專利名稱：用于治療疼痛的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)胞藥物，更具體地說，涉及一種用于治療疼痛的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物。
疼痛是一種常見的可由多種病因引起的給病人帶來極大痛苦的癥狀?，F(xiàn)有的鎮(zhèn)痛藥物，如嗎啡類，雖可在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生止痛效果，但反復(fù)用藥后易產(chǎn)生抗藥性及成癮性。由于腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞可分泌出某些與鎮(zhèn)痛作用有關(guān)的物質(zhì)，如甲啡肽、亮啡肽及單胺類物質(zhì)等，如果將該嗜鉻細(xì)胞植入人或動(dòng)物的脊髓蛛網(wǎng)膜下，就可以象一個(gè)天然的“微型生物泵”那樣，長(zhǎng)期恒定地分泌出鎮(zhèn)痛物質(zhì)，而且不會(huì)產(chǎn)生抗藥性及成癮性。故在本世紀(jì)八十年代初，美國(guó)和瑞士的兩個(gè)研究組嘗試用同種(人、鼠)的腎上腺髓質(zhì)組織和嗜鉻細(xì)胞(chromaffin cell)移植入脊髓蛛網(wǎng)膜下內(nèi)治療疼痛，取得了滿意的效果。但由于人類的腎上腺髓質(zhì)組織和嗜鉻細(xì)胞來源稀少，故在九十年代美國(guó)的研究組嘗試用異種的牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱BCC)植入癌癥病人的脊髓蛛網(wǎng)膜下以治療癌痛。為了克服免疫排斥反應(yīng)，他們采用長(zhǎng)度為5cm、直徑1mm的聚丙烯酰胺中空纖維管包裹BCC。由于中空纖維管壁膜孔只允許小分子的物質(zhì)通過，所以BCC的分泌物可緩慢而且均勻地?cái)U(kuò)散出纖維管，發(fā)揮止痛作用，而宿主體內(nèi)的大分子免疫球蛋白不能穿透管壁膜孔，因此使細(xì)胞能較長(zhǎng)時(shí)間(一年左右)在宿主體內(nèi)存活并不斷地分泌止痛物質(zhì)，從而對(duì)疼痛患者產(chǎn)生治療作用。但是，中空纖維管的體積較大，一方面，由于其管內(nèi)死腔大，因此影響了營(yíng)養(yǎng)物和代謝物的擴(kuò)散，使得管內(nèi)細(xì)胞不易長(zhǎng)期存活；另一方面，大體積的纖維管植入脊髓蛛網(wǎng)膜下易對(duì)脊髓神經(jīng)產(chǎn)生刺激和壓迫，從而產(chǎn)生許多對(duì)人體不利的副作用；此外，由于中空纖維管的體積大，植入脊髓蛛網(wǎng)膜下時(shí)必須采用外科手術(shù)的方法植入，給病人帶來一定的損傷。同時(shí)，用脫乙酰幾丁質(zhì)、聚丙烯酰胺及羧甲基纖維素鈉等材料(美國(guó)等使用)制作的中空纖維管的生物相容性較差，容易引起宿主體的組織反應(yīng)。另一方面，采用藻酸鈉-聚賴氨酸-藻酸鈉制作的三層結(jié)構(gòu)膜微膠囊(以下簡(jiǎn)稱APA微膠囊)，其體積小(直徑為200-1000um)、生物相容性高，利于微囊在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間完好存在和囊內(nèi)細(xì)胞較長(zhǎng)期存活。實(shí)驗(yàn)已證明，APA微膠囊的囊膜可截割大于11萬Kd(道爾頓)的分子，使免疫球蛋白和免疫活性細(xì)胞不能穿過該膜而進(jìn)入囊內(nèi)破壞其中的動(dòng)物細(xì)胞，因而具有較好的免疫保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)亦顯示出APA微膠囊具有較好的生物相容性，在小、大動(dòng)物體內(nèi)可較長(zhǎng)時(shí)間(約1年半)完好存在。在胰島、肝細(xì)胞、甲狀旁腺和基因重組人生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞移植治療疾病模型動(dòng)物的研究中，已證明具有保護(hù)異種移植物免受宿主免疫系統(tǒng)破壞的作用。但是，迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)采用APA微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞作為藥物用于治療疼痛的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是要提供一種生物相容性高、作用時(shí)間長(zhǎng)、毒副作用小、操作簡(jiǎn)便的適用于治療疼痛的APA微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物。
本發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的狀況進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用下述技術(shù)方案即可達(dá)到上述目的，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
1、用于治療疼痛的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物，其特征在于，該細(xì)胞藥物按下列步驟制成(1)將牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞與一種濃度為10-20g/L的藻酸鈉溶液混合，制成懸浮液，使每升懸浮液中含0.1-1×1010個(gè)細(xì)胞；(2)利用噴霧裝置將步驟(1)獲得的懸浮液以150-1000μm直徑的微滴狀態(tài)分散于一種濃度為80-120mmol/L的氯化鈣或乳酸鈣溶液中，兩種液體的比例為保證每升混合液含0.1-1×108個(gè)細(xì)胞，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得含牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞的藻酸鈣珠沉淀；(3)將步驟(2)獲得的沉淀物加入到一種濃度為0.3-0.7g/L的聚賴氨酸溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個(gè)細(xì)胞，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(4)將步驟(3)獲得的沉淀物加入到一種濃度為1.0-2.0g/L的藻酸鈉溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個(gè)細(xì)胞，混合均勻，放置3-15分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(5)將步驟(4)獲得的沉淀物加入到一種濃度為40-70mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個(gè)細(xì)胞，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞沉淀物；(6)將步驟(5)獲得的沉淀物加入到一種濃度為9g/L的氯化鈉溶液清洗，最后將沉淀物轉(zhuǎn)移入細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)并作為治療疼痛的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物保存。
2、如第1項(xiàng)所述的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物，其中所述的牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞優(yōu)選具有80％以上的純度。
3、如第1項(xiàng)所述的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物，在其步驟(2)中優(yōu)選是將步驟(1)獲得的懸浮液以180-500μm直徑的微滴狀態(tài)分散。
在使用時(shí)，只要將本發(fā)明APA微囊化BCC(2-9×106個(gè)細(xì)胞)注入患疼痛的病人(例如癌痛病人)的脊髓蛛網(wǎng)膜下，即可在4-24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，而且一次注射可以維持鎮(zhèn)痛作用9個(gè)月以上。
下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行較詳細(xì)的解釋。
在上述的幾項(xiàng)技術(shù)方案中，第1項(xiàng)為必要解釋特征，而第2、3項(xiàng)屬于優(yōu)選的技術(shù)特征。
在本發(fā)明中所述的牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞(BCC)是指在牛腎上腺髓質(zhì)中能被含鉻染料染色的細(xì)胞，它可分泌單胺類、腦啡肽類(包括甲啡肽.亮啡肽)及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有鎮(zhèn)痛作用。
BCC的獲得與純化方法不屬于本發(fā)明的范圍而是屬于常規(guī)技術(shù)。例如，可以使用膠原酶(Collagenase)與牛的腎上腺作用，使其中膠原組織分解，然后配合機(jī)械方法將牛腎上腺組織分離成單個(gè)細(xì)胞，接著使用170目(88μm)網(wǎng)孔的篩網(wǎng)過濾，牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞(含嗜鉻細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞)穿過濾網(wǎng)，將網(wǎng)下液離心，棄去上清液，即獲得了上述各種牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞的沉淀物，其中，嗜鉻細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的50-60％，內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞二者共約占細(xì)胞總數(shù)的40-50％，由于血細(xì)胞的形態(tài)很小，因此通常都不將其計(jì)算在總細(xì)胞內(nèi)。應(yīng)予指出，由于BCC在牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞總數(shù)中約占50-60％，因此即使不進(jìn)行純化也能應(yīng)用于本發(fā)明中。但是為了提高治療效果，優(yōu)選將其純化至BCC約占細(xì)胞總數(shù)的80％以上。作為BCC的純化方法，例如可以采用常規(guī)的貼壁純化法，其原理是根據(jù)不同種類的細(xì)胞具有不同程度的貼壁傾向來進(jìn)行分離。例如對(duì)于含有嗜鉻細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞的混合液來說，在培養(yǎng)瓶中在數(shù)小時(shí)內(nèi)，大部分成纖維細(xì)胞貼壁，而大部分嗜鉻細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞不貼壁，因此換瓶時(shí)可除去大部分成纖維細(xì)胞。又因血細(xì)胞不貼壁生長(zhǎng)，故可以通過培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間(例如24-48小時(shí))，待嗜鉻細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞貼壁后再次換瓶即可除去大部分血細(xì)胞。如此經(jīng)過兩次換瓶即可使BCC的純度達(dá)到細(xì)胞總數(shù)(血細(xì)胞除外)的80％以上。
關(guān)于細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法，可以采用常規(guī)的染色后顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)的方法。例如可以采用胎盤藍(lán)染色法(Trypanblue stain)，見于“組織培養(yǎng)溶劑和試劑”(Tissue CultureMedia and Reagents)，第1566頁。
在屬于本發(fā)明的必要技術(shù)特征的6個(gè)操作步驟中，各個(gè)步驟所用的溶液量可以根據(jù)限定的細(xì)胞數(shù)目來掌握。例如，在上述本發(fā)明技術(shù)方案1的步驟(1)所獲得的懸浮液中每升含有0.1-1×1010個(gè)細(xì)胞，而在步驟(2)的混合液中每升含有0.1-1×108個(gè)細(xì)胞，也就是步驟(1)的懸浮液中的細(xì)胞濃度相當(dāng)于步驟(2)的混合液中細(xì)胞濃度的約100倍，因此，如果從步驟(1)的懸浮液中取出1ml，則在步驟(2)中最好將其分散到100ml的氯化鈣溶液中。余此類推。
在步驟(2)中形成藻酸鈣珠的作用是為了在步驟(5)中獲得含牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞的微囊創(chuàng)造條件。在步驟(5)中，檸檬酸鈉的鈉離子將藻酸鈣珠中的鈣離子置換之后便形成了具有許多小孔隙的微囊。在這些微囊中含有許多BCC，而在BCC的周圍又包裹著藻酸鈉。
對(duì)藻酸鈣珠的形成方法沒有特殊限定，只要是能將含有BCC的藻酸鈉懸浮液以足夠微小的液滴分散于氯化鈣溶液中既可。該藻酸鈉懸浮液微滴的直徑通常應(yīng)在150-1000μm的范圍內(nèi)，優(yōu)選在180-500μm的范圍內(nèi)。如果微滴直徑在1000μm以上，則最后獲得的微囊過大，在注射入人或動(dòng)物的機(jī)體時(shí)容易引起破裂，因此不好。通常使用的液滴分散方法有針頭注射法、噴霧法等，優(yōu)選是噴霧法，最優(yōu)選的是利用加拿大多倫多大學(xué)制造的靜電微囊發(fā)生器(見《酶學(xué)方法》“微囊化胰島細(xì)胞一種生物內(nèi)分泌胰”SUN,A.M.Micro-encapsulation of pancreatic islet cell:a bio-artificial endocrine pancreas.In:Methods inEnzymology，第137卷，第575-580頁，1988年)進(jìn)行的噴霧的方法。
上面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了較詳細(xì)的解釋，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀了上文及下文所附的實(shí)施例之后將能很容易地理解本發(fā)明。
與本領(lǐng)域的現(xiàn)有同類技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的積極效果通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用本發(fā)明的APA微囊化動(dòng)物細(xì)胞藥物(微囊直徑150-1000μm)將含有0.2-1×105個(gè)BCC細(xì)胞的微囊注入正常大鼠脊髓蛛網(wǎng)膜下，可使大鼠的熱痛閾值(用傳統(tǒng)的抬腳試驗(yàn)和甩尾試驗(yàn)檢測(cè)大鼠對(duì)急性傷害性熱刺激的反應(yīng))明顯升高(較注藥前提高80％-110％)，作用時(shí)間超過9個(gè)月。通過對(duì)癌痛病人的治療證實(shí)，將微囊化BCC(2-9×106個(gè)細(xì)胞)注入癌痛病人脊髓蛛網(wǎng)膜下，可在4-24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，其中絕大多數(shù)病人不再需要使用其他止痛藥物。病人的疼痛評(píng)分值(按國(guó)際通用的VAS評(píng)分法由2名醫(yī)生進(jìn)行評(píng)分)明顯下降，精神和食欲好轉(zhuǎn)，治療效果已持續(xù)超過120天，而且無明顯的副作用。這一事實(shí)表明，本發(fā)明的APA微囊化BCC的植入可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用，而APA微囊可保護(hù)移植物(即BCC)免受宿主體免疫系統(tǒng)的破壞，使得微囊化BCC可在異種動(dòng)物體內(nèi)較長(zhǎng)期的存活和持久地發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列特點(diǎn)1、按本發(fā)明制作的APA微囊體積小(直徑180-500um)，因而至少具有3個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即(1)利于營(yíng)養(yǎng)物和代謝物的擴(kuò)散，使囊內(nèi)細(xì)胞易于較長(zhǎng)期的存活；(2)不需以手術(shù)的方法將中空纖維管植入，僅需以簡(jiǎn)單的腰穿方法即可將微囊注入脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)，對(duì)組織損傷小；(3)在脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)不易對(duì)脊髓神經(jīng)產(chǎn)生刺激和壓迫的副作用；2、與其它材料的免疫隔離膜相比，APA微囊具有很好的生物相容性；3、大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，本發(fā)明的APA微囊具有很好的免疫保護(hù)作用；4、BCC在宿主體內(nèi)可持續(xù)地(3個(gè)月以上)分泌鎮(zhèn)痛物質(zhì)，產(chǎn)生持續(xù)的鎮(zhèn)痛作用，克服了臨床用藥產(chǎn)生的波動(dòng)性止痛效果；5、微囊化BCC可在宿主體內(nèi)較長(zhǎng)期地發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，避免了反復(fù)使用鎮(zhèn)痛藥物而產(chǎn)生的抗藥性、成癮性等副作用；6、與采用人腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞相比，牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞可大批量獲得；
7、可采用低溫技術(shù)保存微囊化BCC，便于長(zhǎng)距離運(yùn)輸和批量供應(yīng)。
概括地說，本發(fā)明具有治療疼痛的效果明顯、作用時(shí)間長(zhǎng)、使用安全、操作簡(jiǎn)便、質(zhì)量穩(wěn)定、可大批量生產(chǎn)、生產(chǎn)周期短等特點(diǎn)。在臨床應(yīng)用中具有廣闊的使用前景。
下面舉出實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例和應(yīng)用例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些具體例的限定。
實(shí)施例1BCC的分離與純化1、從屠宰場(chǎng)取到12個(gè)新鮮的牛腎上腺(在室溫下的缺血時(shí)間不超過1小時(shí))，在冷藏條件下迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。
2、從腎上腺的靜脈注入濃度為1g/L的膠原酶Ⅰ(collagenase Ⅰ)溶液，每個(gè)腎上腺注入膠原酶Ⅰ溶液5ml，然后在37℃下放置30分鐘，以便讓膠原酶與牛腎上腺細(xì)胞周圍的膠質(zhì)充分反應(yīng)。
3、沿腎上腺縱軸切開皮質(zhì)，分離出髓質(zhì)并將其剪碎。
4、向全部已剪碎的髓質(zhì)組織中加入60ml濃度為1g/L的膠原酶Ⅰ溶液，再放置30分鐘。
5、用一個(gè)網(wǎng)孔為170目(88μm)的鋼網(wǎng)過濾，收集網(wǎng)下液。
6、將網(wǎng)下液離心分離，棄去上清液，獲得含牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞(包括BCC、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞)的沉淀物。
7、用臺(tái)盤藍(lán)染色法進(jìn)行計(jì)數(shù)，獲得的細(xì)胞總數(shù)(血細(xì)胞除外)為5.8×107，細(xì)胞存活率為90％。
8、將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入2個(gè)培養(yǎng)瓶中，每瓶加入DMEM(Dulbeco’sModified Eagle Medium)培養(yǎng)液(其中還含有青霉素100單位/ml、鏈霉素100μg/ml、小牛血清10體積％)20ml，置于一臺(tái)溫度為37℃，含5體積％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，5小時(shí)后換瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，使BCC絕大部分貼于瓶壁上，待用。
通常至少需要培養(yǎng)24小時(shí)以上，在用于制備微囊化動(dòng)物細(xì)胞藥物時(shí)，只需將培養(yǎng)瓶中的溶液去除，用常規(guī)胰酶消化法將BCC從培養(yǎng)瓶中收集下來即可作進(jìn)一步的處理。
應(yīng)予說明，實(shí)施例1的方法屬于常規(guī)技術(shù)，它對(duì)本發(fā)明不起任何限定作用。
實(shí)施例2微囊化動(dòng)物細(xì)胞藥物的制備1、使用按實(shí)施例1的方法獲得的BCC，離心分離，獲得BCC的沉淀物，用生理鹽水洗滌并稀釋至1ml，將其移至離心管內(nèi)。
2、用臺(tái)盤藍(lán)染色法計(jì)數(shù)，所獲得細(xì)胞總數(shù)為3×106個(gè)細(xì)胞，其中BCC的純度為82％。
3、向其中加入1ml濃度為15g/L的藻酸鈉溶液，用攪拌法將其制成懸浮液。
4、用靜電微囊發(fā)生器(electrostatic dropletgenerator，加拿大多倫多大學(xué)制造)將懸浮液噴入到100ml濃度為100mmol/L的氯化鈣溶液中，在10分鐘后獲得了一種直徑在180-500μm范圍內(nèi)的含細(xì)胞的藻酸鈣珠沉淀，待沉淀完全后除去上清液。
5、將藻酸鈣珠加入到50ml濃度為0.5g/L的聚賴氨酸溶液中，混合均勻，在室溫下放置10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。
6、將步驟5獲得的沉淀物加入到60ml濃度為1.5g/L的藻酸鈉溶液中，混合均勻，在室溫下放置10分鐘，待沉淀完全后除去上清液。
7、將步驟6獲得的沉淀物加入到60ml濃度為55mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，在室溫下放置10分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得含BCC的微囊化動(dòng)物細(xì)胞沉淀物。
8、用濃度為9g/L的氯化鈉溶液洗滌沉淀物，然后將此沉淀物轉(zhuǎn)移入實(shí)施例1的步驟8所述的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，作為注射用微囊化BCC藥物待用。
實(shí)驗(yàn)例1微囊化BCC對(duì)大鼠痛閾的影響1、使用10只Wister品系大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，每只大鼠的重量為300±30g。
2、使實(shí)施例2中獲得的微囊化BCC懸浮液沉淀，用濃度為9g/L的氯化鈉溶液洗滌3次，獲得含微囊化BCC的氯化鈉懸浮液。將此懸浮液注射入該10只大鼠的脊髓蛛網(wǎng)膜下，注射量為每只大鼠1×105BCC/20μl氯化鈉溶液，結(jié)果表明，所有被注射微囊化BCC的大鼠的熱痛閾值(用國(guó)際通用的抬腳試驗(yàn)和甩尾試驗(yàn)檢測(cè)大鼠對(duì)急性傷害性熱刺激的反應(yīng))明顯升高(較注藥前提高80％-110％)，作用時(shí)間超過9個(gè)月。
實(shí)驗(yàn)例2微囊化BCC應(yīng)用于治療癌痛病人將APA微囊化BCC(約7×106細(xì)胞)懸浮于5毫升濃度為9g/L的氯化鈉溶液中，以常規(guī)的腰椎穿刺方法注入必須長(zhǎng)期使用止痛藥物的癌痛病人的脊髓蛛網(wǎng)膜下。共選取10名癌痛病人進(jìn)行注射前后的疼痛評(píng)分(VAS法)，結(jié)果表明，其中9名病人在移植(即注射微囊化BCC)后的疼痛評(píng)分(VAS法)由6～10級(jí)下降到0～2級(jí)；在該9名病人中的4名用藥的當(dāng)天即開始停止使用止痛藥物，其他的5名病人在次日或第3日開始停止使用止痛藥物。在未用任何免疫抑制劑的條件下，其中1名病人的鎮(zhèn)痛作用時(shí)間已超過120天，另6名病人的鎮(zhèn)痛作用也已超過70天。9名病人在此期間精神愉快，食欲增加。在總共10例病人中只有1例在植入后仍須使用止痛藥物，但用量減少了50％。對(duì)所有10例病人均未觀察到明顯的毒副作用。
具體應(yīng)用例(1)張貴貴，男，42歲，非何杰金氏淋巴瘤。用本藥前需用口服止痛藥美施康定60mg/日，在注射微囊化BCC 7×106個(gè)細(xì)胞4小時(shí)后停用止痛藥，VAS疼痛評(píng)分由8級(jí)下降到0級(jí)，效果現(xiàn)已持續(xù)超過120天。(2)劉風(fēng)英，女，45歲，何杰金氏淋巴瘤。用本藥前需用口服止痛藥芬必得300mg/日，在注射微囊化BCC 7.5×106個(gè)細(xì)胞18小時(shí)后停用止痛藥，VAS疼痛評(píng)分由6級(jí)下降到0級(jí)，效果現(xiàn)已持續(xù)超過90天。(3)趙建華，女，47歲，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。用本藥前需用口服止痛藥美施康定60mg/日和芬必得300mg/日，在注射微囊化BCC 7×106個(gè)細(xì)胞24小時(shí)后減為僅用芬必得150mg/日，3日后完全停用止痛藥，VAS疼痛評(píng)分由10級(jí)下降到1級(jí)，效果現(xiàn)已持續(xù)超過80天。(4)丁順香，女，56歲，肺癌骨轉(zhuǎn)移。用本藥前需口服止痛藥美施康定60mg/日，在注射微囊化BCC 7×106個(gè)細(xì)胞24小時(shí)后減為美施康定30mg/日，6日后完全停用止痛藥，VAS疼痛評(píng)分由10級(jí)下降到2級(jí)，效果現(xiàn)已持續(xù)超過80天。(5)李香芝，女，60歲，多發(fā)性骨腫瘤。用本藥前需用肌肉注射止痛藥嗎啡20mg/日，在注射微囊化BCC 7×106個(gè)細(xì)胞24小時(shí)后減為嗎啡10mg/日，3日后完全停用止痛藥，VAS疼痛評(píng)分由10級(jí)下降到1級(jí)，效果現(xiàn)已持續(xù)超過60天。
權(quán)利要求
1.用于治療疼痛的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物，其特征在于，該細(xì)胞藥物按下列步驟制成(1)將牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞與一種濃度為10-20g/L的藻酸鈉溶液混合，制成懸浮液，使每升懸浮液中含0.1-1×1010個(gè)細(xì)胞；(2)利用噴霧裝置將步驟(1)獲得的懸浮液以150-1000μm直徑的微滴狀態(tài)分散于一種濃度為80-120mmol/L的氯化鈣或乳酸鈣溶液中，兩種液體的比例為保證每升混合液含0.1-1×108個(gè)細(xì)胞，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得含牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞的藻酸鈣珠沉淀；(3)將步驟(2)獲得的沉淀物加入到一種濃度為0.3-0.7g/L的聚賴氨酸溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個(gè)細(xì)胞，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(4)將步驟(3)獲得的沉淀物加入到一種濃度為1.0-2.0g/L的藻酸鈉溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個(gè)細(xì)胞，混合均勻，放置3-15分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得沉淀物；(5)將步驟(4)獲得的沉淀物加入到一種濃度為40-70mmol/L的檸檬酸鈉溶液中，二者的比例為保證每升液體含0.2-2×108個(gè)細(xì)胞，混合均勻，放置5-20分鐘，待沉淀完全后除去上清液，獲得微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞沉淀物；(6)將步驟(5)獲得的沉淀物加入到一種濃度為9g/L的氯化鈉溶液清洗，最后將沉淀物轉(zhuǎn)移入細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)并作為治療疼痛的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物保存。
2.如權(quán)利要求1所述的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物，其特征在于，其中所述的牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞具有80％以上的純度。
3.如權(quán)利要求1所述的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞藥物，其特征在于，在其步驟(2)中將步驟(1)獲得的懸浮液以180-500μm直徑的微滴狀態(tài)分散。
全文摘要
用于治療疼痛的微囊化牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞(簡(jiǎn)稱BCC)藥物,其制法是:1.將BCC懸浮于藻酸鈉溶液中;2.將該懸浮液分散于氯化鈣溶液中以形成藻酸鈣珠沉淀;3.將該沉淀與聚賴氨酸溶液混合以包裹聚賴氨酸膜并沉淀;4.將該沉淀與藻酸鈉溶液混合以包裹藻酸鈉膜;5.用檸檬酸鈉置換出沉淀物中的鈣離子以微囊化BCC;6.將微囊化BCC轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)液中,待用。該細(xì)胞藥物能在人體內(nèi)長(zhǎng)期地分泌鎮(zhèn)痛物質(zhì),植入一次可以止痛數(shù)個(gè)月以上。
文檔編號(hào)A61K9/50GK1235027SQ9910905
公開日1999年11月17日 申請(qǐng)日期1999年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月16日
發(fā)明者薛毅瓏, 何立敏, 黎立, 王振福, 張莉, 李新建 申請(qǐng)人:薛毅瓏, 何立敏