專利名稱：半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞膜和制備及應(yīng)用半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞膜的方法
有關(guān)政府基金的參考文獻(xiàn)此處描述的本發(fā)明是在國(guó)家衛(wèi)生研究所-國(guó)家癌癥研究所基金號(hào)CA-39248的許可或授權(quán)下的工作中進(jìn)行的。美國(guó)政府可具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
Fujiwara等人，免疫學(xué)雜志，1984132，1571表示，某些半抗原化的腫瘤細(xì)胞，即與半抗原三硝基苯(TNP)結(jié)合的腫瘤細(xì)胞，能在鼠系統(tǒng)中誘導(dǎo)對(duì)未修飾的腫瘤細(xì)胞的系統(tǒng)性免疫，只要該小鼠首先在無半抗原特異的抑制T細(xì)胞的情況下對(duì)該半抗原致敏。被治療小鼠的脾細(xì)胞在未治療的受者動(dòng)物中完全并特異地阻止了腫瘤的生長(zhǎng)。Flood等人，免疫學(xué)雜志，1987，138，3573顯示，用TNP結(jié)合的紫外線誘導(dǎo)的“退化”腫瘤加以免疫的小鼠能排斥TNP結(jié)合的“進(jìn)行性”腫瘤，這是非免疫性的。而且，這些小鼠隨后耐受未結(jié)合的“進(jìn)行性”腫瘤的攻擊。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，F(xiàn)ujiwara等人，免疫學(xué)雜志，1984，133，510證明，在環(huán)磷酰胺預(yù)處理后用三硝基氯苯(TNCB)致敏的小鼠通過對(duì)腫瘤細(xì)胞的原位半抗原處理能治愈較大(10mm)的腫瘤；隨后，這些動(dòng)物特異地耐受未結(jié)合的腫瘤細(xì)胞的攻擊。
Fujiwara等人的教導(dǎo)由于包括下列的幾個(gè)原因而不同于本發(fā)明A．Fujiwara的組合物中使用的細(xì)胞來源于誘導(dǎo)的可移植鼠腫瘤，而不是來源于自發(fā)的人類腫瘤；B．Fujiwara的組合物用于免疫預(yù)防，而本發(fā)明使用免疫治療；C．Fujiwara的組合物作為局部治療施用，而本發(fā)明的組合物通過全身接種施用；D．Fujiwara的組合物不引起腫瘤退化，而本發(fā)明的組合物至少在相當(dāng)一部分所治療患者中引起退化和／或使存活時(shí)間延長(zhǎng)；和E．Fujiwara施用腫瘤細(xì)胞，而本發(fā)明教導(dǎo)腫瘤細(xì)胞膜的施用。
最近證明了存在能與未修飾的組織交叉反應(yīng)的T細(xì)胞。Weltzien及同事顯示，從用TNP修飾的同源淋巴細(xì)胞免疫的小鼠中產(chǎn)生的I類MHC限制性T細(xì)胞克隆能應(yīng)答MHC相關(guān)的、TNP修飾的“自身”肽。Ortmann，B．等人，免疫學(xué)雜志，1992，148，1445。另外，已經(jīng)明確，用TNP修飾的淋巴細(xì)胞免疫小鼠引起可在體外顯示次級(jí)增殖反應(yīng)和對(duì)TNP修飾細(xì)胞有細(xì)胞毒性反應(yīng)的脾T細(xì)胞的發(fā)展。Shearer，G．M．，歐洲免疫學(xué)雜志，1974，4，527。由用DNP或TNP修飾的自體細(xì)胞免疫引起的、以應(yīng)答未修飾的自體細(xì)胞的淋巴細(xì)胞的潛能是相當(dāng)有意義的，因?yàn)檫@可能與兩種臨床問題有關(guān)1)藥物誘導(dǎo)的自身免疫病，2)癌癥免疫治療。對(duì)于前者，曾經(jīng)建議用口服藥作為半抗原，它與正常的組織蛋白質(zhì)結(jié)合形成可被T細(xì)胞識(shí)別的免疫復(fù)合物。Tsutsui，H．等人，免疫學(xué)雜志，1992，149，706。隨后，能發(fā)展為自身免疫病，例如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，甚至在取消不喜歡的藥物之后仍持續(xù)。這將意味著可與未修飾的組織交叉反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞的最終產(chǎn)生。
這些實(shí)驗(yàn)的共同特征是在不誘導(dǎo)抑制細(xì)胞的環(huán)境下用半抗原致敏。環(huán)磷酰胺預(yù)處理的、TNCB致敏的小鼠的脾細(xì)胞顯示抗輻射性“增強(qiáng)的輔助功能”，即，它們特異地增強(qiáng)抗TNP細(xì)胞毒性的體外產(chǎn)生。而且，一旦這些增強(qiáng)的輔助功能被體外接觸TNP結(jié)合的自體淋巴細(xì)胞所激活，則它們也能增強(qiáng)對(duì)非相關(guān)抗原包括腫瘤抗原的細(xì)胞毒性(Fujiwara等人，1984)。Flood等人(1987)，同上文，顯示這種增強(qiáng)的輔助活性由具有Lyt-1+、Lyt-2-、L3T4+、I-J+表型的T細(xì)胞所介導(dǎo)，并提出這些細(xì)胞是反抑制細(xì)胞，一種新類型的免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞。
對(duì)黑素瘤患者的免疫治療顯示，在用初級(jí)抗原匙孔戚血藍(lán)蛋白致敏三天前施用高劑量(1000mg／M2)或低劑量(300mg／M2)的環(huán)磷酰胺，顯著增強(qiáng)了對(duì)該抗原的遲發(fā)型過敏反應(yīng)的獲得(Berd等人，癌癥研究(Cancer Res．)，1982，42，4862；癌癥研究，1984，44，1275)。低劑量環(huán)磷酰胺預(yù)處理使轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者應(yīng)答自體黑素瘤疫苗注射，產(chǎn)生對(duì)自體黑素瘤細(xì)胞的遲發(fā)型過敏反應(yīng)(Berd等人，癌癥研究，1986，46，2572；癌癥研究，1988，6，335)。環(huán)磷酰胺施用導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞非特異性T抑制功能的降低(Berd等人，癌癥研究，1984，44，5439；癌癥研究，1987，47，3317)，這可能是由于耗貧了CD4+、CD45R+抑制誘導(dǎo)T細(xì)胞(Berd等人，癌癥研究，1988，48，1671)。該免疫治療方案的抗腫瘤作用似乎受開始施用疫苗與形成對(duì)腫瘤細(xì)胞的遲發(fā)型過敏反應(yīng)之間的過長(zhǎng)間隔所限制(Berd等人，美國(guó)癌癥研究學(xué)會(huì)學(xué)報(bào)(Amer．Assoc．Cancer Res．)，1988，29，408(#1626))。因此，仍需要提高這種疫苗的治療效率以使其更具免疫原性。
大多數(shù)腫瘤免疫學(xué)家現(xiàn)在贊同，T淋巴細(xì)胞-負(fù)責(zé)腫瘤免疫的白細(xì)胞-向腫瘤塊中的浸潤(rùn)是免疫系統(tǒng)破壞腫瘤的先決條件。因此，許多注意力已經(jīng)集中于已知如NCI的Stephen Rosenberg博士所開創(chuàng)的“TIL”治療。Rosenberg博士和其他人從人類轉(zhuǎn)移癌中提取出少量T淋巴細(xì)胞，這些T淋巴細(xì)胞天然存在，通過與白細(xì)胞介素2(IL2)-T淋巴細(xì)胞的一種生長(zhǎng)因子-一起體外培養(yǎng)能大大增加其數(shù)量。Topalian等人，臨床腫瘤學(xué)雜志(J．Clin．Oncol．)，1988，6，839。然而，這種治療還不是十分有效的，因?yàn)樽⑸涞腡細(xì)胞的能力僅限于向腫瘤部位的“回歸”。
在大量研究中在治療上利用了高濃度IL2誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞成為非特異性細(xì)胞毒性殺傷細(xì)胞的能力(Lotze等人，生物學(xué)反應(yīng)雜志(J．Biol．Response)，1982，3，475；West等人，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New Engl．J．Med．)，1987，316，898)。然而，由于高劑量靜脈內(nèi)IL2的強(qiáng)毒性，使該方法具有局限性。已將少量注意力投向以下現(xiàn)象，相當(dāng)?shù)蜐舛鹊腎L2能通過誘導(dǎo)抗原活化T細(xì)胞的擴(kuò)充而作為免疫佐劑(Talmadge等人，癌癥研究，1987，47，5725；Meuer等人，柳葉刀(Lancet)，1989，1，15)。因此，仍然需要理解并努力開發(fā)IL2作為免疫佐劑的用途。
據(jù)認(rèn)為，人類黑素瘤表達(dá)可被T淋巴細(xì)胞識(shí)別的獨(dú)特表面抗原。Old，L．J．，癌癥研究，1981，41，361；Van der Bruggen，P．等人，科學(xué)，1991，254，1643；Mukherji，B．等人，免疫學(xué)雜志，1986，136，1888；和Anichini，A．等人，免疫學(xué)雜志，1989，142，3692。然而，在體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)這些抗原的有效T細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的困難限制了在本發(fā)明人進(jìn)行工作之前的免疫療法。
提出了幾種模型來解釋似乎什么是對(duì)人類腫瘤相關(guān)抗原的耐受性。包括1)下調(diào)初期抗腫瘤反應(yīng)的腫瘤抗原特異性抑制細(xì)胞。Mukherji等人，同上文；Berendt，M．J．和R．J．North．，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J．Exp．Med．)，1980，151，69。
2)人類腫瘤細(xì)胞不能引發(fā)T輔助細(xì)胞或?yàn)檫@些T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)。Fearon，E．R．等人，細(xì)胞(Cell)，1990，60，397；Townsend，S．E．和J．P．Allison，科學(xué)，1993，259，368；和3)主要組織相容性產(chǎn)物在腫瘤細(xì)胞上降低的表面表達(dá)，這限制了其被T細(xì)胞的識(shí)別。Ruiter，D．J．，癌癥生物學(xué)研討會(huì)(Seminars in CancerBiology)，1991，2，35。這些假說中還沒有一個(gè)在臨床系統(tǒng)中證實(shí)。
無論這些解釋是否真實(shí)，仍繼續(xù)需要對(duì)多種惡性腫瘤的更有效治療。
對(duì)于急性骨髓性白血病(AML)，將AML的治療分為一個(gè)或兩個(gè)初期誘導(dǎo)階段和幾個(gè)緩解后過程，也稱為鞏固化學(xué)治療。初期誘導(dǎo)化學(xué)治療根據(jù)所用的方案可在55-88％的患者中誘導(dǎo)完全的應(yīng)答。然而，這些患者中的大多數(shù)復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期(5年+)存活的AML患者僅為20-30％。在第一次緩解期間在治療方案中加上高劑量化學(xué)治療和骨髓移植(BMT)結(jié)果能引起適度的改善。例如，經(jīng)受同種異體BMT的患者在5年存活率上有5-10％的增長(zhǎng)。然而，BMT的嚴(yán)格合格標(biāo)準(zhǔn)(例如年齡、HLA匹配供體的可獲得性)嚴(yán)重限制了可治療的患者的數(shù)量。一旦AML患者復(fù)發(fā)，只有30％的機(jī)會(huì)實(shí)現(xiàn)第二次緩解，并且極少患者能最后成為無病的。對(duì)復(fù)發(fā)的治療形式包括與實(shí)現(xiàn)第一次緩解所用的類似的方案(誘導(dǎo)治療，隨后是幾個(gè)療程的鞏固化學(xué)治療)，盡管也能使用高劑量的單一藥劑和BMT(Keating等人)。
骨髓移植方面的經(jīng)驗(yàn)提示，免疫排斥可能在疾病的控制中起作用。移植物抗宿主疾病(GVHD)和復(fù)發(fā)是用BMT治療的患者死亡的兩個(gè)主要原因。如果發(fā)生弱的GVHD，則復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)降低(Horowitz等人)。因此曾經(jīng)假定移植的淋巴細(xì)胞能夠免疫排斥宿主白血病細(xì)胞(移植物抗白血病反應(yīng)，GVL)。對(duì)特定白血病細(xì)胞抗原的T細(xì)胞反應(yīng)能介導(dǎo)該GVL反應(yīng)，盡管免疫原性人白血病抗原尚未得到證明(對(duì)于黑素瘤同樣如此)。已知人AML細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)Ⅰ類和Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原(Ashman等人；Andreasen等人)，這是分別誘導(dǎo)CD8-和CD4-介導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)的先決條件。然而，針對(duì)白血病細(xì)胞的T細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)尚未成功。
有幾種免疫學(xué)方法曾用于急性白血病的治療(Foon等人；Caron和Scheinberg)。這些方法分為非特異的方法，如卡介苗(BCG)、白細(xì)胞介素2、左旋咪唑、結(jié)核桿菌的甲醇抽提殘余物；和特異性的方法，如單克隆抗體和疫苗(收集的白血病細(xì)胞、無細(xì)胞提取物和培養(yǎng)的細(xì)胞)。這些研究中的大多數(shù)在已經(jīng)緩解的患者中進(jìn)行，其中免疫治療可成功用于控制剩余的疾病。
二十世紀(jì)六十年代后期和二十世紀(jì)七十年代早期，英格蘭St．Barthlomew醫(yī)院的R．Powles研究組進(jìn)行了一系列在化學(xué)治療誘導(dǎo)的緩解后用疫苗治療AML患者的研究(Powles，1974；Powles等人，1977)。他們使用同種異體AML細(xì)胞，以BCG作為佐劑。進(jìn)行了幾次試驗(yàn)，全部是小樣本容量(N=10-15)。與單獨(dú)的化學(xué)療法相比，使用化學(xué)療法與免疫療法的組合使存活期有所延長(zhǎng)，而無復(fù)發(fā)的存活不延長(zhǎng)。未觀察到嚴(yán)重的毒性；未見自身免疫(例如，對(duì)正常骨髓的毒性)?；叵肫饋?，這些試驗(yàn)有許多技術(shù)問題1)使用同種異體的而不是自體的白血病細(xì)胞；2)疫苗中白血病細(xì)胞的劑量是過量的(高達(dá)109細(xì)胞／劑量)；3)BCG劑量極高，并且BCG施用被時(shí)間和白血病細(xì)胞疫苗的位置所分開；4)當(dāng)患者接受細(xì)胞毒性藥物時(shí)施用疫苗(維持或鞏固化學(xué)治療)。
上述治療的有限成功的免疫化學(xué)基礎(chǔ)還有待思考，但正在檢驗(yàn)幾種假說。Kim和Jang(1992)建議，對(duì)特定表位的T細(xì)胞反應(yīng)的缺乏可能不是由于T細(xì)胞所有成分的缺乏，而是由于產(chǎn)生特定表位的困難。Martin等人(1993)通過假定存在由于對(duì)“自身”肽親和力較低而可逃脫胸腺選擇的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，解釋了他們的結(jié)果。
治療人類癌癥的常規(guī)嘗試尚未成功。如上所述例舉的組合物的施用不能可靠地誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的發(fā)展，如遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)、T細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性免疫應(yīng)答所示。
因此，不管在癌癥治療中報(bào)道的基于免疫作用提出的多種理論的嘗試數(shù)量如何，仍需要一種組合物，其在施用于哺乳動(dòng)物后，能引發(fā)浸潤(rùn)腫瘤的T淋巴細(xì)胞、引發(fā)對(duì)腫瘤的炎性免疫應(yīng)答、并引發(fā)對(duì)腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。申請(qǐng)人現(xiàn)在已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，使用從同源或同種異體腫瘤細(xì)胞中分離的膜具有這些希望的特性。
一方面，本發(fā)明涉及一種分離的半抗原修飾的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選地為人)腫瘤細(xì)胞膜。該半抗原可選自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙?；?N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磷酰膽堿、磺胺酸、阿散酸和二硝基苯-S-芥及其組合。
另一方面，本發(fā)明涉及一種單獨(dú)含有半抗原修飾的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞膜或同時(shí)含有半抗原修飾的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞的組合物。
再另一方面，本發(fā)明提供一種含有治療有效量的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選地人)腫瘤細(xì)胞膜的疫苗組合物，用于向患有與該腫瘤細(xì)胞膜相同類型的惡性腫瘤的哺乳動(dòng)物施用。
本發(fā)明的另一方面，該組合物含有一種佐劑，如卡介苗、QS-21、脫毒的內(nèi)毒素和細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素4、γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素15和GM-CSF。
本發(fā)明的膜和組合物(當(dāng)對(duì)患有與分離該膜的腫瘤細(xì)胞相同類型惡性腫瘤的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選地人)施用時(shí))至少具有下列性質(zhì)之一(ⅰ)引發(fā)浸潤(rùn)所治療的哺乳動(dòng)物腫瘤的T淋巴細(xì)胞，(ⅱ)引發(fā)對(duì)該哺乳動(dòng)物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，(ⅲ)引發(fā)對(duì)該哺乳動(dòng)物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。本發(fā)明的膜和組合物也具有在體外刺激T細(xì)胞的性質(zhì)。
再另一方面，本發(fā)明涉及一種治療癌癥的方法，包括向哺乳動(dòng)物(優(yōu)選地人)施用一種含有治療有效量的半抗原修飾的人腫瘤細(xì)胞膜的組合物，其中該哺乳動(dòng)物患有與該腫瘤細(xì)胞膜相同類型的惡性腫瘤。
另外，本發(fā)明涉及一種方法，包括引發(fā)具有浸潤(rùn)該哺乳動(dòng)物(優(yōu)選地人)腫瘤的性質(zhì)的T淋巴細(xì)胞，和任選地，測(cè)定浸潤(rùn)該哺乳動(dòng)物腫瘤的T淋巴細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種方法，包括引發(fā)對(duì)該哺乳動(dòng)物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，和任選地，測(cè)定該炎性免疫應(yīng)答，或者涉及一種方法，包括引發(fā)對(duì)該哺乳動(dòng)物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，和任選地，測(cè)定該遲發(fā)型過敏反應(yīng)。本發(fā)明也涉及一種在體外刺激T細(xì)胞的方法。
在本發(fā)明的再另一方面，本發(fā)明涉及一種制備半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞膜的方法。發(fā)明詳述在此引用的所有專利、專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)都引入作為參考。如果出現(xiàn)矛盾，以本公開內(nèi)容為準(zhǔn)。
本發(fā)明涉及一種分離的修飾的和未修飾的腫瘤細(xì)胞膜、一種含有這種膜的新型組合物、分離和制備該膜和含有該膜的組合物的方法、和使用本發(fā)明的膜和組合物的方法。
本發(fā)明的膜和組合物可用于治療哺乳動(dòng)物優(yōu)選地人的癌癥，包括轉(zhuǎn)移和原發(fā)性癌癥、實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤，如直腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、腎癌和前列腺癌。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期癌癥可以用分離修飾的膜、本發(fā)明的組合物和方法來治療，優(yōu)選的是Ⅲ期和Ⅳ期，再更優(yōu)選的是Ⅲ期。患有前述類型的轉(zhuǎn)移癌的哺乳動(dòng)物，特別是人，可以用本發(fā)明的膜、組合物和方法治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明治療家畜如貓、犬、馬和牛科的成員。
本發(fā)明的膜和組合物也可用于引發(fā)具有浸潤(rùn)哺乳動(dòng)物腫瘤的性質(zhì)的T淋巴細(xì)胞，引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，和／或在體外刺激T淋巴細(xì)胞。
應(yīng)當(dāng)理解，本說明書中有關(guān)應(yīng)用分離的腫瘤細(xì)胞的任何公開內(nèi)容同樣適用于腫瘤細(xì)胞膜的應(yīng)用，或適用于腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜的組合。腫瘤細(xì)胞膜及其組合物本發(fā)明的分離的修飾的腫瘤細(xì)胞膜由哺乳動(dòng)物優(yōu)選地人的腫瘤細(xì)胞制備。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，從貓、犬、馬或牛科動(dòng)物的腫瘤中分離腫瘤細(xì)胞膜。
對(duì)于本發(fā)明，腫瘤細(xì)胞的定義中包括完整的和破裂的腫瘤細(xì)胞。分離膜的腫瘤細(xì)胞可以是活細(xì)胞、減毒細(xì)胞或被殺傷的細(xì)胞。本發(fā)明中能使用在對(duì)患者施用后不生長(zhǎng)和分裂從而基本上保持非生長(zhǎng)狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞。如果對(duì)患者單獨(dú)施用或與分離的腫瘤細(xì)胞膜結(jié)合施用，則這些細(xì)胞是優(yōu)選的。應(yīng)當(dāng)理解，“非生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞”意思是在體內(nèi)不分裂的活的、減毒的或被殺傷的、完整或破裂的(或者同時(shí)有完整和破裂的)細(xì)胞。懸浮非生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞的常規(guī)方法為技術(shù)人員所知，并可用于本發(fā)明。例如，可以在使用前照射細(xì)胞使其不能生長(zhǎng)和分裂。腫瘤細(xì)胞可以以例如2500R照射，以阻止細(xì)胞在施用后生長(zhǎng)。另外，也可從能在體內(nèi)生長(zhǎng)并分裂的腫瘤細(xì)胞中分離腫瘤細(xì)胞膜。優(yōu)選地，在該情況中，腫瘤細(xì)胞膜制品未被能在體內(nèi)分裂的腫瘤細(xì)胞所污染。
腫瘤細(xì)胞膜分離自與欲治療的癌癥相同類型的腫瘤細(xì)胞。例如，用于治療卵巢癌的膜分離自卵巢癌細(xì)胞。優(yōu)選地，腫瘤細(xì)胞來源于欲治療的同一患者。腫瘤細(xì)胞優(yōu)選地是與患者同源的(例如自體的)，但也可以是同種異體的。為定義為“同源的”，腫瘤細(xì)胞不需與所治療患者的腫瘤細(xì)胞或非腫瘤體細(xì)胞完全(即100％)遺傳學(xué)上相同。(分離出膜的)腫瘤細(xì)胞與患者之間的MHC分子遺傳同一性通常是充分的。另外，在用作膜來源的腫瘤細(xì)胞上的特定抗原與患者腫瘤細(xì)胞上存在的抗原之間可有遺傳同一性。遺傳同一性可以按照本領(lǐng)域公知的方法測(cè)定。同源的腫瘤細(xì)胞意思也可是一種經(jīng)遺傳改變(例如利用重組DNA技術(shù))而使其在例如患者特定MHC分子和／或患者癌細(xì)胞上特定抗原方面遺傳學(xué)上相同的細(xì)胞。也可使用來源于相同種的動(dòng)物而遺傳學(xué)上不同的腫瘤細(xì)胞，如同種異體細(xì)胞，制備本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞膜。腫瘤細(xì)胞可以是但不限于從活檢標(biāo)本或從組織培養(yǎng)物中分離的細(xì)胞。從同種異體細(xì)胞和干細(xì)胞分離的膜也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
腫瘤細(xì)胞膜可包括所有細(xì)胞膜，如外膜、核膜、線粒體膜、液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基復(fù)合體膜和溶酶體膜。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，超過大約50％的膜是腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜。優(yōu)選地，超過大約60％的膜由腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜組成，超過大約70％是更優(yōu)選的，80％是甚至更優(yōu)選的，90％是甚至更優(yōu)選的，95％是甚至更優(yōu)選的，99％是最優(yōu)選的。
優(yōu)選地，分離的膜基本上不含細(xì)胞核和細(xì)胞。例如，如果在大約2×108細(xì)胞當(dāng)量(c．e．)的膜物質(zhì)中含有少于大約100個(gè)細(xì)胞和／或細(xì)胞核，則膜制品為基本上不含細(xì)胞核或細(xì)胞。細(xì)胞當(dāng)量是從所示數(shù)量的細(xì)胞中分離的膜的數(shù)量?；旧喜缓?xì)胞和／或細(xì)胞核的分離的腫瘤細(xì)胞膜可以含有淋巴細(xì)胞和／或淋巴細(xì)胞膜。
優(yōu)選地，分離的腫瘤細(xì)胞膜是細(xì)胞外膜，即，腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜。本發(fā)明的膜制品可含有完整的外膜或其部分。含有一部分外膜的本發(fā)明分離的膜包含有外膜的至少一種MHC分子部分和／或一種熱激蛋白部分。膜片段的大小不是重要的。
同種異體腫瘤細(xì)胞膜也可在本發(fā)明的方法中與同源(例如自體)抗原呈遞細(xì)胞一起使用。該方法允許用來源于非患者自身腫瘤的腫瘤細(xì)胞膜來免疫患者。同源抗原呈遞細(xì)胞加工同種異體膜，使得患者的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)可對(duì)其應(yīng)答。
例如，可以用半抗原修飾分離的腫瘤細(xì)胞膜以及腫瘤細(xì)胞。這些修飾的腫瘤細(xì)胞膜(和腫瘤細(xì)胞)至少具有下列性質(zhì)之一(ⅰ)引發(fā)浸潤(rùn)所治療哺乳動(dòng)物的腫瘤的T淋巴細(xì)胞，(ⅱ)引發(fā)對(duì)該哺乳動(dòng)物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，以及(ⅲ)引發(fā)對(duì)該哺乳動(dòng)物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。修飾的腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞也具有在體外刺激T細(xì)胞的性質(zhì)。
本說明書中涉及的(修飾的或未修飾的)腫瘤細(xì)胞膜包括膜制品可以貯存或施用的任一形式，例如，重懸浮于稀釋劑中的膜、膜沉淀或冷凍的或凍干的膜。
本發(fā)明的膜可以在本發(fā)明的方法中單獨(dú)使用，或與其它化合物包括但不限于本發(fā)明的其它組合物一起使用。因此，腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜可以單獨(dú)使用或共同施用。對(duì)于本發(fā)明，共同施用包括同時(shí)和連續(xù)施用。此外，腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜可以與其它化合物，包括但不限于細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素4、γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素15和GM-CSF共同施用。本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜也可以與其它癌癥療法包括但不限于化學(xué)療法、放射療法、抗體療法和反義寡核苷酸療法結(jié)合使用。然而，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于它能單獨(dú)用作癌癥治療，使得不必需要其它治療。
本發(fā)明的組合物可含有本發(fā)明的分離的腫瘤細(xì)胞膜(修飾的或未修飾的)和一種藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑，如但不限于Hanks溶液、鹽水、磷酸緩沖鹽液、蔗糖溶液和水。通常，根據(jù)預(yù)期的施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐選擇藥學(xué)可接受的載體。有效成分與載體的比例自然取決于組合物的化學(xué)性質(zhì)、溶解度和穩(wěn)定性以及預(yù)計(jì)的劑量，并且能用本領(lǐng)域的常識(shí)優(yōu)化。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物是一種含有有效量的分離的修飾腫瘤細(xì)胞膜的疫苗組合物。對(duì)于本公開內(nèi)容，“有效量”是達(dá)到希望的結(jié)果所需的量。例如，在一種治療癌癥的方法中，“有效量”意思是分離的修飾腫瘤細(xì)胞膜的量，該量具有至少導(dǎo)致下列情況之一的性質(zhì)(ⅰ)引發(fā)浸潤(rùn)腫瘤的T淋巴細(xì)胞，(ⅱ)引發(fā)對(duì)腫瘤的炎癥反應(yīng)，(ⅲ)引發(fā)對(duì)腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)，和(ⅳ)腫瘤退化。同樣，在體外刺激T細(xì)胞的方法中，“有效量”是導(dǎo)致T細(xì)胞刺激的膜的量。
疫苗組合物可含有，例如，每劑量至少104c．e．分離的膜，優(yōu)選地至少105c．e．，最優(yōu)選地至少106c．e．。劑量是在單次施用中所施用的疫苗組合物的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗組合物含有每劑量約105-約2．5×107c．e．的膜。更優(yōu)選地約5×106c．e．。所用的本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜的量通常取決于如化合物對(duì)癌細(xì)胞的親和力、存在的癌細(xì)胞的量和組合物的溶解度等因素?？筛鶕?jù)患者的體重、臨床狀況設(shè)定劑量。
本發(fā)明的疫苗組合物可以包裝為適于皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)和皮下施用的劑型。此外，該劑型也可含有分離的腫瘤細(xì)胞膜，在施用時(shí)例如用適當(dāng)?shù)南♂寗┲亟?。半抗原本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜可以作為修飾的、未修飾的腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜使用，或作為修飾的、未修飾的腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜的組合使用。對(duì)于本發(fā)明，修飾包括但不限于用半抗原修飾。不單獨(dú)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(但增強(qiáng)對(duì)結(jié)合或以其它方式附著的另一分子的免疫應(yīng)答)的任一小分子可起半抗原的作用。通常，所使用的分子應(yīng)小于大約1000mw。
本領(lǐng)域中已知多種半抗原，例如TNP(Kempkes等人，免疫學(xué)雜志1991 1472467)；磷酰膽堿(Jang等人，歐洲免疫學(xué)雜志1991 211303)；鎳(Pistoor等人，實(shí)驗(yàn)皮膚病學(xué)雜志(J．Invest．Dermatol．)199510592)；砷酸(酯)(Nalefski和Rao，免疫學(xué)雜志1993 1503806)。
通常，適用于本發(fā)明的半抗原具有可結(jié)合親水性氨基酸(例如賴氨酸)的性質(zhì)。半抗原可通過賴氨酸的ε-氨基或-COOH基與細(xì)胞結(jié)合。另外，也可使用能通過二氮(diaza)偶聯(lián)結(jié)合疏水性氨基酸如酪氨酸和組氨酸的半抗原。適用于本發(fā)明的半抗原的實(shí)例包括二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙?；?N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磷酰膽堿、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥(Nahas和Leskowitz，細(xì)胞免疫學(xué)(Cellular Immunol．)198054241)及其組合。一旦學(xué)習(xí)了本公開內(nèi)容，技術(shù)人員就能選擇用于本發(fā)明的半抗原。例如，能用遲發(fā)型過敏反應(yīng)(DTH)試驗(yàn)常規(guī)測(cè)試半抗原。佐劑在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞膜與一種免疫佐劑一起施用。該佐劑具有增強(qiáng)對(duì)半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞和膜的免疫應(yīng)答的性質(zhì)。佐劑的代表性實(shí)例是卡介苗，BCG，或合成佐劑，包含從皂樹(quillajasaponaria)皮純化的均質(zhì)皂苷、小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)的QS-21，McCune等人，癌癥(Cancer)1979 431619，一般是皂苷、脫毒的內(nèi)毒素和細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素4、γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素15、GM-CSF及其組合。
應(yīng)當(dāng)理解，可對(duì)佐劑進(jìn)行優(yōu)化。換句話說，技術(shù)人員可以利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定使用的最佳佐劑。制備本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞膜的方法本發(fā)明使用的腫瘤細(xì)胞可如下制備。如Berd等人(1986)同上文、Sato等人(1997)、美國(guó)專利號(hào)5，290，551和美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)08／203，004、08／479，016、08／899，905、08／942，794或相應(yīng)的PCT申請(qǐng)PCT／US96／09511所述加工腫瘤，其每一項(xiàng)都在此完整引入作為參考。簡(jiǎn)言之，經(jīng)分裂提取細(xì)胞，如用膠原酶和DNA酶酶促分裂，用攪拌器機(jī)械分裂，用鑷子起毛，使用研缽和研杵，用手術(shù)刀片切成小塊，等等。對(duì)于液體腫瘤，可收集血液或骨髓樣品，并經(jīng)密度梯度離心分離腫瘤細(xì)胞。
通過破裂細(xì)胞由腫瘤細(xì)胞制備腫瘤細(xì)胞膜，例如，利用低滲休克、機(jī)械分裂和酶促分裂，及經(jīng)離心分離不同的細(xì)胞成分。簡(jiǎn)言之，可使用下列步驟裂解腫瘤細(xì)胞，從裂解的腫瘤細(xì)胞中除去細(xì)胞核獲得無細(xì)胞核的腫瘤細(xì)胞，獲得不含細(xì)胞和細(xì)胞核的基本上較純的膜，使該腫瘤細(xì)胞膜與半抗原作用以獲得半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞膜?？砂凑誋eike等人的方法進(jìn)行膜分離。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，完整細(xì)胞和細(xì)胞核可通過連續(xù)離心去除，直到經(jīng)顯微鏡檢查基本上不含細(xì)胞核和細(xì)胞。例如，裂解的細(xì)胞可以以低速度，如約500-2000g離心約5分鐘。該分離方法使得在大約2×108細(xì)胞當(dāng)量(c．e．)的膜物質(zhì)中保留少于約100個(gè)細(xì)胞和／或細(xì)胞核。例如，可通過約100000g約90分鐘的超速離心沉淀含有膜的核后(postnuclear)上清液。沉淀中含有全部膜。例如，可將膜重懸浮于約8％蔗糖、5mM Tris，pH7．6的溶液中，并冷凍于約-80℃直至使用?？梢允褂萌我幌♂寗?，優(yōu)選的是作為穩(wěn)定劑的稀釋劑。為了測(cè)定膜制品的質(zhì)量，可以定期培養(yǎng)(約6×107c．e．膜)。不應(yīng)生成細(xì)胞集落，用光學(xué)顯微鏡也應(yīng)當(dāng)檢測(cè)不到細(xì)胞或細(xì)胞核。
用DNP或另一種半抗原對(duì)所制備的細(xì)胞或膜的修飾可以按已知的方法進(jìn)行，例如，Miller和Claman的方法，免疫學(xué)雜志，1976，117，1519，在此完整引用作為參考，該方法包括腫瘤細(xì)胞或膜與一種半抗原在無菌條件下溫育30分鐘，隨后用無菌鹽水洗滌。用單克隆抗半抗原抗體經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)可證實(shí)半抗原修飾。
分裂的細(xì)胞或分離的膜可以新鮮使用或者例如在可控速度的冷凍機(jī)或在液氮中冷凍貯存?zhèn)溆谩＜?xì)胞和膜一旦融解后立即使用。優(yōu)選地，融解細(xì)胞或膜后馬上向患者施用。例如，可在對(duì)患者進(jìn)行皮膚試驗(yàn)或治療當(dāng)天，融解細(xì)胞或膜。任選地，可洗滌細(xì)胞或膜，并任選地照射2500R。可以再次洗滌，然后懸浮于不含酚紅的Hanks平衡鹽溶液中。
同種異體腫瘤細(xì)胞膜可如上所述制備。然而，在向受試者施用之前，應(yīng)與同源(例如自體的)抗原呈遞細(xì)胞共溫育。同源抗原呈遞細(xì)胞加工同種異體膜，使得患者的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)可對(duì)其應(yīng)答。該方法使得可以用來源于非患者自身腫瘤的腫瘤細(xì)胞膜來免疫患者。同種異體腫瘤細(xì)胞膜與抗原呈遞細(xì)胞溫育約數(shù)小時(shí)到約數(shù)天的一段時(shí)間。然后洗滌膜脈沖(cmembrane-pulsed)的抗原呈遞細(xì)胞，并對(duì)患者注射。
可以用多種方法制備抗原呈遞細(xì)胞，包括例如Grabbe等人，1995和Siena等人，1995的方法。簡(jiǎn)言之，例如通過靜脈穿刺從欲免疫的患者中獲得血液。此外，也可獲得骨髓。此外，也可通過白細(xì)胞除去法獲得血液白細(xì)胞。經(jīng)梯度離心可從這些來源的任一個(gè)中分離單核白細(xì)胞。白細(xì)胞進(jìn)一步可用抗原CD34的單克隆抗體經(jīng)正選擇純化。
在組織培養(yǎng)基(例如，補(bǔ)充有血清如胎牛血清、合并的人血清或自體血清的RPMI-1640)中培養(yǎng)并擴(kuò)大純化的白細(xì)胞。此外，也可使用無血清培養(yǎng)基。為了刺激抗原呈遞細(xì)胞的生長(zhǎng)，可以向培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包括但不限于粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素4(IL4)、TNF(腫瘤壞死因子)、白細(xì)胞介素3(IL3)、FLT3配體和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。
在培養(yǎng)中分離并擴(kuò)大培養(yǎng)的抗原呈遞細(xì)胞可以表征為例如樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞。使用腫瘤細(xì)胞膜和組合物的方法治療癌癥的方法本發(fā)明涉及一種治療診斷或懷疑患有癌癥的哺乳動(dòng)物優(yōu)選地人的方法，包括施用一種藥學(xué)可接受量的半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞膜、半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞或其組合。膜和／或細(xì)胞可與免疫佐劑和／或藥學(xué)可接受的載體混合。在施用該組合物之前可施用藥學(xué)可接受量的低劑量環(huán)磷酰胺或另一種低劑量的化療劑。半抗原化的組合物之后任選地可施用藥學(xué)可接受量的非半抗原化的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞膜。也可按照本發(fā)明的方法施用非半抗原化的組合物。
可根據(jù)本發(fā)明治療任一惡性腫瘤，包括轉(zhuǎn)移和原發(fā)性癌癥，實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤。實(shí)體瘤包括癌，非實(shí)體瘤包括血液惡性腫瘤。癌包括但不限于腺癌和上皮癌。血液惡性腫瘤包括白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。下面是按本發(fā)明的方法可用分離的修飾腫瘤細(xì)胞膜治療的癌癥的非限制性實(shí)例卵巢癌包括晚期卵巢癌、白血病包括但不限于急性骨髓性白血病、結(jié)腸癌，包括轉(zhuǎn)移至肝的結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、腎癌和前列腺癌。卵巢癌可能是腺癌或上皮癌。結(jié)腸和前列腺癌是腺癌。白血病可能來源于髓樣骨髓或淋巴結(jié)。白血病可能是急性的，表現(xiàn)為最初發(fā)育階段的成熟停止，也可能是慢性的，表現(xiàn)為成熟淋巴樣細(xì)胞或髓細(xì)胞的過度生長(zhǎng)?？筛鶕?jù)本發(fā)明治療Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期癌癥，優(yōu)選地Ⅲ和Ⅳ期，再更優(yōu)選地Ⅲ期癌癥。
患有前述類型的轉(zhuǎn)移癌的哺乳動(dòng)物，特別是人類，可以用本發(fā)明的膜、組合物和方法來治療。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以治療家畜。
在施用本發(fā)明的疫苗組合物之前，可通過將其施于皮膚而使患者對(duì)用來修飾腫瘤細(xì)胞和膜的半抗原免疫。例如，可使用二硝基氟苯(DNFB)。隨后(例如，大約2周后)，可給患者注射一種腫瘤細(xì)胞膜組合物。該組合物可施用(如再注射)總共至少三次治療，優(yōu)選地至少六次治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用的總數(shù)(包括最初施用)可以是8次，在另一個(gè)實(shí)施方案中可能是10次。接種方案可由主治醫(yī)師設(shè)計(jì)，以適應(yīng)特定患者的病情。例如，可以每2周，優(yōu)選地每周施行疫苗注射。可施用一次加強(qiáng)疫苗。優(yōu)選地，加強(qiáng)免疫一次或兩次。例如，可在最初施用大約6個(gè)月之后或大約1年之后加強(qiáng)免疫。
可用藥物增強(qiáng)患者的免疫應(yīng)答。例如，每次施用之前可施用環(huán)磷酰胺(CY)。
可在常規(guī)癌癥治療如手術(shù)后應(yīng)用本發(fā)明。對(duì)于實(shí)體瘤，如卵巢癌，可最佳或次最佳地摘除(debulking)腫瘤。最佳地摘除是指切除腫瘤使得被治療的患者中只留有小腫瘤塊。次最佳地摘除是指切除腫瘤而在患者中留有大塊。對(duì)于非實(shí)體瘤，可收集合適的血液或骨髓樣品，并用任何參考文獻(xiàn)中已知的技術(shù)分離癌細(xì)胞。切除的腫瘤或收集的腫瘤細(xì)胞可用來制備如上所述的腫瘤細(xì)胞膜。
可通過任一合適的途徑施用腫瘤細(xì)胞膜，包括接種和注射，例如皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)和皮下注射。每次疫苗治療可以有多個(gè)施用部位。例如，每次施用可以皮內(nèi)注射兩個(gè)優(yōu)選地三個(gè)相鄰部位來施用疫苗組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在上臂或腿上施用疫苗組合物。
施用多種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物可提高疫苗的效能。這些藥劑通過直接或間接地刺激免疫應(yīng)答而起作用。本發(fā)明的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物包括但不限于白細(xì)胞介素12、白細(xì)胞介素15和γ干擾素。在一個(gè)實(shí)施方案中，在每次疫苗注射后施用IL12。對(duì)具有炎癥反應(yīng)的患者施用IL12可使腫瘤塊內(nèi)的T淋巴細(xì)胞增殖并且更具活性。增加的T細(xì)胞數(shù)和功能性引起腫瘤的免疫破壞和消退。
大量工作者已經(jīng)發(fā)展并測(cè)試了人癌癥疫苗。盡管它們有時(shí)能誘導(dǎo)對(duì)患者癌癥的弱免疫力，但很少能導(dǎo)致腫瘤消退或延長(zhǎng)存活時(shí)間。應(yīng)用本發(fā)明的疫苗驚人地發(fā)現(xiàn)了炎癥反應(yīng)的證據(jù)。用顯微鏡觀察到T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。因此，能增強(qiáng)炎癥反應(yīng)和淋巴細(xì)胞數(shù)量的該方法在本領(lǐng)域中具有明顯的進(jìn)步。因此，本發(fā)明也提供了引發(fā)至少具有下列性質(zhì)之一的T細(xì)胞的方法施用時(shí)(ⅰ)引發(fā)浸潤(rùn)所治療哺乳動(dòng)物的腫瘤的T淋巴細(xì)胞，(ⅱ)引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，(ⅲ)引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。
刺激T細(xì)胞的方法可以用分離的腫瘤細(xì)胞膜在體外刺激T細(xì)胞。該試驗(yàn)?zāi)苡脕碓u(píng)價(jià)例如應(yīng)用特定腫瘤膜的治療是否可能成功。該試驗(yàn)中使用的T細(xì)胞可以按照下列方法獲得，該方法是描述用于人的，但是可應(yīng)用于任何哺乳動(dòng)物受試者。
通過對(duì)診斷患有某種類型癌癥的患者施用一種藥學(xué)可接受量的組合物，其中含有半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞膜或其組合，由此產(chǎn)生T細(xì)胞。該組合物任選地可含有一種免疫佐劑和／或一種藥學(xué)可接受的載體。在施用第一次腫瘤細(xì)胞組合物之前，任選地可施用一種藥學(xué)可接受量的低劑量環(huán)磷酰胺或另一種低劑量的化療劑，如但不限于大約5-10mg／M2的苯丙氨酸氮芥。半抗原化的組合物之后任選地可施用一種藥學(xué)可接受量的非半抗原化的疫苗組合物，其含有非半抗原化的膜、腫瘤細(xì)胞或其組合?？梢园凑毡景l(fā)明的方法施用非半抗原化的組合物。
可以從在施用半抗原修飾的自體細(xì)胞或膜后對(duì)其發(fā)生強(qiáng)烈遲發(fā)型過敏(DTH)反應(yīng)的患者中獲得外周血淋巴細(xì)胞(PBL)。DTH反應(yīng)優(yōu)選地有大約10mm的直徑，再更優(yōu)選地大約大于10mm。通過用半抗原修飾的癌細(xì)胞重復(fù)刺激可由PBL建立T細(xì)胞系。T細(xì)胞能用公知的方法分離，如單細(xì)胞懸液的制備，過濾，單核細(xì)胞的排除和表達(dá)特定T細(xì)胞受體(TCR)類型的亞群的分離，方法是使該亞群在TCR亞型特異抗體的存在下和／或在IL-2存在下和／或在超抗原存在下擴(kuò)增。目的T細(xì)胞可在體內(nèi)擴(kuò)增，因?yàn)樗鼈兪菑囊呀?jīng)富集了目的T細(xì)胞的腫瘤的浸潤(rùn)液中收集的。
修飾的腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜都具有刺激T細(xì)胞的性質(zhì)。對(duì)于本發(fā)明，“刺激”是指誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖以及T細(xì)胞在體外的細(xì)胞因子產(chǎn)生。膜和腫瘤細(xì)胞都獨(dú)立地具有刺激T細(xì)胞的能力?？赏ㄟ^T細(xì)胞對(duì)修飾核苷酸的攝取來檢測(cè)并測(cè)定T細(xì)胞的增殖，這些修飾核苷酸如但不限于3H胸苷、125I UDR(碘代脫氧尿嘧啶核苷)；和染料，如能使活細(xì)胞染色的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)。另外，細(xì)胞因子如但不限于IFNγ、腫瘤壞死因子(TNF)和IL-2的產(chǎn)生可用于顯示T細(xì)胞增殖。細(xì)胞因子的產(chǎn)生應(yīng)當(dāng)高于背景水平，通常高25皮克／ml，優(yōu)選地高100皮克／ml。
T細(xì)胞是介導(dǎo)兩種免疫功能-效應(yīng)物功能和調(diào)節(jié)功能、分泌蛋白質(zhì)(淋巴因子)和殺傷其它細(xì)胞(細(xì)胞毒性)-的淋巴細(xì)胞。效應(yīng)物功能包括反應(yīng)性)，遲發(fā)型過敏反應(yīng)、同種異體移植排斥、腫瘤免疫和移植物抗宿主反應(yīng)性。淋巴因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性由T細(xì)胞效應(yīng)物功能證明。T細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能表現(xiàn)為擴(kuò)增其它T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的能力和B細(xì)胞的免疫球蛋白產(chǎn)生。調(diào)節(jié)功能也需要淋巴因子的產(chǎn)生。T細(xì)胞應(yīng)答誘導(dǎo)刺激物(如但不限于促分裂原、抗原或凝集素)產(chǎn)生γ干擾素(IFNγ)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可如下建立T細(xì)胞系。PBL(1×106)與自體DNP結(jié)合的B淋巴母細(xì)胞(1×105)在24孔平底培養(yǎng)板中在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中混合，培養(yǎng)7天后，加入100U／ml IL2(Cetus Oncology，Emeryville，CA)。將擴(kuò)充的T細(xì)胞培養(yǎng)物保存于含有IL2的培養(yǎng)基中，需要時(shí)將其分開，以保持22mm直徑孔中大約2×106個(gè)細(xì)胞的濃度。每14天通過加入自體DNP結(jié)合的B淋巴母細(xì)胞再刺激培養(yǎng)物。用單克隆抗體表(panel)(Becton-Dickinson，San Jose，CA)通過流式細(xì)胞術(shù)可確定表型。CD8+和CD4+T細(xì)胞的分離通過間接淘選完成，其中，按照Wysoki，L．J．和V．L．Sato，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，1978，75，2844的方法，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使抗CD8或抗CD4單克隆抗體包被的T細(xì)胞附著于抗免疫球蛋白包被的平皿上，該文在此完整引用作為參考；分離附著的細(xì)胞，并用DNP修飾的刺激物包括但不限于以下所述、黑素瘤細(xì)胞和β淋巴母細(xì)胞和IL2擴(kuò)充。
例如，通過在圓底微量滴定板的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中以有限稀釋度培養(yǎng)，獲得表型均一的T細(xì)胞亞群，該培養(yǎng)基中含有2×105個(gè)照射的同種異體飼養(yǎng)細(xì)胞、200 U／ml IL-2和植物凝集素。針對(duì)應(yīng)答DNP修飾的B淋巴母細(xì)胞的增殖能力，篩選含有生長(zhǎng)的淋巴細(xì)胞集落的孔。陽性孔用IL2擴(kuò)充，并用自體DNP結(jié)合的B淋巴母細(xì)胞每14天重復(fù)刺激。
可作為效應(yīng)細(xì)胞測(cè)試外周血淋巴細(xì)胞(PBL)。將其懸浮于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-1640、10％合并的人AB+血清、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鹽培養(yǎng)基添加物(Sigma Chemical Co．)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、25mM HEPES緩沖液、青霉素+鏈霉素)中，并以1×105細(xì)胞／孔的濃度加入96孔圓底微量滴定板中。也加入刺激細(xì)胞，包括1)自體或同種異體PBL，2)通過用EB病毒轉(zhuǎn)染制備的自體或同種異體B淋巴母細(xì)胞系，3)自體培養(yǎng)的黑素瘤細(xì)胞；通過照射(5000R)滅活。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，效應(yīng)物∶刺激物比優(yōu)選地為1∶1。培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育5天；然后用125I標(biāo)記的IUDR(ICN Radiochemical，Costa Mesa，CA)使這些孔接受脈沖6小時(shí)，用自動(dòng)收集裝置收集，并用γ計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。計(jì)算三個(gè)重復(fù)孔的平均值。也按照上述方法檢測(cè)培養(yǎng)的T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。
融解在對(duì)DNP修飾的自體細(xì)胞的最大DTH反應(yīng)性時(shí)從患者獲得并冷藏的PBL，并檢測(cè)體外增殖反應(yīng)。單獨(dú)的DNFB應(yīng)用不能產(chǎn)生可檢測(cè)數(shù)量的循環(huán)效應(yīng)細(xì)胞。預(yù)期反應(yīng)性PBL在兩次DNP-疫苗注射后(第63天)可檢測(cè)到，并將在疫苗治療期間持續(xù)檢測(cè)到，這基于以前應(yīng)用DNP修飾的黑素瘤細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)。
為了檢測(cè)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可向圓底微量滴定板中以1×105細(xì)胞／孔加入T細(xì)胞。加入等量刺激物(DNP修飾的自體B淋巴母細(xì)胞)，溫育18小時(shí)后收集上清液。用可商品獲得的ELISA試劑盒測(cè)定γ干擾素(Endogen，Boston，MA；靈敏度=5pg／ml)。
為了測(cè)定該反應(yīng)的MHC依賴性，在加入效應(yīng)細(xì)胞之前，刺激細(xì)胞可與濃度為10μg／ml的MHCⅠ類(W6／32)或MHCⅡ類(L243)單克隆抗體預(yù)溫育1小時(shí)?？蓹z測(cè)相同濃度的非特異性小鼠免疫球蛋白，作為陰性對(duì)照。
通過淘選大量群體獲得的DNP反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞能夠通過用DNP修飾的自體B淋巴母細(xì)胞重復(fù)刺激，長(zhǎng)期(＞3個(gè)月)培養(yǎng)于含IL-2的培養(yǎng)基中；它們保留穩(wěn)定的表型，CD3+、CD8+。兩條證據(jù)表明其反應(yīng)是MHCⅠ類限制性的1)刺激細(xì)胞與抗Ⅰ類構(gòu)架抗體預(yù)溫育，可阻斷γ干擾素產(chǎn)生，而與抗Ⅱ類抗體溫育不能阻斷，2)T細(xì)胞能應(yīng)答一個(gè)或兩個(gè)HLA-A基因座匹配的同種異體DNP修飾的刺激物，但不能應(yīng)答HLA-A不匹配的刺激物。
為了測(cè)定T細(xì)胞的γ干擾素產(chǎn)生，可從患者的血液中獲得淋巴細(xì)胞。大約1，000，000個(gè)淋巴細(xì)胞與DNP修飾的自體黑素瘤細(xì)胞膜混合，用來刺激T細(xì)胞。每7天加入100U／ml白細(xì)胞介素2。通過傳代擴(kuò)充T細(xì)胞。然后用DNP修飾的自體黑素瘤細(xì)胞膜重新刺激T細(xì)胞。得到富集的T細(xì)胞群，其可對(duì)DNP修飾的自體黑素瘤細(xì)胞起反應(yīng)。根據(jù)T細(xì)胞的γ干擾素產(chǎn)量測(cè)定刺激。通常認(rèn)為高于15皮克／ml的γ干擾素產(chǎn)生即是明顯的。
通過下列實(shí)施例進(jìn)一步說明了本發(fā)明，其意圖只在于說明，而不是欲將本發(fā)明限定于這些具體的實(shí)施方案。實(shí)施例1分離的黑素瘤膜對(duì)T細(xì)胞的體外刺激T細(xì)胞系的建立按照本方法進(jìn)行DNP-疫苗施用后，從對(duì)DNP-修飾的自體黑素瘤細(xì)胞具有強(qiáng)烈遲發(fā)型過敏(DTH)反應(yīng)的患者中獲得外周血淋巴細(xì)胞(PBL)。通過密度梯度離心從血液中分離PBL，將其懸浮于冷凍培養(yǎng)基，如含有2．5％人白蛋白和DMSO的RPMI-1640中，在可控速度的冷凍機(jī)中冷凍，并貯存于液氮中直至使用(Sato等人，1995)。
通過用DNP-修飾的自體黑素瘤細(xì)胞(DNP-Mel)重復(fù)刺激由這些PBL建立T細(xì)胞系，并用重組白細(xì)胞介素2(IL-2)維持(Sato等人，1995)。
黑素瘤細(xì)胞如上所述，從由同一患者中手術(shù)取出的轉(zhuǎn)移塊中酶法提取黑素瘤細(xì)胞，并用前述方法冷藏(Sato等人，1997)。由該黑素瘤細(xì)胞懸液建立自體黑素瘤細(xì)胞系。簡(jiǎn)言之，從轉(zhuǎn)移塊中酶法分離出黑素瘤細(xì)胞，將其懸浮于組織培養(yǎng)基(含有胎牛血清或人血清的RPMI-1640)中，并加于組織培養(yǎng)板上。數(shù)天后，除去未附著的腫瘤細(xì)胞，并加入新鮮的培養(yǎng)基。數(shù)周后，附著的黑素瘤細(xì)胞開始快速增殖。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到鋪滿培養(yǎng)板時(shí)，通過用EDTA取下細(xì)胞，并加至新鮮的組織培養(yǎng)板中來使細(xì)胞分離。
用Miller和Claman的方法用DNP修飾該黑素瘤細(xì)胞系細(xì)胞。這包括腫瘤細(xì)胞與二硝基氟苯(DNFB，Sigma Chemical Co．)在無菌條件下溫育30分鐘，隨后用Hanks溶液洗掉過量的DNFB。用小鼠單克隆抗DNP抗體(SPE-7；Sigma Immunochemicals，St．Louis，MO)經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)DNP修飾(100％的細(xì)胞顯示被DNP修飾)。
作為一種備擇方法，可如上所述用DNP修飾冷藏的黑素瘤細(xì)胞，而不需建立細(xì)胞系的中間步驟。
細(xì)胞膜提取用Heike等人的方法從DNP修飾的黑素瘤細(xì)胞(DNP-Mel)中提取細(xì)胞膜。簡(jiǎn)言之，通過在5倍體積的30mM碳酸氫鈉緩沖液、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)中低滲休克，并由Dounce勻漿化(10-20次)，裂解DNP修飾的細(xì)胞。通過以1000g連續(xù)離心5分鐘除去剩余的完整細(xì)胞和細(xì)胞核，直到上清液不含細(xì)胞核和細(xì)胞。然后，經(jīng)100，000g離心90分鐘沉淀膜。將沉淀中的全部膜以每毫升107細(xì)胞當(dāng)量單位(即，從107個(gè)細(xì)胞中提取的膜)重懸浮于8％蔗糖、5mM Tris，pH7．6中，-80℃下冷凍直至使用。
作為一種備擇方法，用上述相同方法從未修飾的黑素瘤細(xì)胞中分離細(xì)胞膜。將膜以不同的細(xì)胞當(dāng)量濃度(105-109細(xì)胞當(dāng)量／ml)懸浮于不含白蛋白的Hanks溶液中。然后如上所述加入DNFB。然后，經(jīng)100，000g離心90分鐘沉淀膜，并用鹽水洗兩次。
膜制品引起的細(xì)胞因子產(chǎn)生根據(jù)IFN-γ產(chǎn)生，測(cè)定DNP修飾的黑素瘤膜誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)。將從患者PBL中獲得的T細(xì)胞以105細(xì)胞／孔平板接種于96孔圓底培養(yǎng)板中，每孔100μl培養(yǎng)基(補(bǔ)加有10％人AB血清、2mM L-谷氨酸、100mg／ml／100U／ml鏈霉素／青霉素、10mM HEPES、1％非必需氨基酸的RPMI 1640)。向每孔中加入不同量(約105-約108細(xì)胞當(dāng)量)的細(xì)胞膜，并加入其它培養(yǎng)基使每孔的總體積為250μl。
溫育18小時(shí)后收集上清液進(jìn)行IFN-γ測(cè)定。用可商品獲得的ELISA試劑盒(Endogen，Boston，MA；敏感度=5pg／ml)測(cè)定上清液中IFN-γ的濃度。
與自體DNP-Mel膜溫育后檢測(cè)到明顯的T細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)生(750pg／ml)。T細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)生與共溫育的DNP-Mel膜的量有關(guān)。未引發(fā)對(duì)未修飾的Mel膜的明顯反應(yīng)。通過用正淘選技術(shù)富集CD4+和CD8+T細(xì)胞建立兩種T細(xì)胞亞系。由于IFN-γ產(chǎn)生，每種亞系可對(duì)DNP-Mel膜起反應(yīng)。CD4+T亞系與DNP-Mel膜的反應(yīng)可被MHCⅡ類的抗體所阻斷，CD8+亞系的反應(yīng)可被MHCⅠ類的抗體所阻斷(分別為73％和80％阻斷)。
這些結(jié)果表明，半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞膜可成功地用于接種需要腫瘤治療的患者。實(shí)施例2用修飾的腫瘤細(xì)胞膜治療Ⅲ期卵巢癌最初可按標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療實(shí)踐(摘除(debulking)手術(shù)，隨后是化學(xué)治療)治療患者。待化學(xué)治療完成后，可以應(yīng)用含有半抗原二硝基苯(DNP)修飾的卵巢癌細(xì)胞膜的疫苗施行6周療程的治療。第一次注射前可施用低劑量的環(huán)磷酰胺。待療程結(jié)束后，可檢測(cè)患者對(duì)DNP修飾的和未修飾的癌細(xì)胞膜的遲發(fā)型過敏反應(yīng)性。用冷藏的從轉(zhuǎn)移性腫瘤提取的和／或從外周血分離的淋巴細(xì)胞可進(jìn)行體外研究。
例如，可選擇接受手術(shù)摘除的患者或化學(xué)治療后顯示腫瘤減小的患者進(jìn)行治療。從每名患者上切下的腫瘤塊足夠獲得至少100×106個(gè)活腫瘤細(xì)胞。這名患者可接受化學(xué)治療，如卡鉑和紫杉醇，在化學(xué)治療完成后優(yōu)選地是臨床上無腫瘤的(即，體檢和CT研究正常，血清CA-125＜35IU／L)。
患者可不接受本發(fā)明的治療，這是依據(jù)對(duì)于制備疫苗和皮膚試驗(yàn)不足量的腫瘤細(xì)胞(＜100×106個(gè)細(xì)胞)，低于80的Karnovsky表現(xiàn)狀態(tài)，以前6個(gè)月內(nèi)的主要區(qū)域放射治療，系統(tǒng)性皮質(zhì)類固醇的當(dāng)前施用，血細(xì)胞比容＜30％或WBC＜3000，年齡＜18，活動(dòng)性自身免疫病，活動(dòng)性重癥感染，另一種活動(dòng)性惡性腫瘤，感染乙型肝炎病毒(循環(huán)抗原)或HIV(循環(huán)抗體)的證據(jù)，或不能提供承諾。
對(duì)患者進(jìn)行腫瘤的手術(shù)切除及轉(zhuǎn)移灶的去除。進(jìn)行最佳或次最佳地去除的患者是符合條件的。可將腫瘤組織送至實(shí)驗(yàn)室并加工以獲得膜。該膜可以冷藏并貯存于液氮中。
同源的和同種異體的腫瘤細(xì)胞膜都可如本說明書所述制備并使用。
從手術(shù)后六(6)周內(nèi)開始，患者可開始化學(xué)治療，如應(yīng)用卡鉑或順鉑+紫杉醇，按照下列劑量方案每3周卡鉑AUC 7．5mg／M2或順鉑75mg／M2，每3周紫杉醇175mg／M2靜脈內(nèi)超過3小時(shí)?？墒┬辛鶄€(gè)循環(huán)的化學(xué)治療。也可施行另外任一種化學(xué)治療。
完成化學(xué)治療大約四周后，可對(duì)患者進(jìn)行轉(zhuǎn)移評(píng)價(jià)，包括胸-腹-骨盆計(jì)算機(jī)X射線斷層造影(CT)。只有證明無復(fù)發(fā)癌的患者才適合選擇進(jìn)行疫苗治療。假如CT研究為復(fù)發(fā)陰性，則血清CA125水平升高的患者是符合條件的。腫瘤細(xì)胞膜治療可以在施行最后一次化學(xué)治療至少4周、最遲12周之后開始。
于第-7天，可用下列物質(zhì)對(duì)患者進(jìn)行皮膚試驗(yàn)1)DNP修飾的自體卵巢癌細(xì)胞或膜，2)稀釋劑(含有0．1％人白蛋白的Hanks平衡鹽溶液)，和3)PPD中間物。可在第-5天測(cè)定DTH反應(yīng)。在第0天，患者可進(jìn)行300mg／M2環(huán)磷酰胺的快速靜脈內(nèi)輸液。三天后，他們可皮內(nèi)注射一種腫瘤細(xì)胞膜組合物，這可每周重復(fù)持續(xù)六(6)周。疫苗可能包含與BCG混合的DNP修飾的卵巢癌細(xì)胞膜。可向上臂內(nèi)注射疫苗。如果由于某種原因已切除了左腋窩淋巴結(jié)，可使用右臂。
第6次接種兩周半之后，可對(duì)患者進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)，包括CBC、SMA-12、CA125和胸部X射線?？蓽y(cè)試他們對(duì)下列物質(zhì)的DTHDNP修飾的和未修飾的自體癌細(xì)胞、DNP修飾的和未修飾的自體外周血淋巴細(xì)胞、稀釋劑和PPD中間物。也可測(cè)試對(duì)二硝基氟苯(DNFB)的接觸敏感性。
可在第6個(gè)月時(shí)(從疫苗計(jì)劃開始時(shí)算起)給予保持無復(fù)發(fā)的患者第7次(加強(qiáng))疫苗。對(duì)于每名患者，可貯存至少一個(gè)冷藏瓶的腫瘤細(xì)胞膜進(jìn)行第6個(gè)月的加強(qiáng)注射。如果預(yù)計(jì)可用的細(xì)胞數(shù)不足以進(jìn)行6次每周疫苗加第6月的加強(qiáng)，則每周注射的開始過程可減為5次。可在一年后施用另一次加強(qiáng)疫苗，但這只是在有足量的細(xì)胞可用時(shí)。恰在一年加強(qiáng)免疫之前，可用自體腫瘤細(xì)胞或膜對(duì)患者進(jìn)行皮膚試驗(yàn)，確定是否保持其以前的免疫水平。實(shí)施例3用修飾的腫瘤細(xì)胞膜治療黑素瘤可如前所述處理腫瘤塊。簡(jiǎn)言之，可通過用膠原酶和DNA酶酶促分裂和通過機(jī)械分裂提取細(xì)胞。如本說明書中所述分離細(xì)胞膜，在可控速度的冷凍機(jī)中冷凍，并貯存于液氮中直至需要使用。在治療患者當(dāng)天，融解、洗滌膜，重懸浮于不含酚紅的Hanks平衡鹽溶液中。可按照Miller和Claman(1976)的方法進(jìn)行DNP修飾。這包括腫瘤細(xì)胞與二硝基氟苯(DNFB)在無菌條件下溫育30分鐘，隨后用無菌鹽水洗滌。
該疫苗組合物可含有最少2．5×106c．e．臺(tái)盼藍(lán)排除的黑素瘤細(xì)胞膜和最多少7．5×106c．e．黑素瘤細(xì)胞膜，其懸浮于0．2ml Hanks溶液中。每次疫苗注射可包括三次向相鄰部位的注射。
冷凍干燥的物質(zhì)可用1ml無菌水或磷酸緩沖鹽溶液，pH7．2(PBS)重建?？稍跓o菌緩沖鹽溶液中進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?。然后在注射前吸?．1ml與疫苗混合。第一次和第二次疫苗可與0．1ml 1∶10稀釋的Tice BCG(“Tice-1”)混合。BCG是從Organon Teknika Corporation(Durham，NC)獲得的Tice菌株(巴斯德研究所菌株的次代株)。第三次和第四次疫苗可與0．1ml 1∶100稀釋物(“Tice-3”)混合。第五次和第六次和加強(qiáng)疫苗可與0．1ml 1∶1000稀釋物(“Tice-5”)混合。理想的疫苗反應(yīng)是只是有小(＜5mm)中心潰瘍的炎性丘疹。
可通過在前臂上皮內(nèi)注射0．1ml試驗(yàn)物質(zhì)進(jìn)行皮膚試驗(yàn)，并通過測(cè)定硬結(jié)的平均直徑估計(jì)48小時(shí)的DTH?？稍囼?yàn)下列物質(zhì)1)1×106個(gè)未修飾的和用DNP修飾的自體黑素瘤細(xì)胞膜細(xì)胞；可使用酶促分裂的(TCE)和機(jī)械分裂的(TCM)腫瘤細(xì)胞；2)3×106個(gè)未修飾的和用DNP修飾的自體外周血淋巴細(xì)胞；3)Hanks溶液；和4)PPD中間物強(qiáng)度。通過對(duì)上臂腹面皮膚施用200μg DNFB并檢查該區(qū)域在48小時(shí)的硬結(jié)圈，也可檢測(cè)對(duì)DNFB的接觸敏感性?？稍诹芤呙缡┯眠^程后進(jìn)行全套DTH試驗(yàn)。預(yù)處理DTH試驗(yàn)僅限于DNP修飾的黑素瘤細(xì)胞膜、PPD和稀釋劑。該策略用來避免1)使患者對(duì)DNP修飾的淋巴細(xì)胞致敏，和2)通過注射未修飾的腫瘤細(xì)胞使患者耐受。
每次進(jìn)行皮膚試驗(yàn)時(shí)，可收集所有患者的血液用于淋巴細(xì)胞和血清的分離和冷藏。可周期性地檢測(cè)如通過增殖測(cè)定的對(duì)自體癌細(xì)胞的應(yīng)答、細(xì)胞因子釋放和細(xì)胞毒性。
可在疫苗治療開始之前評(píng)估患者的轉(zhuǎn)移性疾病。待第一次8周的疫苗治療結(jié)束之后，每三個(gè)月進(jìn)行一次評(píng)價(jià)?？衫^續(xù)評(píng)價(jià)直到第二年，第三年每4個(gè)月一次，其后每6個(gè)月一次。每次評(píng)價(jià)可進(jìn)行體檢和常規(guī)血液檢查(CBC、SMA-12和CA125)。可在施用疫苗前，在(加強(qiáng)免疫前)6個(gè)月和12個(gè)月進(jìn)行胸-腹-骨盆的CT，作為臨床指征?？梢源_定未復(fù)發(fā)的和總存活率。所有患者都可進(jìn)行至少5年或直到死亡時(shí)為止。
預(yù)計(jì)患者可形成對(duì)BCG的局部反應(yīng)，包括排出、2-3月后愈合的壓痛膿皰，留下類似天花接種的瘢痕。患者形成對(duì)BCG的敏感性時(shí)，這些反應(yīng)的強(qiáng)度可能提高。在接種半抗原處理的疫苗的患者中以未觀察到過敏反應(yīng)、其它變應(yīng)性現(xiàn)象和自身免疫。
接種部位的反應(yīng)可如下分級(jí)0-無癥狀；1-癢或不適，但不干擾臂運(yùn)動(dòng)或正?；顒?dòng)；2-導(dǎo)致干擾臂運(yùn)動(dòng)但不需改變正?；顒?dòng)的不適；3-導(dǎo)致主要干擾臂運(yùn)動(dòng)且需要改變正?；顒?dòng)的不適；4-導(dǎo)致不能用四肢進(jìn)行正?；顒?dòng)的不適。
環(huán)磷酰胺可用無菌水重建，并可通過快速靜脈內(nèi)輸液施用適當(dāng)?shù)膭┝俊Ｒ话愕?，大約三分之一的患者在施用低劑量環(huán)磷酰胺后可能感到惡心，大約10％可能會(huì)嘔吐。該劑量時(shí)不會(huì)發(fā)生白細(xì)胞減少、脫發(fā)和膀胱炎。預(yù)期該方案伴有較低的惡心和嘔吐發(fā)生率，因?yàn)榭赡苤慌c最后一次疫苗接種結(jié)合施用一次環(huán)磷酰胺。
可在注射疫苗后觀察患者。讓具有意外癥狀或征象的患者聯(lián)系醫(yī)生立即評(píng)價(jià)。導(dǎo)致不適的發(fā)熱可用乙酰氨基酚治療。低劑量環(huán)磷酰胺引起的惡心可用口服丙氯拉嗪(prochlorperazine)(丙氯拉嗪(Compazine))治療。如果在接種部位發(fā)生嚴(yán)重的局部反應(yīng)(＞5mm潰瘍)，則可降低隨后的BCG劑量(見上)。
一年評(píng)估時(shí)無復(fù)發(fā)的患者可接受最后的加強(qiáng)疫苗注射。然后可觀察其病情而不進(jìn)行進(jìn)一步的治療。發(fā)展為轉(zhuǎn)移的患者可不再研究，并按臨床指征進(jìn)行治療(通常手術(shù)或化學(xué)治療)。
也可進(jìn)行用來確定DNP疫苗是否延長(zhǎng)這些患者的無復(fù)發(fā)和／或總存活時(shí)間的效能研究?？梢詼y(cè)定存活參數(shù)(卡-邁(Kaplan-Meier)法)。
Thomas Jefferson 大學(xué)、NIH和FDA關(guān)于承諾的所有規(guī)定均得到遵守。
我們以前用半抗原修飾的黑素瘤細(xì)胞對(duì)DNP修飾的自體黑素瘤疫苗的研究得出以下結(jié)果治療后100％的患者(N=60)形成對(duì)DNP修飾的自體腫瘤細(xì)胞的陽性DTH反應(yīng)(≥5mm硬結(jié)直徑)，85％形成強(qiáng)陽性反應(yīng)(≥10mm硬結(jié)直徑)。應(yīng)用DNP修飾的自體癌膜疫苗預(yù)期有類似的成功，即，預(yù)期患者形成對(duì)DNP修飾的和未修飾的自體癌細(xì)胞膜的DTH。
從前面的敘述可知，除此處所示及所述之外，本發(fā)明的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯然的。這些修改也處于附加權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
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美國(guó)專利號(hào)5，290，551美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08／203，004美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08／479，016美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08／899，905美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08／942，794PCT US 96／0951權(quán)利要求
1．一種含有半抗原修飾的人腫瘤細(xì)胞膜的組合物。
2．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細(xì)胞膜分離自選自癌細(xì)胞和非實(shí)體瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。
3．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細(xì)胞膜來源于選自白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、腎癌和前列腺癌的腫瘤。
4．權(quán)利要求3的組合物，其中所述白血病是急性骨髓性白血病。
5．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細(xì)胞膜是選自同源腫瘤細(xì)胞膜和同種異體腫瘤細(xì)胞膜的腫瘤細(xì)胞膜。
6．權(quán)利要求5的組合物，其中所述同源腫瘤細(xì)胞膜是自體的。
7．權(quán)利要求1的組合物，其中所述半抗原選自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙酰基-N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其組合。
8．權(quán)利要求1的組合物，其還含有佐劑。
9．權(quán)利要求8的組合物，其中所述佐劑選自卡介苗、QS-21、脫毒的內(nèi)毒素和細(xì)胞因子。
10．權(quán)利要求1的組合物，其具有當(dāng)對(duì)患有與所述腫瘤細(xì)胞膜相同類型的惡性腫瘤的人施用時(shí)，能引發(fā)浸潤(rùn)該病人腫瘤的T淋巴細(xì)胞的性質(zhì)。
11．權(quán)利要求1的組合物，其具有當(dāng)對(duì)患有與所述腫瘤細(xì)胞膜相同類型的惡性腫瘤的人施用時(shí)，能引發(fā)對(duì)該病人腫瘤的炎性免疫應(yīng)答的性質(zhì)。
12．權(quán)利要求1的組合物，其具有當(dāng)對(duì)患有與所述腫瘤細(xì)胞膜相同類型的惡性腫瘤的人施用時(shí)，能引發(fā)對(duì)該病人腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)的性質(zhì)。
13．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細(xì)胞膜是同種異體的，該組合物進(jìn)一步包含一種抗原呈遞細(xì)胞。
14．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細(xì)胞膜是同種異體的，所述抗原呈遞細(xì)胞是同源的。
15．權(quán)利要求1的組合物，其中所述腫瘤細(xì)胞膜是同種異體的，所述抗原呈遞細(xì)胞是自體的。
16．一種治療癌癥的方法，包括對(duì)人施用一種含有治療有效量的半抗原修飾的人腫瘤細(xì)胞膜的組合物，其中該病人患有與該腫瘤細(xì)胞膜相同類型的惡性腫瘤。
17．權(quán)利要求16的方法，包括引發(fā)浸潤(rùn)該病人腫瘤的T淋巴細(xì)胞和測(cè)定浸潤(rùn)該病人腫瘤的T淋巴細(xì)胞。
18．權(quán)利要求16的方法，包括引發(fā)對(duì)該病人腫瘤的炎性免疫應(yīng)答和測(cè)定該炎性免疫應(yīng)答。
19．權(quán)利要求16的方法，包括引發(fā)對(duì)該病人腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)和測(cè)定該遲發(fā)型過敏反應(yīng)。
20．權(quán)利要求16的方法，其中所述惡性腫瘤選自癌和非實(shí)體瘤。
21．權(quán)利要求16的方法，其中所述惡性腫瘤選自白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、腎癌和前列腺癌。
22．權(quán)利要求21的方法，其中所述白血病是急性骨髓性白血病。
23．權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞膜是選自同源腫瘤細(xì)胞膜和同種異體腫瘤細(xì)胞膜的腫瘤細(xì)胞膜。
24．權(quán)利要求23的方法，其中所述同源腫瘤細(xì)胞膜是自體的。
25．權(quán)利要求16的方法，其中所述半抗原選自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙?；?N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其組合。
26．權(quán)利要求16的方法，其中所述組合物還含有一種佐劑。
27．權(quán)利要求26的方法，其中所述佐劑選自卡介苗、QS-21、脫毒的內(nèi)毒素和細(xì)胞因子。
28．權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞膜是同種異體的，所述組合物進(jìn)一步含有一種抗原呈遞細(xì)胞。
29．權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞膜是同種異體的，所述抗原呈遞細(xì)胞是同源的。
30．權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞膜是同種異體的，所述抗原呈遞細(xì)胞是自體的。
31．一種引發(fā)浸潤(rùn)哺乳動(dòng)物腫瘤的T淋巴細(xì)胞的方法，包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用一種治療有效量的半抗原修飾的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞膜，其中該哺乳動(dòng)物患有一種與該腫瘤細(xì)胞膜相同類型的惡性腫瘤。
32．權(quán)利要求31的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人或選自犬、貓、牛和馬科的動(dòng)物。
33.一種引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用一種治療有效量的半抗原修飾的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞膜，其中該哺乳動(dòng)物患有一種與該腫瘤細(xì)胞相同類型的惡性腫瘤。
34．權(quán)利要求33的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人或選自犬、貓、牛和馬科的動(dòng)物。
35．一種引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)的方法，包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用一種治療有效量的半抗原修飾的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞膜，其中該哺乳動(dòng)物患有一種與該腫瘤細(xì)胞膜相同類型的惡性腫瘤。
36．權(quán)利要求35的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人或選自犬、貓、牛和馬科的動(dòng)物。
37．一種制備半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞膜的方法，包括裂解腫瘤細(xì)胞獲得裂解的腫瘤細(xì)胞，從該裂解的腫瘤細(xì)胞中除去細(xì)胞核獲得無細(xì)胞核的腫瘤細(xì)胞，由該無細(xì)胞核的腫瘤細(xì)胞獲得基本上無細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞膜，并使該腫瘤細(xì)胞膜經(jīng)一種半抗原處理，獲得半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞膜。
38．權(quán)利要求37的方法，其中所述裂解選自低滲休克、機(jī)械分裂和酶促分裂。
39．權(quán)利要求37的方法，其中所述半抗原選自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙?；?N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其組合。
40．一種分離的半抗原修飾的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞膜。
41．權(quán)利要求40的膜，其中所述哺乳動(dòng)物是人或選自犬、貓、牛和馬科的動(dòng)物。
42．權(quán)利要求41的膜，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
43．權(quán)利要求42的膜，其中該膜分離自選自癌細(xì)胞和非實(shí)體瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。
44．權(quán)利要求42的膜，其中該膜來源于選自白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、腎癌和前列腺癌的腫瘤。
45．權(quán)利要求44的膜，其中所述白血病是急性骨髓性白血病。
46．權(quán)利要求40的膜，其選自同源腫瘤細(xì)胞膜和同種異體腫瘤細(xì)胞膜。
47．權(quán)利要求46的膜，其中所述同源腫瘤細(xì)胞膜是自體的。
48．權(quán)利要求40的膜，其中所述半抗原選自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙?；?N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、異硫氰酸熒光素、砷酸苯異硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其組合。
49．權(quán)利要求40的膜，其至少具有下列性質(zhì)之一(ⅰ)引發(fā)浸潤(rùn)哺乳動(dòng)物腫瘤的T淋巴細(xì)胞，(ⅱ)引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答，(ⅲ)引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)和(ⅳ)在體外刺激T細(xì)胞。
50．權(quán)利要求40的膜，其中該膜是一種細(xì)胞外膜。
51．權(quán)利要求40的膜，其中該膜包括含有MHC分子、熱激蛋白或其組合的膜部分。
52．一種包含權(quán)利要求40的膜的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的腫瘤細(xì)胞膜、其組合物、制備該膜和組合物的方法、和治療癌癥的方法。本發(fā)明的組合物包括由半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞制備的組合物。本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞膜和組合物具有下列性質(zhì):當(dāng)向患有與所述腫瘤細(xì)胞相同類型的惡性腫瘤的哺乳動(dòng)物施用時(shí),能引發(fā)浸潤(rùn)哺乳動(dòng)物腫瘤的T淋巴細(xì)胞,引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的炎性免疫應(yīng)答,引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。本發(fā)明的膜和組合物也能在體外刺激T細(xì)胞。本發(fā)明的方法涉及治療癌癥,包括施用一種治療有效量的腫瘤細(xì)胞膜。本發(fā)明也涉及一種制備半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞膜的方法和含有該膜的劑型。
文檔編號(hào)A61K39/385GK1291105SQ99803065
公開日2001年4月11日 申請(qǐng)日期1999年2月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月17日
發(fā)明者D·伯德, 佐藤隆美 申請(qǐng)人:托馬斯杰斐遜大學(xué)