物或其他可選擇標志的核苷酸序列，構(gòu)建該質(zhì)粒以使之將以與待破壞的固有新孢子蟲基因的調(diào)節(jié)元件序列可操作性地連接的方式插入到新孢子蟲基因組中?？捎糜趯崿F(xiàn)本發(fā)明的報道基因是本領(lǐng)域已知的，包括編碼CAT、綠色熒光素蛋白和β-半乳糖苷酶等的基因。編碼可選擇性標志的核苷酸序列也是本領(lǐng)域已知的，包括編碼賦予對抗生素或抗代謝物的抗性，或補充營養(yǎng)缺陷性需要之基因產(chǎn)物的核苷酸序列。這樣的序列的例子包括編碼嘧啶甲胺抗性，或新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(賦予對氨基糖苷類的抗性)、或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(賦予對潮霉素的抗性)的那些序列。
可用于制備本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體的方法是本領(lǐng)域已知的，包括體外重組技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組技術(shù)(如參見Maniatis等，1989；Ausubel等，1989；Sambrook等，1989；Innis等，1995，和Erlich,1992等的上述文獻)。
可按照已知技術(shù)，例如電穿孔技術(shù)，用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染新孢子蟲細胞?？墒褂脴藴始夹g(shù)選擇轉(zhuǎn)化體，例如選擇表達與構(gòu)建體相關(guān)之可選擇標記的細胞。可使用基因分析技術(shù)，例如Southern印跡分析，或Northern分析法以檢測編碼特定蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)錄物是否缺乏，或根據(jù)以諸如免疫分析法確定的如降低了致病性或細胞缺乏特定的蛋白質(zhì)等新表型的出現(xiàn)，或聯(lián)用這些方法來鑒定其中已發(fā)生了成功重組過程并已使特定靶基因失活的轉(zhuǎn)化體。
能夠按照本發(fā)明進行修飾的新孢子蟲細胞較好是速殖體，但也可以是慢殖體或卵母細胞。雖然在新孢子蟲生活周期的某些階段細胞是二倍體但速殖體是單倍體。因此，在生產(chǎn)表達適當(dāng)突變表型的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞時優(yōu)選使用速殖體，因為速殖體只需要一次成功重組過程即可破壞特定的新孢子蟲基因?；蛘?，在新孢子蟲的二倍體細胞中，必須破壞各基因的兩個等位基因。為此，可用攜帶兩個不同選擇標志的遺傳構(gòu)建體依次破壞第一個等位基因，然后破壞第二個等位基因。
在另一個非限制性實施方案中，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體進一步包含來自新孢子蟲或可感染動物的不同病原體的不同基因或編碼區(qū)，其中所說的基因或編碼區(qū)編碼可用于在免疫接種了本發(fā)明經(jīng)修飾的活新孢子蟲細胞的動物體內(nèi)誘導(dǎo)或幫助誘導(dǎo)分別的和不同的保護性免疫反應(yīng)?？蓪υ摳郊踊蚧蚓幋a區(qū)作進一步的遺傳修飾以使之含有導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)從被修飾的活新孢子蟲細胞中分泌出來的信號序列，從而使抗原呈現(xiàn)于被免疫動物的免疫系統(tǒng)中。
因此本發(fā)明提供其內(nèi)GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1基因已發(fā)生突變的經(jīng)過修飾的活新孢子蟲細胞。本發(fā)明進一步提供其內(nèi)GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG基因中兩個或多個已發(fā)生突變的經(jīng)過修飾的活新孢子蟲細胞，其中可使用上述常規(guī)方法制備所說的細胞。另外，本發(fā)明提供制備經(jīng)修飾的活新孢子蟲細胞的方法，其包括(a)用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化新孢子蟲；(b)選擇其內(nèi)GRA1、GRA2、MIC1、SAG1或MAG1基因已被遺傳構(gòu)建體突變的被轉(zhuǎn)化的細胞；并且(3)從步驟(b)的細胞中選擇出可用于保護哺乳動物抗新孢子蟲病的疫苗中的那些細胞。
9．培養(yǎng)新孢子蟲細胞可按照本領(lǐng)域中所描述的已知技術(shù)，用速殖體感染任何接受性宿主細胞系，特別是哺乳動物細胞系，以體外培養(yǎng)和維持可用于本發(fā)明的新孢子蟲細胞?？稍谄渲信囵B(yǎng)新孢子蟲速殖體的哺乳動物細胞系，包含人包皮成纖維細胞(Lindsay等，1993，美國獸醫(yī)研究雜志，54:103-106)、牛心肺主動脈內(nèi)皮細胞(Marsh等，1995，上述文獻)、牛單核細胞(Lindsay和Dubey,1989，上述文獻)，和猴腎細胞等。例如，可在Hs68人包皮成纖維細胞(ATCC登記號No.CRL-1635)(Lindsay，等，1993，上述文獻)的單層中培養(yǎng)犬新孢子蟲的速殖體，并且本發(fā)明中使用的用犬新孢子蟲株系NC-1感染的MARC145猴腎細胞保藏在ATCC(登記號No.12231)?？梢灶愃频嘏囵B(yǎng)并維持慢殖體。
可在本領(lǐng)域中描述的幾種類型的培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動物細胞培養(yǎng)物和維持已感染了新孢子蟲細胞的細胞培養(yǎng)物。例如，可以在加有10％(V/V)熱滅活的胎牛血清(FBS)或成年馬血清(ES)、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素(Conrad等，1993，文獻同上)的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM；Gibco Laboratories,N.Y.)中培養(yǎng)已用犬新孢子蟲速殖體感染的牛心肺主動脈內(nèi)皮細胞的穩(wěn)定單層培養(yǎng)物。可在含有2％(V/V)FBS、1.0mM丙酮酸鈉、1×104U/ml青霉素、1×104μg/ml鏈霉素、5×10-2mM 2-巰基乙醇和0.3mg/ml L-谷氨酰胺的RPMI1640(維持培養(yǎng)基)中維持Hs68人包皮成纖維細胞的單層?？稍谄渲蠪BS增加到10％(V/V)的同樣培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基)中維持已被新孢子蟲感染的Hs68人包皮成纖維細胞的單層培養(yǎng)物。
通常在標準組織培養(yǎng)條件如37℃和5％CO2條件下維持被新孢子蟲感染的哺乳動物細胞單層培養(yǎng)物。通?？梢允褂脴藴始夹g(shù)，借助顯微鏡確定，當(dāng)培養(yǎng)物中70-90％的哺乳動物細胞已被感染時，即將速殖體傳代到未被感染的單層培養(yǎng)物中?？墒褂萌魏螛藴始夹g(shù)裂解宿主細胞并經(jīng)過濾或離心收集速殖體，而從被感染的哺乳動物細胞培養(yǎng)物中收集速殖體。
也可以如上所述在哺乳動物細胞中培養(yǎng)本發(fā)明的經(jīng)修飾的活新孢子蟲細胞。
10．抗新孢子蟲疫苗本發(fā)明進一步提供抗新孢子蟲病的疫苗，其包含免疫有效量的一種或多種本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽，和獸醫(yī)可接受的載體。在一優(yōu)選實施方案中，疫苗包含選自GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1的犬新孢子蟲蛋白。
本發(fā)明進一步提供抗新孢子蟲病的疫苗，其包含免疫有效量的一種或多種本發(fā)明的多核苷酸分子，和獸醫(yī)可接受的載體。在一優(yōu)選實施方案中，疫苗包含具有編碼選自GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1的犬新孢子蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列的多核苷酸分子。
本發(fā)明進一步提供抗新孢子蟲病的疫苗，其包含免疫有效量的本發(fā)明的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞，和獸醫(yī)可接受的載體。在一優(yōu)選實施方案中，用于本發(fā)明的疫苗中的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞是表達GRA1-、GRA2-、SAG1-、MICI-或MAG1-表型的活的犬新孢子蟲細胞。或者，本發(fā)明的疫苗也可包含已失活的本發(fā)明的任何經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何技術(shù)，例如用二元氮丙啶(BEI)，或β-丙內(nèi)酯(beta-propiolactone)，或用凍融法或加熱處理，或細胞勻漿化，或合用這些類型的技術(shù)而失活經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞。從勻漿化的、經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞制備的疫苗可由整個未分離的細胞勻漿物或其免疫有效的亞級份組成。
本文中使用的術(shù)語“免疫有效量”是指當(dāng)對哺乳動物的一個成員一次給藥或多次給藥后能夠誘導(dǎo)抗新孢子蟲病的保護性反應(yīng)所需的抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、多核苷酸分子或經(jīng)修飾的細胞的量。
本文中多處使用的短語“能夠誘導(dǎo)保護性反應(yīng)”包含動物響應(yīng)于疫苗接種而誘導(dǎo)或增強任何基于免疫的反應(yīng)，包括可保護接種后動物免于患新孢子蟲病的抗體或細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)或兩種情況兼而有之。術(shù)語“保護性反應(yīng)”和“保護”在這里不僅是指絕對預(yù)防新孢子蟲病或絕對預(yù)防由致新孢子蟲病的病原體引起的感染，而且還指由這種病原體所致感染的速度和程度方面的任何可檢測的降低，或由這種病原體感染所導(dǎo)致的疾病嚴重性或任何癥狀或病情的任何可檢測的降低，包括如在一種或多種組織中所形成的損傷的形成速度或絕對數(shù)目的任何可檢測的降低，或流產(chǎn)發(fā)生率，或感染從受孕哺乳動物向胎兒或從親代哺乳動物向其子代傳播的任何可檢測的降低(以上均為同種的接種疫苗的動物與未接種疫苗的被感染動物相比)。
在進一步的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的疫苗是用于保護哺乳動物抗新孢子蟲病和任選地一種或多種其他會給哺乳動物帶來痛苦的疾病或病理狀況的聯(lián)合疫苗，其包含免疫有效量的含有本發(fā)明的多肽、多核苷酸分子、或經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞的第一成分；免疫有效量的不同于第一成分的第二成分，它能夠誘導(dǎo)或有利于誘導(dǎo)對抗可給哺乳動物帶來痛苦的疾病或病理條件的保護性反應(yīng)；以及獸醫(yī)可接受的載體。
聯(lián)合疫苗的第二種成分是基于其能夠誘導(dǎo)或有利于誘導(dǎo)抗新孢子蟲病，或本領(lǐng)域已知的另一種可給哺乳動物成員帶來痛苦的疾病或病理條件的保護性反應(yīng)而選擇的。本領(lǐng)域中現(xiàn)在已知的，或?qū)泶ǖ目捎糜谔囟ú溉閯游锏囊呙缃M合物中的任何抗原成分均可作為聯(lián)合疫苗的第二種成分。這樣的抗原成分包含但不限于能提供對抗下列病原體的保護作用的抗原牛皰疹病毒(引起感染性牛鼻氣管炎)，牛呼吸道合胞病毒，牛病毒性腹瀉病毒，Ⅰ、Ⅰ或Ⅲ型副流感病毒、鉤端螺旋體、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、支原體、克雷伯氏桿菌、沙門氏菌、冠形病毒、輪狀病毒、狂犬病毒、溶血巴氏桿菌、出血敗血性巴氏桿菌、梭狀芽孢桿菌、破傷風(fēng)類毒素、大腸桿菌、隱孢菌(Cryptosporidium spp.)、艾美球蟲、毛滴蟲及其他真核生物寄生蟲等。
在一非限制性實施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗包含選自下列成員中的兩種或多種成分的組合免疫有效量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽、免疫有效量的本發(fā)明的多核苷酸分子，和免疫有效量的本發(fā)明的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗包含選自犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1蛋白，編碼犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1蛋白之一的多核苷酸分子，和表現(xiàn)有GRA1-、GRA2-、SAG1-、MIC1-和MAG1-表型之一的經(jīng)修飾的活新孢子蟲細胞中的兩種或多種成分的組合。
如下所述，本發(fā)明的疫苗進一步包含一種或多種附加的免疫調(diào)節(jié)成分，包括佐劑或細胞因子。
本發(fā)明進一步提供制備抗新孢子蟲病之疫苗的方法，其包括將免疫有效量的本發(fā)明的犬新孢子蟲蛋白或多肽，或多核苷酸分子，或經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞，以適于對哺乳動物給藥的形式與獸醫(yī)可接受的載體組合。在一優(yōu)選實施方案中，所述蛋白質(zhì)是選自GRA1、GRA2、SAG1、MIC1、或MAG1的犬新孢子蟲蛋白；優(yōu)選所述多核苷酸分子包含編碼選自GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1的犬新孢子蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列；優(yōu)選所述經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞是表現(xiàn)選自GRA1-、GRA2-、SAG1-、MIC1-和MAG1-的表型的活細胞。
可使用含有所說的新孢子蟲細胞(其可以是游離在培養(yǎng)基中或保留在哺乳動物宿主細胞中或兩種情況兼而有之)的培養(yǎng)液等分樣品制備含有本發(fā)明經(jīng)修飾的活新孢子蟲細胞的疫苗，并可直接或以濃縮形式對哺乳動物給藥。或者，可將經(jīng)修飾的活新孢子蟲細胞與獸醫(yī)可接受的載體組合，其中加或不加選自本領(lǐng)域已知的并適于選定的給藥途徑的免疫調(diào)節(jié)劑，并且優(yōu)選疫苗組合物中保留至少有一定程度存活性的經(jīng)修飾的活新孢子蟲細胞?？捎糜诒景l(fā)明的疫苗中的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞較好是速殖體，但也可代之以慢殖體或卵中母細胞，或其某種組合。
可按已被接受的常規(guī)方法配制本發(fā)明的疫苗組合物，以包含獸醫(yī)可接受的載體，如標準緩沖液、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑和/或助溶劑，并可配制成有利于緩釋的劑型。稀釋劑包含水、鹽溶液、右旋糖、乙醇、甘油等。等滲性添加劑包含氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖等。穩(wěn)定劑包含白蛋白等。適用的其他疫苗載體和添加劑，包含特別適用于配制經(jīng)修飾的活疫苗的那些載體和添加劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或顯而易見的(如參見Remington的制藥科學(xué)，第18版，1990,MackPublishing)(其列為本文參考文獻)。
本發(fā)明的疫苗可進一步包含一種或多種其他免疫調(diào)節(jié)成分，如佐劑或細胞因子等?？捎糜诒景l(fā)明疫苗中的佐劑的非限制性例子是RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc.,Hamilton,MT)、明礬、礦物質(zhì)凝膠如氫氧化鋁凝膠、水包油乳劑、油包水乳劑如弗氏完全佐劑和不完全佐劑、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、AMPHIGEN佐劑、皂苷、Quil A或其他皂苷級份、單磷酰脂A和Avridine脂質(zhì)胺佐劑。用于本發(fā)明疫苗中的水包油型乳劑的特定非限制性實例包括改進的SEAM62和SEAM1/2配制品。改進的SEAM62是一種水包油乳劑，其中含有5％(V/V)角鯊烯(Sigma)、1％(V/V)SPAN85去污劑(ICI Surfactants)、0.7％(V/V)TWEEN80去污劑、2.5％(V/V)乙醇、200μg/ml Quil A、100μg/ml膽固醇和0.5％(V/V)卵磷脂。改進的SEAM1/2也是一種水包油乳劑，其中含有5％(V/V)角鯊烯、1％(V/V)SPAN85去污劑、0.7％(V/V)Tween 80去污劑、2.5％(V/V)乙醇、100μg/mlQuil A和50μg/ml膽固醇?？砂ㄓ谝呙缰械钠渌庖哒{(diào)節(jié)劑包含例如一種或多種白細胞介素、干擾素或其他已知的細胞因子。如疫苗中包含經(jīng)修飾的活新孢子蟲細胞，則較好是根據(jù)所得疫苗制劑在維持經(jīng)修飾的活新孢子蟲細胞至少某種程度存活性方面的能力選擇佐劑。
當(dāng)疫苗組合物含有經(jīng)修飾的活新孢子蟲細胞時，可以冷藏或凍存疫苗。當(dāng)疫苗組合物含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽、多核苷酸分子或失活的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞時，則疫苗可以冷凍貯存或以凍干形式貯存，后者要在給藥之前使用適當(dāng)?shù)南♂寗┲匦滤稀?br> 可根據(jù)需要將本發(fā)明的疫苗配制成適于緩慢釋放抗原的形式。這樣的緩釋配方的例子包括抗原與生物相容性聚合物的合成物如聚(乳酸)、乳酸乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid))、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、膠原蛋白等的組合。包括A.Domb等，1992，用于高級技術(shù)的聚合物，3:279-292在內(nèi)的幾種出版物中已綜述了藥物送遞載體中可降解性聚合物的結(jié)構(gòu)、選擇和使用?？稍贛.Chasin和R.Langer(編)，1990，″作為藥物送遞系統(tǒng)的生物可降解性聚合物″(摘自藥物和制藥科學(xué)，Vol.45,M.Dekker,NY)中查到選擇和使用藥物配方中的聚合物的進一步指南。另一種方案是或額外地，可將抗原制成微膠囊化制劑以改善給藥途徑和效率。制備微膠囊化抗原的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括例如美國專利3,137,631、3,959,457、4,205,060、4,606,940、4,744,933、5,132,117，和國際專利申請WO95/28227中描述的那些技術(shù)，所有這些出版物均在此引入作為參考文獻。
脂質(zhì)體也可用于改善抗原的持續(xù)釋放。有關(guān)如何制備和使用脂質(zhì)體配方的詳細內(nèi)容可見于美國專利4,016,100、4,452,747、4921,706、4,927,637、4,944,948、5,008,050和5,009,056，所有這些出版物均在此引入作為參考文獻。
本發(fā)明進一步提供給哺乳動物接種疫苗以對抗新孢子蟲病的方法，其包括給哺乳動物施用免疫有效量的本發(fā)明的疫苗。較好是經(jīng)胃腸道外，如皮下或肌肉內(nèi)注射途徑施用疫苗。但也可以通過腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，或口服、鼻內(nèi)、直腸、陰道、眼內(nèi)或聯(lián)合途徑，或可借助本領(lǐng)域已知的緩釋裝置施用疫苗。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定施用疫苗的最佳途徑，并可基于所選定的用藥途徑確定疫苗組合物的可接受配方。
可用常規(guī)方法確定有效劑量，即從低劑量抗原開始，然后增加劑量，同時監(jiān)測效果。在確定每只動物的最佳劑量時，可考慮多種影響因素。其中主要是動物的種類、大小、年齡和一般狀態(tài)，動物體內(nèi)其他藥物的存在，動物即將接種的新孢子蟲的特定種或株系的毒力等。較好是在考慮了其他動物研究結(jié)果之后再選擇實際劑量。
本發(fā)明疫苗中本發(fā)明的新孢子蟲蛋白或多肽的劑量范圍優(yōu)選約為10μg至10mg，更優(yōu)選為大約50μg至大約1mg，最優(yōu)選為大約100μg至大約0.5mg。本發(fā)明疫苗中本發(fā)明的新孢子蟲多肽苷酸分子的劑量范圍優(yōu)選為大約50μg至大約1mg。本發(fā)明疫苗中本發(fā)明的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞的劑量范圍優(yōu)選為大約1×103至大約1×108個細胞/ml，更優(yōu)選為大約1×105至大約1×107個細胞/ml。適當(dāng)?shù)膭┝矿w積范圍為大約0.5ml至大約10ml，較好為大約1ml至大約5ml。這些抗原的劑量也適用于本發(fā)明的聯(lián)合疫苗。如聯(lián)合疫苗的第二種成分是本發(fā)明的新孢子蟲蛋白、多肽、多核苷酸或經(jīng)修飾的細胞以外的抗原時，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的該第二種成份在現(xiàn)有疫苗中的應(yīng)用情況來確定其在聯(lián)合疫苗中的使用劑量。
本發(fā)明的疫苗可用于保護哺乳動物以抗新孢子蟲病。術(shù)語“哺乳動物”用于本文中是指可使用本發(fā)明的疫苗進行保護以抗新孢子蟲病的任何種的哺乳動物，包括狗、牛、山羊、綿羊和馬等?？筛鶕?jù)多種因素，包括其他動物中新孢子蟲病暴發(fā)的時間規(guī)律等，在特定動物生活期的任何時間施用本發(fā)明的疫苗。例如可作為生育前疫苗，給離乳齡或更年青動物，或較成熟動物施用疫苗，以預(yù)防新孢子蟲相關(guān)的先天性疾病或流產(chǎn)。有效保護作用可能只需要初次疫苗接種，或可能需要一次或多次強化接種。檢測是否已達到了足夠的免疫保護的一種方法是確定疫苗接種后動物體內(nèi)的抗血清形成和抗體滴度。優(yōu)選基于對所有相關(guān)因素(某些因素在前面已有描述)的分析，由獸醫(yī)來決定疫苗接種的時間和強化接種的次數(shù)(如果有的話)。
本發(fā)明進一步提供用于給哺乳動物接種以抗新孢子蟲病的藥盒，所說的藥盒包含含有免疫有效量的本發(fā)明的多肽、多核苷酸分子或經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞或者其某種組合的一個容器。藥盒還可選擇性地包含含有獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或稀釋劑的第二個容器。在一優(yōu)選實施方案中，所述多肽選自犬新孢子蟲的GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1蛋白；所述多核苷酸分子較好具有編碼犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1蛋白之一的核苷酸序列；所述經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞較好是表達GRA1-、GRA2-、SAG1-、MIC1-和MAG1-表型的活細胞。
下列實施例只是舉例描述，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例犬新孢子蟲cDNA和基因序列的分離1．鑒定含有GRA1、GRA2、SAG1和MIC1 cDNA的λ克隆犬新孢子蟲速殖體的cDNA文庫由T.Baszler博士(WashingtonState University,Puuman,WA)惠贈。簡單地說，使用從新孢子蟲NC-1速殖體中純化的RNA構(gòu)建該文庫。將EcoRⅠ和XhoⅠ接頭加到cDNA末端后，將cDNA克隆到噬菌體λZAPExpress(Stratagene,La Jolla,CA)中。當(dāng)將文庫的等分樣品與大腸桿菌XL-1 Blue MRA(P2)(Stratagene)混合并鋪板到含有IPTG的NZY瓊脂板上時，根據(jù)白色噬斑的形成估計該文庫含有約99％重組體。
基本上按照Krishnan等人(1991，核酸研究，19:6177-6182；Krishnan等，1993，酶學(xué)方法，218:258-279)所述的方法，對按上述方法鑒定的各個假定的λZAPExpress克隆的重組體插入片段DNA序列進行PCR分析。使用無菌吸管回收含有良好分離的λ噬菌體噬斑的瓊脂小塊，并在100μl無菌水中浸泡至少1小時。使用大約10μl已分散的λ噬菌體顆粒，在含有(1)對λ噬菌體載體(即λZAPEXpress)特異的并對相鄰于克隆位點(即EcoRⅠ和XhoⅠ)的序列有特異性，而且按5′至3′方向朝向插入片段DNA序列的λDASH-T3和λDASH-T7寡核苷酸引物各100mg；(2)200μM dNTPs；(3)PCR緩沖液(LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg,MD)；和(4)約1單位Taq DNA聚合酶(Life Technologies,Inc.)的總100μl反應(yīng)體積中進行PCR反應(yīng)。λDASH-T3的序列是5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG(SEQ IDNO:14)。λDASH-T7的序列是5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC(SEQ ID NO:15)。熱循環(huán)條件是94℃,5分鐘，1次循環(huán)；94℃,1分鐘，55℃,1分鐘，72℃,1分鐘，30次循環(huán)；72℃,7分鐘，1次循環(huán)。用標準的瓊脂糖凝膠電泳，用溴乙錠染色并在UV光射下進行肉眼觀察，檢查反應(yīng)混合物的等分樣品(一般10μl)。使用PCR純化系統(tǒng)(Qiagen)，經(jīng)離子交換柱層析純化PCR混合物，利用熒光標記的λDASH-T3和λDASH-T4引物和Sanger雙脫氧鏈終止DNA測序技術(shù)直接測序。在National Center for Biotechnology Information,Bethesda,Maryland,20894,USA，通過與DNA序列數(shù)據(jù)庫的比較分析諸序列與其他已知序列的同源性。鑒定出4個分別與T.gondii GRA1、GRA2、SAG1和MIC1基因同源的序列。
2．犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1和MIC1 cDNA的完整ORF的鑒定按照生產(chǎn)商(Stratagene)的使用說明書，對經(jīng)鑒定的含有分別同源于T.gondii GRA1、GRA2、SAG1和MIC1基因之犬新孢子蟲序列的上述噬菌體λZAPExpress顆粒進行體內(nèi)切割，以回收質(zhì)粒pBluescript中的插入片段序列。簡單地說，使噬菌體顆粒感染已用ExAssist輔助噬菌體(Stratagene)共感染的大腸桿菌XL-1 BlueMRF′。經(jīng)此處理后，收集上清并與大腸桿菌XLOLR細胞(Stratagene)混合。然后將細胞懸液的等分樣品鋪板到含有卡那霉素(～50μg/ml)的培養(yǎng)基上，并檢查卡那霉素抗性菌落以分析質(zhì)粒形式。純化質(zhì)粒DNA并使用Sanger雙脫氧鏈終止DNA測序技術(shù)測定重組部分的序列。用DNASTAR(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)分析所得到的DNA序列以鑒定ORF和其他特征。還使用BLAST算法(National Center forBiotechnology Information)分析序列以與公共數(shù)據(jù)庫中的DNA序列進行同源性比較。
將鑒定后證明含有完整犬新孢子蟲GRA1 ORF的重組質(zhì)?？寺《麨閜RC77(ATCC 209685)。pRC77中cDNA插入片段序列的總長度為1,265bp，其中GRA1 ORF從nt205延伸到nt777(SEQ ID NO:1)。SEQID NO:2給出的是推斷的犬新孢子蟲GRA1蛋白的氨基酸序列。犬新孢子蟲GRA1 ORF的核苷酸序列與T.gondii GRA1 ORF的核苷酸序列有大約55％相似性。推斷出的犬新孢子蟲GRA1蛋白的氨基酸序列與推斷出的T.gondii GRA1蛋白的氨基酸序列有大約51％的相似性。
將鑒定為含有完整犬新孢子蟲GRA2 ORF的重組質(zhì)?？寺》Q為pRC5(ATCC 209686)。pRC5中cDNA插入片段序列的總長度為1,031bp，其中GRA2 ORF從nt25延伸到nt660(SEQ ID NO:4)。SEQ IDNO:5給出的是推斷的犬新孢子蟲GRA2蛋白的氨基酸序列。犬新孢子蟲GRA2 ORF的核苷酸序列與T.gondii GRA2 ORF的核苷酸序列有大約37％的相似性。推斷的犬新孢子蟲GRA2蛋白的氨基酸序列與推斷的T.gondii GRA2蛋白的氨基酸序列有大約26％的相似性。
將鑒定為含有完整犬新孢子蟲SAG1 ORF的重組質(zhì)?？寺》Q為pRC102(ATCC 209687)。pRC102中cDNA插入片段序列的總長度為1,263bp，其中SAG1 ORF從nt130延伸到nt1089(SEQ ID NO:6)。SEQID NO:7給出的是推斷的犬新孢子蟲SAG1蛋白的氨基酸序列。犬新孢子蟲SAG1 ORF的核苷酸序列與T.gondii SAG1 ORF的核苷酸序列有大約58％的相似性。推斷的犬新孢子蟲SAG1蛋白的氨基酸序列與推斷的T.gondii SAG1蛋白的氨基酸序列有大約49％的相似性。
將鑒定為含有完整犬新孢子蟲MIC1 ORF的重組質(zhì)?？寺》Q為pRC340(ATCC 209688)。pRC340中cDNA插入片段序列的總長度為2,069bp，其中MIC1 ORF從nt138延伸到nt1,520(SEQ ID NO:8)。SEQID NO:9給出的是推斷的犬新孢子蟲MIC1蛋白的氨基酸序列。犬新孢子蟲MIC1 ORF的核苷酸序列與T.gondii MIC1 ORF的核苷酸序列有大約58％的相似性。推斷的犬新孢子蟲MIC1蛋白的氨基酸序列與推斷的T.gondii MIC1蛋白的氨基酸序列有大約47％的相似性。
3．GRA1基因序列的鑒定按照常規(guī)方法，在噬菌體λⅡ載體(Stratagene)中構(gòu)建犬新孢子蟲株系NC-1的基因組DNA文庫。按下述方法PCR擴增從pRC77(ATCC209685)衍生的cDNA序列，并將所得到的經(jīng)PCR擴增的DNA片段用作探針以篩選犬新孢子蟲株系NC-1的基因組DNA文庫。使用對犬新孢子蟲GRA1 cDNA特異的引物bd219和bd220擴增相當(dāng)于犬新孢子蟲GRA1 cDNA(pRC77)的ORF的一個563bp片段。bd219的序列為5′-GCCGCGACTTCTTTTTCTCT(SEQ ID NO:16),bd220的序列是5′-CTCGATCGCCTCCTTTACTG(SEQ ID NO:17)。使用Seaplaque低熔點瓊脂糖(LMA)(FMC Bioproducts)電泳純化該563bp片段。從凝膠上切出電泳條帶，然后用于隨機引發(fā)的標記反應(yīng)，以產(chǎn)生可用于篩選新孢子蟲基因組文庫的探針。
將犬新孢子蟲基因組文庫(λDASH Stratagene#845201)的2.5×105pfu經(jīng)噬斑浸提到Hybond N+尼龍膜(Amersham)上。使用563bp GRA1cDNA片段作為探針，篩選復(fù)制濾膜。9個復(fù)制pfu被記錄為陽性，隨后將它們浸入1ml SM緩沖液中。對其中4個克隆(#5-8)進行第二輪篩選。第二輪篩選時，將每個克隆500-1000pfu經(jīng)噬斑浸提到復(fù)制膜上。第二輪篩選證明所有4個Gra1克隆均為陽性，作為單個噬斑分離之。
由此方法鑒定出一個稱為Gra1#8的λ克隆，并以其作為模板，使用引物bd256和bd254進行PCR擴增。引物bd256的序列是5′-TGCTAGTACTGGCGAGTGAA(SEQ ID NO:18)。引物bd254是5′-CAGGTTTGCCACACATTTTT(SEQ ID NO:19)。將所得到的PCR片段亞克隆到pGEM-T EASY載體(Promega,Madison,WI)中。利用熒光標記法和Sanger雙脫氧鏈終止測序技術(shù)測定克隆片段的序列。序列分析表明，克隆片段含有GRA1基因。GRA1基因序列(SEQ ID NO:3)含有從nt605至nt855和從nt983至nt1304的一個ORF，其與pRC77(ATCC209685)從nt205至nt777的GRA1 cDNA序列(SEQ ID NO:1)共有全部同一性。然而，GRA1基因序列(SEQ ID NO:3)在3′未翻譯區(qū)的單一核苷酸位置上不同于cDNA序列(SEQ ID NO:1)，在GRA1基因的nt1728處為T殘基，而在pRC77的nt1201處為G殘基。這種差異可能是由于RFLP現(xiàn)象或pRC77中的測序錯誤，因為在來自GRA1#8λ基因組克隆中的2個獨立亞克隆中也證實了這種核苷酸差異。GRA1基因序列(SEQ IDNO:3)還包含一個從nt856延伸到nt982的內(nèi)含子。此外，已在mRNA起始位點的5’側(cè)150bp內(nèi)鑒定了三個啟動子基序，它們與在T.gondii GRA基因中發(fā)現(xiàn)的(Mereier等，1996，分子微生物學(xué)，21:421-428)相似。
4．SAG1基因序列的鑒定基于得自pRC102之DNA序列的SAG1 ORF合成特異于SAG1基因的寡核苷酸引物。稱為NCSAG15′的第一個引物的序列是5′-ATGTTTCCTCCTCGGGCAGTG(SEQ ID NO:20)；稱為NCSAG13′的第二個引物的序列是5′-TCACGCGACGCCAGCCGCTATCG(SEQID NO:21)。后來認定，上面給出的引物NCSAG15′被粗心設(shè)計成包含另外3個附加的核苷酸(CCT)，因此當(dāng)確定真正的SAG1基因序列時考慮到了這3個附加核苷酸的存在。
使用引物NCSAG15′(SEQ ID NO:20)和NCSAG13′(SEQ ID NO:21)對作為模板的犬新孢子蟲株系NC-1基因組DNA進行PCR擴增。得到約1Kb的擴增片段，按照生產(chǎn)商推薦的方法，將其克隆到質(zhì)粒pCR2.1和pBlunt(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。利用熒光標記法并使用標準的“通用”、“反向”引物及下列寡核苷酸，以Sanger雙脫氧鏈終止測序技術(shù)分析已鑒定為含有基因組SAG1 PCR片段的重組質(zhì)粒的序列NCSAG1200:5′-GCCCTGACAATTCGACCGCC(SEQ ID NO:22),NCSAG1500:5′-CCCACAACATCCAAGTCGTTC(SEQ ID NO:23)；NCSAG1660:5′-GTTTTGCACCATCCTTAGTG(SEQ ID NO:24)，和NCSAG1320:5′-GAGAGTTTGCTTTGCACCG(SEQ ID NO:25)。使用DNAStar軟件包分析所得到的DNA序列，并發(fā)現(xiàn)其完全相同于由pRC102推導(dǎo)出的SAG1 ORF的序列。因此，SAG1基因的基因組序列相同于由cDNA測序得出的序列。
5．MIC1基因序列的鑒定使用對MIC1 cDNA片段(參見pRC340的序列)之5′和3′末端特異的寡核苷酸，從犬新孢子蟲基因組DNA以PCR技術(shù)擴增約2.2Kb DNA片段。熱循環(huán)條件是94℃,1分鐘，1次循環(huán)；94℃,45秒，54℃,45秒，72℃,2分鐘，29次循環(huán)；72℃,5分鐘，1次循環(huán)。將此2.2kb片段克隆到pCR2.1和pZEROBLUNT(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。用標準的限制性酶切分析法鑒定重組質(zhì)粒，并使用使用熒光標記法和Sanger雙脫氧鏈終止技術(shù)測定有代表性的克隆的核苷酸序列。與pRC340的MIC1 cDNA序列比較，以確定外顯子和內(nèi)含子的位置。
MIC1基因區(qū)的總長度為2278bp(SEQ ID NO:10)，包含從nt1至nt73、nt345至nt811、nt1187至nt1265，和nt1515至nt2278的ORF，還有3個間插的內(nèi)含子。
6．MAG1基因序列的鑒定使用基因組克隆Gra1#8作為模板，按照生產(chǎn)商推薦的方法，制備BspD1、EcoR1和HindⅢ Vectorette文庫(Genosys)。使用對5′GRA1cDNA特異的反義引物bd234，和Vectorette引物Ⅱ(ER-70)，借助Klentaq(AB Peptide Inc)和PFU(Stratagene)聚合酶從HindⅢVectorette文庫中擴增出一個約2Kb的片段。引物bd234的序列是5′-CCAGCCGAGTTCGTGTTCAGA(SEQ ID NO:26)，引物ER-70的序列是CAACGTGGATCCGATTCAAGCTTC(SEQ ID NO:27)。在1％LMA凝膠上電泳分離產(chǎn)物，切出相應(yīng)的條帶，并直接用來與pGEM-T EASY載體進行克隆反應(yīng)。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中產(chǎn)生一些白色菌落。對20個不同的白色克隆的DNA所進行的NotⅠ限制性分析表明，20個克隆中有18個含有適當(dāng)大小的插入片段。選擇亞克隆2，使之生長為貯備液，并將該質(zhì)粒重新命名為bd245。使用嵌套引物bd218和Vectorette測序引物從兩末端測定得自Vectorette 2Kb Gra1啟動子片段的PCR產(chǎn)物的序列。引物bd218的序列是5′-AAAGCTCTTCGGCAGTTCAA(SEQ ID NO:28)。使用Sanger熒光雙脫氧鏈終止測序技術(shù)，以標準的引物步行法得到質(zhì)粒bd245的完整序列。
在一個PCR反應(yīng)中，聯(lián)合使用引物bd252和引物T7的一個變體，并以Gra1#8 DNA作為模板，以測定克隆Gra1#8之一個末端的位置。引物bd252的序列是5′-CCGCGCTACCACTTTCCA(SEQ ID NO:29)。T7引物變體的序列是5′-GTAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO:30)。使用引物bd252和T7變體擴增得到一個約2.5Kb的片段，將該產(chǎn)物亞克隆到pGEM-T EASY載體中，并將該質(zhì)粒定名為bd282。使用熒光標記法和Sanger雙脫氧鏈終止測序技術(shù)，經(jīng)引物步行法測出質(zhì)粒bd282的完整序列。
使用質(zhì)粒bd245和bd282的序列產(chǎn)生SEQ ID NO:11所示的、通過WU-BLAST2(Washington University BLAST第2版)鑒定為編碼MAG1基因的連續(xù)序列。結(jié)果表明，該序列與T.gondii MAG1基因(登記號No.U09029)具有同源性。通過內(nèi)含子剪接位點共有序列及與T.gondiiMAG1的序列對比，鑒定出推斷的外顯子/內(nèi)含子邊緣，此提示一個有從nt704至nt820(外顯子1)、從nt1301至nt1399(外顯子2)、從nt1510至nt1808(外顯子3)和從nt1921至nt3297(外顯子4)的外顯子，并帶有間插內(nèi)含子的mRNA轉(zhuǎn)錄物?；谶@些推定的外顯子/內(nèi)含子邊緣，SEQ IDNO:12給出了推測的cDNA序列，SEQ ID NO:13給出了由之推出的氨基酸序列。T.gondii和犬新孢子蟲之間的內(nèi)含子和外顯子邊界的比較結(jié)果表明，兩種生物體間MAG1基因的外顯子1-3和內(nèi)含子1-2在位置上是相對保守的。內(nèi)含子3和外顯子4剪接位點是犬新孢子蟲MAG1所獨有的。SEQ ID NO:11還包含GRA1基因序列的一部分(從nt1至nt126)，以及從nt127至nt703的完整的間插性的推定雙向GRA1/MAG1啟動子區(qū)。
用NotⅠ消化來自λGra1#8克隆的DNA以釋放出插入片段DNA，然后用苯酚/氯仿抽提沉淀并重新懸浮于水中。將由此得到的DNA連接到已純化的經(jīng)NotⅠ消化的BS KS+載體DNA(Stratagene)上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α細胞中。使用對GRA1和MAG1基因特異的引物，經(jīng)PCR反應(yīng)篩選克隆，并用Not1限制性消化以進一步證實～16Kb的λGRA1#8 Not1插入片段的存在。用于PCR的引物是GRA1引物219(SEQID NO:16)和220(SEQ ID NO:17)，以及MAG1引物261和270。引物261的序列是5′-CATCAGAGAAACTGGAGT(SEQ ID NO:31)；引物270的序列是5′-CATCAGAGAAACTGGAGT(SEQ ID NO:32)。鑒定出一個含有連接了GRA1#8中之NotⅠ插入片段的BS KS+載體的陽性質(zhì)粒克隆，并定名為bd304(ATCC 203413)。
7．新孢子蟲MAG1和GRA1啟動子的鑒定7.1．有關(guān)T.gondii GRA1啟動子元件的背景由對T.gondii GRA1啟動子的功能性突變分析，和與另一個充分明確的T.gondii啟動子(SAG1)的序列比較，鑒定出了一個七核苷酸基序(TGAGACG)，其以方向非依賴性方式提供基礎(chǔ)GRA1啟動子活性(Mercier等，1996，分子微生物學(xué)，21:421-428)。GRA1啟動子中的另外兩個七核苷酸基序則提供額外的轉(zhuǎn)錄活性。T.gondii GRA1啟動子包含在相對于GRA1轉(zhuǎn)錄起始位點的上游從-129至-47的近端區(qū)域內(nèi)。該T.gondii GRA1區(qū)域中重要的啟動子元件包括1個CAAT框、1個正向七核苷酸基序和兩個反向七核苷酸基序。在T.gondii GRA1啟動子上游(-349到-204)還鑒定出其它三個七核苷酸基序，但它們并沒有明顯地增加-129至-47的啟動子元件的功能。
7.2．新孢子蟲MAG1-GRA1啟動子元件對犬新孢子蟲株系NC-1之完整MAG1-GRA1區(qū)域的基因組序列分析表明，兩個基因是以頭對頭構(gòu)象排列的。MAG1和GRA1基因推定的翻譯起始位點間有一個577bp區(qū)域(SEQ ID NO:11,nt127至nt703)，其含有推定的MAG1/GRA1雙向啟動子。對該577bp區(qū)域的序列分析鑒定出其中有如上文就T.gondii GRA1啟動子所述的(Mercier等，1996，文獻同上)三個反向七核苷酸基序(CGTCTCA或CGTCTCT)。兩個CAAT框側(cè)接于這些七核苷酸基序旁一個CAAT框朝向GRA1基團，另一個CAAT框朝向MAG1基因。下表列出了發(fā)現(xiàn)于犬新孢子蟲MAG1/GRA1雙向啟動子區(qū)中的啟動子元件。
表
a核苷酸位置是根據(jù)由GRA1 cDNA(pRC77)的5′末端限定的推定轉(zhuǎn)錄起始位點而定的。*此CAAT框是由互補鏈讀出的，并且朝向MAG1基因(65KDa)。**如Mercier等人(1996，上述文獻)限定的反向七核苷酸啟動子基序。
7.3新孢子蟲GRA1啟動子構(gòu)建體的構(gòu)建為試驗含有所述兩個七核苷酸基序和兩個CAAT框的577bp假定的MAG1/GRA1雙向啟動子的功能，可以構(gòu)建在所限定的序列下游含有LacZ報道基因的質(zhì)粒，然后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到NC-1速殖體中。定名為GLS的、含有驅(qū)動LacZ表達的T.gondii GRA1啟動子并含有T.gondiiSAG1 3′末端的Bluescript質(zhì)粒是由David Sibley博士(WashingtonUniversity School of Medicine,St.Louis,MO,USA)提供的。用HindⅢ/NsiⅠ消化質(zhì)粒GLS以除去T.gondii GRA1啟動子片段，然后進行LMA純化以產(chǎn)生缺少啟動子的LacZ報道載體。以λ克隆Gra1#8作為模板，使用引物HindⅢ-bd256(5′-GGCCAAGCTTGCTAGTACTGGCGA；SEQ ID NO:33)和bd260-Nsil(5′-ATCCAATGCATCTTGCTGAATGCCTTAAAAG；SEQ IDNO:34)，以及PFU和Klentaq聚合酶進行擴增反應(yīng)，以產(chǎn)生含有新孢子蟲GRA1基因之5′非翻譯區(qū)的～600bp啟動子片段。用HindⅢ/NsiⅠ消化該片段，在LMA上純化，然后與上述缺少啟動子的LacZ報道載體進行連接反應(yīng)，以產(chǎn)生質(zhì)粒克隆bd266。用引物HindⅢ-bd256和bd260-NsiⅠ就質(zhì)粒克隆bd266進行PCR反應(yīng)，以證實犬新孢子蟲GRA1啟動子的插入。
在Howe等人(1997,Methods:A Conpanion to Methods inEnzymology,13:1-11)所述的細胞混合緩沖液中，以1.4kV、10uF，用5μg或50μg未切開的質(zhì)粒bd266或質(zhì)粒GL5經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染犬新孢子蟲NC-1速殖體(1×107)。在T25瓶中使電穿孔的NC-1細胞感染MARC-145猴腎細胞(80％長滿度)，3天后收獲細胞以進行β半乳糖苷酶檢測。為了收獲細胞，首先除去3ml培養(yǎng)基并留下1ml培養(yǎng)基以從培養(yǎng)瓶中刮取細胞。將收獲的細胞轉(zhuǎn)移到微型離心機中離心。棄去上清，并將沉淀的細胞重新懸浮于100μl裂解緩沖液(Howe等，1997，上述文獻)中。將離心管置-20℃保存以備進行β半乳糖苷酶檢測。
為了進行半乳糖苷酶檢測，將試管內(nèi)容物解凍，混合，于50℃保溫1小時，然后在微量離心機中離心。每份樣品使用50μl上清液。按Howe等人(1997，上述文獻)所述方法完成β半乳糖苷酶檢測試驗。使用已被David Sibley博士提供的質(zhì)粒GLS穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的犬新孢子蟲株系制備標準曲線。收獲速殖體，計數(shù)，以104個寄生蟲/ml的密度重新懸浮于裂解緩沖液中，然后按上述方法處理(即于50℃保溫1小時)。以每孔大約20,000至大約10個寄生蟲的范圍制備該制劑的12個連續(xù)稀釋液，并用于制作β半乳糖苷酶檢測中的標準曲線。
7.4．結(jié)果與含有用質(zhì)粒GLS轉(zhuǎn)染之犬新孢子蟲株系NC-1的細胞裂解產(chǎn)物的樣品相比，含有用質(zhì)粒bd266轉(zhuǎn)染之犬新孢子蟲株系NC-1的細胞裂解物的樣品給出了最高β半乳糖苷酶讀數(shù)。使用由bd266(50μg質(zhì)粒)的標準曲線求得的值，得出β半乳糖苷酶讀數(shù)相當(dāng)于上述用質(zhì)粒GLS穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化之犬新孢子蟲細胞系中的7013個寄生蟲。這些實驗提供了首要證據(jù)證明犬新孢子蟲GRA1啟動子是有功能的，并且該啟動子元件處于由引物HindⅢ-bd256和bd260-NsiⅠ限定的約600bp基因組片段之內(nèi)。
實施例重組犬新孢子蟲MIC1蛋白的表達和免疫反應(yīng)性PCR擴增代表MIC1 ORF的DNA序列并克隆到pQE50(Qiagen)中，后者為有利于誘導(dǎo)性高水平表達克隆序列的重組系統(tǒng)。將重組質(zhì)粒定名為pQEmic1。經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮蘭蛋白質(zhì)染色檢查未被誘導(dǎo)的和被誘導(dǎo)的含有pQEmic1之大腸桿菌細胞的全細胞裂解物。在被誘導(dǎo)的攜帶pQEmic1的大腸桿菌細胞中鑒定出一種分子量約57KDa的多肽，未被誘導(dǎo)的細胞中則沒有。根據(jù)推斷的MIC1的氨基酸序列(SEQ IDNO:9)估計MIC1多肽的分子量約為49KDa。
對被誘導(dǎo)的和未被誘導(dǎo)的攜帶pQEmic1的大腸桿菌的全細胞裂解物進行SDS-PAGE，并用標準方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVF膜(Novex)上。然后使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的1％聚乙烯醇(PVA)封閉膜。隨后，在含有0.05％Tween-20的PBS(PBST)中將膜淋洗三次。然后在含有從犬新孢子蟲自然感染的牛群得到的合并的多克隆抗血清(由澳大利亞悉尼技術(shù)大學(xué)John Ellis博士惠贈)溶液中，或含有用T.gondii實驗性感染兔得到的多克隆抗血清(由國家野生生物健康中心(Madison,WI)的R.A.Cole博士惠贈)溶液中將膜保溫約1小時。然后用PBST洗膜三次，并與羊抗牛或抗兔IgG/堿性磷酸酶結(jié)合物(Kirkegaard and Perry Labs,Gaithersburg,MD)(必要時按生產(chǎn)商推薦的方法稀釋500倍)反應(yīng)。再次在PBST中洗膜，在BCIP/NBT試劑(Kirkegaard and Perry Labs)中簡短地保溫，然后用dH2O淋洗以檢測條帶。發(fā)現(xiàn)重組表達的MIC1蛋白質(zhì)與犬新孢子蟲和T.gondii多克隆抗血清有特異反應(yīng)性。
實施例疫苗配制將本發(fā)明的犬新孢子蟲蛋白(如SAG1)以100μg/ml的濃度與等體積改進的SEAM62佐劑合并，然后輕輕混合以配制抗新孢子蟲病的疫苗，并于4℃貯存，以用于初次和強化免疫。給牛初次皮下接種約2ml(總共100μg)疫苗，并于3周后進行一次強化疫苗接種?？稍趶娀庖呓臃N后兩周繁殖牛。也可以按此方式配制并施用含有本發(fā)明的GRA1、GRA2、MIC1或MAG1蛋白的疫苗。
于1998年3月19日將下列生物學(xué)材料保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,20852,USA)，并指定為下列登記號質(zhì)粒ATCC登記號pRC77 209685pRC5 209686pRC102209687pRC340209688下述另一種生物學(xué)材料質(zhì)粒bd304已于1998年11月9日保藏在ATCC(10801 University Blvd,Manassas,VA,20110,USA)，并給出登記號203413。
上文列出的所有專利、專利申請和出版物均全文引入本文作為參考文獻。
本發(fā)明的范圍不只限于所述的特定實施方案，這些方案只是作為本發(fā)明個別方面的單一舉例說明給出的。功能等同的組合物和方法均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。確實，除了本文所示的和描述的內(nèi)容外，對本發(fā)明各種改動對于閱讀了上述內(nèi)容的本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。這些改動將落入本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表<110>Pfizer Products Inc.(所有非美國申請)<120>編碼新孢子蟲蛋白質(zhì)的多核苷酸分子<130>PC9943<140>待定<141>1998-12-15<150>60/079,389<151>1998-03-26<160>34<170>patentIn Ver.2.0-beta<210>1<211>1265<212>DNA<213>犬新孢子蟲<220><221>CDS<222>(205)..(777)<400>1gtttcatcgt tgaactgccg aagagcttta tgtttttgcc gcgacttctt tttctctccc 60ctgaataaat tgtaccgtgg gtggcgtaca cgtctgaaca cgaactcggc tgggtttgct 120tttgtggacg tgtttttccg gctcaaataa tttcattttc attgttcata cgtgtttgtg 180atctctttta aggcattcag caag atg gtg cgt gtg agc gct att gtt ggg231Met Val Arg Val Ser Ala Ile Val Gly1 5gtt gca gcc tcg gtg gtt ctc tcc ctt tct tcc ggc gtg tac gcg gcc 279Val Ala Ala Ser Val Val Leu Ser Leu Ser Ser Gly Val Tyr Ala Ala10 15 20 25gag gga gcg gaa aaa ccc ttg gga ggc gaa ggt caa gcg cct acc ttg 327Glu Gly Ala Glu Lys Pro Leu Gly Gly Glu Gly Gln Ala Pro Thr Leu30 35 40ttg tca atg cta ggt ggc ggg cgc gcg gga agg ggg ttg tca gtc gga 375Leu Ser Met Leu Gly Gly Gly Arg Ala Gly Arg Gly Leu Ser Val Gly45 50 55caa tca gta gac ctt gac ctg atg ggc aga cgc 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Leu Glu Ala Lys Ala Lys Glu Leu Val385 390 395 400Asp Ala Ala Ser Lys Glu Ala Glu Asp Ala Arg Lys Ile Leu Ala Glu405 410 415Gln Pro Ala<210>14<211>20<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>14aattaaccct cactaaaggg20<210>15<211>22<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>15gtaatacgac tcactatagg gc 22<210>16<211>20<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>16gccgcgactt ctttttctct20<210>17<211>20<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>17ctcgatcgcc tcctttactg 20<210>18<211>20<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>18tgctagtact ggcgagtgaa 20<210>19<211>20<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>19caggtttgcc acacattttt 20<210>20<211>21<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>20atgtttcctc ctcgggcagt g 21<210>21<211>23<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>21tcacgcgacg ccagccgcta tcg 23<210>22<211>20<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>22gccctgacaa ttcgaccgcc 20<210>23<211>21<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>23cccacaacat ccaagtcgtt c 21<210>24<211>20<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>24gttttgcacc atccttagtg 20<210>25<211>19<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>25gagagtttgc tttgcaccg19<210>26<211>21<212>DNA<213>犬新孢子蟲<400>26ccagccgagt tcgtgttcag a 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1．包含編碼新孢子蟲GRA1蛋白之核苷酸序列的分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列選自下列成員SEQ ID NO:1中從大約nt205至大約nt777的開放閱讀框(ORF)的核苷酸序列，SEQ ID NO:3中從大約nt605至大約nt1304的ORF的核苷酸序列，和質(zhì)粒pRC77(ATCC209685)的編碼GRA1的ORF的核苷酸序列。
2．權(quán)利要求1的一種分離的多核苷酸分子，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
3．包含與權(quán)利要求1的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。
4．包含編碼一種多肽的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子，所說的多肽同源于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。
5．由一種核苷酸序列組成的一種分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列是權(quán)利要求1,3或4的多核苷酸分子的核苷酸序列的基本部分。
6．包含選自下列一組中的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子SEQ ID NO:1中從大約nt1至大約nt204、SEQ ID NO:1中從大約nt778至大約nt1265,SEQ ID NO:3中從大約nt1至大約nt604,SEQ ID NO:3中從大約nt1305至大約nt1774，及其基本部分。
7．包含編碼新孢子蟲GRA2蛋白的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列選自下列成員SEQ ID NO:4中從大約nt25至大約nt660的ORF的核苷酸序列，和質(zhì)粒pRC5(ATCC209686)的編碼GRA2的ORF的核苷酸序列。
8．權(quán)利要求7的一種分離的多核苷酸分子，其包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
9．包含與權(quán)利要求7的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。
10．包含編碼一種多肽的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子，所說的多肽同源于包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。
11．由一種核苷酸序列組成的一種分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列是權(quán)利要求7、9或10的多核苷酸分子的核苷酸序列的基本部分。
12．包含選自下列一組中的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子SEQ ID NO:4從大約nt1至大約nt24,SEQ ID NO:4從大約nt661至大約nt1031，和其基本部分。
13．包含編碼新孢子蟲SAG1蛋白的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列選自下列成員SEQ ID NO:6中從大約nt130至大約nt1089的ORF的核苷酸序列，和質(zhì)粒pRC102(ATCC209687)的編碼SAG-1的ORF的核苷酸序列。
14．權(quán)利要求13的一種分離的多核苷酸分子，其包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
15．包含與權(quán)利要求13的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。
16．包含編碼一種多肽的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子，所說的多肽同源于包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽。
17．由一種核苷酸序列組成的一種分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列是權(quán)利要求13、15或16的多核苷酸分子的核苷酸序列的基本部分。
18．包含選自下列一組中的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子SEQ ID NO:6從大約nt1至大約nt129,SEQ ID NO:6從大約nt1090至大約nt1263，和其基本部分。
19．包含編碼新孢子蟲MIC1蛋白的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列選自下列成員SEQ ID NO:8中從大約nt138至大約nt1520的ORF的核苷酸序列，SEQ ID NO:10的ORF的核苷酸序列，和質(zhì)粒pRC340(ATCC209688)的編碼MIC1的ORF的核苷酸序列。
20．權(quán)利要求19的一種分離的多核苷酸分子，其包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
21．包含與權(quán)利要求19的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。
22．包含編碼一種多肽的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子，所說的多肽同源于包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽。
23．由一種核苷酸序列組成的一種分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列是權(quán)利要求19、21或22的多核苷酸分子的核苷酸序列的基本部分。
24．包含選自下列一組中的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子SEQ ID NO:8從大約nt1至大約nt137,SEQ ID NO:8從大約nt1521至大約nt2069，和其基本部分。
25．包含編碼新孢子蟲MAG1蛋白的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列選自下列成員SEQ ID NO:11中從大約nt1305至大約nt2786的ORF的核苷酸序列，SEQ ID NO:12中從大約nt122至大約nt1381的ORF的核苷酸序列，和質(zhì)粒bd304(ATCC203413)的編碼MAG1的ORF的核苷酸序列。
26．權(quán)利要求25的一種分離的多核苷酸分子，其包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核苷酸序列。
27．包含與權(quán)利要求25的多核苷酸分子的核苷酸序列同源的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子。
28．包含編碼一種多肽的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子，所說的多肽同源于包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的多肽。
29．由一種核苷酸序列組成的一種分離的多核苷酸分子，所說的核苷酸序列是權(quán)利要求25、27或28的多核苷酸分子的核苷酸序列的基本部分。
30．包含選自下列一組中的核苷酸序列的一種分離的多核苷酸分子SEQ ID NO:11中從大約nt1至大約nt1304、SEQ ID NO:11中從大約nt2787至大約nt4242、SEQ ID NO:12中從大約nt1至大約nt121、SEQ ID NO:12中從大約nt1382至大約nt1892，和其基本部分。
31．一種分離的多核苷酸分子，其包含SEQ ID NO:11中從大約nt127至大約nt703的核苷酸序列。
32．選自含SEQ ID NO:14至26和28至34及其互補物之組的寡核苷酸分子。
33．包含下述多核苷酸分子的重組載體(a)含有編碼犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1蛋白的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)含有與(a)中所述核苷酸序列同源的核苷酸序列的多核苷酸分子；或者由作為(a)或(b)所述核苷酸序列的基本部分的核苷酸序列組成的多核苷酸分子。
34．權(quán)利要求33的重組載體，其選自于質(zhì)粒pRC77(ATCC209685)、質(zhì)粒pRC5(ATCC209686)、質(zhì)粒pRC102(ATCC209687)、質(zhì)粒pRC340(ATCC209688)和質(zhì)粒bd304(ATCC203413)。
35．權(quán)利要求33的重組載體，其還包含含有編碼載體或融合對象之核苷酸序列的多核苷酸分子，從而使重組載體的表達導(dǎo)致產(chǎn)生融合蛋白，所說的融合蛋白含有融合到由權(quán)利要求33的重組載體編碼的多肽上的載體或融合對象。
36．包含權(quán)利要求33、34或35的重組載體的被轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
37．選自下列一組中的已基本純化或分離的多肽(a)犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAGI蛋白；(b)具有與犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1蛋白同源的氨基酸序列的多肽；(c)由犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1蛋白或與之同源的多肽的基本部分組成的多肽；(d)包含(a)、(b)或(c)的蛋白質(zhì)或多肽的融合蛋白；以及(e)(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白質(zhì)或多肽的類似物或衍生物。
38．權(quán)利要求37的多肽，其中GRA1蛋白含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列；GRA2蛋白含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；SAG1蛋白含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；MIC1蛋白含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列；MAG1蛋白含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
39．與選自于GRA1、GRA2、SAG1、MIC1和MAG1的犬新孢子蟲蛋白特異性反應(yīng)的分離的抗體。
40．包含可用于新孢子蟲基因失活的多核苷酸分子的遺傳構(gòu)建體，其包含(a)具有本來與編碼犬新孢子蟲GRA1、GRA2、SAG1、MIC1或MAG1蛋白的核苷酸序列相同的核苷酸序列、或者具有所說核苷酸序列的基本部分，但該核苷酸序列還包含一個或多個失活突變的多核苷酸分子；或(b)包含天然原位側(cè)接于新孢子蟲GRA1、GRA2、MIC1、SAG1或MAG1基因的ORF的核苷酸序列的多核苷酸分子；這樣，用(a)或(b)的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化新孢子蟲細胞即導(dǎo)致GRA1、GRA2、MIC1、SAG1或MAG1基因失活。
41．權(quán)利要求40的遺傳構(gòu)建體，其還包含一個選擇標記。
42．權(quán)利要求40的遺傳構(gòu)建體，其中相應(yīng)基因是由于同源重組過程而失活。
43．經(jīng)權(quán)利要求40的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化而被修飾，使得其內(nèi)GRA1、GRA2、MIC1、SAG1或MAG1基因或其某種組合被失活的新孢子蟲細胞。
44．制備經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞的方法，其包括用權(quán)利要求40的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化新孢子蟲細胞，并選擇由于這種轉(zhuǎn)化而表達選自GRA1-、GRA2-、SAG1-、MIC1-或MAG1-的突變表型的被轉(zhuǎn)化細胞。
45．一種抗新孢子蟲病的疫苗，其包含免疫有效量的成分，所說的成分包含(a)權(quán)利要求37的多肽，(b)包含編碼權(quán)利要求37之多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子，或(c)權(quán)利要求43的經(jīng)修飾的新孢子蟲細胞；以及獸醫(yī)可接受的載體。
46．權(quán)利要求45的疫苗，其中被修飾的新孢子蟲細胞是活細胞。
47．權(quán)利要求45的疫苗，其中被修飾的新孢子蟲細胞是已失活的細胞。
48．權(quán)利要求45的疫苗，其還含有佐劑或細胞因子。
49．權(quán)利要求48的疫苗，其中佐劑選自下列成員RIB1佐劑系統(tǒng)、明礬、礦物質(zhì)凝膠、水包油乳劑、油包水乳劑、嵌段共聚物、QS-21、SAF-M、AMPHIGEN佐劑、皂苷、Quil A、單磷酸類脂A、Avridine類脂胺佐劑、SEAM62和SEAM1/2。
50．權(quán)利要求45的疫苗，其還包含免疫有效量的第二種成分，所述第二種成分能夠誘導(dǎo)對抗會給哺乳動物帶來痛苦的疾病或病理狀況的保護性反應(yīng)。
51．權(quán)利要求50的疫苗，其中第二種成分能夠誘導(dǎo)或有助于誘導(dǎo)抗選自下列一組病原體的保護性反應(yīng)牛皰疹病毒、牛呼吸道合胞病毒、牛病毒性腹瀉病毒、副流感病毒Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型、鉤端螺旋體、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、支原體、克雷伯氏菌、沙門氏菌、冠形病毒、輪狀病毒、狂犬病毒、溶血巴氏桿菌、出血敗血性巴氏桿菌、梭狀芽胞桿菌、破傷風(fēng)類毒素、大腸桿菌、隱孢菌、艾美球蟲和毛滴蟲。
52．制備抗新孢子蟲病的疫苗的方法，其包括將免疫有效量的(a)權(quán)利要求37的多肽，(b)具有編碼權(quán)利要求37的多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子，或(c)權(quán)利要求43的被修飾的新孢子蟲細胞與獸醫(yī)可接受的載體合并。
53．疫苗接種哺乳動物以對抗新孢子蟲病的方法，其包括給哺乳動物施用權(quán)利要求45的疫苗。
54．用于給哺乳動物接種疫苗以抗新孢子蟲病的藥盒，其包含一個容器，其中含有免疫有效量的(1)權(quán)利要求37的多肽，或(b)包含編碼權(quán)利要求37的多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子，或(c)權(quán)利要求43的被修飾的新孢子蟲細胞。
55．權(quán)利要求54的藥盒，其還包含含有獸醫(yī)可接受的載體或稀釋劑的第二個容器。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含編碼犬新孢子蟲GRA1、GRA2、MIC1、SAG1和MAG1蛋白之核苷酸序列的多核苷酸分子,以及重組載體、被轉(zhuǎn)化的宿主細胞和重組表達的蛋白質(zhì)。本發(fā)明進一步提供了包含犬新孢子蟲的雙向GRA1/MAG1啟動子之核苷酸序列的多核苷酸分子。本發(fā)明進一步提供基于本發(fā)明之多核苷酸分子的遺傳構(gòu)建體,該構(gòu)建體可用來制備被修飾的新孢子蟲細胞株系以用于抗新孢子蟲病的疫苗中。
文檔編號A61P25/00GK1232087SQ9910438
公開日1999年10月20日 申請日期1999年3月26日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月26日
發(fā)明者D·A·布雷克, R·A·瑪杜拉, B·A·杜爾特施, B·R·克里施南, S·C·約德 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司