專利名稱：治療含有雙微體dna的細(xì)胞的組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及用于治療癌癥等腫瘤病的新型治療藥物的篩選方法以及該藥物在癌癥治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
引用出版物貫穿該申請(qǐng)的整個(gè)范圍，其文獻(xiàn)目錄中的全部引文均可在該申請(qǐng)的正文或緊接權(quán)利要求書前的說(shuō)明書結(jié)尾處找到。為了能更充分地描述與本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)發(fā)展水平，這些出版物的公開內(nèi)容和發(fā)表的專利說(shuō)明書、著作以及發(fā)行的專利均在文中作為參考引入該公開內(nèi)容中。
眾所周知，在一種先導(dǎo)組分被發(fā)現(xiàn)之前和被發(fā)現(xiàn)之后，導(dǎo)致新藥鑒定的藥物研究通常涉及對(duì)極大量的待選物質(zhì)進(jìn)行篩選。這是導(dǎo)致藥物研究投資大、周期長(zhǎng)的因素之一，因此一種可輔助篩選的方法將會(huì)具有相當(dāng)大的商業(yè)價(jià)值和實(shí)用性。
許多藥物通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)DNA相互作用而發(fā)揮其療效。一些藥物則以矯正遺傳異常為目標(biāo)，遺傳異常的積累可導(dǎo)致某種患病狀態(tài)。例如，在癌癥發(fā)展期間通常會(huì)產(chǎn)生基因突變，它會(huì)大大提高堿基替換或大規(guī)模染色體重排的頻率。舉例來(lái)說(shuō)，涉及p53腫瘤抑制基因的細(xì)胞周期調(diào)控途徑出現(xiàn)缺陷會(huì)形成一種允許環(huán)境，處在該環(huán)境中的細(xì)胞將對(duì)抗代謝物或癌基因過(guò)表達(dá)所造成的壓力產(chǎn)生應(yīng)答，從而高頻率地出現(xiàn)非整倍性、染色體易位和基因擴(kuò)增(Livingstone，et al.(1992)；Yin，et al.(1992)and Denko，et al.(1994))。
修復(fù)及細(xì)胞周期調(diào)控功能有缺陷的細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生的異常染色體結(jié)構(gòu)類型可能受核結(jié)構(gòu)的限制。例如，具有很長(zhǎng)的臂的染色體會(huì)傾向于產(chǎn)生核突起物，該突起物在不同情況下被稱為“泡”或“芽”(Ruddle(1962)；Lo and Fraccaro(1974)；Toledo，et al.(1992)andPedeutour，et al.(1994))。最近在豌豆中進(jìn)行的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，單染色體臂內(nèi)的過(guò)量DNA產(chǎn)生了一種核突起物，該突起物在末期后細(xì)胞分裂板形成時(shí)被切除(Schubert and Oud(1997))。在微核內(nèi)經(jīng)常會(huì)檢測(cè)到該突起物所包含的序列，提示突起物可能是微核的前體(Toledo，et al.(1992)and Pedeutour，et al.(1994))，并且其包含的染色體序列可能從核中丟失。這些數(shù)據(jù)表明，特定細(xì)胞類型的核內(nèi)的每個(gè)染色體臂存在一個(gè)最大容許長(zhǎng)度。
癌細(xì)胞中還經(jīng)常產(chǎn)生如雙微染色體(DMs)等自主復(fù)制的環(huán)狀DNA片段(Barder(1982)；Cowell(1982)and Benner，et al.(1991))。由這些結(jié)構(gòu)編碼的蛋白可在體內(nèi)提供生存優(yōu)勢(shì)，或在體外抵抗多種化學(xué)治療藥物(見Wahl(1989)；Brison(1993)；Von Hoff，et al.(1992)；Shimizu，et al.(1994)and Eckhardt，et al.(1994))。DMs采用細(xì)胞起源的復(fù)制起點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制(Carroll，et al.(1993))，但它們?nèi)狈χz粒，不能利用與染色體相同的機(jī)制進(jìn)行分離。因此，DMs在缺乏選擇的情況下自然丟失。諸如羥基脲等藥物可顯著提高人類和嚙齒類細(xì)胞系內(nèi)DMs的丟失率(Snapka and Varshavsky(1983)；Von Hoff，et al.(1991)；Von Hoff，et al.(1992)；Eckhardt，et al.(1994)and Canute，et al.(1996))。DMs的丟失可導(dǎo)致藥物敏感性增加、致腫瘤性降低、或?qū)е路只?，這取決于DM編碼基因所表達(dá)的蛋白(Snapka and Varshavsky(1983)；Snapka(1992)；Von Hoff，et al.(1992)；Eckhardt，et al.(1994)and Shimizu，et al.(1994))。為此，確定DMs丟失的機(jī)制將能夠發(fā)展出嶄新的或更具選擇性的化學(xué)治療策略，因?yàn)镈Ms僅能夠在癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，這種治療將不會(huì)導(dǎo)致染色體丟失。
另有報(bào)導(dǎo)，DMs與異常長(zhǎng)染色體臂一樣，可被優(yōu)先摻入到將從胞內(nèi)去除的微核內(nèi)(VonHoff，et al.(1992)and Shimizu，et al.(1996))。很明顯，僅靠尺寸小是不能保證DNA片段被選擇性封裝在微核內(nèi)的，因?yàn)榫哂械湫虳M大小的著絲點(diǎn)微染色體被選擇性排斥在微核之外(Shimizu，et al.(1996))。這一觀察結(jié)果與小核形成的經(jīng)典機(jī)制相符，該過(guò)程涉及在有絲分裂末期核膜重組時(shí)封裝滯后的無(wú)著絲點(diǎn)染色體片段(Heddle and Carrano(1977)and Heddle，et al.(1983))。由此，可認(rèn)為DMs是在有絲分裂后被封裝在微核內(nèi)的，因?yàn)樗鼈兺ǔ２痪哂泄δ苄灾z粒(Levan，et al.(1976))。但DMs似乎能夠與染色體或核仁結(jié)合，使它們大多能夠逃避這種有絲分裂后機(jī)制。DMs這種通過(guò)與有絲分裂染色體或核仁結(jié)合而“搭便車”的能力可提供一種解釋，來(lái)說(shuō)明為何在含有大量DMs的細(xì)胞系內(nèi)幾乎檢測(cè)不到中間體中有微核(Levan and Levan(1978))，而且它們?cè)谀承┘?xì)胞系中能夠以驚人的效率分配到子細(xì)胞中(Levan and Levan(1978)and Hamkalo，et al.(1985))。但正常染色體與DMs的間期行為可能不同，因?yàn)镈Ms缺乏著絲粒和/或端粒，而著絲粒和端粒能夠使染色體定位于限定區(qū)域并產(chǎn)生一套設(shè)計(jì)好的S期染色體移動(dòng)線路(De and Mintz(1986)and Cremer et al.(1993))。目前還未能確定間期時(shí)無(wú)著絲點(diǎn)DM DNA所占據(jù)的位置是否與染色體有所不同，以及這是否能使它們通過(guò)與異常長(zhǎng)染色體的觀測(cè)結(jié)果相類似的出芽過(guò)程而從核中去除(Ruddle(1962)；Jackson and Clement(1974)；Lo and Fraccaro(1974)；Miele，et al.(1989)andToledo，et al.(1992))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及從待選物質(zhì)中篩選潛在的藥學(xué)制劑。更詳細(xì)而言，本發(fā)明提供一種方法，通過(guò)該方法可就測(cè)試物通過(guò)微核形式而抑制、增強(qiáng)或消除細(xì)胞內(nèi)雙微體DM或額外染色體DNA的能力而對(duì)其進(jìn)行篩選。
本發(fā)明還提供一種方法，用于誘導(dǎo)具有DM DNA或額外染色體DNA的細(xì)胞的成熟或死亡。將適當(dāng)細(xì)胞與文中定義的一種藥劑相接觸，從而利用微核形成的方法將DM DNA或額外染色體DNA從細(xì)胞內(nèi)消除。
本發(fā)明進(jìn)而提供一種治療方法，通過(guò)將文中定義的一種藥劑以有效劑量向受試者給藥來(lái)治療受試者所患的疾病。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)染色體DNA及額外染色體DNA的方法。本方法需要將一種經(jīng)可檢測(cè)標(biāo)記的蛋白插入細(xì)胞，其中該蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)染色體DNA特異結(jié)合，然后檢測(cè)標(biāo)記，從而檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的染色體DNA和額外染色體DNA。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-D”顯示選擇性包載DMs的核出芽過(guò)程。經(jīng)甲醇/醋酸固定的COLO 320DM細(xì)胞用RNAse處理，用來(lái)自純化微核的生物素標(biāo)記DNA雜交，再用偶聯(lián)FITC的抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)雜交探針。細(xì)胞核用碘化丙錠(PI)復(fù)染。圖1A為前中期圖，說(shuō)明DM著色探針的特異性并證明前中期染色體周圍的DMs周邊定位。箭頭指明一個(gè)與染色體整合的HSR區(qū)域。這些DMs被選擇性摻入間期核形成的核芽?jī)?nèi)(圖1B至1D，箭頭所示)。核芽似乎以很高的選擇性俘獲DM，因?yàn)楹搜績(jī)?nèi)明顯有三個(gè)強(qiáng)烈的PI陽(yáng)性信號(hào)(圖1D)，它們均被FITC FISH探針強(qiáng)烈標(biāo)記(圖1D’)，以及合并圖像(圖1D”)。
圖2A-2F顯示COLO 320DM細(xì)胞同步培養(yǎng)物中微核及核芽的形成。利用下文所述的兩步法將COLO 320DM細(xì)胞同步于G1/S交界。將培養(yǎng)物分為兩部分，并在不加入任何藥物(圖2A、2C和2E)，或加入0.4mg/ml諾考達(dá)唑(圖2B、2D和2F)的情況下釋放。分別測(cè)定[3H]胸腺嘧啶摻入(實(shí)心圓)和有絲分裂細(xì)胞指數(shù)(空心圓)以分別監(jiān)控同步穿越S期和M期的進(jìn)程(圖2A和2B)。在經(jīng)DAPI染色的玻片上測(cè)定總微核數(shù)(實(shí)心圓)和總核芽數(shù)(空心圓)(圖2C和2D)。在經(jīng)純化微核探針雜交的玻片上測(cè)定DM+微核數(shù)(實(shí)心圓)或DM+核芽數(shù)(空心圓)(圖2E和2F)。這些值均以相對(duì)于間期核計(jì)數(shù)的出現(xiàn)頻率形式表示(每個(gè)點(diǎn)的采樣數(shù)均大于1000)。
圖3A和3B顯示各種藥物對(duì)微核誘導(dǎo)及細(xì)胞周期分布的影響。COLO 320DM細(xì)胞用所示濃度的DNA復(fù)制抑制劑(阿非迪霉素(“APH”)；去鐵胺(“Def”)；胍唑(“Gua”)；羥基脲(“HU”)；及PALA)、DNA修復(fù)抑制劑(香豆素(“Cou”)；煙酰胺(“NA”))或膜活化劑DMSO處理3天。在圖3A中，經(jīng)處理的細(xì)胞用甲醇/醋酸固定并用c-myc粘粒探針雜交。計(jì)算被c-myc探針明亮染色的微核數(shù)并以相對(duì)于間期核計(jì)數(shù)的“c-myc+微核出現(xiàn)頻率(％)”形式表示(每個(gè)點(diǎn)的采樣數(shù)均大于1000)。在圖3B中，細(xì)胞在藥物處理末期用BrdU進(jìn)行脈沖標(biāo)記(30分鐘)，并通過(guò)下述的流式細(xì)胞光度計(jì)方法進(jìn)行分析，以確定G1、S和G2/M期的細(xì)胞數(shù)。
圖4A-4F顯示DMs在COLO 320DM間期核內(nèi)的定位。由COLO 320DM細(xì)胞培養(yǎng)物分離的核用PFA固定，并用DM-染色探針進(jìn)行雜交，然后用PI復(fù)染。每個(gè)核中心附近的光截面是利用共焦激光掃描顯微鏡獲得。圖中顯示來(lái)自快速生長(zhǎng)培養(yǎng)物的三個(gè)代表性細(xì)胞核圖像(見圖4A至4C)和來(lái)自100μM羥基脲處理3天的培養(yǎng)物的三個(gè)代表性圖像(見圖4D至4F)。如箭頭所示，未處理培養(yǎng)物中的DMs只優(yōu)先定位于核膜下。而HU處理培養(yǎng)物的核內(nèi)則極少觀察到周邊DMs，并且圖中顯示大多數(shù)信號(hào)都很好地位于細(xì)胞核內(nèi)部。
圖5A-5C顯示DMs和隨染色體擴(kuò)增的序列的核定位定量分析。由COLO 320DM細(xì)胞(見圖5A)、100μM HU處理3天的COLO 320DM細(xì)胞(見圖5B)和具有隨染色體擴(kuò)增c-myc序列的快速生長(zhǎng)COLO 320細(xì)胞(COLO 320HSR)(見圖5C)的快速生長(zhǎng)培養(yǎng)物分離出的核用識(shí)別c-myc擴(kuò)增子的探針進(jìn)行雜交。圖4顯示所獲得的每類細(xì)胞核的中心截面。測(cè)定每個(gè)截面中各雜交信號(hào)的位置和強(qiáng)度。各分析結(jié)果代表對(duì)100個(gè)隨機(jī)選定的核的測(cè)量結(jié)果。橫坐標(biāo)表示距核中心的距離數(shù)(0為中心，1為周邊)，縱座標(biāo)表示在100個(gè)核中觀測(cè)到的各位置的信號(hào)數(shù)。曲線圖顯示每核體積內(nèi)各位置信號(hào)的理論隨機(jī)分布曲線，圖下方為更詳細(xì)的說(shuō)明。
圖6A-6C顯示DM DNA復(fù)制與COLO-320DM細(xì)胞凋亡的分析。在圖6A和6B中，快速生長(zhǎng)COLO-320DM細(xì)胞培養(yǎng)物用10μM BrdU脈沖標(biāo)記1小時(shí)。分離出細(xì)胞核，并用PFA固定，再用生物素標(biāo)記的DM染色探針雜交，按圖4中的方法用結(jié)合FITC的抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)。結(jié)合BrdU的位點(diǎn)先用小鼠抗-BrdU單克隆抗體再用結(jié)合羅丹明的抗小鼠免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)。用共焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)雙標(biāo)記的核。圖中顯示兩個(gè)典型視野的BrdU圖像、FISH圖像以及合并圖像(紅偽色代表BrdU，綠偽色代表FISH)。箭頭指明選擇性包載DMs的核芽，三角箭頭指明脈沖標(biāo)記(BrdU-)時(shí)不處于S期的細(xì)胞。圖6C概括了利用下文所述TUNEL法進(jìn)行的COLO 320DM細(xì)胞凋亡分析的結(jié)果。在獲得該典型照片的實(shí)驗(yàn)中，COLO 320DM細(xì)胞用100μM HU處理3天。箭頭指明一個(gè)非凋亡細(xì)胞內(nèi)的核芽，三角箭頭指明同一視野內(nèi)的一個(gè)凋亡細(xì)胞。
圖7A-7D說(shuō)明p53缺乏可使正常人二倍體成纖維細(xì)胞的S期出芽及微核形成增加。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生野生型(wt)WS1人二倍體成纖維細(xì)胞、或表達(dá)新霉素抗性基因(neo)的轉(zhuǎn)化體或既表達(dá)neo又表達(dá)人乳頭狀瘤病毒E6蛋白(E6)的轉(zhuǎn)化體。在不加入或以所示濃度加入HU或PALA的情況下將這些細(xì)胞培養(yǎng)3天。圖7A顯示在蓋片上生長(zhǎng)的經(jīng)上述方法處理并固定和DAPI染色的細(xì)胞。計(jì)算微核數(shù)，并以相對(duì)于間期核計(jì)數(shù)的微核出現(xiàn)頻率(％)形式表示(每個(gè)點(diǎn)的采樣數(shù)均大于1000)。圖7B顯示按圖2B方法檢查的這些藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響。在圖7C和7D中，利用下文所述方法將WS1 neo(三角形)或WS1 E6(圓形)培養(yǎng)物同步于G1/S交界，并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中釋放。在圖7C中，通過(guò)加入[3H]胸腺嘧啶來(lái)監(jiān)控穿越S期或M期的進(jìn)程(實(shí)心符號(hào))，或通過(guò)中期細(xì)胞數(shù)的顯微檢測(cè)方法確定有絲分裂細(xì)胞數(shù)(空心符號(hào))。圖7D中，將蓋片上的細(xì)胞固定，DAPI染色，并計(jì)算相對(duì)于間期核數(shù)的微核出現(xiàn)頻率。每個(gè)點(diǎn)計(jì)算的核數(shù)均大于500，并且結(jié)果表示為WS1 neo及WS1-E6細(xì)胞的平均±S.D形式(每種細(xì)胞株獨(dú)立測(cè)定3次；WS1 neo數(shù)據(jù)點(diǎn)的誤差范圍小于符號(hào)的大小)。測(cè)定同一玻片上的核出芽頻率，以確定微核形成系數(shù)(每個(gè)點(diǎn)的核采樣數(shù)均大于1000)。
圖8顯示H2B-GFP嵌合肽的示意圖。H2B肽(239個(gè)氨基酸殘基)結(jié)合在GFP肽(126個(gè)氨基酸殘基)的C-端(H2B-G)或N-端(G-H2B)。圖中給出H2B肽和GFP肽連接處的額外氨基酸數(shù)。N-端的組蛋白尾加陰影框顯示。
圖9顯示表達(dá)H2B-GFP的細(xì)胞。圖為組成型表達(dá)H2B-GFP的HeLa活細(xì)胞的共焦顯微圖像。H2B-GFP熒光顯示為反射模式圖像。
圖10A-10D說(shuō)明，H2B-GFP結(jié)合到單核小體內(nèi)部。圖10A顯示HeLa細(xì)胞核及表達(dá)H2B-GFP的HeLa細(xì)胞核的細(xì)球菌核酸酶消化結(jié)果。將分離的核消化0、1、5、10、15、30和60分鐘。純化通過(guò)結(jié)合核小體核心蛋白而免受消化的DNA，并按照材料與方法中的詳細(xì)描述進(jìn)行分析。圖10B顯示單核小體群體的蔗糖梯度分析。由細(xì)球菌核酸酶消化制得的單核小體蛋白-DNA復(fù)合物用5-30％平行蔗糖梯度進(jìn)行純化。提取各部分的蛋白并通過(guò)15％ SDS-PAGE及考馬斯染色加以分析。圖中顯示H2B-GFP蛋白(約45kDa)及天然核心組蛋白。圖10C中，相同的蛋白等分試樣經(jīng)電泳并利用抗人H2B抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡分析。圖中顯示H2B-GFP蛋白及天然H2B蛋白。圖10D中，提取各組分內(nèi)的DNA并用1.5％瓊脂糖凝膠加以分析。
圖11A和11B說(shuō)明H2B-GFP的表達(dá)不影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。圖11A為HeLa細(xì)胞和表達(dá)H2B-GFP的細(xì)胞的GFP直方圖。圖11B為圖11A的相同細(xì)胞經(jīng)PI染色確定的DNA直方圖。
圖12A-12E顯示H2B-GFP蛋白的定位。圖為表達(dá)H2B-GFP的HeLa活細(xì)胞不同時(shí)期的共焦顯微圖像。分別顯示間期(圖12A)、前期(圖12B)、中期(圖12C)和后期(圖12D)的細(xì)胞。各圖板的左側(cè)顯示綠色GFP信號(hào)，右側(cè)為反射模式圖。圖12E顯示表達(dá)H2B-GFP的HeLa細(xì)胞的固定鋪展染色體。圖中顯示GFP定位(左)和DAPI染色(右)。
發(fā)明實(shí)施方式本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，稱為雙微染色體(DMs)的自主復(fù)制的無(wú)著絲點(diǎn)額外染色體結(jié)構(gòu)常介導(dǎo)人腫瘤內(nèi)的癌基因擴(kuò)增。據(jù)本發(fā)明人顯示，通過(guò)S期核膜出芽啟動(dòng)的微核形成作用將DMs由核中去除可促進(jìn)細(xì)胞的成熟、分化和死亡。
因此，本發(fā)明提供一種用于鑒定潛在治療制劑的篩選方法和一種用于誘導(dǎo)適當(dāng)細(xì)胞成熟或死亡的方法。實(shí)施本發(fā)明時(shí)所采用的適當(dāng)測(cè)試細(xì)胞或細(xì)胞包括那些具有DM或額外染色體DNA并且能夠通過(guò)微核形成過(guò)程消除該DNA的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括，但并不限定于，諸如細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞等原核細(xì)胞。另外還包括真核細(xì)胞，如大鼠、鳥類、鼠科、猿、哺乳動(dòng)物，包括寵物和家畜、或人類的細(xì)胞。
就本發(fā)明而言，“藥劑”將包括，但并不限定于，有機(jī)小分子、復(fù)合物、組合物、DNA分子、RNA分子、蛋白、多肽、或融合蛋白。盡管沒(méi)有始終明確聲明，但應(yīng)了解的是，該藥劑可單獨(dú)使用，或與其它在生物活性方面與本發(fā)明所述篩選方法確定的藥劑相同或不同的藥劑一同使用。這些藥劑及方法也可與其它療法相結(jié)合。
文中所用術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)細(xì)胞的成熟或死亡”將包括凋亡、壞死或防止細(xì)胞分裂、致腫瘤性降低、抗藥性喪失、成熟、分化或細(xì)胞的腫瘤表型回復(fù)的其它任何方法。如上文所述，該方法適當(dāng)于處理具有DM或額外染色體DNA的細(xì)胞。這些細(xì)胞的識(shí)別可采用該領(lǐng)域熟知的任何用于鑒定擴(kuò)增的染色體DNA或額外染色體DNA的方法。這些方法包括，但并不限定于，DNA雜交(見下文實(shí)施例IID以及Sambrook etal.(1988))、FISH(見下文實(shí)施例IIB，U.S.Patent Nos.5,665,549；5,633,365；及5,545,524)、熒光激活細(xì)胞分類技術(shù)(FACS)(見下文實(shí)施例IIC)、離心分部分離以及組蛋白-GFP標(biāo)記(見下文實(shí)施例I)。已知某些類型的細(xì)胞中含有微核，如腫瘤抑制蛋白缺失或缺陷的細(xì)胞以及腫瘤或瘤細(xì)胞。腫瘤抑制蛋白缺陷的存在與否可由腫瘤抑制基因缺陷來(lái)決定。由于腫瘤抑制基因的突變可導(dǎo)致功能喪失，因此這些基因被稱為“隱性”基因。在腫瘤形成之前，兩個(gè)等位基因必需均喪失或失效，但單個(gè)等位基因的突變可導(dǎo)致人類群體形成可遺傳的癌癥易感體質(zhì)。
該方法可在體外、來(lái)自體內(nèi)或在體內(nèi)實(shí)施。當(dāng)在體外實(shí)施時(shí)，該方法可提供一種強(qiáng)有力的測(cè)定和篩選手段，來(lái)確定一種藥劑或組合藥劑是否能調(diào)節(jié)以及如何調(diào)節(jié)胞內(nèi)DM或額外染色體DNA的減少或消除。在某些情況下，它有望使DM或額外染色體DNA的消除得到加強(qiáng)，而在另一些情況下，如希望抑制細(xì)胞凋亡時(shí)，它可通過(guò)微核形成的方法減少或抑制DM或額外染色體DNA的消除。因此，通過(guò)首先提供一種適當(dāng)細(xì)胞的實(shí)例，本發(fā)明還提供一種篩選潛在藥物的方法。該細(xì)胞在能夠促進(jìn)藥劑插入細(xì)胞的適當(dāng)條件下與潛在藥物相接觸。在經(jīng)過(guò)適當(dāng)時(shí)間后，對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物或上清液中的DM和/或額外染色體DNA的存在狀況加以測(cè)定。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，DM或額外染色體DNA的減少或消除肯定地表明該藥劑可作為一種潛在的治療方法。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，則有望減少或抑制微核的消除。
因此，為在體外實(shí)施該方法而首先提供一種適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物。所用細(xì)胞為培養(yǎng)的細(xì)胞或經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞。作為選擇，也可使用取自活檢組織的細(xì)胞。將細(xì)胞在一定條件(溫度、培養(yǎng)基及氣體(CO2))下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，獲得不存在密度依賴性抑制的指數(shù)增長(zhǎng)期。另外還需單獨(dú)保留一份額外的細(xì)胞培養(yǎng)物；作為不接受藥劑的對(duì)照加以測(cè)試。
正如對(duì)該領(lǐng)域的技術(shù)人員顯頁(yè)易見的，適當(dāng)細(xì)胞可在微量滴定板中培養(yǎng)，并通過(guò)記錄表型變化或細(xì)胞死亡來(lái)對(duì)不同的藥劑進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。
當(dāng)確定一種潛在藥劑具有所需生物活性時(shí)，可將該藥劑加入細(xì)胞，以誘導(dǎo)細(xì)胞的成熟或死亡。因此，本發(fā)明還提供一種誘導(dǎo)細(xì)胞成熟或死亡的方法，其中該細(xì)胞含有DM或額外染色體DNA，并能夠經(jīng)歷微核形成。該方法包括將細(xì)胞與一種可通過(guò)微核形成來(lái)誘導(dǎo)或增強(qiáng)胞內(nèi)DM或額外染色體DNA消除的藥劑相接觸。該藥劑在能夠促進(jìn)細(xì)胞成熟或死亡的條件下與細(xì)胞相接觸。若該藥劑是除DNA或RNA核酸分子外的一種組合物，則可將適當(dāng)條件直接加到細(xì)胞培養(yǎng)物或培養(yǎng)基內(nèi)。正如該領(lǐng)域的專家所了解的，必須加入“有效的”劑量，該有效劑量可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)加以確定。
當(dāng)藥劑為核酸時(shí)，可利用該領(lǐng)域熟知的方法將其加入細(xì)胞培養(yǎng)物，這些方法包括，但并不限定于，磷酸鈣沉淀法、顯微注射法或電穿孔法。作為可選的或附加的方法，也可將核酸結(jié)合到一種用于摻入細(xì)胞的表達(dá)載體或插入載體內(nèi)。包含一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)經(jīng)操作可接入多核苷酸的克隆位點(diǎn)的載體已為該領(lǐng)域的專家所熟知。這些載體能夠在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA，并且能夠以商品形式從諸如Stratagene(LaJolla，CA)和Promega Biotech(Madison，WI)等供應(yīng)商那里購(gòu)得。為使表達(dá)和/或體外轉(zhuǎn)錄盡可能完善，或許有必要去除、加入或改變克隆的5’和/或3’非翻譯區(qū)，以消除那些可能導(dǎo)致錯(cuò)誤翻譯的額外起始密碼子或那些可在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平阻礙或降低表達(dá)的其它序列。作為選擇，也可在緊接起始密碼子的5’端插入共有核糖體結(jié)合位點(diǎn)以增加表達(dá)。載體的實(shí)例有病毒，如桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，和噬菌體、粘粒、質(zhì)粒、真菌載體，以及其它已證明可在多種真核及原核宿主內(nèi)表達(dá)，并可用于基因治療和單純蛋白表達(dá)的該領(lǐng)域常用的重組載體。
其中有一些非病毒性載體，如DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，和特定病毒蛋白DNA復(fù)合物。為加強(qiáng)向細(xì)胞的輸送，可將本發(fā)明的核酸或蛋白與結(jié)合TCR、CD3或CD4等細(xì)胞表面抗原的抗體或結(jié)合片段相結(jié)合。含有導(dǎo)向抗體或其片段的脂質(zhì)體也可在本發(fā)明所述方法中使用。本發(fā)明還規(guī)定在本文公開的方法中使用的導(dǎo)向復(fù)合物。
利用該領(lǐng)域所熟知的方法將多核苷酸插入載體基因組。例如，可在適當(dāng)條件下使插入DNA和載體DNA接觸，利用限制性內(nèi)切酶在各分子上產(chǎn)生可相互配對(duì)的互補(bǔ)末端，并由連接酶連接。作為選擇，也可將合成的核酸連接子連接在限制性多核苷酸的末端。這些合成連接子中可含有與載體DNA的特定限制酶切位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的核酸序列。此外，還可連接含有終止密碼子和適當(dāng)限制酶切位點(diǎn)的寡核苷酸，以用于插入載體，所述的載體可含有，例如，如下所列的部分或全部成分一種可篩選標(biāo)記基因，如用于篩選哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定型或短暫型轉(zhuǎn)染子的新霉素基因；人類CMV的立早基因中用于高水平轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子；來(lái)自SV40中用于穩(wěn)定mRNA的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和RNA加工信號(hào)；用于游離基因正確復(fù)制的SV40多瘤復(fù)制起始點(diǎn)和Col E1；通用多克隆位點(diǎn)；以及用于體外轉(zhuǎn)錄有義和反義RNA的T7和SP6 RNA啟動(dòng)子。該領(lǐng)域中還有許多眾所周知的其它方法可以采用。
文中使用的“表達(dá)”是指多核苷酸轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成肽、多肽或蛋白的過(guò)程。若多核苷酸起源于基因組DNA，并已選定一種適當(dāng)?shù)恼婧怂拗?，則表達(dá)可能還包括mRNA剪切。表達(dá)所需的調(diào)控元件包括結(jié)合RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列和結(jié)合核糖體的轉(zhuǎn)錄起始序列。例如，細(xì)菌表達(dá)載體就包含有一個(gè)啟動(dòng)子，如lac啟動(dòng)子，和Shine-Dalgarno轉(zhuǎn)錄起始序列以及起始密碼子AUG(Sambrook et al.，見上文)。同樣，真核表達(dá)載體含有可被RNA聚合酶II識(shí)別的異源或同源啟動(dòng)子，以及下游多腺苷酸化信號(hào)、起始密碼子AUG和用于核糖體脫離的終止密碼子。這些載體能夠以商品形式購(gòu)得，或利用該領(lǐng)域熟知的方法中所描述的序列組裝而成，如上文描述的構(gòu)建載體的一般方法。表達(dá)載體可用于產(chǎn)生表達(dá)本發(fā)明所述受體的細(xì)胞。
通過(guò)減少細(xì)胞壽命、細(xì)胞分化或凋亡測(cè)定可確定是否已實(shí)現(xiàn)該方法的目標(biāo)，即通過(guò)微核形成來(lái)減少或消除細(xì)胞中的DM或額外染色體DNA。細(xì)胞分化的監(jiān)控可利用組織學(xué)方法或通過(guò)監(jiān)控與未分化表型相關(guān)的細(xì)胞表面特定標(biāo)記，如初級(jí)造血干細(xì)胞上的CD34，的出現(xiàn)或消失來(lái)加以實(shí)現(xiàn)。
為監(jiān)控細(xì)胞凋亡，可將細(xì)胞以2.5×105細(xì)胞/孔的濃度平鋪在玻璃蓋片上。約兩天后，當(dāng)細(xì)胞鋪展并粘連時(shí)將其固定，再用碘化丙錠染色并封固。利用熒光顯微技術(shù)根據(jù)核的形態(tài)測(cè)定凋亡細(xì)胞和非凋亡細(xì)胞的數(shù)量，并計(jì)算非凋亡細(xì)胞的損失百分率。每個(gè)樣品至少計(jì)算100個(gè)細(xì)胞，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)至少重復(fù)一次。由于在任何正常生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物中均有一小部分細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，因此還需確定未處理樣品或處理樣品中自發(fā)性凋亡的數(shù)量。然后用未處理樣品中自發(fā)性凋亡的頻率進(jìn)行校正，使非凋亡細(xì)胞的百分率標(biāo)準(zhǔn)化。電鏡觀測(cè)則按照電鏡技術(shù)的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)步驟來(lái)固定和處理細(xì)胞。還可使用該領(lǐng)域所熟知的細(xì)胞死亡第二種測(cè)定方法，如MTT轉(zhuǎn)化測(cè)定和結(jié)晶紫染色等。
利用U.S.Patent No.5,399,346中描述的修正方法，還可來(lái)自體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明所述方法。
含有實(shí)施文中所述篩選方法和體外方法所必需的藥劑和說(shuō)明的試劑盒亦被要求專利保護(hù)。
本發(fā)明還提供一種治療疾病的方法，其中該疾病的特征在于受試者中存在含有DM或額外染色體DNA的細(xì)胞，并能夠通過(guò)微核形成消除這些DNA。該方法是給受試者施用有效劑量的藥劑，該藥劑可通過(guò)微核形成誘導(dǎo)或加強(qiáng)這些DNA的消除。
當(dāng)受試者為大鼠或小鼠等動(dòng)物時(shí)，該方法提供一種便利的動(dòng)物模型系統(tǒng)，可在臨床測(cè)試該藥劑前使用。如果與具有此種病理細(xì)胞的未處理動(dòng)物相比，通過(guò)細(xì)胞測(cè)試被確定可在該系統(tǒng)中減少或消除DM或額外染色體DNA，或可改善與含有DM或額外染色體DNA的細(xì)胞的出現(xiàn)相聯(lián)系或相關(guān)的癥狀，則該候選藥劑為一種潛在藥物。健康并且未經(jīng)處理的細(xì)胞或動(dòng)物的獨(dú)立陰性對(duì)照組還可用于提供一種對(duì)比依據(jù)。施用一種選自羥基脲或胍唑的藥劑，可用作體內(nèi)和體外的陽(yáng)性對(duì)照。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，文中所述方法中采用的藥劑選自一個(gè)集合，其中包括羥基脲、胍唑或其衍生物。例如，該藥劑具有結(jié)構(gòu)
其中R1為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、?；?(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基的選自下列一組，它們是鹵素、-OH、-NR2、-OR、-C(O)OR、-OC(O)R、酰胺和?；?，其中R為H、烷基或芳基；R2為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、-C(O)R’或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且其中的R’為烷基或芳基，取代基則如上文定義；R3為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、OR”、NR”2或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基的選自下列一組，它們是-OH、-NR”2、-OR”、-C(O)OR”、-OC(O)R”、酰胺和酰基，其中R”為H、烷基或芳基；并且R4為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基的選擇集合包括-OH、-NR”’2、-OR”’、-C(O)OR”’、-OC(O)R”’、酰胺和?；?，其中R”’為H、烷基或芳基。
在一種替代方法中，該藥劑具有結(jié)構(gòu) 其中R1為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、?；?(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，它們是鹵素、-OH、-NR2、-OR、-C(O)OR、-OC(O)R、酰胺和?；?，其中R為H、烷基或芳基；R2和R4分別為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、OR’、NR’2或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，它們是-OH、-NR’2、-OR’、-C(O)OR’、-OC(O)R’、酰胺和?；?，其中R’為H、烷基或芳基；并且R3和R5分別為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，它們是-OH、-NR”2、-OR”、-C(O)OR”、-OC(O)R”、酰胺和?；?，其中R”為H、烷基或芳基。
羥基脲或胍唑能夠以商品形式購(gòu)得，并用作衍生物的原材料。利用U.S.Patent Nos.5,549,974；5,639,603和5,679,773中描述的修正方案，可通過(guò)本發(fā)明所述方法合成并測(cè)定這些有機(jī)小化合物的衍生物的生物活性。
本發(fā)明的這些藥劑以及上文指出的化合物及其衍生物均可用于制備文中所述方法中使用的藥劑。
文中確定可有效用于其預(yù)定用途的藥劑均可向易于產(chǎn)生或可能產(chǎn)生某種與細(xì)胞中出現(xiàn)DM和/或額外染色體DNA相關(guān)的疾病，如癌癥，的受試者或個(gè)體給藥。當(dāng)該藥劑向小鼠、大鼠或人類患者等受試者給藥時(shí)，可在藥劑中加入藥學(xué)上容許的載體，并對(duì)受試者進(jìn)行全身或局部給藥。為確定能夠從治療中受益的患者，可從患者中采集腫瘤樣本，并測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DM、額外染色體DNA或微核的存在情況。治療劑量主要通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定，并隨所處理的病狀、受試者以及藥劑療效和毒性的不同而改變。當(dāng)向動(dòng)物給藥時(shí)，該方法可用于進(jìn)一步確定藥劑的療效。作為動(dòng)物模型的一個(gè)實(shí)例，對(duì)多組裸鼠(Bal b/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)各皮下注射約105-109個(gè)文中定義的過(guò)增殖癌細(xì)胞或靶細(xì)胞。當(dāng)腫瘤形成時(shí)，將該藥劑給藥，例如可利用在腫瘤周圍的皮下注射方式。用游標(biāo)卡尺對(duì)腫瘤進(jìn)行二維測(cè)量，以確定腫瘤減小的尺寸，每周測(cè)量?jī)纱?。也可采用其它適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型。
體內(nèi)給藥可通過(guò)整個(gè)療程內(nèi)的單次、連續(xù)或間歇給藥方式加以實(shí)現(xiàn)。確定給藥的最有效方式和劑量的方法對(duì)該領(lǐng)域的專家而言是眾所周知的，該方法隨治療所用組合物、治療目的、處理的靶細(xì)胞、以及處理的受試者的不同而不同。由治療醫(yī)師選定的劑量和方式可進(jìn)行單次或多次給藥。適當(dāng)劑量的制劑以及藥劑的給藥方法將在下文給出。
本發(fā)明所述藥劑和組合物可用于藥物的生產(chǎn)，并可通過(guò)常規(guī)的給藥方法，如作為藥用組合物中的活性成分，而用于人類和其它動(dòng)物的治療。
藥用組合物可通過(guò)口服、鼻內(nèi)、胃腸外或吸入療法方式給藥，并且可采取片劑、錠劑、顆粒、膠囊、丸劑、針劑、栓劑或噴霧劑形式。另外也可采取將活性成分溶于水性或非水性稀釋劑而制成的懸浮液、溶液和乳劑形式，或采取糖漿、顆?；蚍勰┬问?。藥用組合物中除可以含有本發(fā)明的一種藥劑外，還可含有其它具有藥學(xué)活性的復(fù)合物或多種本發(fā)明的復(fù)合物。
更詳細(xì)而言，本發(fā)明所述藥劑，也就是此處提到的活性成分，可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)耐緩竭M(jìn)行治療性給藥，如通過(guò)口、直腸、鼻、局部(包括透皮、噴霧劑、口腔及舌下方式)、陰道、胃腸外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)及皮內(nèi)方式)以及肺等途徑。還應(yīng)該了解的是，優(yōu)選的途徑將隨接受者的狀況和年齡以及治療疾病的不同而不同。
理想的藥劑給藥方式應(yīng)能夠使活性復(fù)合物在疾病部位達(dá)到最高濃度值。其實(shí)現(xiàn)方式有，例如，將該藥劑，或溶于生理鹽水的該藥劑，進(jìn)行靜脈內(nèi)注射，或?qū)?，例如，包含活性成分的片劑、膠囊或糖漿通過(guò)口服給藥。該藥劑的所需血液水平可通過(guò)連續(xù)注入加以維持，以在患病組織部位提供治療劑量的活性成分。有效組合物的使用可使治療性組合物所需的各抗病毒藥劑成分的總劑量低于單獨(dú)使用各治療性復(fù)合物或藥物時(shí)所需的劑量，從而可減少副作用。
盡管可以將該藥劑單獨(dú)給藥，但優(yōu)選的是將其以藥學(xué)制劑形式給藥，該藥學(xué)制劑中包含至少一種上文定義的活性成分和為此加入的一種或多種藥學(xué)上容許的載體以及任選的其它藥學(xué)制劑。各種載體必須是“容許的”，其含義是能夠與制劑中的其它成分相容并且對(duì)患者無(wú)害。
制劑中可含有那些適合于通過(guò)口、直腸、鼻、局部(包括透皮、口腔及舌下方式)、陰道、胃腸外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)及皮內(nèi)方式)以及肺途徑給藥的成分。制劑能夠以單位劑量形式方便地提供，并可通過(guò)制藥領(lǐng)域中熟知的任何方法進(jìn)行制備。這些方法包括將活性成分與構(gòu)成一種或多種副組分的載體相結(jié)合的步驟。制劑的制備一般是將活性成分與液態(tài)載體或細(xì)碎的固態(tài)載體或二者均包括在內(nèi)進(jìn)行均勻而又密切地結(jié)合，如果需要可再將產(chǎn)品整形。
本發(fā)明中適合口服給藥的制劑的提供方式可以是各含有預(yù)定劑量活性成分的膠囊劑、扁囊劑或片劑等不連續(xù)單元形式；粉末或顆粒形式；溶于水性或非水性流體的溶液或懸浮液形式；或水包油或油包水乳劑形式。活性成分的提供還可采用大丸劑、藥糖劑或藥膏劑形式。
片劑的制造可采用壓縮法或模塑法，其中可選擇加入一種或多種副組分。壓縮片劑的制備是在適當(dāng)機(jī)器中將粉末狀或顆粒狀等易流動(dòng)形式的活性成分進(jìn)行壓縮，并與粘結(jié)劑(如聚烯吡酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(如淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)的聚烯吡酮、交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑進(jìn)行任意混合。模塑片劑的制備是在適當(dāng)機(jī)器中將粉狀復(fù)合物與一種惰性稀釋液浸濕后所得的混合物模制成型。片劑可被任意包被或修整，并可配方化以使其活性成分緩慢釋放或受控釋放，例如，可利用不同比例的羥丙基甲基纖維素以獲得所需的釋放曲線。也可選擇在片劑外加一層腸衣，使其在腸道部分釋放，而不是在胃內(nèi)釋放。
適合于口內(nèi)局部給藥的配方包括，在調(diào)味基質(zhì)，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠，中含有活性成分的藥糖塊；在惰性基質(zhì)，如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠，中含有活性成分的錠劑；以及在適當(dāng)液態(tài)載體中含有活性成分的漱口劑。
本發(fā)明所述用于局部給藥的藥用組合物可配制成軟膏、乳膏、懸浮液、洗劑、粉末、溶液、糊劑、凝膠、噴劑、氣霧劑或油劑。作為選擇，配方中還可包含浸有活性成分的繃帶或橡皮膠等帖劑或敷料，并可任意包含一種或多種賦形劑或稀釋劑。
如果需要，乳膏基質(zhì)的水相中還可含有，例如，至少約30％ w/w的一種多元醇，即具有兩個(gè)或多個(gè)羥基的醇，如丙二醇、1，3-二醇丁烷、甘露醇、山梨醇、丙三醇和聚乙二醇，以及其混合物。局部制劑中還可包含能促進(jìn)皮膚或其它受影響區(qū)域?qū)λ巹┑奈栈虼┩傅膹?fù)合物。這些皮膚穿透增強(qiáng)劑的實(shí)例有二甲砜及相關(guān)類似物。
本發(fā)明所述乳劑的油相可由已知方式的已知成分構(gòu)成。盡管油相可以只包含一種乳化劑(或在其它地方稱為成乳劑)，但理想的油相為混合物，其中含含有至少一種乳化劑和一種脂或一種油或既有脂又有油。優(yōu)選而言，可將一種親水性乳化劑與一種作為穩(wěn)定劑的親脂性乳化劑一同包含在內(nèi)。既包含一種油又包含一種脂的方案為優(yōu)選方案?？傊虿话€(wěn)定劑的乳化劑構(gòu)成通常所說(shuō)的乳化蠟，而乳化蠟加上油和/或脂構(gòu)成通常所說(shuō)的乳化軟膏基質(zhì)，乳化軟膏基質(zhì)則形成乳膏制劑的分散油相。
適合于在本發(fā)明所述制劑中使用的乳化劑和乳化穩(wěn)定劑包括Tween 60、Span 80、十八醇十六醇混合物、肉豆寇醇、單硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉。
由于活性復(fù)合物在大多數(shù)可用于藥用乳劑的油中的溶解性非常低，因此適用于該制劑的油或脂的選擇依據(jù)是要能夠?qū)崿F(xiàn)所需的裝飾特性。因此，優(yōu)選的乳膏劑產(chǎn)品應(yīng)該是無(wú)油膩性、非污染性以及可清洗的，并且應(yīng)具有適當(dāng)?shù)恼吵矶纫员苊鈴能浌芑蚱渌萜髦行孤?。可使用的有直鏈或支鏈烷基的單價(jià)或二價(jià)酸酯，如二異己二酸酯、異十六基硬脂酸酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯類、豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕櫚酸酯，或稱為Crodamol CAP的支鏈酯混合物，最后三種則為優(yōu)選的酯。它們按所需特性的不同可單獨(dú)或結(jié)合使用。作為選擇，也可使用高融點(diǎn)液體，如白色軟石蠟和/或液體石蠟或其它礦物油。
適合于對(duì)眼進(jìn)行局部給藥的制劑還包括眼藥水，其中活性成分溶解或懸浮在適合于該藥劑的載體，尤其是水性溶劑中。
用于直腸給藥的制劑可作為含有可可脂或水楊酸酯等適當(dāng)基質(zhì)的栓劑形式提供。
適合于陰道給藥的制劑可作為陰道栓劑、衛(wèi)生棉條、乳膏劑、凝膠、糊劑、泡沫劑或噴霧劑形式提供，其中除藥劑外還含有該領(lǐng)域所熟知的適當(dāng)載體。
載體為固體的適合于鼻部給藥的制劑包括顆粒大小范圍約為，例如，20-500微米的粗粉，其給藥方式需用鼻子使勁地吸，即把含有粉末的容器置于鼻子附近并通過(guò)鼻孔快速吸入。載體為流體的適合于以，例如，鼻內(nèi)噴霧、滴鼻液、或用噴霧器噴霧給藥等方式進(jìn)行給藥的制劑包括藥劑的水性或油性溶液。
適合于胃腸外給藥的制劑包括水性和非水性等滲無(wú)菌注射液，其中可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑以及使制劑與預(yù)定接受者的血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性無(wú)菌懸浮液，其中可含有懸浮劑和增稠劑以及可使復(fù)合物定向于血液成分或一種或多種器官的脂質(zhì)體或其它微粒系統(tǒng)。該制劑可置于安瓿和小藥水瓶等單劑量或多劑量密封容器中提供，并可在冷凍干燥(凍干)狀態(tài)下儲(chǔ)存，在使用前只需加入無(wú)菌液態(tài)載體，例如加入水即可用于注射。臨時(shí)注射液和懸浮液可由上述種類的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制得。
所含藥劑的量為一日劑量或一日單位、或如上文所述的日亞劑量、或其適當(dāng)部分的制劑為優(yōu)選的單位劑量制劑。
應(yīng)當(dāng)了解的是，就所述制劑的類型而言，除上文特別提到的成分外，本發(fā)明的制劑還可含有該領(lǐng)域的其它傳統(tǒng)藥劑，如適合于口服給藥的制劑中可進(jìn)一步含有甜味劑、增稠劑和調(diào)味劑等藥劑。此外還將把其它適當(dāng)?shù)慕M合物和療法結(jié)合到本發(fā)明的藥劑、組合物和方法中。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)染色體DNA和額外染色體DNA的方法。該方法步驟是首先在細(xì)胞內(nèi)插入一種可檢測(cè)的標(biāo)記蛋白，其中該蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)的染色體DNA和額外染色體DNA特異結(jié)合，然后檢測(cè)標(biāo)記，從而檢測(cè)胞內(nèi)的染色體DNA和額外染色體DNA。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，該蛋白為組蛋白或具有保守氨基酸取代的類似物，以及融合蛋白。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)記為熒光標(biāo)記，如多管水母屬綠色熒光蛋白，它可經(jīng)修飾產(chǎn)生紅色或黃色熒光。作為選擇，也可使用抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素或生物素。在一項(xiàng)可選實(shí)施方案中，插入步驟包括將細(xì)胞與一種載體接觸，其中該載體中含有經(jīng)可檢測(cè)標(biāo)記的組蛋白融合蛋白的編碼DNA。
上述方法還可用于分析體內(nèi)染色體行為、監(jiān)控染色體運(yùn)動(dòng)，即細(xì)胞內(nèi)染色體片段的丟失或易位、檢測(cè)以胞內(nèi)含有DM或額外染色體DNA為特征的病理細(xì)胞，以及監(jiān)控患者體內(nèi)該病理的進(jìn)展?fàn)顩r。所有這些方法均包括在細(xì)胞內(nèi)插入一種可檢測(cè)的標(biāo)記蛋白，其中該蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)的染色體DNA和額外染色體DNA特異結(jié)合，然后檢測(cè)標(biāo)記，從而檢測(cè)胞內(nèi)的染色體DNA和額外染色體DNA。然后可將所測(cè)染色體區(qū)域的存在、缺失或定位情況與以前的樣品分析結(jié)果或正常細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，從而完成染色體畸變和/或變化的分析和監(jiān)控。也可通過(guò)該方法對(duì)病理細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，其中該病理細(xì)胞含有擴(kuò)增DNA或額外染色體DNA。諸如前列腺癌等癌細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞均可檢測(cè)。
以下實(shí)例用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但不是限制本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例I.DM和額外染色體DNA與表型喪失的關(guān)系細(xì)胞培養(yǎng)人類COLO 320DM(ATCC Accension No.CCL 220)和COLO 320HSR(ATCC Accension No.CCL 220，1)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockvillem Maryland，20853，美國(guó)并通過(guò)有限稀釋法獲得單細(xì)胞亞克隆(Von Hoff，et al.(1988))。利用c-myc粘粒DNA經(jīng)FISH確定c-myc擴(kuò)增基因?qū)Ms或HSRs的定位。細(xì)胞在補(bǔ)加有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中增殖。由美國(guó)模式培養(yǎng)收集所(CRL 1502)獲得的WS1人胚胎皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于Dulbecco’s改進(jìn)型Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中，該培養(yǎng)基補(bǔ)加有10％經(jīng)熱滅活并透析的FBS以及1×MEM非必需氨基酸。WS1neo和WS1E6來(lái)自S.Linke博士的惠贈(zèng)，并分別由表達(dá)新霉素抗性蛋白編碼基因或新霉素抗性蛋白和E6蛋白編碼基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染W(wǎng)S1而產(chǎn)生(E6蛋白來(lái)自人乳頭瘤病毒16)(Linke，et al.(1996))。RPE-h(正常的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)及其neo和E6衍生物同樣由S.Linke博士惠贈(zèng)，其親代細(xì)胞來(lái)自CellGenesys，Inc.(Foster City，CA)。上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法與WS1相同。
B.化學(xué)制劑阿非迪霉素、5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)、香豆素(1，2-苯并吡喃酮)、去鐵胺甲磺酸(甲磺酸去鐵胺)、DMSO、羥基脲(HU)、煙酰胺、胸腺嘧啶以及諾考達(dá)唑(5-(2-噻吩基羰基)-1H-苯異咪唑-2-YL-基甲酚)均由Sigma(St.Louis，MO)購(gòu)得。胍唑(3，5-二氨基-1，2，4-三唑)來(lái)自Aldrich(Milwaukee，WI)，PALA(N-膦乙酰-L-天冬氨酸)則由藥物生物合成和化學(xué)分部，治療開發(fā)項(xiàng)目，癌癥治療部，國(guó)立癌癥研究院(Bethesda，MD)提供。
C.細(xì)胞周期分析按前人所述(Yin，et al.(1992)and Di Leonardo，et al.(1994))，用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期的分布進(jìn)行分析。經(jīng)特定濃度的藥物處理了特定時(shí)間的細(xì)胞用10μM BrdU標(biāo)記30分鐘。收集細(xì)胞，用70％乙醇固定，含有0.5％ Triton X-100的0.1N HCl，然后煮沸10分鐘，再迅速制冷使DNA變性。然后將核與結(jié)合FITC的抗BrdU抗體(Boehringer Mannheim)共保溫，并用含有RNAse(200μg/ml)的2μg/ml碘化丙錠(PI)復(fù)染。利用Becton Dickinson FACScan對(duì)樣品進(jìn)行分析。每份樣品收集1萬(wàn)個(gè)數(shù)據(jù)。按前人所述(Yin，et al.(1992)and Di Leonardo，et al.(1994))用Sun Display對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
D.微核定量利用在標(biāo)準(zhǔn)低滲膨脹條件下(Lawce and Brown(1991))制備的鋪展染色體，來(lái)檢測(cè)COLO 320DM細(xì)胞中含有DM序列的微核，然后按前人所述(Shimizu，et al.(1996))的方法用生物素標(biāo)記的c-myc粘粒探針進(jìn)行雜交。用DAPI(Sigma；1μg/ml in VectaShield，VectorInc.)對(duì)鋪展染色體進(jìn)行染色，并由此確定總微核數(shù)(圖3)。將貼壁細(xì)胞(WS1、RPE-h及其衍生物)培養(yǎng)于蓋片上，用冷丙酮固定(-20℃，5分鐘)，再用冷甲醇固定(-20℃，5分鐘)，PBS重新水化，并用DAPI(1μg/ml in VectaShield)染色。用60×或100×的物鏡和配有適當(dāng)表熒光濾片的Zeiss熒光顯微鏡計(jì)算總微核或富含DM的微核的數(shù)量。結(jié)果以相對(duì)于間期核計(jì)數(shù)的“微核出現(xiàn)頻率(％)”形式表示(每個(gè)點(diǎn)的最小采樣數(shù)為1000)。
E.細(xì)胞同步化按前人所述(Stein，et al.(1994))進(jìn)行同步化。首先用過(guò)量胸腺嘧啶(2mM)處理17小時(shí)，使快速生長(zhǎng)的COLO 320DM細(xì)胞抑制于早S期。然后用培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，并在含有25μM 2’-脫氧胞苷的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中置12小時(shí)(以逆轉(zhuǎn)胸腺嘧啶的毒性)，然后在2.5μg/ml阿非迪霉素中培養(yǎng)17小時(shí)，使細(xì)胞在進(jìn)入S期時(shí)被抑制。用培養(yǎng)基清洗被抑制的細(xì)胞，然后置于不含藥物，或含有諾考達(dá)唑(0.4μg/ml)的培養(yǎng)基中。通過(guò)加入[3H]胸腺嘧啶來(lái)監(jiān)控細(xì)胞周期的進(jìn)展(Stein，et al.(1994))。為檢測(cè)有絲分裂過(guò)程的進(jìn)展，用多聚甲醛(PFA；2％)固定一部分培養(yǎng)物(1ml)并用DAPI染色。利用熒光顯微鏡計(jì)算有絲分裂期細(xì)胞的出現(xiàn)率。WS1 E6細(xì)胞的同步化是通過(guò)將其接種于具有或不具有蓋片(18×18mm)的15cm培養(yǎng)皿中而實(shí)現(xiàn)。在傳代后第二天，去除原培養(yǎng)基并替換為含有0.1％FCS的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48小時(shí)。將通過(guò)血清缺失而被抑制在G0期的細(xì)胞置入含有5μg/ml阿非迪霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)15小時(shí)，使其抑制于S期起始階段。把培養(yǎng)基替換為不含藥物的新鮮培養(yǎng)基，使細(xì)胞釋放并進(jìn)入S期。通過(guò)加入[3H]胸腺嘧啶來(lái)監(jiān)控進(jìn)入S期的進(jìn)展情況(Stein，et al.(1994))。同時(shí)，移取蓋片，用丙酮和甲醇染色，DAPI固定，并按照上文所述計(jì)算微核、核出芽以及有絲分裂細(xì)胞的出現(xiàn)率。
F.TUNEL測(cè)定TUNEL測(cè)定是根據(jù)前人發(fā)表的一套步驟(Gavrieli，et al.(1992))按下列所述的修改方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，即用2％的PFA固定COLO 320DM細(xì)胞(室溫10分鐘)，并利用細(xì)胞甩片機(jī)離心到玻片上。細(xì)胞用冷甲醇進(jìn)一步固定(-20℃，5分鐘)，再用冷丙酮固定(-20℃，5分鐘)。玻片用PBS重新水化，然后在室溫下用反應(yīng)緩沖液(200mM二甲胂酸鈉，1mM MgCl2，1mM β-巰基乙醇，pH7.2)平衡15分鐘。末端標(biāo)記反應(yīng)采用將玻片在37℃下與含有10μM生物素-dUTP(Boehringer Mannheim GmbH，德國(guó))和0.3單位/μl末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Toyobo Co.，Osaka，日本)的反應(yīng)緩沖液保溫60分鐘。將玻片廣泛清洗，用20％FCS封閉，并利用結(jié)合FITC的抗生蛋白鏈菌素按照FISH規(guī)程中的描述(見下文)檢測(cè)結(jié)合的生物素。玻片用RNAse A處理(100μg/ml，37℃，20分鐘)，PI復(fù)染，并在用于觀測(cè)FISH的條件下觀察。
G.探針制備及FISH除利用BioPrime DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Life Technologies Inc.Gaithersburg，MD)直接將純化微核中的DNA用于生物素標(biāo)記之外，其余均按照文獻(xiàn)所述(Shimizu，et al.(1996))從純化微核中制備探針。按照前人所述(Shimizu，et al.(1996))利用經(jīng)甲醇/醋酸標(biāo)準(zhǔn)化固定的核進(jìn)行FISH。用共焦顯微鏡評(píng)測(cè)DM的定位時(shí)需采用以下方法來(lái)保持核的球形。該規(guī)程以用于人淋巴細(xì)胞而開發(fā)的規(guī)程(Ferguson and Ward(1992)and Vourc’h，et al.(1993))為基礎(chǔ)，但由于核的嚴(yán)重聚集而不能將其直接使用于COLO 320DM。改進(jìn)方法包括在260×g下離心5分鐘使10ml COLO 320DM細(xì)胞沉淀，再完全去除上清液。將細(xì)胞溫和懸浮于50μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并緩慢加入10ml預(yù)熱(37℃)的75mM KCl，2mM CaCl2。利用上述條件立即將懸浮液離心，并完全去除上清。溫和地使細(xì)胞沉淀松散，并懸浮于1ml 4℃的75mM KCl和2mM CaCl2中，再加入1ml 4℃的75mM KCl、2mM CaCl2、0.5％Triton X-100。懸浮液在冰上置10分鐘，然后進(jìn)行Dounce勻漿(松配杵，5分鐘，4℃)。懸浮液中加入1.5倍體積溶于PBS的5％PFA，并在室溫下保溫10分鐘，并偶爾溫和搖動(dòng)。保溫后，再加入1/10體積含有1％BSA的1M Tris-HCl(pH7.4)，并于室溫下再保溫10分鐘并溫和搖動(dòng)。固定的核用含有1％ FCS的PBS洗兩次，并在4℃下保存一周。在進(jìn)行FISH雜交前，通過(guò)細(xì)胞甩片將固定的核沉淀于涂有多聚L-賴氨酸的玻片上(Matsunami Glass Ind.，Ltd.，日本)。玻片用RNAse A處理(Sigma，100μg/ml溶于2×SSC，37℃，60分鐘)，再用2×SSC清洗兩次，每次3分鐘，然后用溶于PBS的3％ BSA封閉并在37℃下放置30分鐘。玻片于室溫下在溶于2×SSC的50％甲酰胺中保溫30分鐘，以使緩沖液達(dá)到平衡，再加入含有標(biāo)記探針的雜交液(按FISH的標(biāo)準(zhǔn)方法制備(Shimizu，et al.(1996)))。用蓋片覆蓋樣品，并用橡膠泥完全密封，在85℃下變性，并通過(guò)37℃保溫過(guò)夜完成雜交。雜交探針的清洗與檢測(cè)均按照前人所述(Shimizu，et al.(1996))進(jìn)行。圖像是利用BioRad MRC600共焦系統(tǒng)在Zeiss Axiovert 135顯微鏡上獲得(圖6的方法可參考下文)。多數(shù)圖像是利用×63物鏡(Zeiss，復(fù)消色差物鏡，1.40，油鏡)獲得，并且放大比為2。所得數(shù)字圖像用偽彩色表示，圖像的合并采用Adobe Photoshop(Adobe systems Inc.，Mountain View，CA)。
H.間期核內(nèi)的DMs定位以相應(yīng)核的直徑為單位長(zhǎng)度測(cè)量各雜交信號(hào)與核中心的距離，由此確定共焦核切面中DMs的定位。PI(DNA)和FITC(雜交信號(hào))的核中心共截面圖像來(lái)自隨機(jī)選定的核。數(shù)字圖像的合并采用COMOS軟件(BioRad，Hercules，CA)。為能夠精確地測(cè)量距離，而將各FITC信號(hào)的閾值降低，直至每個(gè)代表了一個(gè)或多個(gè)DMs區(qū)域的信號(hào)成為單一的點(diǎn)。確定該點(diǎn)到核中心的距離以及核的直徑。用前一數(shù)字除以后一數(shù)字來(lái)表示各信號(hào)在核中的位置。按照這種表示方法，核的中心為0，核膜的外邊界為1。同時(shí)，利用任意單位標(biāo)度測(cè)定各信號(hào)的密度。確定每個(gè)核切面中各信號(hào)的該密度值時(shí)，每個(gè)樣品至少隨機(jī)選定100個(gè)核。由這一過(guò)程得出各二維焦平面中的DM信號(hào)分布。每個(gè)核的高度和寬度近似相等，提示文中所述的固定方法確實(shí)保持了核的球狀形態(tài)。假定每個(gè)核體積內(nèi)的信號(hào)分布與我們?cè)?D空間的相應(yīng)半徑內(nèi)檢測(cè)的信號(hào)數(shù)量相符。將信號(hào)數(shù)量對(duì)各徑向位置加以修正，使其代表在相應(yīng)半徑的球形體積內(nèi)所應(yīng)出現(xiàn)的數(shù)量。
I.通過(guò)加入FISH和BrdU摻入來(lái)同時(shí)確定DM位置和DNA復(fù)制快速生長(zhǎng)的COLO 320DM培養(yǎng)物用10μM BrdU(Sigma)脈沖標(biāo)記1小時(shí)，然后立即收集細(xì)胞。按上文所述將核分離，用PFA固定，并利用純化的微核探針進(jìn)行FISH。在FISH后確定BrdU的摻入情況，方法是將玻片與溶于含有0.1％ BSA的PBS中的終濃度為10μg/ml的小鼠抗BrdU單克隆抗體(Pharmingen，San Diego，CA)共保溫。玻片于37℃保溫60分鐘后，用PBS清洗3次，每次5分鐘。然后用終濃度為10μg/ml、溶于含有0.1％BSA的PBS中的羅丹明標(biāo)記的抗小鼠Ig(Boeringer-Mannheim)處理玻片。玻片于37℃保溫60分鐘，再用PBS清洗3次，每次5分鐘。利用Axiovert 135M顯微鏡(Zeiss)上配備的MRC 1024(BioRad)共焦系統(tǒng)觀察未經(jīng)復(fù)染的細(xì)胞核，所得數(shù)字圖像按上文所述進(jìn)行處理。
J.間期時(shí)的核出芽可選擇性包載DMsDMs等無(wú)著絲點(diǎn)染色體片段從細(xì)胞中丟失的傳統(tǒng)機(jī)制涉及末期后將其封裝在重新形成核膜內(nèi)(綜述可參考Heddle，et al.(1991))。但有報(bào)告稱，經(jīng)γ射線照射后可在間期產(chǎn)生類似微核的核異?，F(xiàn)象(Duncan，et al.(1985))。這里采用一種具有c-myc擴(kuò)增基因的細(xì)胞系來(lái)評(píng)定有絲分裂期后結(jié)構(gòu)及間期結(jié)構(gòu)對(duì)DM微核形成的相對(duì)影響。
圖1顯示COLO 320DM，一種神經(jīng)內(nèi)分泌起源的結(jié)腸癌細(xì)胞系，的熒光原位雜交(FISH)分析。特異識(shí)別COLO 320細(xì)胞中c-myc擴(kuò)增子的生物素標(biāo)記FISH探針，來(lái)自COLO 320DM細(xì)胞的純化微核(Shimizu，et al.(1996))。利用該探針?biāo)玫腇ISH分析結(jié)果表明，群體中95％以上的細(xì)胞只含有DMs，其余細(xì)胞則含有DMs以及一種染色體內(nèi)擴(kuò)增區(qū)域(圖1A箭頭所示)。前中期鋪展染色體中的DMs(圖1A)似乎并非隨機(jī)分布，因?yàn)槠渲杏泻芏嗍俏挥谇爸衅诃h(huán)的邊緣，這與前人的報(bào)導(dǎo)(Levan and Levan(1978))相一致。另外還利用共焦顯微技術(shù)觀測(cè)了間期核中的周邊核定位(見下文)。
由COLO 320DM細(xì)胞的指數(shù)增長(zhǎng)培養(yǎng)物所得的分析結(jié)果均顯示出具有突起或“芽”的間期核。約40-80％的核芽含有高度濃縮的DM序列(圖1，B-D圖板顯示典型的含有DMs的芽；C圖板顯示兩個(gè)微核和一個(gè)核芽)。圖1D顯示的核芽高度富含擴(kuò)增序列，因?yàn)樗腥齻€(gè)可被PI染色的簇區(qū)(紅色信號(hào)表示DNA染色，因?yàn)檫@些樣品首先用RNAse進(jìn)行廣泛處理)，而每個(gè)PI陽(yáng)性簇區(qū)均能夠與微核DNA FISH-探針強(qiáng)烈雜交(圖1D’；合并顯示于圖1D”)。偶爾會(huì)觀測(cè)到不與DM探針雜交的PI-陽(yáng)性芽，這表明與DM序列不相關(guān)的DNA也能夠摻入核芽?jī)?nèi)。但含有DM序列的核芽相對(duì)而言似乎含有極少的不與FISH探針雜交的PI反應(yīng)物質(zhì)，這表明核芽的DNA俘獲對(duì)DMs有高度選擇性。采用由包含c-myc的粘粒所獲得的FISH探針、或不同的固定方法(如多聚甲醛，見圖6)或采用核分離所使用的等滲方法，均同樣很容易地表明核芽對(duì)DMs的選擇性包載(數(shù)據(jù)未顯示)。
K.核芽與微核均在S期時(shí)形成產(chǎn)生核芽的核顯示出間期細(xì)胞所具有的典型形態(tài)，而不是有絲分裂期時(shí)的形態(tài)。因此測(cè)定微核與核芽的形成動(dòng)力學(xué)，以確定這些結(jié)構(gòu)是否可產(chǎn)生于S期。利用兩步法將COLO 320DM細(xì)胞同步于G1/S交界，該方法包括用高濃度的胸腺嘧啶處理細(xì)胞，使其阻滯于S期，再將抑制解除12小時(shí)，使細(xì)胞周期的進(jìn)程能夠穿過(guò)并脫離S期，然后與DNA聚合酶抑制劑阿非迪霉素保溫，使細(xì)胞阻滯于下一S期的起始點(diǎn)(Stein，et al.(1994))。去除阿非迪霉素，使細(xì)胞快速進(jìn)入S期，并在4小時(shí)后達(dá)到DNA合成的高峰，在10小時(shí)后達(dá)到有絲分裂的高峰(圖2A)。細(xì)胞在抑制解除19小時(shí)后進(jìn)入同步性較差的第二個(gè)周期。
利用DNA特異性染料4’，6-二脒-2-苯吲哚(DAPI)確定微核與核芽的發(fā)生率(圖2C和2D)。所有樣品用來(lái)自微核的DM著色探針雜交，以確定這些結(jié)構(gòu)是否包含擴(kuò)增序列。具有核芽的核的發(fā)生率在G1/S交界處(即t＝0)幾乎為零，并在細(xì)胞步入早S期時(shí)(t＝0-5小時(shí))顯著增加，在S期后期時(shí)又減小，然后當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入并穿過(guò)第二個(gè)S期時(shí)又逐漸增加(圖2C)。FISH分析說(shuō)明核芽?jī)?nèi)含有DMs(圖2E)。重要的是，總微核或含有DMs的微核的數(shù)量的增加和減少與核芽數(shù)量的增加和減少非常吻合(圖2C)。
在S期發(fā)展過(guò)程中，核芽與微核可再次出現(xiàn)，并且對(duì)其形成而言并非必須經(jīng)歷M期。
出芽與微核形成的動(dòng)力學(xué)分析及核形態(tài)分析結(jié)果表明，這兩個(gè)事件均可發(fā)生于S期。由于減慢復(fù)制叉進(jìn)程可導(dǎo)致DNA斷裂(Eki，et al.(1987)and Linke，et al.(1996))，并且微核可優(yōu)先俘獲無(wú)著絲點(diǎn)的片段(Von Hoff，et al.(1992)and Shimizu，et al.(1996))，因此對(duì)這些抑制因素是否能增加S期的微核形成效率進(jìn)行了測(cè)定。測(cè)試的藥物包括核糖核苷酸還原酶抑制劑(HU、去鐵胺、胍唑)、可催化嘧啶再次生物合成前三個(gè)步驟的CAD酶復(fù)合物的抑制劑(PALA)、以及阿非迪霉素。DNA合成抑制劑導(dǎo)致微核形成的顯著增加，它通常與處S期細(xì)胞的增加相關(guān)(圖3A和3B)。在能夠嚴(yán)重抑制S期的濃度下使用去鐵胺和PALA時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些藥物導(dǎo)致了微核形成效率的急劇下降(圖3B)。這些數(shù)據(jù)表明，能夠阻滯復(fù)制叉進(jìn)程并使S期延長(zhǎng)的抑制劑可導(dǎo)致微核形成。
對(duì)不影響DNA合成的抑制劑的效應(yīng)進(jìn)行分析，以確定阻礙諸如DNA修復(fù)等其它DNA事務(wù)或擾亂膜結(jié)構(gòu)是否會(huì)導(dǎo)致微核形成。由于DNA修復(fù)過(guò)程包括ADP的核糖基化(Satoh and Lindahl(1992))，并且抑制修復(fù)可使無(wú)著絲點(diǎn)染色體片段產(chǎn)生的概率增加，因此測(cè)試采用了多聚(ADP-核糖)聚合酶的兩種抑制劑(煙堿和香豆素)。據(jù)前人報(bào)導(dǎo)，膜活化極性復(fù)合物DMSO可減少某些腫瘤細(xì)胞系內(nèi)DM拷貝數(shù)(Shima，et al.(1989)and Eckhardt，et al.(1994))，在此對(duì)DMSO的效應(yīng)也進(jìn)行了測(cè)試。DMSO使微核形成增加，但不使S期延長(zhǎng)(圖3A和3B)。香豆素對(duì)微核形成沒(méi)有影響，而煙堿在胞內(nèi)損傷量明顯增加的條件下使微核形成稍有增加，因?yàn)樘幱贕2期的細(xì)胞顯著增加(圖3A和3B)。這些數(shù)據(jù)與至少有兩種機(jī)制可提高微核形成效率的觀點(diǎn)相符合，一個(gè)可能涉及到復(fù)制叉進(jìn)程的干擾，另一個(gè)可能涉及到S期外所發(fā)生的事件。
L.DMs的核周邊定位與其通過(guò)出芽而被消除相關(guān)利用共焦顯微技術(shù)了解DMs被選擇性包含在核芽?jī)?nèi)的機(jī)制以及這些結(jié)構(gòu)的形成機(jī)制。為能夠最好地保持核的形態(tài)而用PFA對(duì)核進(jìn)行固定(Manuelidis and Borden(1988))。
圖4A-C顯示分離自未處理的快速生長(zhǎng)COLO 320DM細(xì)胞的三個(gè)代表性核的共焦面。FISH結(jié)果顯示，顯著的雜交強(qiáng)度表明大多數(shù)DM序列優(yōu)先定位于核周邊，并且顯示出DM信號(hào)在細(xì)胞核最邊緣的群集及數(shù)量。注意DM序列在核周邊隨機(jī)分布的基本偏差(圖5A顯示測(cè)量的100個(gè)間期核內(nèi)相對(duì)于每個(gè)核中心的DM位置的定量結(jié)果)。相反，近親細(xì)胞系COLO 320HSR內(nèi)隨染色體擴(kuò)增的序列幾乎在整個(gè)核內(nèi)隨機(jī)分布(圖5C)。用HU處理優(yōu)先減少核周邊的DMs(圖4D-F，定量結(jié)果顯示于圖5B)，競(jìng)爭(zhēng)性PCR擴(kuò)增的測(cè)定結(jié)果表明HU處理使每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的DM含量減少了約三倍(方法見Shimizu，et al.(1996)，數(shù)據(jù)未給出)。綜合以上數(shù)據(jù)，這些結(jié)果表明，定位于核周邊的DM序列可優(yōu)先摻入核芽，然后通過(guò)微核形成從核內(nèi)去除。
M.將復(fù)制的DM序列摻入核芽上文所述的S期進(jìn)程、核出芽和微核形成之間的相關(guān)性，致使本發(fā)明人去研究是否進(jìn)行復(fù)制的DM序列可被定向包含在核芽?jī)?nèi)。用BrdU脈沖標(biāo)記COLO 320DM細(xì)胞，然后用DM FISH探針對(duì)分離的核進(jìn)行雜交。隨后用抗BrdU抗體和熒光素標(biāo)記的二級(jí)抗體進(jìn)行反應(yīng)，使核、核芽以及含有在短暫標(biāo)記間隙進(jìn)行DNA復(fù)制的DMs的微核可被同時(shí)檢測(cè)。兩個(gè)代表性共焦面的FI SH分析結(jié)果(圖6A-A”，B-B”)顯示，這些細(xì)胞內(nèi)的核芽(箭頭所示)內(nèi)含有高度濃縮的DM序列。核、核芽以及每個(gè)核的外周區(qū)域均與BrdU結(jié)合，表明形成這些核芽的核在核芽形成時(shí)正在進(jìn)行DNA合成。表1顯示，BrdU+，DM+核芽(1，1’型)占整個(gè)含DM核芽群體的48％。也有一些核與BrdU結(jié)合，但其產(chǎn)生的核芽卻不被標(biāo)記(2，2’型；35％)。這些核芽中也有一些產(chǎn)生于S期(與前一周期相反)，并且它們未顯示出可與BrdU結(jié)合，因?yàn)槠銬NA在短暫的BrdU溫育期間不進(jìn)行復(fù)制。
從表面上看，此處描述的S期微核形成過(guò)程類似于γ射線照射(Duncan，et al.(1985))或秋水仙素處理(Duncan and Heddle(1984))后由凋亡機(jī)制誘導(dǎo)的“核異?！薄５怯珊水a(chǎn)生的核芽中不含有高度濃縮的DNA，表明它們?cè)谛纬珊搜繒r(shí)并沒(méi)有發(fā)生凋亡。為確定是否能把出芽和微核形成與凋亡分開，而對(duì)核芽中是否含有凋亡細(xì)胞特征性DNA濃縮片段進(jìn)行測(cè)定。DNA片段的檢測(cè)采用TUNEL測(cè)定法，在該方法中利用末端轉(zhuǎn)移酶將BrdU加到凋亡DNA片段產(chǎn)生的3’-OH基團(tuán)上(Gavrieli，et al.(1992))。為觀測(cè)所有的核及核芽，細(xì)胞同樣用PI染色。圖6C-C”顯示由該COLO 320DM細(xì)胞分析所獲得的數(shù)據(jù)實(shí)例。TUNEL測(cè)定結(jié)果顯示一個(gè)具有葉狀細(xì)胞核的細(xì)胞，細(xì)胞核具有強(qiáng)烈的TUNEL反應(yīng)，并且特征性含有在凋亡細(xì)胞中觀測(cè)到的DNA濃縮片段(Cohen(1993))。中間圖板的PI染色結(jié)果顯示一個(gè)細(xì)胞，該細(xì)胞產(chǎn)生的核芽不被TUNEL測(cè)定染色，并且不具有凋亡核的固縮結(jié)構(gòu)。同步化實(shí)驗(yàn)顯示，在S期高峰期時(shí)約有5％的細(xì)胞產(chǎn)生核芽(例如，見圖2C)，但只有0.5-1％為TUNEL陽(yáng)性。
N.微核形成在正常細(xì)胞內(nèi)很少發(fā)生，而一旦p53失活則發(fā)生率上升正常細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)微核形成的幾率明顯低于腫瘤細(xì)胞系(Roser，etal.(1989)and Bondy，et al.(1993))。由于染色體斷裂可誘導(dǎo)微核形成(Heddle and Carrano(1977))，因此在腫瘤細(xì)胞內(nèi)觀測(cè)到的微核形成的增加可能是由可增加DNA斷裂概率的突變所導(dǎo)致。腫瘤抑制因子p53控制著G1檢驗(yàn)點(diǎn)，該檢驗(yàn)點(diǎn)可被經(jīng)PALA處理而導(dǎo)致的DNA斷裂和rNTP損耗所激活，而在PALA處理時(shí)進(jìn)入S期的p53-缺陷細(xì)胞系中可發(fā)生DNA斷裂(Livingstone，et al.(1992)；Yin，et al.(1992)and Linke，et al.(1996))。如上所述，PALA也能夠誘導(dǎo)COLO 320細(xì)胞內(nèi)的S期微核形成。這些數(shù)據(jù)致使我們?nèi)パ芯渴欠裾６扼w成纖維細(xì)胞內(nèi)的p53失活可導(dǎo)致S期出芽及微核形成的增加。
所使用的有人WS1正常二倍體成纖維細(xì)胞和兩種通過(guò)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而產(chǎn)生的幾乎同源的衍生物(WS1-neo)或一種含有人乳頭狀瘤病毒E6基因的致瘤衍生物(WS1-E6)。E6基因產(chǎn)物可通過(guò)泛素依賴性途徑促進(jìn)p53的降解(Scheffner，etal.(1990)and Crook，et al.(1991))。細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)調(diào)節(jié)裝置可在存在DNA損傷或rNTP濃度有限的情況下控制細(xì)胞進(jìn)入S期，它在表達(dá)突變p53和E6致瘤蛋白的人類細(xì)胞以及敲除p53的純合小鼠胚胎成纖維細(xì)胞內(nèi)似乎被同等程度地滅活(Kastan，et al.(1992)；Kuerbitz，et al.(1992)；Livingstone，et al.(1992)；Yin，et al.(1992)；White，et al.(1994)；Linke，et al.(1996)and Linke，et al.(1997))。此前的文獻(xiàn)顯示，在p53-/-MEFs內(nèi)由γ射線照射誘導(dǎo)的微核發(fā)生率要高于野生型MEFs的頻率(Huang，et al.(1996))。因此，在E6致瘤蛋白表達(dá)時(shí)觀測(cè)到的對(duì)微核形成的影響很可能與p53的滅活相關(guān)，而不是與其它可被E6影響的蛋白相關(guān)。
圖7顯示的數(shù)據(jù)表明，E6基因的表達(dá)可提高WS1細(xì)胞的微核形成率。HU或PALA不能使WS1細(xì)胞顯示的低微核形成率有所提高(圖7A)。PALA可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G1期，但HU在所用濃度下不能顯著影響S期WS1細(xì)胞的比例(圖7B)，這與以前的研究(Linke，etal.(1996))相一致。相反，E6的表達(dá)可提高這些在正常條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞的微核形成率，并且HU和PALA均可導(dǎo)致微核形成率的進(jìn)一步顯著提高(圖7A)，而處于S期的細(xì)胞數(shù)量也相應(yīng)地顯著增加(圖7B)。在其它細(xì)胞類型中，E6的作用對(duì)象，這里推斷是p53，在限制微核形成方面具有明顯的重要性，因?yàn)椴捎谜Ｒ暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE-h)及其表達(dá)E6的衍生物時(shí)獲得了類似的結(jié)果。
HU和PALA在COLO 320DM細(xì)胞和WS1 E6細(xì)胞內(nèi)均可使S期延長(zhǎng)并誘導(dǎo)微核產(chǎn)生，這致使我們?nèi)ピu(píng)價(jià)S期出芽是否是WS1-E6細(xì)胞內(nèi)微核形成的主要機(jī)制。利用血清缺乏將WS1-neo和WS1-E6細(xì)胞阻滯于G0期，然后在存在阿非迪霉素的情況下釋放，使細(xì)胞阻滯于G1/S交界(圖7C)。利用血清缺乏進(jìn)行的同步化不提高WS1-neo細(xì)胞內(nèi)的微核形成率，并且S期的微核形成率及出芽率均沒(méi)有增加(圖7D)。相反，當(dāng)WS1-E6細(xì)胞發(fā)展至S期時(shí)去除其中的阿非迪霉素可導(dǎo)致核出芽率及微核形成率均顯著提高(圖7D)。由于DNA損傷不會(huì)誘導(dǎo)WS1或WS1-E6細(xì)胞的凋亡(Di Leonardo，et al.(1994)；Linke，et al.(1996)and Linke，et al.(1997))，因此在這些細(xì)胞中觀測(cè)到的S期微核形成的增加與凋亡程序無(wú)關(guān)。
O.在S期出芽和微核形成前無(wú)需產(chǎn)生凋亡程序；但它們可導(dǎo)致凋亡凋亡可產(chǎn)生核泡(Dini，et al.(1996))，并且推測(cè)可產(chǎn)生與微核類似的“核異?！?Duncan and Heddle(1984)and Duncan，etal.(1985))。但本文報(bào)導(dǎo)的分析結(jié)果表明，產(chǎn)生核芽的核并不象凋亡核那樣呈固縮及碎裂狀。處于單一S期的COLO 320DM細(xì)胞所產(chǎn)生的核芽及微核均不呈TUNEL陽(yáng)性，這表明它們不含有破碎的DNA。盡管在HU處理的COLO 320DM培養(yǎng)物中，凋亡細(xì)胞的確有所增加，但這需要延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，并且在c-myc擴(kuò)增基因的基本部分被去除之后才發(fā)生。此外，經(jīng)歷出芽和微核形成的細(xì)胞還可存活數(shù)天，而這對(duì)微核形成前已激活凋亡程序的細(xì)胞而言是不可想象的。與上文所述相類似的時(shí)程實(shí)驗(yàn)(如圖2)表明，單一S期內(nèi)的出芽增加，而經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞數(shù)量大體保持不變，并且產(chǎn)生核芽的那些核中大多數(shù)不呈TUNEL陽(yáng)性。最后，盡管它不是在正常成纖維細(xì)胞中所觀測(cè)到的凋亡(Di Leonardo et al.(1994))，并且p53功能的喪失通常會(huì)使細(xì)胞對(duì)可導(dǎo)致DNA損傷的生長(zhǎng)條件所引起的凋亡更具有抗性(White(1994))，但推測(cè)由p53功能喪失而引起的乳頭狀瘤病毒E6致瘤基因的表達(dá)，可誘導(dǎo)正常二倍體成纖維細(xì)胞內(nèi)的S期出芽及微核形成。
表1出芽及微核形成的定量結(jié)果BrdU標(biāo)記類型 DM+核芽?jī)?nèi) 核內(nèi) 各種類型的DM+核芽的比例1++ 26/60(43％)1’ ±+ 3/60(5％)2-+ 9/60(15％)2’ - ± 12/60(20％)3-- 10/60(17％)用BrdU對(duì)COLO 320DM的核進(jìn)行脈沖標(biāo)記，然后按圖6所述對(duì)BrdU結(jié)合及DMs進(jìn)行分析。利用表熒光顯微技術(shù)對(duì)核進(jìn)行觀測(cè)。將60個(gè)具有DM+核芽的核根據(jù)DM+核芽是否被BrdU標(biāo)記(1，1’類)、DM+核芽所附屬的核是否被BrdU標(biāo)記(2，2’類)、或核芽與核是否均未被BrdU標(biāo)記(3類)進(jìn)行分類。計(jì)算分屬于各種類型的核的數(shù)量并表示為該類型的核數(shù)/總記數(shù)的形式。
總之，許多癌細(xì)胞內(nèi)均可產(chǎn)生諸如雙微染色體(DMs)等自主復(fù)制的環(huán)形DNA片段(Barker(1982)；Cowell(1982)and Benner，et al.(1991))。這些結(jié)構(gòu)所編碼的蛋白可在體內(nèi)提供生存優(yōu)勢(shì)，或?qū)Χ喾N化學(xué)治療藥劑具有抗性。在S期出芽結(jié)構(gòu)中，DMs優(yōu)先定位于間期細(xì)胞核的周邊，并且被選擇性封裝在核芽?jī)?nèi)，然后在DNA復(fù)制時(shí)，核芽被夾斷而形成微核。這一過(guò)程是微核產(chǎn)生的有絲分裂期后經(jīng)典機(jī)制的替代途徑。含有DMs的微核從細(xì)胞內(nèi)排出或DM DNA在胞內(nèi)微核中降解均可實(shí)現(xiàn)DM含量的降低。無(wú)論在哪種情況下，細(xì)胞核中DM序列的喪失都可導(dǎo)致腫瘤表型、分化或凋亡的逆轉(zhuǎn)。
II.染色體DNA及額外染色體DNA的檢測(cè)與分析A.H2B-GFP表達(dá)載體的構(gòu)建利用PCR從人胎盤基因組DNA中擴(kuò)增出人H2B基因，所用引物可在H2B序列的兩個(gè)末端引入Kpn I和Bam HI位點(diǎn)(Zhong，et al.(1983))。
引物15’-CGGGTACCGCCACCATGCCAGAGCCAGCGAAGTCTGCT-3’引物25’-CGGGATCCTTAGCGCTGGTGTACTTGGTGAC-3’引物1在起始密碼子前部引入Kozak共有序列。PCR反應(yīng)參數(shù)如下95℃10分鐘，在94℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃2分鐘下循環(huán)25次，然后是72℃5分鐘。PCR產(chǎn)物用Kpn I和Bam HI消化，并將消化片段亞克隆到經(jīng)KpnI和BamHI消化的pEGFPN1或pEGFPC1載體(Clontech，Palo Alto，CA)內(nèi)(Yang，et al.(1996))，分別制成C端標(biāo)記的H2B和N端標(biāo)記的H2B。這些載體的CMV啟動(dòng)子用一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的強(qiáng)啟動(dòng)子EF1α啟動(dòng)子替代(Mizushima andNagata(1990))。把EF1α啟動(dòng)子啟動(dòng)的H2B-GFP表達(dá)盒亞克隆到含有由SRα啟動(dòng)子(Takebe，et al.(1988))啟動(dòng)的殺稻瘟菌素S-抗性基因(Izumi，et al.(1991))的主鏈載體中。
B.細(xì)胞系及轉(zhuǎn)染在補(bǔ)加有10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。通過(guò)改進(jìn)的磷酸鈣沉淀法(Chen，et al.(1987))用20μg H2B-GFP表達(dá)載體(H2B-G或G-H2B)轉(zhuǎn)染將要鋪滿的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞重新鋪平板培養(yǎng)，并在轉(zhuǎn)染72小時(shí)后加入5μg/ml的殺稻瘟菌素S(Calbiochem，La Jolla，CA)。在藥物篩選15天后，在熒光顯微鏡下檢驗(yàn)存活的細(xì)胞，并分離出GFP-陽(yáng)性克隆。挑選一些克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)成細(xì)胞系，用于進(jìn)一步的分析。
C.單核小體制備單核小體的純化是按照前人所述(Dubochet and Noll(1978)and Laybourn and Kadonaga(1991))進(jìn)行并有少量修改。胰蛋白酶消化HeLa細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)H2B-GFP的細(xì)胞(3×107)，收集細(xì)胞并用1×RSB緩沖液(10mM Tris pH7.6，15mM NaCl，1.5mM MgCl2)清洗兩次。離心后，將細(xì)胞沉淀重懸于含有1％ Triton-X 100的RSB緩沖液中，用松配杵瞬時(shí)勻漿5次以釋放細(xì)胞核。核通過(guò)離心收集，并用1ml緩沖液A(15mM Tris pH7.5，15mM NaCl，60mM KCl，0.34M蔗糖，0.5mM亞精胺，0.15mM精胺，0.25mM PMSF and 0.1％β-巰基乙醇)清洗兩次。最后將核重懸于1ml緩沖液A中，并加入10μl的0.1M CaCl2。
制備核小體梯帶的方法是在37℃下加入2μl細(xì)球菌核酸酶(Sigma，200單位/ml)(終濃度為0.4單位/ml緩沖液A)并保溫1、5、10、15、30和60分鐘。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出100μl等分試樣并加入2.5μl的0.5M EDTA以終止反應(yīng)。每管加入30μl蒸餾水、20μl的10％ SDS和40μl的5M NaCl?；旌衔镉帽椒?氯仿抽提，并取5μl上清進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。
為制備單核小體，在1.5ml懸浮于緩沖液A的核(終濃度為2單位/ml緩沖液A)中加入15μl細(xì)球菌核酸酶(200單位/ml)進(jìn)行限制性消化。37℃消化2小時(shí)后，加入30μl的0.5M EDTA以終止反應(yīng)。消化產(chǎn)物在10000rpm下離心10分鐘，去除上清。沉淀重懸于450μl的10mM EDTA，加入50μl的5M NaCl以溶解染色質(zhì)。14000rpm離心5分鐘后，上清用Beckman SW41轉(zhuǎn)子在5-30％的蔗糖梯度上26Krpm分級(jí)分離18小時(shí)。離心后收集1ml組分，并取少量等分試樣(50μl)用于DNA分析。剩余樣品(950μl)用280μl含有脫氧膽酸的100％ TCA沉淀并置于冰上10分鐘。然后將樣品在3000rpm下離心5分鐘，沉淀用丙酮清洗，再用70％冷乙醇清洗。沉淀經(jīng)空氣干燥后重懸于20μl的1×SDS樣品緩沖液中，并通過(guò)15％ SDS-PAGE及Coomassie染色加以分析。取同樣的等分試樣用15％ SDS-PAGE進(jìn)行分析，并以抗人H2B抗體(Chemicon)為一抗，結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的抗兔IgG為二抗進(jìn)行蛋白免疫印跡測(cè)定。按照廠商說(shuō)明用魯米諾增強(qiáng)試劑(NEN Life Science Products)檢測(cè)信號(hào)。
D.FACS分析通過(guò)胰蛋白酶消化收集HeLa細(xì)胞和表達(dá)H2B-GFP的HeLa細(xì)胞，在4℃下用70％乙醇固定3小時(shí)。細(xì)胞用含有RNAse的20μg/ml碘化丙錠(PI)染色。細(xì)胞熒光的測(cè)量采用Becton Dickinson FACScan。用FACScan標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)器件區(qū)別并測(cè)量每個(gè)細(xì)胞的紅色(PI)及綠色(GFP)發(fā)射光。為消除由PI發(fā)射和GFP發(fā)射重疊所造成的假象而進(jìn)行補(bǔ)色。細(xì)胞碎片和固定假象均被濾掉。數(shù)據(jù)分析采用Cell Quest，G1、S和G2/M部分的定量則采用Multicycle。
E.熒光顯微鏡檢查鋪展染色體表達(dá)H2B-GFP的HeLa細(xì)胞用秋水仙胺處理60分鐘，胰蛋白酶消化，收集，并重新在低滲緩沖液(10mM Tris pH7.4，10mM NaCl，5mM MgCl2)中懸浮10分鐘(1.5×106細(xì)胞/ml)。通過(guò)細(xì)胞甩片(90秒)將50μl膨脹的細(xì)胞附著在涂有多聚L-賴氨酸的玻片上，用3.7％的甲醛固定5分鐘，溶于PBS的0.1％ NP40固定10分鐘，再用DAPI(1μg/ml)復(fù)染。圖像收集采用配有DAPI(激發(fā)360nm/發(fā)射460nm)或FITC(激發(fā)460nm/發(fā)射535nm)濾光裝置的Nikon熒光顯微鏡。
免疫熒光細(xì)胞置12mm蓋片上生長(zhǎng)，并按照前人所述(Sullivanet al.(1994))用抗著絲?？寡暹M(jìn)行免疫熒光處理。簡(jiǎn)單地說(shuō)，即細(xì)胞用溶于PBS的4％甲醛固定，用含有0.1％ Triton-X 100并溶于PBS的1％ BSA(PBS-TX-BSA)封閉。一抗以1∶2000的比例用PBS-TX-BSA稀釋，加在蓋片上并于37℃保溫30分鐘。蓋片用PBS-TX清洗4次，每次4分鐘，然后用1∶200稀釋于PBS-TX-BSA的羅丹明偶聯(lián)羊抗人IgG(Southern Biotechnologies，Birmingham，AL)共保溫。蓋片在37℃下保溫30分鐘，然后用蒸餾水清洗4次，再空氣干燥。然后用Slow Fade(Molecular Probes，Eugene，OR)將其封固在載玻片上。顯微檢查用建在Zeiss Axiovert 100上的BioRad 1024共焦顯微鏡進(jìn)行，物鏡采用63×1.4 NA Zeiss平場(chǎng)消色差。
活細(xì)胞細(xì)胞置25mm蓋片上生長(zhǎng)，并用預(yù)熱的培養(yǎng)基封固在Dvorak-Stotler盒內(nèi)(Nicholson Precision Instruments，Gaithersburg，MD)。用上述的BioRad 1024共焦顯微鏡采集圖像，物鏡為63×或40×1.3 NA Neofluar，產(chǎn)生GFP熒光的激光功率為0.3-1％。用DIC光學(xué)器件采集透見光圖像。利用Adobe Photoshop將熒光圖像疊加在DIC圖像上。
F.用H2B-GFP標(biāo)記染色體用共焦顯微鏡觀測(cè)表達(dá)H2B-GFP的活細(xì)胞，以確定在間期及有絲分裂期細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)著色的模式。如圖12所示，H2B-GFP能夠高靈敏度地檢測(cè)細(xì)胞周期中所有時(shí)期的染色質(zhì)。獲得該圖像時(shí)無(wú)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和滲透，它們可能會(huì)造成胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的人為改變。H2B-GFP對(duì)核染色質(zhì)具有高度特異性，因?yàn)樵诩?xì)胞質(zhì)中觀測(cè)不到任何的熒光。此外，H2B-GFP可提供非常高的靈敏度。例如，可清晰地觀測(cè)到正在靠近赤道板的后隨姐妹染色單體。間期核內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化表明了染色質(zhì)分布的不均一性。由H2B-GFP觀測(cè)到的核內(nèi)染色質(zhì)精細(xì)結(jié)構(gòu)與此前報(bào)導(dǎo)的用4’，6-二脒苯吲哚(DAPI)染色所獲得的去褶合光截面圖像(Belmont，et al.(1994))相符。表達(dá)H2B-GFP的細(xì)胞的鋪展染色體也說(shuō)明GFP與DAPI的染色模式相同(圖12E)。
在一些間期核內(nèi)的核仁外周觀測(cè)到密集的GFP染色，這表明可能存在核仁外周異染色質(zhì)區(qū)域(圖12A)。確定著絲粒的位置，以查明其定位是否與H2B-GFP濃染色區(qū)域相符。表達(dá)H2B-GFP的細(xì)胞被固定，用抗著絲粒的抗體染色，然后通過(guò)共焦顯微鏡觀察。如前人所述(Moroi，et al.(1981))，在某些間期核中有許多著絲粒位于核仁外周區(qū)域。這些著絲粒與H2B-GFP濃染色區(qū)域重疊。其它不位于核仁外周區(qū)域的著絲粒也往往與H2B-GFP濃染色區(qū)域相關(guān)。在核被膜的內(nèi)表面同樣觀測(cè)到H2B-GFP濃染色區(qū)域，表明也存在外周異染色質(zhì)。
G.活細(xì)胞中雙微染色體顯像H2B-GFP的可能應(yīng)用之一是作為有絲分裂期時(shí)染色體分離的詳細(xì)分析手段。構(gòu)建可高效轉(zhuǎn)移并表達(dá)H2B-GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。構(gòu)建并采用的是一種水泡性口膜炎病毒G糖蛋白(VSV-G)假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(載體的構(gòu)建可參考U.S.Patent No.5,512,421和PCT/US95/11892)，因該系統(tǒng)可提供目前最高的病毒效價(jià)。將含有擴(kuò)增c-myc和DMs的COLO 320DM細(xì)胞用H2B-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，兩天后，幾乎100％的細(xì)胞均表達(dá)H2B-GFP蛋白。利用配有CCD照相機(jī)的表熒光顯微鏡能夠很容易地觀測(cè)到以有絲分裂細(xì)胞內(nèi)小熒光點(diǎn)的形態(tài)存在的DMs。
H.HeLa細(xì)胞內(nèi)H2B-GFP的穩(wěn)定表達(dá)通過(guò)對(duì)人胎盤基因組DNA的PCR擴(kuò)增而獲得人H2B基因。由于組蛋白H2B為多拷貝基因(Baxevanis，et al.(1997))，所以該P(yáng)CR擴(kuò)增獲得了若干克隆。利用與報(bào)導(dǎo)的H2B序列(基因庫(kù)登記號(hào)X00088)(Zhong，et al.(1983))有最高同源性的擴(kuò)增序列構(gòu)建H2B-GFP載體。將H2B基因連接在經(jīng)密碼子優(yōu)化的增強(qiáng)型GFP(EGFP)(Yang，et al.(1996))的C末端(H2B-G)或N末端(G-H2B)(圖8)，并將這些嵌合基因克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體內(nèi)。通過(guò)轉(zhuǎn)染將構(gòu)建體引入HeLa細(xì)胞，熒光顯微鏡觀測(cè)結(jié)果表明H2B-G和G-H2B蛋白均定位在間期核及有絲分裂期染色體上。
為進(jìn)一步描述H2B-GFP蛋白的特征，制備穩(wěn)定表達(dá)H2B-GFP的細(xì)胞系。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中加入殺稻瘟菌素并培養(yǎng)2周，并利用熒光顯微鏡分析抗藥性克隆，以識(shí)別出GFP陽(yáng)性克隆。利用H2B-G或G-H2B抗殺稻瘟菌素克隆產(chǎn)生GFP陽(yáng)性克隆的頻率相等(~10％)。盡管有報(bào)導(dǎo)稱，分離穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞系非常困難(Shima，et al.(1997))，但還是觀測(cè)到數(shù)個(gè)可穩(wěn)定表達(dá)H2B-G或G-H2B的細(xì)胞系。
I.H2B-GFP摻入核小體為確定H2B-GFP是否是核小體核心顆粒的組成部分，利用生物化學(xué)方法將核小體核心顆粒分步分離，并對(duì)H2B-GFP的存在情況進(jìn)行分析。將分離出的表達(dá)H2B-GFP的核用細(xì)球菌核酸酶進(jìn)行廣泛消化而產(chǎn)生單核小體(圖10A)，再通過(guò)含有以解離組蛋白H10.5M NaCl的蔗糖梯度離心進(jìn)行分步分離，(Dubochet and Noll(1978)andLaybourn and Kadonaga(1991))。DNA的電泳分析結(jié)果顯示，級(jí)分2-4(主要為級(jí)分3)中含有與核小體核心顆粒預(yù)定大小(146bp)相同的DNA(圖10D)。通過(guò)15％SDS-PAGE分析樣品中的蛋白含量。圖10B顯示整個(gè)梯度上的蛋白分布。用抗人H2B抗體通過(guò)蛋白免疫印跡分析方法特異檢測(cè)出了H2B和H2B-GFP，這表明H2B-GFP融合蛋白存在于單核小體組分中，并且它在梯度中的分布與組蛋白相同(圖10C)。
J.H2B-GFP的摻入不影響細(xì)胞周期的進(jìn)程將非同步化HeLa細(xì)胞和表達(dá)H2B-GFP的轉(zhuǎn)化體固定，碘化丙錠(PI)染色，并利用FACS進(jìn)行分析。與親代HeLa細(xì)胞相比，GFP標(biāo)記細(xì)胞的綠色發(fā)射光約產(chǎn)生三個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的遷移(圖11A)。通過(guò)測(cè)量PI的紅色發(fā)射光確定DNA的含量(圖11B)。結(jié)果顯示，表達(dá)H2B-GFP的非同步化HeLa細(xì)胞與親代HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期分布沒(méi)有什么區(qū)別。該結(jié)果清晰地表明，H2B-GFP蛋白對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響即便有也是非常小。此外，與親代細(xì)胞相同，利用胸腺嘧啶雙阻斷策略可使表達(dá)H2B-GFP的細(xì)胞成功地同步化。
K.討論這些數(shù)據(jù)表明，H2B-GFP為熒光法標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)染色體提供了一個(gè)新的策略。盡管GFP標(biāo)記的體積較大(239個(gè)氨基酸殘基)，但在許多實(shí)例中都表明，被標(biāo)記的蛋白仍具有功能并且可正確定向(Cubitt，et al.(1995)and Gerdes and Kaether(1996))。顯然，C端標(biāo)記(H2B-G)和N端標(biāo)記(G-H2B)的組蛋白均標(biāo)記出瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的染色體，而利用C端標(biāo)記組蛋白還成功地建立了穩(wěn)定的細(xì)胞系。根據(jù)組蛋白八聚體的X射線晶體結(jié)構(gòu)(Arents，et al.(1991))，組蛋白H3/H4四聚體負(fù)責(zé)組織核小體內(nèi)DNA的中心旋轉(zhuǎn)路線，而H2A/H2B二聚體則結(jié)合在H3/H4四聚體的兩邊。由于早已了解增加離子強(qiáng)度可導(dǎo)致核小體解離成DNA和組蛋白組分(Wolffe(1995))，因此負(fù)責(zé)核小體穩(wěn)定性的初級(jí)相互作用是靜電力。0.5MNaCl可使組蛋白H1和非組蛋白從核小體上解離，但組蛋白H2A/H2B和H3/H4只有在鹽濃度分別達(dá)到0.8M NaCl和1.2M NaCl以上時(shí)才解離(Ohlenbusch，et al.(1967))。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，H2B-GFP能夠在高離子強(qiáng)度(0.5M NaCl)下與單核小體共分離。因此，很可能H2B-GFP蛋白是結(jié)合到核小體核心顆粒內(nèi)部，而不是僅連接在核小體核心顆粒的外側(cè)。
用于活細(xì)胞內(nèi)染色體分析的H2B-GFP策略與其它方法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。盡管已有實(shí)驗(yàn)說(shuō)明可采用Hoechst 33342進(jìn)行哺乳動(dòng)物染色體的活體熒光標(biāo)記(Belmont，et al.(1989)and Hiraoka andHaraguchi(1996))，但要使暴露于藥物的時(shí)間和藥物的濃度得到優(yōu)化，則必須對(duì)每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)分析(Arndt-Jovin，et al.(1989))。此外，由于Hoechst 33342的最大激發(fā)峰接近350nm，而高強(qiáng)度的UV照射可損傷細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞周期延遲或停止，因此必須小心控制UV激發(fā)的強(qiáng)度。DNA藥物，如二氫乙啡啶，的加入可通過(guò)干擾DNA復(fù)制而引起DNA突變(Arndt-Jovin，et al.(1989))。顯微注射羅丹明標(biāo)記的組蛋白曾成功地用于果繩屬染色體的活體染色(Hiraoka，et al.(1989)and Minden(1989))，但它不適合于對(duì)大量哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行分析。與這些方法相比，文中采用的增強(qiáng)GFP方法(Yang，et al.(1996))的激發(fā)光為藍(lán)光(490nm)，與激發(fā)Hoechst所需的UV光激發(fā)相比，它所造成的傷害較小。GFP的圓柱桶狀結(jié)構(gòu)可保護(hù)內(nèi)部的發(fā)色團(tuán)，它可減少由系統(tǒng)間交聯(lián)形成的單態(tài)氧所造成的光化學(xué)損傷(Yang，et al.(1996)and Ormo(1996))。由于DNA非常容易遭受光損傷，因此GFP是一種標(biāo)記DNA的理想蛋白標(biāo)記。此外還進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的延時(shí)成象，在不產(chǎn)生光褪色的17小時(shí)時(shí)間內(nèi)每分鐘采集一個(gè)圖像。由于穩(wěn)定細(xì)胞系內(nèi)的H2B-GFP蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)基因整合而進(jìn)行組成型表達(dá)，因此該細(xì)胞系尤其適合于長(zhǎng)期分析。如文中所示，表達(dá)H2B-GFP的穩(wěn)定細(xì)胞系與親代HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期分布沒(méi)有什么區(qū)別。由于不同物種中組蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)非常保守(Wells(1986))，因此文中所述的H2B-GFP可用于不同物種的細(xì)胞。
GFP標(biāo)記蛋白能夠與特定染色體區(qū)域結(jié)合，加上H2B-GFP的通用修飾能力，使這種蛋白推動(dòng)了體內(nèi)染色體行為的動(dòng)力學(xué)分析。例如，通過(guò)與GFP融合的著絲粒結(jié)合蛋白(CENP-B)的表達(dá)，可對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)的著絲粒進(jìn)行熒光標(biāo)記。這使我們能夠分析有絲分裂期和間期細(xì)胞內(nèi)的著絲粒運(yùn)動(dòng)(Shelby，et al.(1996))。最近，利用與染色體整合的lac操縱子以及在CHO(Robinett，et al.(1996))和芽殖酵母(Straight，et al.(1996))內(nèi)表達(dá)lac阻抑物-GFP融合蛋白的方法對(duì)一種特定染色體區(qū)域進(jìn)行了熒光標(biāo)記。如果能夠?qū)崿F(xiàn)用不同光譜的GFP變異體標(biāo)記特定染色體區(qū)域，并結(jié)合H2B-GFP，我們將能夠同時(shí)檢測(cè)總?cè)旧w上多個(gè)特定位點(diǎn)的行為。例如，在固定細(xì)胞中觀測(cè)到的著絲粒與異染色質(zhì)空間共定位的現(xiàn)象可通過(guò)用不同光譜的GFP變異體標(biāo)記CENP-B而直接在活細(xì)胞核內(nèi)得到證實(shí)。
H2B-GFP載體及其使用方法可在許多方面得到應(yīng)用。由于H2B-GFP的強(qiáng)度代表了染色體的凝集狀況，因此我們可以研究染色體凝集和去凝集(Hiraoka，et al.(1989))、細(xì)胞核形成、以及間期核內(nèi)的異染色質(zhì)移動(dòng)。此外，染色體分離的活體顯像使我們能夠詳細(xì)地分析異常染色體的動(dòng)力學(xué)運(yùn)動(dòng)。例如，已分別在活細(xì)胞內(nèi)顯現(xiàn)了染色體橋的形成和微核形成，它們通常代表了雙著絲點(diǎn)染色體和無(wú)著絲點(diǎn)染色體(Shimizu，et al.(1996))。在活細(xì)胞內(nèi)同樣鑒別出了帶有擴(kuò)增序列的雙微染色體，盡管它們的大小要小于正常染色體。H2B-GFP系統(tǒng)有助于基因組不穩(wěn)定性的分析，如非整倍性的形成、基因擴(kuò)增、以及染色體丟失等，而利用固定鋪展染色體方法難以對(duì)這些問(wèn)題加以分析。
這些結(jié)果表明，H2B-GFP融合蛋白可結(jié)合到核小體核心顆粒內(nèi)部，并能夠在保持核及染色體結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行染色體的高分辨率成象。這使我們能夠?qū)θ旧w動(dòng)力學(xué)的多個(gè)方面進(jìn)行研究，如染色體凝集、核內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及有絲分裂期間的分離等。
應(yīng)該了解的是，盡管連同以上實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但前面的描述以及后面的實(shí)例均是用來(lái)說(shuō)明，而不是限定，本發(fā)明的范圍。處在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它方面、優(yōu)點(diǎn)和修改對(duì)該領(lǐng)域的專家而言是顯而易見的，它們都將從屬于本項(xiàng)發(fā)明。
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權(quán)利要求
1.一種鑒定方法，用來(lái)鑒定可誘導(dǎo)細(xì)胞成熟或細(xì)胞死亡的治療藥劑，該方法包括將測(cè)試細(xì)胞與潛在的治療藥劑相接觸，其中該測(cè)試細(xì)胞含有確定水平的DM或額外染色體DNA，并且能夠經(jīng)歷微核形成；以及測(cè)定所述測(cè)試細(xì)胞的DM或額外染色體DNA的水平，由此確定DM或額外染色體DNA可減少或從細(xì)胞內(nèi)消除，則表明該藥劑是一種可促進(jìn)微核形成從而導(dǎo)致細(xì)胞成熟或細(xì)胞死亡的治療藥劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的測(cè)試細(xì)胞缺乏功能性腫瘤抑制蛋白。
3.權(quán)利要求1的方法，其中的測(cè)試細(xì)胞含有一種癌基因。
4.權(quán)利要求1的方法，其中的測(cè)定是通過(guò)FISH、流式細(xì)胞術(shù)、離心分步分離、或組蛋白-GFP標(biāo)記來(lái)進(jìn)行。
5.由權(quán)利要求1的方法鑒定的一種治療藥劑。
6.一種誘導(dǎo)適當(dāng)細(xì)胞成熟或死亡的方法，該方法包括將適當(dāng)細(xì)胞與能夠通過(guò)微核形成來(lái)誘導(dǎo)或加強(qiáng)該適當(dāng)細(xì)胞內(nèi)DM或額外染色體DNA消除的藥劑相接觸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中的細(xì)胞缺乏功能性腫瘤抑制蛋白。
8.權(quán)利要求6的方法，其中的適當(dāng)細(xì)胞含有一種擴(kuò)增的癌基因。
9.權(quán)利要求6的方法，其中的適當(dāng)細(xì)胞在體外、來(lái)自體內(nèi)或在體內(nèi)進(jìn)行接觸。
10.一種對(duì)患有疾病的受試者進(jìn)行治療的方法，該疾病涉及受試者中存在含有DM或額外染色體DNA，并能夠通過(guò)額外的微核形成消除DM或DNA的細(xì)胞，該方法包括給受試者施用有效劑量的一種藥劑，該藥劑可通過(guò)微核形成誘導(dǎo)或加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)DM或額外染色體DNA消除。
11.權(quán)利要求10的方法，其中的細(xì)胞缺乏功能性腫瘤抑制蛋白。
12.權(quán)利要求10的方法，其中的細(xì)胞含有一種擴(kuò)增的癌基因。
13.權(quán)利要求10的方法，其中的藥劑為羥基脲或其衍生物。
14.權(quán)利要求6或10的方法，其中該制劑為一種具下式的化合物 其中R1為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、?；?(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，包括鹵素、-OH、-NR2、-OR、-C(O)OR、-OC(O)R、酰胺和?；?，其中R為H、烷基或芳基；R2為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、-C(O)R’或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且其中的R’為烷基或芳基，取代基則如上文定義；R3為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、OR”、NR”2或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，包括-OH、-NR”2、-OR”、-C(O)OR”、-OC(O)R”、酰胺和?；渲蠷”為H、烷基或芳基；并且R4為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基的選自下列一組，包括-OH、-NR”’2、-OR”’、-C(O)OR”’、-OC(O)R”’、酰胺和?；?，其中R”’為H、烷基或芳基。
15.權(quán)利要求6或10的方法，其中該制劑為下式的化合物 其中R1為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、?；?(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，包括鹵素、-OH、-NR2、-OR、-C(O)OR、-OC(O)R、酰胺和酰基，其中R為H、烷基或芳基；R2和R4各自獨(dú)立地為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、OR’、NR’2或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，包括-OH、-NR’2、-OR’、-C(O)OR’、-OC(O)R’、酰胺和?；渲蠷’為H、烷基或芳基；并且R3和R5各自獨(dú)立地為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數(shù)，n為1-4的整數(shù)；X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，包括-OH、-NR”2、-OR”、-C(O)OR”、-OC(O)R”、酰胺和?；?，其中R”為H、烷基或芳基。
16.一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DM或額外染色體DNA的方法，該方法包括步驟將一種可檢測(cè)的標(biāo)記蛋白插入細(xì)胞，其中該蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)的DM和額外染色體DNA特異結(jié)合；以及檢測(cè)標(biāo)記蛋白和/或DM或額外染色體DNA復(fù)合物，從而表明細(xì)胞內(nèi)DM和額外染色體DNA的壓力。
17.權(quán)利要求16的方法，其中的蛋白為組蛋白或其類似物。
18.權(quán)利要求16的方法，其中的可檢測(cè)標(biāo)記為一種熒光標(biāo)記。
19.權(quán)利要求18的方法，其中的熒光標(biāo)記為多管水母屬綠色熒光蛋白、多管水母屬紅色熒光蛋白或多管水母屬黃色熒光蛋白。
20.權(quán)利要求16的方法，其中的標(biāo)記蛋白通過(guò)將細(xì)胞與一種載體相接觸而被引入細(xì)胞，該載體含有經(jīng)可檢測(cè)標(biāo)記的組蛋白融合蛋白的編碼DNA。
21.權(quán)利要求20的方法，其中的組蛋白融合蛋白為H2B-GFP。
22.權(quán)利要求20的方法，其中的載體為一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
23.一種監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)染色體DNA物質(zhì)移動(dòng)的方法，包括將一種經(jīng)可檢測(cè)標(biāo)記的蛋白引入細(xì)胞，其中該蛋白能夠與胞內(nèi)染色體DNA特異結(jié)合而產(chǎn)生一種標(biāo)記復(fù)合物；檢測(cè)標(biāo)記復(fù)合物，從而檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)染色體DNA；以及將標(biāo)記復(fù)合物與未復(fù)合染色體的位置進(jìn)行比較。
24.權(quán)利要求23的方法，其中能夠與細(xì)胞內(nèi)染色體DNA特異結(jié)合的蛋白為著絲粒結(jié)合蛋白或lac操縱子。
25.權(quán)利要求23的方法，其中染色體移動(dòng)的選自下列現(xiàn)象，包括染色體凝集、染色體去凝集、核仁形成、異染色質(zhì)移動(dòng)、染色體斷裂、染色體橋形成、微核形成、基因擴(kuò)增、非整倍性形成、染色體丟失和染色體易位。
26.一種檢測(cè)病理細(xì)胞表型的方法，該方法包括將一種經(jīng)可檢測(cè)標(biāo)記的蛋白引入細(xì)胞，其中該蛋白能夠與DM和額外染色體DNA特異結(jié)合而產(chǎn)生一種標(biāo)記復(fù)合物；檢測(cè)標(biāo)記復(fù)合物，從而檢測(cè)與病理性表型相關(guān)的DM和額外染色體DNA；以及將病理性表型與參照細(xì)胞的表型進(jìn)行比較。
27.權(quán)利要求26的方法，其中的病理性表型為癌癥或腫瘤病。
全文摘要
本發(fā)明提供篩選測(cè)試物質(zhì)的方法,通過(guò)該方法篩選能抑制、增強(qiáng)或除去細(xì)胞中微核化形成的雙微體(DM)或額外染色體DNA。本發(fā)明也提供一種方法,誘導(dǎo)能產(chǎn)生微核的細(xì)胞成熟或死亡。本發(fā)明也提供給患病的受試者治療的方法,所治療的細(xì)胞與具有DM和額外染色體DNA并能產(chǎn)生微核以捕捉它們的疾病相關(guān)。進(jìn)一步提供一種檢測(cè)細(xì)胞中染色體和額外染色體DNA的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1383452SQ99803923
公開日2002年12月4日 申請(qǐng)日期1999年1月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月12日
發(fā)明者G·M·瓦爾, H·M·舍帕德, N·施米朱, 特魯·坎達(dá) 申請(qǐng)人:新生物技術(shù)公司, 索爾克學(xué)院