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      靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反義硫代寡核酸,含它們的藥物組合及其用于治療癌癥的用途的制作方法

      文檔序號:967969閱讀:571來源:國知局
      專利名稱:靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反義硫代寡核酸,含它們的藥物組合及其用于治療癌癥的用途的制作方法
      含它們的藥物組合及其用于治療癌癥的用途本發(fā)明涉及靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反義硫代寡核苷酸,含它們的藥物組合物及其用于治療癌癥的用途。
      癌癥是目前全世界直接導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一。傳統(tǒng)的基于細胞毒化學治療方法具有選擇性差、副作用強等缺點,因此,尋找特異性強、尤其是干擾與癌細胞行為密切相關(guān)蛋白表達的藥物是人們所希望的。Nicholas Dean等人在“通過蛋白激酶C-α表達的反義寡核苷酸抑制劑抑制裸鼠中腫瘤細胞系生長,Cancer Res(癌癥研究),56,3499-3507,1996年8月1日”一文中披露了用于治療人體癌癥的靶向蛋白激酶C-α的反義寡核苷酸,其代表物為編號ISIS 3521的寡脫氧核苷酸,該核苷酸序列為5′-TGTCT CGCTG GTGAG TTTCA-3′。但人們認為反義寡核苷酸的設(shè)計、開發(fā)有較大的隨機性(W Roush Science1997;2761192~1193),因此反義藥物的選擇還缺乏理論指導(dǎo)。
      本發(fā)明的目的是以靶點mRNA的二級結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育保守性為基礎(chǔ),尋找靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反義核苷酸藥物。
      本發(fā)明者經(jīng)廣泛深入研究,通過固相合成法合成了一系列硫代寡核苷酸并進行了篩選?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)下面八個對PKC-α異常表達如肺腺癌A549細胞株有良好抑制作用的反義硫代寡核苷酸。
      因此,本發(fā)明第一方面涉及的是具有下面序列1-8的靶向蛋白酶C-α(PKC-α)的反義硫代寡核苷酸序列15′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′,今后簡稱為BIRM-AP1224(20),序列25′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′,今后簡稱為BIRM-AP1240(20)。
      序列35′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′,今后簡稱為BIRM-AP0155(20),序列45′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′,今后簡稱為BIRM-AP0186(20),序列55′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′,今后簡稱為BIRM-AP0478(20),序列65′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′,今后簡稱為BIRM-AP0973(20),序列75′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′,今后簡稱為BIRM-AP1261(20),序列85′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG~3′,今后簡稱為BIRM-AP1755(20),本發(fā)明再一方面涉及的是藥物組合物,其包括具有下面序列的反義硫代寡核苷酸及藥用載體和賦形劑序列15′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′,序列25′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′,序列35′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′,序列45′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′,序列55′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′,序列65′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′,序列75′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′,序列85′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′。
      本發(fā)明再一方面涉及的是上述序列1-8的反義硫代核苷酸用于治療癌癥的用途。
      本發(fā)明再一方面涉及的是上述序列1-8的反義硫代梳苷酸用于制備用于治療癌癥的藥物的用途。
      根據(jù)本發(fā)明,本發(fā)明的反義硫代寡核苷酸序列1-8是以PKC-αmRNA的蛋白編碼區(qū)(5′-CTTGACGCAGCTGCACTCCT-3′,5′-TCCTGCTTCCAGACAGTGGA-3′,5′-TCTTCAAGCAGCCCACCTTC-3′,5′-CACCGACTTCATCTGGGGGT-3′,5′-TGCGGAATGGATCACACTGA-3′,5′-AAAGTCATCAGTCCCTCTGA-3′,5′-CGGCTGTACTTCGTCATGGA-3′,5′-CCCAGCCAAGCGGCTGGGCT-3′)為靶點設(shè)計合成與以上靶點反向互補的硫代脫氧寡核苷酸,其對肺腺癌A549和胃癌BGC細胞的增殖有良好的抑制作用。
      因此本發(fā)明的靶向PKC-α的反義硫代寡核苷酸可用作抗癌藥物。
      在本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方案中,優(yōu)選作用于肺腺癌A549細胞株的本發(fā)明序列1-8的反義硫代寡核苷酸。
      根據(jù)本發(fā)明,本發(fā)明的藥物組合物中還有含有作用于其它靶點的反義寡核苷酸。
      下面的實施例是對本發(fā)明的進一步說明,但不意味著對本發(fā)明任何限制。
      實施例一1.人腫瘤細胞系(A549等)的培養(yǎng)及反義寡核苷酸的處理接種細胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中(補充青、鏈霉素各100ku·L-1),培養(yǎng)器皿置于37℃含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)細胞達到50~60%融合時,用無血清培養(yǎng)基沖洗2遍。按Gibco BRL公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書的要求,將反義寡核苷酸導(dǎo)入到腫瘤細胞內(nèi)。將脂質(zhì)體/無血清培養(yǎng)基=1/5的比例,配制成脂質(zhì)體溶液,室溫下靜置30~40分鐘。等體積混合用無血清培養(yǎng)基溶解的不同濃度的反義寡核苷酸,靜置10~15分鐘后,加入到培養(yǎng)器皿中,迅速補充4倍的無血清培養(yǎng)基。置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中6小時后,換正常培養(yǎng)基,培養(yǎng)48~72小時后MTT法測定細胞活度。對照組僅含等濃度的脂質(zhì)體。
      2.靶向PKC-αmRNA的反義硫代寡核苷酸對腫瘤細胞的抑制作用將對數(shù)生長期的肺腺癌A549細胞或其它的細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,4000個細胞/孔。培養(yǎng)18~24小時,按上述方法,加入不同濃度的反義寡核苷酸,反應(yīng)終體積均為200μl。換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48~72小時,棄上清。每孔加入200μl新鮮配制的含0.5mg/ml四氮唑鹽(MTT)的無血清培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)4小時后棄上清。以200μl DMSO溶解甲_。輕度振蕩后,用酶標儀在檢測波長為570nm、參比波長為450nm下測定光吸收值。
      經(jīng)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR),實驗證實,本發(fā)明反義硫代寡核苷酸對A549細胞內(nèi)PKC-αmRNA有特異性的抑制作用。
      本發(fā)明反義硫代寡核苷酸對肺腺癌A549細胞系有強抑制增殖作用。
      表1~8顯示本發(fā)明反義硫寡核苷酸對A549肺腺癌細胞體外增殖的抑制作用,并與對照核苷酸序列ISIS3521進行了比較。結(jié)果表明BIRM-AP1224(20),BIRM-AP1240(20),BIRM-AP0155(20),BIRM-AP0186(20),BIRM-AP0478(20),BIRM-AP0973(20),BIRM-AP1261(20),BIRM-AP1755(20)在抑制肺腺癌A549細胞系增殖上強或近于陽性對照ISIS3521。(數(shù)據(jù)來自4次重復(fù)實驗的平均值)表1 BIRM-P1224-20
      表2 BIRM-AP1240(20)
      表3 BIRM-AP0155(20)
      表4 BIRM-AP0186(20)
      表5 BIRM-AP0478(20)
      表6 BIRM-AP0973(20)
      表7 BIRM-AP1261(20)
      表8 BIRM-AP1755(20)
      實施例二反義硫代脫氧寡核苷酸的合成合成方法用寡核苷酸固相合成亞磷酰胺法,使用美國ABI公司生產(chǎn)的ABI 390Z核酸合成儀的250umol合成程序合成。主要原料為四乙基秋蘭姆化二硫(TETD)、亞磷酰胺單體(phosphoramidite monomers)。制備時,將固相支持物連接保護的、通過固相合成的含本發(fā)明核苷酸序列的硫代寡核苷酸,用濃氨水在55℃條件下,作用15個小時脫保護,從固相支持物上切離,用HPLC法進行純化。
      序列表(1)一般資料Ⅰ.序列數(shù)量8(2)序列BIRM-AP1224(20)的資料Ⅱ.序列特征a)核苷酸長度20b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓撲特征鏈狀Ⅲ.是否反義反義Ⅳ.序列描述BIRM-AP1224(20)AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG20(3)序列BIRM-AP1240(20)的資料Ⅱ.序列特征a)核苷酸長度20b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓撲特征鏈狀Ⅲ.是否反義反義Ⅳ.序列描述BIRM-AP1240(20)T CCAC TGTCT GGAAG CAGGA 20(4)序列BIRM-AP0155(20)的資料Ⅱ.序列特征a)核苷酸長度20b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓撲特征鏈狀Ⅲ.是否反義反義Ⅳ.序列描述BIRM-AP0155(20)
      5′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′(20)(5)序列BIRM-AP0186(20)的資料Ⅱ.序列特征a)核苷酸長度20b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓撲特征鏈狀Ⅲ.是否反義反義Ⅳ.序列描述BIRM-AP0186(20)5′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′(20)(6)序列BIRM-AP0478(20)的資料Ⅱ.序列特征a)核苷酸長度20b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓撲特征鏈狀Ⅲ.是否反義反義Ⅳ.序列描述BIRM-AP0478(20)5′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′(20)(7)序列BIRM-AP0973(20)的資料Ⅱ.序列特征a)核苷酸長度20b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓撲特征鏈狀Ⅲ.是否反義反義Ⅳ.序列描述BIRM-AP0973(20)5′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′(20)(8)序列BIRM-AP1261(20)的資料Ⅱ.序列特征
      a)核苷酸長度20b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓撲特征鏈狀Ⅲ.是否反義反義Ⅳ.序列描述BIRM-AP1261(20)5′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′(20)(9)序列BIRM-AP1755(20)的資料Ⅱ.序列特征a)核苷酸長度20b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓撲特征鏈狀Ⅲ.是否反義反義Ⅳ.序列描述BIRM-AP1755(20)5′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′(20)
      權(quán)利要求
      1.靶向蛋白激酶C-α的未修飾或修飾的具有序列1-8的反義硫代寡核苷酸序列15′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′,序列25′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′,序列35′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′,序列45′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′,序列55′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′,序列65′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′,序列75′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′,序列85′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′。
      2.權(quán)利要求1的反義硫代寡核苷酸,反義硫代寡核苷酸具有序列1序列15′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′。
      3.權(quán)利要求1的反義硫代寡核苷酸,反義寡核苷酸具有序列2-8序列25′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′,序列35′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′,序列45′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′,序列55′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′,序列65′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′,序列75′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′,序列85′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′。
      4.藥物組合物,其包括作為活性成份的具有序列1-2的反義硫代寡核苷酸和可藥用載體。
      5.權(quán)利要求4的藥物組合物,其中的反義硫代寡核苷酸具有序列1序列15′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′。
      6.權(quán)利要求4的藥物組合物,其中所述反義硫代寡核苷酸具有序列2-8序列25′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′。序列35′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′。序列45′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′。序列55′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′。序列65′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′。序列75′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′。序列85′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′。
      7.具有序列1-8的反義硫代寡核苷酸用于制備用于治療癌癥的藥物的用途。
      8.治療癌癥的方法,其中包括給患有癌癥的動物治療有效量的權(quán)利要求1中具有序列1-8的反義硫代寡核苷酸或權(quán)利要求4的藥物組合物。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及靶向蛋白激酶C-α的反義寡核苷酸,含它們的藥物組合物及其用于治療癌癥的用途。
      文檔編號A61P35/00GK1295078SQ9912340
      公開日2001年5月16日 申請日期1999年11月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月3日
      發(fā)明者宋海峰, 湯仲明, 袁守軍, 朱寶珍, 竇桂芳, 劉秀文 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所
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