專利名稱：流行性出血熱傳代細(xì)胞多價(jià)純化疫苗的制作方法
“流行性出血熱傳代細(xì)胞多價(jià)純化疫苗研究”屬國(guó)家95醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)專題(編號(hào)96-906-03-14)。由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所牽頭，中國(guó)藥品生物制品檢定所和衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所參加。本發(fā)明涉及的病毒株、Vero細(xì)胞生產(chǎn)庫(kù)、生產(chǎn)工藝流程和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及檢定方法均由病毒學(xué)研究所獨(dú)家完成。
流行性出血熱(國(guó)際上統(tǒng)稱腎綜合征出血熱)是危害我國(guó)人民最嚴(yán)重的自然疫源性傳染病，由某些漢坦病毒(Hanta Virus)引起，我國(guó)主要是漢灘病毒(Hantaan Virus，即上述的野鼠型或稱Ⅰ型)和漢城病毒(Seoul Virus，即上述的家鼠型或稱Ⅱ型)，安全有效的疫苗是減少發(fā)病率，控制爆發(fā)流行的關(guān)鍵之舉。雖然我國(guó)已有三種動(dòng)物原代細(xì)胞和乳鼠腦純化滅活疫苗，并取得良好的近期防病效果，但是由于要建立大量正常的動(dòng)物種群，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，質(zhì)量也難以保證，而且由于原有疫苗每劑量的抗原含量有限，全程免疫后的抗體反應(yīng)水平及陽(yáng)轉(zhuǎn)率偏低，長(zhǎng)期的防病效果有待考驗(yàn)。隨著改革開放后我國(guó)人民文化、生活水平的提高，必須要有更安全、更有效的高質(zhì)量疫苗，以滿足日益增長(zhǎng)的防病需要。
通過四年來的努力，從病毒株的選育和培養(yǎng)適應(yīng)，Vero細(xì)胞庫(kù)的建立、生產(chǎn)工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定和實(shí)施等，已經(jīng)連續(xù)研制出了三批上述純化疫苗，完成了全部臨床前的實(shí)驗(yàn)研究，各項(xiàng)結(jié)果指標(biāo)均符合WHO和我國(guó)有關(guān)疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
一個(gè)安全有效的疫苗的關(guān)鍵是要有好的疫苗毒株、合適的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、穩(wěn)定易行的生產(chǎn)工藝流程和一套嚴(yán)格完整的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及方法。1．毒株的選育及在Vero細(xì)胞上的傳代適應(yīng)出血熱病毒是優(yōu)劣不等的群體，在Vero細(xì)胞上利用終末稀釋或空斑篩選及乳小白鼠腦中交替?zhèn)鞔姆椒?，可以獲得繁殖力強(qiáng)(即病毒毒力滴度高)，抗原性和免疫原性好的疫苗候選株。我們用地鼠腎細(xì)胞傳代12次的疫苗株病毒L99，再經(jīng)Vero細(xì)胞連續(xù)3代，終末稀釋5代，再經(jīng)乳鼠腦3代及Vero細(xì)胞2代的病毒作為疫苗種子病毒，再連續(xù)2～4代作為Ⅱ型疫苗生產(chǎn)用毒種。另外用84Fli毒株Vero細(xì)胞傳代連續(xù)3代，終末稀釋5代，再在乳鼠腦3代及Vero細(xì)胞2代作為疫苗種子病毒，再連續(xù)2～4代作為Ⅰ型疫苗生產(chǎn)用毒種。種子病毒的滴度始終保持在107TCID50/ml以上。其他毒株包括R22、A9、PS-6、FT-14、H5和C4等采用上述類似的方法，均可達(dá)到上述目的[說明書附

圖1．我國(guó)流行性出血熱病毒流行株L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84-Fli、H5、C4等在Vero細(xì)胞上的傳代適應(yīng)(圖中滴度為IFAT測(cè)定結(jié)果)傳代適應(yīng)條件1、原始滴度；2、在Vero細(xì)胞連傳三代；3、用終末稀釋法連續(xù)傳5代，可以較好地提高病毒毒力滴度；4、回傳乳鼠，即腹腔接種，收取乳鼠腦，鼠腦懸液毒方滴度可達(dá)8.0LogTCID50/ml；5、再在Vero細(xì)胞上適應(yīng)傳代，毒力一般均達(dá)7.0LogTCID50/ml以上，再傳至4～6代，可用于疫苗的試制。]為了保證使用毒株的正確性，進(jìn)一步用特異引物作RT-PCR擴(kuò)增分型{說明書附圖2．在Vero細(xì)胞傳代適應(yīng)的L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84Fli、H5及C4毒株為，用型特異引物進(jìn)行RT-PCR，以進(jìn)一步確定它們的基因型。表明L99和R22毒株為Ⅱ型，而A9、PS-6、FT-14、84Fli、H5及C4毒株為Ⅰ型。[用上述毒株感染的Vero細(xì)胞提取全RNA，先用共用引物合成cDNA第一鏈，再用Ⅰ和Ⅱ型分型引物進(jìn)行擴(kuò)增。共用引物為P1CCGGATCCTAGTAGTAGACACCGC(+)；Ⅰ型引物為P8GATGAAAAGCTGTTTGAT(+),P3TGTTAACCGGAATCG(-)；Ⅱ型引物為P8GATGAAAAGCTGTTTGAT(+),P4GCCCTGAAACTGG(-)]}。2．在合適的Vero細(xì)胞上生產(chǎn)疫苗原液，半成品和成品的檢定內(nèi)容及方法以中國(guó)藥品生物制品檢定所引入早代Vero細(xì)胞種(130代左右)，每3～4天傳一代，至第135代建立生產(chǎn)用種子細(xì)胞庫(kù)，傳至140～145代可以獲得足夠量的細(xì)胞用于生產(chǎn)。
對(duì)疫苗原液，半成品及成品檢定，采用如下方法(1)疫苗原液無(wú)菌試驗(yàn)，無(wú)細(xì)菌、真菌及支原體污染；病毒毒力測(cè)定，達(dá)到6.5～7.0LogTCID50/ml；免疫熒光(IFAT)+++以上；感染細(xì)胞中的外源因子檢查陰性。
(2)半成品的檢定濃縮和純化滅活樣品，分別測(cè)定蛋白含量，以確定純品中蛋白及其他雜質(zhì)的去除率；純品中殘余牛血清蛋白的含量應(yīng)＜50ng/ml(檢定所試劑盒)細(xì)胞DNA含量應(yīng)＜100pg/針(分子克隆技術(shù))；安全試驗(yàn)(在E6或Vero細(xì)胞上盲傳3代，IFAT檢測(cè)陰性)；β-丙內(nèi)酯殘留量(疫苗研制過程中可完全水解去除)。
(3)疫苗成品的全面檢定無(wú)菌試驗(yàn)(需增菌檢定)；毒性試驗(yàn)(用3周小白鼠)；熱原試驗(yàn)(用2kg重大白兔)；效力試驗(yàn)(0,7天免疫2kg重大白兔，28天后測(cè)中和抗體，四只兔子中必須有三只抗體≥1∶20以上)；Al(OH)3含量＜0.7mg/ml；硫柳汞含量＜0.01(g/ml)；總蛋白含量＜4mg/針；外觀(白色、微混濁)；pH值(6.5～7.8)。
上述各項(xiàng)檢定，均符合規(guī)程要求的指標(biāo)，以保證疫苗的安全和有效性。3、通過上述疫苗的試制，形成一套易行而又穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝流程經(jīng)全面檢定合格的Vero細(xì)胞懸液分別接種經(jīng)嚴(yán)格檢定的Ⅰ、Ⅱ型生產(chǎn)用毒種，分裝至轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，2～3天成片后，用Hanks液噴淋，加含0.2％人白蛋白的199維持液，而后每3～4天收獲一次，經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)和毒力測(cè)定合格，合并。合并的原液10000r/m連續(xù)流離心，超濾濃縮，硫酸魚精蛋白沉淀，7000r/m 30分鐘離心，吸去上清，柱層析(BPG)純化，滅活，半成品檢定合格，稀釋除菌，加入白蛋白、硫柳汞及Al(OH)3，分裝后進(jìn)行成品全面檢定[說明書附圖3流行性出血熱傳代細(xì)胞多價(jià)純化疫苗生產(chǎn)工藝流程。(所謂多價(jià)，即包括不同型的流行性出血熱病毒，至少含有Ⅰ和Ⅱ型病毒兩種)]4、上述生產(chǎn)工藝流程圖(即生產(chǎn)過程)中，我們作了如下改進(jìn)(1)病毒生產(chǎn)Ⅰ、Ⅱ型種子病毒分別與細(xì)胞混種的方法，縮短了生產(chǎn)周期及污染率；(2)一定間隔的充分的噴淋，以盡可能去除殘存牛血清；(3)增加了疫苗原液連續(xù)流離心，去除更多的細(xì)胞雜質(zhì)；(4)純化時(shí)，改變了洗脫液的pH值，提高了Al(OH)3對(duì)病毒抗原的吸附度，有可能提高其免疫原性；(5)病毒樣品純化后再進(jìn)行β-丙內(nèi)酯滅活，可減少污染及可能的抗原損失；(6)單價(jià)疫苗單獨(dú)進(jìn)行濃縮和純化，然后按抗原量稀釋，配制成單價(jià)苗，而后適量合并成多價(jià)純化疫苗，這樣有更多調(diào)配抗原含量的余地。
以下的優(yōu)先實(shí)施例對(duì)本發(fā)明或者實(shí)用新型作補(bǔ)充說明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容，在這些實(shí)施例中，為說明本發(fā)明，我們采用了自己分離的并在地鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)的L99疫苗株，及第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院分離由我們?cè)赩ero細(xì)胞和乳小白鼠適應(yīng)的84Fli毒株，分別在Vero細(xì)胞(從檢定所引進(jìn))制備出原液苗，再經(jīng)市售Millipore PELLICON 300K M.W.超濾濃縮器及Amersham Pharmacia Biotech公司Sepharose 4FF介質(zhì)組裝的BPG柱，作為原液疫苗濃縮及純化的重要手段，對(duì)于純品疫苗的質(zhì)量控制除常規(guī)檢測(cè)外，還進(jìn)行一些特殊的檢測(cè)。實(shí)施例1，為合適疫苗毒株的選育；實(shí)施例2，為原液疫苗的生產(chǎn)；實(shí)施例3，為原液疫苗的濃縮及純化；實(shí)施例4，疫苗原液半成品及成品檢定；實(shí)施例5，純化樣品的特殊檢定。實(shí)例1．選育繁殖力強(qiáng)，抗原譜廣，免疫原性及抗原性強(qiáng)的病毒株是疫苗成敗的關(guān)鍵。
(1)選擇了實(shí)驗(yàn)室收集和分離的多個(gè)病毒株或疫苗候選株，包括L99,R22,A9,FT-14,PS-6,H5,84Fli,C4等，在Vero細(xì)胞傳代適應(yīng)；(2)在Vero細(xì)胞采用終末稀釋的方法傳代；然后(3)回至乳小白鼠腹腔接種，收取乳鼠腦中病毒傳代；最后(4)Vero細(xì)胞繼續(xù)傳代，達(dá)到相對(duì)較高的病毒滴度(如圖1．)，同時(shí)對(duì)病毒的基因型(用RT-PCR技術(shù))進(jìn)行進(jìn)一步確證(如圖2．)。實(shí)例2．將液氮凍存的134代Vero細(xì)胞復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，至138代獲得足夠生產(chǎn)用量的細(xì)胞，消化成細(xì)胞懸液，與Ⅰ型或Ⅱ型病毒一定比例混合分種轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)成牢固單層后，用緩沖液充分噴淋(有間隔)，加入0.2％人白蛋白199培養(yǎng)基(pH7.4～7.8)繼續(xù)培養(yǎng)7～19天，每3～4大收液一次作無(wú)菌試驗(yàn)及毒力測(cè)定，無(wú)菌試驗(yàn)合格，毒力滴度大于6.50LogTCID50/ml，即為合格疫苗原液。實(shí)例3．疫苗原液的濃縮及純化上述合格的疫苗原液合并，進(jìn)行連續(xù)流離心機(jī)離心(10000r/m)，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，然后用Millipore PELLICON 300K M.W.超濾濃縮至少50～100倍，再經(jīng)裝載有Sepharose 4FF介質(zhì)的BPG柱(全套由瑞典Amersham Pharmacia生物技術(shù)公司生產(chǎn))，紫外檢測(cè)第一峰即為所需要的純化病毒峰，按收集的液量，加入β-丙內(nèi)酯(1∶4000)滅活，測(cè)定有關(guān)抗原蛋白含量及ELISA滴度，用PBS(pH7.2～7.4)稀釋至合適量(比疫苗原液高4～8倍)，同時(shí)檢測(cè)殘余牛血清含量，Vero細(xì)胞DNA含量及安全試驗(yàn)(盲傳3代)，必要時(shí)檢測(cè)β-丙內(nèi)酯殘留量，稀釋的樣品中立即加入0.3～0.5％人白蛋白，0.5mg/ml的Al(OH)3及硫柳汞防腐劑等，此為純化疫苗半成品。半成品的檢定，實(shí)際是Ⅰ型和Ⅱ型疫苗的分別檢定，內(nèi)容如下所述。實(shí)例4．疫苗原液、疫苗半成品及成品的檢定。
在病毒培養(yǎng)進(jìn)程中，用免疫熒光檢測(cè)來估計(jì)病毒在細(xì)胞中繁殖狀況，一般IFAT在+++以上為好。收獲的原液應(yīng)做無(wú)菌試驗(yàn)及病毒毒力滴定。
半成品的檢定半成品分兩類，即在加入白蛋白，Al(OH)3和硫柳汞等以前及以后，以前包括蛋白含量、抗原活性(ELISA滴度)、β-丙內(nèi)酯含量、殘牛血清蛋白含量及Vero細(xì)胞DNA含量的測(cè)定，安全試驗(yàn)；以后做無(wú)菌試驗(yàn)。而對(duì)加入成分的含量測(cè)定都放在成品的檢定中。
成品的檢定成品是Ⅰ型半成品和Ⅱ型半成品(在加入人白蛋白等以后)適量合并，分裝安瓶后的制品。需作全面檢定，包括無(wú)菌試驗(yàn)，毒性試驗(yàn)，熱原試驗(yàn)，效力試驗(yàn)及Al(OH)3，硫柳汞和總蛋白量等，另外還包括外觀及pH值等理化檢定。實(shí)例5．純化樣品的特殊檢定下列檢定，將不一定包括在以后的疫苗生產(chǎn)過程中純化樣品中病毒顆粒形態(tài)觀察及病毒蛋白SDS-PAGE電泳，以此判定病毒的特異性及純度。病毒形態(tài)由本所形態(tài)室用負(fù)染色進(jìn)行[如說明書附圖4純化病毒樣品中的病毒顆粒形態(tài)(負(fù)染色，30000×)]。電泳按本室常規(guī)操作進(jìn)行[如說明書附圖5、純化病毒樣品的SDS-GAGE電泳圖1、純化樣品84Fli；2、純化樣品L99；3、蛋白Marker，由上至下分子量依次為97.4KD、66.2KD、42.7KD、31.0KD、14.4KD。]
權(quán)利要求
1．流行性出血熱傳代細(xì)胞多價(jià)純化疫苗，其特征在于(1)使用經(jīng)Vero傳代細(xì)胞長(zhǎng)期傳代適應(yīng)的我國(guó)流行性出血熱流行株-至少包括野鼠型(即Ⅰ型，如A9、PS-6、FT-4、84Fli、H5、C4)和家鼠型(即Ⅱ型，如L99、R22毒株)，它們的毒力滴度均達(dá)7.0Log/ml以上；具有較好的免疫原性及抗原性。(2)野鼠型(Ⅰ型)和家鼠型(Ⅱ型)毒株分別在Vero傳代細(xì)胞(美國(guó)ATCC引進(jìn)，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，生產(chǎn)疫苗時(shí)代次不超過150代)培養(yǎng)，多次收液，合并即為原液，原液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分連續(xù)流離心，PELLICON 300K超濾濃縮，Sepharose4 FF(BPG柱)純化，β-丙內(nèi)酯滅活，再經(jīng)稀釋除菌，半成品檢定合格，加佐劑及多價(jià)配伍，成品檢定合格而成純化疫苗。半成品檢定①無(wú)菌試驗(yàn)陰性，合格；②安全試驗(yàn)三代盲傳(Vero-E6細(xì)胞)，IFAT檢查陰性，合格；③殘余牛血清蛋白含量＜50ng/ml，合格；④蛋白含量＜200ng/ml；⑤細(xì)胞DNA含量＜100pg/針。成品檢定①無(wú)菌試驗(yàn)陰性，合格；②毒性試驗(yàn)陰性，合格；③硫柳汞含量＜0.01％(g/ml)合格；④氫氧化鋁含量＜0.7％mg/ml合格；⑤pH6.5～7.8，合格；⑥過敏原測(cè)定陰性，合格；⑦熱原測(cè)定陰性，合格；⑧效力試驗(yàn)每批疫苗免疫家兔4只，對(duì)Ⅰ、Ⅱ型病毒的中和抗體分別≥1∶20。(3)上述毒株的生產(chǎn)、檢定已經(jīng)形成一套系統(tǒng)、合理而穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝流程和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以保證產(chǎn)品(疫苗)的質(zhì)量。(4)純化疫苗應(yīng)用于人體，具有更好的免疫效果及更好的安全性，將會(huì)得到使用者的歡迎。將會(huì)產(chǎn)生良好的社會(huì)效益和一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
2．根據(jù)權(quán)利要求1(1)使用經(jīng)Vero細(xì)胞傳代的上述我國(guó)流行性出血熱病毒流行株(包括L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84Fli、H5、C4等)，可被用于Vero傳代細(xì)胞為基質(zhì)的疫苗生產(chǎn)；
3．根據(jù)權(quán)利要求1(2)流行性出血熱傳代細(xì)胞多價(jià)純化疫苗在Vero傳代細(xì)胞中的生產(chǎn)，其半成品和成品的全面系統(tǒng)檢定內(nèi)容及方法，可被用于Vero傳代細(xì)胞純化疫苗的質(zhì)量控制；
4．根據(jù)權(quán)利要求1(3)流行性出血熱傳代細(xì)胞多價(jià)純化疫苗在Vero傳代細(xì)胞中的生產(chǎn)，全面、系統(tǒng)、合理而又穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝流程及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，可被利用作為Vero細(xì)胞純化疫苗的流程及標(biāo)準(zhǔn)。
5．根據(jù)權(quán)利要求1(4)流行性出血熱傳代細(xì)胞多價(jià)純化疫苗，由于采用了高速連續(xù)流離心機(jī)離心，去除了更多的雜質(zhì)，同時(shí)人為地控制了病毒蛋白和抗原含量，因而使本疫苗效價(jià)高，對(duì)人體的副反應(yīng)更小，達(dá)到既有效又安全的目的。
全文摘要
流行性出血熱傳代細(xì)胞多價(jià)純化疫苗是屬生物技術(shù)領(lǐng)域“九五”國(guó)家醫(yī)學(xué)技術(shù)攻關(guān)專題研究?jī)?nèi)容，包括我國(guó)流行性出血熱病毒流行株在Vero傳代細(xì)胞中的傳代適應(yīng)，毒株的選育，Vero細(xì)胞庫(kù)的建立，病毒在Vero細(xì)胞中的培養(yǎng)、收獲，超濾濃縮及純化，稀釋配制，分裝，以及對(duì)疫苗原液、半成品及成品一系列的檢測(cè)和檢定，以保證疫苗的質(zhì)量，使其既安全又有效，用于流行性出血熱(腎綜合征出血熱)的免疫預(yù)防。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1237456SQ99109199
公開日1999年12月8日 申請(qǐng)日期1999年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月23日
發(fā)明者杭長(zhǎng)壽, 李德新, 孫世華, 解燕鄉(xiāng), 霍子威, 張全福, 梁米芳 申請(qǐng)人:中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所