專利名稱：：胰島素樣生長因子ii反義寡核苷酸序列以及使用該序列調(diào)節(jié)細胞生長的方法使用該序列調(diào)節(jié)細胞生長的方法可供參考的相關申請本申請要求1998年4月23日提交的美國臨時申請流水號60/082,791的優(yōu)先權，該臨時申請全文列入本文作為參考。參考文獻本申請中提及下列出版物，專利申請和專利1．Toretsky,J.A和Helman,L.J,IGF-Ⅱ與人類癌癥有關，內(nèi)分泌學雜志，149:367-72,1996。2．Werner,H和LeRoith,D.胰島素樣生長因子系統(tǒng)對人類癌癥的作用，AdvCancerRes.68:183-223,1996。3．Rogler,C.E.,Yang,D.,Rossetti,L.,Donohoe,J.,Alt,E.,Chang,C.J.,Rosenfeld,R.,Neely,K.,和Hintz,R.胰島素樣生長因子Ⅱ轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)經(jīng)改變的身體組成和頻率增加的多種惡性腫瘤，生物化學雜志，269:13779-84,1994。4．Bates,P.,Fisher,R.,Ward,A.,Richardson,L.,Hill,D.J.,和Graham,C.F.表達胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺癌[見評論]，英國癌癥雜志，72:1189-93,1995.5．Cullen,K.J.,Lippman,M.E.,Chow,D.,Hill,S.,Rosen,N.,和Zwiebel,J.A,MCF-7細胞中胰島素樣生長因子Ⅱ的過量表達誘導與惡性腫瘤進程相關的表型變化，分子內(nèi)分泌學，6:91-100,1992.6．Werner,H.,Adamo,M.,Roberts,C.T.,Jr.,和LeRoith,D.胰島素樣生長因子作用的分子和細胞方面的機理，VitamHorm.48:1-58,1994。7．Curcio,L.D.,Bouffard,D.Y.,和Scanlon,K.J.用作癌癥基因表達調(diào)節(jié)劑的寡核苷酸，藥物治療，74:317-32,1997。8．Narayanan,R.和Allhtar,S.反義療法，CurrOpinOncol。8:509-15,1996。9．Ho,P.T.和Parkinson,D.R.用作惡性腫瘤疾病治療劑的寡核苷酸，SeminOncol.24:187-202,1997。10．Crooke,S.T.和Bennett,C.F.反義寡核苷酸治療劑進展，AnnuRevPharmacolToxicol.36:107-29,1996。11．Christofori,O.,Naik,P.,和Hanahan,D.在癌基因-誘導的腫瘤生成中由胰島素樣生長因子Ⅱ提供的第二信號，自然，369:414-8,1994。12．El-Badry,O.M.,Minniti,C.,Kohn,E.C.,Houghton,P.J.,Daughaday,W.H.,和Helman,L.J.胰島素樣生長因子Ⅱ用作人橫紋肌肉瘤中的自泌生長和能動因子，細胞生長與分化，1:325-31,1990。13．Kim,K.W.,Bae,S.K.,Lee,O.H.,Bae,M.H.,Lee,M.J.,和Park,B.C.由低氧誘導的胰島素樣生長因子Ⅱ?qū)е氯烁渭毎┭苌?，癌癥研究，58:348-51,1998。14．Volpert,O.,Jackson,D.,Bouck,N.,和Linzer,D.I.增殖蛋白-誘導的血管生成需要胰島素樣生長因子Ⅱ/甘露糖6-磷酸受體，內(nèi)分泌學，137:3871-6,1996。15．Lin,S.B.,Hsieh,S.H.,Hsu,H.L.,Lai,M.Y.,Kan,L.S.,和Au,L.C.,ⅡGF-Ⅱ的反義寡脫氧核苷酸選擇性抑制過量產(chǎn)生IGF-Ⅱ的人肝癌細胞生長，生物化學雜志(東京).122:717-22,1997。16．Steller,M.A.,Delgado,C.H.,Bartels,C.J.,Woodworth,C.D.,和Zou,Z.人子宮頸癌細胞中胰島素樣生長因子-1受體的過量表達和自泌刺激，癌癥研究，56:1761-5,1996。17．Steller,M.A.,Delgado,C.H.,和Zou,Z.胰島素樣生長因子Ⅱ介導子宮頸癌細胞中由表皮生長因子誘導的細胞分裂發(fā)生，ProcNatlAcadSciUSA.92:11970-4,1995。18．Choy等，″涉及核糖核苷酸還原酶的藥物抗性分子機制存在逐步增加的藥物濃度時在一系列克隆相關的小鼠細胞系中選擇的羥基脲抗性″，癌癥研究.48:2029-2035(1988)。19.Fan等，″核糖核苷酸還原酶R2成分是新的惡性腫瘤決定子，它與癌基因合作決定轉(zhuǎn)化和惡變能力″Proc.Nat1.Acad.SciUSA93:14036-40(1996)。20．Huang和Wright，″成纖維細胞生長因子介導的藥物抗性的變化和基因擴增的證據(jù)″癌基因，9:491499(1994)。21．Uhlmann等。ChemRev.90:534-583(1990)。22．Agrawal等。TrendsBiotechnol10:152-158(1992)。23．Remington’sPharmaceuticalSciencesMacePublishingCompany,hiladelphiaPA17th編。(1985)。24．Sambrook等，分子克隆-實驗室手冊，冷泉港實驗室，紐約(1989,1992)。25．Ausubel等，最新分子生物學方法，JohnWiley和Sons,BaltimoreMaryland(1989)。26．Perbal，分子克隆實驗指南，JohnWiley＆Sons，紐約(1988)。27．Hurta和Wright，″H-ras所致的惡變導致轉(zhuǎn)化生長因子-β異常調(diào)節(jié)核糖核苷酸還原酶的基因表達″，細胞生物化學雜志，57:543-556(1995)。28．Dreeley等，科學，258:1650-1654(1992)。29．Nielsen等；科學(1991)354:1497。30．Good和Nielsen；″通過靶向核糖體RNA的肽核酸抑制翻譯和細菌生長″，PNASUSA(1998)95:2073-2076。31．Buchardt,deceased，等，美國專利5,766,855。32．Buchardt,deceased，等，美國專利5,719,262。33．美國專利5,034,506。34．Altschul，等″基本的局部序列對比檢索工具″，分子生物學雜志(1990)215:403-10。35．DevereuxJ.等，″VAX的全套序列分析程序″，核酸研究(1984)12:387-395。36．Chang等；體細胞基因治療，CRCPress,AnnArborMI(1995)。37．Vega等；基因靶向，CRCPress,AnnArborMI(1995)。38．載體分子克隆載體及其用途概述，Butterworths,BostonMA(1988)。39．Sullivan，美國專利5,225,347。40．1991年6月11日公開的美國專利5,023,252。41．Felgner等，美國專利5,580,859。上述所有出版物，專利申請和專利都全文列入本文作為參考，就象特別地和個別地指出每篇出版物，專利申請或?qū)＠既牧腥氡疚淖鳛閰⒖家粯?。IGF-Ⅱ通過多種機理參與多種腫瘤的腫瘤進程和轉(zhuǎn)移(參見(1,2))。與IGF-Ⅱ十分相關的腫瘤包括兒童易患的腫瘤，如橫紋肌肉瘤，維爾姆斯瘤和成神經(jīng)細胞瘤。這些腫瘤闡明了IGF-Ⅱ的過量表達顯示出旁分泌或自分泌環(huán)的存在，并可通過阻斷環(huán)抑制腫瘤生長或轉(zhuǎn)移。在包括骨肉瘤，乳腺癌，肝胚細胞瘤，生殖細胞瘤，肝細胞癌，腎上腺皮質(zhì)癌，肺癌，平滑肌肉瘤，腦瘤和結腸癌的多種腫瘤中，IGF-Ⅱ不同程度地導致腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。另外，過量表達IGF-Ⅱ的轉(zhuǎn)基因小鼠和人細胞系也闡明了IGF-Ⅱ?qū)δ[瘤發(fā)生的直接作用(3-5)。人IGF-Ⅱ基因位于染色體11p15，緊接胰島素基因的下游并跨越30kb(參見(6)；見圖1)。它由9個外顯子組成，其中外顯子7和8以及外顯子9的一部分編碼前體蛋白質(zhì)。外顯子1,4,5和6的上游是不同的啟動子P1,P2,P3和P4。啟動子P1僅在成人的肝臟中有活性，而P2-4在大多數(shù)胎兒組織中具有活性。有幾個成人組織由P2,3和4啟動表達少量轉(zhuǎn)錄物(胎兒轉(zhuǎn)錄物)。已鑒定出4種主要的mRNA類型(胎兒轉(zhuǎn)錄物為6kb,4.8-5kb和2.2kb，成人轉(zhuǎn)錄物為5.3kb)，它們是由不同啟動子啟動并通過不同方式的剪接產(chǎn)生的。在多種原發(fā)性癌癥和細胞系中觀察到的IGF-Ⅱ過量表達似乎是由胎兒mRNA的重新激活(在肝臟中)或過量表達(在其它器官中)引起的，所述胎兒mRNA的表達主要由P3和P4啟動產(chǎn)生。這些胎兒轉(zhuǎn)錄物含有獨特的5’非翻譯區(qū)(含有外顯子4或5或6的5’UTR)，而由P1啟動產(chǎn)生的成人轉(zhuǎn)錄物卻不含該區(qū)域(含有外顯子1,2和3的5’UTR)。通過與靶mRNA進行序列特異性雜交，反義寡核苷酸(AS-ODN)已被廣泛用于以靶-特異性的方式抑制基因表達。在大量的研究中，由反義寡核苷酸-介導的對癌基因的阻抑揭示出這些化合物不僅對闡明控制腫瘤發(fā)生的生化機理十分有用(7)，還很有希望用作新的治療化合物以治療人類癌癥(8,9)。另外，基于寡核苷酸的治療劑的毒性相對較小(10)。幾項研究(11,15-17)表明某些特異性針對成年人或小鼠IGF-Ⅱ轉(zhuǎn)錄物的反義寡核苷酸能有效干擾腫瘤細胞的體外增殖。在一項研究(15)中，靶向成人轉(zhuǎn)錄物之翻譯起始位點的反義寡核苷酸對IGF-Ⅱ生產(chǎn)的抑制作用導致對人肝細胞癌細胞系HuH-7和HepG2生長的抑制作用。在利用人子宮頸癌細胞系的另一些研究(16,17)中，靶向IGF-Ⅱ之蛋白質(zhì)編碼區(qū)的反義寡核苷酸可抑制表皮生長因子(EGF)-誘導的促分裂作用。因此，需要鑒定針對IGF-Ⅱ，并能以較高的特異性和較低的毒性抑制IGF-Ⅱ表達和產(chǎn)生的反義寡核苷酸。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)哺乳動物中的IGF-Ⅱ基因表達和IGF-Ⅱ產(chǎn)生的反義寡核苷酸和含有該反義寡核苷酸的藥物組合物。本發(fā)明還涉及使用該反義寡核苷酸抑制哺乳動物體內(nèi)的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的方法。因此，本發(fā)明一方面涉及反義寡核苷酸，該寡核苷酸長度約為3至100個核苷酸，其含有與哺乳動物胎兒IGF-ⅡmRNA互補的核苷酸。反義寡核苷酸可對核酶具有抗性，并具有一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間連鍵。反義寡核苷酸可進一步含有不與IGF-ⅡmRNA互補的其它核苷酸。寡核苷酸可含有選自表1之SEQIDNO:1至15的序列。本發(fā)明還涉及反義寡核苷酸，該寡核苷酸長度約為20至100個核苷酸，其含有與成年哺乳動物IGF-ⅡmRNA互補的核苷酸，該核苷酸可含有選自表2之SEQIDNO:17至31的序列。本發(fā)明另一方面涉及含有反義寡核苷酸序列的載體，該寡核苷酸長度約為3至100個核苷酸，其含有與哺乳動物胎兒IGF-ⅡmRNA之5’非翻譯區(qū)互補的序列。本發(fā)明另一方面涉及含有反義寡核苷酸序列的載體，該寡核苷酸長度約為20至100個核苷酸，其含有選自表2之SEQIDNO:17至31的序列。本發(fā)明另一方面涉及含有藥物可接受的賦形劑和有效量的反義寡核苷酸的藥物組合物，該寡核苷酸長度約為3至100個核苷酸，其含有與哺乳動物胎兒IGF-ⅡmRNA互補的核苷酸。寡核苷酸可含有選自表1之SEQⅡDNO:1至15的序列。本發(fā)明另一方面涉及含有藥物可接受的賦形劑和有效量的反義寡核苷酸的藥物組合物，該寡核苷酸長度約為20至100個核苷酸，其含有選自表2之SEQIDNO:17至31的列。本發(fā)明另一方面涉及抑制哺乳動物腫瘤生長的方法，所述方法包括在能抑制腫瘤生長的條件下，給懷疑患有腫瘤的哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，該寡核苷酸長度約為3至100個核苷酸，并與哺乳動物胎兒IGF-ⅡmRNA互補。反義寡核苷酸可與化學治療劑一起使用。寡核苷酸可含有選自表1之SEQIDNO:1至15的序列。本發(fā)明另一方面涉及抑制哺乳動物腫瘤生長的方法，所述方法包括在能抑制腫瘤生長的條件下，給懷疑患有腫瘤的哺乳動物施用有效量的選自表2之SEQIDNO:17至31的反義寡核苷酸，該寡核苷酸長度約為20至100個核苷酸，并與成年哺乳動物的IGF-ⅡmRNA互補。本發(fā)明另一方面涉及抑制哺乳動物腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括在能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，給懷疑患有轉(zhuǎn)移性腫瘤的哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，該寡核苷酸長度約為3至100個核苷酸，并與哺乳動物胎兒IGF-ⅡmRNA互補。反義寡核苷酸可與化學治療劑一起使用。寡核苷酸可含有選自表1之SEQIDNO1至15的序列。本發(fā)明另一方面涉及抑制哺乳動物腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括在能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，給懷疑患有轉(zhuǎn)移性腫瘤的哺乳動物施用有效量的選自表2之SEQIDNO:17至31的反義寡核苷酸，該寡核苷酸長度約為20至100個核苷酸，并與成年哺乳動物的IGF-ⅡmRNA互補。圖2A-D是施用所示反義寡核苷酸對不同細胞系的集落形成能力之抑制作用的百分比圖。圖2A顯示了對人橫紋肌肉瘤細胞系RD的抑制作用百分比；圖2B顯示了對人前列腺癌細胞系PC-3的抑制作用百分比；圖2C顯示了對人胰腺癌細胞系AsPC-1的抑制作用百分比；圖2D顯示了對人成神經(jīng)細胞瘤細胞系SK-N-AS的抑制作用百分比。圖3是施用反義寡核苷酸GTI4006[SEQIDNO6]或GTI4011[SEQIDNO:11]之后，人成神經(jīng)細胞瘤細胞系SK-N-AS或橫紋肌肉瘤細胞系(RD)之RNA的Northern印跡放射自顯影圖。圖4是用不同反義寡脫氧核苷酸處理之后，人成神經(jīng)細胞瘤細胞之IGF-Ⅱ表達的Western印跡照片。圖5是用不同反義寡脫氧核苷酸處理之后，人橫紋肌肉瘤細胞之IGF-Ⅱ表達的Western印跡照片。圖6A是用或不用(對照)多種反義寡核苷酸注射小鼠體內(nèi)的人成神經(jīng)細胞瘤細胞(SK-N-AS)之后的腫瘤體積圖。圖6B是用或不用(對照)多種反義寡核苷酸注射小鼠體內(nèi)的人成神經(jīng)細胞瘤細胞(SK-N-AS)之后20天的腫瘤重量圖。圖7A是用或不用(對照)多種反義寡核苷酸注射小鼠體內(nèi)的人維爾姆斯瘤細胞(G401)之后的腫瘤體積圖。圖7B是用或不用(對照)多種反義寡核苷酸注射小鼠體內(nèi)的人維爾姆斯瘤細胞(G401)之后20天的腫瘤重量圖。圖8是用反義寡核苷酸GTI4006[SEQIDNO:6]處理之后，人成神經(jīng)細胞瘤(SK-N-AS)中的IGF-ⅡmRNA水平的Northern印跡放射自顯影圖。圖9是用多種反義寡核苷酸處理之后，人成神經(jīng)細胞瘤(SK-N-AS)之IGF-Ⅱ蛋白質(zhì)水平的Western印跡照片。下面的帶是經(jīng)印度墨汁染色以顯示上樣的總蛋白質(zhì)的凝膠照片。圖10是用多種反義寡核苷酸處理細胞系之后，每只小鼠中的人黑素瘤細胞系(C8161)肺轉(zhuǎn)移的平均數(shù)目。圖11是人IGF-Ⅱ基因之核苷酸序列的一部分。圖11A是外顯子4[SEQIDNO:34]的序列，圖11B是外顯子5[SEQIDNO:35]的序列，圖11C是外顯子6[SEQIDNO:36]的序列，和圖11D是外顯子7-9[SEQIDNO:37]的序列。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及與哺乳動物IGFⅡ基因互補的寡核苷酸，該寡核苷酸可調(diào)節(jié)哺乳動物的腫瘤細胞生長。在多種人原發(fā)性癌癥和細胞系中觀察到的IGF-Ⅱ過量表達似乎是由胎兒mRNA的重新激活(在肝臟中)或過量表達(在其它器官中)引起的。因此，被設計成特異性靶向5’UTR中胎兒轉(zhuǎn)錄物，而使成人轉(zhuǎn)錄物保持原樣的反義寡核苷酸可高度特異性地靶向腫瘤細胞。不必受理論或機理的束縛，據(jù)信這些反義化合物可通過下列方式發(fā)揮其抗腫瘤活性即不僅可抑制腫瘤細胞的自泌生長并可能會誘導細胞凋亡，還可抑制IGF-Ⅱ的自泌/旁分泌功能，如腫瘤細胞的能動性和/或誘導內(nèi)皮細胞移動和血管生成。定義本文所用的下列術語具有下列含義本文所用術語“反義寡核苷酸”指的是與目的mRNA互補的核苷酸序列。反義寡核苷酸與能有效用作抑制IGF-Ⅱ表達之靶的哺乳動物IGF-ⅡmRNA的任何部分互補。優(yōu)選反義寡核苷酸與IGF-Ⅱ胎兒轉(zhuǎn)錄物的5’非翻譯區(qū)互補。更優(yōu)選反義寡核苷酸與圖11A-C所示外顯子4，5或6的核苷酸序列互補。不必受理論或機理的束縛，一般相信反義寡核苷酸的活性取決于寡核苷酸與靶核酸的結合(例如與基因組區(qū)域，基因或其mRNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分結合)，從而通過雜交抑制或通過用RNA酶H破壞靶RNA(當與RNA雜交時能激活RNA酶H)來破壞靶的功能。術語“寡核苷酸”指的是由天然堿基，糖和糖間(骨架)連鍵組成的核苷酸或核苷單體的寡聚體或多聚體。該術語還包括含有非天然單體或其部分且功能相似的經(jīng)修飾或取代的寡聚體。這種經(jīng)修飾或取代的寡聚體優(yōu)于天然寡聚體，因為前者的細胞攝入能力增強，或在核酶的存在下穩(wěn)定性增強。該術語還包括含有兩個或多個不同化學區(qū)域的嵌合寡核苷酸。例如，嵌合寡核苷酸可含有至少一個可賦予有利特性(如核酶抗性增加，細胞攝入能力增強)的經(jīng)修飾的核苷酸區(qū)域，或者本發(fā)明的兩個或多個寡核苷酸可以連接形成嵌合寡核苷酸。本發(fā)明的反義寡核苷酸可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸，并可含有天然或合成的單體堿基，所述堿基包括腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶。寡核苷酸也可含有經(jīng)修飾的堿基，如黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-甲基，2-丙基和其它烷基腺嘌呤，5-鹵尿嘧啶，5-鹵胞嘧啶，6-氮尿嘧啶，6-氮胞嘧啶和6-氮胸腺嘧啶，假尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，8-鹵腺嘌呤，8-氨基腺嘌呤，8-巰基腺嘌呤，8-巰基烷基腺嘌呤，8-羥基腺嘌呤和其它8-取代腺嘌呤，8-鹵鳥嘌呤，8-氨基鳥嘌呤，8-巰基鳥嘌呤，8-巰基烷基鳥嘌呤，8-羥基鳥嘌呤和其它8-取代的鳥嘌呤，其它氮和脫氮尿嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶或鳥嘌呤，5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。修飾也可包括將其它化學基團，如甲基，乙基，丙基結合至包括糖，堿基或骨架組分的寡核苷酸的多個部分。本發(fā)明的反義寡核苷酸也可在磷酸酯骨架，短鏈烷基或環(huán)烷基糖間連鍵中含有磷氧雜原子或含有短鏈雜原子或雜環(huán)糖間連鍵。例如，反義寡核苷酸可含有甲基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯和嗎啉代寡聚體。反義寡核苷酸可含有連接4至6個3’末端核苷酸的硫代磷酸酯鍵。硫代磷酸酯鍵可連接所有核苷酸。硫代磷酸酯連鍵可以是混合的Rp和Sp對映異構體，或者是有規(guī)立構或基本上有規(guī)立構的Rp或Sp形式。反義寡核苷酸也可具有糖模擬物。寡核苷酸可具有至少一個含經(jīng)修飾堿基和/或糖的核苷酸，如2’-O-取代的核糖核苷酸。本發(fā)明意義上的術語“2’-O-取代”指的是用含有1-6個飽和或不飽和碳原子的-O-低級烷基，或用具有2-6個碳原子的-O-芳基或烯丙基取代戊糖組成成分的2’位，其中所述烷基，芳基或烯丙基可以是非取代的，或也可以被例如鹵，羥基，三氟甲基，氰基，硝基，酰基，酰氧基，烷氧基，羧基，烷酯基或氨基取代。本發(fā)明的寡核苷酸可包括4或5個5’末端被2’-O-烷基化的核糖核苷酸和/或4或5個3’末端被2’-O-烷基化的(2’-O-alylated)核糖核苷酸。本發(fā)明的反義寡核苷酸也可含有核苷酸類似物，其中核苷酸的結構發(fā)生了根本性的變化。這種寡核苷酸類似物的一個例子是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脫氧核糖(或核糖)磷酸酯骨架被聚酰胺骨架所取代，所述聚酰胺骨架與肽中的相類似(Nielsen等29；Good和Nielsen30；Buchardt，deceased等31；美國專利5,766,855；Buchardt,deceased等32；美國專利5,719,262)。PNA類似物對酶降解具有抗性，體內(nèi)和體外的壽命延長。相對于天然的核酸分子而言，PNA與互補DNA序列的結合能力更強，原因是PNA鏈和DNA鏈之間缺乏電荷排斥。本發(fā)明的寡核苷酸也可包括含有多聚體骨架，環(huán)骨架或無環(huán)骨架的其它核苷酸。例如，核苷酸可含有嗎啉代骨架結構(美國專利5,034,506(33))。當本發(fā)明的寡核苷酸經(jīng)修飾后對DNA和RNA核酶的降解不敏感，或者被置入本身可保護寡核苷酸免受DNA或RNA核酶降解的傳遞載體中時，所述寡核苷酸即為“核酶抗性”。核酶抗性的寡核苷酸包括例如甲基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯和嗎啉代寡聚體。賦予核酶抗性的適當傳遞載體包括例如脂質(zhì)體。本發(fā)明的寡核苷酸也可含有例如改善寡核苷酸之藥物動力學或藥效學特性的基團。反義寡核苷酸優(yōu)選選自與IGF-Ⅱ基因互補的序列以使序列最小可能的顯示出雙鏈體形成，發(fā)夾形成和同寡聚體/序列重復但具有高至中等的結合IGF-Ⅱ基因序列的效力。使用計算機模型設計程序OLIGO引物分析軟件第5.0版(由NationalBiosciences,Inc.,Plymouth，MN分發(fā))可測定這些特性。該計算機程序可定性估測這5個參數(shù)?；蛘?，也可在兩種或多種哺乳動物之間的IGF-Ⅱ基因序列高度保守的基礎上選擇反義寡核苷酸。使用Wisconsin大學計算機小組(GCG)軟件(DevereuxJ等(35))的BLASTN程序(Altschul等(34))以及國立生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫可測定這些特性。反義寡核苷酸可包括突變，如取代，插入和缺失。優(yōu)選低于10％的序列具有突變。反義寡核苷酸一般含有至少約3個核苷酸或核苷酸類似物，更優(yōu)選至少約為5個核苷酸，更優(yōu)選至少約為7個核苷酸，更優(yōu)選至少約為9個核苷酸，最優(yōu)選至少約為20個核苷酸。反義寡核苷酸優(yōu)選少于約100個核苷酸或核苷酸類似物，更優(yōu)選少于約50個核苷酸或核苷酸類似物，最優(yōu)選少于約35個核苷酸或核苷酸類似物。優(yōu)選反義寡核苷酸與胎兒IGF-Ⅱ轉(zhuǎn)錄物的5’非翻譯區(qū)互補。“胎兒IGF-Ⅱ轉(zhuǎn)錄物的非翻譯區(qū)”指的是在胎兒細胞中轉(zhuǎn)錄形成主要的IGF-Ⅱ轉(zhuǎn)錄物而不形成成人IGF-Ⅱ轉(zhuǎn)錄物(成人細胞中的主要轉(zhuǎn)錄物)部分的IGF-Ⅱ基因部分。優(yōu)選“胎兒IGF-Ⅱ轉(zhuǎn)錄物的非翻譯區(qū)”是IGF-Ⅱ基因的外顯子4,5和6。最優(yōu)選“胎兒IGF-Ⅱ轉(zhuǎn)錄物的非翻譯區(qū)”基本上是圖11A-C所示的外顯子4,5和6的序列。優(yōu)選反義寡核苷酸含有下表1和2所示的序列。表1被設計用于靶向人IGF-Ⅱ胎兒mRNA的反義序列反義寡核苷酸選自與人IGF-ⅡmRNA互補的序列以使序列最不可能顯示出雙鏈體形成，發(fā)夾形成和同寡聚體/序列重復但可高效結合IGF-ⅡmRNA序列并含有GC夾。另外，還消除了對人和小鼠中的其它常見或重復序列的錯誤引發(fā)。使用計算機模型設計程序OLIGO引物分析軟件第5.0版(由NationalBiosciences,Inc.,Plymouth,MN分發(fā))可測定這些特性。表2具有與人IGF-ⅡmRNA的所有區(qū)域互補之序列的反義寡核苷酸<tablesid="table3"num="003"><table>SEQIDNO.名稱序列5′-3′Tm(℃)△G(kcal/mol)26GTI4026GTGCGGAAGGCGGCCACCCT76.4-48.227GTI4027CAGGGTGCTGAGGGGCGGGC76.9-48.028GTI4028GCTCCGGGGCCCAAGCAACC75.9-48.329GTI4029CCCTAGGCGCCGCGGTGGTG77.6-49.330GTI4030TGGCATGGACGACCCCCGGG77.7-48.131GTI4031GGGCCGCAAGGTGGACCGAG74.8-46.7</table></tables>反義寡核苷酸選自與人IGF-ⅡmRNA互補的序列以使序列最不可能顯示出雙鏈體形成，發(fā)夾形成和同寡聚體/序列重復但可高效結合IGF-ⅡmRNA序列并含有GC夾。另外，還消除了對人和小鼠中的其它常見或重復序列的錯誤引發(fā)。使用計算機模型設計程序OLIGO引物分析軟件第5.0版(由NationalBiosciences,Inc.,Plymouth,MN分發(fā))可測定這些特性。在表1和2中，“Tm”是根據(jù)毗鄰熱動力學值計算出的寡核苷酸雙鏈體解鏈溫度。在此溫度下，50％核酸分子為雙鏈體，50％已變性?！唉”是寡核苷酸的自由能，它測定的是寡核苷酸雙鏈體的穩(wěn)定性。術語“烷基”指的是單價烷基，優(yōu)選其具有1至20個碳原子，更優(yōu)選其具有1至6個碳原子。該術語所包括的基團的例子如下甲基，乙基，正-丙基，異-丙基，正-丁基，異-丁基，正-己基等。術語“芳基”指的是具有單個環(huán)(如苯基)或多個縮合(融合)環(huán)(如萘基或蒽基)的6至14個碳原子的不飽和芳香族碳環(huán)基團。優(yōu)選芳基包括苯基，萘基等。術語“鹵”或“鹵素”指的是氟，氯，溴和碘，優(yōu)選為氟或氯。有關含有一個或多個取代基的上述任一基團，應理解所述基團不含空間上無法實施和/或無法合成的任何取代或取代模式。另外，本發(fā)明的化合物包括由這些化合物中的取代所致的所有立體化學異構體。術語“藥物可接受的”指的是不會干擾活性成分之生物活性效力的無毒物質(zhì)。該物質(zhì)與如細胞，細胞培養(yǎng)物，組織或生物體的生物系統(tǒng)相容。術語“藥物可接受的鹽”指的是可保留本發(fā)明反義寡核苷酸的生物效力和特性而本身是或不是生物所需要的鹽。在很多情況下，本發(fā)明的反義寡核苷酸能利用氨基和/或羧基或其類似基團的存在形成酸和/或堿加成鹽。可由無機和有機堿制備藥物可接受的堿加成鹽。衍生自無機堿的鹽包括例如鈉，鉀，鋰，銨，鈣和鎂鹽。衍生自有機堿的鹽包括但不限于伯胺，叔胺和仲胺的鹽，所述胺如烷基胺，二烷基胺，三烷基胺，取代烷基胺，二(取代烷基)胺，三(取代烷基)胺，鏈烯基胺，二鏈烯基胺，三鏈烯基胺，取代鏈烯基胺，二(取代鏈烯基)胺，三(取代鏈烯基)胺，環(huán)烷基胺，二(環(huán)烷基)胺，三(環(huán)烷基)胺，取代環(huán)烷基胺，二取代環(huán)烷基胺，三取代環(huán)烷基胺，環(huán)鏈烯基胺，二(環(huán)鏈烯基)胺，三(環(huán)鏈烯基)胺，取代環(huán)鏈烯基胺，二取代環(huán)鏈烯基胺，三取代環(huán)鏈烯基胺，芳基胺，二芳基胺，三芳基胺，雜芳基胺，二雜芳基胺，三雜芳基胺，雜環(huán)胺，二雜環(huán)胺，三雜環(huán)胺，混合的二-和三-胺，其中胺上的至少兩個取代基有所不同并選自烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯基，環(huán)烷基，取代環(huán)烷基，環(huán)鏈烯基，取代環(huán)鏈烯基，芳基，雜芳基，雜環(huán)等。還包括其中的兩個或三個取代基與氨基氮一起形成雜環(huán)或雜芳基的胺。適當?shù)陌返睦影ɡ绠惐罚谆?，二乙基胺，?異丙基)胺，三(正丙基)胺，乙醇胺，2-二甲基氨基乙醇，氨基丁三醇，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，咖啡因，普魯卡因，哈胺，膽堿，甜菜堿，乙二胺，葡糖胺，N-烷基葡糖胺，可可堿，嘌呤，哌嗪，哌啶，嗎啉，N-乙基哌啶等。應理解其它羧酸衍生物也可用于本發(fā)明實踐，例如，羧酸酰胺，包括氨甲酰，低級烷基氨甲酰，二烷基氨甲酰等?？捎蔁o機和有機酸制備藥物可接受的酸加成鹽。衍生自無機酸的鹽包括鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等。衍生自有機酸的鹽包括醋酸，丙炔酸，乙醇酸，丙酮酸，草酸，蘋果酸，丙二酸，琥珀酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙烷磺酸，對甲苯磺酸，水楊酸等。術語“IGF-Ⅱ基因”或“胰島素樣生長因子Ⅱ”指的是編碼能結合IGF-Ⅰ或IGF-Ⅱ受體的蛋白質(zhì)的任何基因。優(yōu)選IGF-Ⅱ基因之一個或多個區(qū)域的核苷酸序列與圖11A-D所示外顯子4,5,6或7-9的序列基本上相似。術語“互補”指的是反義寡核苷酸序列能結合靶序列，即IGF-Ⅱ基因(或mRNA)。優(yōu)選反義寡核苷酸在生理條件下，通過例如Watson-Crick堿基配對(寡核苷酸和單鏈核酸之間的相互作用)或Hoogsteen堿基配對(寡核苷酸和雙鏈核酸之間的相互作用)或通過任何其它方式(包括在寡核苷酸與RNA結合的情況下導致假結形成)與核酸序列結合。通過觀察對核酸序列之功能的干擾來測定生理條件下通過Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對的結合是可行的。優(yōu)選反義寡核苷酸序列與靶序列之間的同一性至少約為75％，優(yōu)選至少約為90％，最優(yōu)選與靶序列之間的同一性至少約為95％以允許幾個堿基的缺口或錯配存在。通過使用例如Wisconsin大學計算機小組(GCG)軟件的BLASTN程序可測定同一性。優(yōu)選反義寡核苷酸序列與IGF-ⅡmRNA雜交，通過本文所述的OLIGO引物分析軟件第5.0版測定其解鏈溫度至少為45℃，更優(yōu)選至少約為50℃，最優(yōu)選至少約為55℃。術語“抑制生長”指的是將至少一種腫瘤細胞類型的生長降低或抑制優(yōu)選至少10％，更優(yōu)選至少50％，最優(yōu)選至少75％。通過測定裸鼠腫瘤的大小或腫瘤細胞在體外不能形成集落這一特性可測定對腫瘤生長的抑制作用。術語“抑制轉(zhuǎn)移”指的是將所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移腫瘤的數(shù)目減少或抑制優(yōu)選至少10％，更優(yōu)選至少50％。通過實施例中所述的方法和本領域已知的其它方法可測定該抑制作用。術語“抑制IGF-Ⅱ表達”指的是當將反義寡核苷酸施用于細胞時，該寡核苷酸降低了細胞產(chǎn)生的IGF-ⅡmRNA水平或IGF-Ⅱ蛋白質(zhì)水平。術語“哺乳動物”指的是所有哺乳動物，包括人，綿羊，牛，馬，豬，狗，貓和小鼠等，優(yōu)選哺乳動物指的是人。“被懷疑患有腫瘤的哺乳動物”指的是哺乳動物患有增殖性病癥或腫瘤或被診斷為增殖性病癥或腫瘤或以前曾被診斷為增殖性病癥或腫瘤，腫瘤已被外科切除，哺乳動物仍被懷疑具有一些殘留的腫瘤細胞。反義寡核苷酸的制備通過常規(guī)的和眾所周知的技術可制備本發(fā)明的反義寡核苷酸。例如，使用固相合成，尤其是使用商購儀器，如可購自AppliedBiosystemsCanada公司，Mississauga，加拿大的儀器可制備寡核苷酸。通過用本領域已知的方法酶促消化天然IGF-Ⅱ基因也可制備寡核苷酸。通過本領域公知的方法，如氨基磷酸酯或H-磷酸酯化學可制備這些寡核苷酸，所述方法可以手工操作或按Uhlmann等(21)和Agrawal等(22)所述通過自動化的合成儀進行。分離和純化反義寡核苷酸必要時，可通過任何適當?shù)姆蛛x或純化方法分離和純化本文所述的反義寡核苷酸，所述方法如過濾，提取，結晶，柱層析，薄層層析，厚層層析，制備性低或高壓液相層析或上述方法的組合。然而，也可使用其它功能等同的分離方法?？紤]到寡核苷酸的序列并使用本領域已知的方法，可構建含有反義寡核苷酸序列的表達載體。本領域技術人員可構建載體，所述載體含有獲得反義寡核苷酸序列之適當轉(zhuǎn)錄所需的所有表達元件。因此，本發(fā)明提供了含有與編碼反義寡核苷酸之序列可操作相連的轉(zhuǎn)錄控制序列的載體。適當?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯元件有多個來源，包括細菌，真菌，病毒，哺乳動物或昆蟲基因。適當元件的選擇取決于所選的宿主細胞。載體中可包括報道基因。適當?shù)膱蟮阑虬é?半乳糖苷酶(如lacZ)，氯霉素，乙?；D(zhuǎn)移酶，螢火蟲螢光素酶或免疫球蛋白或其部分。通過監(jiān)測報道基因的表達可監(jiān)測反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)錄。通過本領域的多種已知方法中的任一種可將載體導入細胞或組織。所述方法通常描述于Sambrook等24；Ausubel等25；Chang等36；Vega等37和載體分子克隆載體及其用途概述38并包括例如穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染法，電穿孔和用重組病毒載體感染。通過感染導入核酸有幾個優(yōu)點，可獲得較高的效力和組織類型的特異性。病毒一般感染特定的細胞類型并在其中繁殖，因此，可使用病毒的特異性將載體靶向體內(nèi)或組織內(nèi)或混合的細胞培養(yǎng)物中的特定細胞類型。也可用特定的受體或配體修飾病毒載體以通過受體介導的事件改變靶特異性。希望本發(fā)明的寡核苷酸是切割mRNA的核酶。優(yōu)選核酶具有與本發(fā)明的寡核苷酸序列和切割mRNA所必需的催化中心同源的序列。例如，可選擇破壞IGF-ⅡmRNA的同源核酶序列。本發(fā)明所用的核酶類型可選自本領域已知的類型。已鑒定出幾個核酶結構家族，包括Ⅰ組內(nèi)含子，RNA酶P，丁型肝炎病毒核酶，錘頭狀核酶和最初得自煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA(sTRSV)的發(fā)夾核酶(Sullivan1994，美國專利5,225,34739)。錘頭狀核酶和發(fā)夾核酶基元最常適用于反式切割mRNA以用于基因治療(Sullivan1994)。本發(fā)明優(yōu)選使用發(fā)夾核酶。通常，核酶的長度為30至100個核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸可以是不溶解的，例如，寡核苷酸可結合于適當?shù)妮d體上。適當載體的例子是瓊脂糖，纖維素，葡聚糖，Sephadex，Sepharose，羧甲基纖維素，聚苯乙烯，濾紙，離子交換樹脂，塑料薄膜，塑料管，玻璃珠，多胺-甲基乙烯基-醚-馬來酸共聚物，氨基酸共聚物，乙烯-馬來酸共聚物，尼龍，絲織物等。載體的外形可以是管，檢測板，珠盤，球形等。通過使用已知的化學或物理方法，如溴化氰偶聯(lián)法使寡核苷酸與適當?shù)牟蝗苄暂d體反應即可制備不溶解的寡核苷酸。藥物配制當用作藥物時，通常以藥物組合物的形式施用反義寡核苷酸?？赏ㄟ^包括口服，直腸，經(jīng)皮，皮下，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)和鼻內(nèi)的多種途徑施用這些化合物。這些化合物作為可注射的和口服的組合物都是有效的?？砂此帉W領域眾所周知的方式制備所述組合物，該組合物中可含有至少一種活性化合物。例如，可以靜脈內(nèi)注射藥物組合物。希望能將藥物組合物直接注射至需治療的腫瘤中。本發(fā)明還包括含有一種或多種反義寡核苷酸作為活性成分并同時含有藥物可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。在制備本發(fā)明的組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，用賦形劑稀釋活性成分，或?qū)⒒钚猿煞职谀z囊，藥囊，紙或其它容器形式的載體內(nèi)。當賦形劑用作稀釋劑時，它可以是用作活性成分之載體或介質(zhì)的固體，半固體或液體物質(zhì)。因此，組合物的形式可以是片劑，丸劑，粉末，錠劑，藥囊，扁囊劑，池劑，懸浮液，乳劑，溶液，糖漿，氣霧劑(作為固體或溶于液體介質(zhì)中)，含有例如占重量10％的活性化合物的軟膏劑，軟和硬的明膠膠囊，栓劑，無菌的注射溶液和無菌的包裝粉末。制備制劑時，必需研磨活性化合物以在與其它成分混合之前提供適當?shù)念w粒大小。如果活性化合物基本上不溶解，一般將其研磨至顆粒大小小于200目。如果活性化合物基本上是水溶性的，一般通過研磨來調(diào)節(jié)顆粒大小以使制劑中的顆粒分布基本上均勻，如研磨至40目左右。適當賦形劑的一些例子包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉，金合歡膠，磷酸鈣，藻酸鹽，黃蓍膠，明膠，硅酸鈣，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素，無菌水，糖漿和甲基纖維素。制劑中還可包括潤滑劑，如滑石粉，硬脂酸鎂和礦物油；濕潤劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑，如甲基-和丙基羥基-苯甲酸鹽；甜味劑；和調(diào)味劑。也可使用本領域已知的方法配制本發(fā)明的組合物，使得給患者施用之后，能快速控釋或緩釋活性成分。優(yōu)選將組合物配制成單位劑量形式，每個劑量含有約1％至約95％，更優(yōu)選約5％至約90％的活性成分。術語“單位劑量形式”指的是適于用作人受試者和其它哺乳動物的單一劑量的物理分離單位，每個單位含有經(jīng)計算可產(chǎn)生所需治療效果的預定量的活性物質(zhì)以及適當?shù)乃幬镔x形劑。反義寡核苷酸在寬的劑量范圍內(nèi)都有效，一般以藥物有效量給藥。有效量是給藥時可減輕癥狀的量。優(yōu)選有效量是能抑制腫瘤細胞生長的量，優(yōu)選有效量是約0.1mg/kg體重至約20mg/kg體重。然而，應理解實際施用的反義寡核苷酸的量由醫(yī)生根據(jù)有關情況決定，所述情況包括治療的疾病，選定的給藥途徑，實際施用的化合物，年齡，體重和個體患者的反應，患者癥狀的嚴重程度等。療程從幾天至幾個月不等或直至減輕疾病為止。反義寡核苷酸可以與其它已知的療法一起使用。當與一種或多種其它的療法一起使用時，可同時或依次施用寡核苷酸和其它治療。如果是依次施用，護理醫(yī)生將決定施用寡核苷酸與其它療法的適當次序。為了制備固體組合物，如片劑，可將主要的活性成分/反義寡核苷酸與藥物賦形劑混合以形成含有本發(fā)明化合物之均質(zhì)混合物的固體預配制組合物。當將所述預配制的組合物稱為均質(zhì)時，意味著活性成分均勻分散在整個組合物中，使得組合物很容易地被次分為同樣有效的單位劑量形式，如片劑，丸劑和膠囊。可包被或要不然復合本發(fā)明的片劑或丸劑以提供具有作用時間延長之優(yōu)點的劑量形式。例如，片劑或丸劑可含有內(nèi)部劑量組分和外部劑量組分，后者是前者的外膜形式。這兩種組分可由腸層分隔開，所述腸層可以防止在胃中崩解并可使內(nèi)部組分完整地進入十二指腸或延緩釋放。多種物質(zhì)可用作所述腸層或外被，所述物質(zhì)包括多種聚合酸和聚合酸與如蟲膠，鯨蠟醇和乙酸纖維素之物質(zhì)的混合物。其中摻入本發(fā)明的新組合物以口服或注射途徑給藥的液體形式包括水溶液，適當調(diào)味的糖漿，含水或油的懸浮液和用諸如玉米油，棉子油，芝麻油，椰子油或花生油的食用油調(diào)味的乳劑，以及酏劑和類似的藥物載體。用于吸入或吹入的組合物包括溶于藥物可接受的含水或有機溶劑或其混合物中的溶液和懸浮液和粉末。液體或固體組合物可含有本文所述的適當?shù)乃幬锟山邮艿馁x形劑。優(yōu)選通過口服或鼻呼吸途徑施用組合物以產(chǎn)生局部或全身療效?？墒褂枚栊詺怏w噴霧優(yōu)選溶于藥物可接受的溶劑中的組合物，可直接由噴霧裝置中吸入噴霧溶液，或者使噴霧裝置貼附在面罩或間歇正壓呼吸器上。優(yōu)選由以適當方式傳遞制劑的裝置口服或鼻內(nèi)施用溶液，懸浮液或粉末組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以是脂質(zhì)體的形式，其中除了其它藥物可接受的載體外，寡核苷酸還與以聚集體形式存在于水溶液中的兩親性試劑(如脂質(zhì))混合，所述聚集體形式如微團，不溶性單層，液晶或片層。脂質(zhì)體制劑中所用的適當脂質(zhì)包括但不限于甘油單酯，甘油二酯，硫腦苷脂，溶血卵磷脂，磷脂，皂苷，膽汁酸等。一個特別有用的脂質(zhì)載體是lipofectin。制備所述脂質(zhì)體制劑的方法是本領域技術人員眾所周知的，例見國際專利號WO97/21808(28)。藥物組合物可進一步包括能使寡核苷酸至細胞的傳遞增強的化合物，如環(huán)化糊精等或緩釋聚合物。本發(fā)明方法中使用的另一種優(yōu)選制劑使用經(jīng)皮傳遞器具(“貼片”)?？墒褂眠@種經(jīng)皮補片控量連續(xù)或不連續(xù)注入本發(fā)明的反義寡核苷酸。傳遞藥劑所用的經(jīng)皮補片的制備和使用是本領域眾所周知的，例見美國專利5,023,25240(列入本文作為參考)?？芍苽溥@種補片以連續(xù)，脈動或按需傳遞藥劑。另一種優(yōu)選的傳遞方法包括穿過真皮層“散彈槍法”傳遞裸露的反義寡核苷酸。“裸露”反義寡核苷酸的傳遞是本領域眾所周知的，例見Felgner等，美國專利5,580,85941。希望在“散彈槍法”傳遞反義寡核苷酸之前將反義寡核苷酸包裝于脂質(zhì)載體中。下列配方的例子闡明了本發(fā)明代表性的藥物組合物。配方實施例1制備了含有下列成分的硬明膠膠囊成分含量(mg/膠囊)活性成分30.0淀粉305.0硬脂酸鎂5.0混合上述成分并以340mg的量填入硬明膠膠囊。配方實施例2使用下列成分制備片劑成分含量(mg/片)活性成分25.0纖維素，微晶200.0膠態(tài)二氧化硅10.0硬胇酸5.0混合上述組分并壓制成片劑，每片重為240mg。配方實施例3制備含有下列組分的干粉吸入制劑成分重量％活性成分5乳糖95將活性成分與乳糖混合，并將混合物加入干粉吸入器中。配方實施例4按下述制備各含有30mg活性成分的片劑成分含量(mg/片)活性成分30.0mg淀粉45.0mg微晶纖維素35.0mg聚乙烯吡咯烷酮(無菌水中的10％溶液)4.0mg羧甲基淀粉鈉4.5mg硬脂酸鎂0.5mg滑石粉1.0mg總重量120mg將活性成分，淀粉和纖維素穿過20目的U.S.篩并充分混合。將聚乙烯吡咯烷酮溶液與所得粉末混合，然后穿過16目的U.S.篩。于50至60℃干燥所產(chǎn)生的顆粒并穿過16目的U.S.篩。然后在顆粒中加入預先穿過30目的U.S.篩的羧甲基淀粉鈉，硬脂酸鎂和滑石粉，混合后用片劑機壓制產(chǎn)生每片重120mg的片劑。配方實施例5按下述制備各含有40mg藥物的膠囊成分含量(mg/膠囊)活性成分40.0mg淀粉109.0mg硬脂酸鎂1.0mg總重量150.0mg混合活性成分，淀粉和硬脂酸鎂，穿過20目的U.S.篩并以150mg的量填入硬明膠膠囊。配方實施例6按下述制備各含有25mg活性成分的栓劑成分含量活性成分25mg飽和脂肪酸甘油酯至2000mg將活性成分穿過60目的U.S.篩并懸浮于預先用必需的最低溫度融化的飽和脂肪酸甘油酯中。然后將混合物注入容量名義上為2.0g的栓劑模具中并使其冷卻。配方實施例7按下述制備每5.0ml劑量含有50mg藥物的懸浮液成分含量活性成分50.0mg黃原膠4.0mg羧甲基纖維素鈉(11％)微晶纖維素(89％)50.0mg蔗糖1.75g苯甲酸鈉10.0mg調(diào)味劑和著色劑q.v.純水至5.0ml混合活性成分，蔗糖和黃原膠，穿過10目的U.S.篩，然后與預先制備的微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉水溶液混合。用一些水稀釋苯甲酸鈉，調(diào)味劑和著色劑，邊攪拌邊加入，再加入足夠量的水以產(chǎn)生所需的體積。配方實施例8成分含量(mg/膠囊)活性成分15.0mg淀粉407.0mg硬脂酸鎂3.0mg總重量425.0mg混合活性成分，淀粉和硬脂酸鎂，穿過20目的U.S.篩并以425.0mg的量填入硬明膠膠囊。配方實施例9按下述制備制劑成分含量活性成分5.0mg玉米油1.0ml配方實施例10按下述制備局部制劑成分含量活性成分1-10g乳化蠟30g液體石蠟20g白色軟石蠟至100g加熱白色的軟石蠟直至融化，將液體石蠟和乳化蠟混合在一起，攪拌直至溶解。加入活性成分，持續(xù)攪拌直至均勻分散，然后將混合物冷卻為固體。本發(fā)明所用的其它適當制劑見于Remington’sPharmaceuticalSciences(23)?？蓪⒎戳x寡核苷酸或含有反義寡核苷酸的藥物組合物包裝于方便使用的試劑盒中，該試劑盒將必需的物質(zhì)包裝于適當容器中。治療制劑形式的本發(fā)明的反義寡核苷酸可用于治療與腫瘤生長相關的疾病和病癥。在該方法中，將能有效抑制IGF-Ⅱ胎兒轉(zhuǎn)錄物之表達的治療量的寡核苷酸施用于細胞。該細胞可以是細胞培養(yǎng)物，組織培養(yǎng)物的一部分，或是如人的哺乳動物的整個身體的一部分。本發(fā)明的寡核苷酸和核酶調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長，因此，本發(fā)明提供了干擾或抑制哺乳動物腫瘤細胞生長的方法，所述方法包括將腫瘤或腫瘤細胞與本發(fā)明的反義寡核苷酸接觸。術語“接觸”指的是在細胞懸浮液或組織樣品中加入寡核苷酸，核酶等，或直接或間接給動物體內(nèi)的細胞或組織施用寡核苷酸等?？墒褂迷摲椒ㄖ委煱ǘ喾N形式的癌癥或腫瘤的增殖性病癥，如白血病，(Hodgkins和非-Hodgkins)淋巴瘤，肉瘤，黑素瘤，腺瘤，實體組織癌，含氧量低的腫瘤，口腔，咽，喉和肺的鱗狀細胞癌，泌尿生殖道癌癥，如子宮頸和膀胱癌，造血癌癥，結腸癌，乳腺癌，胰腺癌，腎癌，腦癌，皮膚癌，肝癌，頭和頸癌，和神經(jīng)系統(tǒng)的癌癥以及良性損害，如乳頭狀瘤。也包括其它增殖性病癥，如牛皮癬和涉及關節(jié)硬化的病癥。也可使用本發(fā)明的寡核苷酸治療對藥物具有抗性的腫瘤。藥物抗性腫瘤的例子包括對諸如5-氟尿嘧啶，絲裂霉素C，氨甲蝶呤或羥基脲的化學治療劑具有抗性的腫瘤和表達高水平P-糖蛋白的腫瘤，已知P-糖蛋白可賦予對諸如秋水仙素，長春花堿和阿霉素的多種抗癌藥物的抗性；或表達多個-藥物抗性蛋白質(zhì)(如Dreeley等(28)所述)的腫瘤。因此，希望本發(fā)明的寡核苷酸與已知的抗癌化合物或化學治療劑一起使用?；瘜W治療劑是可抑制腫瘤生長的化合物，該藥劑包括但不限于5-氟尿嘧啶，絲裂霉素C，氨甲蝶呤和羥基脲。希望化學治療劑的量為有效量，即足以抑制腫瘤生長的量或低于有效量。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的寡核苷酸可降低轉(zhuǎn)移腫瘤，如C8161黑素瘤細胞的生長。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了降低哺乳動物轉(zhuǎn)移腫瘤生長的方法，所述方法包括施用有效量的約3個至約100個核苷酸長的寡核苷酸，其含有與哺乳動物胎兒IGF-ⅡmRNA之5’非翻譯區(qū)互補的序列，該序列可選自表1所示的寡核苷酸。在另一個實施方案中，提供了降低哺乳動物轉(zhuǎn)移腫瘤生長的方法，所述方法包括施用有效量的約20個至約100個核苷酸長的寡核苷酸，其含有選自表2所示SEQIDNO:17-31的序列。使用病毒或非病毒載體可傳遞寡核苷酸?？蓪⑿蛄袚饺牒谢驑嫿w中以使本發(fā)明的寡核苷酸能在細胞中表達。優(yōu)選構建體含有適當?shù)霓D(zhuǎn)錄控制區(qū)域以使寡核苷酸能在細胞中轉(zhuǎn)錄。因此，本發(fā)明提供了載體，其含有與編碼本發(fā)明的寡核苷酸的序列可操作相連的轉(zhuǎn)錄控制序列。本發(fā)明還提供了被上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其選自適當?shù)恼婧撕驮思毎＿m當?shù)妮d體是已知的，優(yōu)選其含有獲得序列的必要轉(zhuǎn)錄所必需的所有表達元件。噬粒是這種有利載體的特例，因為它們既可用作質(zhì)粒也可用作噬菌體載體。載體的例子包括如噬菌體，桿狀病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，DNA病毒的病毒，脂質(zhì)體和其它重組載體。載體也可含有用于原核或真核宿主系統(tǒng)的元件。本領域技術人員知道何種宿主系統(tǒng)與特定載體相容?？赏ㄟ^穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染法，電穿孔和用重組病毒載體感染將載體導入細胞?？稍谳d體中添加其它特征以確保其安全性和/或增強其治療效力，所述特征包括例如可用于陰性選擇被重組病毒感染之細胞的標記。這種陰性選擇標記的例子是賦予對抗病毒藥丙氧鳥苷的敏感性的TK基因。也可包括將表達局限于特定細胞類型的特征。這種特征包括例如特異于所需細胞類型的啟動子和調(diào)節(jié)元件。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是另一例可用于體內(nèi)導入所需核酸的載體，因為它們具有諸如側向感染和靶向特異性的優(yōu)點。側向感染是單個感染細胞產(chǎn)生很多可感染相鄰細胞的后代毒粒的過程，其結果是大面積細胞被快速感染。可根據(jù)需要靶向的細胞類型選擇本發(fā)明方法中所用的載體。例如，如果需治療乳腺癌，即可使用特異于上皮細胞的載體。類似地，如果需治療造血系統(tǒng)的細胞，則優(yōu)選特異于血細胞的病毒載體。實用性本發(fā)明的反義寡核苷酸具有多種用途。它們可用于抑制哺乳動物細胞中的IGF-Ⅱ基因的表達，導致該細胞的生長受抑制。所述寡核苷酸也可用作雜交探針以檢測哺乳動物細胞中IGF-ⅡmRNA的存在。當如此使用時，可用適當?shù)目蓽y基團(如放射性同位素，配體，特定結合對的另一個成員，如生物素)標記寡核苷酸。最后，將寡核苷酸用作分子量標記。為了進一步闡明本發(fā)明及其優(yōu)點，給出了下列特定的實施例，但這些實施例不以任何方式限制權利要求書的范圍。實施例在下列實施例中，所有溫度以攝氏度表示(除非另有說明)，所有百分比皆為重量百分比(除非另有說明)。在下列實施例中，下列縮寫具有下列含義。如果未定義縮寫，其具有其公知的含義AS=反義cDNA=互補的脫氧核糖核酸ODN=寡脫氧核苷酸μM=微摩爾mM=毫摩爾M=摩爾ml=毫升μl=微升mg=毫克μg=微克PAGE=聚丙烯酰胺凝膠電泳rpm=每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)ΔG=自由能，寡核苷酸雙鏈體穩(wěn)定性的測定結果kcal=千卡FBS=胎牛血清DTT=二硫蘇糖醇SDS=十二烷基硫酸鈉PBS=磷酸緩沖鹽水PMSF=苯甲基磺酰氟GAPDH=甘油醛-3-磷酸脫氫酶IgG=免疫球蛋白GkDa=千道爾頓PCR=聚合酶鏈反應Tris-HCl=三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸TRIzol=總RNA分離試劑ECL=Western印跡檢測試劑IGF-Ⅰ=胰島素樣生長因子ⅠIGF-Ⅱ=胰島素樣生長因子ⅡUTR=非翻譯區(qū)分子生物學的一般方法本領域已知的，本文中未具體描述的標準分子生物學技術一般參照Sambrook等24；Ausubel等25和Perbal26。寡核苷酸反義寡核苷酸選自與IGF-ⅡmRNA互補的序列以使序列最不可能顯示出雙鏈體形成，發(fā)夾形成和同寡聚體/序列重復但可高效結合IGF-ⅡmRNA序列。另外，還消除了對人和小鼠中的其它常見或重復序列的錯誤引發(fā)。使用計算機模型設計程序OLIGO引物分析軟件第5.0版(由InternationalBiosciences,Inc.,Plymouth,MN分發(fā))可測定這些特性。根據(jù)此分析結果，設計硫代磷酸反義寡核苷酸，然后通過本領域眾所周知的方法制備該寡核苷酸。細胞系包括胚胎橫紋肌肉瘤(RD)，成神經(jīng)細胞瘤(SK-N-AS)，維爾姆斯瘤(G401)，黑素瘤(C8161)，人前列腺腺癌(PC-3)，轉(zhuǎn)移性胰腺腺癌(AsPC-1)的5個不同的人癌細胞系得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。將細胞系維持在添加有10％胎牛血清(FBS)的α-MEM培養(yǎng)基(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)中。實施例1．通過與IGF-Ⅱ互補的反義寡核苷酸抑制癌癥細胞系的生長使用前述方法(Choy等18)估計用不同硫代磷酸反義寡核苷酸處理的癌癥細胞系的集落形成能力。具體地說，以約1×104的密度將腫瘤細胞懸浮液的等分試樣接種于60mm組織培養(yǎng)皿中，于37℃，在添加有10％FBS的α-MEM培養(yǎng)基中保溫過夜。用5mlPBS將細胞洗滌1次，再在陽離子脂質(zhì)的存在下(Lipofectin試劑，終濃度為5μg/ml,Gibco-BRL,Gaithers-burg,MD)，用0.2μM所示反義寡核苷酸將細胞處理4小時。通過用PBS洗滌細胞1次以除去反義寡核苷酸，于37℃，在添加有10％FBS的α-MEM生長培養(yǎng)基中將細胞培養(yǎng)7至10天。用亞甲藍染色集落，通過按choy等18以及Huang和Wright20所述直接計數(shù)以進行評分。通過與缺乏反義寡核苷酸的培養(yǎng)物中存在的集落數(shù)目相比較，計算出抑制作用的百分比。所有實驗都重復進行4次。反義寡核苷酸對人腫瘤細胞系的集落形成能力具有抑制作用。圖2A-D分別是各個反義寡核苷酸對橫紋肌肉瘤(RD)；人前列腺癌細胞系(PC-3)；人胰腺癌細胞系(AsPC-1)；和人成神經(jīng)細胞瘤(SK-N-AS)的抑制作用百分比。實施例2．用與IGF-Ⅱ互補的反義寡核苷酸處理之后降低的mRNA水平將人成神經(jīng)細胞瘤(SK-N-AS)或橫紋肌肉瘤細胞(RD)培養(yǎng)至將近鋪滿(70-80％)，然后在陽離子脂質(zhì)(Lipofectin試劑，終濃度為5μg/ml，Gibco-BRL)和Opti-MEM(Gibco-BRL)的存在下，用0.2μM與IGF-Ⅱ互補的硫代磷酸反義寡核苷酸將細胞處理4小時。用PBS洗滌細胞1次并在含有10％FBS的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco-BRL)中將細胞保溫16小時。在TRIzol試劑(Gibco-BRL)中制備總RNA，按Hurta和Wright(27)所述，稍加改動后進行Northern印跡分析。使用正向引物(5’-TACCGCCCCAGTGAGACCCT-3’)[SEQIDNO:32]，反向引物(5’-TGACGTTTGGCCTCCCTGAA-3’)[SEQIDNO:33]并以人結腸腺癌5’端的一段序列加cDNA文庫(Clonetech,PaloAltoCA)為模板合成經(jīng)32P-標記的389bpPCR片斷，將上述印跡與此片斷雜交。人IGF-ⅡmRNA被表達為約6kb的核苷酸轉(zhuǎn)錄物(Werner等6)。通過在雜交之前用亞甲藍染色可闡明相等的RNA上樣量。圖3顯示出相對于對照細胞而言，反義寡核苷酸可將IGF-ⅡmRNA水平至少降低50％。實施例3．用與IGF-Ⅱ互補的反義寡核苷酸處理之后降低的IGF-Ⅱ蛋白質(zhì)水平將人成神經(jīng)細胞瘤(SK-N-AS)或橫紋肌肉瘤細胞(RD)培養(yǎng)至將近鋪滿(70-80％)，然后在陽離子脂質(zhì)(Lipofectin試劑，終濃度為5μg/ml，Gibco-BRL)和Opti-MEM(Gibco-BRL)的存在下，用0.2μM與IGF-Ⅱ互補的硫代磷酸反義寡核苷酸將細胞處理4小時。用PBS洗滌細胞1次并在含有10％FBS的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco-BRL)中將細胞保溫20小時。將處理和保溫過程再重復1次，然后在2×樣品上樣緩沖液(100mMTris-HCl，pH6.8，0.2MDTT,4％SDS,20％甘油和0.015％溴酚藍)中制備全細胞蛋白質(zhì)提取物。按Choy等(18)和Fan等(19)所述，稍加改動后進行Western印跡分析。用抗IGF-Ⅱ抗體(1-2μg/ml)(ResearchDiagnostics公司，F(xiàn)landersNJ)，接著用稀釋度為1∶7000的辣根過氧化物酶-綴合的抗山羊IgG(Sigma,St.LoiusMO)檢測IGF-Ⅱ的表達。通過ECL(Amersham,Arlingtonheights,IL)肉眼觀察到約7.5kDa的蛋白質(zhì)。圖4顯示出用多種反義寡核苷酸處理之后，人成神經(jīng)細胞瘤細胞中IGF-Ⅱ蛋白的減少。圖5顯示出用多種反義寡核苷酸處理之后，人橫紋肌肉瘤細胞中IGF-Ⅱ蛋白的減少。實施例4．通過用與IGF-Ⅱ互補的反義寡核苷酸靜脈內(nèi)治療來抑制小鼠體內(nèi)的人腫瘤細胞生長CD-1無胸腺裸鼠購自CharlesRiver實驗室(Montreal加拿大)。將SK-N-AS人成神經(jīng)細胞瘤細胞(一般為3×106個細胞/100μlPBS)皮下注入6-7周齡的CD-1無胸腺雌性裸鼠的右肋。每個實驗組包括5只小鼠。當腫瘤大小達到約100mm3的體積(一般在注射腫瘤細胞6天后)之后，每隔一天以10mg/kg的劑量通過大藥丸灌注將多種反義寡核苷酸施用于尾靜脈。同時給對照動物僅施用鹽水。隨后，一般持續(xù)治療14天。圖6A顯示出多種反義寡核苷酸對CD-1裸鼠中的人成神經(jīng)細胞瘤生長的影響。在治療的14天里，平均每隔2天用測徑器測量腫瘤體積，由對腫瘤體積的抑制作用估計抗腫瘤活性。圖中的每個點表示由每個實驗組的5只動物計算出的平均腫瘤體積。使用相關變異分析比較每個治療組小鼠在治療時間內(nèi)的回歸曲線。由該分析得出特別的假說，即斜率相同，或當斜率相同時截距也相同。所有分析都使用了SAS(統(tǒng)計學分析系統(tǒng))6.12版。當與鹽水對照相比時，施用反義寡核苷酸可抑制腫瘤生長，p值≤0.0001。治療結束時(通常為最后一次治療后24小時)，處死動物，測定腫瘤重量。圖6B顯示出腫瘤的平均重量，反義寡核苷酸對腫瘤生長具有顯著的抑制作用。使用方差單向分析比較治療組的平均值。當整個組的效果顯著時，從事先使用最小二乘方平均值獲得的多個比較結果中可發(fā)現(xiàn)顯著不同的治療組對。當比較腫瘤重量時，與鹽水對照相比，反義寡核苷酸也顯示出統(tǒng)計學上顯著的抑制作用。實施例5．通過用與IGF-Ⅱ互補的反義寡核苷酸靜脈內(nèi)治療來抑制小鼠體內(nèi)的人腫瘤細胞生長CD-1無胸腺裸鼠購自CharlesRiver實驗室(Montreal加拿大)。將G401人維爾姆斯瘤細胞(一般為3×106個細胞/100μlPBS)皮下注入6-7周齡的CD-1無胸腺雌性裸鼠的右肋。每個實驗組包括5只小鼠。當腫瘤大小達到約100mm3的體積(一般在注射腫瘤細胞8天后)之后，每隔一天以10mg/kg的劑量通過大藥丸灌注將多種反義寡核苷酸施用于尾靜脈。同時給對照動物僅施用鹽水。隨后，一般持續(xù)治療18天。圖7A顯示出多種反義寡核苷酸對CD-1裸鼠中的人維爾姆斯瘤生長的影響。在治療的18天里，平均每隔2天用測徑器測量腫瘤體積，由對腫瘤體積的抑制作用估計抗腫瘤活性。圖中的每個點表示由每個實驗組的5只動物計算出的平均腫瘤體積。使用相關變異分析比較每個治療組小鼠在治療時間內(nèi)的回歸曲線。由該分析得出特別的假說，即斜率相同，或當斜率相同時截距也相同。所有分析都使用了SAS(統(tǒng)計學分析系統(tǒng))6.12版。當與鹽水對照相比時，施用反義寡核苷酸可抑制腫瘤生長，p值≤0.0002。治療結束時(通常為最后一次治療后24小時)，處死動物，測定腫瘤重量。圖7B顯示出腫瘤的平均重量，反義寡核苷酸對腫瘤生長具有顯著的抑制作用。使用方差單向分析比較治療組的平均值。當整個組的效果顯著時，從事先使用最小二乘方平均值獲得的多個比較結果中可發(fā)現(xiàn)顯著不同的治療組對。當比較腫瘤重量時與鹽水對照相比，反義寡核苷酸也顯示出統(tǒng)計學上顯著的抑制作用。實施例6．通過用與IGF-Ⅱ互補的反義寡核苷酸靜脈內(nèi)治療來降低小鼠體內(nèi)的人腫瘤的IGF-ⅡmRNA水平CD-1無胸腺裸鼠購自CharlesRiver實驗室(Montreal加拿大)。將SK-N-AS人成神經(jīng)細胞瘤細胞(一般為3×106個細胞/100μlPBS)皮下注入6-7周齡的CD-1無胸腺雌性裸鼠的右肋。每個實驗組包括5只小鼠。當腫瘤大小達到約100mm3的體積(一般在注射腫瘤細胞6天后)之后，每隔一天以10mg/kg的劑量通過大藥丸灌注將多種反義寡核苷酸施用于尾靜脈。同時給對照動物僅施用鹽水。7次注射后處死小鼠，立即將切下的大小相似的腫瘤片斷收集至TRIzol試劑(GIBCOBRL)中，并快速勻漿以制備mRNA。為了測定反義寡核苷酸對IGF-ⅡmRNA水平的影響，按Hurta和Wright(27)所述，稍加改動后進行Northern印跡分析。使用正向引物(5’-TACCGCCCCAGTGAGACCCT-3’)[SEQIDNO:32]，反向引物(5’-TGACGTTTGGCCTCCCTGAA-3’)[SEQIDNO:33]并以人結腸腺癌5’端的一段序列加cDNA文庫(Clonetech,PaloAltoCA)為模板合成經(jīng)32p-標記的389bpPCR片斷，將上述印跡與此片斷雜交。人IGF-ⅡmRNA被表達為約6kb的核苷酸轉(zhuǎn)錄物(Werner等6)，按Hurta和Wright(27)所述，將其水平與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)mRNA相比較。圖8顯示出被反義寡核苷酸GTI4006[SEQIDNO:6]治療的腫瘤中IGF-ⅡmRNA水平的降低。實施例7．通過用與IGF-Ⅱ互補的反義寡核苷酸靜脈內(nèi)治療來降低小鼠體內(nèi)的人腫瘤的IGF-Ⅱ蛋白質(zhì)水平CD-1無胸腺裸鼠購自CharlesRiver實驗室(Montreal加拿大)。將SK-N-AS人成神經(jīng)細胞瘤細胞(一般為3×106個細胞/100μlPBS)皮下注入6-7周齡的CD-1無胸腺雌性裸鼠的右肋。每個實驗組包括5只小鼠。當腫瘤大小達到約100mm3的體積(一般在注射腫瘤細胞6天后)之后，每隔一天以10mg/kg的劑量通過大藥丸灌注將多種反義寡核苷酸施用于尾靜脈。同時給對照動物僅施用鹽水。7次注射后處死小鼠，立即將切下的大小相似的腫瘤片斷收集至RIPA提取緩沖液(50mMTris-HCl,pH7.5,150mM亮抑蛋白酶肽)中，并快速勻漿以制備蛋白質(zhì)。為了測定反義寡核苷酸對IGF-Ⅱ蛋白質(zhì)水平的影響，按Choy等(18)和Fan等(19)所述，稍加改動后進行Western印跡分析。在15％SDS-PAGE凝膠上分級分離蛋白質(zhì)提取物(10-20μg)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，通過用印度墨汁染色肉眼觀察。用抗IGF-Ⅱ抗體(1-2μg/ml(ResearchDiagnostics公司，F(xiàn)landersNJ)，接著用稀釋度為1∶7000的辣根過氧化物酶-綴合的抗山羊IgG(Sigma,St.LoiusMO)檢測IGF-Ⅱ的表達。通過ECL(Amersham,Arlingtonheights,IL)肉眼觀察到約7.5kDa的蛋白質(zhì)。圖9顯示出提取自腫瘤細胞的蛋白質(zhì)的Western印跡。檢測的每種反義寡核苷酸都能降低腫瘤中IGF-Ⅱ蛋白質(zhì)的水平。下方顯示的用印度墨汁染色的一部分印跡可闡明每個泳道相等的上樣量。實施例8．通過反義寡核苷酸抑制實驗轉(zhuǎn)移按Fan等，199619所述估計用不同反義寡核苷酸處理的C8161人黑素瘤細胞的實驗轉(zhuǎn)移。以2×106的密度將細胞懸浮液的等分試樣接種于100mm組織培養(yǎng)皿中，于37℃，在添加有10％FBS的α-MEM培養(yǎng)基中保溫過夜。用10mlPBS將細胞洗滌1次，再在陽離子脂質(zhì)的存在下(Lipofectin試劑，終濃度為5μg/ml，Gibco-BRL)，用0.2μM寡核苷酸將細胞處理4小時。通過用PBS洗滌細胞1次以除去反義寡核苷酸，并用胰蛋白酶消化細胞。離心收集細胞，將懸浮于0.1mlPBS中的約1×105個細胞注射至6-8周齡的CD-1無胸腺雌性裸鼠的尾靜脈中，5周后估計肺部腫瘤的數(shù)目，用苦味酸染料溶液(75％苦味酸，20％甲醛，5％冰醋酸)染色從各個小鼠體內(nèi)切下的肺。圖10顯示出用多種反義寡核苷酸處理腫瘤細胞之后，雌性裸鼠中肺部腫瘤數(shù)目的降低。權利要求1．反義寡核苷酸，包括約3至約100個核苷酸，其中的寡核苷酸含有與哺乳動物胎兒IGF-ⅡmRNA之5’非翻譯區(qū)互補的序列。2．權利要求1的反義寡核苷酸，其進一步含有一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間連鍵。3．權利要求1的反義寡核苷酸，其進一步含有不與IGF-ⅡmRNA互補的其它核苷酸。4．權利要求1的反義寡核苷酸，其中序列選自表1的SEQIDNO:1-15。5．反義寡核苷酸，包括約20至約100個核苷酸，其中的寡核苷酸含有選自表2的SEQIDNO:17-31的序列。6．權利要求5的反義寡核苷酸，其進一步含有一個或多個硫代磷酸酯核苷酸間連鍵。7．權利要求5的反義寡核苷酸，其進一步含有不與IGF-ⅡmRNA互補的其它核苷酸。8．含有反義寡核苷酸序列的載體，其中所述寡核苷酸序列長度為約3至約100個核苷酸，并含有與哺乳動物胎兒IGF-ⅡmRNA之5’非翻譯區(qū)互補的序列。9．含有反義寡核苷酸序列的載體，其中所述寡核苷酸序列長度為約20至約100個核苷酸，并含有選自表2的SEQIDNO:17-31的序列。10．藥物組合物，其含有藥物可接受的賦形劑和有效量的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列長度為約3至約100個核苷酸，并含有與哺乳動物胎兒IGF-ⅡmRNA之5’非翻譯區(qū)互補的序列。11．權利要求10的藥物組合物，其中序列選自表1的SEQIDNO:1-15。12．藥物組合物，其含有藥物可接受的賦形劑和有效量的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列長度為約20至約100個核苷酸，并含有選自表2的SEQIDNO:17-31的序列。13．抑制哺乳動物腫瘤生長的方法，所述方法包括在能抑制腫瘤生長的條件下，給懷疑患有腫瘤的哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，該寡核苷酸長度約為3至100個核苷酸，并含有與哺乳動物胎兒IGF-ⅡmRNA之5’非翻譯區(qū)互補的序列。14．權利要求13的方法，進一步包括給哺乳動物施用化學治療劑的步驟。15．權利要求13的方法，其中寡核苷酸可含有選自表1之SEQIDNO:1至15的序列。16．權利要求13的方法，其中寡核苷酸為核酶抗性。17．抑制哺乳動物腫瘤生長的方法，所述方法包括在能抑制腫瘤生長的條件下，給懷疑患有腫瘤的哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，該寡核苷酸長度約為20至100個核苷酸，并含有選自表2之SEQIDNO:17至31的序列。18．權利要求17的方法，其中寡核苷酸為核酶抗性。19．權利要求17的方法，進一步包括給哺乳動物施用化學治療劑的步驟。20．抑制哺乳動物腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括在能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，給懷疑患有轉(zhuǎn)移性腫瘤的哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，該寡核苷酸長度約為3至100個核苷酸，并含有與哺乳動物胎兒IGF-ⅡmRNA之5’非翻譯區(qū)互補的序列。21．權利要求20的方法，進一步包括給哺乳動物施用化學治療劑的步驟。22．權利要求20的方法，其中寡核苷酸為核酶抗性。23．權利要求20的方法，其中寡核苷酸含有選自表1之SEQIDNO:1至15的序列。24．抑制哺乳動物腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括在能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，給懷疑患有轉(zhuǎn)移性腫瘤的哺乳動物施用有效量的反義寡核苷酸，該寡核苷酸長度約為20至100個核苷酸，并含有選自表2之SEQIDNO:17至31的序列。25．權利要求24的方法，進一步包括給哺乳動物施用化學治療劑的步驟。26．權利要求25的方法，其中寡核苷酸為核酶抗性。全文摘要本發(fā)明涉及與IGFⅡ基因互補的寡核苷酸,該寡核苷酸可調(diào)節(jié)哺乳動物的腫瘤細胞生長。本發(fā)明還涉及使用該化合物抑制哺乳動物腫瘤細胞生長的方法。本發(fā)明還涉及含有藥物可接受的賦形劑和有效量的本發(fā)明化合物的藥物組合物。文檔編號A61K38/00GK1298444SQ99805384公開日2001年6月6日申請日期1999年4月23日優(yōu)先權日1998年4月23日發(fā)明者J·A·萊特,A·H·楊,Y·S·李申請人:吉倪塞思技術公司