專利名稱：治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的包含組蛋白的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組蛋白H1在改善關(guān)節(jié)炎之炎性癥狀中的應(yīng)用。組蛋白H1降低關(guān)節(jié)炎的誘發(fā)，而且與常規(guī)藥物相比，可更有效地降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)，還具有顯著的預(yù)防效果。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于改善進(jìn)行性、炎性和自體免疫性關(guān)節(jié)炎之癥狀的生理活性化合物及包含該化合物的組合物。盡管已研制出許多的抗關(guān)節(jié)炎藥物，但由于老齡人口的增加，關(guān)節(jié)炎在世界范圍內(nèi)仍是一種嚴(yán)重的疾病。雖然由關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的死亡非常低，但該病患者的生活質(zhì)量卻由于活動能力較差而受到損害。
在許多類型的關(guān)節(jié)炎中，最顯著的一種是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是由于自體反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的作用而誘發(fā)的自體免疫性疾病。T淋巴細(xì)胞通過遲發(fā)型超敏反應(yīng)而導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。尚未完全認(rèn)識到哪一種抗原被T淋巴細(xì)胞識別而導(dǎo)致該疾病的產(chǎn)生。已知II型膠原是最有可能的一種，但不排除其他的可能性。已發(fā)現(xiàn)了抗組蛋白自體抗體，但還未明確該抗體是否是所述疾病的產(chǎn)生原因。
已使用許多藥物來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，但沒有對其癥狀產(chǎn)生完全的緩解。常規(guī)藥物包括非甾體抗炎藥(NSAID，阿斯匹林、布洛芬)、金鹽、青霉胺、和甾體激素。甾體激素是效力最強而且也是最有效的藥物，但長期使用時會產(chǎn)生副作用。最近，人們正在試驗在炎癥機理中起主要作用的腫瘤壞死因子(TNF)的重組可溶性受體，來作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新治療藥物。但是，對于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀，如炎癥、浮腫、新血管的異常形成、軟骨破損和骨侵蝕，仍需要更好的制劑。
已使用膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)作為T淋巴細(xì)胞樣類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動物模型(對II型膠原的自體免疫關(guān)節(jié)炎的實驗?zāi)Ｐ?，J.Exp.Med.146857-868(1977))。在將II型膠原注射入易發(fā)展成關(guān)節(jié)炎的小鼠時，在2周中即可誘發(fā)出關(guān)節(jié)炎，其癥狀是形成血管翳、軟骨和骨侵蝕。與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類似，CIA也對膠原產(chǎn)生激素和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
組蛋白是細(xì)胞核成分中的主要一種，并與核酸形成染色體。從除人以外的哺乳動物中已分離出許多不同類型的組蛋白(H1)。對于組蛋白H1的各種生理活性已有許多報道。
Biochem.J.，第244卷，675-682，1987報道了在牛血漿和牛奶中發(fā)現(xiàn)并分離了水溶性組蛋白H1。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第82卷，4871-4875，報道了體內(nèi)平衡胸腺激素(HTH)的主要成分是組蛋白H1。組蛋白自由地在淋巴和血管中循環(huán)，而且由于具有諸如控制其他激素分泌的能力而起到類似于激素的作用。
Ann.J.Med.Sci.，第250卷，79-85，1965也報道了HTH療法可增強免疫系統(tǒng)，并解決與胸腺切除術(shù)有關(guān)的免疫學(xué)問題。WO85/03003A提示出，在胸腺切除術(shù)或胸腺的放射療法后，使用具有胸腺激素特征的組蛋白H1片段可起到免疫學(xué)療法的作用，防止白血病。第5,182,257號美國專利公開了組蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4可作為淋巴瘤或白血病的治療藥物。
化學(xué)文摘74，85743(1971)報道稱，在與T2噬菌體一起給藥時，組蛋白H1亞單位可減量調(diào)節(jié)T2噬菌體之抗體的形成。化學(xué)文摘73，96837(1970)報道了在皮膚移植后使用組蛋白H1作為免疫抑制劑。
Nature，第360卷，33-39，1992報道稱，組蛋白H1可穩(wěn)定海膽的鞭毛微血管結(jié)構(gòu)。J.Biol.Chem.，第259卷，15523-15531，1984報道稱，與從馬腦中分離的微管共同作用，組蛋白H1可誘導(dǎo)小管的聚集，該小管與微管的環(huán)形結(jié)構(gòu)類似。
但是，現(xiàn)有文獻(xiàn)還沒有提示使用組蛋白H1作為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。
附圖簡述

圖1是顯示在給藥組蛋白H1后類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)作用的變化的圖(I…I接種膠原后沒有治療(對照組)；▲_▲服用預(yù)防效果的地塞米松的組；▲...▲服用治療效果的地塞米松的組；n-n服用預(yù)防效果的組蛋白H1的組；n...n服用治療效果的組蛋白H1的組)。
圖2A是顯示組蛋白H1對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防效果的圖(I…I接種膠原后沒有治療(對照組)；▲_▲注射地塞米松的組；n-n注射組蛋白H1的組)。
圖2B是通過關(guān)節(jié)炎指數(shù)隨時間的變化來顯示組蛋白H1對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果的圖(I...I接種膠原后沒有治療(對照組)；▲_▲注射地塞米松的組；n-n注射組蛋白H1的組)。
圖3A是膠原接種后6周時對照組中表現(xiàn)出浮腫的小鼠的前肢的照片。
圖3B是膠原接種后6周時給藥組蛋白H1的小鼠的前肢的照片。
圖4A和4B是膠原抗原接種后10周時表現(xiàn)出血管翳形成、軟骨損壞、骨侵蝕并有炎性細(xì)胞出現(xiàn)的對照組小鼠的膝關(guān)節(jié)的切片(P＝血管翳，C＝軟骨，J＝關(guān)節(jié)空間)。
圖4C是膠原抗原接種后10周時進(jìn)行組蛋白H1治療的實驗組小鼠的膝關(guān)節(jié)的切片(P＝血管翳，C＝軟骨，J＝關(guān)節(jié)空間)。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供一種藥物組合物，該組合物可比常規(guī)制劑更為有效地改善進(jìn)行性、炎性和自體免疫關(guān)節(jié)炎的癥狀。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種包含組蛋白的藥物組合物，以改善進(jìn)行性、炎性和自體免疫關(guān)節(jié)炎的癥狀。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種包含組蛋白的藥物組合物，以預(yù)防進(jìn)行性、炎性和自體免疫關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種降低患者之類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀的方法，其包括向所述患者給藥治療有效量的組蛋白。發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明涉及組蛋白的新用途，并提供包含組蛋白作為活性成分的藥物組合物，以改善進(jìn)行性、炎性和自體免疫關(guān)節(jié)炎的癥狀。
癥狀緩解包括(1)改善與關(guān)節(jié)炎有關(guān)的癥狀；(2)預(yù)防進(jìn)行性疾病的發(fā)展；以及(3)預(yù)防在易患關(guān)節(jié)炎之個體中的侵入。
本發(fā)明的藥物組合物包括作為活性成分的組蛋白、特別是組蛋白H1，而且如果需要還可包括藥物學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的藥物組合物可以其本身或者與其他常規(guī)關(guān)節(jié)炎藥物復(fù)合使用。
為確定自體免疫類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀是否已被組蛋白H1的治療緩解，可向已患有關(guān)節(jié)炎或者易于患有關(guān)節(jié)炎的哺乳動物給藥組蛋白H1亞單位。在實驗小鼠中誘發(fā)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，其是眾所周知的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型(實施例1)。
在本發(fā)明中，哺乳動物可擴大至人，而關(guān)節(jié)炎可擴大至類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明對分離組蛋白的物質(zhì)沒有限制。同樣，組蛋白可擴大至組蛋白2A、H2B、H3和H4或它們的混合物。
另外，本發(fā)明涉及一種降低患者之類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀的方法，其包括向所述患者給藥治療有效量的組蛋白。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定組蛋白H1足以預(yù)防關(guān)節(jié)炎之癥狀的需要量。
在本發(fā)明中，給藥間隔為3-4天，但該間隔也可延長至1、2或4周。理想的給藥途徑是靜脈或腹膜內(nèi)注射，但也可使用其他的方法。
根據(jù)醫(yī)生的診斷或處方給藥后，觀察癥狀的發(fā)展或患者的反應(yīng)，由此可控制最有效的給藥途徑、劑量和間隔。
以下將通過實施例來進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明，但這些實施例并不是對本發(fā)明范圍的限制。
為估算各實驗組的平均值，在本發(fā)明的實驗中使用Student′s t-檢驗。用Chi-square檢驗來估算標(biāo)準(zhǔn)偏差。如果p＜0.05，則認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性。實施例1在實驗小鼠中誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎從Charles River Japan進(jìn)口5周齡DBA/1J雌性小鼠，并使它們適應(yīng)動物房間2周，在7周齡時將它們用于實驗(20-25g)。
以2mg/ml的濃度將已分離并定量的雞II型膠原(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO，USA)溶解在0.1 N乙酸中。在4℃下將該溶液與等量的完全Freund′s佐劑混合，形成懸浮液。將100微升該混合物圍繞尾靜脈的端點進(jìn)行靜脈注射，然后在第一次注射后的第3和6周進(jìn)行進(jìn)一步的接種(D.E.Trentham等人，Autoimmunity to Type II collagenAnExperimental Model of Arthritis，J.Exp.Med.146857-868(1977))。第一次注射后的4周起誘導(dǎo)出關(guān)節(jié)炎。估算關(guān)節(jié)炎檢查關(guān)節(jié)炎的臨床發(fā)病率(C.I.A.)和關(guān)節(jié)炎指數(shù)。C.I.A.以全部小鼠中患有關(guān)節(jié)炎癥狀的小鼠的百分?jǐn)?shù)來表示。以關(guān)節(jié)炎指數(shù)表示的炎癥程度如下分為0-3類，并由2位研究人員每周觀察。給藥膠原后6周時拍攝一些小鼠的腳部照片。
0正常1略微腫脹和/或紅斑2有限的浮腫性腫脹3嚴(yán)重的浮腫和關(guān)節(jié)僵直計算4只爪(2只后爪和2只前爪)的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，最大值為12。6-8的指數(shù)被認(rèn)為是嚴(yán)重的，因為膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎通常主要侵入后爪。實施例2組蛋白H1的提取和分離從Boehringer Mannheim(目錄號223549，凍干物，得自于牛胸腺，具有電泳均勻性)得到組蛋白H1用于實驗中。實施例3組蛋白H1對關(guān)節(jié)炎的預(yù)防作用給藥組蛋白H1作為檢查預(yù)防作用的實驗組，從第一次注射后的第3周起(誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎之前)至第10周，每周2次通過腹膜內(nèi)注射向10只小鼠給藥1mg/kg體重的組蛋白H1。組蛋白H1在PBS中稀釋至5mg/ml的濃度。作為比較組，從第一次注射后的第3周起(誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎之前)至第10周，每周2次通過腹膜內(nèi)注射向10只小鼠給藥1mg/kg體重的地塞米松——當(dāng)前抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物。作為對照組，從第一次膠原注射后的第3周起至第10周，每周2次通過腹膜內(nèi)注射向20只小鼠給藥300μl的PBS。關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)作用和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的估算在每個組的小鼠中接種抗原后，觀察誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎4周。在膠原注射后沒有進(jìn)行治療的對照組中，接種后4周開始關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)作用(30％)。C.I.A.在第5和6周時為64.3％，在第7周時為100％。與該結(jié)果相比，注射組蛋白H1的實驗組小鼠在第6周時完全防止了關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)作用。實驗組的C.I.A.在第7和8周時為60％，在第10周時為80％。注射常規(guī)地塞米松的對比組小鼠在4-10周時具有20-30％的C.I.A.。
對比組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)是嚴(yán)重性的，抗原接種后，在第4周時為1.50±0.55，在第5周時為3.00±1.00，在第8周時為具有最大值6.00±2.05(圖2A和2B)。與該結(jié)果相比，接種后第7周時才在實驗組中觀察到關(guān)節(jié)炎，其關(guān)節(jié)炎指數(shù)為對照組的60％。在有關(guān)節(jié)炎的小鼠中，關(guān)節(jié)炎指數(shù)約為對照組的一半，在第8周時其值為2.67±1.15，在第10周時為2.25±1.26，這表明預(yù)防作用至少持續(xù)10周。在注射地塞米松的小鼠中，在第5和6周時的關(guān)節(jié)炎指數(shù)分別為2.00和1.50，這表明其預(yù)防作用最多持續(xù)6周，低于組蛋白給藥組。估算免疫反應(yīng)抗膠原抗體濃度在第10周時，通過心臟穿刺得到血樣，并由其中分離血清。將該血清保存在-80℃下，并在實驗前才將其溶化，以通過ELISA法(D.E.Tretham & R.A.Dynesius-Trentham，J.Immunol.1302689-2692(1983))測量抗膠原抗體濃度。將在0.1 PBS中的II型膠原(25μg/ml)放入96孔聚苯乙烯微量板(Nunc，Denmark)的各個孔中，并在4℃下溫育8小時。經(jīng)培養(yǎng)后，用PBS-0.05％Tween 20溶液沖洗幾次所述孔。為防止非特異性免疫反應(yīng)，在各孔中加入PBS-0.5％卵清蛋白，并在室溫下溫育1小時，隨后再用PBS-0.05％Tween 20溶液沖洗。血清用緩沖液稀釋500倍，然后添加至各孔中，并在室溫下反應(yīng)2小時，再用PBS-0.05％Tween 20溶液進(jìn)一步?jīng)_洗。使各孔與堿性磷酸酶結(jié)合山羊抗鼠IgA和IgM反應(yīng)2小時并添加1mg/ml對硝基苯基磷酸酯后，測量450nm處的吸光度。每個樣品的抗膠原抗體濃度測2次，并取平均值。
實驗組的抗膠原抗體濃度為0.588±0.214(p＜0.00005)，對比組的值為0.925±0.075，前者顯著低于后者。但是，因為抗膠原抗體濃度在各組中都比較高，生理作用并不是明顯的。實施例4組蛋白H1的關(guān)節(jié)炎治療作用給藥組蛋白H1作為檢查治療作用的實驗組，從第一次注射后的第6周起(誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎之后)至第10周，每周2次通過腹膜內(nèi)注射向10只小鼠給藥1mg/kg體重的組蛋白H1。組蛋白H1在PBS中稀釋至5mg/ml的濃度。作為比較組，從第一次注射后的第6周起(誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎之后)至第10周，每周2次通過腹膜內(nèi)注射向10只小鼠給藥1mg/kg體重的當(dāng)前抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物——地塞米松。對照組與實施例1的相同。關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)作用和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的估算實驗組的小鼠在抗原接種后的第6周時用組蛋白H1治療，該組小鼠的C.I.A.在第6周時為37.5％，在第7周時降低為12.5％。該治療作用持續(xù)至第10周，C.I.A.在第8和10周時為14.3％。在用地塞米松治療的對比組中，C.I.A.在第7、8、和9周時分別為22.2％、33.3％和22.2％，這表明組蛋白H1的治療效果整體上要更好。
接種后第5周時，經(jīng)過組蛋白治療的實驗組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)為3.33±0.58。在第6周時給藥組蛋白H1后，C.I.A.仍與第5周時的相同，但關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低為2.67±0.58。第7周后，2/3被誘導(dǎo)出的關(guān)節(jié)炎都痊愈。對于仍有關(guān)節(jié)炎的小鼠，在第7、8和10周時關(guān)節(jié)炎指數(shù)分別降低為1.00、2.00和1.00，這表明組蛋白H1對早已發(fā)展的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有顯著的治療作用。用常規(guī)地塞米松治療的對比組中，關(guān)節(jié)炎指數(shù)在第7、8和10周時分別為2.67、1.67和3.00(圖2A和2B)。在給藥膠原后的第6周時拍攝一些小鼠的前爪的照片。對比組的前爪產(chǎn)生浮腫，其為關(guān)節(jié)炎的一個癥狀，而在用組蛋白H1治療的實驗組中觀察到浮腫的改善。估算免疫反應(yīng)抗膠原抗體濃度如實施例3測量抗膠原抗體濃度，以估算免疫反應(yīng)。實驗組的抗膠原抗體濃度為0.540±0.170(p＜0.00005)，對比組的值為0.925±0.075，前者顯著低于后者。但是，因為抗膠原抗體濃度在各組中都比較高，生理作用并不是明顯的。通過H-E染色進(jìn)行病理學(xué)觀察由心臟放血，由此殺死小鼠。在殺死后立即切除各腿，并固定在甲醛中。去鈣后，用蘇木精—曙紅染色各腿。通過H-E染色所進(jìn)行的病理學(xué)觀察表明，在抗原接種后的10周內(nèi)在對照組的切片中觀察到了血管翳的形成、軟骨的侵蝕和炎性細(xì)胞的存在(圖4A和4BP＝血管翳，C＝軟骨，J＝關(guān)節(jié)空間)。
作為對比，在進(jìn)行組蛋白H1治療的實驗組的切片中，在10周內(nèi)沒有觀察到血管翳的形成、軟骨的侵蝕和炎性細(xì)胞的存在，這表明其具有正常的組織結(jié)構(gòu)(圖4C)。
權(quán)利要求
1.一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的組合物，其包括治療有效量的組蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組蛋白是組蛋白H1。
3.一種預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的組合物，其包括治療有效量的組蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中，所述組蛋白是組蛋白H1。
5.一種降低患者之類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀的方法，其包括向所述患者給藥治療有效量的組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及組蛋白的新用途,并提供包含組蛋白作為活性成分的藥物組合物,以改善進(jìn)行性、炎性和自體免疫關(guān)節(jié)炎的癥狀。本發(fā)明的藥物組合物包括作為活性成分的組蛋白、特別是組蛋白H1,而且如果需要還可包括藥物學(xué)上可接受的載體。組蛋白H1降低關(guān)節(jié)炎的誘發(fā),而且與常規(guī)藥物相比,可更有效地降低關(guān)節(jié)炎指數(shù),還具有顯著的預(yù)防效果。
文檔編號A61K38/00GK1255857SQ99800067
公開日2000年6月7日 申請日期1999年1月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月24日
發(fā)明者裴仁洙, 金東洙, 任惠準(zhǔn), 鄭年哲, 李龍源, 洪承緒, 李賢秀 申請人:株式會社三養(yǎng)吉耐克斯