專利名稱：采用丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白進行的基因免疫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組核酸分子和包含例如與基因免疫方案中抗丙型肝炎病毒的疫苗組分同樣有用的藥物組合物；涉及誘導(dǎo)抗丙型肝炎病毒感染的免疫應(yīng)答的方法；并涉及治療患有丙型肝炎感染的病人的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)，由輸血獲得的非甲非乙型肝炎的主要病原體，在美國每年引起了大約150,000起的急性病毒性肝炎的新病例。(Choo，等，科學(xué)，1989,244,359-362.)在西方國家，有0.6％至2.0％的流行率，而在世界的一些不發(fā)達地區(qū)要高達15％。(Heintges，等，Hepathology,1997,26,521-526.)大約一半的此類感染會演變成和肝硬化以及/或肝癌相關(guān)的慢性感染。(Alter，等，科學(xué)，1992,258,135-140；和alter，等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，1992,327,1899-1905).此外，抗丙型肝炎病毒抗體的流行顯示，丙型肝炎病毒的感染是肝細胞癌發(fā)展的一種獨立的危險因素(Colombo，等，Lancet,1989,ii,1006-1008；Saito，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87,6547-6549；Simonetti，等，An.Int.Med.,1992,116,97-102；和Tsukuma，等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，1993,328,1797-1801)。
丙型肝炎病毒是一種具有衣殼的正鏈RNA病毒，長度大約為9,500核苷酸，最近被分類為黃病毒屬的一個獨立種。(Heinz,Arch.Virol.(Suppl.),1992,4,163-171.)不同的分離物顯示出相當多的核酸序列多樣性，導(dǎo)致將HCV的基因組進一步分成八個基因型。(Simmonds，等，J.Gen.Virol.,1993,74,2391-2399.)在所有的基因型中，病毒基因組都包含一個大的開放閱讀框(ORF)，編碼一條由3010到3033個氨基酸組成的，大約330Kd的多聚蛋白前體。(Choo，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88,2451-2455；Inchauspe,等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88,10292-10296；Kato，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87,9524-9528；Okamoto，等，病毒遺傳學(xué)雜志，1991,72,2697-704；和Takamizawa，等，J.Gen.Virol.,1991,65,1105-1113.)通過該多聚蛋白前體的蛋白水解加工產(chǎn)生了核心蛋白(C)，衣殼蛋白(E1,E2)和非結(jié)構(gòu)(NS2-NS5)蛋白，從而產(chǎn)生出各種HCV多肽。(Bartenschlager，等，病毒遺傳學(xué)雜志，1993,67,3835-3844；Grakoui，等，病毒遺傳學(xué)雜志雜志，1993,67,2832-2843；及Selby，等，病毒遺傳學(xué)雜志，1993,74,1103-1113)。這種蛋白水解是聯(lián)合采用細胞蛋白酶和病毒編碼的蛋白酶進行催化反應(yīng)的。NS3基因編碼一種絲氨酸蛋白酶，此酶能在幾種功能部位切斷轉(zhuǎn)錄后的病毒多聚蛋白前體，還可以作為蛋白解旋酶起作用。NS5區(qū)域編碼此病毒的RNA依賴的RNA聚合酶。
除了轉(zhuǎn)錄區(qū)域外，HCV基因組還包含一個5’非翻譯區(qū)域(5’UTR)和一個3’非翻譯區(qū)域(3’UTR)。該324至341的5’非翻譯區(qū)域核酸序列代表了迄今為止報道過的所有HCV分離物中最保守的核酸序列。(Han，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88,1711-1715；和Bukh，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89,4942-4946)。該5’非翻譯區(qū)域被假定包含了HCV RNA復(fù)制和/或翻譯的重要調(diào)控元件。該5’非翻譯區(qū)域還包含了數(shù)個小的開放閱讀框(ORF)，但現(xiàn)今尚未有證據(jù)提示這些開放閱讀框被真實翻譯。
在HCV感染期間涉及肝損傷和病毒清除的細胞免疫機制只是部分的被說明。在嘗試檢測慢性HCV感染病人中肝浸潤淋巴細胞的潛在致病作用時，Koziel等檢驗了細胞毒T淋巴細胞(CTL)對這些細胞的反應(yīng)，并證明HLAⅠ類限制性的CD8+細胞毒T淋巴細胞應(yīng)答針對HCV多肽的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)區(qū)域。(Koziel，等，病毒學(xué)雜志1993,67,7522-7532；和Koziel，等，免疫學(xué)雜志，1992,149,3339-3344)。其他研究者也注意到在外周血單核細胞群體中存在細胞毒T淋巴細胞，它能識別慢性HCV感染時的病毒核心上的和其它病毒相關(guān)蛋白上的表位。(Kita，等，Heatol.,1993,18,1039-1044；和Cerny，等，Intl.Symp.virol Hepatitis Liver Dis.,1993,83(abstr.).)Botarelli，等，(Botarelli，等，Gastroenterol.,1993,104,580-587)和Ferrari，等，(Ferrari,Hepatol.,1994,19,286-295)發(fā)現(xiàn)了針對慢性HCV感染病人體內(nèi)得到的HCV的不同區(qū)域的幾種重組蛋白的HLAⅡ類限制性的CD4+T細胞介導(dǎo)的增殖反應(yīng)。
在有效HCV感染中，體液和細胞免疫應(yīng)答已顯示是多克隆、多特異性的。很可能在持續(xù)HCV感染中產(chǎn)生的宿主免疫應(yīng)答，部分的引了肝細胞損傷。然而，這些免疫應(yīng)答不足夠廣泛或強大，以在慢性HCV感染的病人體內(nèi)促進病毒清除和保護性免疫力。(Chisari,J.Clin.Invest.,1997,99,1472-1477.)最近顯示，那些從急性HCV感染中恢復(fù)的病人能產(chǎn)生很強的對非結(jié)構(gòu)蛋白多肽CD4+T細胞增殖反應(yīng)。(Missale，等，J.Clin.Invest.,1996,98,706-714；和Diepolder，等，Lancet,1995,346,1006-1007.)更重要的是，HCV特異性CTL活性的產(chǎn)生是和慢性肝炎個體體內(nèi)病毒復(fù)制的控制相聯(lián)系的。(Rehermann,等，J.Clin.Invest.,996,98,1432-1440；和Nelson，等，J.Immunol.,1997,158,1473-1481.)然而，非結(jié)構(gòu)蛋白NS3,NS4和NS5是否有足夠的免疫原性能夠在體內(nèi)產(chǎn)生廣泛的、強有力的CTL應(yīng)答尚不知道。
現(xiàn)今還沒有通用的、高效的對慢性HCV感染的治療方法。HCV疫苗策略的開發(fā)是復(fù)雜的，不僅是由于HCV分離物的顯著的異質(zhì)性，還由于在一個病毒分離物中混合了異源基因組。(Martell，等，J.Virol.,1992,66,3225.)此外，病毒包含了一個高度可變的衣殼區(qū)。有效的治療僅限于干擾素。(Carithers,et al,Hepatology,1997,26,83S-88S.)事實上，用這種制劑治療的病人大約8-10％有反應(yīng)，并有HCV從肝部的擴散。然而，近來的研究顯示，和那些獲得持續(xù)性HCV感染的病人比較，從急性HCV感染中恢復(fù)的病人對非結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生了充分的CD4+T細胞增殖反應(yīng)。(Missale，等，J.Clin.Invest.,1996,98,706-714；和Diepolder，等，Lancet,1995,346,1006-1007)直接將DNA注射入動物體內(nèi)是免疫接種輸送特異免疫抗原的一種有前途的方法。(Barry，等，Bio Techniques,1994,16,616-619；Davis，等，Hum.Mol.Genet.,1993,Ⅱ,1847-1851；Tang，等，自然科學(xué)，1992,356,152-154；Wang,等，J.Virol.,1993,67,3338-3344；和Wolff，等，科學(xué)，1990,247,1465-1468.)該方法已被成功的應(yīng)用于在鼠和雞中產(chǎn)生對流感病毒、在鼠和小牛中對牛皰疹病毒、在鼠中對狂犬病毒產(chǎn)生保護性免疫。(Cox，等，J.Virol.,1993,67,5664-5667；Fynan，等，DNA和Cell Biol.,1993,12,785-789；Ulmer等，科學(xué)，1993,259,1745-1749；和Xiang等，Virol.,1994,199,132-140.)在大多數(shù)情況中，強而高度多樣的抗體和細胞毒T細胞應(yīng)答和感染的控制有關(guān)。事實上，和那些死病毒的疫苗，不僅能引起抗急性感染的保護力而且能根除持續(xù)性病毒感染的CTL應(yīng)答的方法比較，不使用肝臟載體而產(chǎn)生長而持續(xù)性的記憶性CTL的可能性，使這種方法特別具有吸引力。(Wolff，等，科學(xué)，1990,247,1465-1468；Wolff，等，Hum.Mol.Genet.,1992,Ⅰ,363-369；Manthorpe，等，Human Gene Therapy,1993,4,419-431；Ulmer等，科學(xué)，1993,259,1745-1749；Yankauckas,etaal.,DNA和細胞生物學(xué)，1993,12,777-783；Montgomery，等，DNA和細胞生物學(xué)，1993,12,777-783；Fynan，等，DNA和細胞生物學(xué)，1993,12,785-789；Wang，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90,4156-4160；Wang，等，DNA和細胞生物學(xué)，1993,12,799-805；Xjang，等，Virol.,1994,199,132-140；Davis，等，Hum.Mol.Genet.,1993,Ⅱ,1847-1851；Donnelly，等，Nat.Med.,1995,Ⅰ,583-587；Boyer，等，Nat.Med.,1997,3,526-532；Tascon，等，Nat.Med.,1996,2,888-892；和Huygen，等，Nat.Med.1996,2,893-898.)。和融合重組蛋白或多肽相比較，該方法的優(yōu)點在于能引起強烈的炎癥性的CD4+T細胞應(yīng)答和細胞毒T細胞活性，推測是病毒蛋白在細胞內(nèi)加工轉(zhuǎn)變成多肽，然后裝載在轉(zhuǎn)染細胞的MHCⅠ類分子上，與抗原遞呈細胞相互作用而致。相反的是，用融合蛋白免疫接種主要導(dǎo)致由MHCⅡ類途徑加工的體液免疫應(yīng)答。由于只有有限數(shù)目的表位能刺激宿主的免疫應(yīng)答，用合成多肽免疫有幾個缺陷之處。相反的，對于感興趣的DNA構(gòu)建物編碼的每個蛋白，天然存在的B和T細胞表位都可能是為T細胞受體識別而保留的，因此可能會產(chǎn)生廣泛的體液和細胞免疫應(yīng)答。(McDonnell，等，N.Engl.J.Med.,1996,334,42-45.)疫苗接種和免疫接種通常指引入某種無毒的物質(zhì)，個體的免疫系統(tǒng)能刺激針對該物質(zhì)的免疫應(yīng)答，從而能抵抗病原體的攻擊。免疫系統(tǒng)識別入侵的“外來”組分和物質(zhì)主要靠識別在個體內(nèi)正常不存在的蛋白和其它的大分子。外來的蛋白是免疫應(yīng)答所針對的目標。
PCT專利申請PCT/US90/01348公開了HCV基因組克隆的序列信息，HCV病毒蛋白的氨基酸序列以及制造和使用包括抗一HCV疫苗等組分的方法，該疫苗中含有HCV蛋白及其產(chǎn)生多肽。
美國專利5,830,876,5,593,972,5,739,118和于1994年1月26日提交的PCT專利申請系列號PCT/US94/00899，其內(nèi)容全部納入本文以供參考。每專利都包含了基因免疫方案的細節(jié)?？笻CV疫苗也包括在各件專利之中。
用于保護個體抵抗HCV感染的疫苗的需求仍然存在，保護個體抵抗HCV感染的方法的需求仍然存在。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及重組核酸序列分子，其包含編碼HCV非結(jié)構(gòu)區(qū)域，如NS3,NS4，或NS5，或它們的組合的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及包含重組核酸分子的藥物組合物，該重組的核酸分子含有一段編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的該核苷酸編碼序列和人細胞中的功能性調(diào)節(jié)元件可操作性相連。該藥物組合物還包含有藥學(xué)上可接受的運載體或稀釋劑，和任選的促進劑(facilitator)，比如丁哌卡因。
該發(fā)明涉及免疫HCV易感個體的方法，包含向該個體給藥，藥物組合物含有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列的重組核酸分子。該編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列與人類細胞中的功能性調(diào)節(jié)元件可操作性相連。該藥物組合物還包含一種藥學(xué)上可接受的運載體或稀釋劑。對個體施用一定量的藥物使之有效誘導(dǎo)抗HCV感染的保護性免疫應(yīng)答。
本發(fā)明涉及治療患有HCV感染個體的方法，包括相該個體歌謠，藥物成分含有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列的重組核酸分子。該編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列序列與人細胞中的功能性調(diào)節(jié)元件可操作性相連。該藥物組分還包含藥學(xué)上可接受的運載體或稀釋劑。給予個體一定量的藥物使之有效誘導(dǎo)HCV感染的治療性免疫應(yīng)答。
附圖簡述

圖1A是一示意圖，顯示HCV的單一大開放閱讀框，它編碼大約3011-3030個氨基酸的多聚蛋白前體。該蛋白前體被宿主信號和病毒蛋白酶切割成不同的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白，如箭頭所示。圖1B顯示HuH-7細胞瞬時轉(zhuǎn)染和SP2/0細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的非結(jié)構(gòu)蛋白表達的示范性放射自顯影圖。1,3,5泳道是模擬DNA轉(zhuǎn)染的細胞，用作陰性對照(Mock)；2,4和6泳道顯示了特異條帶，NS3在大約70,NS4在大約30,NS5大約125KD。7-10泳道顯示了分別轉(zhuǎn)染了含有NS3,NS4，和NS5基因的核酸構(gòu)建物的SP2/0細胞。7和9泳道代表由穩(wěn)定表達HCV-核心蛋白，作為陰性對照(SP2-10)的細胞得到的細胞裂解物，而8和10泳道代表NS3和NS5的特異性表達。
圖2A是一柱狀圖，顯示一代表性的以DNA為基礎(chǔ)免疫接種引起的對NS3,NS4和NS5的體液免疫應(yīng)答；血清抗體水平由一ELISA法測定(每組n=5).圖2B是一柱狀圖，顯示一在體外用特異或非特異性重組蛋白刺激3日后測得的代表性的T細胞增殖。圖2C,2D，和2E為柱狀圖，顯示在體外刺激48小時后測得的代表性的細胞因子IFN-γ,IL-2和IL-4分別在上清液中的分泌水平。
圖3A和3B是柱狀圖，顯示在不同的效應(yīng)細胞和靶細胞比例下(100∶1,30∶1,10∶1,3∶1)分別對NS3和NS5作出的代表性的細胞毒T細胞(CTL)反應(yīng).圖3C是柱狀圖，顯示針對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶細胞譜線的代表性鉻釋放實驗。
圖4A是一表格，顯示評價CTL活性的腫瘤模型的代表性結(jié)果。圖4B是一照片，自左自右顯示接種了1)模擬DNA，并以SP2/NS5-21細胞攻擊；2)pApNS5，以SP2/NS5-21細胞攻擊；3)pApNS5，以SP2-19細胞攻擊；(穩(wěn)定表達HCV核心蛋白)；以及4)用重組NS5蛋白腹膜接種三次，并被SP2/NS5-21細胞攻擊的動物該發(fā)明的優(yōu)選例描述根據(jù)本發(fā)明，提供了對HCV感染進行預(yù)防性/或治療性免疫，或治療個體的方法。重組核酸分子被接種入個體內(nèi)，該重組核苷酸分子包含編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白，如NS3,NS4，或NS5，或它們的組合的核苷酸編碼序列。由該重組核酸基因構(gòu)建物編碼的蛋白由個體的細胞表達，并作為免疫原性靶子，誘導(dǎo)針對它的抗HCV的免疫應(yīng)答。引起的免疫應(yīng)答是廣泛的，除體液免疫應(yīng)答外，細胞免疫的兩個途徑都被激活。該發(fā)明的方法可用來賦予預(yù)防性和治療性免疫力。該發(fā)明的方法除用于人類外，亦可用于哺乳動物以進行生物醫(yī)學(xué)研究。因此，該發(fā)明的方法既可用于個體免疫抵抗HCV攻擊，亦可用于治療HCV感染個體。
本文所用的詞組“HCV非結(jié)構(gòu)蛋白”是指HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3,NS4和NS5，以及它們的等價物。等價蛋白包括保留本文所述的生物活性的NS3,NS4和NS5肽鏈片段。此外，術(shù)語HCV非結(jié)構(gòu)蛋白意指相應(yīng)的來自其它的HCV分離物，(序列上可能有變化)的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白。該領(lǐng)域一般技術(shù)人員能容易的鑒定其它HCV分離物的非結(jié)構(gòu)蛋白。需理解的是，當編碼相同的氨基酸時，密碼子中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而產(chǎn)生的保守的氨基酸取代時，核苷酸的變換也是可被接受的。需理解的是，詞組“HCV非結(jié)構(gòu)蛋白”也包括了融合蛋白，該融合蛋白包括非結(jié)構(gòu)蛋白，以及它的治療和預(yù)防性的活性片段。
本文所用的詞組“基因構(gòu)建物”指包含編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列的重組核酸分子，以及起始和終止信號，它們和包括啟動子、聚腺苷酸化信號，能指導(dǎo)在疫苗接種個體細胞中表達的調(diào)控元件可操作性相連。在某些實施例中，基因構(gòu)建物更包含有增強子，Kozak序列(GCCGCCATG；SEQ IDNO:1)，和至少一個HCV5’UTR片段。
本文所用的詞組“基因疫苗”指包括有一個基因構(gòu)建物的藥物制劑?；蛞呙绨杏糜诖碳CV的預(yù)防性和/或治療性免疫應(yīng)答的藥物制劑。
本文所用的詞組“核酸”指DNA,RNA，或由它們形成的嵌合體。
根據(jù)本發(fā)明，將基因構(gòu)建物引入個體細胞中并在其中表達，從而產(chǎn)生至少一種HCV非結(jié)構(gòu)蛋白。更好的是，本發(fā)明的基因構(gòu)建物的調(diào)控元件能指導(dǎo)哺乳動物細胞中的表達，尤其是人類細胞中的表達。該調(diào)控元件包括啟動子和聚腺苷酸信號。此外，其它元件，如增強子和Kozak序列，亦可包含在基因構(gòu)建物中。
當被細胞攝取后，本發(fā)明的基因構(gòu)建物可以在細胞中作為染色體外功能性分子存在或整合入細胞的染色體DNA中。核酸，例如DNA，可以被引入細胞，在細胞中以質(zhì)粒的形式作為獨立的基因材料存在。另外，可以整合到染色體中的線狀核酸分子也可導(dǎo)入細胞。當將核酸引入細胞時，可加入促進核酸整合到染色體上的試劑。在DNA分子中亦可加入有助于促進整合的DNA序列。此外，RNA也可以接種入細胞。也可考慮將基因構(gòu)建物以線狀微型染色體包括著絲粒、端粒和復(fù)制起始點的形式提供。
根據(jù)本發(fā)明，基因構(gòu)建物包含具有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列的重組核酸分子。在一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包括了編碼NS3的核苷酸編碼序列。在另一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包括了編碼包括NS4在內(nèi)的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列。在另一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包括了編碼包括NS5在內(nèi)的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列。在另一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包括了編碼包括NS3,NS4，和NS5在內(nèi)的任一HCV非結(jié)構(gòu)蛋白組合的核苷酸編碼序列。
在一些優(yōu)選例中，該重組核酸分子包括了編碼包括HCV NS3,NS4,NS5蛋白的片段或它們的組合的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列。這些片段包括，但不限于，含有相應(yīng)非結(jié)構(gòu)蛋白的10,25,50,75,100,150,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950，或1000個氨基酸的片段。此外，這些片段可以包含蛋白羧基端一部分、胺基端一部分、或它們兩者之間的任一部分。該領(lǐng)域技術(shù)熟練的研究人員可以容易地制備HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫原性片段、或含有任一組合的非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫原性片段的融合蛋白。因此，可以考慮，使含有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列的重組核酸分子含有比整個HCV非結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物少的序列，而基本上不改變疫苗效率。還可考慮，在該核苷酸編碼序列中替換至少一個或多個核苷酸而不影響該蛋白的氨基酸序列。此外還可考慮可在整段蛋白中制造至少一個或多個保守性的氨基酸替代，而不實質(zhì)減弱HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫原性的活力。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包含具有HCV5’UTR最后9個核苷酸，HCV5’UTR最后25個核苷酸，HCV5’UTR最后50個核苷酸，HCV5’UTR最后75個核苷酸，HCV5’UTR最后100個核苷酸，HCV5’UTR最后150個核苷酸，HCV5’UTR最后200個核苷酸，HCV5’UTR最后250個核苷酸，以及HCV5’UTR最后300個核苷酸的5’UTR片段。在一些優(yōu)選例中，基因構(gòu)建物含有整個HCV5’UTR。在一些優(yōu)選例中，基因構(gòu)建物含有HCV5’UTR的最3’端的9個核苷酸。一個優(yōu)選例中的整個HCV5’UTR是GCCAGCCCCC GATTGGGGGC GACACTCCAC CATAGATCAC TCCCCTGTGA GGAACTACTGTCTTCACGCA GAAAGCGTCT AGCCATGGCG TTAGTATGAG TGTCGTGCAG CCTCCAGGACCCCCCCTCCC GGGAGAGCCA TAGTGGTCTG CGGAACCGGT GAGTACACCG GAATTGCCAGGACGACCGGG TCCTTTCTTG GATCAACCCG CTCAATGCCT GGAGATTTGG GCGTGCCCCCGCGAGACTGC TAGCCGAGTA GTGTTGGGTC GCGAAAGGCC TTGTGGTACT GCCTGATAGGGTGCTTGCGA GTGCCCCGGG AGGTCTCGTA GACCGTGCAC C (SEQ ID NO:2)DNA分子的基因表達所需的調(diào)控元件包括啟動子，初始密碼子，終止密碼子，聚腺苷酸信號。此外，基因表達常需增強子。這些元件需和編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的的序列可操作性連接，還需要在接種的個體中具操作性。起始密碼子和終止密碼子通常被視為編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列的一部分。
使用的啟動子和聚腺苷酸信號必須在個體細胞中具有功能性。為使蛋白的生產(chǎn)達到最大，可選擇給予該構(gòu)建物的細胞中非常適合基因表達的調(diào)控元件。此外，可選擇能在細胞中最有效轉(zhuǎn)錄的密碼子。在本領(lǐng)域具有一般技能的研究人員能構(gòu)建在哺乳動物，尤其是人類細胞中具有功能性的DNA構(gòu)建物。
用于實現(xiàn)本發(fā)明的啟動子的實例，尤其是生產(chǎn)人類用的基因疫苗的啟動子的實例，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)的啟動子，鼠乳房瘤病毒(MMTV)的啟動子，人類免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV的長最后重復(fù)序列(LTR)的啟動子，白血病(moloney)病毒，ALV(禽白血病(moloney)病毒)，巨細胞病毒(CMV)，如CMV的立即早期啟動子，EB病毒(EBV),Rous肉瘤病毒(RSV)，以及來自人類基因的啟動子，如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血色素、人肌酸素以及人金屬硫蛋白的啟動子。
用于實現(xiàn)本發(fā)明的聚腺苷酸信號的實例，尤其是生產(chǎn)人類用的基因疫苗的聚腺苷酸信號的實例，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)和LTR的聚腺苷酸信號。具體使用的SV40聚腺苷酸信號是在pCEP4質(zhì)粒(Invitrogen,SanDiego CA)中的SV40聚腺苷酸信號。除基因表達所需的調(diào)控元件外，在基因構(gòu)建物中還可含有其它的元件。這些其它的元件包括增強子。增強子可從下列組中選擇但不限于人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血色素、人肌酸素以及病毒增強子如CMV,RSV和EBV的增強子。
可向基因構(gòu)建物提供哺乳動物復(fù)制起始點，以使之保持染色體外的狀態(tài)，從而在細胞中產(chǎn)生此構(gòu)建物的多個拷貝。質(zhì)粒pCEP4,pREP4(San Diego,CA)包含有EB病毒的復(fù)制起始點和無需整合，能產(chǎn)生高拷貝游離型復(fù)制的核酸抗原EBNA-1編碼區(qū)。
接種途徑包括，但不限于肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，真皮內(nèi)，皮下，靜脈注射，動脈內(nèi)，眼內(nèi)和口服，以及透皮或采用吸入法或栓劑。優(yōu)選給藥途徑包括肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，真皮內(nèi)和皮下注射。在采用和粘膜免疫力相關(guān)組織中存在的物質(zhì)免疫接種后，編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的基因構(gòu)建物的輸送能賦予粘膜免疫力。因此，在一些實施例中，此基因構(gòu)建物通過在個體口腔中的口腔前庭接種來輸送。
基因構(gòu)建物可通過包括，但不限于傳統(tǒng)注射，無針注射設(shè)備，或“顯微粒子轟擊基因槍”(microprojectile bombardment gene guns)給予。此外，基因疫苗亦可用多種方法導(dǎo)入從個體上取出的細胞中。這些方法包括比如，體外轉(zhuǎn)染，電穿孔法，顯微注射以及顯微粒子轟擊。在基因構(gòu)建物被細胞攝取后，可將細胞重新植回個體?？煽紤]，本來無免疫原性的細胞摻入了基因構(gòu)建物后可以植入個體，即使被接種的細胞原來來自另一個個體。
根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選例，基因構(gòu)建物采用無針注射器接種入個體。根據(jù)另一些優(yōu)選例，基因構(gòu)建物同時用無針注射器通過真皮內(nèi)，皮下注射和肌肉注射來接種入個體。無針注射器是廣為人知并廣泛可得的。該領(lǐng)域的一般技術(shù)人員能夠按照本文的指導(dǎo)，用無針注射器來將基因物質(zhì)傳遞給個體的細胞。無針注射器非常適合向所有的組織傳遞基因物質(zhì)。它們尤其對相皮膚和肌肉細胞傳遞遺傳物質(zhì)有效。在一些優(yōu)選例中，無針注射器可以用來將含有DNA分子的液體推至個體的皮膚表面。該液體以足夠的速度推動，由于對皮膚的沖擊力，液體穿透皮膚表面，滲入到下面的皮膚和肌肉組織。因此，基因構(gòu)建物同時被接種入真皮，皮下和肌肉。在一些優(yōu)選例中，為了向器官細胞引入核酸分子，無針注射器可用來將基因物質(zhì)傳遞給其它器官的組織。
根據(jù)本發(fā)明，基因疫苗含有1納克至1000毫克的核酸，宜選是DNA。在一些優(yōu)選例中，該疫苗含有10納克至大約800毫克的核酸。在一些優(yōu)選例中，該疫苗含有0.1至大約500毫克的核酸。在一些優(yōu)選例中，該疫苗含有1至大約350毫克的核酸。在一些優(yōu)選例中，該疫苗含有25至大約250毫克的核酸。在一些優(yōu)選例中，該疫苗含有大約100毫克的核酸。該領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能容易地配制所需量核酸的疫苗。
按照接種模式來配置本發(fā)明的基因疫苗。該領(lǐng)域中一般技術(shù)人員可以容易地配制含有基因構(gòu)建物的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包含有的編碼NS3,NS4，或NS5，或它們的組合的單一基因構(gòu)建物。另外，本發(fā)明的藥物組合物包含有編碼NS3,NS4，或NS5，或它們的組合的多個基因構(gòu)建物。另外，本發(fā)明的藥物組合物包含有編碼NS3,NS4，或NS5的片段，或它們的組合的單一或多個基因構(gòu)建物。此外，本發(fā)明的藥物組合物包含編碼所有或任一NS3,NS4，或NS5蛋白片段的融合蛋白的單一基因構(gòu)建物。在某些例子中，等滲的配方被采用。通常，等滲添加劑可包括氯化鈉，葡聚糖，甘露糖醇，山梨醇和乳糖。在某些例子中，可采用等滲溶液例如磷酸緩沖液。穩(wěn)定劑包括凝膠和白蛋白。在一些優(yōu)選例中，在配方中添加血管收縮劑。本發(fā)明的藥物制備需是無菌無熱源質(zhì)提供的。
本發(fā)明的基因構(gòu)建物可以用能提高基因構(gòu)建物的吸收和/或表達的藥劑配制或聯(lián)合接種，該藥劑本文稱為促進劑(facilitator)，它與基因構(gòu)建物的攝取和表達有關(guān)的細胞，以及當在缺少這些藥劑時接種相同的基因疫苗時出現(xiàn)的細胞有關(guān)。這些藥劑和將它們與基因構(gòu)建物聯(lián)合接種的方案在美國專利5,830,876,5,593,972,5,739,118和與1994年1月26日PCT專利申請系列號PCT/US94/00899中有描述。這類藥劑的例子包括CaPO4,DEAE，葡聚糖，脂質(zhì)，胞外基質(zhì)活性酶；皂角苷；凝集素；雌激素化合物和類固醇激素；羰化低級烷，二甲基亞砜(DMSO)；尿素；苯甲酸酯酰替苯胺；脒；氨基甲酸乙酯和局部麻醉藥家族的鹽酸鹽。此外，基因構(gòu)建物可包裹在脂質(zhì)/聚陽離子復(fù)合物中或與該復(fù)合物聯(lián)合接種。一種優(yōu)選的促進劑(facilitator)是丁哌卡因。這些組分可以方便的以單位劑量給予，并可用藥學(xué)領(lǐng)域中熟知的任何方法制備。例如Remington’s PhamaceuticalSciences(Mack Pub.Co.,Easton,PA,1980)，所描述的方法。該文公開的內(nèi)容全部納入本文作參考。
在實施例中，提供了以下的用編碼HCV三種不同非結(jié)構(gòu)蛋白的質(zhì)粒作DNA疫苗接種，顯示能刺激免疫系統(tǒng)二部分能強烈抗原特異性免疫應(yīng)答。三次免疫接種后，所有動物都產(chǎn)生了可檢測的抗體反應(yīng)。在這點上，這些非結(jié)構(gòu)蛋白和以前用結(jié)構(gòu)性HCV核心結(jié)構(gòu)蛋白的研究相比，是好得多的刺激體液免疫應(yīng)答的抗原。(Tokushige，等，Hepatology,1996,24,14-20；和Geissler，等，J.Immunol.,1997,158,1231-1237.)在優(yōu)選例中，對非結(jié)構(gòu)蛋白的體液免疫可以用加入能活化抗原遞呈細胞的化合物來增強，比如，表達細胞因子的質(zhì)粒，如IL-2和GM-CSF。(Geissler，等，J.Immunol.,1997,158,1231-1237；和Xiang,Immunity,1995,2,129-135.)所有的三種編碼NS3,NS4,NS5的質(zhì)粒都證明了產(chǎn)生了具有優(yōu)勢THI表型的炎癥性CD4+T細胞。此外，產(chǎn)生強而特異的CD8+CTL應(yīng)答主要是針對裂解病毒產(chǎn)生的NS3,NS5。以前已顯示能在動物模型系統(tǒng)中誘導(dǎo)抵抗各種病原體的保護力。(Tascon，等，Nat.Med.,1996,2,888-892；和Huygen，等，Nat.Med.,1996,2,893-898.)而且，要確定DNA疫苗產(chǎn)生的CTL應(yīng)答是否能保護動物，防止以編碼NS5蛋白的cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同系SP2/0腫瘤細胞的腫瘤形成。結(jié)果大約60％的小鼠受到保護避免了腫瘤形成，表明該免疫接種方式在體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的CTL活性，另外，與用模擬DNA或重組NS5蛋白免疫接種的動物相比，在患腫瘤的那些動物中，腫瘤重量顯著下降。這個模型也證明了在動物模型中評估抗黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的高水平細胞免疫應(yīng)答作為衡量抑制腫瘤生長的指標的能力。
本文公開的結(jié)果證明，用編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的基因構(gòu)建物來進行DNA為基礎(chǔ)的免疫接種，如本文所述，可用于患有HCV感染的個體的治療性處理，以及可用與抗HCV預(yù)防性疫苗。
本發(fā)明將通過以下實施例作進一步描述，以試圖闡明本發(fā)明。這些實施例并不意味，或被解釋成，限制所公開述的范圍。
實施例實施例1設(shè)計并構(gòu)建HCV表達載體將編碼單個非結(jié)構(gòu)蛋白的基因與采用工程改造后的起始和終止密碼子克隆入一表達質(zhì)粒，由CMV啟動子和RSV增強子(pAp031)驅(qū)動。包括選擇性標記的該表達載體(pcDNA3)也被用來產(chǎn)生穩(wěn)定的SP2/0轉(zhuǎn)染細胞系。(見圖1A)。
作為病毒基因的來源，采用命名為pBRTM/HCV1，覆蓋全長HCV開放閱讀框的質(zhì)?？寺∪氡景l(fā)明的表達載體中。(Grakoui，等，J.Viol.,1993,67,1385-1395)此文公開內(nèi)容全部納入本文以供參考。另外，編碼HCV的核酸序列可從基因文庫(GenBank)的登錄號X61596和D16435來獲得，其公開內(nèi)容全部納入本文。構(gòu)建物pAp031-NS3,pAp031-NS4,pAp031-NS5是在插入了工程化的起始和終止密碼子以及限制性酶切位點后的PCR克隆，采用以下引物對NS3:5’-GGTCTAGATT GATGGCGCCC ATCACGGC-3’(XbaⅠ)(SEQ IDNO:3),5’-CACACGCGTT CACGTGACGA CCTCCAGGT-3’(MluⅠ)(SEQ ID NO:4),對于NS4:5’GGTCTAGATG AGCACCTGGG TGCTC-3’(XbaⅠ)(SEQ ID NO:5),5’-CCAGGATCCT CAGCATGGAG TGGTACA-3’(BamH1)(SEQ ID NO:6)，以及對NS5:5’-TCAGTCTAGA ATGTCCGGCT CCGGCTCCTG GCTAAGGGA-3’(XbaⅠ)(SEQ ID NO:7),5’-AGCTACGCGT TCACCGGTTG GGGAGGAGGT-3’(MluⅠ)(SEQ ID NO:8)。在使用高精度的PCR系統(tǒng)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)進行PCR擴增后，將cDNA片段插入含有RSV增強子元件的質(zhì)粒表達載體pAp031中，由CMV啟動子(Apollon,Malvern,PA)驅(qū)動。使構(gòu)建物在DH5α細胞中生長，而后質(zhì)粒DNA用2x氯化鈰離心或使用無內(nèi)切酶的緩沖液系統(tǒng)(Santa Clara,CA)的Qiagen Giga試劑盒純化。非結(jié)構(gòu)基因的插入物的檢驗可用標準方法來進行序列分析。
要建立作為CTL試驗的靶細胞的NS3,NS4,NS5的穩(wěn)定表達細胞系，將非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因片段克隆入帶有新霉素選擇性標記的pcDNA3和pcDNA3.I Zeo(-)表達載體中(Invitrogen,San Diego)。首先，NS3和NS5的XbaⅠ和MluⅠ片段被亞克隆至Litmus-38載體(New,England Biolabs,MA)的NheⅠ/MluⅠ位點，然后用EcoRⅠ和SalⅠ切開，分別重新連接入pcDNA3和pcDNA3.I Zeo(-)的EcoRⅠ/XhoⅠ多重克隆位點。含有NS4的XbaⅠ和BamH1片段被重新連接入Litmus-20(New,England Biolabs)，用KpnⅠ和EcoRⅠ再次切開，然后重新連入pcDNA3載體。質(zhì)粒被命名為pcDNA3-NS3,pcDNA3-NS4和pcDNA3.1/Zeo(1)-NS5。
該領(lǐng)域技術(shù)人員，若有編碼任一HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA順序，就能設(shè)計引物來制備本發(fā)明的任一基因構(gòu)建物。另外，可進行核苷酸堿基替代，而不影響引物的結(jié)合。另外，為了克隆或連接目的，可制備帶有內(nèi)切核酸酶限制性位點的引物，已為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知道。因此該領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能通過設(shè)計適當?shù)囊?，并進行PCR擴增來制備本發(fā)明的基因構(gòu)建物。將PCR產(chǎn)物連入一表達載體中。
包含HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列的質(zhì)粒如上所述，將各自含有的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列置于CMV啟動子和RSV增強子元件的轉(zhuǎn)錄控制下。
實施例2體外表達測定此質(zhì)粒構(gòu)建物橫跨基因插入物的序列，分別在體外瞬時轉(zhuǎn)染后的HuH-7細胞中，和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的SP2/0靶細胞中確認蛋白質(zhì)的表達。發(fā)現(xiàn)NS3為70,NS4為30，而NS5為125kD的蛋白條帶在細胞內(nèi)被表達，但未分泌入培養(yǎng)基。
對HuH-7人肝癌細胞系，通過磷酸鈣方式以多種構(gòu)建物瞬時轉(zhuǎn)染，以評估HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的表達水平。簡單的說，用35硫-甲硫氨酸和半胱氨酸以代謝法標記4小時后，以改良過的RIPA緩沖液(0.15M NaCl,1％NP-40,50mMTris,0.5％DOC和1％SDS)配制細胞裂解液。細胞裂解液先用馬血清預(yù)澄清，然后，通過與多克隆抗血清WU 110(NS3),W148/151(NS4)和WU 115(NS5)預(yù)溫育過夜使之與瓊脂糖凝膠A結(jié)合。(Grakoui，等，J.Virol.,1993,67,1385-1395，全部納入本文以供參考)在用SDS-PAGE分離蛋白后，將電泳膠晾于，然后放射自顯影。NS5蛋白表達亦可用蛋白印跡和用鼠單克隆抗體進行免疫熒光分析來確定(Biogenesis,Sandown,NH)。要產(chǎn)生表達NS3,NS4和NS5的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，用含有感興趣的病毒基因插入物的pcDNA3質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染同系的BALB/c小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0。將在G418選擇下能生長的細胞用有限稀釋(0.3細胞/孔)法克隆，并用上述的方法篩選。
pcD3和pcD3.1質(zhì)粒分別含有新霉素或葉霉素(Zeomycin)抗性基因，被用來克隆HCV非結(jié)構(gòu)基因和產(chǎn)生穩(wěn)定的同系的靶細胞系。用這些構(gòu)建物瞬時轉(zhuǎn)染HuH-7細胞，并用β-半乳糖苷酶試驗控制轉(zhuǎn)化效率后，在無甲硫氨酸和胱氨酸的培養(yǎng)基中饑餓細胞30分鐘，并用35硫-甲硫氨酸和胱氨酸標記4小時。用對非結(jié)構(gòu)蛋白特異性的多克隆兔血清免疫沉淀細胞裂解物，使之被瓊脂糖凝膠A珠捕獲，用SDS-PAGE電泳，然后放射自顯影分析。1,3,5泳道是模擬DNA轉(zhuǎn)染的細胞，作為陰性對照(模擬)。2,4和6顯示了約NS3 70,NS4 30,NS5 125kD的特異性條帶。(7-10泳道)SP2/0細胞被pcD3為基礎(chǔ)的含有NS3,NS4和NS5的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染，在抗生素選擇后，將細胞經(jīng)有限稀釋(0.3細胞/孔)法克隆，擴增，用放射性標記或免疫沉淀對NS3分析，或如上所述用蛋白印跡法對NS5進行分析。第7和第9泳道代表作為陰性對照(SP2-19)的穩(wěn)定表達HCV-核心蛋白的細胞中得到的細胞裂解液，8和10泳道為NS3和NS5的特異表達。這些細胞被用作體外刺激和作為CTL試驗的靶細胞。
實施例3免疫方案雌性BALB/c(h-2d)小鼠在標準無病原體條件下在麻省總醫(yī)院(Massachusertts General Hospital)的動物設(shè)施中培養(yǎng)。小鼠從CharlesRiver實驗室(Wilmington,MA)獲得，在6至20周齡時用于體內(nèi)研究。將總量為100μg的質(zhì)粒DNA(以100μl的0.9％的氯化鈉溶液配制)注射2和3次，在5個不同位點上注射入小鼠的股四頭肌。每隔14天，在另一條腿上加強注射。作為所有免疫學(xué)實驗的陽性對照，將5μg的配于完全弗氏佐劑(CFA)的重組NS3,NS4，和NS5非結(jié)構(gòu)蛋白(Mikrogen,Munich)在第0日經(jīng)腹膜注射入小鼠，并用等量的以0.05％的SDS配的蛋白在4周和8周后作加強注射。作為這些實驗的陰性對照，使用空白質(zhì)粒載體和重組的乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)(Energix,Smith Kline Beecham,Philadelphia)。所有小鼠在最后一次免疫后10日后被處死。
實施例4體液免疫應(yīng)答的測定用已建立的ELISA法測定每只免疫動物血清中的抗NS3,NS4和NS5的抗體水平。簡單的說，用上述的重組蛋白包裹微量滴定板(Falcon,MicrotestIIIM Flexible Assay Plate),4℃過夜。(0.5μg/孔)。20℃用胎牛血清封閉2小時后，在板中加入1∶50的鼠血清，20℃培養(yǎng)另一小時。用含有0.05％的Tween-20的磷酸緩沖液(PBS)洗滌4次后，加入1∶2000稀釋度的，用辣根過氧化物酶標記的抗鼠抗體(Amersham,Arlington Heights,IL)。培養(yǎng)1小時后，洗滌滴定板，加入底物顯色，在自動閱讀機上讀數(shù)。
三次免疫接種后，用ELISA試驗在所有免疫動物中發(fā)現(xiàn)了針對所有3種非結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體反應(yīng)。用模擬DNA(見圖2A)免疫的小鼠中未檢測到抗原特異性免疫應(yīng)答。作為陽性對照，小鼠用與完全弗氏佐劑(CFA)結(jié)合的重組NS3,NS4和NS5非結(jié)構(gòu)蛋白三次腹腔內(nèi)接種后，如預(yù)料的，顯示了強烈的體液免疫應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖2A顯示了對以DNA為基礎(chǔ)的免疫產(chǎn)生的對NS3,NS4和NS5的體液免疫應(yīng)答。用ELISA法(每組n=5)測定血清抗體水平。對照包括用BSA和模擬免疫小鼠的血清包裹的孔。作為陽性對照的小鼠用重組蛋白腹膜內(nèi)免疫(數(shù)據(jù)未顯示)。圖2B顯示在用特異性或非特異性的重組蛋白體外刺激3日后測定的T細胞增殖情況。細胞與H3-胸苷一起培育18小時然后收集。Δcpm用扣除背景活性(如不加抗原培養(yǎng))的方法測定。和1μg的重組NS3蛋白培育的細胞有毒性，因此未見增殖。用和CFA聯(lián)合的重組蛋白免疫的小鼠有5到10倍的更強反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例5淋巴細胞增殖以及細胞因子釋放分析用異氟烷(Aerrane,Anaquest,NJ)麻醉小鼠，并收集脾細胞。用0.83％的NH4Cl/0.17M Tris pH7.4,25℃培養(yǎng)5分鐘，以除去紅細胞。脾細胞洗滌兩次，用96孔圓底滴定板以每孔5×105細胞，200μl含有10％FBS和2-巰基乙醇的完全DMEM(極限必須培養(yǎng)基)(Mediatech,Washington,DC)一式3份培養(yǎng)。用重組非結(jié)構(gòu)蛋白(NS3,NS4和NS5)(Mikrogen,Munich)在不同濃度下0,0.01,0.1和1μg/ml)刺激。作為陰性對照，用重組HCV-核心蛋白或HbsAg蛋白(Energix)在相同濃度下刺激效應(yīng)細胞。在刺激3日后，加入3H-胸苷(1μgCi/孔)。再培養(yǎng)細胞18小時，收集后測定摻入DNA的3H-胸苷。摻入的放射活性用背景活性修正(Δcpm)。為檢測細胞因子的釋放，將效應(yīng)細胞按上述培養(yǎng)，用商業(yè)試劑盒按照廠商說明(Endogen,Boston,MA)測定培養(yǎng)上清液中的IL-2,IL-4以及干擾素γ水平。
為了檢查對非結(jié)構(gòu)蛋白的細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，收集脾細胞并用重組抗原或用體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系表達的抗原再刺激。如用3H-胸苷摻入法所測定(見圖2B)的那樣，不同抗原濃度的所有非結(jié)構(gòu)蛋白都誘導(dǎo)了實質(zhì)性的淋巴細胞增殖。用重組蛋白腹膜免疫，作為產(chǎn)生最大刺激的方法，對所有三種蛋白產(chǎn)生了強至5到10倍的淋巴細胞增殖速率(數(shù)據(jù)未顯示)。DNA為基礎(chǔ)的免疫后測定的細胞因子分布圖顯示具有高水平y(tǒng)-干擾素(圖2C)和IL-2(圖2D)分泌入細胞培養(yǎng)基的T1應(yīng)答。相反的，在用編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的基因進行基因免疫后，只檢測到很少的IL-4產(chǎn)生(圖2E)。
圖2C,2D以及2E顯示了體外刺激48小時后檢測到的分泌入培養(yǎng)上清液中的細胞因子。編碼NS3,NS4和NS5的DNA構(gòu)建物誘導(dǎo)了TH1-型的細胞因子分布。為了比較，顯示了用重組蛋白(n=4)腹膜免疫小鼠三次的結(jié)果。作為陰性對照，用重組HbsAg免疫小鼠。
實施例6細胞毒T-淋巴細胞活性將免疫小鼠脾細胞以含有10％FCS和2-巰基乙醇的完全DMEM懸浮(5×10-5M)并在體外刺激5日后分析細胞毒活性。以5U/ml的濃度一次加入重組小鼠IL-2，將反應(yīng)細胞(4×107)與2×106個經(jīng)照射的(10,000rad)同系的穩(wěn)定表達全長NS3或NS5蛋白(SP2/NS3-3,SP2/NS5-21)的SP2/0細胞共培養(yǎng)。5日后，收集細胞毒效應(yīng)淋巴細胞群，用51Cr標記的SP2/NS3-3或SP2/NS5-21，在96孔圓底滴定板中進行4小時51Cr釋放試驗。親代SP2/0或表達HCV核心蛋白的SP2-19被用作裂解液的抗原特異性和背景活性的對照。CTL活性試驗以效應(yīng)淋巴細胞對靶細胞(E∶T)分別為100∶1,30∶1,10∶1以及3∶1的比例進行。用含有雜交瘤上清液GK1.5(抗CD4，大鼠)；3.155(抗CD8，大鼠)的抗CD4+或CD8+單克隆抗體，在4℃，培育效應(yīng)細胞30分鐘，洗滌，然后37℃與補體(1∶5稀釋度的低毒性兔補體(Cedarlane Laboratories,Ontario,Cananda))一起培育，進行T細胞缺損試驗。
由于CTL應(yīng)答是從感染細胞中消除病毒，因此用51Cr釋放實驗來分析免疫小鼠脾細胞裂解穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達NS3和NS5蛋白的同系SP2/0小鼠骨髓瘤靶細胞的能力。體外刺激5日后，NS3和NS5免疫的小鼠顯示了強而特異性的細胞毒T細胞應(yīng)答，而對作為靶細胞特異性對照的SP2/0或SP2-19(穩(wěn)定表達HCV核心蛋白)只觀察到低活性(表3A和表3B)。為說明產(chǎn)生特異性裂解的細胞的表型，將脾細胞和CD8+或CD4+反應(yīng)活性的單克隆抗體(mAbs)在補體存在下共培養(yǎng)，CD8+細胞介導(dǎo)的細胞毒活性見表3C。我們無法建立穩(wěn)定表達NS4蛋白的SP2/0細胞系，因此對該HCV非結(jié)構(gòu)蛋白未測量CTL活性。
圖3顯示了細胞毒T細胞(CTL)在不同的效應(yīng)細胞對靶細胞的比例(100∶1,30∶1,10∶1,3∶1)的情況下對NS3(A)和NS5(B)的反應(yīng)。脾細胞與被照射的穩(wěn)定的NS3和NS5表達的小鼠骨髓瘤細胞在體外共培養(yǎng)5天(n=5)。然后，進行4小時51Cr釋放實驗來測定對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的靶細胞系的CTL活性?？鄢龑P2/0或SP2-19(表達HCV核心蛋白)的背景活性以揭示特異性裂解值。圖3C顯示了T細胞缺損實驗(n=3)，將細胞與抗CD8+或CD4+單克隆抗體一起在冰上培育30分鐘，然后與補體37℃培育30分鐘。對照細胞不和補體以及抗CD8+或抗CD4+的單克隆抗體一起培育。測定了作為非相關(guān)陰性對照細胞系，即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了HCV核心蛋白表達構(gòu)建物的SP2-19細胞的背景活性。
實施例7體內(nèi)細胞毒T淋巴細胞活性的評估CTL實驗極難進行，因為直到現(xiàn)在也無人能夠建立用于CTL活性測定的，表達非結(jié)構(gòu)蛋白的穩(wěn)定細胞系。將小鼠用模擬DNA或pApNS5載體肌肉(i.m.)免疫三次。一些動物還用重組NS5蛋白或兩者的組合腹膜免疫。重組蛋白(5μg腹膜內(nèi)注射)作為NS5-4(aa2622-2868)和NS5-12(aa2007-2268)的大腸桿菌表達蛋白(Mikogen,Munich,Germany)，涵蓋了HCV-NS5a和HCV-NS5b部分區(qū)域(大約NS5全長的50％)的混合物提供。用多種質(zhì)粒構(gòu)建物或重組蛋白最后一次免疫的一周后，洗滌2×106的穩(wěn)定表達NS5的同系SP2/0衍生細胞，在200μl的PBS中重懸浮，并作右側(cè)皮下接種。SP2/0細胞表達HCV NS5(SP2/NS5-21)或HCV核心蛋白SP2/19。在這個動物模型中，在皮下接種15天后評價腫瘤形成，測定患腫瘤的動物數(shù)和腫瘤的重量。
只有40％的用模擬DNA免疫，并用表達NS5的小鼠骨髓瘤細胞系(SP2/NS5-21)攻擊的小鼠在15日后生成了腫瘤。另外，以腫瘤重量的測定來確定腫瘤的大小，與用模擬DNA或重組NS5蛋白免疫的小鼠，或用同樣的表達不同的HCV結(jié)構(gòu)蛋白(HCV核心蛋白)的，作為對照的同系SP2/0細胞系免疫的小鼠比較，腫瘤尺寸要小些(圖4A和4B)。事實上，90-100％的用模擬DNA免疫，并用SP2-19細胞攻擊的小鼠顯示出腫瘤的形成，因此顯示了在該小型動物模型中的CTL活性的特異性。強調(diào)用完全弗氏佐劑配的重組NS5蛋白來免疫不能保護動物避免形成腫瘤，這一點很重要。為了評估DNA為基礎(chǔ)的免疫和重組蛋白疫苗聯(lián)合的效果，用二者同時免疫一組動物，產(chǎn)生了防御存在對腫瘤形成的部分保護力，但這種方法不如用編碼NS5蛋白的DNA免疫動物三次那樣有效。
圖4A顯示用評價CTL活性的一種腫瘤模型獲得的代表性結(jié)果。小鼠用pApNS5或模擬DNA(100μg)肌肉注射，或用重組NS5蛋白腹膜內(nèi)注射(5μg)免疫三次。最后一組動物接受了聯(lián)合DNA免疫和重組蛋白。用SP2NS5-21或SP2-10細胞進行腫瘤攻擊15日后，長出腫瘤的小鼠的數(shù)量以及腫瘤的重量被測定。圖4B，自左至右，顯示了用模擬DNA免疫，并用SP2/NS5-21細胞攻擊的動物；用pApNS5免疫，并用SP2/NS5-21攻擊的動物；用pApNS5免疫，并用SP2-19(穩(wěn)定表達HCV核心)攻擊的動物；以及用重組NS5蛋白腹膜內(nèi)注射三次，并用SP2/NS5-21細胞攻擊的動物。在第一、三和第四組動物的右體側(cè)上有大腫瘤形成，而第二組沒有，它是用pApNS5免疫，并用穩(wěn)定表達NS5的小鼠骨髓瘤細胞系攻擊的。
序列表<110>Wands,Jack R.
Encke,Jens<120>采用丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白進行的基因免疫<130>mgh-0002<140>未指定<141>1999-01-28<150>60/073,156<151>1998-01-30<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列的描述合成序列<400>1gccgccatg 9<210>2<211>341<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列的描述合成序列<400>2gccagccccc gattgggggc gacactccac catagatcac tcccctgtga ggaactactg 60tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac 120cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag 180gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc 240gcgagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg 300gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac c 341<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列的描述合成序列<400>3ggtctagatt gatggcgccc atcacggc 28<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列的描述合成序列<400>4cacacgcgtt cacgtgacga cctccaggt29<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列的描述合成序列<400>5ggtctagatg agcacctggg tgctc25<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列的描述合成序列<400>6ccaggatcct cagcatggag tggtaca 27<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列的描述合成序列<400>7tcagtctaga atgtccggct ccggctcctg gctaaggga39<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><220><223>人工序列的描述合成序列<400>8agctacgcgt tcaccggttg gggaggaggt 30
權(quán)利要求
1．一種重組核酸分子，其特征在于，它包含編碼丙型肝炎非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。
2．如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其特征在于，所述非結(jié)構(gòu)蛋白選自包括NS3,NS4和NS5的組。
3．如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列編碼一種融合蛋白，該融合蛋白含NS3、NS4或NS5、或它們的組合。
4．如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列編碼選自包括NS3,NS4以及NS5的組群的非結(jié)構(gòu)蛋白的至少50個氨基酸的片段。
5．如權(quán)利要求2所述的重組核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列和人類細胞中有功能性的調(diào)控元件可操作性相連。
6．如權(quán)利要求5所述的重組核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列和啟動子、增強子、聚腺苷酸序列以及任選的丙型肝炎病毒5’UTR可操作性相連。
7．如權(quán)利要求6所述的重組核酸分子，其特征在于，所述啟動子是巨細胞病毒啟動子，所述增強子是Rous肉瘤病毒增強子。
8．一種包含權(quán)利要求1中所述核酸分子的重組宿主細胞。
9．一種藥物組合物，其特征在于，包含a)如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列和人類細胞中功能性的調(diào)控元件可操作性相連；以及b)藥物接受載體或稀釋劑。
10．如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述核苷酸序列編碼選自下組的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3,NS4和NS5。
11．如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述核苷酸序列編碼一種融合蛋白，該融合蛋白含NS3、NS4或NS5、或它們的組合。
12．如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述核苷酸序列編碼選自NS3,NS4以及NS5的非結(jié)構(gòu)蛋白的至少50個氨基酸的片段。
13．如權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其特征在于，所述在人類細胞中的功能性調(diào)控元件包括啟動子、增強子、聚腺苷酸序列以及任選的丙型肝炎病毒5’UTR。
14．如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，所述啟動子是巨細胞病毒啟動子，所述增強子是Rous肉瘤病毒增強子。
15．如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，它還包含促進劑。
16．如權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其特征在于，所述促進劑是丁哌卡因。
18．一種在未感染丙型肝炎病毒的人體中誘導(dǎo)對丙型肝炎病毒的免疫應(yīng)答的方法，其特征在于，該方法包括對所述人施用一定量的至少一種如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，該用量能有效誘導(dǎo)起對丙型肝炎病毒的免疫應(yīng)答。
19．如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述非結(jié)構(gòu)蛋白選自NS3,NS4和NS5。
20．如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列編碼一種融合蛋白，該融合蛋白含NS3、NS4或NS5、或它們的組合。
21．如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列編碼選自NS3,NS4以及NS5的非結(jié)構(gòu)蛋白的至少50個氨基酸的片段。
22．如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列和人類細胞中的功能性的調(diào)控元件可操作性相連。
23．如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述在人類細胞中有功能性的調(diào)控元件包括啟動子、增強子、聚腺苷酸序列以及任選的、丙型肝炎病毒5’UTR。
24．如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述啟動子是巨細胞病毒啟動子，其中所述增強子是Rous肉瘤病毒增強子。
25．如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括細胞應(yīng)答。
26．如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括體液應(yīng)答。
27．如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述重組核酸分子存在于包含有藥物接受載體或稀釋劑的藥物組合物里。
28．如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述藥物組合物還包含促進劑。
29．如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述促進劑是丁哌卡因。
30．一種對丙型肝炎病毒易感的人免疫的方法，其特征在于，該方法包括對所述人施用一定量的至少一種如權(quán)利要求9所稱的藥物組合物，其用量能有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
31．如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，在給予所述藥物組合物的部位給予丁哌卡因。
32．一種對丙型肝炎病毒易感的人免疫的方法，其特征在于，該方法包括對所述人施用一定量的如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其用量能有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
33．一種對感染丙型肝炎病毒的人進行治療的方法，其特征在于，該方法包括對所述人給予一定量的如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其用量能有效誘導(dǎo)對丙型肝炎病毒的治療性免疫應(yīng)答。
34．如權(quán)利要求33所述方法，其特征在于，在給予所述藥物組合物的部位給予所述人丁哌卡因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種編碼丙型肝炎非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸分子(包括具體公開的DNA序列)。還公開了藥物組合物,它包含編碼NS3、NS4和NS5,或它們組合的核苷酸序列的丙型肝炎非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸分子,該核酸分子和人體細胞內(nèi)功能性的調(diào)控元件可操作性相連。還公開了對丙型肝炎病毒易感或被感染的個體進行免疫的方法,該方法包括施用這些藥物組合物。
文檔編號A61K48/00GK1289339SQ99802481
公開日2001年3月28日 申請日期1999年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月30日
發(fā)明者J·萬德斯, J·恩克 申請人:總醫(yī)院有限公司