專利名稱：一種新的人蛋白質(zhì)及其編碼序列,以及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人OSP的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白是大鼠PRAP和小鼠m17HSD7的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
生物體的各個(gè)組織器官的發(fā)育在時(shí)空上受到機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控。在不同組織中，在生物體不同的發(fā)育階段中，往往有一特異性的蛋白表達(dá)。這些蛋白或是對組織的發(fā)育有調(diào)控作用，或是由組織發(fā)育到一定階段后才被誘導(dǎo)表達(dá)行使一定的功能。
早在1990年，Mclean等(Mclean et al．Endocrinology 1990，126(4)1796-1805)就報(bào)導(dǎo)在懷孕大鼠中特異表達(dá)黃體(corpus luteum)中的一個(gè)約32KDa的蛋白。他們進(jìn)一步的研究表明，該蛋白僅在大黃體細(xì)胞(large luteal cell)中被表達(dá)和磷酸化，并且它的表達(dá)可以受到黃體中合成的雌激素的調(diào)控。這樣，該蛋白被認(rèn)為是大黃體細(xì)胞和雌激素的功能的一個(gè)重要的標(biāo)記。二年后，他們又報(bào)導(dǎo)該蛋白在孕中期的大鼠的大黃體細(xì)胞中有大量的表達(dá)，而這一時(shí)期又恰好是黃體細(xì)胞體積顯著增加，功能顯著增強(qiáng)的時(shí)期。研究同時(shí)顯示該蛋白的表達(dá)受到多種tropichormones(包括雌激素和催乳素(PRL))的調(diào)控。這些結(jié)果表明該蛋白可能在黃體的生長和功能調(diào)控方面有著重要作用(Parmer et al．Endocrinology，1992，131(5)2213-2221)。
1996年，同一實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用功能克隆法，成功地克隆了編碼這一蛋白的cDNA(Duan et al．J．Biol．Chem．1996，341(26)15602-15607)。該cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列與已知的蛋白沒有顯著的同源性。運(yùn)用免疫沉淀法發(fā)現(xiàn)，該蛋白可與PRL受體結(jié)合。已知PRL受體具有多種構(gòu)型。如，在大鼠中就有兩種PRL受體，一種為長鏈?zhǔn)荏w，另一種為短鏈?zhǔn)荏w。兩者具有相同的胞外和穿膜區(qū)，但是其胞內(nèi)部分的長度和氨基酸序列是不同的(Boutin et al．Cell 1988，5369-77；Shirota et al．Mol．Endocrinol．1990，41136-1143；Zhang et al．Biochem．Biophys．Res．Commun1990，168415-422)。當(dāng)PRL與長鏈?zhǔn)荏w結(jié)合后，可以通過Jak2-STAT5途徑進(jìn)而誘導(dǎo)相應(yīng)的蛋白表達(dá)。但對同短鏈?zhǔn)荏w在PRL信號傳導(dǎo)中的作用則不甚明了。為了探明所發(fā)現(xiàn)的蛋白究竟與哪一種PRL受體結(jié)合，運(yùn)用重組蛋白的手段研究發(fā)現(xiàn)該蛋白與PRL短鏈?zhǔn)荏w結(jié)合，并因此而被命名為催乳素受體相關(guān)蛋白(PRLreceptor associated protein，PRAP)。以上事實(shí)提示PRAP在介導(dǎo)PRL的信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。
有趣的是不久以后，Nokelainen等(Nokelainen，et al．MolecularEndocrinology 1998，121048-1059)又報(bào)導(dǎo)在小鼠中克隆了一個(gè)新的cDNA，該cDNA編碼一37KDa的蛋白(被命名為m17HSD7，17 β-Hydroxysteroiddehydrogenases／17-ketosteroid reductases 7(17 β-羥基類固醇脫氫酶／17-酮類固醇還原酶7))，并與大鼠PRAP(rPARP)具有89％的同一性。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該37KDa蛋白具有短鏈脫氫酶／還原酶家族成員的特征。對m17HSD7及rPARP的酶活性分析發(fā)現(xiàn)兩者都可催化雌酮(E1)向雌二酮(E2)的轉(zhuǎn)變。以上證據(jù)以表明m17HSD7和rPARP是17HSD家族成員。
然而，在本發(fā)明之前，還沒有公開或分離出人OSP的序列。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼大鼠PRAP和小鼠m17HSD7的同系物，本發(fā)明的cDNA被命名為人OSP。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的人的大鼠PRAP和小鼠m17HSD7的同系物蛋白，該蛋白被命名為人OSP蛋白。本發(fā)明涉及的OSP cDNA和蛋白質(zhì)與上述大鼠PARP和小鼠m17HSD7有高度的同源性，被認(rèn)為是它們在人中的同系物，即可能是人PRL短鏈?zhǔn)荏w或是人17HSD家族成員之一(迄今已在人中發(fā)現(xiàn)了4種不同的17HSD)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人OSP多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人OSP核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人OSP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO．4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人OSP蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO．4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO．4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人OSP蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人OSP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人OSP蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人OSP蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人OSP蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人OSP蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為1193個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO．3，其中開放讀框位于30-1055位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人OSP蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人OSP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO．3中30-1055位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO．3序列的編碼框30-1055位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO．3中30-1055位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO．4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語還包括與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人OSP相同功能的蛋白的、SEQ ID NO．4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和／或取代，以及在5’和／或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人OSP蛋白多肽”指具有人OSP蛋白活性的SEQ ID NO．4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人OSP蛋白相同功能的、SEQ ID NO．4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和／或取代，以及在C末端和／或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和／或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人OSP蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人OSP DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人OSP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人OSP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人OSP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人OSP多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人OSP蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人OSP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人OSP保守性變異多肽”指與SEQ ID No．4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明還包括人OSP多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人OSP的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人OSP多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人OSP的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人OSP核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于人OSP多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人OSP DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人OSP基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人OSP基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人OSP蛋白的分子，也包括那些并不影響人OSP蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人OSP基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No．4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人OSP基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人OSP或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6511，1976；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N．Y．，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人OSP功能的抗體以及不影響人OSP功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人OSP基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人OSP基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E．Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人OSP核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，人OSP的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人卵巢λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物-A5′-TCACTGCTTGGAAGTGTGAGTGC-3′為正向引物，寡核苷酸B5′-CTACATGCGCATGCCACCACACC-3′為反向引物，進(jìn)行PCR。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序后得到SEQ ID NO．3的全長cDNA序列。
人OSP是一種在孕中期卵巢中特異表達(dá)的蛋白，它被認(rèn)為可能是一種新的PRL的短鏈?zhǔn)荏w，從而在PRL的功能發(fā)揮中起重要作用。同時(shí)OSP還具有短鏈脫氫酶／還原酶家族的特征。對OSP在大鼠和小鼠中的同系物的研究發(fā)現(xiàn)它們都有催化E1向E2轉(zhuǎn)化的酶學(xué)活性，提示OSP也具有該種酶學(xué)活性，從而在E2的合成中發(fā)揮作用。
此外，由于本發(fā)明的人OSP具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種的同族或同類蛋白相比，預(yù)計(jì)在施用于人時(shí)將具有更高的活性和／或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒有)。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人OSP與大鼠rPARP(AAC52623)及小鼠m17HSD7(CAA75742)等3種蛋白的氨基酸序列同源比較圖。其中，相同的氨基酸在序列下方用“*”標(biāo)出，相似的氨基酸用“”或“．”標(biāo)出。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人OSP的cDNA序列的克隆和測定1．引物擴(kuò)增以人卵巢λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物--A5′-TCACTGCTTGGAAGTGTGAGTGC-3′(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸B5′-CTACATGCGCATGCCACCACACC-3′(SEQ ID NO2)為反向引物，進(jìn)行PCR．A／B的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、66℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到約1200bp的目的片段。
2．PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜鯬CR擴(kuò)增產(chǎn)物A／B與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用SequiThermEXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對質(zhì)粒進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1193bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO．3，其中開放讀框位于30-1055位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出人OSP的氨基酸序列，共341個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO．4．實(shí)施例2同源比較用本發(fā)明的人OSP的cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們與大鼠PARP(AAC52623)及小鼠m17HSD7(CAA75742)具有很高的同源性，同源比較發(fā)現(xiàn)它們在蛋白水平上的同一性分別達(dá)到了79．2％和74．2％(圖1)。大鼠PARP被認(rèn)為是PRL短鏈?zhǔn)荏w的一種(Duan et al．J．Biol．Chem．1996，341(26)15602-15607)；并且，其它實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)PARP與小鼠m17HSD7都具有催化雌酮(E1)向雌二酮(E2)的轉(zhuǎn)變的酶活性，被認(rèn)為是一種新的17HSD。根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能，結(jié)構(gòu)相似功能相關(guān)的生物學(xué)原理，可以依據(jù)PARP和17HSD7的功能來推測本發(fā)明蛋白的功能。
PRL對于黃體的功能具有重要意義。它能通過誘導(dǎo)促黃體素釋放激素受體mRNA水平的提高，增強(qiáng)促黃體素釋放激素受體在受孕大鼠的黃體中的活性(Gibori & Richards Endocrinology 1978，102767-774；Segaloff et al．Mol Endocrinol1990，41856-1865)。它還能維持黃體中升高的雌激素的水平(Gibori et al．BiolReprod 1979，21419-424；Gibori et al．Endocrinology 1978，1176-1182；Basuray etal．Biol Reprod 1983，28551-556)。除此之外，PRL還能刺激黃體蛋白的合成，因此可能與導(dǎo)致大黃體細(xì)胞的過度生長有關(guān)(Albarracin et al．J．Biol．Chem．1994，269，7772-7776)。PRL還能通過抑制20α-羥基類固醇脫氫酶(20α-hydroxysteroid dehydrogenase)的表達(dá)來維持孕酮的高水平，從而減少孕激素轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚缘男问?Albarracin et al．Endocrinology 1994，1342453-2460)。
雖然已有大量關(guān)于PRL重要功能的報(bào)導(dǎo)，然而對于其作用機(jī)制的研究卻仍不清。已知PRL受體具有多種構(gòu)型，如，在大鼠中就有長鏈和短鏈兩種PRL受體，另外還有一種中間形態(tài)的受體被克隆(Ali et al．J．Biol．Chem．1991，266，20110-20117)。研究發(fā)現(xiàn)，在Nb2細(xì)胞中長鏈與中間形態(tài)受體都可以通過與蛋白激酶來傳遞信號。然而，對短鏈?zhǔn)荏w的作用卻不甚了解。然而，PRL短鏈?zhǔn)荏w在許多組織中的廣泛表達(dá)特性(Nagano et al．J．Biol．Chem．2691337-13345)暗示它在信號傳遞過程中發(fā)揮了特定的作用。另外一些證據(jù)表明短鏈?zhǔn)荏w也能傳遞信號并刺激細(xì)胞的增殖(Das et al．Mol Endocrinol 1995，91750-1759)。在大鼠中發(fā)現(xiàn)在黃體細(xì)胞中PRAP能與PRL短鏈?zhǔn)荏w結(jié)合暗示短鏈?zhǔn)荏w對于PRL的功能同樣是重要的，并且PRAP可能在其中發(fā)揮了特定的作用。
對PRAP的表達(dá)特征分析同樣支持上述推測。Duan等(Duan et al．Endocrinology 1997，138(8)3216-3221)發(fā)現(xiàn)PRAP僅在黃體組織中有表達(dá)(有5．5、4．3和1．8Kb三種轉(zhuǎn)錄本)，而在其它檢測的組織中沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)的跡象。雌二醇可以上調(diào)PRAP(尤其是4．3和1．8Kb轉(zhuǎn)錄本)的表達(dá)。另外，雖然PRAP的mRNA和蛋白在孕早期很難被檢測到，然而在孕中期它們的表達(dá)量卻急劇上升。PRAP的這種組織和發(fā)育過程中的特異表達(dá)特征，以及它受雌二醇上調(diào)表達(dá)的特點(diǎn)說明PRAP對于雌二醇和PRL在黃體中的功能的發(fā)揮可能有重要的關(guān)系。
然而，Nokelainen等(Nokelainen，et al．Molecular Endocrinology 1998，121048-1059)又報(bào)導(dǎo)在小鼠中克隆了一個(gè)與PRAP高度同源的cDNA，m17HSD7。他們在對PRAP和m17HSD7的結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白都具有短鏈脫氫酶／還原酶家族成員的特征。酶學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩者都可催化雌酮(E1)向雌二酮(E2)的轉(zhuǎn)變。以上證據(jù)以表明m17HSD7和rPARP是17HSD家族成員之一。此對本發(fā)明的蛋白序列進(jìn)行分析，同樣也發(fā)現(xiàn)了短鏈脫氫酶／還原酶家族的保守序列。該保守序列的特征為[LIVSPADNK]-x(12)-Y-[PSTAGNCV]-[STAGNQCIVM]-[STAGC]-K-{PC}-[SAGFYR]-[LIVMSTAGD]-x(2)-[LIVMFYW]-x(3)-[LIVMFYWGAPTHQ]，其中[]內(nèi)的氨基酸符號表達(dá)其中任意的一個(gè)氨基酸，x(n)表示n個(gè)任意氨基酸，{}表示該位不可能為括號內(nèi)的氨基酸。在本發(fā)明的蛋白序列中，符合該保守序列的是S180LEDFQHSKGKEPYSSSKYATDLLSVAL207，其中S180，Y193和K197是對催化活性重要的三個(gè)殘基(Puranen et al．Endocrinology 1997，1383532-3539；Ghosh et al Structure 1995，3503-513；Puranen et al Mol Endocrinol 1997，1177-86)。據(jù)Nokelainen等對m17HSD7的酶動(dòng)力學(xué)研究，雌酮是其優(yōu)先底物，因此，它可能在雌二醇的合成中是必需的。
由于本發(fā)明的OSP蛋白在一級結(jié)構(gòu)上與PRAP和m17HSD7有著高度的相似性，并且如上分析，它也具有HSD家族的結(jié)構(gòu)特征，因此它被認(rèn)為與PRAP和m17HSD7一樣，可能是人中PRL的又一新的短鏈?zhǔn)荏w，從而在PRL和黃體的功能發(fā)揮中起作用；并且／或者具有17HSD的酶活，從而在合成雌二醇或其它物質(zhì)中發(fā)揮作用。
另外，用prosite程序?qū)Ρ景l(fā)明OSP蛋白的序列分析中，發(fā)現(xiàn)其N末端(1-19位)是一信號肽序列，因而OSP是一個(gè)分泌蛋白。
本發(fā)明的人OSP除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人OSP還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人OSP的N端與大鼠rPRAP的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人OSP的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人OSP核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人OSP的表達(dá)水平或者抑制人OSP的過度表達(dá)。本發(fā)明的人OSP蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人OSP缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3人OSP在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A／B為模板，將編碼人OSP的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO．5和6)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人OSP cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5 ′-TCAGGGATCCATGCGAAAGGTGGTTTTGAT-3′(SEQ ID NO．5)，該引物含有BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人OSP編碼序列的20個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5-TTGGAAGCTTTTATAGGCATGAGCCACTG-3i(SEQ ID NO．6)，該引物含有HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人OSP的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc．，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子／操縱子(P／O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHⅠ和HindⅢ消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15／rep4的E．coli菌株，M15／rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)1acⅠ阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證人OSP的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg／ml)和Kan(25μg／ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O／N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O／N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0．4-0．6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使1acⅠ阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P／O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人OSP。用6M鹽酸胍(pH5．0)從柱中洗脫人OSP?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5．0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w／v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約38．2KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO．4的序列一致。
實(shí)施例4人OSP在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A／B為模板，將編碼人OSP的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO．7和8)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人OSP cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGAAGCTTATGCGAAAGGTGGTTTTGAT-3′(SEQ ID NO．7)
該引物含有HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人OSP編碼序列的20個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5i-TTGGGGATCCTTATAGGCATGAGCCACTG-3i(SEQ ID NO．8)該引物含有BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人OSP的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E．coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg／ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O／N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證人OSP的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0．05％Triton的50mMTris·HCl(pH7．6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8．0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8．0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7．4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為38．2KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO．4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund s佐劑乳化。用50-100μg／0．2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freundis佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg／0．2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人OSP基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人復(fù)旦大學(xué)(ⅱ)發(fā)明名稱一種新的人蛋白質(zhì)及其編碼序列，以及制法和用途(ⅲ)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO．1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．1TCACTGCTTG GAAGTGTGAG TGC 23(2)SEQ ID NO．2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2CTACATGCGC ATGCCACCAC ACC 23(2)SEQ ID NO．3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1193bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)序列描述SEQ ID NO．3TCACTGCTTG GAAGTGTGAG TGCGCGAAGA TGCGAAAGGT GGTTTTGATC ACCGGGGCTA 60GCAGTGGCAT TGGCCTGGCC CTCTGCAAGC GGCTGCTGGC GGAAGATGAT GAGCTTCATC 120TGTGTTTGGC GTGCAGGAAC ATGAGCAAGG CAGAAGCTGT CTGTGCTGCT CTGCTGGCCT 180CTCACCCCAC TGCTGAGGTC ACCATTGTCC AGGTGGATGT CAGCAACCTG CAGTCGGTCT 240TCCGGGCCTC CAAGGAACTT AAGCAAAGGT TTCAGAGATT AGACTGTATA TATCTAAATG 300CTGGGATCAT GCCTAATCCA CAACTAAATA TCAAAGCACT TTTCTTTGGC CTCTTTTCAA 360GAAAAGTGAT TCATATGTTC TCCACAGCTG AAGGCCTGCT GACCCAGGGT GATAAGATCA 420CTGCTGATGG ATTTCAGGAG GTGTTTGAGA CCAATGTCTT TGGCCATTTT ATCCTGATTC 480GGGAACTGGA GCCTCTCCTC TGTCACAGTG ACAATCCATC TCAGCTCATC TGGACATCAT 540CTCGCAGTGC AAGGAAATCT AATTTCAGCC TCGAGGACTT CCAGCACAGC AAAGGCAAGG 600AACCCTACAG CTCTTCCAAA TATGCCACTG ACCTTTTGAG TGTGGCTTTG AACAGGAACT 660TCAACCAGCA GGGTCTCTAT TCCAATGTGG CCTGTCCAGG TACAGCATTG ACCAATTTGA 720CATATGGAAT TCTGCCTCCG TTTATATGGA CGCTGTTGAT GCCGGCAATA TTGCTACTTC 780GCTTTTTTGC AAATGCATTC ACTTTGACAC CATATAATGG AACAGAAGCT CTGGTATGGC 840TTTTCCCACC AAAAGCTGAA TCTCTCAATC CTCTGATCAA ATATCTGAGT GGCACCACTG 900CTTTGGAAGA AATTTACATT ATGACCCAGA AGATGGACCT AGATGAAGAC ACTGCTGAAA 960AATTTTATCA AAAGTTACTG GAACTGGAAA AGCACATTAG GGTCACTATT CAAAAAACAG 1020ATAATCAGGC CAGGCTCAGT GGCTCATGCC TATAATTCCA GCACTTTGGG AGGCCAAGGC 1080AGAAGGATCA CTTGAGACCA GGAGTTCAAG ACCAGCCTGA GAAACATAGT GAGCCCTTGT 1140CTCTACAAAA AGAAATAAAA ATAATAGCTG GGTGTGGTGG CATGCGCATG TAG1193(2)SEQ ID NO．4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度341個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．4MRKVVLITGA SSGIGLALCK RLLAEDDELH LCLACRNMSK AEAVCAALLA SHPTAEVTIV 60QVDVSNLQSY FRASKELKQR FQRLDCIYLN AGIMPNPQLN IKALFFGLFS RKVIHMFSTA 120EGLLTQGDKI TADGFQEVFE TNVFGHFILI RELEPLLCHS DNPSQLIWTS SRSARKSNFS 180LEDFQHSKGK EPYSSSKYAT DLLSVALNRN FNQQGLYSNV ACPGTALTNL TYGILPPFIW 240TLLMPAILLL RFFANAFTLT PYNGTEALVW LFPPKAESLN PLIKYLSGTT ALEEIYIMTQ 300KMDLDEDTAE KFYQKLLELE KHIRVTIQKT DNQARLSGSC L 341(2)SEQ ID NO．5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．5TCAGGGATCC ATGCGAAAGGTGGTTTTGAT 30(2)SEQ ID NO．6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．6TTGGAAGCTT TTATAGGCAT GAGCCACTG 29(2)SEQ ID NO．7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．7TCAGAAGCTT ATGCGAAAGGTGGTTTTGAT 30(2)SEQ ID NO．8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．8TTGGGGATCC TTATAGGCATGAGCCACTG 29
權(quán)利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人OSP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列雜交。
2．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO．4所示的序列。
3．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列。
4．一種分離的人OSP蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO．4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5．如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO．4序列的多肽。
6．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7．一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8．一種產(chǎn)生具有人OSP蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人OSP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人OSP蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO．3中從核苷酸30-1055位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人OSP蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人OSP蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人OSP蛋白活性的多肽。
9．一種能與權(quán)利要求4所述的人OSP蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10．一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人OSP的cDNA序列,該cDNA編碼的蛋白是大鼠PRAP和小鼠m17HSD7的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號A61K39/395GK1290748SQ99108928
公開日2001年4月11日 申請日期1999年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月29日
發(fā)明者余龍, 傅強(qiáng), 趙勇, 張宏來, 趙壽元 申請人:復(fù)旦大學(xué)