專利名稱：rhTPO昆蟲桿狀病毒基因治療載體及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的治療人體疾病的重組人血小板生成素(rhTPO)昆蟲桿狀病毒基因治療載體及rhTPO昆蟲桿狀病毒。它可在昆蟲細(xì)胞中擴(kuò)增病毒，但不表達(dá)蛋白；而在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)蛋白，病毒不會(huì)繁殖，具有特異性促進(jìn)血小板生成的能力，可用于治療各種原因引起的血小板減少癥和出血性疾病。
血小板生成素(TPO)是目前已知的唯一可促進(jìn)血小板生成的細(xì)胞因子，1994年美國(guó)de.scnvasc最先分離出其基因，1996年即進(jìn)入臨床，足見人們對(duì)其重視的程度。眾多動(dòng)物體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)表明，TPO單獨(dú)作用可使巨核細(xì)胞體積增大，倍體數(shù)增加，血小板特異性膜蛋白表達(dá)增加，在正常和骨髓受抑的動(dòng)物，TPO均可刺激血小板生成。臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TPO可顯著提高化療前癌癥患者的血小板數(shù)目。
基因作為一種新的給藥方式，已成為臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前，臨床基因治療實(shí)驗(yàn)常用的載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒載體，但由于逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂期細(xì)胞，因而轉(zhuǎn)染效率極低，且容納外源基因的容量有限，還可使宿主細(xì)胞基因異常激活甚至有滅活的可能；腺病毒雖較之逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染效率高一些，但其所攜帶或產(chǎn)生的病毒蛋白可誘發(fā)機(jī)體局部的炎性反應(yīng)及全身性細(xì)胞免疫反應(yīng)，其安全性，特別是遠(yuǎn)期的后果尚難以預(yù)料。
因此，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的基因治療載體尤為重要。
本發(fā)明的目的之一是開發(fā)一種用于治療各種原因引起的血小板減少癥的新的基因治療載體以及具有生物活性的基因治療載體工程藥物，并提供一種可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)出人TPO的昆蟲桿狀病毒，以及TPO的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體。
本發(fā)明的目的之二是提供以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)所說(shuō)的TPO昆蟲桿狀病毒的方法。該方法包括在適于擴(kuò)增本發(fā)明的基因治療載體的條件下，含有編碼所說(shuō)的TPO之核酸序列的真核宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)基中回收所說(shuō)的病毒。
本發(fā)明的目的之三是提供以重組DNA技術(shù)生成所說(shuō)的TPO昆蟲桿狀病毒，并使其感染任何的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明的目的之四是提供一種rhTPO昆蟲桿狀病毒基因載體的應(yīng)用，使所獲得的重組病毒(BM/TPO)可在昆蟲細(xì)胞中大量擴(kuò)增后直接導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)治療各種原因引起的血小板減少癥和出血性疾病。
上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。


圖1重組BM/TPO昆蟲病毒載體。
圖2長(zhǎng)度為333個(gè)氨基酸的TPO氨基酸序列。
圖3PBacMam-2/TPO重組載體的構(gòu)建及與桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞。
圖4利用PT-PCR檢測(cè)TPO在哺乳動(dòng)物正常組織中的表達(dá)。
圖5BM/TPO病毒對(duì)哺乳動(dòng)物血小板的生長(zhǎng)促進(jìn)活性。
參見圖3所示，重組質(zhì)粒的構(gòu)建及與桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞等均按分子生物學(xué)常規(guī)方法進(jìn)行。首先應(yīng)用RT-PCR方法克隆出人全長(zhǎng)TPOcDNA，再將人TPOcDNA通過(guò)基因重組技術(shù)，克隆進(jìn)PBacMam-2表達(dá)載體中；再利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組的PBacMam-2/TPO載體與野生型桿狀病毒DNA一起共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，經(jīng)體內(nèi)重組、噬斑篩選獲得重組病毒。將陽(yáng)性重組病毒在昆蟲細(xì)胞中多次擴(kuò)增后收取病毒顆粒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)TPO。或直接將病毒顆粒注射入動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行基因治療。包含在載體內(nèi)的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、包括啟動(dòng)子和處于適當(dāng)啟動(dòng)子控制下之多核苷酸編碼序列的載體以及用于轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系的多角體桿狀病毒DNA都是基因治療領(lǐng)域中已知的。
本發(fā)明中所說(shuō)的病毒最好是以純化的方式存在，可通過(guò)常規(guī)的途徑，如皮下，肌肉和腹腔注射等，將本發(fā)明的病毒顆粒投用于病人體內(nèi)以表達(dá)TPO。
可以用本發(fā)明的重組病毒顆粒體外感染任何的真核細(xì)胞，包括CHO，293，HeLa，Cos，HcpG2等及某些原代細(xì)胞。
可以使用本發(fā)明全長(zhǎng)基因的含有TPO基因的小片段作為cDNA文庫(kù)的探針，這些探針一般至少有30個(gè)堿基，以檢測(cè)TPO在正常阻止及外周血中的表達(dá)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在以下各方面1.高效本發(fā)明的重組病毒可感染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可高效表達(dá)TPO；2.安全低毒與以往的基因治療載體相比較，其昆蟲桿狀病毒最大的優(yōu)點(diǎn)是，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)毒副作用。重組病毒只在昆蟲細(xì)胞中大量擴(kuò)增而不表達(dá)蛋白，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中只表達(dá)重組目的蛋白。病毒不會(huì)在體內(nèi)繁殖擴(kuò)增。不表達(dá)病毒蛋白，因此也無(wú)致病性；3.生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單只需將重組病毒直接感染昆蟲細(xì)胞，且易于體外大規(guī)模生產(chǎn)，回收的病毒純化工藝簡(jiǎn)單，可直接應(yīng)用；4.治療易于控制可按臨床需求追加注射次數(shù)。
下面提供本發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例1BM/TPO在小鼠體內(nèi)mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè) 稱取注射TPO昆蟲病毒后4、8、12、16天的肌肉組織為對(duì)照。使用TriZOLTM(GIBCO-BRI Co.)試劑抽提組織總DNA按每個(gè)反應(yīng)管中加入Oligo(dT)16lug，總RNA5ug，SuperScript II 2U，10mmol/LNTP 2ul，0.1mol/DTT4ul，5xFirst Strand Buffer 8ul及DEPC水，總體積40ul，反應(yīng)條件42℃，50min，70℃15min。PCR反應(yīng)按常規(guī)方法進(jìn)行，內(nèi)參照β-actin上下游引物分別為5′-ATCATGTTTGAGACCTTCA-3′及5′-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3′(2158-2475nt，318bp)；TPO上下游引物分別為5′-ACCCCTTTGCCTACACCTGTC-3′，5′-CAGAAGCCCAGAGCCAGTA-3′(161-657nt，495bp)。
反應(yīng)條件97℃預(yù)變性5min，然后94℃45s，58℃45s，72℃90s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，結(jié)果顯示TPO在病毒注射4天后組織中即有表達(dá)，且持續(xù)至第16天。
實(shí)施例2BM/TPO病毒對(duì)哺乳動(dòng)物血小板的生長(zhǎng)促進(jìn)活性隨機(jī)挑選Balb/c小鼠分3組進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)a對(duì)照組(NaCl組)注射0.9％生理鹽水；b實(shí)驗(yàn)組(BM/TPO組)注射重組TPO病毒，劑量2.5×1010pfu/ml.Kg體重；c陽(yáng)性對(duì)照組(TPO組)注射本室生產(chǎn)重組TPO因子，劑量為200ug/Kg體重。外周血小板計(jì)數(shù)按常規(guī)進(jìn)行。
上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組于注射后第4天外周血小板計(jì)數(shù)開始升高，升高幅度明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組(p＜0.01)，第8天血小板計(jì)數(shù)達(dá)到峰值600×109/l，為對(duì)照組的2.35倍，且血小板計(jì)數(shù)持續(xù)升高，與陽(yáng)性對(duì)照組相比均有顯著性差異(p＜0.01或p＜0.05)，直至第28天恢復(fù)正常水平。
權(quán)利要求
1.一種基因治療載體及基因治療藥物，其特征在于該基因治療載體是PBacMam-2與rhTPO的重組昆蟲病毒載體，即在pPBacMam-2的EcoRI位點(diǎn)中插入了全長(zhǎng)999個(gè)堿基的TPOcDNA；該基因治療藥物是BM/TPO昆蟲桿狀病毒，即PBacMam-2/rhTPO的重組載體與野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，經(jīng)體內(nèi)重組，再通過(guò)噬斑篩選獲得的重組病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程生產(chǎn)的藥物，其特征在于利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系生產(chǎn)TPO桿狀病毒。
3.一種生產(chǎn)基因治療載體工程藥物的方法，其特征在于包括重組質(zhì)粒的構(gòu)建、共轉(zhuǎn)染、噬斑篩選及哺乳動(dòng)物體內(nèi)導(dǎo)入及表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)基因治療載體工程藥物的方法，其特征在于在適于擴(kuò)增所述的病毒的條件下，培養(yǎng)含有編碼所說(shuō)的TPO之核酸序列的真核宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)基中回收所說(shuō)的病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的rhTPO昆蟲桿狀病毒基因載體的應(yīng)用，其特征在于利用BM/TPO桿狀病毒的藥物作為基因治療載體進(jìn)行基因治療。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的rhTPO昆蟲桿狀病毒基因載體的應(yīng)用，其特征在于所獲得的重組病毒(BM/TPO)可在昆蟲細(xì)胞中大量擴(kuò)增后直接導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)治療各種原因引起的血小板減少癥和出血性疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的治療人體疾病的重組人血小板生成素(rhTPO)昆蟲桿狀病毒基因治療載體及rhTPO昆蟲桿狀病毒,即在pPBacMtam－2的EcoRI位點(diǎn)中插入了全長(zhǎng)999個(gè)堿基的TPOcDNA,再與野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞,通過(guò)體內(nèi)重組、噬斑篩選獲得的重組病毒。它具有可在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)TPO的能力,及特異性促進(jìn)血小板生成的能力,可用于治療各種原因引起的血小板減少癥和出血性疾病。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1249195SQ9910973
公開日2000年4月5日 申請(qǐng)日期1999年7月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月9日
發(fā)明者侯緯敏, 董東生, 陸愛麗 申請(qǐng)人:董東生