專利名稱：小母豬動情期和排卵的調(diào)節(jié)的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及動物飼養(yǎng)業(yè)領(lǐng)域，特別是對小母豬動情期和排卵調(diào)節(jié)的控釋制劑。
實際上，小母豬(未曾產(chǎn)過豬仔的雌性幼豬)一般在150至250天齡時達(dá)到青春動情期。一旦處于青春動情期，它們就具有了規(guī)則的排卵和性興奮周期，稱作“動情期”或“發(fā)情期”。小母豬多數(shù)似乎是在發(fā)情期的時候排卵和受孕。
正常情況下，小母豬和母豬不是同步發(fā)情(動情)，因此不在同一時間內(nèi)全部受孕。和母豬相比，小母豬所生產(chǎn)的幼仔趨于較小和較輕。
市售豬用產(chǎn)品的主要目標(biāo)是使繁殖率達(dá)到最高，尤其是在小母豬中。繁殖率的增高給生產(chǎn)者提供了降低生產(chǎn)成本和增加收益率的極大機(jī)會。人們正在試圖提高可生育小母豬的早期繁殖率，使小母豬的動情期同步，用人工授精(AI)使小母豬受孕，提高幼仔大小，增加幼仔的生產(chǎn)和斷奶期體重。
通過化學(xué)方式誘發(fā)的青春動情期可以使小母豬在較早的年齡進(jìn)行繁殖。一種用化學(xué)方法誘發(fā)青春動情期的方式是通過施用PG600TM的單劑量注射劑(孕馬血清促性腺激素和人絨毛促性腺激素)。小母豬通常在被處理后的第3至6天時表現(xiàn)出動情，而且90至95％的小母豬甚至在未表現(xiàn)出動情的情況下排卵。當(dāng)小母豬自PG600TM給藥后通過每天直接身體接觸公豬的刺激可以提高動情反應(yīng)率。
小母豬在其首次通過化學(xué)方式誘發(fā)動情期所生產(chǎn)的幼仔的大小相當(dāng)于小母豬在其首次自發(fā)動情期所生產(chǎn)幼仔的大小。然而，需等至第2次或第3次動情期才可以得到體形較大的幼仔。與等待第2次或第3次動情期有關(guān)的主要問題是動情期不再接近同步。
迄今為止，在美國還沒有獲得批準(zhǔn)的可以在小母豬一經(jīng)開始動情周期時有效調(diào)節(jié)動情期的產(chǎn)品，因此現(xiàn)在還不能在高產(chǎn)的第2或3動情周期期間使動情同步化。動情期的調(diào)節(jié)和計劃生育是利用其它管理技術(shù)來完成的，保持大量圍欄的小母豬，由此使固定數(shù)量的動物處于動情期或者按其過程自然發(fā)展。然而，這些技術(shù)沒有效果。
最常見的其它管理技術(shù)是通過首先使小母豬交配和隨后施用前列腺素F2α(PGF2α)引起“同步流產(chǎn)”來使一群小母豬在交配期結(jié)束后2至3周，至多8至10周內(nèi)動情期同步化。如果在交配后第1個40至50天內(nèi)誘導(dǎo)流產(chǎn)，流產(chǎn)小母豬表現(xiàn)出正常的發(fā)情和正常的生育力。經(jīng)歷不完全妊娠的小母豬傾向于獲得比首次或第二次生育小母豬的更大的幼仔。這種同步化動情期的方法如今已經(jīng)應(yīng)用在一些大規(guī)模的豬飼養(yǎng)業(yè)中，但這需要大量公豬和很多公豬畜欄。并且，流產(chǎn)的妊娠是不衛(wèi)生的，可能導(dǎo)致小母豬在流產(chǎn)后產(chǎn)生子宮內(nèi)膜異位。
每天對AI或繁殖期的各個動物的發(fā)情期進(jìn)行監(jiān)測仍然十分可靠，小母豬和母豬依然基于自發(fā)動情周期來繁殖。在豬繁殖事務(wù)中，需要投入約半數(shù)的勞動對繁殖小母豬或母豬動情進(jìn)行監(jiān)測。每天必須檢測至少一次小母豬或母豬，目的是在正確時間生產(chǎn)，而如果應(yīng)用AI，需要每天檢測2次以獲得最佳結(jié)果。必須嚴(yán)格監(jiān)測發(fā)情期，因為難以預(yù)測出任何處于周期內(nèi)的小母豬或開欄母豬的發(fā)情期日期，即使對于具有良好發(fā)情監(jiān)測結(jié)果的動物來說也是如此。小母豬在被首次檢測發(fā)情或恰好在與繁殖群吻合的時間檢測之前常常在小母豬欄內(nèi)呆3或4個周期。
用于小母豬中動情期同步化和增加斷奶幼仔體重的方法將顯著提高豬生產(chǎn)的效率。近年來的嘗試集中在對動情期的誘發(fā)，這是通過首先在大量動物中誘發(fā)假妊娠，隨后誘發(fā)動物動情。假妊娠是一種類似于妊娠的狀態(tài)，它發(fā)生在一些哺乳動物不育交配之后。在假妊娠中，在未受孕的情況下表現(xiàn)出妊娠的機(jī)體癥狀，例如缺乏性感受性、體重增加和乳房發(fā)育。
假妊娠可用現(xiàn)有或新出的市售藥品來誘發(fā)。通過在發(fā)情后第11天開始施用4至8天的雌激素可以在處于動情周期內(nèi)的小母豬中誘發(fā)假妊娠(Geisert等人，“豬中雌激素給藥的時間和持續(xù)期對假妊娠的長短和子宮蛋白釋放模式的影響”，J．Reprod．Fert．79163(1987)和Pusateri等人，“豬Ⅰ中妊娠的母體識別誘發(fā)周期小母豬中短期或長期假妊娠的外源性17β-雌二醇的最大要求”Biol．Reprod．55582-589(1992))。所述化合物通常以日基礎(chǔ)量通過注射給藥。
假妊娠小母豬保持其黃體(CL)60天左右，因此通過在假妊娠期間用PGF2α處理可以誘發(fā)出現(xiàn)“即時”發(fā)情。(Geisert等，(1987))假妊娠小母豬中的發(fā)情通常發(fā)生在PGF2α處理后3至6天。
日用注射劑或不得不取出的已注射的植入劑是不切實際的。適宜提供一種控制豬(尤其是小母豬)生殖途徑的方法，該方法不涉及日用注射劑或應(yīng)用需要在處理結(jié)束時取出的生物不可降解的注射植入劑。
所以，本發(fā)明的一個目的是提供一種控制豬，尤其是小母豬生殖途徑的方法，該方法不涉及日用注射劑或在處理結(jié)束時不得不取出的植入劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于控制豬的生殖途徑的制劑，該制劑采用符合FDA要求的天然雌激素或其酯。
本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)小母豬和母豬動情期和排卵的控釋組合物及其使用方法。所述方法包括給動物施用控釋組合物以誘發(fā)假妊娠，隨后給動物施用終止假妊娠和誘發(fā)動情期和黃體解體的組合物。人們可以通過誘發(fā)動物的假妊娠和隨后的動情期來管理大量小母豬和母豬的生殖循環(huán)。
所述控釋組合物優(yōu)選是微粒制劑或水凝膠。所述微粒適宜含有通過水解可以降解的可生物降解、生物相容性聚合物如聚丙交酯。除了微粒體系以外，還可以應(yīng)用其它適于誘發(fā)假妊娠藥物給藥的可注射或可植入控釋制劑。在可注射或可植入控釋制劑的制備中可以采用可降解賦形劑和不可降解賦形劑，但優(yōu)選可降解賦形劑。
適于誘發(fā)假妊娠的化合物包括雌激素和擬雌激素物質(zhì)(estrogenmimics)。適用的雌激素包括任何常規(guī)市售的那些雌激素，其中包括天然和合成雌激素。優(yōu)選雌激素是17β-雌二醇，一種天然甾類化合物。在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法包括肌肉內(nèi)注射單劑量控釋微球注射制劑，其中含有該天然甾類化合物17β-雌二醇。
適合用來終止假妊娠和誘發(fā)動情期的化合物包括PGF2α及其市售類似物，包括地諾前列素(dinotrost tromethamine)、前列苯烯(fenprostelene)、α-prosonol、氯前列烯醇(cloprostonol)、前列氟醇鈉(fluprostenol sodium)、魯前列醇鈉(luprosiol sodium)和前列他林(prostelene)。優(yōu)選的化合物是PGF2α，地諾前列素或前列苯烯，它們是以單劑量注射劑給藥。優(yōu)選該方法涉及LutalyseTM(地諾前列素，10mg)(Pharmaeia-UpjohnTM)的給藥以在假妊娠小母豬中誘發(fā)可控的動情期。
圖2是一個表示被處理小母豬中孕酮(P4)水平(pg／ml)的曲線圖。實心菱形代表載體。圓圈代表用12．5mg雌二醇處理。三角形代表用25mg雌二醇處理。方形代表用50mg雌二醇處理。X代表用100mg雌二醇處理。
圖3是一個表示用鹽水(小實心圓圈)、荷載雌二醇的微球(大實心圓圈)、存在于乙酸異丁酸蔗糖酯載體中的5(重量)％雌二醇(實心三角形)或存在于乙酸異丁酸蔗糖酯載體中的10(重量)％雌二醇(實心方形)處理的閹割動物中血漿雌二醇水平(pg／ml)的曲線圖。
圖4是一個表示用鹽水(小實心圓圈)、荷載雌二醇的微球(大實心圓圈)、存在于乙酸異丁酸蔗糖酯載體中的5(重量)％雌二醇(實心三角形)或存在于乙酸異丁酸蔗糖酯載體中的10(重量)％雌二醇(實心方形)處理的閹割動物中促黃體激素水平(pg／ml)的曲線圖。
圖5是一個表示用鹽水(小實心圓圈)、荷載雌二醇的微球(大實心圓圈)、存在于乙酸異丁酸蔗糖酯載體中的5(重量)％雌二醇(實心三角形)或存在于乙酸異丁酸蔗糖酯載體中的10(重量)％雌二醇(實心方形)處理的閹割動物中促卵泡激素水平(pg／ml)的曲線圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)小母豬和母豬的動情期和排卵的組合物和方法。所述組合物和方法能夠充分準(zhǔn)確地控制小母豬的動情期和排卵，由此在商業(yè)養(yǎng)豬單位中可以例行采用指定的人工授精(AI)。
所述方法包括給動物施用誘發(fā)假妊娠的控釋組合物，和隨后給所述動物施用終止假妊娠和誘發(fā)動情期和黃體解體的組合物。所述控釋組合物優(yōu)選是由可生物降解聚合物形成的微粒制劑。動物和制劑A．動物任何可生育的小母豬和母豬均可以用在此所述的組合物和方法處理。在一個優(yōu)選實施方案中，處于青春前期和160至200天齡的小母豬用PG 600TM(Intervet Inc．Millsboro DE)處理以誘發(fā)青春期，并且在處理后的3至6天內(nèi)對PG 600TM的處理產(chǎn)生響應(yīng)。
優(yōu)選利用上述小母豬是能夠在豬飼養(yǎng)中產(chǎn)生最大的效益。所述小母豬將具有由化學(xué)方式誘發(fā)的青春期、由化學(xué)方式誘發(fā)的假妊娠、由化學(xué)方式誘發(fā)的動情期和可以人工授精。這能夠最大程度地自動化和控制豬的繁殖周期。然而，除了由化學(xué)方式誘發(fā)青春期的那些以外小母豬應(yīng)對這種處理產(chǎn)生反應(yīng)。B．用于誘發(fā)假妊娠的化合物適用于誘發(fā)假妊娠的化合物包括雌激素和擬雌激素物質(zhì)。適用的化合物包括任何市售的那些，其中包括天然和合成雌激素。適用的合成雌激素包括那些在1993 Sigma化學(xué)公司目錄，398-402頁(該文獻(xiàn)在此引入作為參考)中公開的那些。其實例包括17α-雌二醇；雌二醇的一酯和二酯如醋酸雌二醇-17-酯，3，17-二醋酸雌二醇酯、3-苯甲酸雌二醇酯和十一烷酸雌二醇-17-酯；雌二醇的一醚和二醚；雌二醇17位的烷基衍生物如乙炔雌二醇和3-異丙基磺酸乙炔雌二醇酯、羥甲雌二醇(methyloestradiol)、quenistrol、美雌醇，和它們的混合物。適用的天然雌激素包括結(jié)合馬雌激素(congjugated equine estrogen)、17β-雌二醇、戊酸雌二醇酯、雌酮、哌嗪雌酮硫酸鹽、雌三醇、琥珀酸雌三醇和聚磷酸雌醇(polyestrol phosphate)。優(yōu)選該化合物是17β-雌二醇。C．控釋制劑制劑應(yīng)適宜在5至30天，優(yōu)選15至30天和更優(yōu)選25-30天的期間內(nèi)釋放出生理水平的用于誘發(fā)假妊娠的化合物。(1)微粒在此所用的術(shù)語“微?！卑ㄎ⑶蚝臀⒛?。為了誘發(fā)假妊娠化合物的給藥，所述微粒優(yōu)選優(yōu)選是可生物降解和生物相容的，并且任選能夠以可控速率生物降解。所述顆?？梢杂啥喾N聚合或非聚合性材料制成。(a)用于制備微粒的材料所述微粒可以包括任何生物相容，優(yōu)選可生物降解的聚合物、共聚物和混合物。適用的聚合物包括多羥基酸、聚原酸酯、聚內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚磷腈、多糖、蛋白質(zhì)、聚酐、它們的共聚物和它們的混合物。適用的聚(羥基酸)包括聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)和它們的共聚物。優(yōu)選的微粒包括聚(D，L-乳酸)和／或(D，L-乳酸-羥基乙酸)共聚物(“PLGA”)。優(yōu)選材料是聚丙交酯。
基于多種因素如制備微粒所用的材料等，可以設(shè)計和裝配出具有降解性能和釋放時間在數(shù)天至數(shù)月內(nèi)的顆粒。優(yōu)選的釋放時間是在約5至30天內(nèi)。
誘發(fā)假妊娠的化合物(優(yōu)選17β-雌二醇)優(yōu)選在數(shù)周，更優(yōu)選在25天至30天的期間內(nèi)以生理水平進(jìn)行釋放，由此甾類化合物在4至11天的初始窗口期間存在，該窗口出現(xiàn)在前一動情期后的第9至20天之間，這是誘發(fā)小母豬假妊娠所需要的。(b)微粒制備的方法微粒(包括微球和微囊)可以通過任何不破壞所用誘發(fā)假妊娠化合物的活性的方法來制備?？梢詰?yīng)用單和雙乳液溶劑蒸發(fā)法、噴霧干燥、溶劑提取、溶劑蒸發(fā)、相分離、簡單和復(fù)合凝聚、界面聚合和其它為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來制備。
文獻(xiàn)中公開了已經(jīng)開發(fā)出的給藥用微球的生產(chǎn)方法，例如，如Doubrow，M．，Ed．，“醫(yī)學(xué)和藥學(xué)中的微囊和毫微囊”CRC Press．BocaRaton，1992所述。也可以參見Tice等人的美國專利號5407609，和Herbert等人的美國專利號5654008中公開的微球制備方法。(2)其它控釋制劑除了微粒體系，可以應(yīng)用其它適于誘發(fā)假妊娠化合物給藥的可注射或可植入控釋制劑。在可注射或可植入控釋制劑的制備中可以采用可降解賦形劑和非降解賦形劑，但優(yōu)選可降解賦形劑。
可注射制劑的例子包括用油性和蠟狀賦形劑制備的局部用延效型制劑(例如類似于DepotTM)和原位膠凝體系如用乙酸異丁酸蔗糖酯或可生物降解聚合物制備的那些。
可植入制劑的實例包括壓制片劑如那些在牛中用來控釋促生長素的制劑(例如SynovexTM)，和CompudoseTM(用含有雌二醇的醫(yī)用硅橡膠薄層包衣的硅橡膠芯)。在一個實施方案中，可以應(yīng)用可生物降解凝膠和／或植入劑。
除了可植入制劑以外，還可以應(yīng)用易于插入和從動物中取出的多種制劑，例如陰道或子宮頸環(huán)、海綿(如由聚氨酯制備的海綿)和陰道內(nèi)植入劑。
可以采用類似于目前用于如牛和羊的陰道內(nèi)孕酮給藥的CIDR(控制內(nèi)部藥物釋放)的陰道內(nèi)植入劑。另一種植入劑稱作PRID(陰道內(nèi)孕酮釋放裝置)，該植入劑包括用含有孕酮的硅橡膠涂層的不銹鋼線圈，并且該制劑任選地包括含有雌二醇的明膠膠囊。
也可以應(yīng)用通過將活性物質(zhì)混合在聚合性賦形劑中制備的棒劑?？梢圆捎枚喾N方法來制備適用的棒劑，其中包括將活性化合物填充在由控速膜聚合物制成的管子中，或?qū)⒒钚曰衔锖唾x形劑化合，隨后通過擠出或模制來形成最終的植入劑。
利用任何上述途徑和常規(guī)藥物賦形劑，所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以開發(fā)出適當(dāng)?shù)闹苿?。D．用于終止假妊娠和誘發(fā)動情期的化合物適用于終止假妊娠和誘發(fā)動情期的化合物包括PGF2α、地諾前列素、前列苯烯、α-prosonol、氯前列烯醇、前列氟醇鈉、魯前列醇鈉和前列他林。優(yōu)選的化合物是PGF2α、地諾前列素和前列苯烯。優(yōu)選所述方法包括以單劑量注射施用LutalyseTM。處理方法A．假妊娠的誘發(fā)在豬中誘發(fā)假妊娠的時間窗口較窄。該窗口為4至11天，它發(fā)生在前一動情期后第9至20天之間。通過施用有效量的假妊娠誘發(fā)化合物，例如雌激素或擬雌激素物質(zhì)的控釋制劑來誘發(fā)假妊娠。所述化合物的釋放優(yōu)選在5至30天內(nèi)，更優(yōu)選在15至30天內(nèi)和首選25至30天內(nèi)發(fā)生。
當(dāng)施用的化合物是17β-雌二醇(小母豬產(chǎn)生相同的雌激素)時，5至30天內(nèi)的適用劑量是10至100mg／只給藥動物。所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員易于判斷出其它化合物的適當(dāng)劑量范圍。
在一個優(yōu)選實施方案中，緩釋制劑含有天然17β-雌二醇，該天然17β-雌二醇微囊包封在聚丙交酯微球中。所述微球具有優(yōu)異的生物相容性，在數(shù)周的時間內(nèi)可以自然生物降解為乳酸，在上述4至11天的窗口期間釋放出生理優(yōu)選水平的17β-雌二醇以誘發(fā)假妊娠，和釋放出有效量的化合物以誘發(fā)假妊娠。
所述組合物優(yōu)選經(jīng)肌肉內(nèi)注射給藥，優(yōu)選在頸側(cè)內(nèi)給藥。通過將針頭定向插入頸部厚肌肉系統(tǒng)的肌肉部分來完成上述肌肉內(nèi)注射。在注射之前，適宜將活塞輕輕回抽。如果注射器中出現(xiàn)血液，這表示針頭進(jìn)入了血管。應(yīng)抽出針頭并且選擇另外的位點。注射位點應(yīng)用適當(dāng)?shù)南緞┤鏐etadine_清潔。B．假妊娠的判定由中間動情時間間隔(IEI)明顯(P＜0．05)延長的出現(xiàn)和黃體作用下的孕酮持續(xù)分泌可以測定出假妊娠，黃體可以阻斷正?；謴?fù)至動情期，如在正常妊娠中出現(xiàn)的那樣。孕酮濃度高于1ng／ml表示黃體的存在。C．孕酮和雌二醇濃度的測定可以通過將動物取血且利用標(biāo)準(zhǔn)檢測方法如HPLC或免疫測定法分析血樣來測定孕酮和雌二醇的濃度?？梢苑謩e按照上述Stevenson等人Biol．Reprod．24341(1981)和Howard ＆ Britt，J．Reprod．Fert．90245(1990)所述的利用有效放射免疫分析(RIA)對豬的樣本進(jìn)行血清孕酮和雌二醇濃度的測定。D．假妊娠的終止和動情期的誘發(fā)假妊娠的終止和動情期的誘發(fā)可以通過給假妊娠小母豬施用有效量的PGF2α或其市售類似物來達(dá)到。所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員易于確定用于終止假妊娠和誘發(fā)動情期的PGF2α的有效量。一種可用于終止假妊娠和誘發(fā)動情期的含有PGF2α的市售制劑稱作LutalyseTM。LutalyseTM的臨床有效劑量約是10mg地諾前列素／頭動物。伴有排卵的正常動情期通常出現(xiàn)在注射后3至6天內(nèi)。大量豬，優(yōu)選假妊娠小母豬，優(yōu)選被同時處理以使豬全部恢復(fù)至動情期并且能夠同時受孕。一旦在豬中已經(jīng)同時獲得動情期時，可以將它們同時人工授精?？梢岳靡阎椒z測豬的妊娠，例如按照上述假妊娠測定中所述方法測定孕酮和雌二醇的血清濃度。除了小母豬以外，還可以處理母豬，但也可以利用斷奶程序控制它們。E．動情行為的測定通過目測檢查來核查小母豬的動情?；谟^察到的體征，將小母豬分為動情或未動情。所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知小母豬的優(yōu)勢陽性動情行為體征，這些體征是動情行為的特征。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員也熟知一般情況下小母豬優(yōu)勢陰性或非動情行為體征，這些體征是非動情行為的特征。
本發(fā)明將通過參見下列非限定實施例得到進(jìn)一步理解。實施例1用雌二醇微球調(diào)節(jié)小母豬的動情期和排卵實驗設(shè)計在180天齡的小母豬中進(jìn)行控制研究是為了證實單劑量注射控釋微球制劑一定能夠誘發(fā)假妊娠，隨后PG 600TM誘發(fā)青春動情排卵。在這個研究中對4個劑量的雌二醇微球作出評估。研究還證明了LutalyseTM(PGF2α，10mg)可以在以控制方式處理誘發(fā)黃體解體和動情期之后的第59天時在假妊娠小母豬中誘發(fā)可控動情期。
該研究被設(shè)計為平行組方案。將相同數(shù)量的小母豬隨機(jī)分為下列處理組安慰劑組；含有12．5mg17β-雌二醇的聚丙交酯微球組；25mg17β-雌二醇組；50mg17β-雌二醇組；100mg17β-雌二醇組。
為了避免解釋性偏見，只有未參與實驗準(zhǔn)備和注射給藥的研究人員才能作為各處理組的適當(dāng)研究人員。材料實驗動物所有小母豬在實驗之前滿足下列標(biāo)準(zhǔn)1．它們在用PG 600TM(Intervet Inc．Millsboro DE)處理之前是處于青春前期和在160和200天齡之間；和2．它們在處理后3至6天對PG 600TM的處理產(chǎn)生響應(yīng)，出現(xiàn)正常動情期。
表現(xiàn)出臨床生殖反常的小母豬、患有感染癥狀的小母豬和接受并行療法的小母豬均被排除在外。在豬飼養(yǎng)工業(yè)普遍采用的常規(guī)條件下管理小母豬，給動物喂食1．8-2．7kg-1的14％粗蛋白玉米／大豆飼料，該飼料中強(qiáng)化有維生素類物質(zhì)和礦物質(zhì)以符合國家研究委員會的推薦(NRC，1988)。微粒制劑利用溶劑提取法制備含有17-β雌二醇(E2)的聚(DL-丙交酯)微球，其中將聚(DL-丙交酯)(Birmingham Polymers，Inc．，Birmingham，AL)、E2和溶劑分散在水中，隨后除去溶劑，得到所需微球。此后通過過濾收集微球。用純水充分洗滌且真空干燥。在暴露于γ射線下滅菌后的微球通過球芯荷載、SEM表面形態(tài)學(xué)和粒度分析得到鑒定。
采用含有這些微球的單劑量注射控釋制劑。以四個不同劑量的17β-雌二醇給藥12．5mg，25mg，50mg，和100mg。注射載體(0mg 17β-雌二醇)用作安慰劑(0mg組)。方法藥物的包裝和儲藏藥物是以無菌瓶提供，該瓶按照FDA規(guī)定標(biāo)簽，保藏在冷凍(2-8℃)下直至使用。劑量的制備在使用之前加熱(不超過25℃)無菌注射載體。將滅菌的16或18規(guī)格的針頭插入滅菌注射載體的瓶中以釋放真空。將空的注射器和針頭相接。將裝有載體的瓶子倒置，從多劑量瓶中抽出適當(dāng)體積的載體。將載體注射到含有微球的瓶子中標(biāo)簽抽出針頭。劇烈振搖該瓶子至少1分鐘以使微球懸浮在載體中。當(dāng)微球被很好地分散后，將它們抽吸到注射器(對于接受25、50或100mg劑量雌二醇的小母豬是約1ml，和對于接受12．5mg劑量的小母豬約是0．5ml)中。重要的是在2分鐘內(nèi)將微球的懸浮液注射完畢以防止微球沉淀。肌肉內(nèi)注射給藥途徑是通過在頸側(cè)中肌肉內(nèi)注射給藥。通過將針頭定向插入頸部厚肌肉系統(tǒng)的肌肉部分來完成上述肌肉內(nèi)注射，避開血管和主神經(jīng)。在懸浮液注射之前，將活塞輕輕回抽以判斷是否插入了血管。在插入血管的那些情況中，應(yīng)抽出針頭并且選擇另外的位點。對處理反應(yīng)的評估Ⅰ．動情行為的判定從首次發(fā)情后第18天開始至第22天，每天檢查1次或2次小母豬。基于觀察的體征將小母豬分為動情(符號E表示動情)，如果它們表現(xiàn)出優(yōu)勢陽性動情行為體征，這些體征是小母豬動情行為的特征。表現(xiàn)為優(yōu)勢陰性或非動情行為體征的小母豬分為(符號D表示未動情)未動情，這些體征是小母豬非動情行為的特征。PGF2α處理后按照上述方法檢查小母豬的動情期。ⅱ．假妊娠的測定根據(jù)小母豬經(jīng)歷的顯著(P＜0．05)中間動情時間間隔(IEI)和黃體作用下的孕酮持續(xù)分泌可以判定出假妊娠。孕酮濃度高于1ng／ml被認(rèn)為是黃體存在的指征。僅僅是出于本實施例的目的，將最大假妊娠反應(yīng)定義為小母豬保持假妊娠直至第59天，在這天施用了LutalyseTM(即IEI大于或等于59天)。ⅲ．孕酮和雌二醇濃度的測定樣本收集的時間在雌二醇處理之前(第14天)和此后每周從所有動物抽取兩次血液直至研究的第73天。ⅳ．樣本處理用滅菌真空管(Becton-Dickinson)通過頸靜脈穿刺術(shù)收集血清樣本。將管貼上標(biāo)簽，寫明動物、日期和血樣。令血樣在4℃下凝結(jié)過夜且通過在離心后傾析上清液來收集血清。將血清保藏在-20℃下直至進(jìn)行孕酮和雌二醇分析。ⅴ．激素分析分別按照上述Stevenson等人Biol．Reprod．24341(1981)和Howard＆ Britt，J．Reprod．Fert．90245(1990)所述的，利用有效放射免疫分析(RIA)對豬的樣本進(jìn)行血清孕酮和雌二醇濃度的測定。對處理反應(yīng)的分析評估下列標(biāo)準(zhǔn)以分析小母豬對上述處理的反應(yīng)a)黃體壽命(通過監(jiān)測孕酮濃度來測定)；b)乳房評分；c)小母豬在第59天假妊娠的百分率；和d)假妊娠小母豬對第59天PGF2α處理反應(yīng)的百分率。實驗方法(在第0天時)用PG600TM(Intervet Inc．，millsboro DE)誘發(fā)40頭180天齡小母豬排卵。14天后，將小母豬隨機(jī)接受五種盲處理(n=8／組)中的一種處理。處理采用存在于聚(DL-丙交酯)微球中的0mg雌二醇(E2)(載體)或12．5，25，50或100mg E2。樣本的收集是在雌二醇處理之前和此后每周從所有動物抽取兩次血液直至研究的第73天，以監(jiān)測孕酮(P4)和E2的濃度。
在18至26天，用無傷公豬測定是否恢復(fù)至動情期。在第59天，給小母豬注射10mg PGF2α并且在7天內(nèi)用無傷公豬檢查動情期。在第62天，對乳房發(fā)育進(jìn)行評分(0=未發(fā)育；1=有一些發(fā)育；2=乳頭和乳腺發(fā)育)。用最小平方ANOVA來分析乳房評分、E2峰濃度和黃體(CL)壽命(P4＞1ng／ml)。用卡方分析法來分析在第59天具有機(jī)能性CL的小母豬的百分率和對PGF2α處理產(chǎn)生反應(yīng)的百分率。結(jié)果和討論表1中所列的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)檢驗強(qiáng)有力地提示了，基于持續(xù)的CLP4分泌大于1ng／ml，雌二醇微球可以促進(jìn)假妊娠。E2在大于25mg的劑量下處理也可以顯著促進(jìn)被處理小母豬的乳房發(fā)育。
不包括3頭對PG 600TM無反應(yīng)的小母豬；a，b(P＜0．05)E2的血清濃度是在處理后10至30天進(jìn)行評估(p＜0．05)，它依賴于劑量，對于0、12．5、25、50和100mg組來說分別在59、1649、3700、4579和6635pg／ml出現(xiàn)峰值。平均血清E2水平如

圖1所示。
如圖2所示，E2處理后的平均血清P4水平在所有雌二醇處理組中保持在增高的黃體或假妊娠水平50天以上(P4大于1ng／ml)。該數(shù)據(jù)具有顯著性差異(p＜0．05)。這個數(shù)值證實了雌二醇誘發(fā)假妊娠的有效性。結(jié)論為在16至26天期間釋放生理有效水平的17β-雌二醇所設(shè)計的控釋聚丙交酯微球能夠成功地誘發(fā)小母豬假妊娠長達(dá)50天以上。在誘發(fā)假妊娠后，通過施用PGF2α的市售類似物可以終止假妊娠和誘發(fā)動情期。誘發(fā)假妊娠隨后誘發(fā)動情期的優(yōu)點在于可以控制大量小母豬的繁殖模式。實施例2乙酸異丁酸蔗糖酯制劑中的雌二醇的可生物降解給藥體系概述本研究的目的是制備以乙酸異丁酸蔗糖酯(SAIB)為基質(zhì)的雌二醇制劑，該制劑具有類似于應(yīng)用可生物降解微球制劑所獲得的那些體內(nèi)藥代動力學(xué)釋放特征。所述給藥體系采用SAIB作為高粘度基質(zhì)化合物以在特定時間內(nèi)為活性物質(zhì)提供控釋。在加入少量溶劑的情況下，高粘度組分SAIB轉(zhuǎn)化為易于注射的液體。一旦進(jìn)入機(jī)體，溶劑消散，生產(chǎn)半固體、可生物降解的植入劑。應(yīng)用不同的溶劑和調(diào)節(jié)劑可以使釋放時間由數(shù)小時變化為數(shù)月。除了雌二醇在血液中的濃度以外，還需對基于兩種促性腺激素濃縮物處理的生物反應(yīng)、促黃體激素(LH)和促濾泡激素(FSH)進(jìn)行評估。實驗方法制劑制備11種含有不同含量溶劑或添加劑[例如Burns等人，Proc．CRSConference控釋給藥的進(jìn)展(Baltimore，MD，Abstract No．639(1996))所述的體外實驗用可生物降解聚合物]的SAIB基質(zhì)型制劑?；谶@些制劑的體外評估，選出兩種進(jìn)行體內(nèi)實驗。制劑1含有SAIB∶乙醇的比例是85∶15和5(重量)％雌二醇，劑量為2ml。制劑2含有SAIB∶乙醇的比例是85∶15和10(重量)％雌二醇，劑量為1ml。所述可生物降解雌二醇微球制劑是采用溶劑提取方法來制備，其中將聚(DL-丙交酯)(Birmingham Polymers，Inc．，Birminghamm AL)、雌二醇和溶劑的混合物在水中乳化，隨后除去溶劑，生產(chǎn)離散微球。此后通過過濾收集微球，用大量純水洗滌，真空干燥。在暴露于γ射線下滅菌后，本研究所用的微球的特征通過核芯荷載，分析SEM表面形態(tài)學(xué)和粒度得以鑒定。體內(nèi)評估采用12匹活躍的6至12歲的閹割馬，它們體重為490至560kg并且身體狀況、性情和健康良好。選3匹閹割馬接受2ml生理鹽水的肌肉內(nèi)注射(i．m．)作為陰性對照。在處理組中，3匹閹割馬接受在2ml注射載體中含有100mg 17β-雌二醇的微球懸浮液的肌肉內(nèi)注射，作為陽性對照；3只閹割馬匹接受SAIB制劑，該制劑為5％溶液(肌肉內(nèi)注射2ml)或10％溶液(注射1ml)。在處理注射前24小時和注射之前即時由所有閹割馬匹取頸靜脈血液樣本，隨后在注射后第1、3、6和24小時以及第2、5、8、11、14、17、20、23、26和29天取所有閹割馬匹的頸靜脈血液樣本。收獲全部樣本的肝素化血漿，利用放射免疫測定血漿中雌二醇、LH和FSH的濃度。應(yīng)用SAS的GLM程序通過方差split-plot分析法來分析數(shù)據(jù)。結(jié)果鹽水處理對照閹割馬匹中的雌二醇濃度始終很低且在試驗期間沒有變化(p＞0．1)，如圖3所示。注射存在于微球內(nèi)的100mg雌二醇導(dǎo)致雌二醇濃度在24小時內(nèi)開始升高至30pg／ml，并且在注射后第8天達(dá)到濃度峰值40pg／ml并且在17天內(nèi)保持高水平(p＜0．01)，如圖3所示。
注射100mg存在于SAIB制劑1中的雌二醇的5％溶液可以導(dǎo)致雌二醇濃度在注射后的第1個小時內(nèi)開始升高直至112pg／ml(p＜0．01)，該濃度在24-48小時內(nèi)衰減至45pg／ml。隨后雌二醇濃度在此后18天期間逐漸衰減，但仍然在注射后第20天保持在升高的11pg／ml。注射100mg存在于SAIB制劑2中的雌二醇的10％溶液可以導(dǎo)致雌二醇濃度在注射后的第1個小時內(nèi)開始升高直至30pg／ml(p＜0．01)，該濃度在24-48小時內(nèi)衰減至15-19pg／ml。隨后雌二醇濃度逐漸升高，在第8天達(dá)到峰值57pg／ml，此后逐漸衰減，在注射后第20天達(dá)到13pg／ml。圖3表述SAIB制劑的雌二醇水平。
在對雌二醇注射的反應(yīng)中，在8-12天期間，血漿LH濃度在全部三組中升高(P＜0．01)。LH濃度在閹割馬匹接受雌二醇微球17天后逐漸降低，但接受兩種SAIB制劑的閹割馬匹在29天期間LH濃度較高(P＜0．05)。血漿LH水平如圖4所示。
如圖5所示，血漿FSH濃度在所有三組接受雌二醇的閹割馬匹中均降低(P＜0．01)。SAIB的10％制劑引起的降低最大。結(jié)論適宜用SAIB給藥體系來配制控釋雌二醇制劑，該制劑可以在16至20天的期間內(nèi)釋放出類似于應(yīng)用微球制劑所獲得的生理有效水平的雌二醇。
權(quán)利要求
1．一種用于在可繁殖雌豬中誘發(fā)假妊娠的方法，該方法包括給所述豬施用有效量的誘發(fā)假妊娠的化合物，該化合物存在于控釋制劑內(nèi)。
2．權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括在誘發(fā)假妊娠之前通過化學(xué)方式在小母豬中誘發(fā)青春動情期。
3．權(quán)利要求2所述的方法，其中所述青春動情期是通過施用孕馬血清促性腺激素和人絨毛促性腺激素的混合物來誘發(fā)。
4．權(quán)利要求1所述的方法，其中所述制劑含有微粒，所述微粒可以以控制方式在5至30天的時間內(nèi)釋放出生理有效水平的所述化合物。
5．權(quán)利要求4所述的方法，其中所述微粒包括可生物降解的聚合物。
6．權(quán)利要求5所述的方法，其中所述聚合物選自聚羥基酸、聚原酸酯、聚內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚磷腈、多糖、蛋白質(zhì)、聚酐，它們的共聚物和它們的混合物。
7．權(quán)利要求6所述的方法，其中所述聚合物選自聚乳酸、聚羥基乙酸和乳酸-羥基乙酸共聚物。
8．權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物選自17β-雌二醇、雌二醇一酯、雌二醇二酯、雌二醇一醚、雌二醇二醚、雌二醇17位的烷基衍生物、結(jié)合馬雌激素、雌酮、哌嗪雌酮硫酸鹽、雌三醇、琥珀酸雌三醇、聚磷酸雌醇、17α-雌二醇，和它們的混合物。
9．權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物選自雌二醇、雌酮、雌三醇，它們的酯和它們的混合物。
10．權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括施用在小母豬或母豬假妊娠時誘發(fā)動情期的組合物。
11．權(quán)利要求10所述的方法，該方法進(jìn)一步包括對小母豬和母豬進(jìn)行人工授精。
12．權(quán)利要求1所述的方法，其中所述制劑包括原位膠凝體系。
13．權(quán)利要求12所述的方法，其中所述制劑含有乙酸異丁酸蔗糖酯。
14．權(quán)利要求1所述的方法，其中所述制劑是可植入的和可以在化合物釋放以后從豬中取出的。
15．一種用于在小母豬或母豬中誘發(fā)假妊娠的組合物，該組合物包含在小母豬或母豬中誘發(fā)假妊娠的化合物的控釋制劑。
16．權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述制劑含有微粒。
17．權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述化合物選自17β-雌二醇、雌二醇一酯、雌二醇二酯、雌二醇一醚、雌二醇二醚、雌二醇17位的烷基衍生物、結(jié)合馬雌激素、雌酮、哌嗪雌酮硫酸鹽、雌三醇、琥珀酸雌三醇、聚磷酸雌醇、17α-雌二醇，和它們的混合物
18．權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述化合物選自17β-雌二醇、雌酮、雌三醇，它們的酯和它們的混合物。
19．權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述微粒含有選自聚羥基酸、聚原酸酯、聚內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚磷腈、多糖、蛋白質(zhì)、聚酐，它們的共聚物和它們的混合物。
20．權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述聚合物選自聚乳酸、聚羥基乙酸和乳酸-羥基乙酸共聚物。
21．權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述化合物是17β-雌二醇，所述聚合物是聚丙交酯。
22．權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述制劑包括原位膠凝體系。
23．權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述制劑含有乙酸異丁酸蔗糖酯。
24．一種在可繁殖雌豬中誘發(fā)假妊娠的可植入裝置，該裝置包括誘發(fā)假妊娠的化合物的控釋制劑，其中所述裝置可以在化合物釋放后從豬中取出。
25．權(quán)利要求24所述的裝置選自子宮頸環(huán)、陰道環(huán)、海綿和其它陰道內(nèi)植入劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于誘發(fā)小母豬和母豬假妊娠的控釋組合物和方法。在優(yōu)選實施方案中,所述制劑包括在5至30天內(nèi)釋放生理有效水平的17β雌二醇的聚丙交酯微球。在誘發(fā)假妊娠后,通過施用化合物例如PDF2α來終止假妊娠和誘發(fā)動情期。誘發(fā)假妊娠后誘發(fā)動情期的優(yōu)點是可以控制大量小母豬和母豬的繁殖模式。
文檔編號A61K38/24GK1291101SQ99803109
公開日2001年4月11日 申請日期1999年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月19日
發(fā)明者帕特里克·J·伯恩斯 申請人:荊棘生物科學(xué)股份有限公司